analisis metabolitos secundarios en argemone mexicana, bignonia unguis-cati, diospyros sinaloensis...
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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SINALOA ESCUELA DE BIOLOGIACENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL IPNANÁLISIS DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN Argemone mexicana, Bignonia unguis-cati, Diospyros sinaloensis y Maytenus phyllanthoides CON POSIBLE APLICACIÓN EN FARMACIA Y AGRICULTURATESISQUE PRESENTADALIA ELIZABETH ÁVILA GRAVEPARA OBTENER EL TITULO DELICENCIADO EN BIOLOGÍACULIACÁN, SINALOA, MÉXICO. JUNIO 2009“Análisis de metabolitos secundarios en Argemone mexicana, Bignonia ungTRANSCRIPT
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SINALOA
ESCUELA DE BIOLOGIA
CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOS
DEL IPN
ANÁLISIS DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN Argemone mexicana,
Bignonia unguis-cati, Diospyros sinaloensis y Maytenus phyllanthoides CON
POSIBLE APLICACIÓN EN FARMACIA Y AGRICULTURA
TESIS
QUE PRESENTA
DALIA ELIZABETH ÁVILA GRAVE
PARA OBTENER EL TITULO DE
LICENCIADO EN BIOLOGÍA
CULIACÁN, SINALOA, MÉXICO. JUNIO 2009
2
“Análisis de metabolitos secundarios en Argemone mexicana, Bignonia unguis-
cati, Diospyros sinaloensis y Maytenus phyllanthoides con posible aplicación en
farmacia y agricultura”
Tesis aprobada
Dr. Jorge Molina Torres M.C. Irma Romelia Sánchez Mendoza
Director de tesis externo Director de tesis interno
M.C. Enrique Ramírez Chávez M.C. Ana Cecilia Lerma Arrendondo
Asesor externo Asesor interno
Q.F.B. Daniel Montoya López
Revisor
3
Este trabajo fue realizado en el Departamento de Biotecnología de Plantas del
Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Irapuato, en el
Laboratorio de fitobioquímica bajo la dirección del Dr. Jorge Molina Torres y M.C.
Enrique Ramírez Chávez
4
DEDICATORIA
CON TODO CARIÑO PARA
MI ABUELITA VICTORIA GALLARDO
QUE EN PAZ DESCANSE.
DE SU NIETA QUE LA QUIERE Y NUNCA LA OLVIDARA
5
AGRADECIMIENTOS
A mis Padres, que me hicieron, que me alentaron y que sin su apoyo incondicional es evidente que no habría llegado hasta aquí. A mi hermana, por estar siempre presente. Al Dr. Jorge Molina Torres, por su agradable recibimiento en su laboratorio, constante motivación, protección, apoyo en la realización de este trabajo y el placer de haberle conocido. A la M.C. Irma Romelia Sánchez Mendoza, por apoyarme desde el primer momento, por su amistad y por la dirección de esta Tesis. Al M.C. Enrique Ramírez Chávez, por la ayuda en la realización de las actividades de obtención de ácidos grasos y alcaloides, por su apoyo y sus palabras de ánimo durante mi estancia en el Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN. A la M.C. Ana Cecilia Lerma Arrendo, por su constante apoyo, sus palabras de ánimo y por sus valiosos comentarios. Al Q.F.B Daniel Montoya López, por la revisión de esta tesis. A Alicia, por todos los buenos y malos momentos compartidos, por darme siempre una palabra de aliento y por estar allí para lo que sea. A Nallely, por su amistad, apoyo y confianza.
6
A Jovita y Yancy, por contagiarme su alegría a través de sus ocurrencias, gracias por su amistad. A Julio y Carolina, por todo el apoyo y cariño que me han brindado siempre, este también es un triunfo de ustedes. A Sarai, por su apoyo y amistad desde el primer momento que llegue al laboratorio. Gracias y hasta siempre. A mis compañeros de clases, quienes me acompañaron en esta trayectoria de aprendizaje y conocimiento. A la Escuela de Biología que me formo como profesionista, y a todos los profesores que de alguna manera contribuyeron en mi formación académica Gracias por que sin ustedes, no habría logrado uno de las metas de mi vida .......
7
CONTENIDO
Resumen 10
I.- Introducción 11
II.- Antecedentes
2.1 Argemone mexicana 14
2.1.1Usos 14
2.2 Bignonia unguis-cati 15
2.2.1 Usos 16
2.3 Diospyros sinaloensis 16
2.3.1 Usos 17
2.4 Maytenus phyllanthoides 17
2.4.1 Usos 18
2.5 Determinación de familias compuestos químicos 18
2.5.1 Quimiotaxonomía 18
2.5.2 Principios activos 19
2.5.3 Metabolitos secundarios 19
2.6 Características representativas de cada familia de compuestos 20
2.6.1 Triterpenos 20
2.6.2 Aceites esenciales 21
2.6.3 Esteroles 23
2.6.4 Carotenoides 24
2.6.5 Ácidos grasos 25
2. 6.5.1 Características generales 25
2. 6.5.2 Naturaleza química 25
2. 6.5.3 Acilglicéridos 27
2. 6.5.4 Fosfolípidos 27
8
2.6.5.5 Clasificación de ácidos grasos 28
2.6.6 Cumarinas 30
2.6.7 Taninos 30
2.6.8 Flavonoides 30
2.6.9 Mucílagos o gomas 31
2.6.10 Alcaloides 32
2. 6.10.1 Características generales 32
2. 6.10.2 Naturaleza química 34
2.6.10.3 Actividad farmacológica 35
III.- Justificación 36
IV.- Hipótesis 36
V.- Objetivos 37
5.1 Objetivo general 37
5.2 Objetivos específicos 37
VI.- Materiales y métodos
6.1 Materiales 38
6.1.1 Material biológico 38
6.1.2 Equipo 40
6.2 Determinación de alcaloides presentes en el extracto 41
6.2.1 Generalidades 41
6.2.2 Cromatografía de gases-espectrometría de masas de
los alcaloides presentes en el extracto 42
6.2.3 Cuantificación de alcaloides 43
6.3 Determinación de ácidos grasos 43
6.3.1 Generalidades 43
9
6.3.2 Método de esterificación-transmetilación in situ 44
6.4 Cromatografía de gases-espectrometría de masas para ácidos g 46
6.4.1 Cuantificación de ácidos grasos 47
VII. Resultados
7.1 Identificación y cuantificación de alcaloides 48
7.2 Identificación y cuantificación de ácido 62
VIII. Discusión de resultados 80
IX. Conclusiones 82
X. Glosario 83
XI. Bibliografía 86
10
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Argemone Mexicana 17
Figura 2. Bignonia unguis-cati 19
Figura 3. Diospyros sinaloensis 21
Figura 4. Maytenus phyllanthoides 22
Figura 5. Rotavapor Buchi 011 47
Figura 6. Cromatógrafo de gases acoplado a espectrometría de masas 48
Figura 7. Thermoblock de calentamiento 51
Figura 8. Recuperación de la fase orgánica para la obtención de ácidos grasos 52
Figura9. Viales con muestra para análisis en Cromatógrafo de gases 53
Figura 10. Perfil cromatográfico de alcaloides en Argemone mexicana, en seco usando
metanol como solvente. 56
Figura 11. Perfil cromatográfico de alcaloides en Argemone mexicana, en fresco usando
metanol como solvente. 57
Figura 12. Perfil cromatográfico de alcaloides en Argemone mexicana, en seco usando
Diclorometano como solvente. 58
Figura 13. Perfil cromatográfico de alcaloides en Argemone mexicana, en fresco usando
Diclorometano como solvente 59
Figura 14. Perfil cromatográfico de alcaloides en Bignonia unguis-cati, en fresco usando
Diclorometano como solvente 60
Figura 15. Perfil cromatográfico de alcaloides en Bignonia unguis-cati, en seco usando
Diclorometano como solvente 61
Figura 16. Perfil cromatográfico de alcaloides en Bignonia unguis-cati, en seco usando
Metanol como solvente 62
Figura 17. Perfil cromatográfico de alcaloides en Diospyros sinaloensis, en seco usando
Diclorometano como solvente. 63
11
Figura 18. Perfil cromatográfico de alcaloides en Diospyros sinaloensis, en fresco usando
Diclorometano como solvente. 64
Figura 19. Perfil cromatográfico de alcaloides en Diospyros sinaloensis, en fresco usando
Metanol como solvente 65
Figura 20. Perfil cromatográfico de alcaloides en Diospyros sinaloensis, en seco usando Metanol
como solvente 66
Figura 21. Perfil cromatográfico de alcaloides en Maytenus phyllanthoides, en fresco usando
Diclorometano como solvente 67
Figura 22. Perfil cromatográfico de alcaloides en Maytenus phyllanthoides, en fresco usando
Metanol como solvente 68
Figura 23. Perfil cromatográfico de alcaloides en Maytenus phyllanthoides, en seco usando
Metanol como solvente 69
Figura 24. Perfil cromatográfico de alcaloides en Maytenus phyllanthoides, en seco usando
Diclorometano como solvente 70
Figura 25. Cuantificación de Fagarina presente en Argemone mexicana, Bignonia unguis-cati
Diospyros sinaloensis y Maytenus phyllanthoides 71
Figura 26. Estructura molecular de ϒ- fagarina 72
Figura 27. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Argemone mexicana, (muestra 1) 75
Figura 28. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Argemone mexicana, (muestra 2) 76
Figura 29. Cuantificación de ácidos grasos en Argemone mexicana. 77
Figura 30. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Bignonia unguis-cati, (muestra 1) 78
Figura 31. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Bignonia unguis-cati, (muestra 2) 79
Figura 32. Cuantificación de ácidos grasos en Bignonia unguis cati 80
