ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

Instituto Internacional de Cromatografia

httpdxdoiorg104322sc2013004

ISSN 1984-4433

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

Elena E Stashenko Jairo Reneacute MartiacutenezCentro de Cromatografiacutea y Espectrometriacutea de Masas ndash CROM-MASS Centro de Investigacioacuten de Excelencia ndash CENIVAM

Escuela de Quiacutemica Universidad Industrial de Santander ndash UIS Bucaramanga Santander Colombia e-mail elenatucanuiseduco

Resumen

Se describen diversas caracteriacutesticas quiacutemicas de las fragancias florales y se presentan ejemplos de aplicacioacuten de los meacutetodos de espacio de cabeza destilativos y extractivos maacutes usados comuacutenmente para el aislamiento de estas mezclas de compuestos orgaacutenicos volaacutetiles cuya concentracioacuten variacutea entre picogramos y microgramos por litro Para el anaacutelisis GC-MS de las fragancias florales se presentan recomendaciones sobre su separacioacuten deteccioacuten e identificacioacuten acompantildeadas de ejemplos

Palabras claveFragancia floral microextraccioacuten en fase soacutelida cromatografiacutea de gases acoplada a espectrometriacutea de masas compuestos orgaacutenicos volaacutetiles

GC-MS analysis of floral fragrance

Abstract

The diverse chemical features of floral fragrances are described and examples of the application of headspace distillative and extraction methods most commonly used to isolate these mixtures of volatile organic compounds whose concentration varies between picograms and micrograms per liter are presented Regarding the GC-MS analysis of floral fragrances recommendations about their separation detection and identification are presented together with examples

KeywordsFloral scent solid-phase microextraction gas chromatography coupled to mass spectrometry volatile organic compounds

Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

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de extraccioacuten en espacio de cabeza (headspace) meacutetodos destilativos extractivos con solventes y en la superficie activa ie procesos de adsor-cioacutendesorcioacuten teacutermica usando adsorbentes con diferentes caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas[34] Para el anaacutelisis instrumental de las fracciones volaacutetiles y extractos se usa la cromatografiacutea de gases (GC) en versiones monodimensional o bidimensio-nal GCxGC en columnas capilares de diferentes polaridades y sistemas de deteccioacuten tanto uni-versales (detector de ionizacioacuten en llama FID detector selectivo de masas MSD por sus siglas en ingleacutes) como selectivos (detector selectivo de nitroacutegeno y foacutesforo NPD detector fotomeacutetrico de llama FPD para registrar compuestos nitro-genados o azufrados respectivamente) y muy especiacuteficos (electroantenografiacutea nariz electroacute-nica etc)[5]

2 Composicioacuten quiacutemica de las fragancias florales

Muchos y muy diversos compuestos han sido detectados e identificados en las fragan-cias florales Maacutes de 1700 han sido registrados en una multitud diversa de flores estudiadas[67] Los grupos principales de compuestos quiacutemicos encontrados en emisiones florales comprenden hidrocarburos (saturados ciacuteclicos y olefiacutenicos) terpenos baacutesicamente monoterpenoides y ben-cenoides y fenilpropanoides entre otros compues-tos oxigenados de naturaleza mixta alcoholes aldehiacutedos eacuteteres eacutesteres y sustancias que incor-poran heteroaacutetomos azufre o nitroacutegeno

La composicioacuten de la fragancia floral es uno de los aspectos maacutes relevantes y variados del fenotipo de las plantas La funcioacuten baacutesica de la fragancia floral es promover la polinizacioacuten cru-zada que es un proceso vital en el ciclo de vida de la mayoriacutea de las plantas[1] El conocimiento de la composicioacuten de la fragancia floral es impor-

1 Introduccioacuten

Uno de los campos de estudio de productos naturales comprende un aacuterea muy interesante la obtencioacuten y el anaacutelisis de las fragancias florales que pueden ser monitoreadas tanto in vivo como ex vivo[1] El estudio de metabolitos secundarios volaacutetiles que emanan las flores es importante en muchas aacutereas de las ciencias bioloacutegicas y quiacutemi-cas en agricultura para el control de plagas en el estudio de interacciones planta-insecto ale-lopatiacutea en ciencias analiacuteticas (preparacioacuten de muestras y cromatografiacutea) en industrias farma-ceacuteutica de perfumes y cosmeacutetica sabores y fra-gancias entre otras El intereacutes creciente en este campo de investigacioacuten se refleja en que en los uacuteltimos 20 antildeos el nuacutemero de artiacuteculos cientiacutefi-cos publicados por antildeo sobre el tema crecioacute de 7 (1993) a 158 (2012)[2]

Las fragancias florales son mezclas comple-jas producto del metabolismo de una planta en florecimiento estaacuten compuestas por centenares de moleacuteculas de diferente origen bioquiacutemico con distintas caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas (polari-dad volatilidad solubilidad) contienen diversos grupos funcionales (hidrocarburos alcoholes aldehiacutedos cetonas aacutecidos eacutesteres etc) y pueden encontrarse en concentraciones muy disiacutemiles (desde partes por trilloacuten ppt hasta partes por milloacuten ppm) Son sustancias predominante-mente lipofiacutelicas con peso molecular menor de 300 Da apolares o medianamente polares con presioacuten de vapor alta La nariz humana puede ser maacutes sensible -que un sistema de deteccioacuten cromatograacutefico- a algunas sustancias de fragan-cia floral presentes a nivel de trazas por ello es necesario llevar a cabo el proceso de extrac-cioacuten y concentracioacuten de la fragancia floral de tal manera que sus componentes sean detectables y puedan ser identificados Esto constituye un reto analiacutetico muy grande Hoy en diacutea este reto se resuelve aplicando diferentes estrategias teacutecnicas

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de compuestos que contienen aacutetomos de azufre o nitroacutegeno provenientes probablemente del metabolismo de aminoaacutecidos entre estos meta-bolitos secundarios volaacutetiles figuran compuestos con grupo nitro indoles oximas nitrilos antra-nilatos y sulfuros entre los maacutes comunes

3 Meacutetodos de obtencioacuten de fragancias florales

Antes de proceder a recolectar los volaacutetiles de flores es importante establecer si su monito-reo se haraacute in vivo (en el campo) o ex vivo El montaje experimental para cada propoacutesito seraacute diferente Algunas teacutecnicas de extraccioacuten no son aplicables en el campo para monitoreo de flores in vivo Es importante tambieacuten tener conoci-miento previo sobre la cantidad de volaacutetiles que emite la flor ya que de la cantidad dependeraacute el sistema de extraccioacuten y concentracioacuten empleado El buqueacute de sustancias volaacutetiles producidas por las flores puede tener de uno a maacutes de cien com-puestos pero generalmente contiene de 20 a 60 sustancias diferentes[1] La cantidad de volaacutetiles emitidos va desde los niveles bajos de picogra-mos hasta maacutes de 30 μgL[8] Algunos meacutetodos de recoleccioacuten de volaacutetiles florales pueden tener un disentildeo automatizado que permite el monitoreo durante 24 horas o por periodos maacutes largos Sin embargo la mayoriacutea de las teacutecnicas de extraccioacuten hacen una captura momentaacutenea un ldquosnapshotrdquo de los volaacutetiles florales emitidos[910]

Los meacutetodos de extraccioacuten de los metabo-litos secundarios volaacutetiles de las flores se pue-den dividir en tres categoriacuteas grandes a saber (I) Teacutecnicas de headspace (headspace HS por sus siglas en ingleacutes o espacio de cabeza) en modos estaacutetico o dinaacutemico (II) Teacutecnicas desti-lativas entre ellas destilacioacuten por arrastre con vapor destilacioacuten con agua-vapor hidrodestila-cioacuten hidrodestilacioacuten asistida por la radiacioacuten

tante para entender la interaccioacuten planta-insecto las estrategias quiacutemicas para atraer los poliniza-dores pero tambieacuten para disuadir a los herbiacutevo-ros y enfrentar a los patoacutegenos para adaptarse a diferentes estreses abioacuteticos para estudiar las rutas bioquiacutemicas de formacioacuten de metaboli-tos secundarios en una planta su capacidad de adaptacioacuten y la evolucioacuten bioloacutegica Tambieacuten es de intereacutes praacutectico conocer la composicioacuten flo-ral como fuente de inspiracioacuten para crear nuevas fragancias y mezclas odoriacuteferas que se usan en las industrias de cosmeacuteticos perfumes produc-tos de higiene personal o en la aromaterapia

Las fragancias florales de diferentes plantas a pesar de tener un olor diferente y a menudo distintivo y diferenciador entre especies y varie-dades vegetales poseen muchos compuestos comunes Entre estos conforman un grupo grande los terpenoides monoterpenos sesqui-terpenos diterpenos y terpenos irregulares y sus anaacutelogos oxigenados Entre los maacutes frecuentes figuran monoterpenos oxigenados alcoholes linalol mentol geraniol nerol y sus acetatos cetonas carvona mentona verbenona aldehiacute-dos citral (geranial y neral sus oacutexidos) hidro-carburos monoterpeacutenicos pinenos ocimenos carenos terpinenos limoneno p-cimeno se encuentran tambieacuten sesquiterpenoides entre los cuales se pueden mencionar cariofileno farne-seno bisaboleno cadineno cubebeno elemeno germacreno y sus isoacutemeros estructurales oacutexidos y alcoholes eg oacutexido de cariofileno alcoholes farnesol nerolidol y sus eacutesteres La familia maacutes grande en la fragancia floral tal vez estaacute confor-mada por los hidrocarburos alifaacuteticos C1-C30 (maacutes frecuentes C13-C21) y olefiacutenicos y algunas cicloparafinas Estas sustancias junto con los aacuteci-dos grasos C12-C22 forman parte de la capa pro-tectora de cera que reviste los peacutetalos de muchas flores Una nota odoriacutefera distintiva en la fragan-cia floral se debe a la presencia en sus mezclas

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de microondas y (III) Teacutecnicas extractivas que emplean disolventes de diferente naturaleza eg grasas (maceracioacuten enfleurage obtencioacuten de pomadas) disolventes apolares (hidrocarbu-ros obtencioacuten de concretos) disolventes pola-res (alcoholes obtencioacuten de absolutos) y fluidos supercriacuteticos (principalmente CO2) Las teacutecni-cas de espacio de cabeza (HS) se emplean en dos ldquoformatosrdquo diferentes headspace estaacutetico (S-HS) y headspace dinaacutemico eg purga y trampa (PampT) Hoy en diacutea la teacutecnica maacutes popular para el anaacute-lisis de fragancias florales es la micro-extraccioacuten en fase soacutelida (SPME por sus siglas en ingleacutes) operada en espacio de cabeza HS-SPME[4] Este meacutetodo de extraccioacuten sobre un adsorbente poli-meacuterico -que reviste una fibra de siacutelice fundida- combina la alta selectividad de extraccioacuten que se logra con la escogencia del poliacutemero su natu-raleza quiacutemica y el grosor y la optimizacioacuten de condiciones de muestreo (voluacutemenes del mate-rial y de espacio de cabeza temperaturas tiem-pos de pre-equilibrio y de exposicioacuten de la fibra modos de agitacioacuten de la muestra aditivos etc) con la concentracioacuten de analitos sobre la fibra La extraccioacuten y la concentracioacuten simultaacutenea de la muestra son procesos que destacan a la teacutecnica SPME y la hacen muy ventajosa frente a otros meacutetodos[11-13]

Los meacutetodos headspace aportan la informa-cioacuten sobre la composicioacuten quiacutemica de las frac-ciones volaacutetiles las teacutecnicas de destilacioacuten sobre aceites esenciales destilados o condensados mien-tras que los meacutetodos extractivos (solventes CO2 supercriacutetico) sobre la composicioacuten quiacutemica de mezclas que pueden incluir sustancias de baja volatilidad y mayor masa molecular (gt400 Da) que en general se denominan los extractos Las composiciones de estas mezclas pueden dife-renciarse no solamente cuantitativamente sino cualitativamente Tal como se mencionoacute ante-riormente en condensados y extractos prevale-

ceraacuten compuestos maacutes ldquopesadosrdquo aacutecidos grasos hidrocarburos parafiacutenicos de cadena larga sus alcoholes o aldehiacutedos mientras que en las frac-ciones volaacutetiles se encuentran compuestos de bajo peso molecular que ndasheventualmente- pue-den ldquoescaparrdquo durante la destilacioacuten en la etapa de despresurizacioacuten (SFE-CO2) o concentracioacuten de los extractos

La composicioacuten quiacutemica de la fraccioacuten volaacutetil de las flores depende tanto de factores intriacutensecos (geneacuteticos) de la especie como de factores extriacutensecos ambientales[14] El haacutebitat el ambiente donde crece la planta las condicio-nes (temperatura humedad luz tipo de suelo micronutrientes etc) en las cuales se monito-rean los metabolitos secundarios florales afec-taraacuten la composicioacuten cualitativa y cuantitativa de la fraccioacuten volaacutetil emitida y recolectada Por ello es muy importante durante la recoleccioacuten de volaacutetiles florales mantener las condiciones de monitoreo controladas constantes Muchiacutesimos factores externos afectaraacuten la produccioacuten de volaacute-tiles en la flor entre ellos figuran los cambios de la temperatura de la humedad el aumento o la disminucioacuten de la energiacutea lumiacutenica entre otros Algunas condiciones de estreacutes (hiacutedrico lumiacute-nico nutricional) pueden alterar notoriamente la generacioacuten de volaacutetiles florales o hasta suprimir su produccioacuten[15]

Algunos aspectos del estudio de las fra-gancias florales deben contemplar el estado de desarrollo de la flor[1617] Las flores del aacuterbol de ylang-ylang (Cananga odorata Hook Fil et Thomson forma genuina familia Annonaceae) son materia prima importante para la obtencioacuten de aceites esenciales y absolutos que son ingre-dientes valiosos en muchos perfumes jabones champuacutes lociones En el aacuterbol la flor permanece varias semanas mientras se madura inicia con una flor muy pequentildea verde que aumenta luego su tamantildeo permaneciendo varios diacuteas verde

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y luego se torna amarilla grande con puntos de color marroacuten En el mismo aacuterbol es comuacuten encontrar flores en diferentes grados de madu-racioacuten junto con los frutos que llevan semillas a traveacutes de las cuales se propaga esta especie vegetal La composicioacuten de volaacutetiles en la flor de ylang-ylang variacutea notoriamente con su estado de madurez En flores pequentildeas verdes se registran 10 veces menos componentes que en una flor amarilla madura En las flores de ylang-ylang maduras amarillas y completamente desarrolla-das se encuentran 16 y 4 veces maacutes sustancias oxigenadas livianas (p-metilanisol alcohol ben-ciacutelico 18-cineol benzoato y salicilato de metilo y etilo linalol nerol geraniol acetato de bencilo anetol acetato de cinamilo otros) y sustancias oxigenadas maacutes pesadas (sesquiterpenoles far-nesal farnesol nerolidol y sus acetatos cedrol benzoato y salicilato de bencilo otros) que en las flores verdes pequentildeas que empiezan su desar-rollo Los compuestos nitrogenados fenilaceto-nitrilo 4-metilbenzaldoxima indol 2-fenil-1-ni-troetano y antranilato de metilo solo aparecen en las flores maduras grandes y amarillas[1819]

La composicioacuten de los metabolitos secun-darios en la emisioacuten floral variacutea tambieacuten seguacuten la parte de la flor de donde se extraen los volaacute-tiles En los peacutetalos de las flores de ylang-ylang prevalecen los compuestos oxigenados (mono-terpenos oxigenados bencenoides y fenilpro-panoides) mientras que en los ovarios (parte central de la flor pequentildea y compacta) abundan los hidrocarburos monoterpeacutenicos y sequiterpeacute-nicos[20] La composicioacuten porcentual relativa de las familias de compuestos presentes en las flores de ylang-ylang depende del meacutetodo de su extrac-cioacuten la destilacioacuten con vapor o la destilacioacuten--extraccioacuten con solvente simultaacutenea (SDE por sus siglas en ingleacutes) permiten obtener mezclas de metabolitos secundarios ricas en compuestos oxigenados livianos (50-60) y en compuestos

oxigenados maacutes pesados (18-20) mientras que la extraccioacuten con fluido supercriacutetico SFE-CO2 aiacutesla extractos ricos en hidrocarburos alifaacuteticos (Cngt20) y terpeacutenicos compuestos nitrogenados y hasta algunos aacutecidos grasos (C14-C18)

[19]

El perfil de compuestos volaacutetiles emitidos por la flor depende tambieacuten de la hora del diacutea los insectos que la polinizan pueden ser diurnos o nocturnos y de ello dependeraacute tambieacuten la cineacutetica de emanacioacuten de compuestos fragantes y el tipo de los volaacutetiles emitidos por la flor que variacutean para la mayoriacutea de las flores con la hora del diacutea (ritmo circadiano) y seguacuten la funcioacuten bioloacutegica que cumplen Por ejemplo en las flores de ylang-ylang la cantidad de sustancias nitro-genadas cambia durante el diacutea es maacutexima en la madrugada disminuye despueacutes del mediodiacutea y vuelve a aumentar en las horas de la tarde y de la noche (Figura 1)

La fragancia de flores de Brugmansia suave-olens (Familia Solanaacutecea) sigue un claro ritmo circadiano la emisioacuten de volaacutetiles se incrementa por la tarde y alcanza su maacuteximo a las nueve de la noche luego la emisioacuten de volaacutetiles empieza lentamente a disminuir (Figura 2) en la mantildeana y durante el diacutea las flores casi no huelen aunque atraen masivamente las abejas[3] Es interesante anotar que algunas flores cambian su fragancia despueacutes de haber sido polinizadas esto sucede con las flores de algunas orquiacutedeas (Ophrys sphe-godes)[2122]

En la Tabla 1 se reuacutene la informacioacuten sobre las sustancias volaacutetiles emitidas por las flores de diferentes especies vegetales provenientes de distintos oriacutegenes (Aacutefrica Oriental Asia Arabia Ameacuterica del Sur Centroameacuterica o Meacutexico) y cultivadas en el Complejo Agroindustrial Piloto de CENIVAM (Bucaramanga Colombia) Los volaacutetiles se obtuvieron por HS-SPME usando la fibra de PDMSDVB (65 μm) expuesta a las flores frescas (ca 20 g) recieacuten cortadas colo-

