Analisis Komponen Kimia dan Uji KLT Bioautografi Fungi

Endofit dari Daun Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa

(Scheff) Boerl)

OLEH Burhanuddin Taebe Andi Reski Amalia

Sartini

Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) masuk dalam suku Thymelaeaceae merupakan tanaman tropis dan banyak digunakan sebagai bahan baku obat tradisional.

Daun dan kulit buah mengandung alkaloid,

steroid, flavonoid, saponin, dan polifenol.

Telah diisolasi lignan piroresinol, lariciresinol dan matairesinol dari beberapa bagian tanaman.

Pada buah mahkota dewa telah berhasil disolasi icarisida-C, falerin, dan magiferin serta asam galat.

Selain kandungan kimia juga terdapat mikroba yang hidup di dalam jaringan hidup tanaman dan dikenal sebagai mikroba endofit.

Fungi endofit adalah fungi yang

hidup berkolonisasi dalam jaringan

tanaman tanpa menyebabkan efek

negatif dalam tanaman tersebut.

•Dengan jamur endofit, secara

fermentasi dapat dihasilkan metabolit

yang berkhasiat obat secara

berkesinambungan (reproducible) dalam

skala industri, dengan keuntungan :

waktu relatif singkat, tidak merusak

tanaman inangnya dan tidak

menimbulkan kerusakan ekologi

TUJUAN PENELITIAN

Untuk mengetahui komponen antibakteri yang dihasilkan oleh fungi endofit dari daun

mahkota dewa

Penyiapan Alat dan Bahan Yang Digunakan

- Alat - alat

- Bahan-bahan daun mahkota dewa, media dan

bahan kimia

Penyiapan Sampel

- Pengambilan Sampel

Daun mahkota dewa diambil di TOGA SMAN 1

Makassar.

- Penyiapan Sampel

Bagian tanaman yang digunakan adalah daun

segar; cuci, potong kecil-kecil + 2 cm, sterilisasi

permukaan berturut-turut etanol 70%, Bayclin®

(NaOCl 5,25% ) , etanol 70% ,bilas dengan air

steril. Bagian tepi dari potongan tadi dibuang

kemudian tiap potongan dibelah menjadi 2 bagian

yang sama secara longitudinal. (39)

- Isolasi Fungi Endofit

Potongan sampel tanaman (steril) tempelkan

pada cawan Petri yang berisi media PDA + diberi

kloramfe-nikol 0,05 % secara aseptik. Inkubasi

suhu kamar selama 5 - 21 hari (tergantung tingkat

pertumbuhan kapang). Isolat diamati bentuk dan

warna koloni, selan-jutnya diamati di bawah

mikroskop. (39)

- Pemurnian Kapang Endofit

Koloni-koloni fungi yang tumbuh masing-masing

dipindahkan ke dalam cawan yang berisi media PDA

dan diinkubasi selama 3-5 hari. Pemurnian dilakukan

berulang-ulang hingga diperoleh koloni yang murni.

Setiap koloni murni dipindahkan ke media PDA agar

miring untuk disimpan sebagai stock culture.

- Produksi Metabolit Sekunder dari Fungi Endofit

Isolat fungi endofit difermentasi dalam 50 ml media

PD-Y (Potato Dextrose Broth 25 g/l, Yeast extract 2 g/l)

suhu kamar selama 7 hari. Koloni dan supernatan

dipisahkan, ambil supernatan (hasil fermentasi).

Ekstraksi 50 ml etil asetat menggunakan corong pisah

selama 1 menit, lapisan atas (etil asetat) dan lapisan

bawah (air) dilakukan sebanyak 3 kali. Lapisan etil

asetat diuapkan pada suhu kamar hingga diperoleh

ekstrak kering.

- Analisis Komponen Kimia KLT

Ekstrak uji ditotolkan pada lempeng silika gel GF

254 dan dielusi dengan eluen heksan : etil asetat

(1:2). Bercak diamati di bawah lampu UV 254 nm dan

366 nm. Profil diidentifikasi komponen kimianya dan

dilakukan uji aktivitas antibakterinya menggunakan

metode KLT Bioautografi.

- Identifikasi Komponen Kimia Alkaloid

Identifikasi alkaloid dengan menyemprotkan

pereaksi Dragendorf ((1) 0,6 gram bismutsubnitrat

dalam 2 ml HCl pekat dan 10 ml air (2) 6 gram KI

dalam 10 ml air. Larutan 1 dan 2 dicampur dengan

7 ml HCl pekat dan 15 ml air) pada profil KLT

ekstrak uji. Hasil positif jika bercak noda

menunjukkan warna coklat jingga dengan latar

belakang kuning.

- Identifikasi Flavonoid

a. FeCl3 5%

Hasil positif jika bercak noda warna hijau

kehitaman.

b. AlCl3 5%

Hasil positif jika bercak noda warna kuning.

c. Sitroborat

Hasil positif jika bercak noda warna kuning.

- Steroid

a. Lieberman-Buchard

Hasil positif jika bercak noda pada warna

ungu.

b. Vanilin-H2SO4

Hasil positif jika bercak noda warna merah

ungu.

c. H2SO4 10%

Hasil positif jika bercak noda warna merah

keunguan.

.