Figura 33. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Diospyros sinaloensis, (muestra 1) 81
Figura 34. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Diospyros sinaloensis, (muestra 2) 82
Figura 35. Cuantificación de ácidos grasos en Diospyros sinaloensis. 83
Figura 36. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Maytenus phyllanthoides, (muestra 1) 84
Figura 37. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Maytenus phyllanthoides, (muestra 2) 85
Figura 38. Cuantificación de ácidos grasos presentes en Maytenus phyllanthoides 86
12
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Extractos vegetales con capacidad inhibitoria de diferentes patógenos 44
Tabla 2. Presencia de fagarina en Argemone mexicana, bignonia unguis-cati,
Diospyros sinaloensis y Maytenus phyllanthoides 55
Tabla 3. Contenido de compuestos en Argemone mexicana (Metanol en seco) 56
Tabla 4. Contenido de compuestos en Argemone mexicana (Metanol en fresco) 57
Tabla 5. Contenido de compuestos en Argemone mexicana (Diclorometano en seco) 58
Tabla 6. Contenido de compuestos en Argemone mexicana (Diclorometano en fresco) 59
Tabla 7. Contenido de compuestos en Bignonia unguis-cati (Diclorometano en fresco) 60
Tabla 8. Contenido de compuestos en Bignonia unguis-cati (Diclorometano en seco) 61
Tabla 9. Contenido de compuestos en Bignonia unguis-cati (Metanol en seco) 62
Tabla 10. Contenido de compuestos en Diospyros sinaloensis (Metanol en seco) 63
Tabla 11. Contenido de compuestos en Diospyros sinaloensis (Diclorometano en fresco) 64
Tabla 12. Contenido de compuestos en Diospyros sinaloensis (Metanol en fresco) 65
Tabla 13. Contenido de compuestos en Diospyros sinaloensis (Metanol en seco) 66
Tabla 14. Contenido de compuestos en Maytenus phyllanthoides (Diclorometano en fresco) 67
Tabla 15. Contenido de compuestos en Maytenus phyllanthoides (Metanol en fresco) 68
Tabla 16. Contenido de compuestos en Maytenus phyllanthoides Metanol en seco) 69
Tabla 17. Contenido de compuestos en Maytenus phyllanthoides (Diclorometano en seco) 70
Tabla 18. Presencia/ausencia de ácidos grasos de Argemone mexicana, Bignonia
unguis-cati, Diospyros sinaloensis y Maytenus phyllanthoides 73
Tabla 19. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra1) 75
Tabla 20. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 2) 76
Tabla 21. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 1) 78
Tabla 22. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 2) 79
Tabla 23. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 1) 81
Tabla 24. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 2) 82
Tabla 25. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 1) 84
Tabla 26. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 2) 85
13
Resumen
El empleo de las plantas medicinales con fines curativos es una práctica
que se ha utilizado desde fechas prehistóricas. Durante mucho tiempo los
remedios naturales, sobre todo las plantas medicinales, fueron el principal recurso,
además de las sales minerales, de que disponían los responsables de la salud de
las comunidades. Esto hizo que se profundizara en el conocimiento de las
especies vegetales que poseen propiedades medicinales y se ampliara su
experiencia en el empleo de los productos que de las plantas se extraen. Sin
embargo, a pesar de que han aumentado las investigaciones y los estudios
científicos de las plantas medicinales, todavía no se conocen muchos de los
principios activos a los que deben estas sus cualidades.
Por lo que el objetivo de este trabajo exploratorio es identificar y cuantificar
metabolitos secundarios: alcaloides y ácidos grasos de muestras vegetales
utilizando técnicas de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas (CG-EM). Para esta exploración se utiliza como material vegetal las
especies Argemone mexicana, Bignonia unguis-cati, Diospyros sinaloensis y
Maytenus phyllanthoides.
El estudio permitió establecer la presencia y abundancia de los siguientes
ácidos grasos: ácido palmítico, linoleíco, linolénico, tridecílico, araquídico,
behénico, elaídico, esteárico, araquídico y valérico.
Al utilizar metanol y diclorometano como solventes de extracción, el estudio
permitió establecer la presencia, así como la abundancia de un alcaloide de tipo
furoquinolínico: ϒ-fagarina. La caracterización de este metabolito se hizo por
comparación de las características de los compuestos reportados en la base de
datos de National Institute of Standards and Technology (NIST, 2005. US
Department of Commerce) en las muestras analizadas mediante el uso de la
computadora acoplada al sistema CG-EM. Encontrándose en Argemone mexicana
utilizando ambos solventes y en Diospyros sinaloensis utilizando diclorometano.
14
I. Introducción
Las plantas han desempeñado un papel fundamental en la historia del
Hombre, quien las ha utilizado para satisfacer necesidades básicas como
alimento, medicina vivienda y vestido, incluso en actos rituales. El uso de las
plantas es una práctica que seguramente existe desde los inicios de la especie
humana (1).
Entre esta vasta diversidad, existen especies vegetales con propiedades
de interés para la investigación y el descubrimiento de nuevos productos. Sin
embargo, se calcula que menos del 10% de las plantas han sido evaluadas en la
búsqueda de actividad biológica (2). Se estima que en el mundo existen alrededor
de 310 000 especies de plantas, encontrándose en los bosques tropicales cerca
de 125 000 de ellas (3).
Este recurso natural en México ha sido y sigue siendo utilizado por los
habitantes de culturas indígenas para el tratamiento de diversas afecciones del
hombre e incluso de animales. El conocimiento del uso y de las propiedades
curativas de un cierto tipo de plantas ha sido transmitido de generación en
generación en forma empírica (4).
15
Como parte de su metabolismo, las plantas producen una diversidad de
compuestos orgánicos, de los cuales no parece tener participación directa en su
crecimiento y desarrollo. A estos componentes se les conoce como metabolitos
secundarios y sus propiedades químicas se han investigado desde mediados del
siglo XIX. El reconocimiento de las propiedades bioactivas de los metabolitos
secundarios ha conducido a la búsqueda de nuevos fármacos, antibióticos,
insecticidas y herbicidas (6).
Dichos metabolitos confieren características importantes a los extractos de
las plantas de donde se obtienen. Estas características pueden ser como
antivirales, antimicrobianos o repelentes, por lo que se utilizan para proteger los
cultivos e incrementar la calidad y su producción alimentaria, ya que pueden tener
la propiedad de ser más selectivos en su toxicidad y más fácilmente degradables
(5).
Los metabolitos secundarios que producen las plantas son constituyentes
bioquímicos y frecuentemente constituyentes farmacológicamente activos con
actividad terapéutica potencial. Esta actividad puede deberse a una sustancia
única o una mezcla de principios. Los constituyentes pueden ser alcaloides,
glucósidos, enzimas, etc. Algunas mezclas por tener uso terapéutico, son
importantes en la industria farmacéutica (7).
16
La investigación de plantas utilizadas por los curanderos, ha influenciado la
manera en que se realizan las formulaciones de las nuevas drogas, permitiendo la
recopilación del un amplio conocimiento de la variada gama de plantas utilizadas
surgiendo así los estudios fitoquímicos, para determinar estructura de los
principios activos de familias química conocidas, que podrán dar posteriores
formulaciones farmacológicas (4).
Las especies vegetales usadas en medicina popular requieren de un
estudio exhaustivo para conocer su composición química que justifique un
potencial uso farmacológico. Además, para el expendio de las hierbas medicinales
de igual modo que en los demás medicamentos, es necesario garantizar su
calidad, seguridad y eficacia. El estudio farmacognóstico y fisicoquímico aporta
información para el control de calidad del material vegetal (9).
El aislamiento y la determinación estructural de los metabolitos
responsables de las actividades farmacológicas es el paso primordial en la
investigación de esos remedios. Las técnicas de separación, en especial las
cromatográficas, permiten separar los componentes de una mezcla los cuales
puede utilizarse con fines analíticos cualitativos o cuantitativos (7).
17
II. Antecedentes
2.1 Argemone mexicana L.
Pertenece a la familia Papaveraceae, su nombre común es cardo santo.