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cadas en un recipiente sellado (22 mL) a 40 degC durante 30 min con el tiempo de pre-equilibrio de 15 min En experimentos previos se ha deter-minado que las mejores recuperaciones (aacuterea cromatograacutefica total maacutes alta) de volaacutetiles se obtienen en su orden creciente con las fibras asiacute PA (85 μm) lt PDMS (100 μm) lt PDMSDVB (65 μm) asymp CARPDMS (65 μm) Con tiempos de exposicioacuten de la fibra cortos (2-5 min) solo se logra recuperar aldehiacutedos y alcoholes volaacutetiles e hidrocarburos monoterpeacutenicos con tiempos

de exposicioacuten maacutes prolongados (20-40 min) en la fraccioacuten volaacutetil se registran tambieacuten bence-noides fenilpropanoides monoterpenos oxige-nados y sesquiterpenoides junto con parafinas (Cngt13) y sus anaacutelogos insaturados aldehiacutedos y alcoholes de cadena maacutes larga (Cngt13) sustan-cias nitrogenados indoles y antranilatos A pesar de que las flores pertenecen a plantas de geacuteneros diferentes varios componentes volaacutetiles en sus emisiones florales son los mismos (Tabla 1) La diversidad en la composicioacuten se aprecia en que entre los 115 compuestos diferentes que apare-cen en la Tabla 1 el 51 de los compuestos apa-rece en solamente 1 de las especies el 31 apa-rece en 2 especies 10 en 3 35 en 4 y 35 en 5 especies En una comparacioacuten hecha entre 165 artiacuteculos cientiacuteficos sobre composicioacuten de fragancias florales se encontroacute que la rosa fue la flor maacutes estudiada (21 publicaciones) seguida por la petunia (10) y el jazmiacuten (6) entre 73 flo-res diferentes objeto de estos estudios[2] El linalol fue el constituyente volaacutetil encontrado maacutes fre-cuentemente (24 especies) seguido del 2-feni-letanol (19 especies) el geraniol el β-ocimeno el germacreno D y el citronelol (9 especies) La microextraccioacuten en fase soacutelida fue la teacutecnica de aislamiento de sustancias volaacutetiles maacutes comuacuten en estos artiacuteculos (33) seguida del muestreo hea-dspace (22) la extraccioacuten con solventes (16) y la destilacioacuten (13)

4 Anaacutelisis cromatograacutefico de fragancias florales

Las sustancias que conforman la fraccioacuten volaacutetil aislada de las flores son de bajo peso molecular (lt300 Da) y conforman mezclas de componentes con diversa polaridad y concentra-cioacuten gracias a la naturaleza de los compuestos volaacutetiles su anaacutelisis se hace por cromatografiacutea de gases (GC) Debido a la complejidad de algunas

Figura 1 Cromatograma tiacutepico de los metabolitos secundarios volaacutetiles de flores de ylang-ylang (solo se registran compuestos nitrogenados) monitoreados a diferentes horas del diacutea Columna DB-1 (60 m) Detector selectivo de nitroacutegeno y foacutesforo NPD

Figura 2 Perfil cromatograacutefico de los metabolitos secundarios volaacutetiles de flores de Brugmansia suaveolens (familia Solanaacutecea) aislados por HS-SPME y el cambio de la cantidad de volaacutetiles emitidos por la flor (aacuterea cromatograacutefica total GC-FID) en funcioacuten de la hora del diacutea

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mezclas de volaacutetiles aislados de flores y a la pre-sencia en ellas de sustancias isomeacutericas (isome-riacutea geomeacutetrica de posicioacuten estereoisomeriacutea) se recomienda hacer su anaacutelisis en columnas capi-lares de siacutelice fundida preferiblemente largas de 50 o 60 m con diaacutemetros internos (DI) de 025 022 o 020 mm Los diaacutemetros internos meno-res aunque permiten aumentar la resolucioacuten eventualmente pueden comprometer tambieacuten la sensibilidad Se usan columnas con el grosor de la fase estacionaria (df) igual o mayor de 025 μm todo ello para que la forma de picos su sepa-racioacuten y la sensibilidad necesaria para su detec-cioacuten reproducible sean adecuadas

Generalmente para la inyeccioacuten de la mues-tra (Tdeg del inyector usualmente de 230-250degC) se puede usar la relacioacuten de split de 130 pero cuando las concentraciones de algunos com-ponentes de intereacutes son bajas es conveniente la inyeccioacuten en modo splitless Cuando se emplea el modo de inyeccioacuten splitless para disminuir la ldquodispersioacutenrdquo o el ensanchamiento de los picos de sustancias muy volaacutetiles se puede hacer la inyec-cioacuten en el modo de splitless pulsado es cuando la presioacuten de entrada del gas de arrastre durante la transferencia de la muestra por el liner se incre-menta unas 2-3 veces Teniendo en cuenta la presencia de algunas sustancias termolaacutebiles la inyeccioacuten on-column o con la programacioacuten de temperatura (con PTV programmed-temperature vaporizer por sus siglas en ingleacutes) podriacutea ser una buena alternativa

Para el anaacutelisis de las fracciones volaacutetiles la temperatura inicial de la columna de 35-50degC seriacutea la recomendable la naturaleza de la muestra (compuestos volaacutetiles) no exige que la tempera-tura final de la columna sea alta la de 200-250degC seraacute suficiente para eluir los componentes maacutes retenidos La velocidad de calentamiento de la columna es funcioacuten de su longitud a mayor lon-gitud maacutes lentamente hay que calentar la colu-

mna 3-4degCmin pero si se usan columnas maacutes cortas eg de 30 m se podriacutea ir incrementando la temperatura de la columna maacutes raacutepidamente a razoacuten de 5-7degCmin Por supuesto el proceso de programacioacuten de la temperatura en la colu-mna es optimizable depende de la complejidad de la mezcla de sustancias a analizar (nuacutemero de componentes isomeriacutea o similitud estructural) su naturaleza (polaridad peso molecular) las dimensiones de la columna (L DI) el tipo de la fase estacionaria (polaridad) y su grosor (df)

Para el anaacutelisis de la fraccioacuten volaacutetil floral se usan en combinacioacuten dos columnas una con la fase estacionaria polar poli(etilenglicol) (eg INNOWAX DB-WAX HP-20M otras) y la otra con la fase estacionaria apolar poli(dimetilsiloxano) (HP-1 Ultra 1 DB-1 BP-1 otras) o 5-fenil poli(dimetilsiloxano) (HP-5 DB-5 Ultra 2 CPSil 5 BP-5 otras) En la Figura 3 se pueden observar perfiles cromato-graacuteficos de la fragancia de flores de cafeacute (Coffea arabica Fam Rubiaacutecea) aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm temperatura - 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) obtenidos por GC-MS en columnas de diferente polaridad

La cromatografiacutea de gases enantioselectiva aprovecha el hecho de que los enantioacutemeros poseen tiempos de retencioacuten diferentes cuando en la fase estacionaria se insertan compuestos que pueden formar aductos cuya estabilidad es funcioacuten de la forma tridimensional del analito Las ciclodextrinas con su geometriacutea de cono con cavidad de diferente tamantildeo han resultado ser agentes quirales muy efectivos al constituir complejos de inclusioacuten que permiten discri-minar isoacutemeros seguacuten su forma Las fragancias de jazmiacuten (Jasminum grandiflorum) y otras flo-res (Osmanthus fragrans Boronia megastima) contienen una mezcla de estereoisoacutemeros del jasmonato de metilo Wilfred Koumlnig reportoacute la separacioacuten de todos los isoacutemeros por medio de

Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

20 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

cromatografiacutea de gases preparativa en la que uti-lizoacute columnas empacadas con ciclodextrinas[23] Esto permitioacute confirmar la estimacioacuten hecha por Acree y Barnard de que el isoacutemero (+)-epi-jas-monato de metilo tiene un umbral de olor unas 500 veces maacutes bajo que el del isoacutemero mayorita-rio el (-)-jasmonato de metilo[24]

Los aldehiacutedos y alcoholes lilac son monoterpenos oxigenados que se encuen-tran en especies vegetales de muchas familias Lamiaceae (Origanum vulgare[25]) Orchidaceae (Platanthera sp[26]) Rosaceae (Prunus padus[27]) y Rubiaceae (Cephalanthus occidentalis[25]) son algunos ejemplos de estas familias Cada una de las moleacuteculas lilac posee 3 carbonos quirales lo

que da lugar a 8 estereoisoacutemeros del aldehiacutedo y 8 estereoisoacutemeros del alcohol lilac Doumltterl et al[28] lograron separar todos los isoacutemeros del aldehiacutedo y 7 isoacutemeros del alcohol lilac por medio de un sistema de cromatografiacutea de gases bidimensional en el que una columna capilar de 30 m con fase estacionaria de 5-fenil polimetilsiloxano fue unida por medio de una vaacutelvula T a un detec-tor selectivo de masas y a otra columna capilar de 30 m con una fase estacionaria formada por fenil-poli(dimetilsiloxano) (70) y un derivado de ciclodextrina (30) Cada columna tuvo un horno independiente Este sistema se modificoacute para convertirlo en cromatografiacutea microprepara-tiva La salida de la segunda columna se conectoacute

Figura 3 Cromatogramas tiacutepicos de la fragancia de flores de cafeacute aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) A Columna cromatograacutefica apolar DB-5MS (60 m x 025 mm x 025 mm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) B Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten deficiente de limoneno (LRI = 1030) alcohol benciacutelico (LRI = 1031) y 18-cineol (LRI = 1032) C Columna cromatograacutefica polar DB-WAX (60 m x 025 mm x 025 μm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) D Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten mejor de limoneno y 18-cineol el alcohol benciacutelico tiene un tiempo de retencioacuten mucho maacutes largo (tR =341 min LRI = 1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno tal como sucede en la columna apolar (B)

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 21

a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

22 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 23

es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

Referencias

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Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 9

de compuestos que contienen aacutetomos de azufre o nitroacutegeno provenientes probablemente del metabolismo de aminoaacutecidos entre estos meta-bolitos secundarios volaacutetiles figuran compuestos con grupo nitro indoles oximas nitrilos antra-nilatos y sulfuros entre los maacutes comunes

3 Meacutetodos de obtencioacuten de fragancias florales

Antes de proceder a recolectar los volaacutetiles de flores es importante establecer si su monito-reo se haraacute in vivo (en el campo) o ex vivo El montaje experimental para cada propoacutesito seraacute diferente Algunas teacutecnicas de extraccioacuten no son aplicables en el campo para monitoreo de flores in vivo Es importante tambieacuten tener conoci-miento previo sobre la cantidad de volaacutetiles que emite la flor ya que de la cantidad dependeraacute el sistema de extraccioacuten y concentracioacuten empleado El buqueacute de sustancias volaacutetiles producidas por las flores puede tener de uno a maacutes de cien com-puestos pero generalmente contiene de 20 a 60 sustancias diferentes[1] La cantidad de volaacutetiles emitidos va desde los niveles bajos de picogra-mos hasta maacutes de 30 μgL[8] Algunos meacutetodos de recoleccioacuten de volaacutetiles florales pueden tener un disentildeo automatizado que permite el monitoreo durante 24 horas o por periodos maacutes largos Sin embargo la mayoriacutea de las teacutecnicas de extraccioacuten hacen una captura momentaacutenea un ldquosnapshotrdquo de los volaacutetiles florales emitidos[910]

Los meacutetodos de extraccioacuten de los metabo-litos secundarios volaacutetiles de las flores se pue-den dividir en tres categoriacuteas grandes a saber (I) Teacutecnicas de headspace (headspace HS por sus siglas en ingleacutes o espacio de cabeza) en modos estaacutetico o dinaacutemico (II) Teacutecnicas desti-lativas entre ellas destilacioacuten por arrastre con vapor destilacioacuten con agua-vapor hidrodestila-cioacuten hidrodestilacioacuten asistida por la radiacioacuten

tante para entender la interaccioacuten planta-insecto las estrategias quiacutemicas para atraer los poliniza-dores pero tambieacuten para disuadir a los herbiacutevo-ros y enfrentar a los patoacutegenos para adaptarse a diferentes estreses abioacuteticos para estudiar las rutas bioquiacutemicas de formacioacuten de metaboli-tos secundarios en una planta su capacidad de adaptacioacuten y la evolucioacuten bioloacutegica Tambieacuten es de intereacutes praacutectico conocer la composicioacuten flo-ral como fuente de inspiracioacuten para crear nuevas fragancias y mezclas odoriacuteferas que se usan en las industrias de cosmeacuteticos perfumes produc-tos de higiene personal o en la aromaterapia

Las fragancias florales de diferentes plantas a pesar de tener un olor diferente y a menudo distintivo y diferenciador entre especies y varie-dades vegetales poseen muchos compuestos comunes Entre estos conforman un grupo grande los terpenoides monoterpenos sesqui-terpenos diterpenos y terpenos irregulares y sus anaacutelogos oxigenados Entre los maacutes frecuentes figuran monoterpenos oxigenados alcoholes linalol mentol geraniol nerol y sus acetatos cetonas carvona mentona verbenona aldehiacute-dos citral (geranial y neral sus oacutexidos) hidro-carburos monoterpeacutenicos pinenos ocimenos carenos terpinenos limoneno p-cimeno se encuentran tambieacuten sesquiterpenoides entre los cuales se pueden mencionar cariofileno farne-seno bisaboleno cadineno cubebeno elemeno germacreno y sus isoacutemeros estructurales oacutexidos y alcoholes eg oacutexido de cariofileno alcoholes farnesol nerolidol y sus eacutesteres La familia maacutes grande en la fragancia floral tal vez estaacute confor-mada por los hidrocarburos alifaacuteticos C1-C30 (maacutes frecuentes C13-C21) y olefiacutenicos y algunas cicloparafinas Estas sustancias junto con los aacuteci-dos grasos C12-C22 forman parte de la capa pro-tectora de cera que reviste los peacutetalos de muchas flores Una nota odoriacutefera distintiva en la fragan-cia floral se debe a la presencia en sus mezclas

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de microondas y (III) Teacutecnicas extractivas que emplean disolventes de diferente naturaleza eg grasas (maceracioacuten enfleurage obtencioacuten de pomadas) disolventes apolares (hidrocarbu-ros obtencioacuten de concretos) disolventes pola-res (alcoholes obtencioacuten de absolutos) y fluidos supercriacuteticos (principalmente CO2) Las teacutecni-cas de espacio de cabeza (HS) se emplean en dos ldquoformatosrdquo diferentes headspace estaacutetico (S-HS) y headspace dinaacutemico eg purga y trampa (PampT) Hoy en diacutea la teacutecnica maacutes popular para el anaacute-lisis de fragancias florales es la micro-extraccioacuten en fase soacutelida (SPME por sus siglas en ingleacutes) operada en espacio de cabeza HS-SPME[4] Este meacutetodo de extraccioacuten sobre un adsorbente poli-meacuterico -que reviste una fibra de siacutelice fundida- combina la alta selectividad de extraccioacuten que se logra con la escogencia del poliacutemero su natu-raleza quiacutemica y el grosor y la optimizacioacuten de condiciones de muestreo (voluacutemenes del mate-rial y de espacio de cabeza temperaturas tiem-pos de pre-equilibrio y de exposicioacuten de la fibra modos de agitacioacuten de la muestra aditivos etc) con la concentracioacuten de analitos sobre la fibra La extraccioacuten y la concentracioacuten simultaacutenea de la muestra son procesos que destacan a la teacutecnica SPME y la hacen muy ventajosa frente a otros meacutetodos[11-13]

Los meacutetodos headspace aportan la informa-cioacuten sobre la composicioacuten quiacutemica de las frac-ciones volaacutetiles las teacutecnicas de destilacioacuten sobre aceites esenciales destilados o condensados mien-tras que los meacutetodos extractivos (solventes CO2 supercriacutetico) sobre la composicioacuten quiacutemica de mezclas que pueden incluir sustancias de baja volatilidad y mayor masa molecular (gt400 Da) que en general se denominan los extractos Las composiciones de estas mezclas pueden dife-renciarse no solamente cuantitativamente sino cualitativamente Tal como se mencionoacute ante-riormente en condensados y extractos prevale-

ceraacuten compuestos maacutes ldquopesadosrdquo aacutecidos grasos hidrocarburos parafiacutenicos de cadena larga sus alcoholes o aldehiacutedos mientras que en las frac-ciones volaacutetiles se encuentran compuestos de bajo peso molecular que ndasheventualmente- pue-den ldquoescaparrdquo durante la destilacioacuten en la etapa de despresurizacioacuten (SFE-CO2) o concentracioacuten de los extractos

La composicioacuten quiacutemica de la fraccioacuten volaacutetil de las flores depende tanto de factores intriacutensecos (geneacuteticos) de la especie como de factores extriacutensecos ambientales[14] El haacutebitat el ambiente donde crece la planta las condicio-nes (temperatura humedad luz tipo de suelo micronutrientes etc) en las cuales se monito-rean los metabolitos secundarios florales afec-taraacuten la composicioacuten cualitativa y cuantitativa de la fraccioacuten volaacutetil emitida y recolectada Por ello es muy importante durante la recoleccioacuten de volaacutetiles florales mantener las condiciones de monitoreo controladas constantes Muchiacutesimos factores externos afectaraacuten la produccioacuten de volaacute-tiles en la flor entre ellos figuran los cambios de la temperatura de la humedad el aumento o la disminucioacuten de la energiacutea lumiacutenica entre otros Algunas condiciones de estreacutes (hiacutedrico lumiacute-nico nutricional) pueden alterar notoriamente la generacioacuten de volaacutetiles florales o hasta suprimir su produccioacuten[15]

Algunos aspectos del estudio de las fra-gancias florales deben contemplar el estado de desarrollo de la flor[1617] Las flores del aacuterbol de ylang-ylang (Cananga odorata Hook Fil et Thomson forma genuina familia Annonaceae) son materia prima importante para la obtencioacuten de aceites esenciales y absolutos que son ingre-dientes valiosos en muchos perfumes jabones champuacutes lociones En el aacuterbol la flor permanece varias semanas mientras se madura inicia con una flor muy pequentildea verde que aumenta luego su tamantildeo permaneciendo varios diacuteas verde

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 11

y luego se torna amarilla grande con puntos de color marroacuten En el mismo aacuterbol es comuacuten encontrar flores en diferentes grados de madu-racioacuten junto con los frutos que llevan semillas a traveacutes de las cuales se propaga esta especie vegetal La composicioacuten de volaacutetiles en la flor de ylang-ylang variacutea notoriamente con su estado de madurez En flores pequentildeas verdes se registran 10 veces menos componentes que en una flor amarilla madura En las flores de ylang-ylang maduras amarillas y completamente desarrolla-das se encuentran 16 y 4 veces maacutes sustancias oxigenadas livianas (p-metilanisol alcohol ben-ciacutelico 18-cineol benzoato y salicilato de metilo y etilo linalol nerol geraniol acetato de bencilo anetol acetato de cinamilo otros) y sustancias oxigenadas maacutes pesadas (sesquiterpenoles far-nesal farnesol nerolidol y sus acetatos cedrol benzoato y salicilato de bencilo otros) que en las flores verdes pequentildeas que empiezan su desar-rollo Los compuestos nitrogenados fenilaceto-nitrilo 4-metilbenzaldoxima indol 2-fenil-1-ni-troetano y antranilato de metilo solo aparecen en las flores maduras grandes y amarillas[1819]

La composicioacuten de los metabolitos secun-darios en la emisioacuten floral variacutea tambieacuten seguacuten la parte de la flor de donde se extraen los volaacute-tiles En los peacutetalos de las flores de ylang-ylang prevalecen los compuestos oxigenados (mono-terpenos oxigenados bencenoides y fenilpro-panoides) mientras que en los ovarios (parte central de la flor pequentildea y compacta) abundan los hidrocarburos monoterpeacutenicos y sequiterpeacute-nicos[20] La composicioacuten porcentual relativa de las familias de compuestos presentes en las flores de ylang-ylang depende del meacutetodo de su extrac-cioacuten la destilacioacuten con vapor o la destilacioacuten--extraccioacuten con solvente simultaacutenea (SDE por sus siglas en ingleacutes) permiten obtener mezclas de metabolitos secundarios ricas en compuestos oxigenados livianos (50-60) y en compuestos

oxigenados maacutes pesados (18-20) mientras que la extraccioacuten con fluido supercriacutetico SFE-CO2 aiacutesla extractos ricos en hidrocarburos alifaacuteticos (Cngt20) y terpeacutenicos compuestos nitrogenados y hasta algunos aacutecidos grasos (C14-C18)