- KLT Bioautografi

a. Pembuatan Medium

- Medium Nutrien Agar (NA)

- Medium Muller Hilton Agar (MHA)

b. Peremajaan Bakteri Uji

c. Uji Aktivitas Antimikroba

d. Identifikasi Fungi Endofit

e. Pengumpulan dan Analisis Data

f. Penarikan Kesimpulan

.

Daun mahkota dewa Dicuci dengan air mengalir selama 10 menit

Bagian tanaman dipotong kecil-kecil ± 2 cm

Sterilisasi permukaan dengan Etanol 70% selama 1’, NaOCl selama 1,5’, Etanol 70%

selama 0,5’, bilas dengan air steril

Dikeringkan di atas kertas saring steril

Bagian tepi dibuang, tiap potongan dibelah 2 secara longitudinal

Potongan sampel Ditempelkan pada media PDA + Kloramfenikol 0,05%

Inkubasi 3-14 hari

Diamati koloni yang terbentuk

Dipindahkan pada media PDA yang baru

Inkubasi 3-5 hari

Koloni murni

Stock culture

Dipindahkan ke media PDA agar miring

Difermentasi dengan media PD-Y 50 ml pada suhu kamar selama 7 hari

Hasil fermentasi

Hasil fermentasi Ekstraksi dengan etil asetat 50 ml

Lapisan etil asetat Lapisan air Uapkan

Ekstrak uji Elusi dengan Heksan:Etil asetat (1:2)

Kromatogram

Uji KLT Bioautografi Uji Golongan

•Lempeng KLT di atas medium

•Inkubasi suhu 37oC 24 jam

•Pengamatan zona hambat

Pembahasan

KESIMPULAN

Skema Identifikasi Fungi

Sampel

Diidentifikasi

Diamati bentuk morfologi

selnya

Diamati bentuk

koloninya

Sampel diinokulasikan

dalam media PDA

Mikroskopik Makroskopik

Berdasarkan hasil diperoleh 2 isolat fungi yaitu isolat A dan B

Isolat Murni Fungi Endofit Daun Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) a. Isolat Fungi A b. Isolat fungi B

a b

No Pereaksi penampak noda Warna Nilai Rf (cm)

1 Dragendorrf - -

2 FeCl3 Hijau kehitaman 0,4

3 AlCl3 Kuning 0,4

4 Sitroborat Kuning 0,4

5 Lieberman-Buchard Ungu 0,1

6 Vanilin-H2SO4 Ungu 0,1

7 H2SO4 10% Ungu 0,1

No Bakteri uji Nilai Rf yang

menghambat (cm)

1 Staphylococcus aureus 0,1

0,4

2 Escherichia coli 0,1

0,4

1. Pada daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) diperoleh dua isolat fungi endofit.

2. Fungi endofit B menunjukkan adanya golongan flavonoid dan steroid sebagai metabolit sekunder yang dihasilkan.

3.Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh fungi endofit B menunjukkan adanya aktivitas antibakteri thd Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.

SARAN

Sebaiknya dilakukan optimalisasi media dan kondisi fermentasi untuk produksi metabolit sekunder dari isolat fungi B.

Sebaiknya dilakukan pembuktian lebih lanjut melalui studi elusidasi struktur dari hasil identifikasi komponen kimia yang diperoleh.

Gambar 2.Kromatogram dengan Eluen Heksan : Etil asetat (1:2) thd (1) ekstrak etil asetat daun mahkota dewa, (2) ekstrak etil asetat isolat fungi A dan (3) ekstrak etil asetat isolat fungi B

a. Dilihat pada lampu UV 254 nm

b. Dilihat pada lampu UV 366 nm

c. Setelah disemprot H2SO4 10%

c b a

a b c

Gambar 3. Kromatogram Ekstrak Etil asetat Isolat Fungi B dengan Menggunakan Eluen Heksan : Etil asetat (1:2) a. setelah disemprot H2SO4 10% b. setelah disemprot Lieberman-Buchard c. setelah disemprot Vanilin-H2SO4

Gambar 4. Kromatogram Ekstrak Etil asetat Isolat Fungi B dengan Menggunakan Eluen Heksan : Etil asetat (1:2)

a. Setelah disemprot FeCl3 5%

b. Setelah disemprot AlCl3 5%, dilihat di bawah sinar UV 366 nm

a b

Gambar 5. Foto KLT Bioautografi Ekstrak Etil asetat Isolat Fungi B terhadap pertumbuhan bakteri (a) Staphylococcus aureus, dan (b) Escherichia coli

Zona

hambat

Zona

hambat

a b

Gambar 6. Kromatogram Ekstrak Etil asetat Isolat Fungi B dengan Menggunakan Eluen etil asetat : metanol : asam asetat glasial (4:0,5:4)

a. Setelah disemprot AlCl3 5%, dilihat di bawah sinar UV 366 nm

b.Setelah disemprot Sitroborat, dilihat di bawah sinar UV 366 nm

a b

Gambar 7. Foto Hasil Identifikasi Isolat Fungi B

Gambar 8. Foto tanaman mahkota dewa

Gambar 9. Foto daun mahkota dewa

TERIMA KASIH

WASSALAMU’ALAIKUM

WR.WB.,