análisis de la estructura del picoplancton y sus patrones
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Análisis de la estructura del picoplancton y suspatrones biogeográficos en lagos comprendidos
en una transecta Patagónico-AntárticaSchiaffino, María Romina
2012
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesUniversidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
Contacto: [email protected]
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica conreconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir.It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source.
Fuente / source: Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Ecología, Genética y Evolución
Análisis de la estructura del picoplancton y sus
patrones biogeográficos en lagos comprendidos
en una transecta Patagónico-Antártica
Tesis presentada para optar por el título de Doctor de la Universidad de
Buenos Aires en el área Ciencias Biológicas
María Romina Schiaffino
Director de Tesis: Dra. Irina Izaguirre
Consejero de estudios: Dra. Irina Izaguirre
Lugar de Trabajo: Laboratorio de Limnología Buenos Aires, 2011
ÍNDICE
Resumen …………………………………………………………………………………....….i
Summary ……………………………………………………………………………...…...…..ii
Agradecimientos …………………………………………………………………….…...iii-v
Dedicatoria ………………………………………………………………………..……….....vi
Introducción general ……..……………………………………………….....................1-9
Objetivos ………………………………………………………………………………….....10
Área de estudio …………………………………………………………….................11-16
Capítulo I
Estructura del picoplancton en lagos antárticos
Introducción…………………………………………………………………………...…...17-20
Estudio de la composición y diversidad del picoplan cton en lagos antárticos y su
variación temporal
Materiales y Métodos…………………………………………………...........................21-29
Resultados………………………………………………………………………….…..….29-58
Estudio cuantitativo de bacterias y arqueas en lago s antárticos y su variación
temporal
Materiales y Métodos…………………………………………………...........................59-60
Resultados…………………………………………………………………………..….....60-66
Discusión………………………………………………………………………………..…67-73
Capítulo II
Estructura del picoplancton en lagos patagónicos
Introducción……………………………………………………………………………..…74-75
Estudio de la composición y diversidad del picoplan cton en lagos patagónicos
Materiales y Métodos…………………………………………………...........................76-80
Resultados……………………………………………………………………….……….80-105
Estudio cuantitativo de bacterias y arqueas en lago s patagónicos
Materiales y Métodos…………………………………………………..............................106
Resultados……………………………………………………………………………...106-111
Discusión…………………………………………………………………………...…...112-116
Capítulo III
Análisis de los patrones biogeográficos del picopla ncton a lo largo del
gradiente latitudinal patagónico-antártico
Introducción……………………………………………………………………….….…117-120
Materiales y Métodos……………………………………….....................................120-123
Resultados……………………………………………………………………………...124-142
Discusión…………………………………………………………………………..……143-146
Capítulo IV
Análisis cuantitativo del picoplancton a lo largo d el gradiente latitudinal
patagónico-antártico
Introducción……………………………………………………………….………….…147-150
Materiales y Métodos………………………………………………...........................150-153
Resultados……………………………………………………………………………...153-172
Discusión………………………………………………………………………………..173-177
Resumen y conclusiones generales ………………………………………….178-183
Anexos
Anexo I DGGE …………………………………………………………………………184-187
Anexo II CARD-FISH……………………………………………………………….….187-191
Bibliografía …………………………………………………………………………...192-213
RESUMEN
i
Análisis de la estructura del picoplancton y sus pa trones biogeográficos
en lagos comprendidos en una transecta Patagónico-A ntártica
En esta tesis se estudiaron 45 cuerpos de agua (lagos, lagunas y lagunas temporarias)
ubicados a lo largo de un gradiente latitudinal que se extiende desde Patagonia Austral
Argentina (45º 22' S) hasta Antártida Marítima (63º 24' S), con el objetivo central de
analizar la estructura (abundancia, composición y diversidad) del picoplancton
autotrófico y heterotrófico. Los estudios involucraron un enfoque polifacético mediante
la utilización de técnicas moleculares, microscopía de epifluorescencia y citometría de
flujo. Otro de los objetivos principales fue analizar la existencia de patrones
biogeográficos para estos microorganismos. Los resultados obtenidos constituyen un
importante aporte al conocimiento de la estructura de los distintos componentes
picoplanctónicos en estos ambientes únicos y permiten avanzar en el conocimiento de
sus patrones biogeográficos a lo largo de escalas espaciales extensas (>2100 km).
Las investigaciones realizadas mostraron que al aumentar la distancia geográfica
disminuyó significativamente la similitud en la composición del picoplancton, y a pesar
de que algunas secuencias y muchas unidades taxonómicas operativas (OTUs) fueron
compartidas entre Patagonia y Antártida (60-70%), la composición de estas
comunidades fue significativamente diferente. Por otro lado, se observaron diferencias
en la composición del picoplancton entre los lagos relacionadas con su estado trófico.
La influencia de los factores ambientales locales y geográficos en el modelado de las
comunidades picoplanctónicas revela que ambos controlan la estructura del
picoplancton, sugiriendo una distribución no aleatoria del picoplancton y aportando
nuevas evidencias que apoyan la hipótesis de la existencia de patrones biogeográficos
en la ecología microbiana.
Palabras claves : picoplancton, lagos patagónicos, lagos antárticos, gradiente
latitudinal, ecología microbiana.
RESUMEN
ii
Analysis of the structure of picoplankton and their biogeographic patterns
in lakes along a Patagonian-Antarctic transect
In this Doctoral Thesis the structure (abundance, composition and diversity) of
autotrophic and heterotrophic picoplankton of 45 freshwater environments (lakes,
shallow lakes and ponds) located along a latitudinal gradient from Southern
Argentinean Patagonia (45º 22' S) to Maritime Antarctica (63º 24' S) was analyzed. The
studies involved a polyphasic approach combining molecular techniques,
epifluorescence microscopy and flow cytometry. The existence of biogeographic
patterns for these microorganisms was also analyzed. The results constitute an
important contribution to the knowledge of the structure of the different picoplanktonic
components in these unique environments and allow understanding patterns over large
spatial scales (>2100 km). The results showed that with increasing geographic
distance, the similarity in the composition of picoplankton significantly decreased, and
even though some sequences and a high percentage of OTUs (operational taxonomic
units) were shared between Patagonia and Antarctica (60%-70%), the composition of
these communities was significantly different. On the other hand, differences in the
picoplankton structure among the lakes were also related with their trophic state. The
influence of local environmental factors and geographic factors on picoplankton
communities reveals that both control and shape the structure of picoplankton,
suggesting a nonrandom distribution of picoplankton and providing new evidence
supporting the hypothesis of biogeographic patterns in microbial ecology.
Keywords : picoplankton, Patagonian lakes, Antarctic lakes, latitudinal gradient,
microbial ecology.
AGRADECIMIENTOS
iii
AGRADECIMIENTOS
En primera instancia quiero agradecer a mi directora de tesis, Irina, que siempre me ha
dado muchas oportunidades y me ha apoyado en todo momento. Recuerdo el día que
fui a golpear la puerta del laboratorio…allá por el 2002...para preguntarle si podía
hacer una pasantía en el Labo de Limno. Su respuesta fue positiva y desde entonces
siempre, a pesar de mis idas y venidas, ella me dio la oportunidad de crecer, aprender,
formarme y de brindarme una guía. Así que muchísimas gracias por todo esto y por
estar….incluso hasta los fines de semana!
A Guillermo, por darme la oportunidad también de trabajar en el laboratorio, por sus
valiosísimos comentarios acerca de la ciencia y por el tenis que alguna vez hemos
compartido!
A Haydée, por su afectuosa y simpática presencia, por las cartas de recomendación
que alguna vez te he pedido. Que bien la pasamos en el viaje a St. John´s! Me
quedaron muy lindos recuerdos!
A Inés, gracias por tu siempre generosa ayuda, por las cartas de recomendación que
también te he “mangueado” en algún momento y por los mates compartidos!
A Rubén, por dedicar parte de su tiempo a instruirme en estadística y otras cuestiones
ecológicas, por su buena onda, y por último, pero no menos importante, por compartir
algún partidito de tenis!
A Alicia, por tu buena disposición, aportes bibliográficos y por algún que otro turrón
que generosamente me has regalado cuando el apetito me arrebataba!
A Fer, si bien he protestado cuando veía tus comentarios y críticas sobre los paper
que escribí, ahora entiendo que de eso se trata la ciencia…nunca hay que perder el
sentido crítico y te agradezco por recordarme esto. Además te agradezco porque
siempre estuviste ahí, ayudándome…..hasta cuando hice Limno…que eras ayudante!
A Lauri, compañera y amiga de ruta desde los comienzos de este camino que empezó
hace unos 5 años. Juntas pasamos tragos amargos….como el garronazo de haber
perdido todo luego de haber trabajado arduamente en la Antártida….pero también muy
buenos momentos que no se van a borrar nunca y lo mas importante y valioso es que
hemos aprendido mucho de todo esto!!! Gracias Laurita por estar ahí!
AGRADECIMIENTOS
iv
A Paty, que siempre me escucha…aunque a veces yo más a ella….gracias porque
siempre estuviste presente hasta en los momentos más turbulentos y de cambios. A
Luchy, por transmitirme esa tranquilidad y calma, por los consejos, por los mates y los
tecitos después del almuerzo. A Rodri, por ayudarme constantemente con los
programas, gráficos y demás temas tecnológicos, y por hacerme reír tanto. A Euge por
la alegría que transmite (salvo en contadas excepciones de días con mal humor y
silencio absoluto). A Sole (mi vecina!), Gri, Paulita, Sol, Juancito, Pablo, Vicky, Gabita
y Gaby. Muchas gracias a todos por la buena onda!!!
A María, recuerdo que todo empezó con un viaje a Tucumán…..o antes quizás cuando
viajé a Chasco para ver como extraías ADN….gracias porque todo el tiempo aprendí
mucho con vos y de vos, y me ayudaste incondicionalmente!
A Horacio y Marce, muchísimas gracias por su buena onda y hospitalidad!!!
A los demás integrantes del labo de aguas de Chascomús: Paulina, Anita (ex Chasco),
Nadia, Gonza, Leo, Roberto y Pepe. Gracias por la buena onda y los mates
compartidos durante mis estadías allá!
A la gente de España: Muy especialmente a Josep Gasol y Ramón Massana por la
colaboración y ayuda brindada en todo momento. Pep, muchas gracias por tu
valiosísimo aporte y ayuda con la Citometría. A Vane, muchas gracias por haberme
aguantado cuando estuve ahí! Por haberme instruido en la biología
molecular….cuantas DGGEs hemos hecho!!!! A Irene y Clara por la ayuda brindada
durante mi estadía. Ha sido un placer conocerlos a todos y haber estado ahí. Gracias,
porque recibí mucho de todos ustedes!
A mis Papás, que me preguntan todo el tiempo cuando voy a terminar de estudiar y
cuando voy a parar con todo esto....espero que nunca! Les agradezco por estar ahí y
espero que sea por un largo tiempo más. Los quiero muchísimo viejos!
A mis hermanos y a mi cuña Patito, gracias por el apoyo y por ayudarme siempre que
lo necesité.
A mi abuela, que durante toda mi vida ha estado muy presente y me ha ayudado
incondicionalmente. No me voy a olvidar nunca de los viernes de té…
A mi amiga y hermana del alma, Cari, gracias por estar y por escucharme en todo
momento. Te quiero con todo mi corazón!
AGRADECIMIENTOS
v
A mis amigas Nuevejulienses, la Flaca, Yani, Mane, Vane con las que he compartido
casi toda mi vida….con la mayoría desde jardín! Gracias por estar a mi lado! La quiero
mucho!
A mis amigas de la carrera, Cecy, María del Mar, Mariana con las que he atravesado
el largo camino de la carrera de Licenciatura en Cs. Biológicas. Gracias por los mates,
por la amistad y por el aguante!
A Pablo, gracias por la alegría y el amor que me das. También por el escritorio que me
armaste para que pudiera escribir la tesis! Muchísimas gracias por estar!!!
A las personas que ya no forman parte de mi vida, pero que me han hecho reaccionar
de alguna forma y me han enseñado, sin saberlo, a poner todo en perspectiva y a
darle importancia solo a las cosas que lo merecen (gracias por enseñarme a “ver el
bosque”).
De todos estos años me llevo un aprendizaje y es que si bien creo que la ciencia y el
aportar nuestro granito de arena al inmenso mundo del conocimiento son muy
importantes y valen la pena, lo que uno se lleva son las cosas que ha vivido, el
trayecto del camino, los afectos, las relaciones humanas y lo que se aprende de ellas.
MUCHAS GRACIAS A TODOS!!!
Las campañas antárticas fueron financiadas por proyectos de cooperación entre el
Instituto Antártico Argentino, Universidad de Buenos Aires y el Instituto de Ciencias del
Mar-CSIC. Las expediciones fueron financiadas por los proyectos MIXANTAR
(REN2002-11396-E/ANT) y MICRODIFF (DGICYT REN2001-2120/MAR).
La presente tesis fue financiada por subsidios de la Agencia Nacional de Promoción
Científica y Tecnológica (ANPCYT PICT 32732/2005), del Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET Programa de cooperación científica
Argentina-España “Luis Santaló” 2007AR0018-CSIC y el PIP418 2011-2013) y de la
Universidad de Buenos Aires (UBACyT 101018-2011-2014).
Quiero agradecer al Comando Antártico del Ejército y a los miembros de la Base
Antártica Esperanza por el apoyo logístico.
Quiero agradecer también la colaboración en las campañas y toma de muestras a
Guillermo Tell, Adrián Rua, Fernando Unrein, Patricia Rodríguez, Rodrigo Sinistro y
Laura Sánchez.
DEDICATORIA
vi
A mis padres, a mis hermanos y a mi abuela
INTRODUCCIÓN
GENERAL
INTRODUCCIÓN GENERAL
1
El Picoplancton
El término picoplancton fue introducido por primera vez en la clasificación de tamaños
del plancton publicada por Sieburth et al. (1978). Esta fracción del plancton está
integrada por organismos cuyos tamaños celulares oscilan entre 0,2 y 2 µm, e incluye
tanto células procariotas como células eucariotas (Johnson & Sieburth 1982). Desde el
punto de vista trófico, en el picoplancton encontramos organismos heterotróficos (e.g.
bacterias; arqueobacterias; pequeños flagelados) y autotróficos (e.g. picoeucariotas y
picocianobacterias, ambos fotosintéticos; bacterias anoxigénicas fotosintéticas;
bacterias quimiosintéticas). El picoplancton se encuentra representado por integrantes
de los tres dominios del árbol filogenético propuesto por Woese et al. (1990) para la
división de todos los organismos: Bacteria, Archaea y Eucarya (Figura 1) y tiene una
importancia esencial en el flujo de carbono de los océanos y cuerpos de agua dulce.
En la mayoría de sistemas de agua dulce, el picoplancton fotosintético contribuye entre
un 16 y un 70% a la producción de carbono total (Steitz & Velimirov 1999, Callieri
2008, Greisberger et al. 2007). En particular, en los lagos ultraoligotroficos entre un 50
y 70% del flujo de carbono anual es atribuido a organismos que pasan a través de
filtros con tamaños de poro de 1 a 2 µm (Caron et al. 1985).
Dada su gran abundancia y versatilidad metabólica y fisiológica, estos
microorganismos son capaces de habitar una gran variedad de ambientes, desde
aquellos que ofrecen condiciones ideales para el crecimiento hasta ambientes
extremos cuyas características impiden el desarrollo de cualquier otra forma de vida
(Prosser et al. 2007).
INTRODUCCIÓN GENERAL
2
Figura 1. Árbol filogenético propuesto por Woese et al. (1990) que reagrupa a los
seres vivos en tres grandes Dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya. Figura adaptada
de Pace (2009).
Rol del picoplancton en las tramas microbianas
El picoplancton representa un componente fundamental en el flujo de energía a través
del bucle microbiano (“microbial loop”) conectando los ciclos de carbono y nutrientes
con el esquema de red trófica convencional en los sistemas acuáticos (Figura 2).
INTRODUCCIÓN GENERAL
3
Hacia principios de los años ochenta se comprobó que el carbono procedente de la
descomposición orgánica no se perdía del sistema, sino que se reintroducía mediante
lo que se denominó bucle microbiano, de forma tal que las bacterias que consumen la
materia orgánica disuelta son las responsables de reintroducir en la cadena trófica
este carbono orgánico al ser consumidas por flagelados y ciliados (Azam et al. 1983).
El picoplancton representa un componente clave en las tramas tróficas acuáticas y su
biomasa es un recurso significativo de alimento para muchos organismos (Azam et al.
1983, Cole 1999). En la últimas décadas, su importancia en las cadenas tróficas
acuáticas ha sido bien documentada (e.g. Pomeroy 1974, Azam et al. 1983, Stockner
& Antia 1986, Weisse 1993, Vörös et al. 1998, Callieri & Stockner 2002, Drakare 2002)
y actualmente es ampliamente reconocida la contribución que tiene esta fracción en el
flujo de carbono en muchos sistemas acuáticos, particularmente en sistemas
oligotróficos (Agawin et al. 2000, Bell & Kalff 2001, Richardson & Jackson 2007,
Barber 2007). Azam & colaboradores (1983) fueron los primeros en conceptualizar el
rol del picoplancton en las cadenas trófica microbianas en los océanos y más
recientemente Richardson & Jackson (2007) cambiaron la visión sobre la importancia
del picoplancton en las cadenas tróficas marinas, al establecer que estos
microorganismos transfieren mucho más carbono sintetizado a través de la red trófica
acuática que lo que se asumía previamente, demostrando que el picoplancton puede
ser también una fuente importante de carbono orgánico para la producción del
zooplancton y materia orgánica.
El control ejercido por predadores (“top-down”) sobre el picoplancton es principalmente
ejercido por la actividad de nanoflagelados heterotróficos y mixotróficos y pequeños
ciliados (Callieri 2008), mientras que el control ejercido por los recursos (“bottom-up”)
sobre la abundancia del picoplancton parece estar ejercido particularmente por la
disponibilidad de nutrientes y por demás variables ambientales, como por ejemplo pH,
salinidad, temperatura, luz, calidad y cantidad de materia orgánica disuelta (Stockner &
Porter 1988, Sanders et al. 1992, Burns & Schallenberg 1998, Gasol et al. 2002). Entre
los factores ecológicos que regulan la estructura del picoplancton autotrófico se han
señalado: el estado trófico de los lagos, la morfometría, el régimen térmico, el tiempo
de residencia, los nutrientes, la luz y las interacciones bióticas (Callieri 2008 y citas en
este trabajo).
INTRODUCCIÓN GENERAL
4
Figura 2. Trama trófica acuática convencional (A); incorporación del bucle microbiano
a la trama trófica convencional (B); adición del efecto de virus, del picofitoplancton y de
nuevas interacciones tróficas entre los diferentes niveles (C). Figura adaptada de
Gasol et al. (2005).
Métodos de estudio de la abundancia y diversidad de l picoplancton
Hasta la década del 70 del siglo XX la abundancia e importancia de la fracción
picoplanctónica había sido subestimada o en algunos casos totalmente ignorada en
los sistemas acuáticos debido a que no se contaba con las herramientas adecuadas
para su estudio. Entre los años 70 y 80, gracias a la incorporación de nuevas técnicas
tales como la microscopia de epifluorescencia (Daley & Hobbie 1975), la microscopía
electrónica (Johnson & Sieburth 1982, Takahashi & Hori 1984) y la citometría de flujo
(Olson et al. 1985, Chisholm et al. 1988) se lograron importantes avances en la
ecología, fisiología y taxonomía del picoplancton. No obstante, el estudio de la
diversidad del picoplancton recién fue posible a partir de la incorporación y aplicación
de técnicas de biología molecular basadas en el análisis de diferentes aspectos del
gen que codifica para el ARN ribosomal (ARNr) (Pace et al. 1986). La utilización de
estas técnicas moleculares en la ecología microbiana ha revolucionado el
INTRODUCCIÓN GENERAL
5
conocimiento de los ecosistemas acuáticos y ha influenciado de manera significativa el
entendimiento de la diversidad, distribución y ecología microbiana en ambientes
naturales. Por primera vez fue posible determinar la composición del picoplancton sin
la necesidad de observarlo bajo microscopio o cultivarlo, gracias a que fue obtenida la
secuencia de un gen presente en todos los organismos vivos que codifica para la
subunidad menor del ARNr. Además ha sido posible establecer a partir de secuencias
específicas dentro de este gen las características de determinados grupos de
organismos, así como también la posibilidad de sintetizar sondas moleculares que
reconocen e identifican estas regiones de ADN de los microorganismos que se quieren
identificar. El análisis comparativo de genes filogenéticamente informativos (como es
el caso del ARNr) ha permitido reconocer nuevos linajes filogenéticos, ampliar el mapa
de distribución biogeográfica de los microorganismos y, fundamentalmente, ha puesto
en evidencia que la utilización de las técnicas tradicionales de cultivo microbiológico
para el estudio de la diversidad microbiana deja fuera del análisis a la mayoría de los
microorganismos que habitan en los ambientes naturales (Staley & Konopka 1985). El
análisis filogenético de las secuencias de los genes 16S ARNr (para bacterias y
picocianobacterias) y el 18S ARNr (para picoeucariotas) han resultado una
herramienta muy útil en la evaluación de relaciones filogenéticas (Amann et al. 1995,
Murray et al. 1996, Callieri 2008).
Entre los métodos utilizados en biología molecular se ha desarrollado un tipo de
técnicas PCR (Polymerase Chain Reaction) dependientes que permiten obtener un
“perfil genético” o “huella genética” (fingerprinting) de la comunidad. Estos métodos
aprovechan diferentes propiedades del material genético obtenido a partir de la
muestra ambiental (e.g. longitud de secuencia, presencia o ausencia de sitios de
restricción, comportamiento de desnaturalización) y permiten obtener una rápida
visualización del ensamble microbiano, lo que facilita el análisis de cambios espaciales
y temporales dentro de la comunidad y la comparación entre diferentes comunidades.
Entre los métodos de “huella genética” más utilizados podemos mencionar el análisis
de polimorfismos de longitud en fragmentos terminales de restricción (T-RFLP:
Terminal-Restriction Fragments Length Polymorphism) (Avaniss-Aghajani et al. 1994,
Liu et al. 1997), la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE:
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (Muyzer et al. 1993, 1997), el análisis
automatizado del espacio intergénico ribosomal (ARISA: Automated Ribosomal
Intergenic Spacer Analysis) (Fisher & Triplett 1999, Yannarell & Triplett 2005), entre
otros. Por otro lado, existen otro tipo de técnicas también PCR dependientes como las
bibliotecas genéticas (Giovannoni et al. 1990, Schmidt et al. 1991) y la
INTRODUCCIÓN GENERAL
6
pirosecuenciación (Sogin et al. 2006), esta última permitiendo obtener además
información de los componentes minoritarios o menos abundantes de las comunidades
del picoplancton. Alternativamente, existen métodos moleculares cuantitativos que son
PCR independientes y que permiten identificar células individuales in situ, y así
obtener la abundancia de determinados grupos: hibridación in situ con sondas
fluorescentes (FISH: Fluorescence in situ Hybridization) (Moter & Göbel 2000,
Pernthaler et al. 2001), deposición catalizada e hibridación in situ con sondas
fluorescentes (CARD-FISH: Catalyzed Reporter Deposition-Fluorescence in situ
Hybridization) (Pernthaler et al. 2002, Pernthaler et al. 2004), microautoradiografía e
hibridación in situ con sondas fluorescentes (MAR-CARDFISH: Microautoradiography-
Fluorescence in situ Hybridization) (Alonso & Pernthaler 2005); este último permite
obtener además de la identidad filogenética, la actividad metabólica de determinados
grupos de organismos.
Aún existen controversias para definir la unidad biológica fundamental de diversidad
de algunos de estos microorganismos. La mayoría de los trabajos microbiológicos
adoptan el concepto de “unidad taxonómica operativa” (OTU: operational taxonomic
unit). Actualmente esta terminología se aplica a cualquier taxón definido de manera
pragmática y que no necesariamente cumple con todos los requisitos de la definición
formal de especie. Esta definición permite clasificar a los individuos en grupos
excluyentes de acuerdo a algún criterio consistente de clasificación (Pedrós-Alió
2006).