[19]

El perfil de compuestos volaacutetiles emitidos por la flor depende tambieacuten de la hora del diacutea los insectos que la polinizan pueden ser diurnos o nocturnos y de ello dependeraacute tambieacuten la cineacutetica de emanacioacuten de compuestos fragantes y el tipo de los volaacutetiles emitidos por la flor que variacutean para la mayoriacutea de las flores con la hora del diacutea (ritmo circadiano) y seguacuten la funcioacuten bioloacutegica que cumplen Por ejemplo en las flores de ylang-ylang la cantidad de sustancias nitro-genadas cambia durante el diacutea es maacutexima en la madrugada disminuye despueacutes del mediodiacutea y vuelve a aumentar en las horas de la tarde y de la noche (Figura 1)

La fragancia de flores de Brugmansia suave-olens (Familia Solanaacutecea) sigue un claro ritmo circadiano la emisioacuten de volaacutetiles se incrementa por la tarde y alcanza su maacuteximo a las nueve de la noche luego la emisioacuten de volaacutetiles empieza lentamente a disminuir (Figura 2) en la mantildeana y durante el diacutea las flores casi no huelen aunque atraen masivamente las abejas[3] Es interesante anotar que algunas flores cambian su fragancia despueacutes de haber sido polinizadas esto sucede con las flores de algunas orquiacutedeas (Ophrys sphe-godes)[2122]

En la Tabla 1 se reuacutene la informacioacuten sobre las sustancias volaacutetiles emitidas por las flores de diferentes especies vegetales provenientes de distintos oriacutegenes (Aacutefrica Oriental Asia Arabia Ameacuterica del Sur Centroameacuterica o Meacutexico) y cultivadas en el Complejo Agroindustrial Piloto de CENIVAM (Bucaramanga Colombia) Los volaacutetiles se obtuvieron por HS-SPME usando la fibra de PDMSDVB (65 μm) expuesta a las flores frescas (ca 20 g) recieacuten cortadas colo-

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cadas en un recipiente sellado (22 mL) a 40 degC durante 30 min con el tiempo de pre-equilibrio de 15 min En experimentos previos se ha deter-minado que las mejores recuperaciones (aacuterea cromatograacutefica total maacutes alta) de volaacutetiles se obtienen en su orden creciente con las fibras asiacute PA (85 μm) lt PDMS (100 μm) lt PDMSDVB (65 μm) asymp CARPDMS (65 μm) Con tiempos de exposicioacuten de la fibra cortos (2-5 min) solo se logra recuperar aldehiacutedos y alcoholes volaacutetiles e hidrocarburos monoterpeacutenicos con tiempos

de exposicioacuten maacutes prolongados (20-40 min) en la fraccioacuten volaacutetil se registran tambieacuten bence-noides fenilpropanoides monoterpenos oxige-nados y sesquiterpenoides junto con parafinas (Cngt13) y sus anaacutelogos insaturados aldehiacutedos y alcoholes de cadena maacutes larga (Cngt13) sustan-cias nitrogenados indoles y antranilatos A pesar de que las flores pertenecen a plantas de geacuteneros diferentes varios componentes volaacutetiles en sus emisiones florales son los mismos (Tabla 1) La diversidad en la composicioacuten se aprecia en que entre los 115 compuestos diferentes que apare-cen en la Tabla 1 el 51 de los compuestos apa-rece en solamente 1 de las especies el 31 apa-rece en 2 especies 10 en 3 35 en 4 y 35 en 5 especies En una comparacioacuten hecha entre 165 artiacuteculos cientiacuteficos sobre composicioacuten de fragancias florales se encontroacute que la rosa fue la flor maacutes estudiada (21 publicaciones) seguida por la petunia (10) y el jazmiacuten (6) entre 73 flo-res diferentes objeto de estos estudios[2] El linalol fue el constituyente volaacutetil encontrado maacutes fre-cuentemente (24 especies) seguido del 2-feni-letanol (19 especies) el geraniol el β-ocimeno el germacreno D y el citronelol (9 especies) La microextraccioacuten en fase soacutelida fue la teacutecnica de aislamiento de sustancias volaacutetiles maacutes comuacuten en estos artiacuteculos (33) seguida del muestreo hea-dspace (22) la extraccioacuten con solventes (16) y la destilacioacuten (13)

4 Anaacutelisis cromatograacutefico de fragancias florales

Las sustancias que conforman la fraccioacuten volaacutetil aislada de las flores son de bajo peso molecular (lt300 Da) y conforman mezclas de componentes con diversa polaridad y concentra-cioacuten gracias a la naturaleza de los compuestos volaacutetiles su anaacutelisis se hace por cromatografiacutea de gases (GC) Debido a la complejidad de algunas

Figura 1 Cromatograma tiacutepico de los metabolitos secundarios volaacutetiles de flores de ylang-ylang (solo se registran compuestos nitrogenados) monitoreados a diferentes horas del diacutea Columna DB-1 (60 m) Detector selectivo de nitroacutegeno y foacutesforo NPD

Figura 2 Perfil cromatograacutefico de los metabolitos secundarios volaacutetiles de flores de Brugmansia suaveolens (familia Solanaacutecea) aislados por HS-SPME y el cambio de la cantidad de volaacutetiles emitidos por la flor (aacuterea cromatograacutefica total GC-FID) en funcioacuten de la hora del diacutea

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mezclas de volaacutetiles aislados de flores y a la pre-sencia en ellas de sustancias isomeacutericas (isome-riacutea geomeacutetrica de posicioacuten estereoisomeriacutea) se recomienda hacer su anaacutelisis en columnas capi-lares de siacutelice fundida preferiblemente largas de 50 o 60 m con diaacutemetros internos (DI) de 025 022 o 020 mm Los diaacutemetros internos meno-res aunque permiten aumentar la resolucioacuten eventualmente pueden comprometer tambieacuten la sensibilidad Se usan columnas con el grosor de la fase estacionaria (df) igual o mayor de 025 μm todo ello para que la forma de picos su sepa-racioacuten y la sensibilidad necesaria para su detec-cioacuten reproducible sean adecuadas

Generalmente para la inyeccioacuten de la mues-tra (Tdeg del inyector usualmente de 230-250degC) se puede usar la relacioacuten de split de 130 pero cuando las concentraciones de algunos com-ponentes de intereacutes son bajas es conveniente la inyeccioacuten en modo splitless Cuando se emplea el modo de inyeccioacuten splitless para disminuir la ldquodispersioacutenrdquo o el ensanchamiento de los picos de sustancias muy volaacutetiles se puede hacer la inyec-cioacuten en el modo de splitless pulsado es cuando la presioacuten de entrada del gas de arrastre durante la transferencia de la muestra por el liner se incre-menta unas 2-3 veces Teniendo en cuenta la presencia de algunas sustancias termolaacutebiles la inyeccioacuten on-column o con la programacioacuten de temperatura (con PTV programmed-temperature vaporizer por sus siglas en ingleacutes) podriacutea ser una buena alternativa

Para el anaacutelisis de las fracciones volaacutetiles la temperatura inicial de la columna de 35-50degC seriacutea la recomendable la naturaleza de la muestra (compuestos volaacutetiles) no exige que la tempera-tura final de la columna sea alta la de 200-250degC seraacute suficiente para eluir los componentes maacutes retenidos La velocidad de calentamiento de la columna es funcioacuten de su longitud a mayor lon-gitud maacutes lentamente hay que calentar la colu-

mna 3-4degCmin pero si se usan columnas maacutes cortas eg de 30 m se podriacutea ir incrementando la temperatura de la columna maacutes raacutepidamente a razoacuten de 5-7degCmin Por supuesto el proceso de programacioacuten de la temperatura en la colu-mna es optimizable depende de la complejidad de la mezcla de sustancias a analizar (nuacutemero de componentes isomeriacutea o similitud estructural) su naturaleza (polaridad peso molecular) las dimensiones de la columna (L DI) el tipo de la fase estacionaria (polaridad) y su grosor (df)

Para el anaacutelisis de la fraccioacuten volaacutetil floral se usan en combinacioacuten dos columnas una con la fase estacionaria polar poli(etilenglicol) (eg INNOWAX DB-WAX HP-20M otras) y la otra con la fase estacionaria apolar poli(dimetilsiloxano) (HP-1 Ultra 1 DB-1 BP-1 otras) o 5-fenil poli(dimetilsiloxano) (HP-5 DB-5 Ultra 2 CPSil 5 BP-5 otras) En la Figura 3 se pueden observar perfiles cromato-graacuteficos de la fragancia de flores de cafeacute (Coffea arabica Fam Rubiaacutecea) aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm temperatura - 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) obtenidos por GC-MS en columnas de diferente polaridad

La cromatografiacutea de gases enantioselectiva aprovecha el hecho de que los enantioacutemeros poseen tiempos de retencioacuten diferentes cuando en la fase estacionaria se insertan compuestos que pueden formar aductos cuya estabilidad es funcioacuten de la forma tridimensional del analito Las ciclodextrinas con su geometriacutea de cono con cavidad de diferente tamantildeo han resultado ser agentes quirales muy efectivos al constituir complejos de inclusioacuten que permiten discri-minar isoacutemeros seguacuten su forma Las fragancias de jazmiacuten (Jasminum grandiflorum) y otras flo-res (Osmanthus fragrans Boronia megastima) contienen una mezcla de estereoisoacutemeros del jasmonato de metilo Wilfred Koumlnig reportoacute la separacioacuten de todos los isoacutemeros por medio de

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cromatografiacutea de gases preparativa en la que uti-lizoacute columnas empacadas con ciclodextrinas[23] Esto permitioacute confirmar la estimacioacuten hecha por Acree y Barnard de que el isoacutemero (+)-epi-jas-monato de metilo tiene un umbral de olor unas 500 veces maacutes bajo que el del isoacutemero mayorita-rio el (-)-jasmonato de metilo[24]

Los aldehiacutedos y alcoholes lilac son monoterpenos oxigenados que se encuen-tran en especies vegetales de muchas familias Lamiaceae (Origanum vulgare[25]) Orchidaceae (Platanthera sp[26]) Rosaceae (Prunus padus[27]) y Rubiaceae (Cephalanthus occidentalis[25]) son algunos ejemplos de estas familias Cada una de las moleacuteculas lilac posee 3 carbonos quirales lo

que da lugar a 8 estereoisoacutemeros del aldehiacutedo y 8 estereoisoacutemeros del alcohol lilac Doumltterl et al[28] lograron separar todos los isoacutemeros del aldehiacutedo y 7 isoacutemeros del alcohol lilac por medio de un sistema de cromatografiacutea de gases bidimensional en el que una columna capilar de 30 m con fase estacionaria de 5-fenil polimetilsiloxano fue unida por medio de una vaacutelvula T a un detec-tor selectivo de masas y a otra columna capilar de 30 m con una fase estacionaria formada por fenil-poli(dimetilsiloxano) (70) y un derivado de ciclodextrina (30) Cada columna tuvo un horno independiente Este sistema se modificoacute para convertirlo en cromatografiacutea microprepara-tiva La salida de la segunda columna se conectoacute

Figura 3 Cromatogramas tiacutepicos de la fragancia de flores de cafeacute aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) A Columna cromatograacutefica apolar DB-5MS (60 m x 025 mm x 025 mm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) B Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten deficiente de limoneno (LRI = 1030) alcohol benciacutelico (LRI = 1031) y 18-cineol (LRI = 1032) C Columna cromatograacutefica polar DB-WAX (60 m x 025 mm x 025 μm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) D Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten mejor de limoneno y 18-cineol el alcohol benciacutelico tiene un tiempo de retencioacuten mucho maacutes largo (tR =341 min LRI = 1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno tal como sucede en la columna apolar (B)

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a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

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Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

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es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

Referencias

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de microondas y (III) Teacutecnicas extractivas que emplean disolventes de diferente naturaleza eg grasas (maceracioacuten enfleurage obtencioacuten de pomadas) disolventes apolares (hidrocarbu-ros obtencioacuten de concretos) disolventes pola-res (alcoholes obtencioacuten de absolutos) y fluidos supercriacuteticos (principalmente CO2) Las teacutecni-cas de espacio de cabeza (HS) se emplean en dos ldquoformatosrdquo diferentes headspace estaacutetico (S-HS) y headspace dinaacutemico eg purga y trampa (PampT) Hoy en diacutea la teacutecnica maacutes popular para el anaacute-lisis de fragancias florales es la micro-extraccioacuten en fase soacutelida (SPME por sus siglas en ingleacutes) operada en espacio de cabeza HS-SPME[4] Este meacutetodo de extraccioacuten sobre un adsorbente poli-meacuterico -que reviste una fibra de siacutelice fundida- combina la alta selectividad de extraccioacuten que se logra con la escogencia del poliacutemero su natu-raleza quiacutemica y el grosor y la optimizacioacuten de condiciones de muestreo (voluacutemenes del mate-rial y de espacio de cabeza temperaturas tiem-pos de pre-equilibrio y de exposicioacuten de la fibra modos de agitacioacuten de la muestra aditivos etc) con la concentracioacuten de analitos sobre la fibra La extraccioacuten y la concentracioacuten simultaacutenea de la muestra son procesos que destacan a la teacutecnica SPME y la hacen muy ventajosa frente a otros meacutetodos[11-13]

Los meacutetodos headspace aportan la informa-cioacuten sobre la composicioacuten quiacutemica de las frac-ciones volaacutetiles las teacutecnicas de destilacioacuten sobre aceites esenciales destilados o condensados mien-tras que los meacutetodos extractivos (solventes CO2 supercriacutetico) sobre la composicioacuten quiacutemica de mezclas que pueden incluir sustancias de baja volatilidad y mayor masa molecular (gt400 Da) que en general se denominan los extractos Las composiciones de estas mezclas pueden dife-renciarse no solamente cuantitativamente sino cualitativamente Tal como se mencionoacute ante-riormente en condensados y extractos prevale-

ceraacuten compuestos maacutes ldquopesadosrdquo aacutecidos grasos hidrocarburos parafiacutenicos de cadena larga sus alcoholes o aldehiacutedos mientras que en las frac-ciones volaacutetiles se encuentran compuestos de bajo peso molecular que ndasheventualmente- pue-den ldquoescaparrdquo durante la destilacioacuten en la etapa de despresurizacioacuten (SFE-CO2) o concentracioacuten de los extractos

La composicioacuten quiacutemica de la fraccioacuten volaacutetil de las flores depende tanto de factores intriacutensecos (geneacuteticos) de la especie como de factores extriacutensecos ambientales[14] El haacutebitat el ambiente donde crece la planta las condicio-nes (temperatura humedad luz tipo de suelo micronutrientes etc) en las cuales se monito-rean los metabolitos secundarios florales afec-taraacuten la composicioacuten cualitativa y cuantitativa de la fraccioacuten volaacutetil emitida y recolectada Por ello es muy importante durante la recoleccioacuten de volaacutetiles florales mantener las condiciones de monitoreo controladas constantes Muchiacutesimos factores externos afectaraacuten la produccioacuten de volaacute-tiles en la flor entre ellos figuran los cambios de la temperatura de la humedad el aumento o la disminucioacuten de la energiacutea lumiacutenica entre otros Algunas condiciones de estreacutes (hiacutedrico lumiacute-nico nutricional) pueden alterar notoriamente la generacioacuten de volaacutetiles florales o hasta suprimir su produccioacuten[15]

Algunos aspectos del estudio de las fra-gancias florales deben contemplar el estado de desarrollo de la flor[1617] Las flores del aacuterbol de ylang-ylang (Cananga odorata Hook Fil et Thomson forma genuina familia Annonaceae) son materia prima importante para la obtencioacuten de aceites esenciales y absolutos que son ingre-dientes valiosos en muchos perfumes jabones champuacutes lociones En el aacuterbol la flor permanece varias semanas mientras se madura inicia con una flor muy pequentildea verde que aumenta luego su tamantildeo permaneciendo varios diacuteas verde

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y luego se torna amarilla grande con puntos de color marroacuten En el mismo aacuterbol es comuacuten encontrar flores en diferentes grados de madu-racioacuten junto con los frutos que llevan semillas a traveacutes de las cuales se propaga esta especie vegetal La composicioacuten de volaacutetiles en la flor de ylang-ylang variacutea notoriamente con su estado de madurez En flores pequentildeas verdes se registran 10 veces menos componentes que en una flor amarilla madura En las flores de ylang-ylang maduras amarillas y completamente desarrolla-das se encuentran 16 y 4 veces maacutes sustancias oxigenadas livianas (p-metilanisol alcohol ben-ciacutelico 18-cineol benzoato y salicilato de metilo y etilo linalol nerol geraniol acetato de bencilo anetol acetato de cinamilo otros) y sustancias oxigenadas maacutes pesadas (sesquiterpenoles far-nesal farnesol nerolidol y sus acetatos cedrol benzoato y salicilato de bencilo otros) que en las flores verdes pequentildeas que empiezan su desar-rollo Los compuestos nitrogenados fenilaceto-nitrilo 4-metilbenzaldoxima indol 2-fenil-1-ni-troetano y antranilato de metilo solo aparecen en las flores maduras grandes y amarillas[1819]

La composicioacuten de los metabolitos secun-darios en la emisioacuten floral variacutea tambieacuten seguacuten la parte de la flor de donde se extraen los volaacute-tiles En los peacutetalos de las flores de ylang-ylang prevalecen los compuestos oxigenados (mono-terpenos oxigenados bencenoides y fenilpro-panoides) mientras que en los ovarios (parte central de la flor pequentildea y compacta) abundan los hidrocarburos monoterpeacutenicos y sequiterpeacute-nicos[20] La composicioacuten porcentual relativa de las familias de compuestos presentes en las flores de ylang-ylang depende del meacutetodo de su extrac-cioacuten la destilacioacuten con vapor o la destilacioacuten--extraccioacuten con solvente simultaacutenea (SDE por sus siglas en ingleacutes) permiten obtener mezclas de metabolitos secundarios ricas en compuestos oxigenados livianos (50-60) y en compuestos

oxigenados maacutes pesados (18-20) mientras que la extraccioacuten con fluido supercriacutetico SFE-CO2 aiacutesla extractos ricos en hidrocarburos alifaacuteticos (Cngt20) y terpeacutenicos compuestos nitrogenados y hasta algunos aacutecidos grasos (C14-C18)

[19]

El perfil de compuestos volaacutetiles emitidos por la flor depende tambieacuten de la hora del diacutea los insectos que la polinizan pueden ser diurnos o nocturnos y de ello dependeraacute tambieacuten la cineacutetica de emanacioacuten de compuestos fragantes y el tipo de los volaacutetiles emitidos por la flor que variacutean para la mayoriacutea de las flores con la hora del diacutea (ritmo circadiano) y seguacuten la funcioacuten bioloacutegica que cumplen Por ejemplo en las flores de ylang-ylang la cantidad de sustancias nitro-genadas cambia durante el diacutea es maacutexima en la madrugada disminuye despueacutes del mediodiacutea y vuelve a aumentar en las horas de la tarde y de la noche (Figura 1)