Planta herbácea, de hojas divididas con los segmentos espinosos; flores blanco
amarillentas, muy semejantes a las amapolas, pero la cápsula es alargada,
dehiscente por la parte superior por donde se escapan las semillas, las cuales son
muy pequeñas, negruzcas y rugosas. Su tallo contiene un látex lechoso
amarillento. Las hojas y el tallo contienen pequeña cantidad de una sustancia
análoga a la morfina, esta sustancia se encuentra en mayor cantidad en las
cápsulas verdes (Figura 1).
Figura 1. Argemone mexicana L.
18
2.1.1 Usos
Se utiliza como hipnótico y calmante para combatir la tos. El aceite no es
recomendable como purgante, pero debido a sus propiedades secantes, podría
emplearse sobre la piel en vez de colodión. El látex se usa para quitar las
manchas de la córnea y las flores en infusión como narcótico. Algunos análisis
más recientes han revelado la presencia de dos alcaloides en la semilla, berberina
y protopina. El aceite es secante y produce efectos emotocatárticos debido al
parecer a un principio acre y volátil que fácilmente se altera con el tiempo (10).
2.2 Bignonia unguis-cati L.
Su nombre común es uña de gato, pertenece a la familia Bignoniaceae, es
una planta trepadora leñosa de hoja semipersistente, con una altura de 12 metros,
sus hojas son compuestas y opuestas de dos foliolos acabadas en un zarcillo
ramificado y ganchudo, con márgenes enteros. Sus raíces pueden llegar a ser
tuberosas o elongadas con la edad. Ramas con raíces adventicias aéreas. Hojas
con foliolos de ovados a lanceolados de 3 a 4 cm, de base aguda o truncada y
ápice agudo o cortamente acuminados, membranáceos, con pelos glandulares en
la nervadura del envés.
19
Inflorescencias con pocas flores largamente pedunculadas, pueden crecer
en grupos de 2 a 3, tienen un diámetro de 4 a 5 cm, con el cáliz membranáceo,
glabro, de 1 a 2 cm de largo, corola de color amarillo con bandas naranjas en la
garganta, de 5 a 8 cm de longitud. Flores vistosas en forma de trompeta, de 7 a 10
cm de largo, solitarias o en grupos de pocas flores. Fruto capsular dehiscente,
linear, de 25 a 50 cm de longitud (11) (Figura 2).
Figura .2. Bignonia unguis-cati
20
2.2.1 Usos
Bignonia unguis-cati se utiliza como antiabortivo, antídoto de picadura de
serpiente, antipirético y antiinflamatorio. Para el tratamiento de dolencias
intestinales, el paludismo y la oliguria (11).
2.3 Diospyros sinaloensis Blake
De la familia Ebenaceae, conocida como chapote. Son árboles o arbustos
erectos, en ocasiones con las ramas en forma de punta. Hojas alternadas,
raramente opuestas, simples y enteras; estipulas ausentes. Flores actinomórficas,
usualmente unisexuales, deciduas o polígamas, raramente bisexuales. Flores
masculinas con frecuencia en cimas, algunas veces en grupos o solitarias; pistilos
rudimentarios o ausentes. Flores femeninas de color blanco, frecuentemente
solitarias, axilares, imperfectas o sin estambres. Algunas veces estambres
hipogeos o en el inferior de la corola.
21
Yemas terminales ausentes. Corola campanulada o tubular, 3 a 5 lóbulos
deciduos. Cáliz de 6 a 7 lóbulos, persistentes y con frecuencia llegan a ampliarse
en flores femeninas o bisexuales; los lóbulos se encuentran lindados o
superpuestos en yemas (11) (Figura 3).
Figura 3. Diospyros sinaloensis
2.3.1 Usos
Se emplea como remedio domestico para la diarrea, disentería crónica y
hemorragia uterina. La corteza es astringente y muy amarga (11).
22
2.4 Maytenus phyllanthoides Benth.
Maytenus phyllanthoides Benth. O mangle dulce de la Familia Celastraceae,
es un gran arbusto o un árbol pequeño que crece de 2 a 4 m (6 a 12 pies) de alto
con hojas alternas, enteras o dentadas y pequeñas estipulas o deciduas, tiene la
corteza madura gris claro y tallos café rojizo. Las hojas ovovadas y cuerudas son
de 2 a 4 cm de largo. Inflorescencias racemosas, cimoso-paniculadas o
fasciculadas; flores principalmente en cinco partes, de blancas a verde
amarillentas o a veces rojizas, pétalos imbricados; ovario confluente con el disco
anular aplanado, 2 celdas con 1 o 2 óvulos por celda. Las escasas flores que
produce de abril a noviembre son aproximadamente de 1.5 cm. Fruto capsular
ovoide, 2 o 3 celdas, principalmente una semilla, de amarilla a anaranjada que se
encuentran envueltas en un carnoso arilo rojo brillante (11) (Figura 4).
Figura 4. Maytenus phyllanthoides
23
2.4.1 Usos
La madera es usada como combustible. Sus hojas se utilizan para el dolor
de muelas, así como en la sustitución de goma de mascar y como material
aislante. Muchos compuestos con actividad biológica han sido aislados de estas
plantas, como los alcaloides sesquiterpénicos piridínicos con actividad
antialimentaria e inmunosupresora, poliésteres sesquiterpénicos con actividad
promotora antitumoral y nortiterpeno metilénquinonas con actividad antimicrobiana
(11).
2.5 Determinación de familias de compuestos químicos
2.5.1 Quimiotaxonomía
Es la Ciencia que usa las características químicas, en particular de los
llamados metabolitos secundarios (alcaloides, triterpenos, etc.) de un conjunto de
organismos para determinar su posición en una clase jerarquizada evolutiva de los
seres vivos (14).
24
2.5.2 Principios activos
La importancia terapéutica de las plantas radica en la presencia de familias
de compuestos químicos que poseen propiedades farmacológicas variadas. La
lista de estas familias de compuestos es amplia y variada, por lo que en esta
oportunidad se presentan las familias de compuestos de mayor importancia, y que
son consideradas de interés para la industria farmacéutica, el orden de
presentación es por la forma en que los metabolitos son determinados en el
proceso de tamizaje (14).
2.5.3 Metabolitos secundarios.
Los metabolitos secundarios son sustancias frecuentemente responsables
del aroma, color, sabor y cualidades medicinales de las plantas. Inicialmente
fueron considerados compuestos de desecho de los procesos fisiológicos de la
planta, pero se ha ido comprobando que muchas de estas sustancias ayudan a la
planta en su proceso de adaptación a las condiciones ambientales adversas, en la
competencia con otras plantas, en protegerla del consumo por parte de los
herbívoros, en atraer a los polinizadores o en la dispersión y protección de frutos y
semillas.
25
Se supone que algunas de estas sustancias que sirven para proteger a la
planta pueden ser utilizadas en un sentido similar por el ser humano, algo que no
siempre sucede, dado que muchos metabolitos secundarios son tóxicos (4).
2.6. Características representativas de cada familia de compuestos
2.6.1 Triterpenos
Los triterpenos son productos naturales que se encuentran en las plantas,
están constituidas por unidades del isopreno, constituido por cinco carbonos. Los
triterpenos tienen 6 unidades isoprénicas por lo tanto contienen 30 átomos de
carbono. Estos compuestos existen en una variedad de tipos estructurales.
Frecuentemente constituyen los llamados aceites esenciales, que son compuestos
de varias substancias orgánicas volátiles o aromáticas, que pueden estar
constituidos por alcoholes, cetonas, ésteres, aldehídos, y que se producen y
almacenan en los canales secretores de las plantas. Se les extrae,
preferentemente, por arrastre de vapor o por solventes orgánicos.
Las plantas con aceites esenciales se ubican principalmente en las familias
Labiatae y las Umbelliferae. Sus propiedades curativas son variadas y
abundantes. Por lo general, poseen propiedades sedantes, antiespasmódicas y
desinfectantes. Dado que son compuestos volátiles, son eliminados por las vías
respiratorias y actúan como expectorantes.
26
Algunas plantas poseen aceites esenciales que aumentan la diuresis como
Calendula sp. y otras poseen efectos anti-histamínicos como la Manzanilla.
Éstos metabolitos son útiles en perfumería, farmacia y en la preparación de
determinados alimentos. Previenen las caries y actúan como agentes anti-
ulcerativos. Se unen al estrógeno e inhiben los procesos inflamatorios por
supresión de la actividad de ciertas enzimas (15).
2.6.2 Aceites esenciales
Son fracciones contenidos en ciertos aceites vegetales. Son llamados
"esenciales" ya que frecuentemente tienen un olor penetrante y característico que
frecuentemente se utilizan en perfumería.
Son aceites muy livianos, contenidos en diferentes partes de las así
llamadas plantas aromáticas, algunas de las cuales contienen la esencia
principalmente en sus semillas, como el anís, el eneldo, en las cáscaras de su
fruto como el limón y la naranja, en las hojas como la menta, el eucalipto y el té,
en la madera de la canela, el sándalo y el cedro, en las flores de jazmín, la
lavanda, en sus raíces como el vetiver, el jengibre, la angélica y otras finalmente
en su resina como el incienso, el benjuí y la mirra (16).