El entendimiento de la taxonomía, distribución, estructura y ecología del picoplancton
está continuamente siendo enriquecido gracias al desarrollo de la biología molecular y
gracias a la introducción de equipos sofisticados dirigidos al estudio de las
propiedades celulares de estos microorganismos (Callieri 2008).
Biogeografía de microorganismos
La biogeografía es la observación, registro y explicación de los rangos geográficos de
los organismos (Pielou 1979) y consiste en estudiar la distribución de la biodiversidad
en el espacio y tiempo (Martiny et al. 2006). La principal diferencia entre la
biogeografía de macroorganismos y la de microorganismos radica en que para estos
últimos los factores históricos (e.g. condiciones ambientales pasadas, limitaciones en
la dispersión causadas por barreras geográficas) tienen menor importancia en los
patrones observados, mientras que los factores biológicos y físicos resultan más
INTRODUCCIÓN GENERAL
7
relevantes (Dolan 2005). Dejando de lado la definición de “especie”, dado que existen
controversias al respecto, tres características importantes distinguen a los
microorganismos de la mayoría de los organismos multicelulares: grandes tamaños
poblacionales, tiempos generacionales cortos, y altas tasas de dispersión. Estas
diferencias son fundamentales considerando la escala temporal de la vida de un
microorganismo comparada a la de organismos superiores (Dolan op. cit.). La primera
aproximación que permite comenzar a dilucidar la estructura y funcionamiento de una
comunidad consiste en la búsqueda de patrones, es decir, de aquellas similitudes o
tendencias repetidas a lo largo de diferentes gradientes ambientales. El
reconocimiento de estos patrones resulta fundamental para la formulación y puesta a
prueba de hipótesis sobre los distintos mecanismos subyacentes que definen y
mantienen la estructura comunitaria. El interés por estudiar la biogeografía de los
microorganismos acuáticos consiste en elucidar los factores físicos y biológicos que
controlan la presencia o ausencia de los mismos en determinados ambientes. Sin
embargo, se han reportado patrones y tendencias contrastantes y existe un gran
debate sobre la existencia o no de patrones biogeográficos para los microogranismos
(Martiny et al. 2006, Horner-Devine et al. 2007, Logue & Lindström 2008). El dilema se
basa en si los microoganismos siguen o no las mismas “reglas” o principios ecológicos
que los macroorganismos. Una corriente defiende la idea de que todos los organismos
pequeños al ser muy abundantes y poseer altas tasas de dispersión, se distribuyen
homogéneamente por todo el planeta (“Everything is everywhere, but the environment
select”, Baas-Becking 1934, Brock 1961) al no estar limitados por barreras geográficas
ya que muchos organismos tienen adaptaciones extraordinarias para la dispersión y
gran resistencia a importantes cambios en el ambiente. Esta hipótesis ha sido
defendida principalmente por Fenchel y Finlay en una serie de publicaciones (Finlay
1998, Finlay & Clarke 1999, Finlay 2002, Fenchel & Finlay 2004), en las cuales
proponen que los organismos pequeños (<1 mm de longitud) tienden a presentar una
distribución cosmopolita. Pero por otro lado, en contra de la hipótesis de ubicuidad de
los microorganismos, algunos autores han reportado la existencia de especies
endémicas, distribuciones restringidas y divergencias genéticas entre poblaciones de
la misma especie en diferentes ambientes (Whitaker et al. 2003, Pommier et al. 2007,
Crump et al. 2007, Martiny et al. 2006, Vyverman et al. 2010), es decir que habría una
barrera ecológica por lo menos para la dispersión de algunos microorganismos.
Gracias a la incorporación de técnicas y herramientas moleculares sofisticadas, los
estudios taxonómicos están intentando identificar las relaciones funcionales, las
INTRODUCCIÓN GENERAL
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estructuras y las distribuciones biogeográficas de las comunidades microbianas
(Moosvi et al. 2005, Laybourn-Parry & Pearce 2007).
Antecedentes de estudios del picoplancton en Patagon ia y Antártida
A pesar de la gran importancia del picoplancton en las tramas tróficas acuáticas, la
incorporación de esta fracción en los estudios del plancton de agua dulce en la
Patagonia y en Argentina es en general relativamente reciente. El primer estudio fue
llevado a cabo por Zunino & Díaz (2000), quienes analizaron el picoplancton
autotrófico en un gradiente de 13 lagos oligo-eutróficos ubicados en la región andino
patagónica norte y no encontraron relaciones significativas entre la abundancia del
picoplancton autotrófico y las variables ambientales relacionadas con el trofismo, pero
observaron que las picocianobacterias ricas en ficoeritrina eran más abundantes en
lagos oligotróficos, mientras que las ricas en ficocianina predominaban en lagos con
mayor grado de trofismo. Más recientemente, Callieri et al. (2007) y Bastidas Navarro
et al. (2009a) reportaron la dominancia de picoplancton autotrófico procariota
(Synechococcus spp.) rico en ficoeritrina en lagos andino-patagónicos. Por otro lado,
para la misma región, Corno et al. (2008) estudiaron el efecto de la presión de
predación sobre la abundancia, diversidad y la estructura de bacterias en un sistema
oligotrófico patagónico. Posteriormente, Caravati et al. (2009) realizó el primer estudio
de la diversidad de picocianobacterias en lagos ultraoligotróficos del noroeste
patagónico mediante la técnica molecular ARISA, reportando una diversidad beta alta
y la presencia de una OTU ampliamente distribuida en los lagos estudiados. Al mismo
tiempo, Corno et al. (2009) estudiaron la diversidad y morfología de bacterias en lagos
ultraoligotróficos de la región andino-patagónica mediante DGGE y posterior
secuenciación y encontraron que en general la composición de las comunidades del
bacterioplancton fue similar en todos los lagos. De acuerdo a los datos reportados por
Modenutti & Balseiro (2002) y Callieri et al. (2007), en los lagos ultraoligotróficos de la
región andino-patagónica aproximadamente el 30% del total de clorofila a puede ser
atribuido al aporte de picocianobacterias.
En la Antártida los lagos se caracterizan por presentar cadenas tróficas simples y
cortas (Laybourn-Parry & Pearce 2007), esencialmente dominadas por la trama trófica
microbiana (Ellis-Evans 1996, Vincent et al. 2008), donde el zooplancton representa el
eslabón más alto de la cadena. Los primeros estudios sobre el picoplancton de lagos
ubicados en Península Antártica (particularmente en Bahía Esperanza, uno de los
INTRODUCCIÓN GENERAL
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sectores de la Región de Antártida Marítima estudiada en esta tesis) datan de 1991.
En esta región fueron realizados estudios comparativos de las comunidades
picoplanctónicas en lagos con condiciones tróficas contrastantes (Allende & Izaguirre
2003, Izaguirre et al. 2003). Posteriormente, en algunos lagos en particular, se llevaron
a cabo diferentes estudios experimentales en los que se evaluaron los efectos “top-
down” y “bottom-up” sobre la abundancia del picoplancton (Almada et al. 2004, Allende
& Pizarro 2006, Allende 2009). Para las Islas Shetland del Sur existen varios
antecedentes de estudios sobre el picoplancton autotrófico y heterotrófico.
Particularmente en la Península Byers fueron llevados a cabo por Camacho (2006),
Toro et al. (2007), Rochera et al. (2010) y Villaescusa et al. (2010); estos últimos
autores analizaron la composición de las bacterias planctónicas mediante la técnica
molecular DGGE y reportaron que la composición de estas comunidades estuvo
influida por el estado trófico de los cuerpos de agua estudiados.
Cabe destacar que la Patagonia Austral y la Antártida Marítima resultan áreas muy
útiles para los estudios de biogeografía, debido a las diferencias en las condiciones
ambientales que presentan y a la existencia de una barrera biogeográfica, climática y
oceanográfica muy relevante, como el Pasaje de Drake que separa América de
Antártida. Por otro lado, se han reportado muy pocos trabajos (e.g. Van der Gucht et
al. 2007) que hayan estudiados la biogeografía del picoplancton en cuerpos de agua
continentales a una gran escala espacial como la estudiada en esta tesis.
Hipótesis
1) Existen distribuciones restringidas y patrones biogeográficos para las comunidades
picoplanctónicas.
2) Existen algunas unidades taxonómicas operativas (OTUs) y secuencias en común
entre los cuerpos de agua patagónicos y antárticos.
3) La composición y la abundancia del picoplancton cambian con el estado trófico de los
cuerpos de agua.
4) La abundancia y el número de OTUs dominantes del picoplancton disminuyen y la
composición del picoplancton cambia al aumentar la latitud.
OBJETIVOS
OBJETIVOS
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OBJETIVOS GENERALES
El objetivo central de este trabajo de tesis doctoral fue analizar la estructura
(abundancia, composición y diversidad) del picoplancton de un conjunto de cuerpos de
agua lénticos ubicados a lo largo de un gradiente latitudinal patagónico-antártico. En
este contexto, otro de los objetivos principales fue analizar la existencia de patrones
biogeográficos para estos microorganismos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Caracterizar la estructura de las comunidades picoplanctónicas autotróficas y
heterotróficas en un conjunto de cuerpos de agua de la Región Antártida Marítima
mediante técnicas moleculares, y analizar sus variaciones temporales.
2. Comparar estas comunidades en cuerpos de agua de tres sectores distintos de la
Región Antártida Marítima con estados tróficos contrastantes y características
limnológicas diferentes.
3. Estudiar la estructura de las comunidades picoplanctónicas autotróficas y
heterotróficas y sus variaciones espaciales en un conjunto de cuerpos de agua de la
Patagonia Austral Argentina, ubicados en dos regiones (Andino-Patagónica y Meseta)
que presentan diferentes características limnológicas, mediante técnicas moleculares.
4. Analizar los patrones biogeográficos del picoplancton en el gradiente latitudinal de
lagos estudiados desde la Patagonia Austral Argentina hasta la Antártida Marítima
(Península Antártica e Islas Shetland del Sur).
5. Determinar a través de estudios de biología molecular la existencia de especies
comunes entre la Patagonia y la Antártida, así como la existencia de especies
endémicas.
6. Evaluar el rol y la importancia de los factores geográficos o espaciales y ambientales
locales en el modelado de la estructura de las comunidades picoplanctónicas.
7. Evaluar la abundancia del picoplancton autotrófico y heterotrófico en los cuerpos de
agua del gradiente latitudinal patagónico-antártico combinando técnicas de
microscopia de epifluorescencia y citometría de flujo, y comparar estas abundancias
entre cuerpos de agua con estados tróficos contrastantes.
8. Analizar estadísticamente qué factores (espaciales y/o ambientales) son más
importantes en determinar la abundancia de los distintos componentes del
picoplancton a lo largo del gradiente latitudinal patagónico-antártico.
ÁREA DE ESTUDIO
ÁREA DE ESTUDIO
11
Los 45 cuerpos de agua seleccionados para este trabajo de tesis se localizan en la
Patagonia Austral Argentina (desde la Provincia de Chubut hasta Tierra del Fuego) y
en la Antártida Marítima (Península Antártica e Islas Shetland del Sur). Estos cuerpos
de agua se ubican a lo largo de un gradiente latitudinal que se extiende desde los 45º
22' S hasta los 63º 24' S de latitud, comprendiendo una distancia de 2150 km y 19
grados de latitud (Figura 3, Tabla 1). A lo largo de este gradiente se seleccionaron
distintos tipos de cuerpos de agua, que difieren principalmente en sus características
morfométricas y en su estado trófico: lagos profundos (L), lagos someros o lagunas
(Lag.) y lagunas temporarias (P).
Figura 3. Mapa con la localización de los cuerpos de agua patagónicos y antárticos.
Cada número corresponde a un cuerpo de agua.
ÁREA DE ESTUDIO
12
Tabla 1. Ubicación y posición geográfica de los cuerpos de agua comprendidos en un
gradiente latitudinal patagónico-antártico. Latitud y longitud expresada en grados y
minutos decimales. L.: Lago, Lag.: Laguna, P.: Laguna temporaria, m s.n.m.: metros
sobre el nivel del mar.
Numeración en la Figura 1
Ambiente Ubicación Latitud (S) Longitud (O) Altura
(m s.n.m)
1 L. Musters Chubut 45º 33,24´ 69º 08,27´ 277
2 P.2 Chubut 45º 34,29´ 69º 06,80´ 297
3 P.3 Chubut 45º 36,09´ 68º 59,87´ 269
4 L. Colhué Huapi Chubut 45º 22,09´ 68º 57,25´ 280
5 L. Pueyrredón Santa Cruz 47º 22,80´ 71º 58,20´ 158
6 L. Posadas Santa Cruz 47º 27,00´ 71º 48,60´ 160
7 P.7 Santa Cruz 47º 20,40´ 70º 59,40´ 447
8 L. Ghio Santa Cruz 47º 16,20´ 71º 30,60´ 400
9 P.9 Santa Cruz 47º 12,00´ 71º 36,00´ 580
10 P.10 Santa Cruz 47º 27,60´ 71º 52,20´ 161
11 P.11 Santa Cruz 48º 41,40´ 71º 09,00´ 830
12 P.12 Santa Cruz 48º 40,80´ 71º 07,80´ 848
13 P.13 Santa Cruz 48º 37,80´ 71º 08,40´ 880
14 L. Cardiel Santa Cruz 48º 59,40´ 71º 07,80´ 280
15 P.15 Santa Cruz 49º 15,60´ 72º 53,40´ 425
16 L. del Desierto Santa Cruz 49º 04,80´ 72º 53,40´ 506
17 P.17 Santa Cruz 49º 07,80´ 72º 55,80´ 459
18 P.18 Santa Cruz 49º 35,40´ 72º 18,00´ 253
19 P.19 Santa Cruz 49º 35,40´ 72º 18,60´ 253
20 L. Viedma Santa Cruz 49º 23,40´ 72º 52,20´ 273
21 L. Argentino Santa Cruz 50º 18,60´ 72º 48,00´ 181
22 P.22 Santa Cruz 50º 19,20´ 72º 47,40´ 184
23 Lag. de Los Cisnes Tierra del Fuego 53º 47,40´ 67º 46,80´ 8
24 Lag. San Luis Tierra del Fuego 53º 55,20´ 67º 36,00´ 10
25 L. Acigami Tierra del Fuego 54º 49,80´ 68º 33,60´ 20
26 Lag. Laguna Negra Tierra del Fuego 54º 50,40´ 68º 35,40´ 29
27 L. Escondido Tierra del Fuego 54º 40,80´ 67º 48,60´ 120
28 L. Fagnano Tierra del Fuego 54º 35,40´ 67º 37,20´ 27
29 P.27 Tierra del Fuego 54º 36,00´ 67º 37,80´ 43
30 Lag. Victoria Tierra del Fuego 54º 46,80´ 67º 42,00´ 103
31 P.29 Tierra del Fuego 54º 52,20´ 67º 21,00´ 11
32 P.30 Tierra del Fuego 54º 51,00´ 68º 34,80´ 15
33 L. Yehuin Tierra del Fuego 54º 21,60´ 67º 46,80´ 50
34 L.L Península Potter 62º 15,00´ 58º 38,40´ 60
35 L.M Península Potter 62º 15,00´ 58º 39,00´ 30
36 L.W Península Potter 62º 14,40´ 58º 40,20´ 12
ÁREA DE ESTUDIO
13
37 L.Z Península Potter 62º 14,40´ 58º 39,60´ 20
38 L. Refugio Península Byers 62º 40,20´ 61º 00,00´ 5
39 L. Limnopolar Península Byers 62º 39,00´ 61º 00,00´ 10
40 P. Pingüi Bahía Esperanza 63º 24,00´ 57º 00,60´ 20
41 L. Boeckella Bahía Esperanza 63º 24,00´ 57º 00,00´ 49
42 L. Esperanza Bahía Esperanza 63º 24,60´ 57º 01,80´ 52
43 L. Encantado Bahía Esperanza 63º 24,60´ 57º 02,40´ 55
44 L. Flora Bahía Esperanza 63º 24,60´ 57º 02,40´ 52
45 L. Chico Bahía Esperanza 63º 24,60´ 57º 00,60´ 100
Patagonia Austral
En esta zona se estudiaron 33 cuerpos de agua comprendidos desde el sur de la
Provincia de Chubut (45° 22´ S, 68° 57´ O) hasta el sur de la Provincia de Tierra del
Fuego (54° 52´ S, 67° 21´ O). Estos cuerpos de agua se encuentran ubicados en dos
Limno-regiones distintas: la �Región Andino-Patagónica� y la �Región de la Meseta
Patagónica�. Los lagos más profundos están situados en la proximidad de la Cordillera
de los Andes y en general varían desde ultraoligotróficos hasta oligotróficos. Los lagos
ubicados en la meseta patagónica son generalmente más someros que los lagos
andinos y usualmente varían desde mesotróficos hasta eutróficos (Quirós & Drago
1999). De acuerdo a Quirós & Cuch (1985), las concentraciones de fósforo y clorofila a
fitoplanctónica en los lagos de la meseta son más altas que las registradas en los
lagos andino-patagónicos.
Los lagos de la �Región Andino-Patagónica� fueron formados por procesos glaciarios y
tectónicos, que conjuntamente a una posterior fuerte erosión fluvial y a la característica
composición de rocas duras, explican sus típicas aguas diluidas, variando entre
ultraoligotróficos y oligotróficos. Esta región alberga los lagos más grandes y
profundos de Sudamérica, que se encuentran normalmente extendidos con una
orientación este-oeste debido a la forma de los valles glaciales que los contienen (Díaz
et al. 2000). En esta región se encuentran también algunos lagos más someros de
menor tamaño.
La �Región de la Meseta Patagónica� está conformada por un paisaje complejo,
caracterizado principalmente por una meseta basáltica con terrazas elevadas por
actividad tectónica (Iriondo 1989). Es una región árida que contiene diferentes tipos de
cuerpos de agua, desde lagos naturales permanentes ubicados en depresiones hasta
ÁREA DE ESTUDIO
14
lagunas temporarias. También existen en esta región algunos embalses que son
alimentados por ríos exorreicos originados en los Andes.
En Tierra del Fuego (Patagonia Insular) algunos lagos están ubicados cerca de las
montañas y comparten las características de los lagos de la �Región Andino-
Patagónica�, mientras que otros están ubicados en la �Región de la Meseta
Patagónica�, entre los cuales la mayoría de los lagos localizados en la parte sudeste
de la isla son húmicos.
La temperatura media anual en Patagonia varía desde 12°C en la parte noreste a 3°C
hacia la parte sur. Desde los Andes y hacia el este, las precipitaciones anuales
disminuyen fuertemente, con medias anuales de aproximadamente 2000 mm en la
parte oeste de los Andes a menos de 200 mm en la parte central de la Patagonia
(Paruelo et al. 1998). Durante todo el año predominan los vientos del oeste, pero en
verano además existe una influencia de vientos del sur (Polares), que se caracterizan
por su baja humedad (Beltrán 1997).
Antártida Marítima
La Región Antártida Marítima comprende el oeste de la Península Antártica hasta
aproximadamente los 72°S de latitud (Smith 1996), Islas Sandwich y Orcadas del Sur,
Islas Shetland del Sur e Islas Bouvetøya y Peter I (Huiskes et al. 2006). En esta región
se estudiaron en total 12 cuerpos de agua ubicados en las Islas Shetland del Sur (62°
14´ S, 60° 54´ O) y en la Península Antártica (63° 24´ S, 57° 00´ O). En la Antártida
Marítima, los lagos presentan en general una menor profundidad (<10 m) en
comparación con los lagos de la Región Antártida Continental, y suelen permanecer
libres de hielo por algunas semanas durante el verano austral. Generalmente son
pobres en nutrientes salvo los que reciben la influencia de aves y mamíferos marinos
(Izaguirre et al. 2001). Asimismo, en las islas de Antártida Marítima pueden
encontrarse una enorme variedad de lagos con diferentes tipos de cuenca y
condiciones de trofismo (Vinocur & Unrein 2000). El clima de esta región es menos
extremo que el de la Antártida Continental, y presenta una precipitación media anual
de 50-500 mm por año y una temperatura promedio de 0°C durante el verano austral
(Huiskes et al. 2006). Los cuerpos de agua seleccionados para este estudio se
encuentran en la Región de Antártida Marítima correspondiente a Península Potter
ÁREA DE ESTUDIO
15
(Isla 25 de Mayo � Islas Shetland del Sur), Península Byers (Isla Livingston � Islas
Shetland del Sur) y Bahía Esperanza (Península Antártica).
La Península Potter (62° 14´ S, 58° 38´ O) se encuentra en el extremo sur de la Isla 25
de Mayo, la isla más grande de las Islas Shetland del Sur. Esta área presenta un gran
número de lagunas temporarias, lagos y arroyos. Los primeros están alimentados por
agua de lluvia y agua de deshielo (Drago 1983). Estos cuerpos de agua presentan un
amplio rango de características físicas, químicas y biológicas (Drago 1983, Unrein &
Vinocur 1999) y exhiben un gradiente trófico que varía desde ultraoligotróficos a
hipereutróficos. Algunos cuerpos de agua ubicados en las cercanías del mar están
fuertemente influenciados por las poblaciones de pingüinos y elefantes marinos. Los
lagos de esta región presentan un origen glaciario (Vinocur & Unrein 2000). La
mayoría de las lagunas temporarias y lagos están ubicados en cuencas cubiertas por
musgos y algunos cuerpos de agua presentan una cubierta de hielo que persiste
después del comienzo del verano (Vinocur & Unrein op. cit.). La Península Potter se
encuentra afectada por fuertes vientos húmedos del este y del oeste (Drago 1983).
La Península Byers (62° 37´ S, 60° 54´ O) se ubica en el extremo oeste de la Isla
Livingston, la segunda isla más grande de las Islas Shetland del Sur. La península
tiene una superficie de 60,6 Km2, una altitud máxima de 265 m (Cerro Start) y presenta
una meseta central. La Isla Livingston está cubierta por glaciares, excepto en las
zonas costeras y en la Península Byers. En esta zona existen más de 110 lagos y
lagunas temporarias de tamaño variable y con un sistema de drenaje complejo que
cubren una superficie total de aproximadamente 1,5% de la península (López-Martínez
et al. 1996a, b). Los lagos son someros (<9 m), la mayoría tiene un origen glaciario y
algunos de ellos pueden congelarse completamente durante el invierno. La mayoría de
los lagos se localizan en la meseta central de la Península Byers y se caracterizan por
ser ultraoligotróficos y pequeños, aunque algunos están ubicados en las cercanías del
mar y se caracterizan por poseer concentraciones más altas de sal y nutrientes (Toro
et al. 2007). Las temperaturas medias en verano oscilan entre 1 y 3°C, con máximas
de 10°C y mínimas de -10°C, y en invierno las temperaturas mínimas pueden alcanzar
los -35°C, con máximas siempre por debajo de los 0°C. Las precipitaciones medias
anuales oscilan entre 700 y 1000 mm (Bañón 2001). La dirección del viento muestra
un predominio general en la dirección suroeste-noreste. La velocidad media del viento
oscila entre 20 y 30 km h-1 y las velocidades máximas de más de 100 km h-1 son
frecuentes durante todo el año (Toro et al. 2007).