La fragancia de flores de Brugmansia suave-olens (Familia Solanaacutecea) sigue un claro ritmo circadiano la emisioacuten de volaacutetiles se incrementa por la tarde y alcanza su maacuteximo a las nueve de la noche luego la emisioacuten de volaacutetiles empieza lentamente a disminuir (Figura 2) en la mantildeana y durante el diacutea las flores casi no huelen aunque atraen masivamente las abejas[3] Es interesante anotar que algunas flores cambian su fragancia despueacutes de haber sido polinizadas esto sucede con las flores de algunas orquiacutedeas (Ophrys sphe-godes)[2122]

En la Tabla 1 se reuacutene la informacioacuten sobre las sustancias volaacutetiles emitidas por las flores de diferentes especies vegetales provenientes de distintos oriacutegenes (Aacutefrica Oriental Asia Arabia Ameacuterica del Sur Centroameacuterica o Meacutexico) y cultivadas en el Complejo Agroindustrial Piloto de CENIVAM (Bucaramanga Colombia) Los volaacutetiles se obtuvieron por HS-SPME usando la fibra de PDMSDVB (65 μm) expuesta a las flores frescas (ca 20 g) recieacuten cortadas colo-

Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

12 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

cadas en un recipiente sellado (22 mL) a 40 degC durante 30 min con el tiempo de pre-equilibrio de 15 min En experimentos previos se ha deter-minado que las mejores recuperaciones (aacuterea cromatograacutefica total maacutes alta) de volaacutetiles se obtienen en su orden creciente con las fibras asiacute PA (85 μm) lt PDMS (100 μm) lt PDMSDVB (65 μm) asymp CARPDMS (65 μm) Con tiempos de exposicioacuten de la fibra cortos (2-5 min) solo se logra recuperar aldehiacutedos y alcoholes volaacutetiles e hidrocarburos monoterpeacutenicos con tiempos

de exposicioacuten maacutes prolongados (20-40 min) en la fraccioacuten volaacutetil se registran tambieacuten bence-noides fenilpropanoides monoterpenos oxige-nados y sesquiterpenoides junto con parafinas (Cngt13) y sus anaacutelogos insaturados aldehiacutedos y alcoholes de cadena maacutes larga (Cngt13) sustan-cias nitrogenados indoles y antranilatos A pesar de que las flores pertenecen a plantas de geacuteneros diferentes varios componentes volaacutetiles en sus emisiones florales son los mismos (Tabla 1) La diversidad en la composicioacuten se aprecia en que entre los 115 compuestos diferentes que apare-cen en la Tabla 1 el 51 de los compuestos apa-rece en solamente 1 de las especies el 31 apa-rece en 2 especies 10 en 3 35 en 4 y 35 en 5 especies En una comparacioacuten hecha entre 165 artiacuteculos cientiacuteficos sobre composicioacuten de fragancias florales se encontroacute que la rosa fue la flor maacutes estudiada (21 publicaciones) seguida por la petunia (10) y el jazmiacuten (6) entre 73 flo-res diferentes objeto de estos estudios[2] El linalol fue el constituyente volaacutetil encontrado maacutes fre-cuentemente (24 especies) seguido del 2-feni-letanol (19 especies) el geraniol el β-ocimeno el germacreno D y el citronelol (9 especies) La microextraccioacuten en fase soacutelida fue la teacutecnica de aislamiento de sustancias volaacutetiles maacutes comuacuten en estos artiacuteculos (33) seguida del muestreo hea-dspace (22) la extraccioacuten con solventes (16) y la destilacioacuten (13)

4 Anaacutelisis cromatograacutefico de fragancias florales

Las sustancias que conforman la fraccioacuten volaacutetil aislada de las flores son de bajo peso molecular (lt300 Da) y conforman mezclas de componentes con diversa polaridad y concentra-cioacuten gracias a la naturaleza de los compuestos volaacutetiles su anaacutelisis se hace por cromatografiacutea de gases (GC) Debido a la complejidad de algunas

Figura 1 Cromatograma tiacutepico de los metabolitos secundarios volaacutetiles de flores de ylang-ylang (solo se registran compuestos nitrogenados) monitoreados a diferentes horas del diacutea Columna DB-1 (60 m) Detector selectivo de nitroacutegeno y foacutesforo NPD

Figura 2 Perfil cromatograacutefico de los metabolitos secundarios volaacutetiles de flores de Brugmansia suaveolens (familia Solanaacutecea) aislados por HS-SPME y el cambio de la cantidad de volaacutetiles emitidos por la flor (aacuterea cromatograacutefica total GC-FID) en funcioacuten de la hora del diacutea

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 13

Tabl

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Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

14 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

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Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 15

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Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

16 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

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Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 17

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Con

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Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

18 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

Com

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Tabl

a 1

Con

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Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 19

mezclas de volaacutetiles aislados de flores y a la pre-sencia en ellas de sustancias isomeacutericas (isome-riacutea geomeacutetrica de posicioacuten estereoisomeriacutea) se recomienda hacer su anaacutelisis en columnas capi-lares de siacutelice fundida preferiblemente largas de 50 o 60 m con diaacutemetros internos (DI) de 025 022 o 020 mm Los diaacutemetros internos meno-res aunque permiten aumentar la resolucioacuten eventualmente pueden comprometer tambieacuten la sensibilidad Se usan columnas con el grosor de la fase estacionaria (df) igual o mayor de 025 μm todo ello para que la forma de picos su sepa-racioacuten y la sensibilidad necesaria para su detec-cioacuten reproducible sean adecuadas

Generalmente para la inyeccioacuten de la mues-tra (Tdeg del inyector usualmente de 230-250degC) se puede usar la relacioacuten de split de 130 pero cuando las concentraciones de algunos com-ponentes de intereacutes son bajas es conveniente la inyeccioacuten en modo splitless Cuando se emplea el modo de inyeccioacuten splitless para disminuir la ldquodispersioacutenrdquo o el ensanchamiento de los picos de sustancias muy volaacutetiles se puede hacer la inyec-cioacuten en el modo de splitless pulsado es cuando la presioacuten de entrada del gas de arrastre durante la transferencia de la muestra por el liner se incre-menta unas 2-3 veces Teniendo en cuenta la presencia de algunas sustancias termolaacutebiles la inyeccioacuten on-column o con la programacioacuten de temperatura (con PTV programmed-temperature vaporizer por sus siglas en ingleacutes) podriacutea ser una buena alternativa

Para el anaacutelisis de las fracciones volaacutetiles la temperatura inicial de la columna de 35-50degC seriacutea la recomendable la naturaleza de la muestra (compuestos volaacutetiles) no exige que la tempera-tura final de la columna sea alta la de 200-250degC seraacute suficiente para eluir los componentes maacutes retenidos La velocidad de calentamiento de la columna es funcioacuten de su longitud a mayor lon-gitud maacutes lentamente hay que calentar la colu-

mna 3-4degCmin pero si se usan columnas maacutes cortas eg de 30 m se podriacutea ir incrementando la temperatura de la columna maacutes raacutepidamente a razoacuten de 5-7degCmin Por supuesto el proceso de programacioacuten de la temperatura en la colu-mna es optimizable depende de la complejidad de la mezcla de sustancias a analizar (nuacutemero de componentes isomeriacutea o similitud estructural) su naturaleza (polaridad peso molecular) las dimensiones de la columna (L DI) el tipo de la fase estacionaria (polaridad) y su grosor (df)

Para el anaacutelisis de la fraccioacuten volaacutetil floral se usan en combinacioacuten dos columnas una con la fase estacionaria polar poli(etilenglicol) (eg INNOWAX DB-WAX HP-20M otras) y la otra con la fase estacionaria apolar poli(dimetilsiloxano) (HP-1 Ultra 1 DB-1 BP-1 otras) o 5-fenil poli(dimetilsiloxano) (HP-5 DB-5 Ultra 2 CPSil 5 BP-5 otras) En la Figura 3 se pueden observar perfiles cromato-graacuteficos de la fragancia de flores de cafeacute (Coffea arabica Fam Rubiaacutecea) aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm temperatura - 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) obtenidos por GC-MS en columnas de diferente polaridad

La cromatografiacutea de gases enantioselectiva aprovecha el hecho de que los enantioacutemeros poseen tiempos de retencioacuten diferentes cuando en la fase estacionaria se insertan compuestos que pueden formar aductos cuya estabilidad es funcioacuten de la forma tridimensional del analito Las ciclodextrinas con su geometriacutea de cono con cavidad de diferente tamantildeo han resultado ser agentes quirales muy efectivos al constituir complejos de inclusioacuten que permiten discri-minar isoacutemeros seguacuten su forma Las fragancias de jazmiacuten (Jasminum grandiflorum) y otras flo-res (Osmanthus fragrans Boronia megastima) contienen una mezcla de estereoisoacutemeros del jasmonato de metilo Wilfred Koumlnig reportoacute la separacioacuten de todos los isoacutemeros por medio de

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cromatografiacutea de gases preparativa en la que uti-lizoacute columnas empacadas con ciclodextrinas[23] Esto permitioacute confirmar la estimacioacuten hecha por Acree y Barnard de que el isoacutemero (+)-epi-jas-monato de metilo tiene un umbral de olor unas 500 veces maacutes bajo que el del isoacutemero mayorita-rio el (-)-jasmonato de metilo[24]

Los aldehiacutedos y alcoholes lilac son monoterpenos oxigenados que se encuen-tran en especies vegetales de muchas familias Lamiaceae (Origanum vulgare[25]) Orchidaceae (Platanthera sp[26]) Rosaceae (Prunus padus[27]) y Rubiaceae (Cephalanthus occidentalis[25]) son algunos ejemplos de estas familias Cada una de las moleacuteculas lilac posee 3 carbonos quirales lo

que da lugar a 8 estereoisoacutemeros del aldehiacutedo y 8 estereoisoacutemeros del alcohol lilac Doumltterl et al[28] lograron separar todos los isoacutemeros del aldehiacutedo y 7 isoacutemeros del alcohol lilac por medio de un sistema de cromatografiacutea de gases bidimensional en el que una columna capilar de 30 m con fase estacionaria de 5-fenil polimetilsiloxano fue unida por medio de una vaacutelvula T a un detec-tor selectivo de masas y a otra columna capilar de 30 m con una fase estacionaria formada por fenil-poli(dimetilsiloxano) (70) y un derivado de ciclodextrina (30) Cada columna tuvo un horno independiente Este sistema se modificoacute para convertirlo en cromatografiacutea microprepara-tiva La salida de la segunda columna se conectoacute

Figura 3 Cromatogramas tiacutepicos de la fragancia de flores de cafeacute aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) A Columna cromatograacutefica apolar DB-5MS (60 m x 025 mm x 025 mm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) B Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten deficiente de limoneno (LRI = 1030) alcohol benciacutelico (LRI = 1031) y 18-cineol (LRI = 1032) C Columna cromatograacutefica polar DB-WAX (60 m x 025 mm x 025 μm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) D Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten mejor de limoneno y 18-cineol el alcohol benciacutelico tiene un tiempo de retencioacuten mucho maacutes largo (tR =341 min LRI = 1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno tal como sucede en la columna apolar (B)

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a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

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Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

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es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

Referencias

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y luego se torna amarilla grande con puntos de color marroacuten En el mismo aacuterbol es comuacuten encontrar flores en diferentes grados de madu-racioacuten junto con los frutos que llevan semillas a traveacutes de las cuales se propaga esta especie vegetal La composicioacuten de volaacutetiles en la flor de ylang-ylang variacutea notoriamente con su estado de madurez En flores pequentildeas verdes se registran 10 veces menos componentes que en una flor amarilla madura En las flores de ylang-ylang maduras amarillas y completamente desarrolla-das se encuentran 16 y 4 veces maacutes sustancias oxigenadas livianas (p-metilanisol alcohol ben-ciacutelico 18-cineol benzoato y salicilato de metilo y etilo linalol nerol geraniol acetato de bencilo anetol acetato de cinamilo otros) y sustancias oxigenadas maacutes pesadas (sesquiterpenoles far-nesal farnesol nerolidol y sus acetatos cedrol benzoato y salicilato de bencilo otros) que en las flores verdes pequentildeas que empiezan su desar-rollo Los compuestos nitrogenados fenilaceto-nitrilo 4-metilbenzaldoxima indol 2-fenil-1-ni-troetano y antranilato de metilo solo aparecen en las flores maduras grandes y amarillas[1819]

La composicioacuten de los metabolitos secun-darios en la emisioacuten floral variacutea tambieacuten seguacuten la parte de la flor de donde se extraen los volaacute-tiles En los peacutetalos de las flores de ylang-ylang prevalecen los compuestos oxigenados (mono-terpenos oxigenados bencenoides y fenilpro-panoides) mientras que en los ovarios (parte central de la flor pequentildea y compacta) abundan los hidrocarburos monoterpeacutenicos y sequiterpeacute-nicos[20] La composicioacuten porcentual relativa de las familias de compuestos presentes en las flores de ylang-ylang depende del meacutetodo de su extrac-cioacuten la destilacioacuten con vapor o la destilacioacuten--extraccioacuten con solvente simultaacutenea (SDE por sus siglas en ingleacutes) permiten obtener mezclas de metabolitos secundarios ricas en compuestos oxigenados livianos (50-60) y en compuestos

oxigenados maacutes pesados (18-20) mientras que la extraccioacuten con fluido supercriacutetico SFE-CO2 aiacutesla extractos ricos en hidrocarburos alifaacuteticos (Cngt20) y terpeacutenicos compuestos nitrogenados y hasta algunos aacutecidos grasos (C14-C18)

[19]

El perfil de compuestos volaacutetiles emitidos por la flor depende tambieacuten de la hora del diacutea los insectos que la polinizan pueden ser diurnos o nocturnos y de ello dependeraacute tambieacuten la cineacutetica de emanacioacuten de compuestos fragantes y el tipo de los volaacutetiles emitidos por la flor que variacutean para la mayoriacutea de las flores con la hora del diacutea (ritmo circadiano) y seguacuten la funcioacuten bioloacutegica que cumplen Por ejemplo en las flores de ylang-ylang la cantidad de sustancias nitro-genadas cambia durante el diacutea es maacutexima en la madrugada disminuye despueacutes del mediodiacutea y vuelve a aumentar en las horas de la tarde y de la noche (Figura 1)

La fragancia de flores de Brugmansia suave-olens (Familia Solanaacutecea) sigue un claro ritmo circadiano la emisioacuten de volaacutetiles se incrementa por la tarde y alcanza su maacuteximo a las nueve de la noche luego la emisioacuten de volaacutetiles empieza lentamente a disminuir (Figura 2) en la mantildeana y durante el diacutea las flores casi no huelen aunque atraen masivamente las abejas[3] Es interesante anotar que algunas flores cambian su fragancia despueacutes de haber sido polinizadas esto sucede con las flores de algunas orquiacutedeas (Ophrys sphe-godes)[2122]

En la Tabla 1 se reuacutene la informacioacuten sobre las sustancias volaacutetiles emitidas por las flores de diferentes especies vegetales provenientes de distintos oriacutegenes (Aacutefrica Oriental Asia Arabia Ameacuterica del Sur Centroameacuterica o Meacutexico) y cultivadas en el Complejo Agroindustrial Piloto de CENIVAM (Bucaramanga Colombia) Los volaacutetiles se obtuvieron por HS-SPME usando la fibra de PDMSDVB (65 μm) expuesta a las flores frescas (ca 20 g) recieacuten cortadas colo-

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cadas en un recipiente sellado (22 mL) a 40 degC durante 30 min con el tiempo de pre-equilibrio de 15 min En experimentos previos se ha deter-minado que las mejores recuperaciones (aacuterea cromatograacutefica total maacutes alta) de volaacutetiles se obtienen en su orden creciente con las fibras asiacute PA (85 μm) lt PDMS (100 μm) lt PDMSDVB (65 μm) asymp CARPDMS (65 μm) Con tiempos de exposicioacuten de la fibra cortos (2-5 min) solo se logra recuperar aldehiacutedos y alcoholes volaacutetiles e hidrocarburos monoterpeacutenicos con tiempos

de exposicioacuten maacutes prolongados (20-40 min) en la fraccioacuten volaacutetil se registran tambieacuten bence-noides fenilpropanoides monoterpenos oxige-nados y sesquiterpenoides junto con parafinas (Cngt13) y sus anaacutelogos insaturados aldehiacutedos y alcoholes de cadena maacutes larga (Cngt13) sustan-cias nitrogenados indoles y antranilatos A pesar de que las flores pertenecen a plantas de geacuteneros diferentes varios componentes volaacutetiles en sus emisiones florales son los mismos (Tabla 1) La diversidad en la composicioacuten se aprecia en que entre los 115 compuestos diferentes que apare-cen en la Tabla 1 el 51 de los compuestos apa-rece en solamente 1 de las especies el 31 apa-rece en 2 especies 10 en 3 35 en 4 y 35 en 5 especies En una comparacioacuten hecha entre 165 artiacuteculos cientiacuteficos sobre composicioacuten de fragancias florales se encontroacute que la rosa fue la flor maacutes estudiada (21 publicaciones) seguida por la petunia (10) y el jazmiacuten (6) entre 73 flo-res diferentes objeto de estos estudios[2] El linalol fue el constituyente volaacutetil encontrado maacutes fre-cuentemente (24 especies) seguido del 2-feni-letanol (19 especies) el geraniol el β-ocimeno el germacreno D y el citronelol (9 especies) La microextraccioacuten en fase soacutelida fue la teacutecnica de aislamiento de sustancias volaacutetiles maacutes comuacuten en estos artiacuteculos (33) seguida del muestreo hea-dspace (22) la extraccioacuten con solventes (16) y la destilacioacuten (13)

4 Anaacutelisis cromatograacutefico de fragancias florales

Las sustancias que conforman la fraccioacuten volaacutetil aislada de las flores son de bajo peso molecular (lt300 Da) y conforman mezclas de componentes con diversa polaridad y concentra-cioacuten gracias a la naturaleza de los compuestos volaacutetiles su anaacutelisis se hace por cromatografiacutea de gases (GC) Debido a la complejidad de algunas

Figura 1 Cromatograma tiacutepico de los metabolitos secundarios volaacutetiles de flores de ylang-ylang (solo se registran compuestos nitrogenados) monitoreados a diferentes horas del diacutea Columna DB-1 (60 m) Detector selectivo de nitroacutegeno y foacutesforo NPD

Figura 2 Perfil cromatograacutefico de los metabolitos secundarios volaacutetiles de flores de Brugmansia suaveolens (familia Solanaacutecea) aislados por HS-SPME y el cambio de la cantidad de volaacutetiles emitidos por la flor (aacuterea cromatograacutefica total GC-FID) en funcioacuten de la hora del diacutea

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mezclas de volaacutetiles aislados de flores y a la pre-sencia en ellas de sustancias isomeacutericas (isome-riacutea geomeacutetrica de posicioacuten estereoisomeriacutea) se recomienda hacer su anaacutelisis en columnas capi-lares de siacutelice fundida preferiblemente largas de 50 o 60 m con diaacutemetros internos (DI) de 025 022 o 020 mm Los diaacutemetros internos meno-res aunque permiten aumentar la resolucioacuten eventualmente pueden comprometer tambieacuten la sensibilidad Se usan columnas con el grosor de la fase estacionaria (df) igual o mayor de 025 μm todo ello para que la forma de picos su sepa-racioacuten y la sensibilidad necesaria para su detec-cioacuten reproducible sean adecuadas