27
Estos aceites son, debido a su estructura molecular específica, tan livianos,
que algunas de sus fracciones se evaporan a temperatura ambiente, hecho que es
determinante para su uso en perfumes. Los "aceites esenciales" generalmente no
dejan manchas, tal como sus parientes más pesados que son los aceites
vegetales normales como son el girasol, el sésamo, la soya, etc., los que a su vez
tampoco dejarían manchas, si se "evaporan" rápidamente a temperatura
ambiente, pero su punto de ebullición, a la presión atmosférica, está arriba de
70oC. Se obtienen a partir de diferentes plantas mediante destilación, prensado o
extracción por agentes solubilizantes.
Son utilizados los primeros preferentemente para fabricar fragancias,
también tienen aplicación como sustancia beneficiosa en la aromaterapia y son
muy apreciados para perfumar ambientes o como productos de baño (16).
Los aceites esenciales desempeñan un papel clave en la bioquímica de las
plantas, ya que actúan como:
• Reguladores y mensajeros
• Protegen a la planta de parásitos y enfermedades
• Son muy importantes para la fertilización
• Llevan información inter-celular y se relacionan con la respuesta hormonal
de la planta
28
• Controlan la multiplicación y renovación de las células (16).
2.6.3 Esteroles
En la naturaleza se encuentran una gran cantidad y diversidad de
sustancias con el núcleo esteroide, las cuales incluyen a los esteroles, los
esteroides con grupos carbonilo, los esteroides con grupos amino en el núcleo o la
cadena lateral (alcaloides esteroidales) y los cardenólidos entre otros.
Estos a su vez se les encuentra en forma libre, esterificados con ácidos
grasos o glicosidados. A continuación se describen algunos aspectos generales de
los esteroides más distribuidos, haciendo un énfasis especial en su elucidación
estructural.
Los esteroles se encuentran ampliamente distribuidos en los reinos animal y
vegetal; y se les encuentra en forma libre, como ésteres o como glucósidos. Todos
contienen un núcleo ciclopentano perhidrofenantreno y presentan un grupo
hidroxilo en el carbono 3. La mayoría de esteroles naturales o esteroles
insaturados poseen una cadena lateral de 8 a 10 átomos de carbono y un enlace
doble en el C-5 (17).
29
2.6.4 Carotenoides
Los carotenoides están presentes en muchos de los alimentos que se
consumen a diario, particularmente en frutas y otros vegetales. Los carotenoides o
tetraterpenoides son una clase de pigmentos terpenoides con 40 átomos de
carbono derivados biosintéticamente a partir de dos unidades de geranil-
pirofosfato. En su mayoría son solubles en solventes apolares y tienen
coloraciones que oscilan entre el amarillo, por ejemplo el ß-caroteno y el rojo por
ejemplo el licopeno (18).
Los carotenoides son hidrocarburos liposolubles altamente insaturados
derivados del poliisopreno. Se sabe que en las grasas animales y vegetales están
presentes más de 75 carotenoides diferentes. Los más frecuentes son los
carotenos α, β y γ, la licopina, la luteína y las xantofilas. Los carotenoides y sus
derivados son normalmente los que dan el color amarillo a rojo intenso a las frutas,
hortalizas, cereales y aceite de palma bruto. Los carotenoides son los precursores
de la vitamina A, presentando el α-caroteno la mayor actividad de provitamina A
(18).
30
2.6.5 Ácidos grasos
2.6.5.1 Características generales
Las grasas comestibles incluyen todos los lípidos de los tejidos vegetales y
animales que se ingieren como alimentos. Las grasas (sólidas) o aceites (líquidos)
más frecuentes son una mezcla de triacilglicéridos (triglicéridos) con cantidades
menores de otros lípidos. Los ácidos grasos presentes en varias moléculas de
lípidos constituyen la parte con mayor interés nutritivo.
2.6.5.2 Naturaleza química
Los ácidos grasos más abundantes presentan cadenas lineales con un
número par de átomos de carbono. Existen en un amplio espectro de longitud de
cadena, que varía entre un ácido graso de la leche, con cuatro átomos de
carbono, y los ácidos grasos de algunos aceites de pescado, con 30 átomos de
carbono. Los más frecuentes son los ácidos grasos con 18 átomos de carbono
(19).
31
La posición de los dobles enlaces y los sustituyentes situados en la cadena
de carbonos se designan en relación al carbono del grupo carboxilo que se
denomina la posición 1. Así, los dobles enlaces del ácido linoleico le proporcionan
el nombre químico sistemático de ácido 9,12-octadecadienoico. Una abreviatura
taquigráfica para designar el ácido linoleico sería 18:2 con 18 átomos de carbono:
dos dobles enlaces. Su último doble enlace se encuentra a seis átomos de
carbono del metilo terminal, una característica importante para algunas enzimas.
Este ácido se considera un ácido graso -6. Omega por contarse desde la última
posición de la cadena.
Los ácidos grasos poliinsaturados -6 y -3 presentan dobles enlaces en cis
separados por grupos metileno. Un doble enlace puede cambiar de configuración
cis a trans (isomerización geométrica), o bien puede desplazarse a otra posición
de la cadena de carbonos (isomerización posicional).
Como resultado de esto, los ácidos grasos insaturados con dobles
ligaduras en posición trans presentan punto de fusión más elevados que sus
isómeros en cis. Desde este punto de vista el isómero en trans puede
considerarse con características intermedias entre el ácido graso insaturado en
cis, y un ácido graso saturado.
32
2.6.5.3 Acilglicéridos
El glicerol es un tri-alcohol que frecuentemente se encuentra esterificado a
grupos acilo, principalmente de ácidos grasos. El tipo de ácido graso y la posición
en la cual se esterifica al glicerol determinan las características de los
acilglicéridos. Además de los glicéridos que presentan tres ácidos grasos
esterificados o triglicéridos, que son los más abundantes, los diacilglícéridos y los
monoacilglicéridos, también están presentes en los lípidos de reserva, y
consecuentemente en los alimentos. La posición que ocupan los ácidos grasos en
el glicerol resulta en características específicas de la molécula.
Las grasas de reserva de origen animal tienden a presentar un ácido graso
saturado en la posición 1 y un ácido graso insaturado en la posición 2. Los ácidos
grasos de la posición 3 parecen presentar una distribución fortuita, aunque con
frecuencia ahí se acumulan ácidos grasos poliinsaturados (19).
2.6.5.4 Fosfolípidos
Los fosfolípidos son componentes de la membrana celular que están
presentes en todos los tejidos y aceites obtenidos por extracción. Normalmente,
en la posición 1 se esterifica un ácido graso saturado, y en la posición 2 un ácido
graso polinsaturado.
33
Los grupos polares que contienen fósforo y una base orgánica proporcionan
a la molécula lipídica una región hidrofílica. Además de los fosfoglicéridos, los
fosfolípidos incluyen esfingomielinas y cerebrósido, que se basan en la esfingosina
en lugar del glicerol. Aunque los fosfolípidos constituyen sólo una pequeña
fracción de la grasa total de la dieta, pueden constituir una fuente importante de
ácidos grasos esenciales (20).
2.6.5.5 Clasificación de ácidos grasos
Ácidos grasos saturados. Son ácidos grasos sin dobles enlaces entre carbonos;
tienden a formar cadenas extendidas y a ser sólidos a temperatura ambiente,
excepto los de cadena corta.
Cadena corta (volátiles)
Ácido butírico (ácido butanoico)
Ácido isobutirico (ácido 2-metilpropionico)
Ácido valérico (ácido pentanoico)
Ácido isovalerico (ácido 3-metilbutanoico)
Cadena larga
Ácido miristico (14:0 ácido tetradecanoico)
Ácido palmítico (16:0 ácido hexadecanoico)
Ácido esteárico (18:0 ácido octadecanoico)
Ácidos grasos insaturados. Son ácidos grasos con dobles enlaces entre carbonos;
suelen ser líquidos a temperatura ambiente.
34
Ácido grasos monoinsaturados. Son ácidos grasos insaturados con un solo doble
enlace
Ácido oleico, 18:1(9) (ácido cis-9-octadecanoico)
Ácido grasos poliinsaturados. Son ácidos grasos insaturados con varios dobles
enlaces.
Ácido linoleíco, 18:2(9,12) (ácido cis-9-12-octadecanoico) (esencial)
Ácido linolénico 18:3(9,12,15) (ácido cis-9,12,15- octadecanoico) (esencial)
Ácido araquídico 20:4(5,8,11,14) (ácido cis -5,8,11,14- eicosatetrienoico)
(esencial)
Se llaman ácidos grasos esenciales a algunos ácidos grasos, como el
linoleíco, linolénico y el araquídico que un organismo, el nuestro en este caso, no
puede sintetizar, por lo que deben obtenerse por medio de la dieta.