Bahía Esperanza (63º 24� S, 56º 59� O) se ubica en el norte de la Península Antártica,
enmarcada por tres montes, Taylor (1000 m), Whitten (445 m) y Flora (530 m). La
ÁREA DE ESTUDIO
16
mayoría de los alrededores de la bahía se encuentran ocupados por glaciares, salvo
en su cara sur en la que existe una zona libre de hielo de aproximadamente 10 Km2 en
la que habita una importante población de pingüinos (Pygoscelis adeliae) (Coria &
Montalti 1993). Durante el verano, después del periodo de deshielo, se pueden
encontrar lagos, lagunas y chorrillos en un área de aproximadamente 3,8 km2, desde
el Monte Flora hasta la costa del mar. Como fuera descripto por Vinocur & Pizarro
(1995) e Izaguirre et al. (1998, 2003), Bahía Esperanza se caracteriza por tener varios
cuerpos de agua de diferente origen y morfometría, algunos de ellos no se congelan
hasta el fondo durante el invierno y permanecen libres de hielo durante el verano y
otros son muy someros y se congelan hasta el fondo en invierno. La duración del
periodo libre de hielo en los distintos cuerpos de agua es muy variable. Estos cuerpos
de agua están alimentados por el descongelamiento de la nieve y del hielo de los
glaciares. Las propiedades limnológicas están fuertemente afectadas por las
características de sus cuencas así como por la cercanía y presencia de aves y
mamíferos marinos (Izaguirre et al. 1998, Pizarro et al. 2002). En Bahía Esperanza los
cuerpos de agua cubren todo el gradiente trófico desde ultraoligotróficos a
hipereutróficos con influencia de las pingüineras circundantes. Los lagos son someros
(<6 m) y la mayoría tiene un origen glaciario. Las temperaturas medias anuales oscilan
entre los �5,0°C y �3,3°C, las medias de invierno entre �8°C y �12°C y las medias de
verano entre +1,0°C y �2,5°C. Las precipitaciones no superan los 620 mm anuales y la
forma de precipitación durante el verano depende de las condiciones térmicas. Es una
bahía fuertemente azotada por vientos que superan los 200 Km h-1 y que provienen del
noroeste (Servicio Meteorológico Nacional de la Fuerza Aérea Argentina).
Los capítulos I y II están embargados a pedido del autor a la espera de ser publicados en revistas especializadas
At author's request chapters I and II are under embargo, therefore, unavailable, until they are published in specialized journals
CAPÍTULO III
ANÁLISIS DE LOS PATRONES
BIOGEOGRÁFICOS DEL
PICOPLANCTON A LO LARGO DEL
GRADIENTE LATITUDINAL
PATAGÓNICO-ANTÁRTICO
CAPÍTULO III
117
INTRODUCCIÓN
El estudio de los factores que regulan la distribución geográfica de los
microorganismos y estructura de las comunidades microbianas ha sido muy limitado
hasta el siglo XXI. En la última década, a partir del uso generalizado de las técnicas
moleculares en ecología microbiana, comienzan a desarrollarse investigaciones
tendientes a analizar la influencia relativa de los factores espaciales
(geográficos/regionales) y ambientales sobre la composición de las comunidades
microbianas acuáticas (Dolan 2005, Martiny et al. 2006, Yergeau et al. 2007, Pommier
et al. 2007, Crump et al. 2007, Van der Gucht et al. 2007, Fuhrman et al. 2008,
Barberán & Casamayor 2010), aunque la importancia de los factores ambientales
locales ha sido más intensivamente estudiada que la importancia de los factores
espaciales. Esto podría deberse a que los procesos regionales son más difíciles de
incorporar en los estudios ecológicos dado que actúan a una escala mucho mayor
(Logue & Lindström 2008). Por lo tanto, existe un vívido debate sobre la importancia
relativa de los factores ambientales (e.g. estado trófico del cuerpo de agua, variables
físico-químicas) y espaciales (e.g. latitud, longitud, distancia geográfica) en el
modelado de las comunidades microbianas, y sobre la existencia o no de
distribuciones biogeográficas en los microorganismos (Van der Gucht et al. 2007).
Como fue mencionado brevemente en la Introducción General de esta tesis, la visión
histórica de la biogeografía microbiana es que "todo está en todas partes, pero que el
medio ambiente selecciona" ("everything is everywhere, but the environment selects")
(Baas-Becking 1934, Brock 1961). Esta idea presume ubicuidad de los
microorganismos basada en la gran tasa de dispersión y las altas abundancias que
presentan. Esta hipótesis fue defendida por Fenchel y Finlay en una serie de
publicaciones (Finlay 1998, Finlay & Clarke 1999, Finlay 2002, Fenchel & Finlay 2004),
en las que proponen que los organismos inferiores a 1 mm de longitud además de
tener una distribución cosmopolita, tienden a presentar una relación inexistente entre
la riqueza de especies y el área, y como máximo un débil gradiente latitudinal de la
diversidad (Fenchel & Finlay 2004). En apoyo a la dispersión de los microorganismos
por todo el mundo (ubicuidad), Sommaruga & Casamayor (2009) reportaron que
muchos filotipos de bacterias planctónicas encontradas en lagos de altura eran
similares a otros reportados en ambientes extremos fríos del planeta (e.g. polares,
glaciares, lagos alpinos), sugiriendo que los factores ambientales de los lagos juegan
un rol muy importante en la selección de filotipos similares. En oposición a la hipótesis
CAPÍTULO III
118
de la ubicuidad, algunos estudios reportaron la existencia de especies endémicas,
distribuciones restringidas y patrones no estocásticos en la diversidad de
microorganismos (e.g. Whitaker et al. 2003, Pommier et al. 2005, Pommier et al. 2007,
Vyverman et al. 2010). Específicamente para bacterias, Yergeau et al. (2007)
proporcionaron evidencia acerca de los factores que modelan la composición de las
comunidades bacterianas a lo largo de una transecta antártica de más de 3200 km de
extensión usando bibliotecas genéticas de los genes 16S ARNr y encontraron que
aunque la riqueza de bacterias disminuyó con el aumento de latitud, resultaron ser
también importantes patrones hábitat-específicos (presencia-ausencia de vegetación)
y que la distancia geográfica y la cobertura vegetal (factor ambiental local) influyeron
sobre la composición de las comunidades bacterianas. Por su parte, Pommier et al.
(2007) estudiaron las bacterias planctónicas marinas provenientes de 9 sitios
distribuidos en distintas partes del mundo mediante bibliotecas genéticas y
encontraron diferencias en la composición y riqueza de las unidades taxonómicas
operativas (OTUs) entre los distintos sitios, un alto grado de endemismo y un número
decreciente de los OTUs con la latitud. Igualmente, Fuhrman et al. (2008) utilizaron la
técnica de análisis automatizado del espacio intergénico ribosomal (ARISA) para
cuantificar la riqueza de OTUs bacterianas en muestras marinas superficiales tomadas
desde regiones tropicales a polares en los dos hemisferios y encontraron que el
número de OTUs disminuyó significativamente con la latitud y estuvo positivamente
correlacionado con la temperatura del agua.
Los dos estudios mencionados previamente estuvieron focalizados en ecosistemas
marinos. En estos ambientes (bien conectados) las olas y corrientes deberían facilitar
la dispersión y subsecuente colonización por microorganismos marinos (Collins 2001).
Contrariamente, los cuerpos de agua continentales pueden ser considerados como
islas dentro de un mar de tierra (Reche et al. 2005) y como hábitats desconectados y
relativamente heterogéneos (Papke & Ward 2004), por lo que sería más probable
encontrar patrones biogeográficos. Además, en general los lagos presentan
distribuciones en parches que probablemente generen limitaciones en la dispersión
(Barberán & Casamayor 2010). Yannarell & Triplett (2005) estudiaron 30 lagos
ubicados en el estado de Wisconsin, Estados Unidos de América, con la técnica
ARISA y encontraron que las diferencias en la composición de las comunidades
bacterianas se explicaban principalmente por factores regionales (lagos del norte
versus los del sur de Wisconsin) y por nivel de paisaje (lagos de filtración versus lagos
de drenaje). Por su parte, Crump et al. (2007) estudiaron la composición de las
comunidades del bacterioplancton de lagos y arroyos del Ártico mediante DGGE y
CAPÍTULO III
119
sugirieron que a una escala espacial restringida (<10 km) la composición de las
comunidades bacterianas estaba controlada tanto por factores geográficos (altitud,
hidrología del lago) como ambientales (conductividad, temperatura, pH).
Sin embargo, todos estos estudios se han enfocado en la influencia de los factores
espaciales o ambientales locales sobre la composición de las comunidades
microbianas, y pocos han investigado la influencia relativa de los dos tipos de factores
(espaciales y ambientales) en una escala espacial amplia. Entre las escasas
investigaciones que exploraron conjuntamente ambos tipos de factores se cuentan los
trabajos de Van der Gucht et al. (2007) y Barberán & Casamayor (2010). En el primer
trabajo se llevó a cabo un estudio de metacomunidades de bacterias planctónicas con
DGGE, incluyendo 98 lagos someros (mesotróficos y eutróficos) en un gradiente norte-
sur de Europa (>2500 km) para estudiar el impacto de factores regionales y locales, y
se observó una fuerte influencia de los factores ambientales locales (recursos y
pastoreo) sobre la composición de las comunidades bacterianas, con un impacto
marginal de la distancia espacial. El segundo trabajo mencionado consistió en un
meta-análisis empírico con diferentes grupos bacterianos de aguas superficiales de
todas partes del mundo (18 cuerpos de agua continentales de diferentes tamaños,
altitudes y estados tróficos y 16 sitios marinos costeros), encontrándose una
importante influencia de las fuerzas ambientales en el modelado de los ensambles
microbianos a una escala global y una influencia geográfica para algunos grupos
bacterianos de aguas continentales.
A pesar del aislamiento del Continente Antártico y hábitats sub-Antárticos, los
microorganismos pueden ser transportados por el aire hacia la Península Antártica
desde Sudamérica u otras zonas antárticas (Marshall 1996, Hughes et al. 2004). Por
ejemplo, Hirano (1965) consideró que al estudiar la biogeografía del fitoplancton en
Antártida, era necesario estudiar también el fitoplancton del continente Sudamericano,
probablemente porque muchas especies antárticas podrían haber llegado desde
Sudamérica. En línea con esta idea, un estudio sobre la diversidad de diatomeas a lo
largo de un gradiente patagónico-antártico reveló la presencia de especies endémicas
y cosmopolitas en los dos continentes, y un decrecimiento evidente de la riqueza de
especies con el aumento de latitud (Maidana et al. 2005). El mismo patrón de
disminución en la riqueza de algas fue reportado por Tell et al. (2011) para un grupo
de clorofíceas (Chlorococcales) en una transecta patagónica latitudinal.
El presente capítulo se centra en el estudio de la biogeografía de las comunidades del
picoplancton (autotrófico y heterotrófico) de cuerpos de agua ubicados a lo largo de un
gradiente patagónico-antártico, y en la evaluación del efecto de los factores que
AP TU O III
120
inciden sobre la estructura de estas comunidades. En este capítulo se analizaron los
ensambles microbianos de 41 cuerpos de agua (incluyendo lagos, lagunas y lagunas
temporarias) de la Patagonia Austral (45° 22´ S, 68° 57´ O) y de Antártida Marítima
(63° 24´ S, 57° 2´ O) mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR:
Poli e ase ai eactio ) seguida de una electroforesis en gel de gradiente
desnaturalizante (DGGE: e at i g adie t el lect op o esis) y secuenciación.
Se maximizó el rango de latitud así como también la variabilidad en los regímenes
ecológicos de los cuerpos de agua, incluyendo tanta variación (tamaño del lago,
estado trófico, altitud) como la existente en cada región.
Los objetivos específicos del presente capítulo son:
i) Analizar los patrones biogeográficos del picoplancton en el gradiente latitudinal
de lagos estudiados desde la Patagonia Austral Argentina hasta la Antártida
Marítima (Península Antártica e Islas Shetland del Sur) mediante técnicas
moleculares.
ii) Estudiar las secuencias y cantidad total de OTUs picoplanctónicas compartidas
entre la Patagonia y Antártida, y determinar estadísticamente el grado de
similitud en la composición del picoplancton entre ambas regiones.
iii) Evaluar estadísticamente qué factores (espaciales y/o ambientales) son más
relevantes en el modelado de la estructura de las comunidades del
picoplancton a lo largo del gradiente latitudinal.
ATERIALES TODOS
En el presente capítulo se llevó a cabo un análisis biogeográfico del picoplancton a lo
largo del gradiente latitudinal patagónico-antártico estudiado (45° 22´ S a 63 24´ S).
Para la región Antártica, en los casos en que los lagos fueron muestreados en más de
una oportunidad, se incorporaron al gradiente las muestras correspondientes a la
primera fecha de muestreo del año 2004. Las características de los lagos analizados
fueron descriptas en los a ítulos I y II de esta tesis.
Los patrones biogeográficos se analizaron combinando distintos tipos de análisis
multivariados con el objeto de obtener resultados más confiables:
CAPÍTULO III
121
Análisis de Cluster:
Se analizó la similitud en la composición de las comunidades del picoplancton
(procariota y eucariota) entre las distintas muestras mediante análisis de agrupamiento
(Análisis de Cluster). Estos análisis se realizaron con los patrones de bandas
obtenidos a partir de los geles de DGGE de todos los cuerpos de agua del gradiente.
Se utilizó el Índice de Jaccard para las matrices de presencia-ausencia de bandas y se
aplicó el método UPGMA (unweighted pair- group average linkage) como algoritmo de
enlace. Para llevar a cabo estos análisis se utilizó el programa XLSTAT 2009
(AddinSoft SARL).
Análisis de Correspondencia Canónica (CCA):
Se construyeron otras matrices con la composición de las comunidades del
picoplancton del gradiente teniendo en cuenta las intensidades relativas de cada
banda de DGGE comparada con la intensidad total en cada calle (100%). Para poder
identificar los factores que controlan la composición de las comunidades del
picoplancton en los cuerpos de agua, se analizaron las matrices de intensidades
relativas de las bandas conjuntamente con las matrices de variables ambientales
(incluyendo las variables espaciales) de todos los lagos del gradiente (datos tomados
de las Tablas 1-I y 1-II de los Capítulos I y II respectivamente) mediante el método de
ordenamiento CCA. Se seleccionó este análisis realizando previamente un DCA y
comprobando que las matrices de intensidades relativas de las OTUs presentaban una
respuesta unimodal. En el caso de las comunidades picoplanctónicas procariotas se
incluyeron en el análisis las variables latitud, área del cuerpo de agua, fosfato,
coeficiente de atenuación vertical de la luz (Kd), y carbono orgánico disuelto (COD). El
CCA realizado para las comunidades de eucariotas de 0,2 - 3 µm incluyó las variables
latitud, longitud, COD, oxígeno disuelto (OD), nitrógeno inorgánico disuelto (NID:
nitrato + nitrito + amonio) y conductividad. Se utilizó la selección forward para agregar
variables ambientales al modelo. Las variables fuertemente correlacionadas fueron
eliminadas del análisis debido a que proporcionan información redundante. La
significación de los ejes canónicos fue determinada mediante el test de Monte Carlo.
Análisis de la Partición de la Variación Canónica (CCA y RDA parciales):
Para explorar más profundamente los patrones existentes en la composición de las
comunidades picoplanctónicas revelados por DGGE, se llevaron a cabo análisis de
partición de la variación canónica, CCA o RDA (RDA: Redundancy Analysis) parciales
(Borcard et al. 1992). Este tipo de análisis permite discernir patrones relacionados a un
CAPÍTULO III
122
grupo de variables explicativas mientras se controla un segundo grupo de variables
explicativas, denominadas covariables (Legendre & Legendre 1998). En particular,
estos análisis son útiles para medir la importancia relativa de los factores ambientales
no espaciales (físicos, químicos y morfométricos) y los factores espaciales
(coordenadas geográficas) en estudios biogeográficos (Cottenie 2005, Yannarell &
Triplett 2005, Langenheder & Ragnarsson 2007) y son apropiados para determinar el
porcentaje de variación explicado por cada tipo de factor. La variación total de las
matrices fue dividida de la siguiente forma: variación ambiental no espacial (ambiente
solo), variación espacial no compartida por las variables ambientales (espacio solo),
variación ambiental espacialmente estructurada (espacio + ambiente), y variación no
explicada más fluctuaciones estocásticas (Borcard et al. 1992). La significación de
estos componentes fue evaluada mediante el test de permutaciones de Monte Carlo.
Los análisis de partición de la variación canónica fueron llevados a cabo con la matriz
que presenta la composición de las comunidades picoplanctónicas (basadas en el
patrón de intensidades de las OTUs/bandas y de la presencia-ausencia de las
OTUs/bandas en los geles DGGE) versus la matriz espacial (coordenadas
geográficas: latitud y longitud) mientras se controlaba el efecto de las variables
ambientales locales (área del cuerpo de agua, fosfato, kd, COD para bacterioplancton;
NID, COD, OD y conductividad para la fracción picoeucariota) y con la matriz que
presenta la composición de las comunidades picoplanctónicas versus las variables
ambientales mientras se controlaban las variables espaciales (matriz de distancia
geográfica). Se llevó a cabo un CCA parcial para la matriz con las intensidades
relativas de bandas y RDA parcial para la matriz con presencia-ausencia de bandas,
dado que las respuestas de las OTUs fueron unimodales y lineales respectivamente.
Estos análisis fueron efectuados mediante el programa CANOCO (Ter Braak 1991).
Test de Mantel simple y parcial:
Por otro lado, se realizó el Test de Mantel simple y parcial para obtener las
correlaciones entre matrices de similitud y disimilitud (distancia) mediante el programa
zt versión 1.1 (Bonnet & Van der Peer 2002). Las matrices de similitud con la
composición de las comunidades picoplanctónicas (basadas en las matrices de
intensidades relativas y matrices de presencia-ausencia de bandas) fueron obtenidas
utilizando la distancia de Bray Curtis (1 menos la matriz distancia Bray Curtis) y el
Índice de Jaccard respectivamente. La matriz espacial fue obtenida con distancia
Euclídea simple y la matriz de similitud ambiental estandarizada fue obtenida utilizando
1 menos la matriz de distancia Euclídea estandarizada, en la cual las variables
CAPÍTULO III
123
ambientales fueron transformadas ([x-media] / desvío estándar) para estandarizar las
diferentes unidades de las variables ambientales (Martiny et al. 2006). También en
este caso se exploraron los efectos de cada tipo de componente ambiental sobre la
matriz de similitud de las OTUs picoplanctónicas, separando la matriz de similitud
ambiental estandarizada en dos matrices de similitud diferentes: matriz físico-química
(fosfato, Kd, COD, etc.) y matriz morfo-topográfica (área del cuerpo de agua y altitud).
Regresiones Lineales Múltiples:
Se realizaron regresiones lineales múltiples (Stepwise Multiple Regressions) con el
número de bandas de DGGE por lago (variable dependiente) y las siguientes variables
ambientales (variables independientes): latitud, área del cuerpo de agua, fosfato, COD,
Kd, pH, OD, NID y clorofila a. Las variables que no cumplieron normalidad y fueron
utilizadas en los test estadísticos fueron transformadas (Log10 o Log10 + 1) para cumplir
el supuesto de normalidad. Por otro lado, las correlaciones entre las variables fueron
llevadas a cabo con el test Rho de Spearman. Los análisis de regresiones múltiples y
correlaciones se realizaron mediante el programa SPSS 15.0.1 (StatSoft).
Análisis de Similitud ANOSIM:
Para evaluar estadísticamente el grado de semejanza en la composición de las
comunidades picoplanctónicas (basadas en las intensidades de bandas de DGGE
mediante la distancia de Bray Curtis y en la presencia-ausencia de bandas usando el
Índice de Jaccard) entre Antártida y Patagonia, se realizaron análisis de similitud
(ANOSIM) (Clarke & Green 1988) mediante el software PAST versión 2.0 (Hammer et
al. 2001). El test ANOSIM genera un estadístico (r) y la magnitud de este estadístico
indica el grado de separación entre grupos. Un valor de 1 indica completa separación
de los grupos mientras que un valor de 0 indica no separación de los mismos.
CAPÍTULO III
124
RESULTADOS
Patrones latitudinales de la composición del picopl ancton procariota y
eucariota
Para comparar la composición de las bacterias planctónicas a lo largo del gradiente
patagónico-antártico se corrieron 41 muestras en 3 geles de DGGE con fragmentos de
aproximadamente 500 pb (Figura 1-III A). A lo largo del gradiente latitudinal el número
de bandas por muestra varió de 10 a 35. Los lagos patagónicos presentaron entre 12 y
35 bandas por lago y los lagos antárticos entre 10 y 21 bandas. Se observaron un total
de 863 bandas ubicadas en 76 posiciones diferentes, las cuales representaron la
riqueza total de bacterioplancton dominante a lo largo del gradiente latitudinal. Cada
posición en los geles de DGGE fue considerada como una unidad taxonómica
operativa (OTU) bacteriana. Entre estas 76 OTUs, 45 fueron compartidas entre los
cuerpos de agua de Patagonia y Antártida, 28 estuvieron presentes solamente en los
patagónicos y 3 fueron exclusivas de los lagos antárticos. De un total de 76 posiciones
diferentes a lo largo del gradiente latitudinal, 50 fueron secuenciadas exitosamente
(estas 50 posiciones representaron un 80% del total de intensidad en los 3 geles de
DGGE). Se secuenciaron bandas con la misma posición en distintos lagos para
confirmar que correspondían a la misma secuencia: e.g. bandas 4 (a, b) o 45 (a, b, c,
d, e, f, g) (Figura 1-III A). La similitud entre estas secuencias, ubicadas en la misma
posición, varió entre 99,5 y 100%, indicando que probablemente corresponden a la
misma OTU. Entre Patagonia y Antártida se encontraron las siguientes secuencias en
común: 16 (presente en P.15 y L.W) correspondiente a Arcicella sp. proveniente de un
lago de altura de la Meseta Tibetana, 25 (presente en P.19 y L.W) afiliada
filogenéticamente a Algoriphagus aquatilis proveniente de un reservorio de agua dulce
de China, 32 (presente en P.10, P.15, L.L, L.Z, L.Refugio, L.Encantado, L.Flora y
L.Boeckella) perteneciente a Polaromonas sp. aislada de un glaciar del Himalaya, y 45
(presente en L.del Desierto, L.Viedma, Lag.San Luis, L.Z, L.W, L.Limnopolar y
L.Encantado) afiliada a Candidatus Planktophila limnetica aislada de un lago de
Austria. La información completa de estas secuencias se encuentra detallada en las
Tablas 5-I y 3-II de los Capítulos I y II respectivamente.
Para estudiar la composición de la fracción picoplanctónica eucariota a lo largo del
gradiente patagónico-antártico se corrieron 40 muestras en 3 geles de DGGE con
fragmentos de aproximadamente 500 pb del gen 18S ARNr (Figura 1-III B). A lo largo
del gradiente latitudinal el número de bandas por muestra varió de 12 a 28. Los lagos
CAPÍTULO III
125
patagónicos presentaron entre 17 y 28 bandas por lago y los lagos antárticos entre 12
y 25 bandas. En estos geles se observaron un total de 819 bandas ubicadas en 90
posiciones diferentes. Cada posición en los geles de DGGE fue considerada como una
unidad taxonómica operativa (OTU) eucariota. Entre estas 90 OTUs, 63 fueron
compartidas entre los cuerpos de agua de Patagonia y Antártida, 24 estuvieron
presentes solamente en los patagónicos y 3 fueron exclusivas de los lagos antárticos.
De un total de 90 posiciones diferentes, 27 fueron secuenciadas exitosamente (estas
27 posiciones representan un 45% del total de intensidad en los 3 geles de DGGE). Se
secuenciaron bandas con la misma posición en distintos lagos para confirmar que
correspondían a la misma secuencia: bandas 3 (a, b), 7 (a, b) y 17 (a, b) (Figura 1-III
B). Del total de bandas secuenciadas exitosamente, se encontró que únicamente la
secuencia 3 (presente en los Lagos Ghio y M), correspondiente a una eucariota no
cultivada aislada de un lago antártico cubierto de hielo, fue hallada simultáneamente
en los lagos patagónicos y antárticos estudiados. La información completa de estas
secuencias se encuentra detallada en las Tablas 8-I y 6-II de los Capítulos I y II
respectivamente.