Generalmente para la inyeccioacuten de la mues-tra (Tdeg del inyector usualmente de 230-250degC) se puede usar la relacioacuten de split de 130 pero cuando las concentraciones de algunos com-ponentes de intereacutes son bajas es conveniente la inyeccioacuten en modo splitless Cuando se emplea el modo de inyeccioacuten splitless para disminuir la ldquodispersioacutenrdquo o el ensanchamiento de los picos de sustancias muy volaacutetiles se puede hacer la inyec-cioacuten en el modo de splitless pulsado es cuando la presioacuten de entrada del gas de arrastre durante la transferencia de la muestra por el liner se incre-menta unas 2-3 veces Teniendo en cuenta la presencia de algunas sustancias termolaacutebiles la inyeccioacuten on-column o con la programacioacuten de temperatura (con PTV programmed-temperature vaporizer por sus siglas en ingleacutes) podriacutea ser una buena alternativa

Para el anaacutelisis de las fracciones volaacutetiles la temperatura inicial de la columna de 35-50degC seriacutea la recomendable la naturaleza de la muestra (compuestos volaacutetiles) no exige que la tempera-tura final de la columna sea alta la de 200-250degC seraacute suficiente para eluir los componentes maacutes retenidos La velocidad de calentamiento de la columna es funcioacuten de su longitud a mayor lon-gitud maacutes lentamente hay que calentar la colu-

mna 3-4degCmin pero si se usan columnas maacutes cortas eg de 30 m se podriacutea ir incrementando la temperatura de la columna maacutes raacutepidamente a razoacuten de 5-7degCmin Por supuesto el proceso de programacioacuten de la temperatura en la colu-mna es optimizable depende de la complejidad de la mezcla de sustancias a analizar (nuacutemero de componentes isomeriacutea o similitud estructural) su naturaleza (polaridad peso molecular) las dimensiones de la columna (L DI) el tipo de la fase estacionaria (polaridad) y su grosor (df)

Para el anaacutelisis de la fraccioacuten volaacutetil floral se usan en combinacioacuten dos columnas una con la fase estacionaria polar poli(etilenglicol) (eg INNOWAX DB-WAX HP-20M otras) y la otra con la fase estacionaria apolar poli(dimetilsiloxano) (HP-1 Ultra 1 DB-1 BP-1 otras) o 5-fenil poli(dimetilsiloxano) (HP-5 DB-5 Ultra 2 CPSil 5 BP-5 otras) En la Figura 3 se pueden observar perfiles cromato-graacuteficos de la fragancia de flores de cafeacute (Coffea arabica Fam Rubiaacutecea) aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm temperatura - 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) obtenidos por GC-MS en columnas de diferente polaridad

La cromatografiacutea de gases enantioselectiva aprovecha el hecho de que los enantioacutemeros poseen tiempos de retencioacuten diferentes cuando en la fase estacionaria se insertan compuestos que pueden formar aductos cuya estabilidad es funcioacuten de la forma tridimensional del analito Las ciclodextrinas con su geometriacutea de cono con cavidad de diferente tamantildeo han resultado ser agentes quirales muy efectivos al constituir complejos de inclusioacuten que permiten discri-minar isoacutemeros seguacuten su forma Las fragancias de jazmiacuten (Jasminum grandiflorum) y otras flo-res (Osmanthus fragrans Boronia megastima) contienen una mezcla de estereoisoacutemeros del jasmonato de metilo Wilfred Koumlnig reportoacute la separacioacuten de todos los isoacutemeros por medio de

Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

20 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

cromatografiacutea de gases preparativa en la que uti-lizoacute columnas empacadas con ciclodextrinas[23] Esto permitioacute confirmar la estimacioacuten hecha por Acree y Barnard de que el isoacutemero (+)-epi-jas-monato de metilo tiene un umbral de olor unas 500 veces maacutes bajo que el del isoacutemero mayorita-rio el (-)-jasmonato de metilo[24]

Los aldehiacutedos y alcoholes lilac son monoterpenos oxigenados que se encuen-tran en especies vegetales de muchas familias Lamiaceae (Origanum vulgare[25]) Orchidaceae (Platanthera sp[26]) Rosaceae (Prunus padus[27]) y Rubiaceae (Cephalanthus occidentalis[25]) son algunos ejemplos de estas familias Cada una de las moleacuteculas lilac posee 3 carbonos quirales lo

que da lugar a 8 estereoisoacutemeros del aldehiacutedo y 8 estereoisoacutemeros del alcohol lilac Doumltterl et al[28] lograron separar todos los isoacutemeros del aldehiacutedo y 7 isoacutemeros del alcohol lilac por medio de un sistema de cromatografiacutea de gases bidimensional en el que una columna capilar de 30 m con fase estacionaria de 5-fenil polimetilsiloxano fue unida por medio de una vaacutelvula T a un detec-tor selectivo de masas y a otra columna capilar de 30 m con una fase estacionaria formada por fenil-poli(dimetilsiloxano) (70) y un derivado de ciclodextrina (30) Cada columna tuvo un horno independiente Este sistema se modificoacute para convertirlo en cromatografiacutea microprepara-tiva La salida de la segunda columna se conectoacute

Figura 3 Cromatogramas tiacutepicos de la fragancia de flores de cafeacute aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) A Columna cromatograacutefica apolar DB-5MS (60 m x 025 mm x 025 mm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) B Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten deficiente de limoneno (LRI = 1030) alcohol benciacutelico (LRI = 1031) y 18-cineol (LRI = 1032) C Columna cromatograacutefica polar DB-WAX (60 m x 025 mm x 025 μm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) D Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten mejor de limoneno y 18-cineol el alcohol benciacutelico tiene un tiempo de retencioacuten mucho maacutes largo (tR =341 min LRI = 1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno tal como sucede en la columna apolar (B)

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 21

a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

22 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 23

es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

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Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

12 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

cadas en un recipiente sellado (22 mL) a 40 degC durante 30 min con el tiempo de pre-equilibrio de 15 min En experimentos previos se ha deter-minado que las mejores recuperaciones (aacuterea cromatograacutefica total maacutes alta) de volaacutetiles se obtienen en su orden creciente con las fibras asiacute PA (85 μm) lt PDMS (100 μm) lt PDMSDVB (65 μm) asymp CARPDMS (65 μm) Con tiempos de exposicioacuten de la fibra cortos (2-5 min) solo se logra recuperar aldehiacutedos y alcoholes volaacutetiles e hidrocarburos monoterpeacutenicos con tiempos

de exposicioacuten maacutes prolongados (20-40 min) en la fraccioacuten volaacutetil se registran tambieacuten bence-noides fenilpropanoides monoterpenos oxige-nados y sesquiterpenoides junto con parafinas (Cngt13) y sus anaacutelogos insaturados aldehiacutedos y alcoholes de cadena maacutes larga (Cngt13) sustan-cias nitrogenados indoles y antranilatos A pesar de que las flores pertenecen a plantas de geacuteneros diferentes varios componentes volaacutetiles en sus emisiones florales son los mismos (Tabla 1) La diversidad en la composicioacuten se aprecia en que entre los 115 compuestos diferentes que apare-cen en la Tabla 1 el 51 de los compuestos apa-rece en solamente 1 de las especies el 31 apa-rece en 2 especies 10 en 3 35 en 4 y 35 en 5 especies En una comparacioacuten hecha entre 165 artiacuteculos cientiacuteficos sobre composicioacuten de fragancias florales se encontroacute que la rosa fue la flor maacutes estudiada (21 publicaciones) seguida por la petunia (10) y el jazmiacuten (6) entre 73 flo-res diferentes objeto de estos estudios[2] El linalol fue el constituyente volaacutetil encontrado maacutes fre-cuentemente (24 especies) seguido del 2-feni-letanol (19 especies) el geraniol el β-ocimeno el germacreno D y el citronelol (9 especies) La microextraccioacuten en fase soacutelida fue la teacutecnica de aislamiento de sustancias volaacutetiles maacutes comuacuten en estos artiacuteculos (33) seguida del muestreo hea-dspace (22) la extraccioacuten con solventes (16) y la destilacioacuten (13)

4 Anaacutelisis cromatograacutefico de fragancias florales

Las sustancias que conforman la fraccioacuten volaacutetil aislada de las flores son de bajo peso molecular (lt300 Da) y conforman mezclas de componentes con diversa polaridad y concentra-cioacuten gracias a la naturaleza de los compuestos volaacutetiles su anaacutelisis se hace por cromatografiacutea de gases (GC) Debido a la complejidad de algunas

Figura 1 Cromatograma tiacutepico de los metabolitos secundarios volaacutetiles de flores de ylang-ylang (solo se registran compuestos nitrogenados) monitoreados a diferentes horas del diacutea Columna DB-1 (60 m) Detector selectivo de nitroacutegeno y foacutesforo NPD

Figura 2 Perfil cromatograacutefico de los metabolitos secundarios volaacutetiles de flores de Brugmansia suaveolens (familia Solanaacutecea) aislados por HS-SPME y el cambio de la cantidad de volaacutetiles emitidos por la flor (aacuterea cromatograacutefica total GC-FID) en funcioacuten de la hora del diacutea

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 13

Tabl

a 1

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Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

14 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

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Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 15

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Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

16 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

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Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 17

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a 1

Con

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cioacuten

Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

18 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

Com

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a 1

Con

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cioacuten

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 19

mezclas de volaacutetiles aislados de flores y a la pre-sencia en ellas de sustancias isomeacutericas (isome-riacutea geomeacutetrica de posicioacuten estereoisomeriacutea) se recomienda hacer su anaacutelisis en columnas capi-lares de siacutelice fundida preferiblemente largas de 50 o 60 m con diaacutemetros internos (DI) de 025 022 o 020 mm Los diaacutemetros internos meno-res aunque permiten aumentar la resolucioacuten eventualmente pueden comprometer tambieacuten la sensibilidad Se usan columnas con el grosor de la fase estacionaria (df) igual o mayor de 025 μm todo ello para que la forma de picos su sepa-racioacuten y la sensibilidad necesaria para su detec-cioacuten reproducible sean adecuadas

Generalmente para la inyeccioacuten de la mues-tra (Tdeg del inyector usualmente de 230-250degC) se puede usar la relacioacuten de split de 130 pero cuando las concentraciones de algunos com-ponentes de intereacutes son bajas es conveniente la inyeccioacuten en modo splitless Cuando se emplea el modo de inyeccioacuten splitless para disminuir la ldquodispersioacutenrdquo o el ensanchamiento de los picos de sustancias muy volaacutetiles se puede hacer la inyec-cioacuten en el modo de splitless pulsado es cuando la presioacuten de entrada del gas de arrastre durante la transferencia de la muestra por el liner se incre-menta unas 2-3 veces Teniendo en cuenta la presencia de algunas sustancias termolaacutebiles la inyeccioacuten on-column o con la programacioacuten de temperatura (con PTV programmed-temperature vaporizer por sus siglas en ingleacutes) podriacutea ser una buena alternativa

Para el anaacutelisis de las fracciones volaacutetiles la temperatura inicial de la columna de 35-50degC seriacutea la recomendable la naturaleza de la muestra (compuestos volaacutetiles) no exige que la tempera-tura final de la columna sea alta la de 200-250degC seraacute suficiente para eluir los componentes maacutes retenidos La velocidad de calentamiento de la columna es funcioacuten de su longitud a mayor lon-gitud maacutes lentamente hay que calentar la colu-

mna 3-4degCmin pero si se usan columnas maacutes cortas eg de 30 m se podriacutea ir incrementando la temperatura de la columna maacutes raacutepidamente a razoacuten de 5-7degCmin Por supuesto el proceso de programacioacuten de la temperatura en la colu-mna es optimizable depende de la complejidad de la mezcla de sustancias a analizar (nuacutemero de componentes isomeriacutea o similitud estructural) su naturaleza (polaridad peso molecular) las dimensiones de la columna (L DI) el tipo de la fase estacionaria (polaridad) y su grosor (df)

Para el anaacutelisis de la fraccioacuten volaacutetil floral se usan en combinacioacuten dos columnas una con la fase estacionaria polar poli(etilenglicol) (eg INNOWAX DB-WAX HP-20M otras) y la otra con la fase estacionaria apolar poli(dimetilsiloxano) (HP-1 Ultra 1 DB-1 BP-1 otras) o 5-fenil poli(dimetilsiloxano) (HP-5 DB-5 Ultra 2 CPSil 5 BP-5 otras) En la Figura 3 se pueden observar perfiles cromato-graacuteficos de la fragancia de flores de cafeacute (Coffea arabica Fam Rubiaacutecea) aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm temperatura - 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) obtenidos por GC-MS en columnas de diferente polaridad

La cromatografiacutea de gases enantioselectiva aprovecha el hecho de que los enantioacutemeros poseen tiempos de retencioacuten diferentes cuando en la fase estacionaria se insertan compuestos que pueden formar aductos cuya estabilidad es funcioacuten de la forma tridimensional del analito Las ciclodextrinas con su geometriacutea de cono con cavidad de diferente tamantildeo han resultado ser agentes quirales muy efectivos al constituir complejos de inclusioacuten que permiten discri-minar isoacutemeros seguacuten su forma Las fragancias de jazmiacuten (Jasminum grandiflorum) y otras flo-res (Osmanthus fragrans Boronia megastima) contienen una mezcla de estereoisoacutemeros del jasmonato de metilo Wilfred Koumlnig reportoacute la separacioacuten de todos los isoacutemeros por medio de

Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

20 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

cromatografiacutea de gases preparativa en la que uti-lizoacute columnas empacadas con ciclodextrinas[23] Esto permitioacute confirmar la estimacioacuten hecha por Acree y Barnard de que el isoacutemero (+)-epi-jas-monato de metilo tiene un umbral de olor unas 500 veces maacutes bajo que el del isoacutemero mayorita-rio el (-)-jasmonato de metilo[24]

Los aldehiacutedos y alcoholes lilac son monoterpenos oxigenados que se encuen-tran en especies vegetales de muchas familias Lamiaceae (Origanum vulgare[25]) Orchidaceae (Platanthera sp[26]) Rosaceae (Prunus padus[27]) y Rubiaceae (Cephalanthus occidentalis[25]) son algunos ejemplos de estas familias Cada una de las moleacuteculas lilac posee 3 carbonos quirales lo

que da lugar a 8 estereoisoacutemeros del aldehiacutedo y 8 estereoisoacutemeros del alcohol lilac Doumltterl et al[28] lograron separar todos los isoacutemeros del aldehiacutedo y 7 isoacutemeros del alcohol lilac por medio de un sistema de cromatografiacutea de gases bidimensional en el que una columna capilar de 30 m con fase estacionaria de 5-fenil polimetilsiloxano fue unida por medio de una vaacutelvula T a un detec-tor selectivo de masas y a otra columna capilar de 30 m con una fase estacionaria formada por fenil-poli(dimetilsiloxano) (70) y un derivado de ciclodextrina (30) Cada columna tuvo un horno independiente Este sistema se modificoacute para convertirlo en cromatografiacutea microprepara-tiva La salida de la segunda columna se conectoacute

Figura 3 Cromatogramas tiacutepicos de la fragancia de flores de cafeacute aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) A Columna cromatograacutefica apolar DB-5MS (60 m x 025 mm x 025 mm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) B Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten deficiente de limoneno (LRI = 1030) alcohol benciacutelico (LRI = 1031) y 18-cineol (LRI = 1032) C Columna cromatograacutefica polar DB-WAX (60 m x 025 mm x 025 μm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) D Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten mejor de limoneno y 18-cineol el alcohol benciacutelico tiene un tiempo de retencioacuten mucho maacutes largo (tR =341 min LRI = 1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno tal como sucede en la columna apolar (B)

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 21

a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

22 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 23

es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

Referencias

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mezclas de volaacutetiles aislados de flores y a la pre-sencia en ellas de sustancias isomeacutericas (isome-riacutea geomeacutetrica de posicioacuten estereoisomeriacutea) se recomienda hacer su anaacutelisis en columnas capi-lares de siacutelice fundida preferiblemente largas de 50 o 60 m con diaacutemetros internos (DI) de 025 022 o 020 mm Los diaacutemetros internos meno-res aunque permiten aumentar la resolucioacuten eventualmente pueden comprometer tambieacuten la sensibilidad Se usan columnas con el grosor de la fase estacionaria (df) igual o mayor de 025 μm todo ello para que la forma de picos su sepa-racioacuten y la sensibilidad necesaria para su detec-cioacuten reproducible sean adecuadas

Generalmente para la inyeccioacuten de la mues-tra (Tdeg del inyector usualmente de 230-250degC) se puede usar la relacioacuten de split de 130 pero cuando las concentraciones de algunos com-ponentes de intereacutes son bajas es conveniente la inyeccioacuten en modo splitless Cuando se emplea el modo de inyeccioacuten splitless para disminuir la ldquodispersioacutenrdquo o el ensanchamiento de los picos de sustancias muy volaacutetiles se puede hacer la inyec-cioacuten en el modo de splitless pulsado es cuando la presioacuten de entrada del gas de arrastre durante la transferencia de la muestra por el liner se incre-menta unas 2-3 veces Teniendo en cuenta la presencia de algunas sustancias termolaacutebiles la inyeccioacuten on-column o con la programacioacuten de temperatura (con PTV programmed-temperature vaporizer por sus siglas en ingleacutes) podriacutea ser una buena alternativa

Para el anaacutelisis de las fracciones volaacutetiles la temperatura inicial de la columna de 35-50degC seriacutea la recomendable la naturaleza de la muestra (compuestos volaacutetiles) no exige que la tempera-tura final de la columna sea alta la de 200-250degC seraacute suficiente para eluir los componentes maacutes retenidos La velocidad de calentamiento de la columna es funcioacuten de su longitud a mayor lon-gitud maacutes lentamente hay que calentar la colu-

mna 3-4degCmin pero si se usan columnas maacutes cortas eg de 30 m se podriacutea ir incrementando la temperatura de la columna maacutes raacutepidamente a razoacuten de 5-7degCmin Por supuesto el proceso de programacioacuten de la temperatura en la colu-mna es optimizable depende de la complejidad de la mezcla de sustancias a analizar (nuacutemero de componentes isomeriacutea o similitud estructural) su naturaleza (polaridad peso molecular) las dimensiones de la columna (L DI) el tipo de la fase estacionaria (polaridad) y su grosor (df)

Para el anaacutelisis de la fraccioacuten volaacutetil floral se usan en combinacioacuten dos columnas una con la fase estacionaria polar poli(etilenglicol) (eg INNOWAX DB-WAX HP-20M otras) y la otra con la fase estacionaria apolar poli(dimetilsiloxano) (HP-1 Ultra 1 DB-1 BP-1 otras) o 5-fenil poli(dimetilsiloxano) (HP-5 DB-5 Ultra 2 CPSil 5 BP-5 otras) En la Figura 3 se pueden observar perfiles cromato-graacuteficos de la fragancia de flores de cafeacute (Coffea arabica Fam Rubiaacutecea) aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm temperatura - 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) obtenidos por GC-MS en columnas de diferente polaridad