Los ácidos grasos no esenciales, incluye a los ácidos grasos saturados
palmítico, esteárico, y araquídico y ácidos grasos insaturados como palmitoléico y
oleico. Estos pueden ser sintetizados, a partir de acetato, por el complejo
enzimático de la sintetasa de ácidos grasos (FAS) en nuestras células animales.
35
2.6.6 Cumarinas
Compuestos ampliamente repartidos en el reino vegetal, siendo más
abundantes cuando se secan. Presentan una estructura básica de 2H-1-
benzopiran-2-ona. Se originan por lactonización del ácido cis-O-hidroxicinámico o
ácido cumarínico. Se encuentran en hojas, frutos, semilla y raíces, mayormente en
las Gramineas y Umbilíferas. Da un olor agradable en el espliego, el tabaco, etc.
Tipo de lactona, se prohíbe su uso como saborizante por ser tóxico, tienen
propiedades anticoagulante y aromatizante (21).
2.6.7 Taninos
Los taninos son polifenoles hidrosolubles, que se utilizan desde la
antigüedad por sus propiedades curtientes y antisépticas, ya que estos presentan
la propiedad de precipitar las macromoléculas como las proteínas (22).
2.6.8 Flavonoides
Las propiedades físicas dependen de la clase de flavonoide considerado y
su forma. Por ejemplo las flavonas, flavonoles y auronas, debido al sistema
conjugado son sólidos con colores que comprenden desde el amarillo muy tenue
hasta el rojo. Las antocianidinas son de colores rojo intenso, morado, violeta y
azul.
36
Las flavanonas y flavanonoles debido al carbono quiral C-2 presentan
rotación óptica. Los glicósidos son en general sólidos amorfos, mientras que las
agliconas y los altamente metoxilados son cristalinos (24).
2.6.9 Mucílagos o gomas
Sustancia gelatinosa exudada por ciertas plantas. Las gomas están
compuestas por ácidos orgánicos complejos, llamados ácidos de la goma, o por
sus sales. Cuando se hidrolizan, estos ácidos, como la arabina o ácido arábico,
dan azúcares como la arabinosa, galactosa, xilosa y ácidos simples.
Las gomas tienen consistencia similar a la cola cuando se mojan, pero son
duras si están secas.
Son incoloras e inodoras y no se disuelven en disolventes orgánicos,
aunque son muy solubles en agua. Sirven de base para elaborar mucílagos, se
usan en el apresto de tejidos, el estampado de géneros de algodón y como
emulgentes y calmantes en medicamentos.
La goma arábiga, un exudado de distintas especies de acacia, es un
ejemplo característico de las gomas que contienen arabina. La de mejor calidad se
obtiene de las especies Acacia senegal y Acacia arabica, que crecen en el oeste y
el norte de África.
37
La goma forma en agua una solución espesa y límpida; si a esta solución
se añade alcohol etílico ligeramente acidificado con ácido clorhídrico, se obtiene
arabina. (26).
Muchas gomorresinas y otros exudados vegetales reciben a menudo el
nombre de gomas. Las gomorresinas son sustancias que contienen goma y
resina, por lo cual son sólo solubles en mezclas de agua y alcohol. Las principales
gomorresinas son las llamadas gomas de amoníaco, asafétida, benzoína, gálbano,
gutagamba, mirra y sandáraca. El látex, del cual proceden el chicle, el caucho y la
gutapercha, es una mezcla de gomorresinas, ceras y grasas (30).
2.6.10 Alcaloides
2.6.10.1 Características generales
Son sustancias orgánicas de origen vegetal con una actividad fisiológica
muy intensa en dosis pequeñas. Contienen nitrógeno en su molécula y con
frecuencia se presentan combinados con ácidos orgánicos o taninos. Representan
entre el 1-3% del peso seco de la planta. En 1803, Derosne aisló por primera vez
un alcaloide: la morfina. Su gran actividad exige una gran precaución en su
empleo por causar intoxicaciones en muchas ocasiones mortales.
Actualmente se conocen más de 4000 alcaloides, aunque su presencia
probablemente quede reducida a menos del 10% de las especies botánicas.
38
Algunas familias botánicas destacan por su riqueza en alcaloides:
Amarillidaceae, Annonaceae, Apocinaceae, Asteraceae, Berberidaceae,
Boraginaceae, Buxaceae, Celastraceae, Fabaceae, Lauraceae, Liliaceae,
Loganiaceae, Menispermaceae, Papaveraceae, Piperaceae, Poaceae,
Ranunculaceae, Rubiaceae, Rutaceae y Solanaceae (23).
En 2003, Milijaona Randrianarivelojosia aisló de la corteza de Zanthoxylum
tsihanimposa, una planta endémica de Madagascar cinco alcaloides que fueron
probados contra el parasito de la malaria, ϒ-fagarina, N-benzoyl-tyramina,
skimmianina, dictammnina y 4-metoxy-1-2-quinolona, de los cuales ϒ-fagarina fue
el que presento la actividad plasmodial más alta (8).
Ming-Jen Cheng, en 2005 aisló de Zanthoxylum ailanthoides veintiséis
compuestos obtenidos de las raíces de esta planta para evaluar la inhibición de la
replicación de VIH en células linfociticas, y catorce de los compuestos
demostraron una actividad significante, siendo los más potentes, ϒ-fagarina,
decarina y tembamide (12).
39
En el mismo año, Olivia Jansen probó catorce alcaloides de Haplophyllum
A. Juss. por las propiedades citoxicas que presentan en contra de las líneas
celulares HeLa, de los cuales cinco fueron altamente citotoxicos, consisten en tres
furoquinolonas: skimmianina, haplopina y ϒ-fagarina, y dos piranoquinolonas:
flindersina y haplamina (13).
En 2008, José Manuel Lozano aisló metabolitos de extractos de hojas de
Peltostigma guatemaltense, los cuales fueron siete alcaloides: skimmianina, ϒ-
fagarina, anhidroevoxina, evoxina, 7-isopentiloxi-ϒ-fagarina, kokusagina y 4-
metoxi-1-metil-2-quinolona. Fueron probados contra Plasmodium falciparum y
contra cepas bacterianas: Staphylococcus aereus, Enterococcus fecalis y
Salmonella typhimurium (25).
2.6.10.2 Naturaleza química
Los alcaloides son sustancias más o menos tóxicas que actúan
primariamente sobre el sistema nervioso central, tienen un carácter básico,
contienen nitrógeno heterocíclico y son sintetizados en plantas partiendo de
aminoácidos y derivados inmediatos (23).
40
Los alcaloides se encuentran ampliamente distribuidos en el reino vegetal
aunque se ha demostrado que ciertos grupos están característicamente exentos
de ellos. Pueden ser sólidos, solubles en alcohol o insolubles en el agua. Se
extraen mediante el agua, alcohol, con álcalis y con disolventes orgánicos
apolares. Su función es reguladora y protege a la planta contra los insectos y
parásitos.
Los alcaloides son solubles en agua, se manejan procedimientos donde el
agua acidulada puede conducir a un extracto que pueda ser testificado
directamente con uno o más reactivos estándar precipitadores de alcaloides (23).
2.6.10.3 Actividad farmacológica
En medicina, farmacología y fitoterapia se emplean en estado puro o por
quimiosintésis como drogas vegetales como quinina y morfina, Aproximadamente
30 de los alcaloides conocidos se usan en medicina.
Por ejemplo, la atropina, que se obtiene de la belladona, dilata las pupilas;
la morfina es un calmante; la quinina es un remedio específico para la malaria; la
nicotina es un insecticida potente y la reserpina un tranquilizador. También para
infusiones se utilizan (cafeína, té) y en bebidas refrescantes (colas). Existen
innumerables plantas que tienen alcaloides: opio, cafeto, té, ruda, cicuta,
belladona, eléboro, etc. (23).
41
III. Justificación
Las plantas han jugado un papel importante y fundamental en el desarrollo
de la Humanidad, tanto en la utilización artesanal de las mismas, como en su
posterior estudio como fuente de materia prima para las industrias farmacéuticas,
alimenticias, etc.
México es un país que se caracteriza por sus riquezas naturales y que
posee una gran variedad de plantas endémicas, algunas de las cuales son usadas
artesanalmente como medicina o alimento. En nuestro país, el recurso natural
como sustrato de investigación es muy poco utilizado a pesar que se cuenta con
una gran biodiversidad de flora. Muchas especies son candidatos potenciales para
la obtención de metabolitos bioactivos de importancia médica y agrícola.
El estudio de una gran cantidad de especies vegetales de uso industrial,
hacen necesario disponer de métodos confiables y sencillos, ajustados a la
realidad del país, que permitan la identificación de las familias de metabolitos
secundarios en plantas, de una manera sistemática.