Factores que determinan la composición de las comunidades picoplanctónicas
El resultado del Análisis de Cluster (Figura 2-III A) utilizando el patrón de bandas de
DGGE completo (presencia-ausencia de OTUs procariotas) sugiere un efecto de la
ubicación geografica y de la morfometría de los cuerpos de agua sobre la composición
de las comunidades de bacterias planctónicas. Los lagos de Antártida se agruparon
juntos (grupo I), excepto la Laguna temporaria Pingüi. Los cuerpos de agua de
Patagonia también se agruparon juntos (grupo II) y subgrupos dentro de éste, reflejan
en general, diferencias en las características morfométricas y limonológicas: el grupo
II-A reúne principalmente a lagos profundos y oligotróficos, mientras que el grupo II-B
incluye principalmente cuerpos de agua pequeños, someros y meso-eutróficos.
Además, se encontraron diferencias significativas en la composición de las
comunidades del bacterioplancton (basada en la intensidad de las bandas y en la
presencia-ausencia de las bandas de DGGE) entre Patagonia y Antártida (ANOSIM r =
0,46 (Bray Curtis) y r = 0,69 (Jaccard), ambos P<0,0001). El resultado del Análisis de
Cluster (Figura 2-III B) utilizando el patrón de bandas de DGGE completo (presencia-
ausencia de OTUs eucariotas) también sugiere en general un efecto de la posición
geográfica y de la morfometría de los cuerpos de agua sobre la composición de las
CAPÍTULO III
126
comunidades de eucariotas (fracción picoplanctónica). Los lagos antárticos se
agruparon juntos (grupo I), excepto la Laguna temporaria Pingüi que se agrupa junto a
lagunas temporarias patagónicas (grupo III). Los cuerpos de agua de Patagonia
forman otro grupo (II) que consiste principalmente en lagos profundos y oligotróficos
(excepto las Lagunas temporarias 13, 9, 7 y 3). En la parte inferior del dendrograma se
observa otro grupo (IV) conformado por las lagunas patagónicas de Tierra del Fuego y
algunas lagunas temporarias (P.11 y P.2). Se encontraron diferencias significativas en
la composición de las comunidades de la fracción eucariota de 0,2 –3 µm (basada en
la intensidad de las bandas y en la presencia-ausencia de las bandas de DGGE) entre
Patagonia y Antártida (ANOSIM r = 0,23 (Bray Curtis) y r = 0,17 (Jaccard), ambos
P<0,01).
CAPÍTULO III
127
Figura 1-III. Imágenes de los geles de DGGE corridos con productos de amplificación de 500 pb del gen 16S ARNr bacteriano (A) y de los
geles de DGGE corridos con productos de amplificación de 500 pb del gen 18S ARNr de la fracción eucariota de 0,2 -3 µm (B). Los números
en los geles indican las bandas cortadas y secuenciadas. En la base de la figura se presenta el número total de bandas de cada cuerpo de
agua. L.: Lago, Lag.: Laguna, P.: Laguna temporaria.
A
CAPÍTULO III
128
B
CAPÍTULO III
129
Figura 2-III. Dendrogramas resultantes del análisis de agrupamiento utilizando el
patrón de bandas (presencia-ausencia) procariota de la Figura 1-III A (A) y utilizando el
patrón de bandas (presencia-ausencia) eucariota de la Figura 1-III (B), el método
UPGMA (unweighted pair- group average linkage) como algoritmo de enlace y el
Índice de Jaccard como medida de similitud. L.: Lago, Lag.: Laguna, P.: Laguna
temporaria.
A
CAPÍTULO III
130
B
En la Figura 3-III A se muestra el resultado del CCA utilizando el patron de bandas de
DGGE (intensidades relativas) procariota y las variables ambientales junto con las
espaciales para 41 cuerpos de agua. Los primeros dos ejes explicaron un 59,0% de la
varianza (eje 1: 38,5% y eje 2: 20,5%). Las variables ambientales estuvieron
correlacionadas significativamente con el primer eje (P = 0,022) y el test de Monte
Carlo para todos los ejes canónicos también resultó significativo (P = 0,012). El primer
eje estuvo definido principalemente por la latitud (coeficiente de correlación: -0,86) y el
segundo eje por el área del lago y el COD (coeficiente de correlación: 0,63 y -0,68
respectivamente). Este análisis muestra claramente la separación de los cuerpos de
CAPÍTULO III
131
agua por la latitud y la morfometría. Los lagos antárticos estan ordenados en la parte
media e izquierda de la figura y los lagos con mayores superficies, como el L.
Argentino, L. Viedma, L. Fagnano, L. Musters, L. Pueyrredón, L. Cardiel y L. Colhue
Huapi están ubicados juntos en la parte superior derecha de la figura. Por otro lado, la
mayoría de las lagunas y cuerpos de agua temporarios se ordenan a mayores valores
de fosfato y COD. La variable más importante y significativa fue la latitud (P = 0,002),
la segunda variable en importancia fue el área de los cuerpos de agua, aunque no
resultó significativa (P = 0,078) al igual que la otras variables incluídas en el análisis
(Figura 3-III A).
En la Figura 3-III B se muestra el resultado del CCA utilizando el patrón de
intensidades relativas de bandas de DGGE eucariotas (fracción 0,2 – 3 µm) y las
variables ambientales junto con las espaciales para 40 cuerpos de agua. Los primeros
dos ejes explicaron un 57,8% de la varianza (eje 1: 33,5% y eje 2: 24,3%). Las
variables ambientales estuvieron correlacionadas significativamente con el primer eje
(P = 0,024) y el test de Monte Carlo para todos los ejes canónicos también fue
significativo (P = 0,002). El primer eje estuvo definido principalmente por la
conductividad y el COD (coeficientes de correlación: 0,95 y 0,44 respectivamente) y el
segundo eje por la latitud, longitud y el oxígeno disuelto (coeficientes de correlación:
0,85; -0,84; 0,71 respectivamente). Este análisis muestra claramente la separación de
los cuerpos de agua por la latitud y características ambientales locales: los lagos
antárticos estan ordenados en la parte superior e izquierda de la figura,
coincidentemente con mayores valores de latitud y oxígeno disuelto y la mayoría de
los lagos patagónicos se ubican en la parte inferior de la figura, con menores valores
de latitud y con mayores valores de longitud y COD. La laguna de Los Cisnes se ubica
junto a mayores valores de conductividad en la parte superior derecha de la figura. Las
variables más importantes y significativas fueron latitud (P = 0,038), longitud (P =
0,002) y conductividad (P = 0,004), mientras que el resto de las variables no resultaron
significativas (Figura 3-III B).
CAPÍTULO III
132
Figura 3-III. Imágenes pertenecientes al análisis de correspondencia canónica (CCA)
basado en las intensidades del patrón de bandas de DGGE procariota (Figura 1-III A) y
las variables ambientales (biplot) (A), y al CCA basado en las intensidades del patrón
de bandas de DGGE eucariota (Figura 1-III B) y las variables ambientales (biplot) (B).
Las variables ambientales significativas (P<0,05) están indicadas con líneas sólidas y
las variables no significativas con líneas punteadas. COD: carbono orgánico disuelto,
P-PO4: concentración de fosfato, Kd: coeficiente de atenuación vertical de la luz, OD:
oxígeno disuelto, NID: nitrógeno inorgánico disuelto, L.: Lago, Lag.: Laguna, P.:
Laguna temporaria.
A
CAPÍTULO III
133
B
Los análisis de partición de la variación canónica realizados para discriminar la
importancia relativa de los factores ambientales y los espaciales, mostraron que
ambos ejercen influencia sobre la composición de las comunidades de bacterias
planctónicas. En el caso de la matriz de similitud de las OTUs bacterianas basada en
las intensidades relativas de las bandas, la importancia de la componente espacial fue
de 11,0%, para los factores ambientales no espaciales fue de 11,8% (Test de Monte
Carlo P<0,05 para todos los ejes canónicos), mientras que para la componente
espacial de influencia ambiental fue de 2,2% (espacio + ambiente). Cuando se utilizó
la matriz de similitud de las OTUs bacterianas basada en la presencia-ausencia de las
bandas, la importancia relativa de la componente espacial fue de 12,0%, mientras que
para la ambiental fue de 15,1% (Test de Monte Carlo P<0,002 para todos los ejes
CAPÍTULO III
134
canónicos) y para el conjunto ambiente más espacio fue de 3,7% (Figura 4-III A, B). El
Test de Mantel (simple y parcial) indicó que tanto las variables ambientales como las
espaciales influyeron significativamente sobre la composición de las comunidades de
bacterias planctónicas (Figura 4-III C, D) tanto para la matriz basada en la presencia-
ausencia de bandas (Test de Mantel parcial: ambiente solo r = 0,15, P = 0,02 ; espacio
solo r = -0,51, P = 0,00001) como en la basada en las intensidades relativas de las
bandas (Test de Mantel parcial: ambiente solo r = 0,11, P = 0,07; espacio solo r = -
0,28, P = 0,00001). Cabe destacar que según este análisis, la influencia de los factores
ambientales locales tuvo una menor importancia sobre la matriz de intensidades
relativas de bandas u OTUs.
El análisis de partición de la variación canónica (CCA parcial) realizado para
discriminar la importancia relativa de los factores ambientales y los espaciales, mostró
que ambos ejercen influencia sobre la composición de las comunidades de
picoeucariotas planctónicas. Para la matriz de OTUs eucariotas basada en las
intensidades relativas, la importancia de la componente espacial fue de 8,7%, mientras
que para los factores ambientales no espaciales fue de 14,3 (Test de Monte Carlo
P<0,05 para todos los ejes canónicos) y para la componente espacial de influencia
ambiental fue de 3,5% (espacio + ambiente). En el caso de la matriz de similitud de las
OTUs eucariotas basada en la presencia-ausencia de las bandas la importancia
relativa de la componente espacial fue de 9,4%, para la ambiental fue de 13,4% (Test
de Monte Carlo P<0,05 para todos los ejes canónicos) y para el conjunto ambiente
más espacio fue de 2,5% (Figura 5-III A, B). En el caso del Test de Mantel (simple y
parcial) sólo la matriz de distancia geográfica o matriz espacial (calculada con latitud y
longitud) ejerció una influencia significativa sobre la composición de las comunidades
eucariotas planctónicas, tanto para la matriz de similitud de las OTUs basada en
intensidades relativas (Test de Mantel parcial: r = -0,24; P = 0,00001), como para la
matriz basada en la presencia-ausencia de bandas (Test de Mantel parcial: r = -0,19; P
= 0,0005). En cambio, de acuerdo a este análisis la matriz de similitud ambiental
estandarizada no ejerció una influencia significativa sobre la composición de las
comunidades eucariotas planctónicas, tanto para la matriz basada en intensidades
relativas de bandas (Test de Mantel parcial: r = 0,091; P = 0,140) como para la matriz
basada en la presencia-ausencia de bandas (Test de Mantel parcial: r = 0,053; P =
0,273) (Figura 5-III C, D).
CAPÍTULO III
135
Figura 4-III. Resultados de los análisis de partición de la variación canónica de las
matrices de las OTUs bacterianas en distintos componentes: (A) para la matriz de las
comunidades bacterianas basada en la intensidad relativa de las bandas (respuesta
unimodal) mediante CCA parcial y (B) para la matriz de las comunidades basada en la
presencia-ausencia de las bandas (respuesta lineal) mediante RDA parcial. Los
resultados del Test de Mantel parcial en distintos componentes se muestran en (C)
para la matriz de intensidades relativas de las OTUs y (D) para la matriz de presencia-
ausencia de OTUs. Se ilustran 4 componentes distintos: variación ambiental pura que
no es compartida por las variables espaciales (ambiente solo), variación espacial pura
independiente de cualquier factor ambiental (espacio solo), estructura espacial en la
comunidad bacteriana que es compartida por las variables ambientales (ambiente +
espacio) y variación no explicada.
CAPÍTULO III
136
Figura 5-III. Resultados de los análisis de partición de la variación canónica de las
matrices de OTUs eucariotas en distintos componentes: (A) para la matriz de las
comunidades eucariotas basada en la intensidad relativa de las bandas (respuesta
unimodal) mediante CCA parcial y (B) para la matriz de las comunidades eucariotas
basada en la presencia-ausencia de las bandas (respuesta unimodal) mediante CCA
parcial. Los resultados del Test de Mantel parcial en distintos componentes se
muestran en (C) para la matriz de intensidades relativas de las OTUs y (D) para la
matriz de presencia-ausencia de OTUs eucariotas. Se ilustran 4 componentes distintos
al igual que en la Figura 4-III.
CAPÍTULO III
137
Por otro lado, en la Figura 6-III A y B se muestra la relación entre la matriz de similitud
de las OTUs bacterianas basada en la presencia-ausencia de bandas versus la matriz
de distancia geográfica y versus la matriz de similitud ambiental respectivamente. Se
observa que al aumentar la distancia geográfica disminuye significativamente la
similitud de las OTUs bacterianas (Figura 6-III A) y que al aumentar la similitud de las
variables ambientales locales, aumenta significativamente la similitud de las OTUs
bacterianas (Figura 6-III B).
Figura 6-III. Matriz de similitud de la composición de la comunidad bacteriana (basada
en la presencia-ausencia de OTUs) versus la matriz de distancia geográfica (calculada
con latitud y longitud) (A), y Matriz de similitud de la composición de la comunidad
bacteriana versus la matriz de similitud ambiental estandarizada (calculada con área,
fosfato, COD, Kd) (B). Se realizó el Test de Mantel parcial para determinar las
correlaciones entre las matrices controlando el efecto de la matriz de similitud
ambiental (A), y el efecto de la matriz de distancia geográfica (B).
CAPÍTULO III
138
En el caso de las OTUS eucariotas, la relación entre la matriz de similitud basada en la
presencia-ausencia de bandas versus la matriz de distancia geográfica y versus la
matriz de similitud ambiental se muestra en la Figura 7-III A y B respectivamente. Se
observa que al aumentar la distancia geográfica disminuye significativamente la
similitud entre las OTUs eucariotas (Figura 7-III A) y que al aumentar la similitud de las
variables ambientales locales, aumenta sutilmente la similitud entre las OTUs
bacterianas (Figura 7-III B) aunque no de forma significativa.
Figura 7-III. Matriz de similitud de la composición de la comunidad eucariota (basada
en la presencia-ausencia de OTUs) versus la matriz de distancia geográfica (calculada
con latitud y longitud) (A), y Matriz de similitud de la composición de la comunidad
eucariota versus la matriz de similitud ambiental estandarizada (calculada con
conductividad, COD, NID, OD) (B). Se realizó el Test de Mantel parcial para
determinar las correlaciones entre las matrices controlando el efecto de la matriz de
similitud ambiental (A), y el efecto de la matriz de distancia geográfica (B).
CAPÍTULO III
139
Para poder estudiar a mayor profundidad la influencia de los factores que modelan la
composición de las comunidades del picoplancton procariota y eucariota, cada matriz
de similitud (procariota y eucariota) obtenida a partir del patrón de presencia-ausencia
de bandas fue comparada con 3 matrices distintas, matriz de distribución espacial,
matriz de características físico-químicas y matriz morfo-topográfica, utilizando el Test
de Mantel simple y parcial. Este análisis indicó que la distribución espacial de los lagos
y los factores físico-químicos tuvieron un efecto significativo sobre la composición de
las comunidades bacterianas (Tabla 1-III A). Por otro lado, sólo la distribución espacial
de los lagos ejerció un efecto significativo sobre la composición de las comunidades
eucariotas planctónicas (Tabla 1-III B).
Tabla 1-III. Resultado de las correlaciones del Test de Mantel simple y parcial de la
matriz de similitud basada en la presencia-ausencia de OTUs procariotas (A) y
eucariotas (B) con la matriz de distancia geográfica (distancia entre pares de lagos
calculada con la latitud y longitud), con la matriz físico-química (fosfato, COD, Kd para
procariotas y conductividad, COD, OD, NID para eucariotas) y con la matriz morfo-
topográfica (área del lago y altitud).
A
Mantel Mantel parcial†
Tipo de matriz R P r P
Espacial/Geográfica -0,503* 0,0001 --- ---
Físico-química 0,296* 0,0001 0,305* 0,0001
Morfo-topográfica 0,082 0,1020 0,036 0,3066
B
Mantel Mantel parcial†
Tipo de matriz R P r P
Espacial/Geográfica -0,201* 0,0004 --- ---
Físico-química 0,094 0,136 0,053 0,273
Morfo-topográfica -0,031 0,349 -0,055 0,264 *P<0,05 † El Test de Mantel parcial mantiene constante la matriz espacial/geográfica
CAPÍTULO III
140
Factores que determinan el número de bandas de DGGE (riqueza de OTUs
dominantes) de las comunidades picoplanctónicas
Las regresiones lineales múltiples realizadas con el número de bandas procariotas de
cada cuerpo de agua y las variables ambientales (latitud, área del cuerpo de agua,
fosfato, nitrógeno inorgánico disuelto, COD, Kd, pH, y oxígeno disuelto) mostraron que
solamente la latitud y el área del cuerpo de agua tuvieron un efecto significativo sobre
la variable dependiente y fueron seleccionadas por el modelo de regresión, siendo las
variables que mejor explicaban el patrón del número de bandas dominantes. El modelo
seleccionado (1) presentó coeficientes de regresión parcial significativos (coeficiente
de determinación corregido R2 = 0,49; P = 0,0001; n = 41):
(1) Número de bandas de DGGE = 36,90 – 0,32 x latitud + 8,50x10-9 x área,
con la latitud expresada en grados y el área en m2. Los coeficientes de regresión
parcial estandarizados fueron: 0,51 (área del cuerpo de agua) y -0,39 (latitud).
El número de bandas de DGGE disminuyó con el aumento de latitud, resultando en
una correlación negativa y significativa (Figura 8-III A). Por otro lado, el número de
bandas de DGGE presentó una relación más débil con la temperatura (Figura 8-III B)
que con la latitud, y no estuvo correlacionada con la concentración de clorofila a (r = -
0,08; P = 0,63; n = 41). Además, el número de bandas de DGGE presentó una relación
positiva con el área del cuerpo de agua (Figura 8-III C) y con la concentración de
fosfato (r = 0,34; P = 0,032; n = 41), y una correlación negativa con el oxígeno disuelto
de cada cuerpo de agua (r = -0,40; P = 0,009; n = 41).
CAPÍTULO III
141
Figure 8-III. Correlaciones entre el número de bandas de DGGE (riqueza de OTUs
bacterianas dominantes) y latitud (A), temperatura (B), y Log10-área de cada cuerpo de
agua (C). Se utilizó el Test de Spearman para determinar las correlaciones entre las
variables.
CAPÍTULO III
142
Las regresiones lineales múltiples realizadas con el número de bandas eucariotas de
cada cuerpo de agua y las variables ambientales (latitud, longitud, área del cuerpo de
agua, fosfato, nitrógeno inorgánico disuelto, COD, Kd, conductividad, oxígeno disuelto
y clorofila a) mostraron que solamente la clorofila a y el área del cuerpo de agua
tuvieron un efecto significativo sobre la variable dependiente y fueron seleccionadas
por el modelo de regresión, siendo las variables que mejor explican el patrón en el
número de bandas de picoeucariotas dominantes. El modelo seleccionado (2)
presentó coeficientes de regresión parcial significativos (coeficiente de determinación
corregido R2 = 0,35; P = 0,0001; n = 40):
(2) Número de bandas de DGGE = 19,29 + 0,186 x clorofila a + 4,55 x 10-9 x área,
con la concentración de clorofila a fitoplanctónica expresada en µg l-1 y el área en m2.
Los coeficientes de regresión parcial estandarizados fueron: 0,48 (clorofila a) y 0,35
(área del cuerpo de agua).
No se observó ninguna correlación entre el número de bandas de DGGE eucariotas y
la latitud, el área o la temperatura de cada cuerpo de agua. Al igual que para los
procariotas, el número de bandas de DGGE presentó una relación positiva con la
concentración de fosfato (r = 0,48; P = 0,002; n = 40), mientras que mostró una
correlación negativa con el oxígeno disuelto de cada cuerpo de agua (r = -0,41; P =
0,009; n = 40). Además, el número de bandas presentó una correlación positiva con la
clorofila a (r = 0,32; P = 0,046; n = 40).
NOTA: Parte de los resultados expuestos en este capítulo han sido publicados en el
año 2011 en la Revista “Freshwater Biology” (56: 1973-1991). El artículo se adjunta al
final de esta tesis.
CAPÍTULO III
143
DISCUSIÓN
Se ha postulado que a pesar del aislamiento de la Antártida y los hábitats sub-
antárticos, los microorganismos pueden ser dispersados por el aire a la Península
Antártica probablemente desde Sudamérica u otras regiones antárticas (Marshall
1996, Hughes et al. 2004). No obstante, a pesar de que un alto porcentaje de bandas
fue compartido entre Patagonia y Antártida (60% de OTUs procariotas y 70% de OTUs
eucariotas) y que presentaron varias secuencias en común, la composición de las
comunidades picoplanctónicas fue significativamente diferente. Asimismo, se observa
también que al aumentar la distancia geográfica disminuye significativamente la
similitud en la composición de las OTUs procariotas y eucariotas (disminución menos
marcada para las comunidades eucariotas de 0,2 a 3 µm). Estas diferencias
encontradas en la composición de las comunidades picoplanctónicas pueden deberse
probablemente al aumento en la severidad climática a lo largo del gradiente latitudinal,
y a las bajas temperaturas y condiciones extremas imperantes en el continente
antártico comparadas con las de Patagonia, que determinan que sólo ciertas especies
puedan prosperar. No obstante, diferencias similares en la composición de las
comunidades picoplanctónicas con la distancia geográfica también fueron observadas
en otros ambientes. Pommier et al. (2010) estudiaron el bacterioplancton a lo largo de
una transecta en el Mar Mediterráneo, mediante la técnica pirosecuenciación, y
observaron que la estructura de las comunidades bacterianas varió dramáticamente
entre sitios, a pesar de la proximidad y de la conectividad física entre los mismos.
Los resultados obtenidos a partir de los diferentes análisis multivariados evidenciaron
que la composición de la fracción picoplanctónica procariota y eucariota estuvo influida
tanto por factores ambientales como espaciales. La influencia de los factores
ambientales y espaciales sobre la estructura de comunidades bacterianas fue
reportada por diferentes autores para distintos ambientes acuáticos. En particular,
Langenheder & Ragnarsson (2007) estudiaron un grupo de estanques rocosos
costeros a una escala espacial pequeña (<500 m) y encontraron que la composición
del bacterioplancton estaba influenciada tanto por las condiciones ambientales locales
como por factores espaciales. Por su parte, Yannarell & Tripplet (2005) reportaron que
las características ambientales, regionales, temporales y de paisaje interactuaban
modelando los ensamblajes bacterianos en lagos templados del norte de Wisconsin,
Estados Unidos de América; Cottenie (2005), en un trabajo basado en un gran set de
datos publicados sobre la estructura de un amplio rango de taxones encontró que
aproximadamente el 50% de la variación en la composición de las comunidades se
CAPÍTULO III
144
explicaba por variables locales y espaciales. Por otro lado, en un estudio de
metacomunidades bacterianas llevado a cabo en 98 cuerpos de agua someros meso-
eutróficos ubicados en un gradiente norte-sur en Europa (>2500 km), se observó una
fuerte influencia de factores ambientales locales (recursos y pastoreo), mientras que la
distancia espacial mostró un impacto marginal (Van der Gutch et al. 2007). Fuller et al.
(2006) realizaron un análisis molecular de la estructura de las comunidades de
picofitoplancton en el Mar Arábigo y reportaron un efecto del espacio sobre los
distintos ecotipos a lo largo de la transecta horizontal estudiada.