La cromatografiacutea de gases enantioselectiva aprovecha el hecho de que los enantioacutemeros poseen tiempos de retencioacuten diferentes cuando en la fase estacionaria se insertan compuestos que pueden formar aductos cuya estabilidad es funcioacuten de la forma tridimensional del analito Las ciclodextrinas con su geometriacutea de cono con cavidad de diferente tamantildeo han resultado ser agentes quirales muy efectivos al constituir complejos de inclusioacuten que permiten discri-minar isoacutemeros seguacuten su forma Las fragancias de jazmiacuten (Jasminum grandiflorum) y otras flo-res (Osmanthus fragrans Boronia megastima) contienen una mezcla de estereoisoacutemeros del jasmonato de metilo Wilfred Koumlnig reportoacute la separacioacuten de todos los isoacutemeros por medio de

Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

20 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

cromatografiacutea de gases preparativa en la que uti-lizoacute columnas empacadas con ciclodextrinas[23] Esto permitioacute confirmar la estimacioacuten hecha por Acree y Barnard de que el isoacutemero (+)-epi-jas-monato de metilo tiene un umbral de olor unas 500 veces maacutes bajo que el del isoacutemero mayorita-rio el (-)-jasmonato de metilo[24]

Los aldehiacutedos y alcoholes lilac son monoterpenos oxigenados que se encuen-tran en especies vegetales de muchas familias Lamiaceae (Origanum vulgare[25]) Orchidaceae (Platanthera sp[26]) Rosaceae (Prunus padus[27]) y Rubiaceae (Cephalanthus occidentalis[25]) son algunos ejemplos de estas familias Cada una de las moleacuteculas lilac posee 3 carbonos quirales lo

que da lugar a 8 estereoisoacutemeros del aldehiacutedo y 8 estereoisoacutemeros del alcohol lilac Doumltterl et al[28] lograron separar todos los isoacutemeros del aldehiacutedo y 7 isoacutemeros del alcohol lilac por medio de un sistema de cromatografiacutea de gases bidimensional en el que una columna capilar de 30 m con fase estacionaria de 5-fenil polimetilsiloxano fue unida por medio de una vaacutelvula T a un detec-tor selectivo de masas y a otra columna capilar de 30 m con una fase estacionaria formada por fenil-poli(dimetilsiloxano) (70) y un derivado de ciclodextrina (30) Cada columna tuvo un horno independiente Este sistema se modificoacute para convertirlo en cromatografiacutea microprepara-tiva La salida de la segunda columna se conectoacute

Figura 3 Cromatogramas tiacutepicos de la fragancia de flores de cafeacute aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) A Columna cromatograacutefica apolar DB-5MS (60 m x 025 mm x 025 mm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) B Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten deficiente de limoneno (LRI = 1030) alcohol benciacutelico (LRI = 1031) y 18-cineol (LRI = 1032) C Columna cromatograacutefica polar DB-WAX (60 m x 025 mm x 025 μm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) D Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten mejor de limoneno y 18-cineol el alcohol benciacutelico tiene un tiempo de retencioacuten mucho maacutes largo (tR =341 min LRI = 1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno tal como sucede en la columna apolar (B)

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 21

a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

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22 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

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es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

Referencias

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mezclas de volaacutetiles aislados de flores y a la pre-sencia en ellas de sustancias isomeacutericas (isome-riacutea geomeacutetrica de posicioacuten estereoisomeriacutea) se recomienda hacer su anaacutelisis en columnas capi-lares de siacutelice fundida preferiblemente largas de 50 o 60 m con diaacutemetros internos (DI) de 025 022 o 020 mm Los diaacutemetros internos meno-res aunque permiten aumentar la resolucioacuten eventualmente pueden comprometer tambieacuten la sensibilidad Se usan columnas con el grosor de la fase estacionaria (df) igual o mayor de 025 μm todo ello para que la forma de picos su sepa-racioacuten y la sensibilidad necesaria para su detec-cioacuten reproducible sean adecuadas

Generalmente para la inyeccioacuten de la mues-tra (Tdeg del inyector usualmente de 230-250degC) se puede usar la relacioacuten de split de 130 pero cuando las concentraciones de algunos com-ponentes de intereacutes son bajas es conveniente la inyeccioacuten en modo splitless Cuando se emplea el modo de inyeccioacuten splitless para disminuir la ldquodispersioacutenrdquo o el ensanchamiento de los picos de sustancias muy volaacutetiles se puede hacer la inyec-cioacuten en el modo de splitless pulsado es cuando la presioacuten de entrada del gas de arrastre durante la transferencia de la muestra por el liner se incre-menta unas 2-3 veces Teniendo en cuenta la presencia de algunas sustancias termolaacutebiles la inyeccioacuten on-column o con la programacioacuten de temperatura (con PTV programmed-temperature vaporizer por sus siglas en ingleacutes) podriacutea ser una buena alternativa

Para el anaacutelisis de las fracciones volaacutetiles la temperatura inicial de la columna de 35-50degC seriacutea la recomendable la naturaleza de la muestra (compuestos volaacutetiles) no exige que la tempera-tura final de la columna sea alta la de 200-250degC seraacute suficiente para eluir los componentes maacutes retenidos La velocidad de calentamiento de la columna es funcioacuten de su longitud a mayor lon-gitud maacutes lentamente hay que calentar la colu-

mna 3-4degCmin pero si se usan columnas maacutes cortas eg de 30 m se podriacutea ir incrementando la temperatura de la columna maacutes raacutepidamente a razoacuten de 5-7degCmin Por supuesto el proceso de programacioacuten de la temperatura en la colu-mna es optimizable depende de la complejidad de la mezcla de sustancias a analizar (nuacutemero de componentes isomeriacutea o similitud estructural) su naturaleza (polaridad peso molecular) las dimensiones de la columna (L DI) el tipo de la fase estacionaria (polaridad) y su grosor (df)

Para el anaacutelisis de la fraccioacuten volaacutetil floral se usan en combinacioacuten dos columnas una con la fase estacionaria polar poli(etilenglicol) (eg INNOWAX DB-WAX HP-20M otras) y la otra con la fase estacionaria apolar poli(dimetilsiloxano) (HP-1 Ultra 1 DB-1 BP-1 otras) o 5-fenil poli(dimetilsiloxano) (HP-5 DB-5 Ultra 2 CPSil 5 BP-5 otras) En la Figura 3 se pueden observar perfiles cromato-graacuteficos de la fragancia de flores de cafeacute (Coffea arabica Fam Rubiaacutecea) aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm temperatura - 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) obtenidos por GC-MS en columnas de diferente polaridad

La cromatografiacutea de gases enantioselectiva aprovecha el hecho de que los enantioacutemeros poseen tiempos de retencioacuten diferentes cuando en la fase estacionaria se insertan compuestos que pueden formar aductos cuya estabilidad es funcioacuten de la forma tridimensional del analito Las ciclodextrinas con su geometriacutea de cono con cavidad de diferente tamantildeo han resultado ser agentes quirales muy efectivos al constituir complejos de inclusioacuten que permiten discri-minar isoacutemeros seguacuten su forma Las fragancias de jazmiacuten (Jasminum grandiflorum) y otras flo-res (Osmanthus fragrans Boronia megastima) contienen una mezcla de estereoisoacutemeros del jasmonato de metilo Wilfred Koumlnig reportoacute la separacioacuten de todos los isoacutemeros por medio de

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cromatografiacutea de gases preparativa en la que uti-lizoacute columnas empacadas con ciclodextrinas[23] Esto permitioacute confirmar la estimacioacuten hecha por Acree y Barnard de que el isoacutemero (+)-epi-jas-monato de metilo tiene un umbral de olor unas 500 veces maacutes bajo que el del isoacutemero mayorita-rio el (-)-jasmonato de metilo[24]

Los aldehiacutedos y alcoholes lilac son monoterpenos oxigenados que se encuen-tran en especies vegetales de muchas familias Lamiaceae (Origanum vulgare[25]) Orchidaceae (Platanthera sp[26]) Rosaceae (Prunus padus[27]) y Rubiaceae (Cephalanthus occidentalis[25]) son algunos ejemplos de estas familias Cada una de las moleacuteculas lilac posee 3 carbonos quirales lo

que da lugar a 8 estereoisoacutemeros del aldehiacutedo y 8 estereoisoacutemeros del alcohol lilac Doumltterl et al[28] lograron separar todos los isoacutemeros del aldehiacutedo y 7 isoacutemeros del alcohol lilac por medio de un sistema de cromatografiacutea de gases bidimensional en el que una columna capilar de 30 m con fase estacionaria de 5-fenil polimetilsiloxano fue unida por medio de una vaacutelvula T a un detec-tor selectivo de masas y a otra columna capilar de 30 m con una fase estacionaria formada por fenil-poli(dimetilsiloxano) (70) y un derivado de ciclodextrina (30) Cada columna tuvo un horno independiente Este sistema se modificoacute para convertirlo en cromatografiacutea microprepara-tiva La salida de la segunda columna se conectoacute

Figura 3 Cromatogramas tiacutepicos de la fragancia de flores de cafeacute aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) A Columna cromatograacutefica apolar DB-5MS (60 m x 025 mm x 025 mm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) B Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten deficiente de limoneno (LRI = 1030) alcohol benciacutelico (LRI = 1031) y 18-cineol (LRI = 1032) C Columna cromatograacutefica polar DB-WAX (60 m x 025 mm x 025 μm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) D Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten mejor de limoneno y 18-cineol el alcohol benciacutelico tiene un tiempo de retencioacuten mucho maacutes largo (tR =341 min LRI = 1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno tal como sucede en la columna apolar (B)

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a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

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Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

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es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

Referencias

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mezclas de volaacutetiles aislados de flores y a la pre-sencia en ellas de sustancias isomeacutericas (isome-riacutea geomeacutetrica de posicioacuten estereoisomeriacutea) se recomienda hacer su anaacutelisis en columnas capi-lares de siacutelice fundida preferiblemente largas de 50 o 60 m con diaacutemetros internos (DI) de 025 022 o 020 mm Los diaacutemetros internos meno-res aunque permiten aumentar la resolucioacuten eventualmente pueden comprometer tambieacuten la sensibilidad Se usan columnas con el grosor de la fase estacionaria (df) igual o mayor de 025 μm todo ello para que la forma de picos su sepa-racioacuten y la sensibilidad necesaria para su detec-cioacuten reproducible sean adecuadas

Generalmente para la inyeccioacuten de la mues-tra (Tdeg del inyector usualmente de 230-250degC) se puede usar la relacioacuten de split de 130 pero cuando las concentraciones de algunos com-ponentes de intereacutes son bajas es conveniente la inyeccioacuten en modo splitless Cuando se emplea el modo de inyeccioacuten splitless para disminuir la ldquodispersioacutenrdquo o el ensanchamiento de los picos de sustancias muy volaacutetiles se puede hacer la inyec-cioacuten en el modo de splitless pulsado es cuando la presioacuten de entrada del gas de arrastre durante la transferencia de la muestra por el liner se incre-menta unas 2-3 veces Teniendo en cuenta la presencia de algunas sustancias termolaacutebiles la inyeccioacuten on-column o con la programacioacuten de temperatura (con PTV programmed-temperature vaporizer por sus siglas en ingleacutes) podriacutea ser una buena alternativa

Para el anaacutelisis de las fracciones volaacutetiles la temperatura inicial de la columna de 35-50degC seriacutea la recomendable la naturaleza de la muestra (compuestos volaacutetiles) no exige que la tempera-tura final de la columna sea alta la de 200-250degC seraacute suficiente para eluir los componentes maacutes retenidos La velocidad de calentamiento de la columna es funcioacuten de su longitud a mayor lon-gitud maacutes lentamente hay que calentar la colu-

mna 3-4degCmin pero si se usan columnas maacutes cortas eg de 30 m se podriacutea ir incrementando la temperatura de la columna maacutes raacutepidamente a razoacuten de 5-7degCmin Por supuesto el proceso de programacioacuten de la temperatura en la colu-mna es optimizable depende de la complejidad de la mezcla de sustancias a analizar (nuacutemero de componentes isomeriacutea o similitud estructural) su naturaleza (polaridad peso molecular) las dimensiones de la columna (L DI) el tipo de la fase estacionaria (polaridad) y su grosor (df)

Para el anaacutelisis de la fraccioacuten volaacutetil floral se usan en combinacioacuten dos columnas una con la fase estacionaria polar poli(etilenglicol) (eg INNOWAX DB-WAX HP-20M otras) y la otra con la fase estacionaria apolar poli(dimetilsiloxano) (HP-1 Ultra 1 DB-1 BP-1 otras) o 5-fenil poli(dimetilsiloxano) (HP-5 DB-5 Ultra 2 CPSil 5 BP-5 otras) En la Figura 3 se pueden observar perfiles cromato-graacuteficos de la fragancia de flores de cafeacute (Coffea arabica Fam Rubiaacutecea) aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm temperatura - 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) obtenidos por GC-MS en columnas de diferente polaridad

La cromatografiacutea de gases enantioselectiva aprovecha el hecho de que los enantioacutemeros poseen tiempos de retencioacuten diferentes cuando en la fase estacionaria se insertan compuestos que pueden formar aductos cuya estabilidad es funcioacuten de la forma tridimensional del analito Las ciclodextrinas con su geometriacutea de cono con cavidad de diferente tamantildeo han resultado ser agentes quirales muy efectivos al constituir complejos de inclusioacuten que permiten discri-minar isoacutemeros seguacuten su forma Las fragancias de jazmiacuten (Jasminum grandiflorum) y otras flo-res (Osmanthus fragrans Boronia megastima) contienen una mezcla de estereoisoacutemeros del jasmonato de metilo Wilfred Koumlnig reportoacute la separacioacuten de todos los isoacutemeros por medio de

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cromatografiacutea de gases preparativa en la que uti-lizoacute columnas empacadas con ciclodextrinas[23] Esto permitioacute confirmar la estimacioacuten hecha por Acree y Barnard de que el isoacutemero (+)-epi-jas-monato de metilo tiene un umbral de olor unas 500 veces maacutes bajo que el del isoacutemero mayorita-rio el (-)-jasmonato de metilo[24]

Los aldehiacutedos y alcoholes lilac son monoterpenos oxigenados que se encuen-tran en especies vegetales de muchas familias Lamiaceae (Origanum vulgare[25]) Orchidaceae (Platanthera sp[26]) Rosaceae (Prunus padus[27]) y Rubiaceae (Cephalanthus occidentalis[25]) son algunos ejemplos de estas familias Cada una de las moleacuteculas lilac posee 3 carbonos quirales lo

que da lugar a 8 estereoisoacutemeros del aldehiacutedo y 8 estereoisoacutemeros del alcohol lilac Doumltterl et al[28] lograron separar todos los isoacutemeros del aldehiacutedo y 7 isoacutemeros del alcohol lilac por medio de un sistema de cromatografiacutea de gases bidimensional en el que una columna capilar de 30 m con fase estacionaria de 5-fenil polimetilsiloxano fue unida por medio de una vaacutelvula T a un detec-tor selectivo de masas y a otra columna capilar de 30 m con una fase estacionaria formada por fenil-poli(dimetilsiloxano) (70) y un derivado de ciclodextrina (30) Cada columna tuvo un horno independiente Este sistema se modificoacute para convertirlo en cromatografiacutea microprepara-tiva La salida de la segunda columna se conectoacute

Figura 3 Cromatogramas tiacutepicos de la fragancia de flores de cafeacute aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) A Columna cromatograacutefica apolar DB-5MS (60 m x 025 mm x 025 mm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) B Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten deficiente de limoneno (LRI = 1030) alcohol benciacutelico (LRI = 1031) y 18-cineol (LRI = 1032) C Columna cromatograacutefica polar DB-WAX (60 m x 025 mm x 025 μm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) D Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten mejor de limoneno y 18-cineol el alcohol benciacutelico tiene un tiempo de retencioacuten mucho maacutes largo (tR =341 min LRI = 1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno tal como sucede en la columna apolar (B)

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a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

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Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

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es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

Referencias

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mezclas de volaacutetiles aislados de flores y a la pre-sencia en ellas de sustancias isomeacutericas (isome-riacutea geomeacutetrica de posicioacuten estereoisomeriacutea) se recomienda hacer su anaacutelisis en columnas capi-lares de siacutelice fundida preferiblemente largas de 50 o 60 m con diaacutemetros internos (DI) de 025 022 o 020 mm Los diaacutemetros internos meno-res aunque permiten aumentar la resolucioacuten eventualmente pueden comprometer tambieacuten la sensibilidad Se usan columnas con el grosor de la fase estacionaria (df) igual o mayor de 025 μm todo ello para que la forma de picos su sepa-racioacuten y la sensibilidad necesaria para su detec-cioacuten reproducible sean adecuadas

Generalmente para la inyeccioacuten de la mues-tra (Tdeg del inyector usualmente de 230-250degC) se puede usar la relacioacuten de split de 130 pero cuando las concentraciones de algunos com-ponentes de intereacutes son bajas es conveniente la inyeccioacuten en modo splitless Cuando se emplea el modo de inyeccioacuten splitless para disminuir la ldquodispersioacutenrdquo o el ensanchamiento de los picos de sustancias muy volaacutetiles se puede hacer la inyec-cioacuten en el modo de splitless pulsado es cuando la presioacuten de entrada del gas de arrastre durante la transferencia de la muestra por el liner se incre-menta unas 2-3 veces Teniendo en cuenta la presencia de algunas sustancias termolaacutebiles la inyeccioacuten on-column o con la programacioacuten de temperatura (con PTV programmed-temperature vaporizer por sus siglas en ingleacutes) podriacutea ser una buena alternativa

Para el anaacutelisis de las fracciones volaacutetiles la temperatura inicial de la columna de 35-50degC seriacutea la recomendable la naturaleza de la muestra (compuestos volaacutetiles) no exige que la tempera-tura final de la columna sea alta la de 200-250degC seraacute suficiente para eluir los componentes maacutes retenidos La velocidad de calentamiento de la columna es funcioacuten de su longitud a mayor lon-gitud maacutes lentamente hay que calentar la colu-

mna 3-4degCmin pero si se usan columnas maacutes cortas eg de 30 m se podriacutea ir incrementando la temperatura de la columna maacutes raacutepidamente a razoacuten de 5-7degCmin Por supuesto el proceso de programacioacuten de la temperatura en la colu-mna es optimizable depende de la complejidad de la mezcla de sustancias a analizar (nuacutemero de componentes isomeriacutea o similitud estructural) su naturaleza (polaridad peso molecular) las dimensiones de la columna (L DI) el tipo de la fase estacionaria (polaridad) y su grosor (df)

Para el anaacutelisis de la fraccioacuten volaacutetil floral se usan en combinacioacuten dos columnas una con la fase estacionaria polar poli(etilenglicol) (eg INNOWAX DB-WAX HP-20M otras) y la otra con la fase estacionaria apolar poli(dimetilsiloxano) (HP-1 Ultra 1 DB-1 BP-1 otras) o 5-fenil poli(dimetilsiloxano) (HP-5 DB-5 Ultra 2 CPSil 5 BP-5 otras) En la Figura 3 se pueden observar perfiles cromato-graacuteficos de la fragancia de flores de cafeacute (Coffea arabica Fam Rubiaacutecea) aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm temperatura - 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) obtenidos por GC-MS en columnas de diferente polaridad