42
IV. Hipótesis
Es posible determinar la presencia de alcaloides en hojas secas y frescas
de Argemone mexicana, Bignonia unguis-cati, Diospyros sinaloensis y
Maytenus phyllanthoides.
Se espera encontrar ácidos grasos esenciales en hojas secas de Argemone
mexicana, Bignonia unguis-cati, Diospyros sinaloensis y Maytenus
phyllanthoides.
43
V. Objetivos:
5.1 Objetivo general:
Identificar y cuantificar los metabolitos secundarios: alcaloides y ácidos
grasos de Argemone mexicana, Bignonia unguis-cati, Diospyros sinaloensis y
Maytenus phyllanthoides por cromatografía de gases acoplada a espectrometría
de masas (CG-EM).
5.2 Objetivos específicos:
Identificación y cuantificación de alcaloides en hojas secas y frescas
de las especies en estudio por CG-EM.
Identificación y cuantificación de ácidos grasos de las hojas de las
especies en estudio por CG-EM.
44
VI. MATERIALES Y METODOS
6.1 Materiales
6.1.1 Material biológico
Para la realización del presente trabajo se utilizaron muestras de plantas
que presentaron actividad biocida contra diferentes bacterias patógenas, las
cuales se obtuvieron del proyecto “Actividad antibacterial de Argemone mexicana,
Bignonia unguis-cati, Diospyros sinaloensis y Maytenus phyllanthoides”, FOMIX-
CONACYT y Gobierno del estado de Sinaloa, Convocatoria 2007, Responsable
M.C. Irma Romelia Sánchez Mendoza, clave de registro Sin-2007-C01-72153, y
del Seminario de Investigación II, “ Estudio de la bioactividad de extractos
vegetales a partir de cuatro especies de la región contra la bacteria Erwinia
carotovora patógena de papa (Solanum tuberosum)”. En la Tabla 1 se presentan
las especies vegetales estudiadas, el sistema de solventes utilizado en cada
extracto y los microorganismos patógenos contra los que se hicieron los ensayos.
45
Tabla 1. Extractos vegetales con capacidad inhibitoria frente a diferentes patógenos.
ESPECIE SOLVENTE DE EXTRACCIÓN PATÓGENO AL QUE SE LE APLICÓ
Argemone mexicana cloroformo Erwinia carotovora
heptano Erwinia carotovora
Bignonia unguis-cati agua Erwinia carotovora
cloroformo Erwinia carotovora
heptano Erwinia carotovora, Proteus mirabilis,
E. coli, Citrobacter freundii
Diospyros sinaloensis cloroformo Erwinia carotovora
heptano Erwinia carotovora, Proteus mirabilis,
E. coli, Citrobacter freundii
Maytenus phyllanthoides agua Erwinia carotovora
cloroformo Erwinia carotovora
heptano Erwinia carotovora, Proteus mirabilis,
E. coli, Citrobacter freundii
El muestreo se llevó a cabo en cuatro diferentes áreas circunvecinas y
urbanas del municipio de Culiacán, Sinaloa, el primer punto de muestreo fue en el
entronque Nuevo Altata, Dautillos, Navolato donde se recolectó Maytenus
phyllanthoides que se ubica entre las coordenadas N 24°40´073´´ W
107°57´237´´; el segundo punto se ubica sobre la carretera a Nuevo Altata Km. 1
Navolato, Sinaloa, entre las coordenadas N 24°39´004´´, W 107° 55´748´´, donde
fue recolectada Diospyros sinaloensis.
46
Argemone mexicana se recolectó en Jotagua, Culiacán se ubica entre las
coordenadas N 24° 51´54´´ W 107°16´11´´, la cuarta colecta se ubicó dentro de las
coordenadas N 24° 52´ 11.0´´W 107°15´21.70´´, en la localidad de El Mauta,
Culiacán, donde se colectó Bignonia unguis.cati.
Un espécimen de cada planta fue depositado en el Herbario de la Escuela
de Biología de la Universidad Autónoma de Sinaloa. La caracterización botánica
de cada especie la realizó el M.C. José Luis Beltrán Magallanes.
6.1.2 Equipo
Cromatógrafo de gases 7890 serie II (Agilent Technologies), detector
selectivo de masas 5973 (Hewlett Packard), biblioteca de espectros de masas
para compuestos orgánicos NIST (* NIST/EPA/NIH Main and Selected Replicates
with Chemical Structures, MS Search Program v.2.0 Mass Spec Interpreter y
Amdis 2.65) que cuenta con un total 180,000 compuestos, computadora con
programa “Chemstation” Agilent Technologies. Columna capilar, HP-1 MS de 30m
X 0.25mm (Agilent). Injector automático Agilent Technologies 7683B series.
47
Equipo y material para extracción y procesamiento:
Rotavapor Buchi 011, Matraz bola, pipetas Pasteur, viales de 4 y 1.5 mL.
Thermoblock Fisher Scientific Pierce modelo 18780 Reactivap, Vortex-2
Genie Scientific Industries modelo G-560, y reactiviales con capacidad de 3 mL
marca Pierce, septas de silicón, tapas, tubos de ensaye con capacidad de 15 mL
(2 por cada muestra), pipetas Pasteur, micropipetas Eppendorf, puntillas, gradilla,
espátulas, vasos de precipitado de 250 mL, viales con capacidad de 4 y 1.5 mL.
6.2 Determinación de alcaloides
6.2.1 Generalidades
Para obtener la fracción conteniendo alcaloides se pesaron 20 gramos de
hojas frescas y secas de cada especie de planta y se homogenizaron con 80 ml de
solvente. Se separaron los residuos del extracto vegetal, por medio de filtración a
gravedad, a través de papel filtro Whatman. El extracto obtenido es llevado a
sequedad total utilizando un rotavapor (Figura 5). El extracto se colocó en viales
con capacidad de 4 mL de los que posteriormente se tomaron 200 µl que se
colocaron en viales de 1.5 mL con insertos de 100 microlitros para su ser
analizados por el sistema CG-EM.
48
Figura 5. Rotavapor Buchi 011
6.2.2 Cromatografía de gases-espectrometría de masas de los alcaloides
presentes en el extracto.
Los extractos de alcaloides obtenidos se inyectaron en el sistema CG-EM
(Figura 6) bajo las siguientes condiciones.
Temperatura del puerto de inyección, 180°C. Temperatura inicial del horno
40°C durante 3 min, tasa de incremento de temperatura de 3°C/min hasta llegar a
240°C manteniendo esta temperatura final por 15 minutos. La presión fue de 3 psi
y el flujo constante del gas acarreador fue de 1 mL/min de helio de ultra alta
pureza y la relación de “Splitt” de 30:1. La temperatura del inyector 180°C. La
columna que se uso fue la HP-5MS de 30 m X 0.25 mm.
49
Figura 6. Cromatografo de gases acoplado a espectrometría de masas.
Para la identificación de los picos en los cromatogramas se comparó cada
espectro de los eluyentes en su ápice, en el momento que es registrado como
tiempo de retención en el cromatograma compuesto por la suma de señales de los
iones producidos. El espectro producido por el colector de iones fue comparado
con la base de datos NIST arriba mencionada. Los espectros de la biblioteca
comparados por el “software” del sistema CG-EM, dan un buen acercamiento a la
evaluación realizando la comparación de los compuestos encontrados en las
muestras analizadas mediante el uso de la computadora acoplada al sistema CG-
EM.
50
6.2.3 Cuantificación de alcaloides
La cuantificación de los alcaloides identificados por CG-EM se realizó por
cromatografía de gases en las condiciones anteriormente descritas. En base a las
áreas de los picos detectados en los cromatogramas.
6.3 Determinación de ácidos grasos
6.3.1 Generalidades
Los lípidos de las células están constituidas por compuestos poco polares y
especialmente en membranas y cuerpos lipídicos, que contienen ésteres de
ácidos grasos. Estos compuestos pueden ser extraídos con solventes y los ácidos
grasos pueden ser saponificados y liberados de los ésteres como en el caso de los
ésteres de glicerol antes mencionados. Los ácidos grasos, para poder pasar a
fase gaseosa, esto es para facilitar su volatilidad son comúnmente convertidos a
sus correspondientes metil ésteres.
Los metil ésteres de ácidos grasos (FAME) son convencionalmente
preparados al someter los lípidos a un proceso de calentamiento utilizando
condiciones drásticas de temperatura y pH. Una extracción de lípidos ineficiente
podría conducir a errores en el análisis de composición de lípidos.
51
Los FAME pueden ser preparados in situ, de manera que simplifique el
procedimiento y reduzca el uso de solventes orgánicos, ya que estos son
directamente preparados sin previa extracción, paso que es requerido en el
método convencional para la preparación de metil ésteres.
El método de esterificación-tranmetilación in situ es una modificación del
método oficial de la Sociedad Americana de Química de Aceites (AOCS) de 1980
para la preparación de FAME de grasas y aceites. Los FAME preparados a través
de una saponificación seguida por la metilación o transesterificación del extracto
lipídico.