Separar los dos tipos de factores (espacial o geográfico y ambiental) en los estudios
biogeográficos es esencial porque los factores espaciales pueden presentar
correlaciones espurias con determinados factores ambientales locales, que afectan la
composición de las comunidades (Somaruga & Casamayor 2009). La dificultad de la
covariación entre las características espaciales y ambientales sólo puede, en cierta
medida, ser discernida a partir de los análisis multivariados (e.g. Beisner et al. 2006,
Langenheder & Ragnarsson 2007, Van der Gucht et al. 2007). En este capítulo los
análisis de partición de la variación canónica realizados resultaron útiles para
discriminar la influencia de cada tipo de factor, observándose que la posición
geográfica de los lagos y las condiciones ambientales influyeron sobre el
bacterioplancton y la fracción picoeucariota. Con el Test de Mantel simple y parcial se
obtuvieron resultados relativamente parecidos. Para el picoplancton procariota la
importancia relativa del espacio fue mayor en los análisis de Mantel que en los análisis
de partición de la variación canónica. Para el picoplancton eucariota, si bien los
análisis de partición de la variación canónica mostraron que los dos factores ejercen
influencia sobre las comunidades, los análisis de Mantel indicaron que solamente la
distancia geográfica influyó sobre la composición de estas comunidades y no así las
variables ambientales locales. Aunque los análisis canónicos poseen mucha más
potencia que los de Mantel, estos últimos resultan apropiados para estudiar la
variación en la diversidad beta (recambio o diversidad de especies entre áreas) entre
grupos de sitios (Legendre et al. 2005). Asimismo, un alto porcentaje de la variación
resultó no explicado por los factores abióticos estudiados, pudiendo deberse a la
influencia de los factores bióticos, que podrían afectar y regular a estas comunidades.
Por otro lado, se observó que el número de OTUs bacterianas dominantes disminuyó
con la latitud, mientras el número de OTUs de la fracción picoeucariota no mostró lo
mismo. Como la técnica molecular empleada en este estudio (DGGE) no es totalmente
apropiada para obtener la riqueza total de OTUs, estos resultados deben ser
interpretados con cautela en el marco de la teoría que postula la disminución de la
CAPÍTULO III
145
biodiversidad con el aumento de latitud. Sin embargo, cabe señalar que otros autores
también han observado gradientes latitudinales en la diversidad de bacterias; en
particular, Fuhrman et al. (2008) reportaron un patrón de disminución de la diversidad
de bacterias planctónicas marinas con muestras tomadas desde los trópicos hasta los
polos en ambos hemisferios. Pommier et al. (2007) también observaron un gradiente
latitudinal en la riqueza de OTUs en aguas costeras y Yergueau et al. (2007)
obtuvieron el mismo patrón en la diversidad de bacterias a lo largo de un gradiente de
hábitats terrestres antárticos. Contrariamente, Chu et al. (2010) no encontraron el
mismo patrón en bacterias del suelo utilizando la técnica de pirosecuenciación. En el
caso de los eucariotas, Lawley et al. (2004) observaron una disminución de la
diversidad con el aumento de latitud sólo cuando se realizaron comparaciones a una
escala espacial amplia (regional) entre muestras de suelo de Antártida Marítima y
Continental, mientras que no obtuvieron el mismo patrón al comparar sólo el gradiente
de latitud en los sitios de Antártida Marítima (de 60° a 72° S).
En concordancia con los estudios realizados por Pommier et al. (2007) y Fuhrman et
al. (2008) para bacterioplancton marino, en este trabajo de tesis el número de bandas
de DGGE de bacterias estuvo correlacionado débilmente con la temperatura (r = 0,33;
P = 0,036) pero no con la concentración de clorofila a, sugiriendo que la temperatura
tiene más importancia que la productividad en el patrón latitudinal observado para la
fracción procariota. Por el contrario, la fracción eucariota 0, 2 – 3 µm no estuvo
correlacionada con la temperatura pero sí presentó una relación débil con la
concentración de clorofila a (r = 0,32; P = 0,046) sugiriendo que para estas
comunidades la productividad de los sistemas tendría más importancia.
En este trabajo también se encontró que el número de OTUs bacterianas dominantes
estuvo directamente correlacionado con el área de los cuerpos de agua, mientras que
no ocurrió lo mismo con el número de OTUs de la fracción picoeucariota. El análisis de
la relación entre el tamaño del área de los lagos y el número de OTUs bacterianas ha
arrojado resultados contrapuestos. En particular, una relación positiva fue reportada
por Horner-Devine et al. (2004), Bell et al. (2005), van der Gast et al. (2005) y Reche et
al. (2005), mientras que otros autores no encontraron esta misma relación (Lindström
& Leskinen 2002, Zwart et al. 2002). Aunque el número de bandas de DGGE no refleja
la riqueza total de una comunidad, cantidades diferentes de bandas de DGGE para
cada muestra pueden reflejar una diferencia en el rango de abundancia de las
poblaciones (por ejemplo, en el número de poblaciones por encima del umbral de
detección) y una correlación significativa entre el número de bandas de DGGE y la
superficie del cuerpo de agua podría tener algún significado ecológico.
CAPÍTULO III
146
Los patrones previamente discutidos fueron observados mediante la utilización de un
método de huella genética (fingerprinting) que como fue mencionado previamente,
permite comparar los lagos en base a las poblaciones más abundantes. Sin embargo,
esta limitante metodológica no afecta los patrones generales observados, ya que en
este trabajo nos enfocamos en un criterio conservativo, analizando los grupos más
abundantes detectados. En el mismo sentido, en un estudio de patrones espaciales de
bacterias del Mar Mediterráneo, Pommier et al. (2010) observaron que el
agrupamiento de las muestras era similar usando las 300 OTUs más abundantes y
utilizando el set de datos completos obtenidos con pirosecuenciación; estos resultados
sugieren que los métodos de fingerprinting fueron suficientes para agrupar las
muestras apropiadamente a pesar de que éstos permiten obtener sólo los taxones
más abundantes. Con la técnica de DGGE se espera estudiar los organismos
dominantes que están viviendo, desarrollándose y reproduciéndose en un cuerpo de
agua en un momento determinado y no organismos ocasionales que podrían haber
llegado a ese lugar por simple azar. Algunas especies permanecen en el tiempo y
presentan altas abundancias y son probablemente las responsables de gran parte del
funcionamiento del ecosistema (Pedrós-Alió 2006). Magurran & Henderson (2003)
llamaron a estas especies "núcleo o esenciales", y aquellas que se encuentran por
debajo del umbral de detección por las técnicas moleculares pueden ser consideradas
como especies "ocasionales" que forman parte del "banco de semillas" de especies
raras, que crecen lentamente o esporádicamente o no se desarrollan nunca. Por otro
lado, aunque la técnica molecular utilizada en este trabajo es adecuada para estudiar
los taxones dominantes que permanecen en el tiempo y presentan altas abundancias,
hay que tener en cuenta los posibles cambios temporales que podrían ocurrir en los
ensamblajes picoplanctónicos. Al tratarse de un estudio que abarca una gran escala
espacial, las muestras patagónicas sólo pudieron ser tomadas en una ocasión en cada
lago durante dos años consecutivos y en la misma estación para poder compararse.
De lo expuesto hasta aquí se concluye que la composición de las comunidades
picoplanctónicas fue diferente entre Patagonia y Antártida, registrándose mayores
diferencias para las comunidades procariotas que para los eucariotas. Por otro lado, la
composición de estas comunidades estuvo controlada por una combinación de
factores ambientales locales (e.g. área, conductividad, COD) y espaciales o
geográficos (principalmente latitud, además de la longitud). Estos resultados proveen
nueva evidencia que soporta la hipótesis de patrones biogeográficos de los ensambles
microbianos y sugiere que tanto los factores espaciales como los ambientales locales
controlan la estructura de estas comunidades.
CAPÍTULO IV
ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL PICOPLANCTON A LO LARGO DEL
GRADIENTE LATITUDINAL PATAGÓNICO-ANTÁRTICO
CAPÍTULO IV
147
INTRODUCCIÓN
El desarrollo de nuevas técnicas durante las décadas del ‘70 y ’80, tales como la
microscopía de epifluorescencia y la tinción del DNA (Daley & Hobbie 1975), y más
tarde la citometría de flujo (Olson et al. 1985, Chisholm et al. 1988) permitieron
cuantificar con mayor precisión los organismos <2 �m cuya importancia hasta
entonces había sido subestimada (Sieburth et al. 1978), generando importantes
avances en la ecología, fisiología y taxonomía del picoplancton. Estos adelantos
llevaron a ampliar la noción de cadena trófica tradicional incorporando el concepto de
“microbial loop” o bucle microbiano (Azam et al. 1983) referido a una red microbiana
en donde el carbono orgánico disuelto (COD) es reincorporado al sistema a través de
las bacterias heterotróficas. Nanoflagelados bacterívoros y pequeños ciliados cierran
esta cadena formando un bucle entre las bacterias y el zooplancton. Actualmente se
sabe que la trama trófica microbiana es mucho más compleja e importante de lo que
se pensaba 30 años atrás y que el picoplancton usualmente domina todos los
ambientes acuáticos en términos numéricos y muchas veces también en biomasa (del
Giorgio & Gasol 1995, Gasol et al. 1997), y que juega un papel fundamental en los
ciclos biogeoquímicos (Sherr & Sherr 2002), canalizando el carbono orgánico y los
nutrientes desde los estratos inferiores de la trama trófica hacia los estratos
superiores.
Las técnicas de epifluoescencia y citometría de flujo permiten cuantificar los
componentes heterotróficos (bacterioplancton) y autotróficos o fotosintéticos
(principalmente picocianobacterias y picoeucariotas) del picoplancton utilizando
distintas estrategias. La técnica de epifluorescencia se basa en la observación directa
de la fluorescencia emitida por los microorganismos teñidos con un colorante para
ADN y excitados con una longitud de onda adecuada, permitiendo cuantificarlos
(Porter & Feig 1980). Al mismo tiempo, la autofluorescencia de la clorofila y de otros
pigmentos accesorios (ficoeritrina y ficocianina) permiten individualizar y cuantificar los
organismos fotosintéticos. La citometría de flujo (con la cual no es posible “ver” los
organismos) se basa en la medición de la luz dispersada y la fluorescencia emitida por
una partícula (porque fue teñida o porque posee pigmentos autofluorescentes) cuando
atraviesa un láser de una determinada longitud de onda. A través de este método se
obtiene información simultánea sobre la abundancia, estructura interna, tamaño,
concentración relativa de pigmentos (clorofila, ficoeritrina, ficocianina) e inclusive
actividad de la célula (Gasol & del Giorgio 2000).
CAPÍTULO IV
148
La abundancia del picoplancton parece particularmente afectada por la temperatura
del agua y la disponibilidad de nutrientes. En relación a los nutrientes, estos
organismos de pequeño tamaño, resultan mejores competidores que las algas de
mayor tamaño en ambientes oligotróficos (Callieri & Stockner 1997), dado que
presentan una alta relación superficie/volumen (Sournia 1981). Cuando más pequeño
es el tamaño del organismo, más eficiente es metabólicamente. Actualmente es
comúnmente aceptado que mientras la abundancia y producción del picoplancton
fotosintético aumenta con el incremento del estado trófico del cuerpo de agua, su
contribución relativa a la biomasa total del fitoplancton y a la producción disminuye en
el mismo gradiente, tanto en ambientes marinos como en agua dulce (Stockner 1988,
1991, Søndergaard 1991, Agawin et al. 2000, Bell & Kalff 2001). En particular, Agawin
et al. (2000) demostraron que la menor contribución del picoplancton fotosintético en
aguas productivas podría estar relacionada con el aumento de las tasas de pérdida (de
las células del picoplancton fotosintético por el pastoreo), mientras que su posición
dominante en aguas cálidas y oligotróficas comúnmente se atribuye a su elevada
relación superficie/volumen y a las diferencias en las tasas de crecimiento intrínseco
entre el picoplancton fotosintético y las células de fitoplancton de mayor tamaño.
Las condiciones lumínicas en la columna de agua también tienen un impacto
importante en la composición de las comunidades de picoplancton fotosintético al
seleccionar el tipo de pigmento dominante. Vörös et al. (1998) reportaron que las
células de cianobacterias ricas en ficocianina son típicas en condiciones de baja luz
(e.g. en cuerpos de agua eutróficos y/o turbios), mientras que las aguas más
transparentes usualmente favorecen a las células ricas en ficoeritrina (e.g en cuerpos
de agua oligotróficos). Este resultado coincidió con experimentos de laboratorio
llevados a cabo con especies de Synechococcus marinas (Glover et al. 1986,
Waterbury et al. 1986) y de agua dulce (Wyman & Fay 1987, Hauschild et al. 1991,
Callieri et al. 1996). Por otro lado, Craig (1987) demostró la importancia de la luz en
explicar la prevalencia de picoeucariotas sobre picoprocariotas en lagos menos
transparentes y eutróficos. Asimismo, Pick & Agbeti (1991) reportaron que la
contribución del picoplancton eucariota a la biomasa total picoplanctónica aumentaría
al aumentar el coeficiente de atenuación de la luz.
La gran mayoría de los trabajos disponibles para agua dulce sobre picoplancton
autotrófico se focalizaron en lagos de latitudes altas o lagos dimícticos templados (e.g.
Bell & Kalff 2001). Como fue mencionado en la sección Introducción general de esta
tesis, existen algunos trabajos realizados en lagos del noroeste patagónico (Zunino &
Diaz 2000, Modenutti et al. 2003, Callieri et al. 2007, Bastidas Navarro et al. 2009a,
CAPÍTULO IV
149
Corno et al. 2009), en los que se han estudiado las comunidades picoplanctónicas y
reportado entre otras cosas, la abundancia de estas comunidades. Lo observado hasta
el momento en esos lagos fue que en general las picocianobacterias fueron
numéricamente más abundantes (hasta 2 órdenes de magnitud) que las
picoeucariotas. Las abundancias reportadas (obtenidas por epifluorescencia) variaron
entre 2 x 103 y 1 x 105 células ml-1 para el picoplancton autotrófico y entre 4 x 105 y 2 x
106 células ml-1 para el picoplancton heterotrófico. Además, algunos de estos autores
observaron que los lagos oligotróficos están dominados por células de cianobacterias
ricas en ficoeritrina y que los cuerpos de agua con altas concentraciones de clorofila a
y nutrientes, están dominados por células de cianobacterias ricas en ficocianina.
Para lagos de Antártida marítima se registra el trabajo de Toro et al. (2007), quienes
caracterizaron los cuerpos de agua de Península Byers y reportaron abundancias de
bacterioplancton en el rango de 0,5-6,5 x 106 células ml-1 y de picocianobacterias entre
1-2 x 102 células ml-1 en superficie y de 2 x 104 células ml-1 en profundidad. En el
mismo sitio antártico, Villaescusa et al. (2010) estudiaron la composición y abundancia
de las comunidades bacterianas en los lagos mediante la técnica de DGGE y
citometría de flujo, reportando valores de bacterioplancton de 1,0 x 106 y 1,2 x 107
células ml-1 y observando dos grupos bacterianos distintos, con alto y bajo contenido
de ADN. Para Bahía Esperanza, los estudios previos sobre las comunidades
microbianas estuvieron restringidos a la cuantificación de la abundancia de
bacterioplancton, picocianobacterias y picoeucariotas mediante epifluorescencia entre
lagos con grado de trofismo contrastante (Allende & Izaguirre 2003, Izaguirre et al.
2003), registrándose valores de picocianobacterias de hasta 3,6 x 105 células ml-1.
Aunque muchos estudios demostraron la eficiencia y sensibilidad de la citometría de
flujo (e.g. Li & Wood 1988, Olson et al. 1993, Gasol & del Giorgio 2000), esta técnica
ha sido usada con menor frecuencia por los limnólogos en estudios de campo del
picofitoplancton en comparación a la epifluorescencia. Su utilización se ha extendido
en la última década en diferentes ambientes acuáticos continentales (e.g. Crosbie et
al. 2003, Vidal et al. 2007, Sarmento et al. 2008, Izaguirre et al. 2010, Kranewitter
2010). Por otro lado, el picoplancton autotrófico y las bacterias heterotróficas son
usualmente estudiados separadamente, aún cuando desde un punto de vista funcional
es probable que ocupen una posición similar en la cadena trófica microbiana dado que
ambos son tomados por el protozooplancton (nanoflagelados heterotróficos, ciliados y
rotíferos) como la principal fuente de carbono (e.g. Nagata et al. 1996, Simek et al.
1996) y compiten por nutrientes inorgánicos (e.g. Tanaka et al. 2004).
CAPÍTULO IV
150
Los objetivos del presente capítulo son:
i) Cuantificar el picoplancton (autotrófico y heterotrófico) en los distintos cuerpos
de agua del gradiente latitudinal patagónico-antártico combinando técnicas
de microscopía de epifluorescencia y citometría de flujo.
ii) Comparar la abundancia y composición (cantidad de poblaciones distintas) del
picoplancton entre cuerpos de agua con estados tróficos contrastantes.
iii) Analizar estadísticamente qué factores (espaciales y/o ambientales) son más
importantes en determinar la abundancia de los distintos componentes del
picoplancton a lo largo del gradiente latitudinal patagónico-antártico.
MATERIALES Y MÉTODOS
En el presente capítulo se llevó a cabo un análisis cuantitativo del picoplancton,
utilizando las técnicas epifluorescencia y citometría de flujo, a lo largo de un gradiente
latitudinal que se extiende desde la Provincia de Chubut, Patagonia Austral Argentina,
hasta Bahía Esperanza, Península Antártica (45° 22´ a 63° 24´ S) (Figura 1, sección
Área de estudio de estas tesis). Las características del área de estudio, de los
cuerpos de agua y el diseño de muestreo fueron detallados en los Capítulo I y II.
Determinación de la abundancia del picoplancton
Epifluorescencia
La abundancia total de bacterias, picocianobacterias y picoeucariotas fue determinada
mediante recuentos con microscopio de epifluorescencia (Olympus BX40F4, Japón).
Una muestra de cada cuerpo de agua fue fijada con glutaraldehído 10% frío
previamente filtrado por 0,2 µm (concentración final 1%). Antes de las 24 hs se filtró un
volumen de muestra a través de membranas negras de policarbonato de 0,2 µm de
tamaño de poro, agregándose DAPI (4,6 diamidino-2-fenilindole, concentración final 10
�g ml-1) como colorante para la tinción del ADN de las bacterias, y siguiendo el
procedimiento empleado por Porter & Feig (1980). Los filtros se montaron entre porta y
CAPÍTULO IV
151
cubre con aceite de inmersión para epifluorescencia y los preparados se preservaron
en freezer a –20°C. Las bacterias (teñidas con DAPI ) se contaron bajo luz UV (las
arqueas estarían incluidas en estos recuentos), los picoeucariotas bajo luz azul y las
picocianobacterias bajo luz verde y azul a fin de distinguir organismos ricos en
ficocianina y en ficoeritrina. Bajo excitación con luz azul (450-490 nm) las
picoeucariotas se ven rojas, debido a la autofluorescencia de la clorofila a y las
picocianobacterias se ven amarillas (células ricas en ficoeritrina) o rojas oscuras
(células ricas en ficocianina), dependiendo de la presencia o ausencia de la
ficobiliproteína, ficoeritrina. Bajo luz verde (546 nm) las picocianobacterias se ven
amarillas/naranjas (células ricas en ficoeritrina) y rojas (células ricas en ficocianina)
(Callieri 2008).
Las muestras de los 45 cuerpos de agua estudiados pudieron ser analizadas
exitosamente mediante esta técnica.
Citometría de Flujo
Las muestras de cada cuerpo de agua (4 ml) se fijaron con glutaraldehido 10% frío
previamente filtrado por 0,2 µm (concentración final 1%) dentro de crioviales de 5 ml
de capacidad, se dejaron en oscuridad por 10 minutos y luego se preservaron en
nitrógeno líquido para su transporte al laboratorio, donde se almacenaron en freezer a
–70°C hasta su análisis.
Los estudios cuantitativos del picoplancton fotosintético (picocianobacterias y
picoeucariotas) y heterotrófico (bacterias) por citometría de flujo se llevaron a cabo
mediante el citómetro de flujo FACSCalibur (Becton-Dickinson, USA) del Instituto de
Ciencias del Mar de Barcelona equipado con un laser azul de argón (potencia =
15mW, 488 nm de emisión) y un laser rojo diodo (635 nm de emisión). Al menos
30.000 eventos fueron obtenidos para cada muestra (usualmente 90.000 eventos).
Este citómetro permite obtener hasta 6 parámetros simultáneamente: 4 colores (FL1,
FL2, FL3 y FL4), además del side scatter (SSC) y el forward scatter (FSC). El FL1
corresponde a la fluorescencia verde luego de excitarse con luz azul (488 nm
excitación, 530/30 nm BP emisión) lo que permite identificar a los organismos que
fueron teñidos con SybrGreen I. El FL2 es la fluorescencia naranja luego de excitarse
con luz azul (488 nm exitación, 585/42 nm BP emisión) que permite detectar la
autofluorescencia de la ficoeritrina. El FL3 corresponde a la fluorescencia roja luego de
excitarse con luz azul (488 nm excitación, 670 nm LP emisión) que permite detectar la
autofluorescencia de la clorofila a. El FL4 es la fluorescencia roja luego de excitarse
CAPÍTULO IV
152
con luz roja (635 nm excitación, 661/61 nm BP emisión) que corresponde a la
autofluorescencia de la ficocianina. El side scatter (SSC) representa la luz dispersada
por la partícula en un ángulo de 90º y está asociada con la estructura y complejidad
interna de la célula, y en partículas pequeñas, también con el tamaño. El forward
scatter (FSC) está relacionado con el tamaño de las partículas.
En el momento de ser analizadas cada muestra fue descongelada y separada en dos
submuestras por separado para contar bacterias y picofitoplancton (picocianobacterias
y picoeucariotas). Para las determinaciones de bacterias se realizaron diluciones que
dependieron de la muestra (entre 1:1 y 1:8) y se utilizó 2 µl de fluorocromo SyBGreen
(494/521, Molecular Probes Inc.) para teñir el ADN de las células; esta mezcla fue
dejada en oscuridad por 10 minutos y corrida en el citómetro de flujo durante 120
segundos. Para las determinaciones de picofitoplancton se utilizó un volumen de 2 ml,
no se realizó tinción dado que se aprovechó la fluorescencia natural de los pigmentos
fotosintéticos y las muestras se corrieron en general durante 300 segundos. Como
estándar interno se utilizó una solución de microesferas de latex fluorescentes
(Fluospheres® microesferas de carboxilato de 1µm de diámetro = beads, yellow-green
fluorescent 505/515, Molecular Probes) de tamaño y fluorescencia constante, la cual
se adicionó a cada muestra antes de ser analizada. La concentración estándar de
microesferas de latex (ML) fue determinada mediante microscopio de epifluorescencia.
Con el set de detectores del citómetro de flujo se logró diferenciar las distintas
poblaciones picoplanctónicas. Las bacterias fueron detectadas siguiendo el criterio de
Gasol y del Giorgio (2000) por su figura en citogramas de SSC vs. FL1 y FL1 vs. FL3.
Para las bacterias normalmente es posible detectar dos subpoblaciones en los
citogramas SSC versus FL1, poblaciones con alto contenido de ADN y poblaciones
con bajo contenido del mismo (Gasol et al. 1999, Bouvier et al. 2007). En los gráficos
FL1 versus FL3, las ML caen en una línea, las bacterias en otra y el ruido en una
tercera (con más FL3 que FL1 respectivamente). Las picocianobacterias y
picoeucariotas fueron identificadas en los citogramas de SSC vs. FL3, FL2 vs. FL3
(fluorescencia naranja, correspondiente a ficoeritrina) y FL4 vs. FL3 (fluorescencia
roja, correspondiente a ficocianina) (Olson et al. 1993). El análisis de los datos se llevó
a cabo con el programa FlowJo (Tree Star).
La biomasa de las bacterias heterotróficas fue calculada usando la relación carbono-
volumen derivada de Norland (1993) a partir de los datos de Simon y Azam (1989): pg
C célula-1 = 0,12 pg (µm3 célula-1)0,7.