La cromatografiacutea de gases enantioselectiva aprovecha el hecho de que los enantioacutemeros poseen tiempos de retencioacuten diferentes cuando en la fase estacionaria se insertan compuestos que pueden formar aductos cuya estabilidad es funcioacuten de la forma tridimensional del analito Las ciclodextrinas con su geometriacutea de cono con cavidad de diferente tamantildeo han resultado ser agentes quirales muy efectivos al constituir complejos de inclusioacuten que permiten discri-minar isoacutemeros seguacuten su forma Las fragancias de jazmiacuten (Jasminum grandiflorum) y otras flo-res (Osmanthus fragrans Boronia megastima) contienen una mezcla de estereoisoacutemeros del jasmonato de metilo Wilfred Koumlnig reportoacute la separacioacuten de todos los isoacutemeros por medio de

Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

20 Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25

cromatografiacutea de gases preparativa en la que uti-lizoacute columnas empacadas con ciclodextrinas[23] Esto permitioacute confirmar la estimacioacuten hecha por Acree y Barnard de que el isoacutemero (+)-epi-jas-monato de metilo tiene un umbral de olor unas 500 veces maacutes bajo que el del isoacutemero mayorita-rio el (-)-jasmonato de metilo[24]

Los aldehiacutedos y alcoholes lilac son monoterpenos oxigenados que se encuen-tran en especies vegetales de muchas familias Lamiaceae (Origanum vulgare[25]) Orchidaceae (Platanthera sp[26]) Rosaceae (Prunus padus[27]) y Rubiaceae (Cephalanthus occidentalis[25]) son algunos ejemplos de estas familias Cada una de las moleacuteculas lilac posee 3 carbonos quirales lo

que da lugar a 8 estereoisoacutemeros del aldehiacutedo y 8 estereoisoacutemeros del alcohol lilac Doumltterl et al[28] lograron separar todos los isoacutemeros del aldehiacutedo y 7 isoacutemeros del alcohol lilac por medio de un sistema de cromatografiacutea de gases bidimensional en el que una columna capilar de 30 m con fase estacionaria de 5-fenil polimetilsiloxano fue unida por medio de una vaacutelvula T a un detec-tor selectivo de masas y a otra columna capilar de 30 m con una fase estacionaria formada por fenil-poli(dimetilsiloxano) (70) y un derivado de ciclodextrina (30) Cada columna tuvo un horno independiente Este sistema se modificoacute para convertirlo en cromatografiacutea microprepara-tiva La salida de la segunda columna se conectoacute

Figura 3 Cromatogramas tiacutepicos de la fragancia de flores de cafeacute aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) A Columna cromatograacutefica apolar DB-5MS (60 m x 025 mm x 025 mm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) B Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten deficiente de limoneno (LRI = 1030) alcohol benciacutelico (LRI = 1031) y 18-cineol (LRI = 1032) C Columna cromatograacutefica polar DB-WAX (60 m x 025 mm x 025 μm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) D Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten mejor de limoneno y 18-cineol el alcohol benciacutelico tiene un tiempo de retencioacuten mucho maacutes largo (tR =341 min LRI = 1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno tal como sucede en la columna apolar (B)

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 21

a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

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Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

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es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

Referencias

1 Dudareva NA Pichersky E editors Biology of floral scent Boca Raton CRC Taylor amp Francis Group 2006 346 p

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5 Choi H-S Characterization of Citrus unshiu (C unshiu Marcov Forma Miyagawa-wase) blossom aroma by solid-phase microextraction in conjunction with an electronic nose Journal of Agricultural and Food Chemistry 2003 51418-423 httpdxdoiorg101021jf0114280

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7 Knudsen JT Tollsten L Bergstrom G Floral scents - a checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques Phytochemistry 1993 33253-280 httpdxdoiorg1010160031-9422(93)85502-I

8 Knudsen JT Gershenzon J The chemical diversity of floral scent In Dudareva NA Pichersky E editors Biology of floral scent Boca Raton CRC Taylor amp Francis Group 2006 p 40

9 Tholl D Boland W Hansel A Loreto F Roumlse U Schnitzler J-P Practical approaches to plant volatile analysis Plant Journal 2006 45540-560 httpdxdoiorg101111j1365-313X200502612x

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mezclas de volaacutetiles aislados de flores y a la pre-sencia en ellas de sustancias isomeacutericas (isome-riacutea geomeacutetrica de posicioacuten estereoisomeriacutea) se recomienda hacer su anaacutelisis en columnas capi-lares de siacutelice fundida preferiblemente largas de 50 o 60 m con diaacutemetros internos (DI) de 025 022 o 020 mm Los diaacutemetros internos meno-res aunque permiten aumentar la resolucioacuten eventualmente pueden comprometer tambieacuten la sensibilidad Se usan columnas con el grosor de la fase estacionaria (df) igual o mayor de 025 μm todo ello para que la forma de picos su sepa-racioacuten y la sensibilidad necesaria para su detec-cioacuten reproducible sean adecuadas

Generalmente para la inyeccioacuten de la mues-tra (Tdeg del inyector usualmente de 230-250degC) se puede usar la relacioacuten de split de 130 pero cuando las concentraciones de algunos com-ponentes de intereacutes son bajas es conveniente la inyeccioacuten en modo splitless Cuando se emplea el modo de inyeccioacuten splitless para disminuir la ldquodispersioacutenrdquo o el ensanchamiento de los picos de sustancias muy volaacutetiles se puede hacer la inyec-cioacuten en el modo de splitless pulsado es cuando la presioacuten de entrada del gas de arrastre durante la transferencia de la muestra por el liner se incre-menta unas 2-3 veces Teniendo en cuenta la presencia de algunas sustancias termolaacutebiles la inyeccioacuten on-column o con la programacioacuten de temperatura (con PTV programmed-temperature vaporizer por sus siglas en ingleacutes) podriacutea ser una buena alternativa

Para el anaacutelisis de las fracciones volaacutetiles la temperatura inicial de la columna de 35-50degC seriacutea la recomendable la naturaleza de la muestra (compuestos volaacutetiles) no exige que la tempera-tura final de la columna sea alta la de 200-250degC seraacute suficiente para eluir los componentes maacutes retenidos La velocidad de calentamiento de la columna es funcioacuten de su longitud a mayor lon-gitud maacutes lentamente hay que calentar la colu-

mna 3-4degCmin pero si se usan columnas maacutes cortas eg de 30 m se podriacutea ir incrementando la temperatura de la columna maacutes raacutepidamente a razoacuten de 5-7degCmin Por supuesto el proceso de programacioacuten de la temperatura en la colu-mna es optimizable depende de la complejidad de la mezcla de sustancias a analizar (nuacutemero de componentes isomeriacutea o similitud estructural) su naturaleza (polaridad peso molecular) las dimensiones de la columna (L DI) el tipo de la fase estacionaria (polaridad) y su grosor (df)

Para el anaacutelisis de la fraccioacuten volaacutetil floral se usan en combinacioacuten dos columnas una con la fase estacionaria polar poli(etilenglicol) (eg INNOWAX DB-WAX HP-20M otras) y la otra con la fase estacionaria apolar poli(dimetilsiloxano) (HP-1 Ultra 1 DB-1 BP-1 otras) o 5-fenil poli(dimetilsiloxano) (HP-5 DB-5 Ultra 2 CPSil 5 BP-5 otras) En la Figura 3 se pueden observar perfiles cromato-graacuteficos de la fragancia de flores de cafeacute (Coffea arabica Fam Rubiaacutecea) aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm temperatura - 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) obtenidos por GC-MS en columnas de diferente polaridad

La cromatografiacutea de gases enantioselectiva aprovecha el hecho de que los enantioacutemeros poseen tiempos de retencioacuten diferentes cuando en la fase estacionaria se insertan compuestos que pueden formar aductos cuya estabilidad es funcioacuten de la forma tridimensional del analito Las ciclodextrinas con su geometriacutea de cono con cavidad de diferente tamantildeo han resultado ser agentes quirales muy efectivos al constituir complejos de inclusioacuten que permiten discri-minar isoacutemeros seguacuten su forma Las fragancias de jazmiacuten (Jasminum grandiflorum) y otras flo-res (Osmanthus fragrans Boronia megastima) contienen una mezcla de estereoisoacutemeros del jasmonato de metilo Wilfred Koumlnig reportoacute la separacioacuten de todos los isoacutemeros por medio de

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cromatografiacutea de gases preparativa en la que uti-lizoacute columnas empacadas con ciclodextrinas[23] Esto permitioacute confirmar la estimacioacuten hecha por Acree y Barnard de que el isoacutemero (+)-epi-jas-monato de metilo tiene un umbral de olor unas 500 veces maacutes bajo que el del isoacutemero mayorita-rio el (-)-jasmonato de metilo[24]

Los aldehiacutedos y alcoholes lilac son monoterpenos oxigenados que se encuen-tran en especies vegetales de muchas familias Lamiaceae (Origanum vulgare[25]) Orchidaceae (Platanthera sp[26]) Rosaceae (Prunus padus[27]) y Rubiaceae (Cephalanthus occidentalis[25]) son algunos ejemplos de estas familias Cada una de las moleacuteculas lilac posee 3 carbonos quirales lo

que da lugar a 8 estereoisoacutemeros del aldehiacutedo y 8 estereoisoacutemeros del alcohol lilac Doumltterl et al[28] lograron separar todos los isoacutemeros del aldehiacutedo y 7 isoacutemeros del alcohol lilac por medio de un sistema de cromatografiacutea de gases bidimensional en el que una columna capilar de 30 m con fase estacionaria de 5-fenil polimetilsiloxano fue unida por medio de una vaacutelvula T a un detec-tor selectivo de masas y a otra columna capilar de 30 m con una fase estacionaria formada por fenil-poli(dimetilsiloxano) (70) y un derivado de ciclodextrina (30) Cada columna tuvo un horno independiente Este sistema se modificoacute para convertirlo en cromatografiacutea microprepara-tiva La salida de la segunda columna se conectoacute

Figura 3 Cromatogramas tiacutepicos de la fragancia de flores de cafeacute aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) A Columna cromatograacutefica apolar DB-5MS (60 m x 025 mm x 025 mm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) B Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten deficiente de limoneno (LRI = 1030) alcohol benciacutelico (LRI = 1031) y 18-cineol (LRI = 1032) C Columna cromatograacutefica polar DB-WAX (60 m x 025 mm x 025 μm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) D Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten mejor de limoneno y 18-cineol el alcohol benciacutelico tiene un tiempo de retencioacuten mucho maacutes largo (tR =341 min LRI = 1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno tal como sucede en la columna apolar (B)

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a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

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Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

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es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

Referencias

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2 Scopus Base de datos Elsevier 2013 Consultada en 10-05-2013

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5 Choi H-S Characterization of Citrus unshiu (C unshiu Marcov Forma Miyagawa-wase) blossom aroma by solid-phase microextraction in conjunction with an electronic nose Journal of Agricultural and Food Chemistry 2003 51418-423 httpdxdoiorg101021jf0114280

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7 Knudsen JT Tollsten L Bergstrom G Floral scents - a checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques Phytochemistry 1993 33253-280 httpdxdoiorg1010160031-9422(93)85502-I

8 Knudsen JT Gershenzon J The chemical diversity of floral scent In Dudareva NA Pichersky E editors Biology of floral scent Boca Raton CRC Taylor amp Francis Group 2006 p 40

9 Tholl D Boland W Hansel A Loreto F Roumlse U Schnitzler J-P Practical approaches to plant volatile analysis Plant Journal 2006 45540-560 httpdxdoiorg101111j1365-313X200502612x

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mezclas de volaacutetiles aislados de flores y a la pre-sencia en ellas de sustancias isomeacutericas (isome-riacutea geomeacutetrica de posicioacuten estereoisomeriacutea) se recomienda hacer su anaacutelisis en columnas capi-lares de siacutelice fundida preferiblemente largas de 50 o 60 m con diaacutemetros internos (DI) de 025 022 o 020 mm Los diaacutemetros internos meno-res aunque permiten aumentar la resolucioacuten eventualmente pueden comprometer tambieacuten la sensibilidad Se usan columnas con el grosor de la fase estacionaria (df) igual o mayor de 025 μm todo ello para que la forma de picos su sepa-racioacuten y la sensibilidad necesaria para su detec-cioacuten reproducible sean adecuadas

Generalmente para la inyeccioacuten de la mues-tra (Tdeg del inyector usualmente de 230-250degC) se puede usar la relacioacuten de split de 130 pero cuando las concentraciones de algunos com-ponentes de intereacutes son bajas es conveniente la inyeccioacuten en modo splitless Cuando se emplea el modo de inyeccioacuten splitless para disminuir la ldquodispersioacutenrdquo o el ensanchamiento de los picos de sustancias muy volaacutetiles se puede hacer la inyec-cioacuten en el modo de splitless pulsado es cuando la presioacuten de entrada del gas de arrastre durante la transferencia de la muestra por el liner se incre-menta unas 2-3 veces Teniendo en cuenta la presencia de algunas sustancias termolaacutebiles la inyeccioacuten on-column o con la programacioacuten de temperatura (con PTV programmed-temperature vaporizer por sus siglas en ingleacutes) podriacutea ser una buena alternativa

Para el anaacutelisis de las fracciones volaacutetiles la temperatura inicial de la columna de 35-50degC seriacutea la recomendable la naturaleza de la muestra (compuestos volaacutetiles) no exige que la tempera-tura final de la columna sea alta la de 200-250degC seraacute suficiente para eluir los componentes maacutes retenidos La velocidad de calentamiento de la columna es funcioacuten de su longitud a mayor lon-gitud maacutes lentamente hay que calentar la colu-

mna 3-4degCmin pero si se usan columnas maacutes cortas eg de 30 m se podriacutea ir incrementando la temperatura de la columna maacutes raacutepidamente a razoacuten de 5-7degCmin Por supuesto el proceso de programacioacuten de la temperatura en la colu-mna es optimizable depende de la complejidad de la mezcla de sustancias a analizar (nuacutemero de componentes isomeriacutea o similitud estructural) su naturaleza (polaridad peso molecular) las dimensiones de la columna (L DI) el tipo de la fase estacionaria (polaridad) y su grosor (df)

Para el anaacutelisis de la fraccioacuten volaacutetil floral se usan en combinacioacuten dos columnas una con la fase estacionaria polar poli(etilenglicol) (eg INNOWAX DB-WAX HP-20M otras) y la otra con la fase estacionaria apolar poli(dimetilsiloxano) (HP-1 Ultra 1 DB-1 BP-1 otras) o 5-fenil poli(dimetilsiloxano) (HP-5 DB-5 Ultra 2 CPSil 5 BP-5 otras) En la Figura 3 se pueden observar perfiles cromato-graacuteficos de la fragancia de flores de cafeacute (Coffea arabica Fam Rubiaacutecea) aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm temperatura - 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) obtenidos por GC-MS en columnas de diferente polaridad

La cromatografiacutea de gases enantioselectiva aprovecha el hecho de que los enantioacutemeros poseen tiempos de retencioacuten diferentes cuando en la fase estacionaria se insertan compuestos que pueden formar aductos cuya estabilidad es funcioacuten de la forma tridimensional del analito Las ciclodextrinas con su geometriacutea de cono con cavidad de diferente tamantildeo han resultado ser agentes quirales muy efectivos al constituir complejos de inclusioacuten que permiten discri-minar isoacutemeros seguacuten su forma Las fragancias de jazmiacuten (Jasminum grandiflorum) y otras flo-res (Osmanthus fragrans Boronia megastima) contienen una mezcla de estereoisoacutemeros del jasmonato de metilo Wilfred Koumlnig reportoacute la separacioacuten de todos los isoacutemeros por medio de

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cromatografiacutea de gases preparativa en la que uti-lizoacute columnas empacadas con ciclodextrinas[23] Esto permitioacute confirmar la estimacioacuten hecha por Acree y Barnard de que el isoacutemero (+)-epi-jas-monato de metilo tiene un umbral de olor unas 500 veces maacutes bajo que el del isoacutemero mayorita-rio el (-)-jasmonato de metilo[24]

Los aldehiacutedos y alcoholes lilac son monoterpenos oxigenados que se encuen-tran en especies vegetales de muchas familias Lamiaceae (Origanum vulgare[25]) Orchidaceae (Platanthera sp[26]) Rosaceae (Prunus padus[27]) y Rubiaceae (Cephalanthus occidentalis[25]) son algunos ejemplos de estas familias Cada una de las moleacuteculas lilac posee 3 carbonos quirales lo

que da lugar a 8 estereoisoacutemeros del aldehiacutedo y 8 estereoisoacutemeros del alcohol lilac Doumltterl et al[28] lograron separar todos los isoacutemeros del aldehiacutedo y 7 isoacutemeros del alcohol lilac por medio de un sistema de cromatografiacutea de gases bidimensional en el que una columna capilar de 30 m con fase estacionaria de 5-fenil polimetilsiloxano fue unida por medio de una vaacutelvula T a un detec-tor selectivo de masas y a otra columna capilar de 30 m con una fase estacionaria formada por fenil-poli(dimetilsiloxano) (70) y un derivado de ciclodextrina (30) Cada columna tuvo un horno independiente Este sistema se modificoacute para convertirlo en cromatografiacutea microprepara-tiva La salida de la segunda columna se conectoacute

Figura 3 Cromatogramas tiacutepicos de la fragancia de flores de cafeacute aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) A Columna cromatograacutefica apolar DB-5MS (60 m x 025 mm x 025 mm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) B Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten deficiente de limoneno (LRI = 1030) alcohol benciacutelico (LRI = 1031) y 18-cineol (LRI = 1032) C Columna cromatograacutefica polar DB-WAX (60 m x 025 mm x 025 μm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) D Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten mejor de limoneno y 18-cineol el alcohol benciacutelico tiene un tiempo de retencioacuten mucho maacutes largo (tR =341 min LRI = 1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno tal como sucede en la columna apolar (B)

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a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

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Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

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es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

Referencias

1 Dudareva NA Pichersky E editors Biology of floral scent Boca Raton CRC Taylor amp Francis Group 2006 346 p

2 Scopus Base de datos Elsevier 2013 Consultada en 10-05-2013

3 Stashenko EE Martiacutenez JR Sampling flower scent for chromatographic analysis Journal of Separation Science 2008 312022-2031 httpdxdoiorg101002jssc200800151

4 Stashenko EE Martiacutenez JR Sampling volatile compounds from natural products with headspacesolid-phase micro-extraction Journal of Biochemical and Biophysical Methods 2007 70235-242 httpdxdoiorg101016jjbbm200608011

5 Choi H-S Characterization of Citrus unshiu (C unshiu Marcov Forma Miyagawa-wase) blossom aroma by solid-phase microextraction in conjunction with an electronic nose Journal of Agricultural and Food Chemistry 2003 51418-423 httpdxdoiorg101021jf0114280

6 Knudsen JT Eriksson R Gershenzon J Staringhl B Diversity and distribution of floral scent Botanical Review 2006 721-120 httpdxdoiorg1016630006-8101(2006)72[1DADOFS]20CO2