6.3.2 Método de esterificación-transmetilación in situ
El procedimiento para la preparación del estándar que se empleó en este
método de transmetilación in situ fue el siguiente:
En la balanza analítica se pesó 1 mg del metil éster del ácido
heptadecanoico como estándar interno para las determinaciones de ácidos
grasos, tomando la precaución de mantener en refrigeración el estándar hasta el
momento de su uso. Una vez pesado el estándar, éste se colocó en un vial con
capacidad de 4 mL y se le adicionaron 2mL de metanol; posteriormente se
homogeneizó en un vortex, se selló con parafilm y se guardó hasta el momento de
su uso.
52
Para la determinación de ácidos grasos, las muestras fueron sometidas a
una preparación previa. Se pesaron las hojas secas de cada especie de planta,
para posteriormente ser molidas con la ayuda de una licuadora. Se realizó por
duplicado para cada especie.
Se tomó una cantidad de muestra de 20 mg de hojas secas de cada planta
por duplicado y se colocaron en viales de capacidad de 4 mL. Posteriormente se
les agregó 100 µl (0.05 mg) del metil éster del ácido heptadecanoico en metanol
como estándar interno. Una vez agregado el estándar interno las muestras se
sometieron a un proceso de transesterificación que consiste en dos etapas.
1. Hidrólisis alcalina, en donde por adición de 1 mL de hidróxido de sodio
en metanol 0.5N se llevó a cabo la hidrólisis de los glicéridos y
metilación de ácidos grasos. Posteriormente los viales de reacción
fueron calentados en un block de calentamiento a 90°C por 15 min y se
enfriaron para continuar con la siguiente etapa (Figura 7)
Figura 7. Thermoblock de calentamiento
53
2. Trans-metilación, que tiene como principal objetivo completar la
esterificación total de los ácidos grasos libres. Para esto, se agregó 1
mL de trifluoruro de boro en metanol para la metilación total y se calentó
nuevamente a 90°C durante 15 min. La mezcla de reacción se transfirió
a un tubo de ensaye de capacidad de 15 mL. 2 mL de agua destilada y 3
mL de hexano fueron agregados y se agitó en un vortex dejándolos
reposar un tiempo hasta que se formaron dos fases. Se recuperó la fase
orgánica con una pipeta Pasteur y se transfirió a un tubo de ensaye
limpio (Figura 8)
Figura 8. Recuperación de la fase orgánica para la obtención de ácidos grasos.
.
54
Al tubo con la fase acuosa se le agregó 3 mL de hexano, se agitó con un
vórtex y nuevamente se dejo reposar hasta formar dos fases y se recuperó la fase
orgánica que se adicionó a la anterior.
La fase orgánica se llevó a sequedad total con una corriente de nitrógeno.
El residuo fue disuelto en 20 mL de isooctano de los cuales se tomaron 200 µl
para el análisis de CG-EM (Figura 9).
Figura 9. Viales con muestra para análisis en Cromatografo de gases.
6.4 Cromatografía de gases-espectrometría de masas para ácidos grasos
Los extractos de ácidos grasos obtenidos por el método in situ
anteriormente descrito se analizaron en el sistema CG-EM bajo las siguientes
condiciones.
55
Temperatura inicial del horno 130°C por 3 min, tasa de incremento de
temperatura 3°C/min hasta llegar a 270°C con un tiempo final de 30°C. La presión
fue de 10 psi y el flujo del gas acarreador fue de 0.492 mL/min de helio de ultra
alta pureza y la relación de “Split” de 1:30. La temperatura del inyector 200°C y del
detector 250°C. Para la identificación de los ácidos grasos en los cromatogramas,
se siguió el mismo procedimiento ya mencionado en la identificación de alcaloides.
6.4.1Cuantificación de ácidos grasos
La cuantificación de los ácidos grasos identificados por CG-EM se llevó a
cabo por cromatografía de gases en las condiciones anteriormente mencionadas.
Con las áreas de compuestos y del estándar interno (metil éster del ácido
heptadecanoico) se realizaron las determinaciones de cada uno de los ácidos
grasos presentes.
56
VII. Resultados
7.1 Identificación y cuantificación de alcaloides
Al analizar los extractos de Argemone mexicana, Bignonia unguis-cati,
Diospyros sinaloensis y Maytenus phyllanthoides, por cromatografía de gases
acoplado a espectrometría de masas (CG-EM), utilizando Metanol y
Diclorometano como solventes de extracción. El estudio permitió establecer la
presencia, así como la abundancia de un alcaloide de tipo furoquinolínico: ϒ-
fagarina, realizando la comparación de los compuestos encontrados en las
muestras analizadas mediante el uso de la computadora acoplada al sistema CG-
EM. Encontrándose en Argemone mexicana utilizando ambos solventes y en
Diospyros sinaloensis utilizando Diclorometano (Tabla 3). El espectro de masas
coincidió un 98% por lo cual se puede asegurar que se trata de ϒ-fagarina.
Tabla 3. Presencia de fagarina en Argemone mexicana, Bignonia unguis-cati, Diospyros sinaloensis y
Maytenus phyllanthoides.
Especie de
trabajo
Argemone
mexicana
Bignonia unguis-
cati
Diospyros
sinaloensis
Maytenus
phyllanthoides
Solvente
extracción
Fresco seco Fresco seco Fresco Seco Fresco seco
Metanol - + - - - - - -
Diclorometano + + - - + + - -
57
Figura 10. Perfil cromatográfico de compuestos en Argemone mexicana, en seco usando metanol como
solvente. 7.ϒ-Fagarina
Tabla 4. Contenido de compuestos en Argemone mexicana (metanol en seco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 5.498 75427 8925339 21.83% 9.569%
2 6.035 78759 13100343 32.05% 14.044%
3 24.999 121939 5674874 13.88% 6.084%
4 28.742 56733 3105150 7.60% 3.329%
5 28.934 26779 1597117 3.91% 1.712%
6 30.825 69473 3098663 7.58% 3.322%
7 49.444 461500 40880178 100.00% 43.826%
7
58
Figura 11. Perfil cromatográfico de compuestos en Argemone mexicana, en fresco usando metanol como
solvente. 7.ϒ-Fagarina
Tabla 5. Contenido de compuestos en Argemone mexicana (metanol en fresco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 5.606 72884 10695174 63.05% 22.917%
2 5.725 69816 2506715 14.78% 5.371%
3 5.979 72991 12936666 76.26% 27.720%
4 8.513 36083 3144558 18.54% 6.738%
5 35.556 4011 40227 0.24% 0.086%
6 35.650 8618 381892 2.25% 0.818%
7 49.379 238037 16963747 100.00% 36.349%
7
59
Figura 12. Perfil cromatográfico de compuestos en Argemone mexicana, en seco usando
Diclorometano como solvente. 3.ϒ-Fagarina
Tabla 6. Contenido de compuestos en Argemone mexicana (Diclorometano en seco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 44.348 49051 5326807 0.83% 0.329%
2 45.347 7801 652072 100.00% 39.229%
3 47.068 457720 37546349 5.84% 2.322%
4 47.703 2608 237530 36.43% 14.290%
5 51.045 2608 237530 36.43% 14.290%
6 51.181 746 83539 12.81% 5.026%
7 51.458 573286 94446423 14.69% 5.841%
8 51.554 149771 18050810 2.81% 1.116%
3
60
Figura 13. Perfil cromatográfico de compuestos en Argemone mexicana, en fresco usando
Diclorometano como solvente.
Tabla 7. Contenido de compuestos en Argemone mexicana (Diclorometano en fresco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 47.031 242718 17935380 36.64% 14.911%
2 51.031 478265 48956408 100.00% 40.700%
3 51.523 95335 3711787 7.58% 3.086%
4 54.464 20424 1284296 2.62% 1.068%
5 54.562 20060 1221771 2.50% 1.016%
6 54.587 18587 702547 1.44% 0.584%
7 55.165 51589 4284660 8.75% 3.562%
8 55.405 69479 2748955 5.62% 2.285%
9 55.405 69479 2748955 5.62% 2.285%
10 55.497 92283 2111146 4.31% 1.755%
61
Figura 14. Perfil cromatográfico de compuestos en Bignonia unguis-cati, en fresco usando
Diclorometano como solvente.
Tabla 8. Contenido de compuestos en Bignonia unguis-cati (Diclorometano en fresco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 10.345 49428 1627754 4.98% 2.708%
2 46.502 49044 1355122 4.14% 2.254%
3 46.902 32543 3108712 9.50% 5.171%
4 48.338 28217 464472 1.42% 0.773%
5 48.389 22336 243750 0.75% 0.405%
6 48.410 19289 505950 1.55% 0.842%
7 53.676 427746 32717974 100.00% 54.422%
8 56.279 32470 2402974 7.34% 3.997%
9 57.243 109726 3649949 11.16% 6.071%
62
Figura 15. Perfil cromatográfico de compuestos en Bignonia unguis-cati, en seco usando Diclorometano
como solvente.