Un total de 37 muestras pertenecientes a los cuerpos de agua estudiados a lo largo
del gradiente latitudinal pudieron ser analizadas exitosamente con esta técnica para
CAPÍTULO IV
153
todos los componentes picoplanctónicos. Las muestras correspondientes a los
cuerpos de agua Colhué Huapi (Bacterias), P.10 y Pingüi, analizadas mediante
citometría de flujo, fueron descartadas por la interferencia o ruido generado por los
sedimentos y la por la mala resolución de los citogramas. Para el Lago Colhué Huapi
solo fueron descartadas las bacterias por estar muy cerca del ruido, pero el
picoplancton autotrófico si pudo ser analizado con éxito. Las muestras de los lagos
Refugio, Limnopolar, L, M, Z no pudieron ser tomadas para realizar esta técnica.
Análisis estadístico
Se realizaron regresiones lineales múltiples (Stepwise Multiple Regressions) con las
abundancias de los distintos componentes picoplactónicos (variable dependiente)
obtenidos mediante epifluorescencia (picoeucariotas, picocianobacterias y bacterias), y
las siguientes variables ambientales (variables independientes): latitud, longitud,
altitud, área del cuerpo de agua, fosfato, carbono orgánico disuelto (COD), coeficiente
de atenuación vertical de la luz (Kd), pH, oxígeno disuelto, nitrógeno inorgánico
disuelto (NID) y clorofila a. Además, entre la concentración de clorofila a y la
abundancia de picoplancton fotosintético y la abundancia de bacterias se realizaron
regresiones lineales simples. Las variables dependientes que no cumplieron el
supuesto de normalidad (Prueba Kolmogorov-Smirnov) fueron transformadas (Log10 o
Log10 + 1). Por otro lado, las correlaciones entre las distintas variables fueron llevadas
a cabo con la prueba Rho de Spearman. Los análisis de regresiones simples,
regresiones múltiples y correlaciones se realizaron mediante el programa SPSS 15.0.1
(StatSoft).
RESULTADOS
Cuantificación del picoplancton heterotrófico y autotrófico mediante
Epifluorescencia
Para comparar la abundancia de las comunidades picoplanctónicas de los cuerpos de
agua ubicados a lo largo del gradiente latitudinal patagónico-antártico se realizaron
recuentos por epifluorescencia del picoplancton heterotrófico (bacterias totales) y del
CAPÍTULO IV
154
picoplancton autotrófico o fotosintético (picocianobacterias y picoeucariotas). En la
Figura 1-IV A y B se muestran las abundancias de estas comunidades para cada uno
de los cuerpos de agua estudiados. Las bacterias presentaron un rango de
abundancias que varió entre 1,10 x 105 y 6,96 x 107 células ml-1 (promedio = 6,85 x 106
células ml-1). Las picocianobacterias variaron entre valores no detectables hasta un
máximo de 5,71 x 106 células ml-1 (promedio = 4,41 x 105 células ml-1). Por su parte, las
picoeucariotas también mostraron un amplio rango de variación, desde no detectables
hasta 5,56 x 105 células ml-1 (promedio = 4,27 x 104 células ml-1). En general, dentro
del picoplancton fotosintético, las picocianobacterias presentaron abundancias con un
orden de magnitud mayor que la de las picoeucariotas, excepto en algunos cuerpos de
agua donde la abundancia de picoeucariotas fue casi igual o mayor (Lagunas
temporarias 2, 19, 22, 27, 29, Lagunas Negra, Victoria, San Luis y en la mayoría de los
lagos antárticos).
Por otro lado, las cianobacterias de los distintos cuerpos de agua estudiados variaron
en el contenido de ficoeritrina y/o ficocianina en sus células. En muchos cuerpos de
agua se observaron células de picocianobacterias sólo ricas en ficoeritrina (e.g. Lagos
Pueyrredón, Posadas, Cardiel, Viedma, Argentino, del Desierto, Escondido, Yehuin,
Acigami, Laguna temporaria 18 y en lagos antárticos) y en otros se observaron
picocianobacterias tanto ricas en ficoeritrina como en ficocianina (e.g. Lagunas
temporarias 2, 11, 22) y en muy pocos cuerpos de agua se observaron sólo células
ricas en ficocianina (Laguna Negra y Laguna temporaria 19). Las células ricas en
ficoeritrina se evidenciaron al microscopio de epifluorescencia dado que al ser
excitadas con luz verde emitieron fluorescencia amarilla/naranja brillante y en luz azul
amarilla/verdosa, mientras que las células ricas en ficocianina se evidenciaron dado
que al ser excitadas con luz verde emitieron fluorescencia roja obscura y ante la luz
azul mostraban un rojo muy pálido, casi imperceptible (MacIsaac & Stockner 1993).
Este resultado fue corroborado mediante las señales FL2 y FL4 del citómetro de flujo
(ver más abajo).
En la Tabla 1-IV se encuentran resumidos los rangos de abundancias de
picoeucariotas, picocianobacterias y bacterias de los cuerpos de agua del gradiente
latitudinal estudiado, los cuales fueron clasificados por su estado trófico teniendo en
cuenta los niveles de clorofila a, nitrógeno inorgánico disuelto (NID), fosfato, carbono
orgánico disuelto (COD) y coeficiente de atenuación vertical de la luz (Kd). Al
considerar todas estas variables provenientes de los 45 cuerpos de agua que integran
el gradiente latitudinal, 26 cuerpos de agua fueron clasificados como oligotróficos
(incluidos los ultraoligotróficos), 12 como mesotróficos y 7 como eutróficos. En esta
CAPÍTULO IV
155
tabla se observa que la abundancia de los distintos componentes picoplanctónicos
(bacterias, picocianobacterias y picoeucariotas) aumenta con el aumento de estado
trófico de los cuerpos de agua.
La abundancia de picoeucariotas, picocianobacterias y bacterias estuvo
correlacionada positivamente con la concentración de fosfato (r = 0,331 P = 0,026; r =
0,580 P<0,0001; r = 0, 556 P<0,0001, respectivamente) y con el COD (r = 0,581
P<0,0001; r = 0,559 P<0,0001; r = 0,828 P<0,0001, respectivamente). Por su parte, la
abundancia de picoeucariotas se correlacionó positivamente con el Kd y con la clorofila
a (r = 0,522 P<0.0001; r = 0.403 P = 0,006 respectivamente), a diferencia de lo que
ocurrió con las picocianobacterias que mostraron una débil correlación con el Kd (r =
0,301 P = 0,045) y no mostraron ninguna correlación con la clorofila a.
Figura 1-IV . Abundancias obtenidas mediante recuentos por epifluorescencia del
picoplancton heterotrófico (A) y del picoplancton autotrófico (B). L.: Lago, Lag.:
Laguna, P.: Laguna temporaria.
A
CAPÍTULO IV
156
B
Las densidades más altas de picoeucariotas (en el orden de 105 células ml-1) fueron
registradas en los cuerpos de agua que presentaron mayor turbidez (Lago Colhué
Huapi en Chubut, la Laguna San Luis en Tierra del Fuego y en las Lagunas
temporarias 22 y 29). La abundancia de bacterias también estuvo positivamente
correlacionada con el Kd (r = 0,527 P<0.0001), y la clorofila a (r = 0,535 P<0,0001)
(Tabla 2-IV). Por otro lado, la abundancia de los distintos componentes
picoplanctónicos estudiados se correlacionó negativamente con la latitud y
positivamente con la temperatura (Tabla 2-IV).
Las abundancias de cada uno de los componentes picoplanctónicos obtenidos por
epifluorescencia (bacterias, picocianobacterias y picoeucariotas) fueron relacionadas
con todas las variables ambientales juntas mediante regresiones lineales múltiples
para poder determinar qué variables eran seleccionadas por el modelo y por lo tanto
presentaban mayor importancia para explicar la tendencia de las abundancias lo largo
del gradiente latitudinal.
CAPÍTULO IV
157
Tabla 1-IV. Rangos de valores de las variables ambientales y de las abundancias del picoplancton (obtenidas por epifluorescencia) según la
clasificación de los distintos cuerpos de agua de acuerdo a su estado trófico (oligotrófico, mesotrófico o eutróficos). Entre paréntesis se indican
los promedios. Clorofila a = µg l-1, nitrógeno inorgánico disuelto (NID) = mg l-1, fosfato (P-PO43-) = mg l-1, carbono orgánico disuelto (COD) = mg
l-1, coeficiente de atenuación vertical de la luz (Kd) = m-1, L.: Lago, Lag.: Laguna, P.: Laguna temporaria.
Estado trófico Cuerpo de agua Variables ambientales
Picoeucariotas (células ml -1)
Picocianobacterias (células ml -1)
Bacterias (células ml -1)
Oligotrófico
L.Musters, L.Pueyrredón, L.Posadas, L.Ghio, L.Cardiel, P.15, L. del Desierto, P.17, L.Viedma, L.Argentino, L.Acigami,
Lag.Negra, L.Fagnano, L.Escondido, Lag. Victoria, P.30, L.Yehuin, L.L, L.M, LW, L.Z, L.Limnopolar, L.Esperanza,
L.Encantado, L.Flora, L.Chico
Clorofila = 0,10-2,62 NID = 0,007-0,370
P-PO43-= 0,002-1,390
COD = 0,38-42,00 Kd = 0,09-2,16
0 - 4,03 x 104
(8,10 x 103) 0 - 3,57 x 105
(6,51 x 104) 1,10 x 105 - 5,28 x 106
(2,07 x 106)
Mesotrófico P.2,P.3, P.10, P.12, P.18, P.19, P.22,
Lag.De Los Cisnes, Lag.San Luis, P.27, P.29, L.Boeckella
Clorofila = 0,29-9,68 NID = 0,03-0,61
P-PO43-= 0,04-0,40
COD = 0,7-50,2 Kd = 0,42-3,30
2,35 x 103 - 1,64 x 105
(6,47 x 104) 0 - 1,38 x 106
(2,89 x 105) 5,33 x 105 - 1,29 x 107
(6,20 x 106)
Eutrófico L.Colhué Huapi, P.7, P.9, P.11, P.13, L.Refugio, L.Pingüi
Clorofila = 17,02-47,01 NID = 0,05-33,60
P-PO43-= 0,10-15,80
COD = 8,2-64,1 Kd = 1,17-28,52
1,74 x 102 - 5,56 x 105
(1,98 x 105) 9,10 x 101 - 5,71 x 106
(2,10 x 106) 2,95 x 106 - 6,96 x 107
(4,33 x 107)
CAPÍTULO IV
158
Tabla 2-IV. Correlaciones (Rho de Spearman) entre las abundancias de los distintos
componentes picoplanctónicos (picoeucariotas, picocianobacterias, picoplancton
fotosintético: picoeucariotas + picocianobacterias, y bacterias) y algunas de las
variables ambientales. Nitrógeno inorgánico disuelto (NID), carbono orgánico disuelto
(COD) y coeficiente de atenuación vertical de la luz (Kd). Abundancias obtenidas
mediante epifluorescencia.
Picoeucariotas Picocianobacterias Picoplancton fotosintético Bacterias
Latitud -0,627*** -0,768*** -0,803*** -0,562***
Longitud 0,412* 0,587*** 0,598*** 0,331
Altitud 0,468** 0,586*** 0,580*** 0,400*
Temperatura 0,612*** 0,697*** 0,742*** 0,655***
Oxígeno disuelto -0,536*** -0,521*** -0,569*** -0,618***
pH 0,539*** 0,713*** 0,717*** 0,680***
Conductividad 0,322 0,471** 0,489** 0,640***
Fosfato 0,331 0,580*** 0,532*** 0,556***
NID 0,005 0,079 -0,027 0,215
Kd 0,522*** 0,301 0,399* 0,527***
COD 0,581*** 0,559*** 0,608*** 0,828***
Clorofila a 0,403* 0,276 0,291 0,535***
Valores en negrita representan P<0.05; *P<0.01; **P<0.001; ***P<0.0001. n = 45.
Valores en rojo: correlaciones que no fueron obtenidas a partir de los recuentos de citometría de
flujo, y solo fueron obtenidas a partir de los datos de epifluorescencia. Valores en negro:
correlaciones que sí fueron obtenidas a partir de los datos de los recuentos por citómetría de flujo
(valores de r y P no mostrados) y epifluorescencia.
Para el total de bacterias heterotróficas la latitud, el COD, el fosfato, la concentración
de clorofila a y el área de los cuerpos de agua tuvieron un efecto significativo sobre la
variable dependiente y fueron seleccionadas por el modelo de regresión, siendo las
variables que mejor explicaban el patrón de abundancias de bacterias.
CAPÍTULO IV
159
El modelo seleccionado (1) presentó coeficientes de regresión parcial significativos
(coeficiente de determinación corregido R2 = 0,729; P = 0,0001; n = 45):
(1) Bacterias (células ml-1) = 8,73 – 0,049 x latitud + 0,019 x clorofila a – 0,001 x área
+ 0,011 x COD + 0,039 x fosfato,
con latitud expresada en grados, clorofila a en µg l-1, el área en km2 y DOC y fosfato en
mg l-1. Los coeficientes de regresión parcial estandarizados fueron: -0,47 (latitud), 0,29
(clorofila), -0,28 (área del cuerpo de agua), 0,25 (COD), y 0,22 (fosfato).
Para el total de picocianobacterias solamente la latitud, el pH y la altitud de los cuerpos
de agua tuvieron un efecto significativo sobre la variable dependiente y fueron
seleccionadas por el modelo de regresión, siendo las variables que mejor explicaban
el patrón de abundancias de esta comunidad. El modelo seleccionado (2) presentó
coeficientes de regresión parcial significativos (coeficiente de determinación corregido
R2 = 0,717; P = 0,0001; n = 45):
(2) Picocianobacterias (células ml-1) = 11,98 – 0,83 x latitud + 6,53 x pH + 0,01 x
altitud,
con la latitud expresada en grados y altitud en metros sobre el nivel del mar. Los
coeficientes de regresión parcial estandarizados fueron: -0,39 (latitud) 0,39 (pH) y 0,26
(altitud).
Por su parte, para el total de picoeucariotas solamente la latitud y la clorofila a de los
cuerpos de agua tuvieron un efecto significativo sobre la variable dependiente y fueron
seleccionadas por el modelo de regresión, siendo las variables que mejor explicaban
el patrón de abundancias de esta comunidad. El modelo seleccionado (3) presentó
coeficientes de regresión parcial significativos (coeficiente de determinación corregido
R2 = 0,423; P = 0,0001; n = 45):
(3) Picoeucariotas (células ml-1) = 8,79 – 0,09 x latitud + 0,02 x clorofila a,
con la latitud expresada en grados y la clorofila a en µg l-1. Los coeficientes de
regresión parcial estandarizados fueron: -0,58 (latitud) y 0,24 (clorofila a).
Este estudio también reveló diferencias importantes en la abundancia del picoplancton
fotosintético total (picocianobacterias + picoeucariotas) entre los cuerpos de agua
estudiados en relación al estado trófico de los mismos. La abundancia de esta
CAPÍTULO IV
160
comunidad fue mayor en cuerpos de agua eutróficos, con valores de abundancias
comprendidos en el rango 2,65 x 102 a 5,80 x 106 células ml-1. Los valores en los lagos
oligotróficos variaron entre 4,18 x 102 y 3,65 x 105 células ml-1. La relación entre la
abundancia de picoplancton fotosintético y la concentración de clorofila a (estimación
de la biomasa autotrófica total) fue positiva y significativa (Figura 2-IV A).
En la Figura 2-IV B se observa que la abundancia de bacterias heterotróficas sigue el
mismo patrón que el picoplancton fotosintético en cuanto a su relación a la clorofila a o
biomasa autotrófica total.
Figura 2-IV. Regresión lineal simple entre la biomasa autotrófica (medida como
concentración de clorofila a fitoplanctónica) y la abundancia del picoplancton
fotosintético (picoeucariotas + picocianobacterias) (A) y la abundancia de bacterias
heterotróficas (B). Ambos graficados en escala logarítmica (Log10 + 1).
A
B
CAPÍTULO IV
161
Cuantificación y caracterización de las poblaciones picoplanctónicas
autotróficas y heterotróficas mediante Citometría de Flujo
El análisis de las muestras por citometría de flujo evidenció una notable variedad de
poblaciones de organismos picoplanctónicos en los cuerpos de agua del gradiente
latitudinal estudiado, que se diferenciaron de acuerdo a su tamaño, presencia de
pigmentos, contenido de ADN, estructura celular y complejidad interna: bacterias con
bajo contenido de ADN y alto contenido de ADN (Figura 3-IV A), picocianobacterias
ricas en ficoeritrina y ricas en ficocianina y distintas poblaciones de picoeucariotas
(Figura 3-IV B y C).
Las bacterias heterotróficas presentaron un rango de abundancias a lo largo del
gradiente latitudinal de cuerpos de agua que varió entre 9,11 x 104 y 2,92 x 107 células
ml-1 (promedio = 4,67 x 106 células ml-1), el de las picocianobacterias entre no
detectables (0) y 8,55 x 105 células ml-1 (promedio = 8,20 x 104 células ml-1) y el de las
picoeucariotas varió entre no detectables (0) y 8,46 x 105 células ml-1 (promedio = 8,28
x 104 células ml-1).
En la Tabla 3-IV se muestran los rangos de abundancias y promedios de las bacterias
heterotróficas con bajo contenido de ADN y alto contenido de ADN, de las
picocianobacterias ricas en ficoeritrina y ficocianina y la abundancia total de
picoeucariotas. En general se observa que la abundancia de los distintos componentes
picoplanctónicos aumentó con el aumento de estado trófico del cuerpo de agua,
excepto la abundancia de las picocianobacterias ricas en ficoeritrina. En particular se
observa que las abundancias de las bacterias con bajo contenido de ADN y con alto
contenido de ADN son mayores al aumentar el estado trófico de los cuerpos de agua.
Además, en la mayoría de los casos las abundancias de las bacterias con bajo
contenido de ADN son levemente mayores que las abundancias de las bacterias con
alto contenido. Este aumento se vio reflejado en las correlaciones significativas y
positivas entre las bacterias heterotróficas y las distintas variables ambientales
relacionadas con el trofismo. La abundancia de las bacterias con bajo contenido de
ADN estuvo correlacionada positivamente con el pH (r = 0,740 P = 0,0001), la
conductividad (r = 0,717 P = 0,0001), el Kd (r = 0,421 P = 0,009), el fosfato (r = 0,480 P
= 0,003), el COD (r = 0,845 P = 0,0001), y la concentración de clorofila a (r = 0,488 P =
0,002). Lo mismo ocurrió con las bacterias con alto contenido de ADN, mostrando
correlaciones significativas y positivas con el pH (r = 0,684 P = 0,0001), la
CAPÍTULO IV
162
conductividad (r = 0,666 P = 0,0001), el Kd (r = 0,427 P = 0,008), el fosfato (r = 0,474 P
= 0,003), el COD (r = 0,836 P = 0,0001) y la clorofila a (r = 0,473 P = 0,003).
Con respecto a las picocianobacterias, al igual que el patrón registrado por
epifluorescencia, se observaron mayores abundancias de células ricas en ficoeritrina
en cuerpos de agua oligotróficos y mesotróficos, presentando un promedio de
abundancias que casi cuadriplica (Promedios = 8,37 x 104 y 8,94 x 104 células ml-1
respectivamente) la abundancia de los cuerpos de agua eutróficos (Promedio = 2,42 x
104 células ml-1). Lo opuesto ocurrió con las células ricas en ficocianina, que
presentaron una abundancia promedio con un orden de magnitud mayor en cuerpos
de agua eutróficos (2,47 x 104 células ml-1) que en oligotróficos y mesotróficos (1,75 x
103 y 9,09 x 102 células ml-1 respectivamente) (Tabla 3-IV). Al considerar todos los
lagos del gradiente latitudinal, se observa que la contribución promedio de células
ricas en ficoeritrina al total de picocianobacterias (en términos de abundancia) fue del
82% y el de las células ricas en ficocianina fue de 18%. La contribución de
picocianobacterias ricas en ficoeritrina al total de picocianobacterias aumentó
significativamente con el área del cuerpo de agua (r = 0,337 P = 0,049) y disminuyó
significativamente con el aumento de pH (r = -0,439 P = 0,015), con el aumento en la
concentración de fósforo (r = -0,487 P = 0,006), con el aumento de COD (r = -0,411 P
= 0,024) y con el aumento de clorofila a (r = -0,539 P = 0,003). Lo opuesto ocurrió con
la contribución de picocianobacterias ricas en ficocianina al total de picocianobacterias,
resultando una correlación significativa y negativa con el área del cuerpo de agua (r = -
0,353 P = 0,046), y en correlaciones significativas y positivas con el pH, fosfato, COD y
clorofila a (r = 0,436 P = 0,016; r = 0,481 P = 0,007; r = 0,418 P = 0,022; r = 0,569 P =
0,001).
Las picoeucariotas mostraron un aumento en su abundancia al aumentar el estado
trófico de los cuerpos de agua (Tabla 3-IV). La abundancia de este componente
picoplanctónico aumentó al aumentar el pH, la conductividad y Kd del cuerpo de agua
(r = 0,534 P = 0,001; r = 0,481 P = 0,002; r = 0,407 P = 0,011), y al aumentar
concentración de COD y clorofila a (r = 0,515 P = 0,001; r = 623 P = 0,0001).
Estos análisis permitieron reconocer las poblaciones de picoplancton fotosintético más
representativas en los distintos tipos de lagos estudiados (Figura 3-IV B y C). El
número de poblaciones de picoplancton fotosintético (picoeucariotas y
picocianobacterias) a lo largo del gradiente latitudinal varió entre 1 y 8 con un
promedio de 4 poblaciones (en lagos patagónicos el número de poblaciones varió
entre 1 y 8, promedio = 5; y en lagos antárticos entre 2 y 4, promedio = 3).
CAPÍTULO IV
163
Figura 3-IV. Gráficos obtenidos mediante citometría de flujo de algunos de los cuerpos
de agua estudiados.. Se detallan las distintas poblaciones identificadas en cada uno:
(A) bacterias con bajo contenido de ADN (LNA) y alto contenido de ADN (HNA), (B) y
(C) picocianobacterias ricas en ficoeritrina (Pcy rica-PE) y ricas en ficocianina (Pcy
rica-PC) y distintas poblaciones de picoeucariotas (Peuk). ML: microesferas de látex.
A
B
CAPÍTULO IV
164
C
CAPÍTULO IV
165
Tabla 3-IV . Rangos y promedios de las abundancias en células ml-1 de los distintos componentes del picoplancton clasificando los cuerpos de
agua según su estado trófico en oligotróficos, mesotróficos y eutróficos.
PICOEUCARIOTAS PICOCIANOBACTERIAS BACTERIAS
Cuerpo de agua Picoeucariotas totales (células ml -1)
Picocianobacterias ricas en ficoeritrina (células ml -1)
Picocianobacterias ricas en ficocianina (células ml -1)
Bacterias bajo contenido de ADN
(células ml -1)
Bacterias alto contenido de ADN
(células ml -1)
Oligotróficos (promedio)
4,89 x 102 - 2,51 X 104
(7,57 x 103) 0 - 4,86 x 105 (8,37 x 104)
0 - 3,80 x 104 (1,75 x 103)
3,05 x 104 - 4,73 x 106 (9,44 x 105)
5,27 x 104 - 2,86 x 106 (6,94 x 105)
Mesotróficos (promedio)
0 - 3,45 x 105 (7,16 x 104)
0 - 8,55 x 105
(8,94 x 104) 0 - 7,22 x 103 (9,09 x 102)
7,85 x 104 - 9,51 x 106 (3,73 x 106)
2,44 x 105 - 5,83 x 106 (2,65 x 106)
Eutróficos (promedio)
5,66 x 104 - 8,46 x 105 (4,39 x 105)
0 - 9,09 x 104 (2,42 x 104)
0 - 6,06 x 104 (2,47 x 104)
5,81 x 106 - 1,54 x 107 (9,99 x 106)
1,64 x 106 - 1,38 x 107 (6,67 x 106)
Gradiente latitudinal de cuerpos de agua (promedio)
0 - 8,46 x 105
(8,28 x 104) 0 - 8,55 x 105 (7,75 x 104)
0 - 6,06 x 104 (4,53 x 103)
3,05 x 104 - 1,54 x 107 (2,75 x 106)
5,27 x 104 - 1,38 x 107 (1,92 x 106)
CAPÍTULO IV
166
En la tabla 4-IV se observa que a lo largo del gradiente latitudinal se encontraron hasta
7 poblaciones distintas (promedio = 3 poblaciones) de picoeucariotas, 3 poblaciones
distintas de picocianobacterias ricas es ficoeritrina y hasta 2 poblaciones ricas en
ficocianina. Los tamaños celulares promedio de las bacterias a lo largo del gradiente
latitudinal estudiado variaron entre 0,037 y 0,090 µm3 (en lagos patagónicos el tamaño
promedio varió entre 0,061 y 0,090 µm3, promedio = 0,076 µm3; y en lagos antárticos
entre 0,037 y 0,059 µm3, promedio = 0,046 µm3). La biomasa de bacterias expresada
en µg de carbono aumentó con estado trófico de los cuerpos de agua (en promedio
11,0 µg C l-1 en cuerpos de agua oligotróficos y 107,2 µg C l-1 en eutróficos) (Tabla 4-
IV). El tamaño celular promedio y la biomasa de bacterias aumentaron
significativamente con el pH (r = 0,417 P = 0,010; r = 0,702 P = 0,0001
respectivamente), con la concentración de fosfato (r = 0,373 P = 0,023; r = 0,490 P =
0,002 respectivamente) y con la concentración de COD (r = 0,462 P = 0,004; r = 0,832
P = 0,0001 respectivamente).