7 Knudsen JT Tollsten L Bergstrom G Floral scents - a checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques Phytochemistry 1993 33253-280 httpdxdoiorg1010160031-9422(93)85502-I

8 Knudsen JT Gershenzon J The chemical diversity of floral scent In Dudareva NA Pichersky E editors Biology of floral scent Boca Raton CRC Taylor amp Francis Group 2006 p 40

9 Tholl D Boland W Hansel A Loreto F Roumlse U Schnitzler J-P Practical approaches to plant volatile analysis Plant Journal 2006 45540-560 httpdxdoiorg101111j1365-313X200502612x

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mezclas de volaacutetiles aislados de flores y a la pre-sencia en ellas de sustancias isomeacutericas (isome-riacutea geomeacutetrica de posicioacuten estereoisomeriacutea) se recomienda hacer su anaacutelisis en columnas capi-lares de siacutelice fundida preferiblemente largas de 50 o 60 m con diaacutemetros internos (DI) de 025 022 o 020 mm Los diaacutemetros internos meno-res aunque permiten aumentar la resolucioacuten eventualmente pueden comprometer tambieacuten la sensibilidad Se usan columnas con el grosor de la fase estacionaria (df) igual o mayor de 025 μm todo ello para que la forma de picos su sepa-racioacuten y la sensibilidad necesaria para su detec-cioacuten reproducible sean adecuadas

Generalmente para la inyeccioacuten de la mues-tra (Tdeg del inyector usualmente de 230-250degC) se puede usar la relacioacuten de split de 130 pero cuando las concentraciones de algunos com-ponentes de intereacutes son bajas es conveniente la inyeccioacuten en modo splitless Cuando se emplea el modo de inyeccioacuten splitless para disminuir la ldquodispersioacutenrdquo o el ensanchamiento de los picos de sustancias muy volaacutetiles se puede hacer la inyec-cioacuten en el modo de splitless pulsado es cuando la presioacuten de entrada del gas de arrastre durante la transferencia de la muestra por el liner se incre-menta unas 2-3 veces Teniendo en cuenta la presencia de algunas sustancias termolaacutebiles la inyeccioacuten on-column o con la programacioacuten de temperatura (con PTV programmed-temperature vaporizer por sus siglas en ingleacutes) podriacutea ser una buena alternativa

Para el anaacutelisis de las fracciones volaacutetiles la temperatura inicial de la columna de 35-50degC seriacutea la recomendable la naturaleza de la muestra (compuestos volaacutetiles) no exige que la tempera-tura final de la columna sea alta la de 200-250degC seraacute suficiente para eluir los componentes maacutes retenidos La velocidad de calentamiento de la columna es funcioacuten de su longitud a mayor lon-gitud maacutes lentamente hay que calentar la colu-

mna 3-4degCmin pero si se usan columnas maacutes cortas eg de 30 m se podriacutea ir incrementando la temperatura de la columna maacutes raacutepidamente a razoacuten de 5-7degCmin Por supuesto el proceso de programacioacuten de la temperatura en la colu-mna es optimizable depende de la complejidad de la mezcla de sustancias a analizar (nuacutemero de componentes isomeriacutea o similitud estructural) su naturaleza (polaridad peso molecular) las dimensiones de la columna (L DI) el tipo de la fase estacionaria (polaridad) y su grosor (df)

Para el anaacutelisis de la fraccioacuten volaacutetil floral se usan en combinacioacuten dos columnas una con la fase estacionaria polar poli(etilenglicol) (eg INNOWAX DB-WAX HP-20M otras) y la otra con la fase estacionaria apolar poli(dimetilsiloxano) (HP-1 Ultra 1 DB-1 BP-1 otras) o 5-fenil poli(dimetilsiloxano) (HP-5 DB-5 Ultra 2 CPSil 5 BP-5 otras) En la Figura 3 se pueden observar perfiles cromato-graacuteficos de la fragancia de flores de cafeacute (Coffea arabica Fam Rubiaacutecea) aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm temperatura - 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) obtenidos por GC-MS en columnas de diferente polaridad

La cromatografiacutea de gases enantioselectiva aprovecha el hecho de que los enantioacutemeros poseen tiempos de retencioacuten diferentes cuando en la fase estacionaria se insertan compuestos que pueden formar aductos cuya estabilidad es funcioacuten de la forma tridimensional del analito Las ciclodextrinas con su geometriacutea de cono con cavidad de diferente tamantildeo han resultado ser agentes quirales muy efectivos al constituir complejos de inclusioacuten que permiten discri-minar isoacutemeros seguacuten su forma Las fragancias de jazmiacuten (Jasminum grandiflorum) y otras flo-res (Osmanthus fragrans Boronia megastima) contienen una mezcla de estereoisoacutemeros del jasmonato de metilo Wilfred Koumlnig reportoacute la separacioacuten de todos los isoacutemeros por medio de

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cromatografiacutea de gases preparativa en la que uti-lizoacute columnas empacadas con ciclodextrinas[23] Esto permitioacute confirmar la estimacioacuten hecha por Acree y Barnard de que el isoacutemero (+)-epi-jas-monato de metilo tiene un umbral de olor unas 500 veces maacutes bajo que el del isoacutemero mayorita-rio el (-)-jasmonato de metilo[24]

Los aldehiacutedos y alcoholes lilac son monoterpenos oxigenados que se encuen-tran en especies vegetales de muchas familias Lamiaceae (Origanum vulgare[25]) Orchidaceae (Platanthera sp[26]) Rosaceae (Prunus padus[27]) y Rubiaceae (Cephalanthus occidentalis[25]) son algunos ejemplos de estas familias Cada una de las moleacuteculas lilac posee 3 carbonos quirales lo

que da lugar a 8 estereoisoacutemeros del aldehiacutedo y 8 estereoisoacutemeros del alcohol lilac Doumltterl et al[28] lograron separar todos los isoacutemeros del aldehiacutedo y 7 isoacutemeros del alcohol lilac por medio de un sistema de cromatografiacutea de gases bidimensional en el que una columna capilar de 30 m con fase estacionaria de 5-fenil polimetilsiloxano fue unida por medio de una vaacutelvula T a un detec-tor selectivo de masas y a otra columna capilar de 30 m con una fase estacionaria formada por fenil-poli(dimetilsiloxano) (70) y un derivado de ciclodextrina (30) Cada columna tuvo un horno independiente Este sistema se modificoacute para convertirlo en cromatografiacutea microprepara-tiva La salida de la segunda columna se conectoacute

Figura 3 Cromatogramas tiacutepicos de la fragancia de flores de cafeacute aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) A Columna cromatograacutefica apolar DB-5MS (60 m x 025 mm x 025 mm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) B Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten deficiente de limoneno (LRI = 1030) alcohol benciacutelico (LRI = 1031) y 18-cineol (LRI = 1032) C Columna cromatograacutefica polar DB-WAX (60 m x 025 mm x 025 μm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) D Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten mejor de limoneno y 18-cineol el alcohol benciacutelico tiene un tiempo de retencioacuten mucho maacutes largo (tR =341 min LRI = 1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno tal como sucede en la columna apolar (B)

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a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

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Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

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es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

Referencias

1 Dudareva NA Pichersky E editors Biology of floral scent Boca Raton CRC Taylor amp Francis Group 2006 346 p

2 Scopus Base de datos Elsevier 2013 Consultada en 10-05-2013

3 Stashenko EE Martiacutenez JR Sampling flower scent for chromatographic analysis Journal of Separation Science 2008 312022-2031 httpdxdoiorg101002jssc200800151

4 Stashenko EE Martiacutenez JR Sampling volatile compounds from natural products with headspacesolid-phase micro-extraction Journal of Biochemical and Biophysical Methods 2007 70235-242 httpdxdoiorg101016jjbbm200608011

5 Choi H-S Characterization of Citrus unshiu (C unshiu Marcov Forma Miyagawa-wase) blossom aroma by solid-phase microextraction in conjunction with an electronic nose Journal of Agricultural and Food Chemistry 2003 51418-423 httpdxdoiorg101021jf0114280

6 Knudsen JT Eriksson R Gershenzon J Staringhl B Diversity and distribution of floral scent Botanical Review 2006 721-120 httpdxdoiorg1016630006-8101(2006)72[1DADOFS]20CO2

7 Knudsen JT Tollsten L Bergstrom G Floral scents - a checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques Phytochemistry 1993 33253-280 httpdxdoiorg1010160031-9422(93)85502-I

8 Knudsen JT Gershenzon J The chemical diversity of floral scent In Dudareva NA Pichersky E editors Biology of floral scent Boca Raton CRC Taylor amp Francis Group 2006 p 40

9 Tholl D Boland W Hansel A Loreto F Roumlse U Schnitzler J-P Practical approaches to plant volatile analysis Plant Journal 2006 45540-560 httpdxdoiorg101111j1365-313X200502612x

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cromatografiacutea de gases preparativa en la que uti-lizoacute columnas empacadas con ciclodextrinas[23] Esto permitioacute confirmar la estimacioacuten hecha por Acree y Barnard de que el isoacutemero (+)-epi-jas-monato de metilo tiene un umbral de olor unas 500 veces maacutes bajo que el del isoacutemero mayorita-rio el (-)-jasmonato de metilo[24]

Los aldehiacutedos y alcoholes lilac son monoterpenos oxigenados que se encuen-tran en especies vegetales de muchas familias Lamiaceae (Origanum vulgare[25]) Orchidaceae (Platanthera sp[26]) Rosaceae (Prunus padus[27]) y Rubiaceae (Cephalanthus occidentalis[25]) son algunos ejemplos de estas familias Cada una de las moleacuteculas lilac posee 3 carbonos quirales lo

que da lugar a 8 estereoisoacutemeros del aldehiacutedo y 8 estereoisoacutemeros del alcohol lilac Doumltterl et al[28] lograron separar todos los isoacutemeros del aldehiacutedo y 7 isoacutemeros del alcohol lilac por medio de un sistema de cromatografiacutea de gases bidimensional en el que una columna capilar de 30 m con fase estacionaria de 5-fenil polimetilsiloxano fue unida por medio de una vaacutelvula T a un detec-tor selectivo de masas y a otra columna capilar de 30 m con una fase estacionaria formada por fenil-poli(dimetilsiloxano) (70) y un derivado de ciclodextrina (30) Cada columna tuvo un horno independiente Este sistema se modificoacute para convertirlo en cromatografiacutea microprepara-tiva La salida de la segunda columna se conectoacute

Figura 3 Cromatogramas tiacutepicos de la fragancia de flores de cafeacute aislada por HS-SPME (CARPDMS 65 μm 60degC tiempo de exposicioacuten de la fibra ndash 30 min) A Columna cromatograacutefica apolar DB-5MS (60 m x 025 mm x 025 mm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) B Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten deficiente de limoneno (LRI = 1030) alcohol benciacutelico (LRI = 1031) y 18-cineol (LRI = 1032) C Columna cromatograacutefica polar DB-WAX (60 m x 025 mm x 025 μm) Detector selectivo de masas (MSD EI 70 eV) D Fragmento ampliado del mismo cromatograma donde se observa la separacioacuten mejor de limoneno y 18-cineol el alcohol benciacutelico tiene un tiempo de retencioacuten mucho maacutes largo (tR =341 min LRI = 1895) en la columna polar y no co-eluye con limoneno tal como sucede en la columna apolar (B)

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a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

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Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

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es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

Referencias

1 Dudareva NA Pichersky E editors Biology of floral scent Boca Raton CRC Taylor amp Francis Group 2006 346 p

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8 Knudsen JT Gershenzon J The chemical diversity of floral scent In Dudareva NA Pichersky E editors Biology of floral scent Boca Raton CRC Taylor amp Francis Group 2006 p 40

9 Tholl D Boland W Hansel A Loreto F Roumlse U Schnitzler J-P Practical approaches to plant volatile analysis Plant Journal 2006 45540-560 httpdxdoiorg101111j1365-313X200502612x

Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS Stashenko EE Martiacutenez JR

Scientia Chromatographica 2013 5(1)7-25 21

a un divisor de flujo que permitioacute dirigir una parte del efluente hacia un detector de ioniza-cioacuten en llama y la otra parte hacia una barra de agitacioacuten recubierta de PDMS para absorber los analitos separados Esta modificacioacuten permitioacute recoger los isoacutemeros que luego se emplearon en experimentos de electroantenografiacutea en los que se utilizaron antenas de diferentes insectos para examinar si habiacutea alguna respuesta selectiva para alguno de los isoacutemeros Se encontroacute que las ante-nas de la polilla Hadena bicruris respondieron a los 8 isoacutemeros de aldehiacutedo lilac pero fueron maacutes sensibles a algunos isoacutemeros que a otros

El sistema de deteccioacuten maacutes comuacuten para el anaacutelisis comparativo y para la cuantificacioacuten de compuestos en las fracciones volaacutetiles aisladas de flores es el detector de ionizacioacuten en llama (FID) un sistema simple robusto con una sen-sibilidad aceptable y un amplio rango dinaacutemico Los detectores selectivos tales como el detector de nitroacutegeno y foacutesforo (NPD) y el detector foto-meacutetrico de llama (FPD) son herramientas muy uacutetiles para la deteccioacuten selectiva de compuestos nitrogenados y azufrados muy frecuentes en las fragancias florales

Un ejemplo interesante de la aplicacioacuten de la antenografiacutea al estudio de la relacioacuten planta--insecto es el trabajo de Balao et al[29] sobre la emisioacuten de volaacutetiles por las flores de Dianthus inoxianus Esta especie es polinizada uacutenicamente durante la noche por solamente un tipo de poli-nizador Hyles livornica un insecto que poliniza un buen nuacutemero de especies diferentes La esen-cia floral de D inoxianus contiene 68 compues-tos volatiles pero estaacute dominada por sustancias alifaacuteticas que poseen un grupo cetona en la posi-cioacuten 2 El anaacutelisis cromatograacutefico mostroacute que la cantidad total de volaacutetiles liberados durante el diacutea es similar a la de la noche lo cual no se corre-laciona con la actividad del insecto polinizador Sin embargo la electroantenografiacutea permitioacute

determinar cuaacuteles compuestos volaacutetiles causan respuesta en las antenas de machos y hembras de H livornica Al seguir su variacioacuten entre diacutea y noche se encontroacute que la proporcioacuten de com-puestos activos aumenta en la noche lo que sirve de sentildeal para atraer al insecto polinizador

El ejemplo anterior muestra un tipo de experimento que solamente es posible al dispo-ner de un detector de alta especificidad Empero el sistema de deteccioacuten maacutes importante y de mayor uso en el anaacutelisis de mezclas volaacutetiles es el detector selectivo de masas (MSD) su combina-cioacuten con la cromatografiacutea capilar (GC-MS) es un instrumento perfecto para lograr la separacioacuten e identificacioacuten (presuntiva o confirmatoria) de componentes presentes en una mezcla

El modo de ionizacioacuten maacutes empleado para el anaacutelisis de sustancias volaacutetiles es el impacto con electrones (EI) de 70 eV de energiacutea Los espectros de masas (MS) de EI contienen mucha informacioacuten porque en el espectro aparecen sentildeales de numerosos fragmentos ionizados que forman una combinacioacuten uacutenica y que per-mite diferenciar una moleacutecula de la otra En la Figura 4 aparecen espectros de masas de dos sesquiterpenos b-cariofileno y αndashhumuleno presentes frecuentemente en flores y plantas en general La masa (mz) de fragmentos (iones o ion-radicales) y sus abundancias relativas que conforman el patroacuten de fragmentacioacuten son la guiacutea para diferenciar las estructuras Los iacutendi-ces de retencioacuten lineales (LRI por sus siglas en ingleacutes) de ambos sesquiterpenos se diferencian en 15-20 unidades para columnas de fases esta-cionarias polar y apolar Los LRI medidos expe-rimentalmente en las columnas polar y apolar se comparan con los registrados en la literatura o en bases de datos[30-35]

Sin embargo hay situaciones maacutes comple-jas es cuando los espectros de masas y LRI de las sustancias son similares y el margen de duda

Stashenko EE Martiacutenez JR Anaacutelisis de fragancias florales por GC-MS

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Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

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es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

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Figura 4 Espectros de masas de impacto con electrones (EI 70 eV) de los sesquiterpenos isomeacutericos b-cariofileno y α-humuleno que presentan patrones de fragmentacioacuten claramente distinguibles [Tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] Sus iacutendices de retencioacuten lineales (LRI) se diferencian en 15-20 unidades en columnas apolares eg DB-1 [poli(dimetilsiloxano)] o DB-5 [5-fenil poli(metilsiloxano)][3134] lo que ayuda a diferenciarlos por su retencioacuten en la columna apolar o polar

Figura 5 Espectros de masas de impacto de electrones (EI 70 eV) de safrol e isosafrol que presentan patrones de fragmentacioacuten muy similares [tomado de NIST Chemistry WebBook NIST Standard Reference Database Number 69 httpwebbooknistgov] que no permiten diferenciarlos solo con base en sus espectros de masas

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es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

Agradecimientos

Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

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es bastante amplio En la Figura 5 aparecen los espectros de masas (EI 70 eV) de safrol y de su isoacutemero isosafrol El isosafrol puede existir en dos formas geomeacutetricas isoacutemero cis- e isoacutemero trans- Es difiacutecil diferenciar las dos sustancias por sus espectros de masas solo se observan pequentildeas diferencias cuantitativas en las abun-dancias de algunos iones Los LRI de los isoacuteme-ros no se diferencian mucho en unas 5-7 unida-des lo que no permite diferenciarlos con base en este paraacutemetro[36] en este caso para la identifica-cioacuten confirmatoria del compuesto se requiere el uso de una sustancia certificada (patroacuten)

En el caso de estudio de emisiones flora-les y la relacioacuten de algunos componentes como atrayentes de polinizadores la identificacioacuten confirmatoria es importante pero para muchas sustancias no hay patrones comerciales enton-ces se recurre a la siacutentesis de la sustancia para su identificacioacuten quiacutemica completa

El anaacutelisis del aceite esencial de las flores de ylang-ylang por cromatografiacutea completa con analizador de tiempo de vuelo GCxGC-TOFMS permitioacute detectar un total de 161 compuestos de los cuales 75 no habiacutean sido encontrados en el anaacutelisis GC-MS unidimensional[37] Sin embargo a pesar de que la segunda dimensioacuten cromato-graacutefica permite un aumento dramaacutetico en la resolucioacuten algunos compuestos pudieron ser clasificados seguacuten su naturaleza quiacutemica pero no se logroacute su identificacioacuten completa debido a su gran similitud espectral con otros componen-tes y a la carencia de sustancias patroacuten

En resumen las fragancias florales son mezclas complejas cuyo estudio requiere una seleccioacuten cuidadosa de las teacutecnicas de aisla-miento y de anaacutelisis instrumental Gracias a los avances en estos campos es posible ahora lograr una caracterizacioacuten detallada de los compuestos volaacutetiles emitidos por las flores hasta distinguir entre diversos estereoisoacutemeros

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Los autores agradecen la financiacioacuten del Patrimonio Autoacutenomo Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia la Tecnologiacutea y la Innovacioacuten Francisco Joseacute de Caldas contrato RC 0572-2012 Tambieacuten agradecen a Martha Cervantes MSc por su colaboracioacuten con buacutes-quedas bibliograacuteficas

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Recebido 13042013

Aceito 21052013