Tabla 4-IV. Número de poblaciones de picoeucariotas, el número de poblaciones de
picocianobacterias ricas en ficoeritrina y ficocianina, los tamaños celulares promedio
de las bacterias por lago, y la biomasa de bacterias expresada en µg de carbono para
cada uno de los cuerpos de agua estudiados. Al final de la tabla se muestran los
rangos y promedios de los distintos componentes separando los cuerpos de agua
según su estado trófico, así como también los rangos y promedios para todos los
cuerpos de agua del gradiente latitudinal. L.: Lago, Lag.: Laguna, P.: Laguna
temporaria.
PICOEUCARIOTAS PICOCIANOBACTERIAS BACTERIAS
Cuerpo de agua Número de
poblaciones Picoeucariotas
Número de poblaciones
picocianobacterias ricas en ficoeritrina
Número de poblaciones
picocianobacterias ricas en ficocianina
Tamaño celular promedio Bacterias
(µm3)
Biomasa Bacterias (µgC l -1)
L.Musters 2 2 0 0,076 26,0
P.2 3 0 0 0,079 30,1
P.3 4 1 2 0,090 62,3
L.Colhué Huapi 2 1 2 n.d. n.d.
L.Pueyrredón 1 2 0 0,080 3,8
L.Posadas 4 2 0 0,078 12,0
P.7 3 0 1* 0,063 46,3
CAPÍTULO IV
167
L.Ghio 2 1 1 0,083 27,6
P.9 2 1 2 0,069 71,1
P.11 3 2 1 0,077 62,6
P.12 6 1 0 n.d. n.d.
P.13 4 0 0 0,086 248,9
L.Cardiel 3 2 0 0,075 39,1
P.15 3 1 1 0,087 21,5
L.del Desierto 3 1 0 0,080 7,4
P.17 4 1 0 0,079 30,7
P.18 6 1 1* 0,077 27,2
P.19 4 0 1 0,078 24,2
L.Viedma 1 1 0 0,082 2,5
L.Argentino 2 1 0 0,073 1,1
P.22 2 1 1 0,071 147,1
L.Acigami 1 1 0 0,069 2,1
Lag.Negra 4 0 1 0,073 10,9
L.Escondido 3 3 0 0,073 6,5
L.Fagnano 4 2 0 0,066 5,5
P.27 3 1 0 0,070 19,6
Lag.Victoria 4 1 0 0,070 3,7
P.29 2 1 1 0,071 27,3
P.30 5 1 0 0,082 8,6
Lag.San Luis 0 1 0 0,079 64,3
Lag.de Los Cisnes 1 0 0 0,089 48,4
L.Yehuin 7 1 0 0,061 10,2
L.Esperanza 3 0 0 0,037 5,0
L.Boeckella 3 0 0 0,059 5,3
L.Encantado 3 1 0 0,037 12.0
L.Flora 3 0 0 0,037 2,7
L.Chico 3 0 0 0,059 1,5
L.W 2 0 0 0,046 1,5
Oligotróficos (promedio) 1 -7 (3,0) 0 - 3 (1,1) 0 - 1 (0,1) 0,037 - 0,087
(0,068) 1,1 - 39,1
(11,0)
Mesotróficos (promedio) 0 - 6 (3,1) 0 - 1 (0,6) 0 - 2 (0,5) 0,059 - 0,090
(0,076) 5,3 - 147,1
(45,6)
Eutróficos (promedio) 2 - 4 (2,8) 0 - 2 (0,8) 0 - 2 (1,3) 0,063 - 0,086
(0,074) 46,3 - 248,9
(107,2)
Gradiente latitudinal (promedio) 0 -7 (3,0) 0- 3 (0,9) 0 - 2 (0,4) 0,037 - 0,090
(0,07) 1,1 - 248,9
(31,3)
*dato dudoso por encontrarse muy cerca del ruido en los citogramas. n.d.: dato no disponible.
En general se observó que los distintos componentes picoplanctónicos encontrados
mediante citometría de flujo estuvieron relacionados con la latitud y la temperatura del
Tabla 4-IV (Continuación)
CAPÍTULO IV
168
agua. Las bacterias totales disminuyeron su abundancia significativamente al
aumentar la latitud (r = -0,636; P = 0,0001; n = 37) y al disminuir la temperatura (r =
0,756; P = 0,0001; n = 37). Las bacterias con bajo contenido de ADN y las bacterias
con alto contenido de ADN mostraron la misma tendencia (Figura 4-IV A y B). La
biomasa de bacterias (expresada en µg de carbono) y el tamaño celular promedio de
las bacterias también disminuyeron al aumentar la latitud y al disminuir la temperatura
(Figura 4-IV C, D, E, F). Lo mismo se observó para el picoplancton fotosintético (Figura
4-IV G, H).
Ambas técnicas, epifluorescencia y citometría de flujo, fueron consistentes en cuanto a
las abundancias obtenidas, aunque se evidenciaron algunas diferencias. En la Figura
5-IV A se observa que la correlación entre la abundancia de bacterias heterotróficas
obtenidas mediante epifluorescencia y citometría de flujo fue positiva y significativa (r
=0,903; P = 0,0001; n = 37) y en la Figura 5-IV B se observa que la relación entre la
abundancia de fitoplancton fotosintético obtenido por las dos técnicas también resultó
positiva y significativa (r = 0,867; P = 0,0001; n = 38).
CAPÍTULO IV
169
Figura 4-IV. Correlaciones (Rho de Spearman) entre la abundancia de bacterias con alto y bajo contenido de ADN versus latitud (A), y
temperatura (B); correlaciones entre la biomasa de bacterias totales expresada en microgramos de carbono por litro versus latitud (C) y
temperatura (D); correlaciones entre el tamaño celular promedio de bacterias versus latitud (E) y temperatura (F); correlaciones entre la
abundancia de picoplancton fotosintético versus latitud (G) y temperatura (H).
A B
..
CAPÍTULO IV
170
C D
E F
CAPÍTULO IV
171
G H
CAPÍTULO IV
172
Figura 5-IV. Correlaciones (Rho de Spearman) entre las abundancias de las bacterias
heterotróficas obtenidas mediante microscopía de epifluorescencia y citometría de flujo
(A) y entre las abundancias de picoplancton fotosintético (picocianobacterias y
picoeucariotas) obtenidas por las dos técnicas.
A
B
CAPÍTULO IV
173
DISCUSIÓN
La tendencia observada en la abundancia del picoplancton a lo largo del gradiente
latitudinal estuvo modelada por factores físico-químicos relacionados con el trofismo
(e.g. COD, fostato, pH, clorofila a, Kd, temperatura), así como también por los factores
geográficos (latitud, longitud, altitud) de los cuerpos de agua. En general esta
tendencia fue observada con las dos técnicas empleadas para estudiar la abundancia
del picoplancton (epiflorescencia y citometría de flujo) y se vio reflejada en las
correlaciones y regresiones múltiples realizadas entre las abundancias de los distintos
componentes picoplanctónicos y las variables físico-químicas junto a las geográficas.
Aunque la latitud fue seleccionada por los modelos de regresión múltiple como una de
las variables más importantes en determinar la abundancia de todos los componentes
picoplanctónicos (bacterias, picocianobacterias y picoeucariotas), se observaron
algunas diferencias en cuanto al resto de las variables que fueron seleccionadas por
los modelos para cada una de las componentes. Con respecto a las bacterias
heterotróficas se evidenció la importancia de la concentración de COD y de fosfato, la
concentración de clorofila a y el área del cuerpo de agua. Esta última variable se
relaciona en parte con el trofismo, dado que entre los ambientes estudiados, en
general los cuerpos de agua de menor tamaño son meso-eutróficos, mientras que los
de mayor tamaño son en su mayoría oligotróficos. En el caso de las bacterias, la
cantidad y calidad de materia orgánica afectan en gran medida sus tasas de
producción y crecimiento, y por lo tanto la abundancia de las mismas (Farjalla et al.
2002). Por otro lado, el fósforo, además del nitrógeno, constituye un factor limitante
para el crecimiento de las bacterias, especialmente en verano cuando hay bajas
concentraciones de nitrato y amonio en los cuerpos de agua (Morris & Lewis 1992,
Carlsson & Caron 2001). Coincidentemente, Bird & Kalff (1984) y Cole et al. (1988)
observaron regresiones positivas y significativas entre la abundancia de bacterias y la
concentración de clorofila a, tanto en el mar como en agua dulce. Con respecto a las
picocianobacterias se observó un efecto importante de la altitud y pH, mientras que
para las picoeucariotas de la clorofila a. Coincidentemente, Stockner & Shortreed
(1991) reportaron disminuciones en el número de picocianobacterias con la
disminución del pH, sugiriendo que debajo de pH 6 las picocianobacterias contribuyen
muy débilmente a la comunidad picoplanctónica autotrófica.
Es ampliamente reconocido que, en general, las abundancias de los organismos
picoplanctónicos, bacterias heterotróficas (Bird & Kalff 1984, Cole et al. 1988,
Sommaruga & Robarts 1997) y picofitoplancton (Vörös et al. 1998, Callieri et al. 2007),
CAPÍTULO IV
174
aumentan directamente con el grado trófico (concentración de clorofila a). Sin
embargo, en el caso de las algas, la importancia relativa de la fracción <2 �m
disminuye en ambientes más eutróficos (Callieri 2008). Estas relaciones positivas se
hallaron a lo largo de gradientes tróficos en donde los valores máximos de clorofila a
fueron de 220 �g l-1
a 380 �g l-1, mientras que los de abundancia fueron de 3,2 x 10
7
bacterias ml-1 y de picofitoplancton de 8,9 x 10
6 células ml
-1 (Bird & Kalff 1984, Vörös et
al. 1998). Los cuerpos de agua estudiados en esta tesis exhibieron características
contrastantes en relación a su estado trófico (0,10 a 50,0 µg l-1 de clorofila a), lo que
influyó en las diferencias encontradas en las abundancias de picoeucariotas,
picocianobacterias y bacterias planctónicas (1,10 x 105 – 6,96 x 107 células ml-1 para
bacterias y 0 – 5,80 x 106 células ml-1 para picoplancton fotosintético). Todos estos
componentes microbianos fueron más abundantes en los cuerpos de agua eutróficos,
que en los mesotróficos y oligotróficos, resultado consistente con el patrón general
descripto en estudios de ecología microbiana (Gasol & Duarte 2000).
La abundancia del picoplancton parece particularmente afectada no sólo por la
disponibilidad de nutrientes, sino también por la temperatura del agua (Callieri 2008).
En general, la temperatura se relaciona de forma positiva con la tasa de crecimiento
de organismos heterótrofos y autotróficos (Pomeroy & Deibel 1986, White et al. 1991,
Callieri & Stockner 2002). En este trabajo la abundancia de las bacterias heterotróficas
y del picofitoplancton fotosintético aumentó con el aumento de temperatura y
disminuyó a mayor latitud. En coincidencia, otros autores también reportaron que la
abundancia de estos componentes microbianos se correlaciona con la temperatura
tanto en lagos como en océanos (e.g. Caron et al. 1985, Murphy & Haugen 1985,
Jochem 1988, Maeda et al. 1992, Coveney & Wetzel 1995, Li 1998). La temperatura
también puede funcionar como modeladora del tamaño celular bacteriano
(Sommaruga & Robarts 1997, White et al. 1991), lo que explica la relación encontrada
en los cuerpos de agua estudiados entre el tamaño celular promedio de las bacterias y
la temperatura (r = 0,756 P = 0,0001).
La calidad y cantidad de luz en la columna de agua es otro factor particularmente
determinante de la estructura y dinámica del picofitoplancton (Callieri 2008), siendo
diferentes los requerimientos de nutrientes y luz de las picoeucariotas y las
picocianobacterias (Weisse 1993). Para los cuerpos de agua estudiados se observó
una correlación positiva y significativa entre la abundancia de picoeucariotas (obtenida
mediante epifluorescencia y citometría de flujo) y el coeficiente de atenuación vertical
de la luz (r = 0,533 P = 0,0001), mientras que la abundancia de picocianobacterias
totales presentó una correlación baja (r = 0,301 P = 0,045) con el Kd con los datos
CAPÍTULO IV
175
obtenidos por epifluorescencia, y ninguna correlación con los obtenidos por citometría.
Este resultado concuerda con los patrones descriptos por otros autores, que
reportaron que las picoeucariotas prevalecen sobre las picocianobacterias en cuerpos
de agua menos transparentes o eutróficos, debido a que las mismas parecen estar
favorecidas bajo condiciones severas de limitación de luz (Craig 1987, Pick & Agbeti
1991, Søndergaard 1991, Callieri 2008, Vörös et al. 2009). No obstante, las
picocianobacterias con diferente composición de pigmentos accesorios (ficocianina,
ficoeritrina) poseen distinta capacidad para captar diferentes longitudes de onda y por
lo tanto ocupan distintos nichos lumínicos (Stomp et al. 2004). Estudios realizados en
lagos profundos oligotróficos (e.g. lagos subalpinos, lagos del norte patagónico)
demostraron que en general estos ambientes poseen picofitoplancton dominado por
células ricas en ficoeritrina, mientras que las células ricas en ficocianina y el
picofitoplancton eucariota son más raros (Callieri 2008). En comparación con las
picocianobacterias ricas en ficoeritrina, las ricas en ficocianina suelen dominar en
ambientes turbios (Mozes et al. 2006) con coeficientes de atenuación vertical de la
radiación fotosintéticamente activa (PAR) elevados (Pick 1991, Vörös et al. 1998,
Sommaruga & Robart 1997, Silvoso et al. 2011). Esta diferencia está relacionada con
la capacidad que presenta cada grupo de picocianobacterias para utilizar distintas
calidades de luz en la columna de agua. El espectro de absorción de la ficocianina
tiene un máximo en el rojo. En ambientes turbios, la luz roja es la que penetra a mayor
profundidad, por lo que las algas que poseen este pigmento accesorio presentan una
mayor capacidad de captación de luz (Stomp et al. 2007). Todo esto concuerda con lo
observado mediante epifluorescencia y citomtertría en los cuerpos de agua del
gradiente latitudinal estudiado, siendo los cuerpos de agua más transparentes y
oligotróficos dominados por picocianobacterias ricas en ficoeritrina y los cuerpos de
agua menos transparentes o eutróficos dominados por células ricas en ficocianina. Por
otro lado, la contribución de células ricas en ficoeritrina al total de células de
picocianobacterias (en términos de abundancia) aumentó con el área del cuerpo de
agua (como ya se mencionó, en general los cuerpos de agua de mayor tamaño son
oligotróficos) y disminuyó con el aumento de los valores de las variables relacionadas
al trofismo (pH, fosfato, DOC y clorofila a). Por las causas antes mencionadas, la
contribución de células ricas en ficocianina al total de picocianobacterias disminuyó
con el área del cuerpo de agua y aumentó con el aumento de los valores de las
variables relacionadas al trofismo. Esta tendencia coincide con la descripta por Zunino
& Diaz (2000) para lagos profundos y oligotróficos ubicados en el norte patagónico, ya
que estos autores observaron que las células ricas en ficoeritrina eran más
CAPÍTULO IV
176
importantes que las células ricas en ficocianina, y que estas últimas dominaban sólo
en ambientes con alta concentración de clorofila a y nutrientes. En coincidencia,
estudios realizados por Callieri et al. (2007) también reportaron una dominancia de
células de picocianobacterias ricas en ficoeritrina en cuerpos de agua oligotróficos de
la misma región.
En general, la abundancia de cada uno de los componentes del picoplancton difiere en
un orden o más de magnitud, siendo normalmente más abundantes las bacterias
heterotróficas, seguidas por las picocianobacterias y en último lugar las picoeucariotas.
Distintos estudios revelan que la abundancia del picofitoplancton eucariota (<2 µm) es
generalmente un orden de magnitud menor que el de las picocianobacterias,
mostrando frecuentemente picos de abundancia en primavera o durante la
estratificación estival (Stockner 1991, Callieri & Stockner 2002). En los lagos del
gradiente latitudinal estudiado se observó que la abundancia de las bacterias
heterotróficas fue entre 1 y 3 órdenes de magnitud mayor que la abundancia del
picoplancton autotrófico, y que la abundancia de picocianobacterias fue entre 1 y 2
órdenes de magnitud mayor que la abundancia de picoeucariotas, excepto en algunos
cuerpos de agua que presentaron el mismo orden o incluso uno menos (e.g. P.2, P.19,
P.22, P.27, P.29, Lag.Negra), la mayoría mesotróficos y con Kd mayor a 2 m-1. Estas
diferencias en las abundancias coinciden con observaciones de otros autores para
diferentes lagos. Por ejemplo, Burns & Stockner (1991) reportaron densidades de
picoeucariotas de aproximadamente un orden de magnitud menor que el de las de
cianobacterias en seis lagos de Nueva Zelanda de variado estado trófico. Sarmento et
al. (2008) estudiaron un lago oligotrófico del este de África y encontraron que las
densidades de picoeucariotas fueron siempre de un orden de magnitud menor que las
de las picocianobacterias, y más comúnmente 2 órdenes de magnitud menor. Para
lagos norandino-patagónicos Zunino & Diaz (2000) también reportaron que las
picocianobacterias fueron numéricamente más abundantes (hasta 2 órdenes de
magnitud) que las picoeucariotas.
Las correlaciones entre los recuentos obtenidos por epifluorescencia y citometría de
flujo para las bacterias totales y para el picoplancton fotosintético fueron en general
altas (r = 0,904 y r = 0,867 respectivamente) y significativas (P<0,0001), sugiriendo
estimaciones confiables en las abundancias obtenidas por las dos técnicas para los
distintos grupos. No obstante, las abundancias obtenidas por citometría de flujo fueron
en general levemente inferiores a los recuentos totales obtenidos mediante
epifluorescencia. Como muchas técnicas, la citometría de flujo presenta límites de
detección, o sea que para poder detectar una población esta tiene que presentar una
CAPÍTULO IV
177
abundancia mínima, y por lo general se puede definir una población cuando se cuenta
con por lo menos 30 células (Gasol com. pers.). Teniendo en cuenta que la velocidad
de flujo a la que fueron corridas las bacterias fue de 12 µl min-1 (muestras corridas
generalmente durante 2 minutos), se requieren por lo menos 1250 células min-1 y para
el picoplancton fotosintético corrido a 50 µl min-1 (muestras corridas durante 5
minutos), se requieren por lo menos 120 células ml-1 para detectar una población. La
menor correlación observada para el picofitolancton (r = 0,867) puede deberse a que
este grupo se encuentra por lo general en menor abundancia que por ejemplo las
bacterias en los cuerpos de agua y por lo tanto podrían verse subestimadas por el
límite de detección de la técnica citometría de flujo. Además, se observaron algunas
diferencias particulares entre las dos técnicas que podrían atribuirse a lo anteriormente
expuesto; por ejemplo, en la Laguna San Luis se encontró por citometría una
población de picocianobacterias rica en ficoeritrina y ninguna picoeucariota ni
picocianobacteria rica en ficocianina, mientras que éstas sí fueron observadas
mediante la técnica de epifluorescencia. En la Laguna de Los Cisnes se encontró por
citometría solamente una población de picoeucariotas, mientras que por
epifluorescencia no sólo fueron observadas picoeucariotas, sino también
picocianobacterias (mayoritariamente ricas en ficocianina). La abundancia de
picocianobacterias estimada a través de la técnica de epifluorescencia se correlacionó
con varias variables relacionadas con el trofismo (e.g. oxígeno disuelto, pH, fosfato, Kd,
COD). Sin embargo, se observaron ciertas diferencias en estas correlaciones con las
abundancias obtenidas por citometría de flujo, lo que puede deberse a que con
citometría las abundancias de picocianobacterias registradas fueron en la mayoría de
los casos menores que con epifluorescencia. A pesar de estas diferencias, la
citometría de flujo aporta más información en cuanto a la estructura celular interna y al
número de poblaciones de cada componente picoplanctónico, aumentando el nivel de
resolución y reduciendo significativamente el tiempo empleado en hacer las
determinaciones comparado con la microscopía de epifluorescencia (Gasol & del
Giorgio 2000).
RESUMEN Y CONCLUSIONES
GENERALES
RESUMEN Y CONCLUSIONES GENERALES
178
Este trabajo de tesis doctoral constituye la primera caracterización de los patrones de
las comunidades picoplanctónicas autotróficas y heterotróficas de un conjunto de lagos
ubicados en un gradiente latitudinal desde Patagonia Austral Argentina hasta la
Península Antártica. Los resultados obtenidos constituyen un importante aporte ya que
permiten avanzar en el entendimiento de la estructura de los componentes
microbianos en estos ambientes únicos y permiten comprender los patrones a lo largo
de escalas espaciales extensas (>2100 km y 19 grados de latitud). El enfoque
polifacético empleado, mediante la combinación de un conjunto de métodos
complementarios (microscopía de epifluorescencia, citometría de flujo, técnicas
moleculares PCR-dependientes y técnicas moleculares PCR-independientes) permitió
abordar los distintos aspectos de la comunidad (abundancia, poblaciones dominantes
y genotipos más representativos) y una mejor comprensión de los resultados
obtenidos y de los patrones y tendencias observadas. En la Figura A se presenta un
esquema final conceptual que resume los principales resultados y conclusiones de
este trabajo de tesis.
Principales conclusiones
• Los factores que resultaron más importantes en el modelado de la estructura de las
comunidades picoplanctónicas dependieron de la escala espacial bajo estudio. A
escalas menores (<200 km para Antártida y <1000 km para Patagonia Austral), se
observó principalmente la influencia de los factores ambientales locales relacionados
con el estado trófico y con las variables morfométricas de los cuerpos de agua. En
cambio, cuando se consideraron todos los cuerpos de agua del gradiente patagónico-
antártico y se aumentó la escala espacial bajo estudio (>2100 km), el efecto de los
factores geográficos o espaciales (particularmente la latitud) resultó más evidente.
• En particular, la composición de las comunidades del picoplancton a lo largo del
gradiente latitudinal estuvo controlada por una combinación de factores ambientales
locales (e.g. área del cuerpo de agua, conductividad, COD) y geográficos o espaciales
(principalmente latitud, además de la longitud). Por otro lado, la abundancia de los
distintos componentes picoplanctónicos estuvo modelada por factores físico-químicos
relacionados con el estado trófico de los cuerpos de agua (e.g. COD, fostato, pH,
clorofila a, Kd, temperatura), así como también por factores geográficos (latitud,
longitud, altitud).
RESUMEN Y CONCLUSIONES GENERALES
179
• Las investigaciones realizadas evidenciaron un cambio en la composición del
picoplancton y una disminución en la abundancia y en el número de OTUs dominantes
del picoplancton al aumentar la latitud y las condiciones ambientales extremas (e.g.
bajas temperaturas).
• Al comparar los tres sitios antárticos estudiados, todos ellos ubicados en la Región
Antártida Marítima, las variables relacionadas con el estado trófico de los cuerpos de
agua tuvieron un peso muy importante en la estructura de las comunidades
picoplanctónicas. Por el contrario, la distancia geográfica entre estos tres sitios ejerció
una influencia mucho menor. Estos resultados probablemente serían diferentes si se
compararan lagos ubicados en una escala espacial más grande dentro del continente
antártico, lo que debería analizarse en futuros estudios biogeográficos.
• Los cuerpos de agua patagónicos ubicados en la “Región Andino-Patagónica” y en la
“Región de la Meseta Patagónica” se diferenciaron en las características físico-
químicas y morfométricas, presentando además algunas diferencias en la composición
del picoplancton.
• La influencia del estado trófico se manifestó principalmente en diferencias en la
composición del picoplancton entre lagos con características tróficas contrastantes, y
por otro lado, en un aumento de su abundancia al incrementarse el estado trófico de
los cuerpos de agua. El picoplancton autotrófico de los cuerpos de agua más
eutróficos y/o más turbios se caracterizó por un predominio de picocianobacterias ricas
en ficocianina. Por el contrario, los lagos más transparentes y oligotróficos revelaron
una preponderancia de picocianobacterias ricas en ficoeritrina. Las algas
picoeucariotas fueron abundantes en algunos lagos eutróficos y turbios.
• Los resultados anteriormente mencionados revelan que tanto los factores ambientales
locales como los factores geográficos controlan la estructura de las comunidades
picoplanctónicas, sugiriendo una distribución no aleatoria del picoplancton y aportando
nuevas evidencias que apoyan la hipótesis de la existencia de patrones biogeográficos
en la ecología microbiana.
• Se observaron ciertas variaciones temporales (intermensuales e interanuales) en la
composición y abundancia de las comunidades picoplanctónicas de los cuerpos de
agua antárticos. A pesar de los cambios temporales en la estructura del picoplancton
RESUMEN Y CONCLUSIONES GENERALES
180
que pueden exhibir los cuerpos de agua, en un estudio biogeográfico a macroescala
(como el de esta tesis), cuando se elimina la estacionalidad como variable, las
diferencias geográficas se hacen evidentes, dado que los patrones observados en
relación a la latitud fueron muy notorios.
• La utilización de técnicas complementarias (enfoque polifacético) es esencial para
poder estudiar profundamente las comunidades de microorganismos ya que todas las
técnicas existentes hasta el momento poseen sesgos.
• Los análisis moleculares mostraron que al aumentar la distancia geográfica disminuyó
significativamente la similitud en la composición del picoplancton. Aunque un alto
porcentaje de bandas fue compartido entre Patagonia y Antártida (entre el 60% y el
70% de las OTUs) y que también presentaron varias secuencias en común, la
composición de las comunidades picoplanctónicas fue significativamente diferente
entre estas dos zonas.
• Al considerar todos los cuerpos de agua del gradiente latitudinal, el 57% de las
secuencias correspondientes a procariotas y el 26% de las secuencias
correspondientes a eucariotas fueron similares (>97% similitud) a otras secuencias y
clones depositados en el banco de genes (GenBank) aisladas de ambientes fríos de
otras partes del mundo, remarcando el efecto que tiene el ambiente en seleccionar los
microorganismos que en él se desarrollan, y sugiriendo la existencia de secuencias
conservadas entre estos microorganismos según el ambiente donde viven y
prosperan.
• A lo largo del gradiente latitudinal se obtuvieron secuencias cosmopolitas (>97% de
similitud con otras secuencias y clones del banco de genes) y otras aparentemente
endémicas (<94 % de similitud con otras secuencias y clones ya existentes en el
banco de genes). Con respecto a este último punto, es preciso aclarar que una
especie que sólo se registra en un lugar puede habitar en otra parte del mundo por
debajo del umbral de detección de las técnicas con las que contamos en el presente o
puede habitar un lugar que no ha sido muestreado aún, por lo que no ha sido
encontrada todavía.
RESUMEN Y CONCLUSIONES GENERALES
181
Figura A. Esquema conceptual que resume los principales resultados y conclusiones de esta tesis.
RESUMEN Y CONCLUSIONES GENERALES
182
Perspectivas
La biodiversidad total de un ecosistema está compuesta por dos elementos. En primer
lugar por un conjunto de taxones abundantes que son los responsables del
funcionamiento de los ecosistemas (taxones "núcleo o esenciales"), los que crecen
activamente y sufren intensas pérdidas ocasionadas por la predación y la infección por
virus. Estos taxones son obtenidos con la mayoría de las técnicas moleculares
existentes y son difíciles de cultivar. En segundo lugar, por un conjunto de taxones
raros que forman parte del "banco de semillas" que en general no están en crecimiento
o crecen muy lentamente, y sufren pocas pérdidas por predación o por infecciones
virales. Gran parte de estos taxones permanecen por debajo de los umbrales de
detección de las técnicas moleculares existentes. Como consecuencia de las bajas
tasas de pérdida que experimentan se espera una lista extensa de taxones raros en
los ensambles microbianos (Pedrós-Alió 2006). No obstante, cualquier taxón puede
pasar de ser un taxón raro a ser un taxón núcleo, o viceversa en pocos días o
semanas si las condiciones llegan a ser adecuadas para el crecimiento de ese
organismo en particular. Si realmente los microorganismos pudiesen dispersarse
fácilmente por todos lados ("everything is everywhere, but the environment selects",
Baas-Becking 1934) la lista extensa que forma parte del "banco de semillas" de
cualquier ecosistema debería incluir todos los microorganismos sobre la Tierra. En
efecto, la biodiversidad de un ecosistema en particular debería ser idéntica a la
biodiversidad de cualquier otro ecosistema sobre la tierra al incluir esta lista extensa
de taxones raros (Pedrós-Alió 2006). Por lo expuesto previamente y por las
limitaciones inherentes a las técnicas moleculares empleadas, sería recomendable
profundizar el estudio de la biodiversidad de estas comunidades en lagos de la
Patagonia Austral y Antártida mediante la nueva técnica molecular pirosecuenciación
(Sogin et al. 2006), que en teoría permite obtener no sólo los taxones dominantes sino
también aquellos menos abundantes que forman parte de los taxones raros del "banco
de semillas". Esta técnica se basa en un paso inicial de PCR seguido de muchas
secuenciaciones paralelas con adaptadores ("parallel tag sequencing strategy").
Por otro lado, mediante las técnicas CARD-FISH y DGGE se encontró que en los
cuerpos de agua antárticos y patagónicos, las Alfaproteobacterias estaban muy bien
representadas. En distintos cuerpos de agua dulce de Europa se encontró una alta
dominancia de un grupo hermano de las Alfaproteobacterias marinas SAR11, el linaje
LD12 (Salcher et al. 2011). Estos dos grupos juntos (SAR11 y LD12) forman uno de
los linajes monofiléticos de ultramicrobacterias (~0,017 µm3) raros que han logrado
RESUMEN Y CONCLUSIONES GENERALES
183
atravesar la barrera entre ambientes marinos y de agua dulce. Asimismo, se observó
que la sonda disponible para detectar Alfaproteobacterias (ALF968, Amann & Fuchs
2008) presentó algunos “mismatches” con varios genotipos del cluster LD12. Por esta
razón sería interesante llevar a cabo la técnica CARD-FISH con la sonda LD12 en los
lagos de la transecta para comprobar si las Alfaproteobacterias encontradas mediante
CARD-FISH y DGGE en los cuerpos de agua de Patagonia y Antártida corresponden o
no a este nuevo linaje de agua dulce de las Alfaproteobacterias.
Además, también sería interesante efectuar una caracterización filogenética detallada
con las secuencias del picoplancton obtenidas mediante DGGE y bibliotecas
genéticas. Este punto está pensado para una próxima etapa, en la que se tiene
planeado efectuar árboles filogenéticos con las secuencias obtenidas.
Dado que este trabajo de tesis permitió realizar la primera caracterización de las
comunidades picoplanctónicas en muchos de los cuerpos de agua patagónicos y
antárticos que no habían sido previamente estudiados, es posible definir una línea de
base preliminar sobre la diversidad y composición del picoplancton para las futuras
evaluaciones sobre los efectos de la perturbación humana y cambio climático en estos
ecosistemas únicos. Con el objetivo de analizar estas perturbaciones y evaluar
posibles cambios temporales, en un futuro cercano se planea intensificar los
muestreos de estas comunidades en algunas de las zonas ya estudiadas.
ANEXOS
ANEXOS
184
ANEXO I
Detalle del protocolo de la técnica de electrofores is en gel de gradiente desnaturalizante
(DGGE) para bacterias y eucariotas (Protocolo adaptado de “Molecular marine microbiology
protocols”, Massana & Balagué 2007)
Filtración de las muestras
• Filtrar las muestras de manera secuencial: Previamente por una red de 50 µm de
tamaño de poro (lavada con agua MiliQ). Posteriormente filtrar el agua recolectada a
través de membranas de policarbonato (47 mm de diámetro, Millipore): primero a
través de filtros de 20 µm de tamaño de poro, el eluído recolectado se debe filtrar a
través de filtros de 3 µm de poro y finalmente el eluído recolectado a través de filtros de
0,2 µm de poro.
• Ubicar los filtros dentro de crioviales estériles y agregarles 1,8 ml de lysis buffer (40
mM EDTA, 50mM Tris-HCl, 0,75 M sacarosa).
• Almacenar los crioviales con los filtros en freezer a -80°C.
Extracción de ADN ambiental
Realizar la extracción con fenol-cloroformo-isoamil alcohol (25:24:1).
Corroborar la integridad del ADN extraído mediante una electroforesis (120V) en gel de
agarosa al 0,8% (0,4 gramos de agarosa en 50 ml de 0,5X TBE buffer), teñir el gel con SYBR
SAFE (concentración final 0,5X; Invitrogen) y cuantificar por comparación con un marcador
estándar de corrida (1Kb DNA Ladder para fragmentos desde 500 pb hasta 12 Kb, Invitrogen).
Amplificación y cuantificación del ADN ambiental
• Realizar PCRs (Polymerase Chain Reaction) de 50 µl con todas las muestras a
comparar.
• Analizar los productos de PCR mediante una electroforesis (120V) en gel de agarosa al
1% (0,5 gramos de agarosa en 50 ml de 0,5X TBE buffer), teñir el gel con SYBR SAFE
(concentración final 0,5X; Invitrogen) y cuantificar por comparación con un marcador
estándar de corrida de bajo peso molecular (Low DNA Mass Ladder para fragmentos
de 100-200-400-800-1200-2000 pb; Invitrogen) mediante el programa Quantity One
Software (Bio-Rad).
ANEXOS
185
Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)
• Correr las muestras con un equipo DGGE-2000 (CBS Scientific Company) o D-Code
(Bio-Rad).
• Preparar un gel de poliacrilamida al 6% con un gradiente lineal de condiciones
desnaturalizantes (100% de agente desnaturalizante con urea 7M y formamida
deionizada 40%)
-Gradiente para primers bacterianos: 40 y 80%
-Gradiente para primers eucariotas (muestras de agua dulce): 35 y 55%
-Gradiente para primers eucariotas (muestras marinas): 45 y 65%
-Gradiente para primers de arqueas: 20 y 50%
Preparar los siguientes reactivos:
-Formamida deionizada: preparar alícuotas de 32 ml en tubos falcon de 50 ml y guardar a
una temperatura de -20 C°.
-ASP 10% (0,1 g ml-1). Mezclar 100 mg de ASP en 1 ml de agua MiliQ. Preparar alícuotas
de 150 µl y guardar en freezer a -20 C° (se utiliza una alícuota para 1 gel de DGGE).
-Solución stock de acrilamida al 6% (mantener a 4°C hasta máximo 1 mes):
0% desnaturalizante: 20 ml de acrilamida (30% acrilamida/bisacrilamida; 37,5/1) (Bio-Rad)
5 ml TAE 20X
75 ml de agua MiliQ
Filtrar a través de filtros GF/F
80% desnaturalizante: 20 ml acrilamida (30% acrilamida/bisacrilamida; 37,5/1)
5 ml TAE 20X
33,6 g Urea (Sigma Ultra)
32 ml de formamida deionizada
Agregar lentamente agua hasta 100 ml y en simultáneo agitar (con
agitador magnético y buzo).
Filtrar a través de filtros GF/F
Secar (se suelen almacenar las placas de vidrios dentro de un recipiente con agua MiliQ),
esterilizar (con etanol 70%) y ensamblar las placas de vidrio del equipo de DGGE para
formar el cassette que contendrá el gel de poliacrilamida.
Preparar las siguientes soluciones:
Para productos de PCR bacterianos soluciones 80, 40 y 0% desnaturalizantes
Para productos de PCR de eucariotas (agua dulce) soluciones 55, 35 y 0%
(Preparar en tubos falcon de 15 ml ubicados sobre hielo molido y bajo campana)
ANEXOS
186
80% 65% 55% 45% 40% 35% 0%
80%
desnaturalizante 8,75 ml 7,1 ml 6 ml 4,95 ml 4,4 ml 3,8 ml 0 ml
0% desnaturalizante 0 ml 1,7 ml 2,8 ml 3,85 ml 4,4 ml 5 ml 5 ml
TEMED 8 µl 8 µl 8 µl 8 µl 8 µl 8 µl 5 µl
*APS 10% 45 µl 45 µl 45 µl 45 µl 45 µl 45 µl 40 µl
*Agregar justo antes de volcar la solución dentro de las cámaras del generador de gradiente
porque induce la polimerización del gel de poliacrilamida.
Cantidades para el sistema CBS system (22 ml, espesor del gel 0,75 mm)
Agregar 80 µl de colorante GLB 5X en la solución más concentrada (i.e. 80% y 55%)
Cargar la solución más concentrada (80% o 55%) en la cámara de salida (la de la derecha)
del generador de gradiente, agregar una barra magnética (buzo) en esta cámara y cargar la
cámara izquierda con la solución 40% o 35%. Abrir la conexión entre las dos cámaras,
remover las potenciales burbujas de aire que pudieran formarse apretando la cámara
izquierda con el dedo. Abrir la llave principal que une las cámaras con el cassette,
encender tanto el mezclador como la bomba peristáltica (mantener a una tasa de 4 ml
min-1). Al finalizar enjuagar las dos cámaras con agua MiliQ y desechar el agua de
enjuague (se puede aumentar la velocidad en este paso).
Agregar con micropipeta la solución 0% en la parte superior del cassette y agregar el peine
cuidadosamente en el cassette evitando la formación de burbujas.
Dejar polimerizar el gel durante por lo menos 1 hora.
• Sembrar aproximadamente 800 ng de producto de PCR proveniente de cada una de
las muestras con una jeringa Hamilton (previamente mezclar el producto de PCR con
10% de GLB 5X o utilizar el producto de PCR directamente si se empleó green buffer
en la PCR)
• Correr el gel a 100V y 60°C durante 16 h (960 min) en buffer TAE 1X
(aproximadamente 20 litros)
(Para DGGE de Arqueas se corre a 200V durante 3,5 h)
• Tinción del gel
Separar las dos placas y dejar el gel en una de ellas. Hacer una pequeña marca para
recordar el orden en que fueron sembradas las muestras. Agregar 20 ml de la solución de
teñido (20 ml de TAE 1X + 3 µl de SYBR Gold-Molecular Probes) sobre el gel con una
jeringa. Dejar teñir durante 45 min en oscuridad. Posteriormente enjuagar el gel con
aproximadamente 600 ml de buffer TAE 1X. Remover el gel de la placa de vidrio y
transferirlo a una cuchara/placa transparente especial para ver en UV (UV gel scoop,
Sigma).
ANEXOS
187
• Visualizar el gel con un transiluminador en UV con el programa Quantity One-
Chemidoc (Bio-Rad).
• Realizar el análisis cuantitativo de los geles de DGGE utilizando el programa Quantity
One (Bio-Rad) o GelPro analyzer.
ANEXO II
Detalle del protocolo de Deposición Catalizada e Hi bridación in situ con Sondas
Fluorescentes (CARD-FISH) para bacterias y arqueas planctónicas (Protocolo adaptado de
“Molecular marine microbiology protocols”, Massana & Balagué 2007)
Fijación y filtración de las muestras
• Fijar las muestras con glutaraldehído filtrado (concentración final 2%) y mantener a 4°C
por no más de 24 h.
• Antes de las 24 h, filtrar (5 mm Hg) una alícuota de las muestras utilizando filtros
blancos de policarbonato de 0,2 µm de poro.
• Lavar los filtros dos veces con agua MiliQ (5-10 ml).
• Almacenar los filtros en freezer a -80°C.
Adhesión de las células a los filtros
• Preparar agarosa 0,1% (0,05 g de agarosa de bajo punto de gelificación en 50 ml de
agua MiliQ).
• Calentar la agarosa en un microondas hasta su ebullición.
• Depositar la agarosa en platitos de petri y dejar enfriar hasta aproximadamente 35-
40°C.
• Sumergir los filtros de ambos lados dentro de la agarosa y ubicarlos con la cara
brillante hacia arriba sobre parafilm en placas de vidrio.
• Secar los filtros en un horno de hibridación durante 10-30 minutos a 37°C.
• Una vez secos, pipetear agua MiliQ sobre los bordes de los filtros para despegarlos y
apoyarlos sobre papel absorbente con la cara brillante hacia arriba hasta que se
sequen.
Permeabilización con lisozima y achromopeptidasa
• Preparar 10 ml de solución de lisozima fresca:
ANEXOS
188
1 ml de EDTA 0,5 M
1 ml de Tris-HCl 1M, pH 8
8 ml de agua MiliQ
100 mg de lisozima
• Incubar los filtros en la solución de lisozima durante 60 minutos a 37°C.
• Preparar 10 ml de solución de acrhomopeptidasa:
20 µl achromopeptidasa (30000 U/ml)
10 ml de achromopeptidasa buffer (el buffer contiene 100 µl NaCl 5M, 500 µl Tris-HCl 1M,
50 ml agua MiliQ, ajustar el pH a 8, conservar a 4°C)
• Incubar los filtros en la solución de achromopeptidasa durante 30 minutos a 37°C.
• Lavar los filtros con agua MiliQ en cajas de petri pequeñas.
• Dejar secar los filtros sobre papel absorbente.
(Después de la permeabilización los filtros pueden ser almacenados a -20°C por varias
semanas)
Preparar el buffer de hibridación (BH)
• Pipetear en un tubo de 50 ml:
3,6 ml NaCl 5M
0,4 ml Tris-HCl 1M
Agregar agua MiliQ y formamida deionizada dependiendo de la sonda utilizada (Tabla BH,
ver Lista de sondas al final del protocolo)
2 ml de blocking reagent
20 µl SDS (10%)
Agregar 2 g de dextran sulfate. Calentar hasta 40-60°C y agitar hasta que el dextran sulfate
se haya disuelto completamente.
(El BH puede ser conservado en alícuotas de 900 µl en tubos eppendorf durante varios meses
a -20°C).
Tabla BH.
% Formamida Formamida (ml) Agua MiliQ (ml)
20% 4 10
45% 9 5
50% 10 4
55% 11 3
60% 12 2
ANEXOS
189
Hibridación
• Cortar los filtros en secciones iguales y se rotularlos con lápiz negro en el borde.
• Mezclar el BH y la sonda con la HRP [50 ng µl-1] a (300:1 o 100:1 dependiendo de la
sonda) en un eppendorf (generalmente 900 µl de BH: 3 µl de sonda). Poner las
secciones de los filtros dentro de los tubos eppendorf (entre 10 y 12 secciones por
tubo).
• Dejar hibridar en estufa a 35°C toda la noche.
(No utilizar vortex en este paso porque la enzima HRP es muy sensible y puede despegarse de
la sonda).
Preparar el buffer de lavado (BL)
• Pipetear en un tubo de 50 ml:
45 ml de agua MiliQ precalentada a 37°C
0,5 ml EDTA 0,5M
1ml Tris-HCl 1M, pH8
Un volumen de NaCl dependiendo del % de formamida (Tabla BL)
Enrasar hasta 50 ml con agua MiliQ
50 µl SDS (10%)
• Calentar la mezcla anterior hasta 37°C.
(Es muy importante realizar el lavado post hibridación dos grados centígrados por encima de la
temperatura de hibridación).
Tabla BL.
% Formamida en el BH NaCl 5M (µl en 50 ml de BL)
20% 1350
45% 160
50% 90
55% 30
60% 0
Lavado
• Lavar las secciones de los filtros durante 15 minutos en 50 ml de BL precalentado a
37°C.
ANEXOS
190
• Remover las secciones de los filtros del BL y colocarlos en cajas de petri con PBS (1X)
durante 15 minutos a temperatura ambiente.
(Después del lavado no se deben dejar secar las secciones de los filtros porque esto reducirá la
actividad de la enzima HRP).
Deposición catalizada (amplificación)
• Preparar el buffer de amplificación (BA) en un tubo de 50 ml:
2 ml PBS (20X)
0,4 ml blocking reagent
16 ml NaCl (5M)
Enrasar hasta 40 ml con agua MiliQ
Agregar 4 g de dextran sulfate. Calentar (40 a 60°C) y mezclar hasta que el dextran sulfate
se haya disuelto completamente.
(El BA puede ser almacenado en alícuotas de 1 ml a 4°C por varias semanas).
• Preparar stock de H2O2 fresco:
200 µl PBS (1X)
1 µl H2O2 (30%)
Mezclar con vortex
• Preparar tiramida marcada Alexa 448:
Resuspender o reconstituir la tiramida con 20 µl de N-N dimetil formamida conteniendo
IPBA (20 mg de IPBA (ácido p-iodofenilborónico) + 1 ml de N-N diemetil formamida).
• Mezclar en un tubo eppendorf 1 ml de BA + 10 µl del stock de H2O2 fresco + 4 µl de
tiramida marcada Alexa 448.
• Colocar las secciones de los filtros en la mezcla anterior e incubarlos durante 15
minutos en oscuridad a 46°C.
• Remover los filtros de la solución y quitar el exceso de líquido sobre un papel
absorbente. Lavar los filtros en PBS (1X) en una caja de petri a temperatura ambiente
en oscuridad durante 10 minutos.
• Lavar los filtros con abundante agua MiliQ en un colador de porcelana durante
aproximadamente 5 minutos. Posteriormente dejar los filtros en cajas de petri con agua
MiliQ durante 5 minutos a oscuridad.
• Colocar los filtros sobre papel absorbente y dejarlos secar en oscuridad.
• Montar los filtros entre porta y cubreobjetos utilizando Vectashield (con DAPI) y guardar
los preparados a -20°C.
ANEXOS
191
Lista de sondas
Sonda ( fuente ) Secuencia (5´ 3´) % Formamida Volumen sonda (µl) Organismo blanco
Eury806 (Teira et al. 2004) CACAGCGTTTACACCTAG 20 3 Euryarchaea
Cren554 (Massana et al. 1997) TTAGGCCCAATAATCMTCCT 20 3 Crenarchaea
Eub338 (Amann et al. 1990) GCTGCCTCCCGTAGGAGT 55 9 Mayoría de bacterias
Eub338(II) (Daims et al. 1999) GCAGCCACCCGTAGGTGT 55 3 Plantomycetes
Eub338(III) (Daims et al. 1999) GCTGCCACCCGTAGGTGT 55 3 Verrucomicrobia
Alf968 (Neef 1997) GGTAAGGTTCTGCGCGTT 45 9 Alfaproteobacteria
Gam42a (Manz et al. 1992) GCCTTCCCACATCGTTT 55 3 Gammaproteobacteria
Bet42a (Manz et al. 1992) GCCTTCCCACTTCGTTT 55 3 Betaproteobacteria
CF319a (Manz et al. 1996) TGGTCCGTGTCTCAGTAC 55 3 Bacteroidetes
HGC69a (Amann et al. 1995) TATAGTTACCACCGCCGT 30 3 Actinobacteria
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