Tabla 9. Contenido de compuestos en Bignonia unguis-cati (Diclorometano en seco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 47.031 242718 17935380 36.64% 14.911%
2 51.031 478265 48956408 100.00% 40.700%
3 51.523 95335 3711787 7.58% 3.086%
4 54.464 20424 1284296 2.62% 1.068%
5 54.562 20060 1221771 2.50% 1.016%
6 54.587 18587 702547 1.44% 0.584%
7 55.165 51589 4284660 8.75% 3.562%
8 55.405 69479 2748955 5.62% 2.285%
9 55.405 69479 2748955 5.62% 2.285%
10 55.497 92283 2111146 4.31% 1.755%
11 55.706 330194 34387337 70.24% 28.588%
63
Figura 16. Perfil cromatográfico de compuestos en Bignonia unguis-cati, en seco usando Metanol como
solvente.
Tabla 10. Contenido de compuestos en Bignonia unguis-cati (Metanol en seco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 5.519 45993 5419976 34.88% 18.996%
2 6.019 35700 5981302 38.50% 20.963%
3 44.441 30919 1594692 10.26% 5.589%
4 56.396 134037 15536733 100.00% 54.452%
64
Figura 17. Perfil cromatográfico de compuestos en Diospyros sinaloensis, en seco usando
Diclorometano como solvente. 9. ϒ-Fagarina
Tabla 11. Contenido de compuestos en Diospyros sinaloensis (Diclorometano en seco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 47.031 242718 17935380 36.64% 14.911%
2 51.031 478265 48956408 100.00% 40.700%
3 51.523 95335 3711787 7.58% 3.086%
4 54.464 20424 1284296 2.62% 1.068%
5 54.562 20060 1221771 2.50% 1.016%
6 54.587 18587 702547 1.44% 0.584%
7 55.405 69479 2748955 5.62% 2.285%
8 55.405 69479 2748955 5.62% 2.285%
9 55.706 330194 34387337 70.24% 28.588%
9
65
Figura 18. Perfil cromatográfico de compuestos en Diospyros sinaloensis, en fresco usando Diclorometano
como solvente. 2. ϒ-Fagarina
Tabla 12. Contenido de compuestos en Diospyros sinaloensis (Diclorometano en fresco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 44.344 34131 1077445 9.99% 9.084%
2 55.472 110728 10783928 100.00% 90.916%
2
66
Figura 19. Perfil cromatográfico de compuestos en Diospyros sinaloensis, en fresco usando
Metanol como solvente.
Tabla 13. Contenido de compuestos en Diospyros sinaloensis (Metanol en fresco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 47.031 242718 17935380 36.64% 14.911%
2 51.031 478265 48956408 100.00% 40.700%
3 51.523 95335 3711787 7.58% 3.086%
4 54.464 20424 1284296 2.62% 1.068%
5 54.562 20060 1221771 2.50% 1.016%
6 54.587 18587 702547 1.44% 0.584%
7 55.165 51589 4284660 8.75% 3.562%
8 55.405 69479 2748955 5.62% 2.285%
67
Figura 20. Perfil cromatográfico de compuestos en Diospyros sinaloensis, en seco usando Metanol como
solvente.
Tabla 14. Contenido de compuestos en Diospyros sinaloensis (Metanol en seco)
Peak # R.T. min Peak
height
Corr. area Corr. % max. % of total
1 5.561 173167 26086171 100.00% 50.894%
2 5.863 78045 2377928 9.12% 4.639%
3 6.044 96080 10823749 41.49% 21.117%
4 24.972 47830 2157036 8.27% 4.208%
5 28.883 70747 3486592 13.37% 6.802%
6 44.427 26562 1726406 6.62% 3.368%
7 56.345 46152 4597576 17.62% 8.970%
68
Figura 21. Perfil cromatográfico de compuestos en Maytenus phyllanthoides, en fresco usando Diclorometano
como solvente.
Tabla 15. Contenido de compuestos en Maytenus phyllanthoides (Diclorometano en fresco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 10.343 38270 1237973 100.00% 29.273%
2 44.354 24367 720206 58.18% 17.030%
3 46.490 23655 664914 53.71% 15.723%
4 46.873 18347 575232 46.47% 13.602%
5 50.829 17091 724817 58.55% 17.139%
6 57.227 6944 305861 24.71% 7.232%
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.000
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
Time-->
Abundance
T IC: M D F.D \ d a ta .ms1 0 .3 4 3
4 4 .3 5 44 6 .4 9 0
4 6 .8 7 35 0 .8 2 9
5 7 .2 2 7
69
Figura 22. Perfil cromatográfico de compuestos en Maytenus phyllanthoides, en fresco usando Metanol como
solvente.
Tabla 16. Contenido de compuestos en Maytenus phyllanthoides (Metanol en fresco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 5.519 45993 5419976 34.88% 18.996%
2 5.019 35700 5981302 38.50% 20.963%
3 5.805 19912 960782 20.47% 7.699%
4 41.802 31145 2296643 48.93% 18.404%
5 41.848 31883 2826207 60.21% 22.648%
70
Figura 23. Perfil cromatográfico de compuestos en Maytenus phyllanthoides, en seco usando Metanol como
solvente.
Tabla 17. Contenido de compuestos en Maytenus phyllanthoides (Metanol en seco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 5.511 45993 5419976 34.88% 18.996%
2 41.462 47068 8732665 100.00% 65.391%
71
Figura 24. Perfil cromatográfico de compuestos en Maytenus phyllanthoides, en seco usando Diclorometano
como solvente.
Tabla 18. Contenido de compuestos en Maytenus phyllanthoides (Diclorometano en seco)
Peak # R.T. min Peak height Corr. Area Corr. % max. % of total
1 41.031 242718 17935380 36.64% 14.911%
2 41.802 31145 2296643 48.93% 18.404%
3 41.848 31883 2826207 60.21% 22.648%
4 51.031 478265 48956408 100.00% 40.700%
5 51.523 95335 3711787 7.58% 3.086%
6 54.464 20424 1284296 2.62% 1.068%
7 54.562 20060 1221771 2.50% 1.016%
8 54.587 18587 702547 1.44% 0.584%
9 55.165 51589 4284660 8.75% 3.562%
10 55.405 69479 2748955 5.62% 2.285%
11 55.405 69479 2748955 5.62% 2.285%
12 55.497 92283 2111146 4.31% 1.755%
72
Figura 25. Cuantificación de Fagarina presente en Argemone mexicana, Bignonia unguis-cati,
Diospyros sinaloensis y Maytenus phyllanthoides .en hojas frescas y secas.
En el análisis cromatográfico de compuestos presentes en las muestras
de hojas de tanto en seco como en fresco, Argemone mexicana, Bignonia unguis-
cati, Diospyros sinaloensis y Maytenus phyllanthoides se encontró un alcaloide de
tipo furoquinolínico: ϒ- fagarina. Este compuesto se encontró en Argemone
mexicana usando metanol como solvente de extracción, en fresco (36.35%) y en
seco (43.83%), y usando diclorometano en hojas fresca (2.32%), En Diospyros
sinaloensis usando Diclorometano como solvente, estuvo presente en fresco
(90.92%), siendo esta en donde hubo una mayor cantidad de este compuesto y en
seco (28.59%).
73
Tanto en Bignonia unguis-cati como en Maytenus phyllanthoides no se
detectó la presencia de este compuesto de tipo alcaloide, como se puede apreciar
en sus respectivos cromatogramas, pero no se descarta la posibilidad de que
estas plantas puedan contener este compuesto, por lo que se puede continuar en
trabajos futuros con la identificación de ϒ- fagarina utilizando otros solventes de
extracción.
Figura 26. Estructura molecular de ϒ- fagarina.
74
7.2 Identificación y cuantificación de ácidos grasos
El estudio permitió establecer la presencia y abundancia de los siguientes
ácidos grasos en las plantas mencionadas anteriormente: ácido palmítico,
linoleíco, linolénico, tridecílico, araquídico, behénico, elaídico, esteárico, valérico
(Tabla 19).
Tabla 19. Presencia/ausencia de ácidos grasos en Argemone mexicana, Bignonia unguis-cati,
Diospyros sinaloensis y Maytenus phyllanthoides.
ÁCIDO
GRASO
Argemone
mexicana
Bignonia
unguis- cati
Diospyros
sinaloensis
Maytenus
phyllanthoides
Ácido
palmítico
+ + + +
Ácido linoleíco + + + +
Ácido
linolénico
+ + + +
Ácido
Tridecílico
+ + + +
Ácido
araquídico
+ + + -
Ácido behénico + - - -
Ácido elaidico - + - +
Ácido esteárico - + + +
Ácido valérico - - + -
75
Para la identificación de los ácidos grasos en los cromatogramas se
comparó cada espectro de los eluyentes en su ápice, en el momento que es
registrado como tiempo de retención en el cromatograma. El espectro producido
fue comparado con la base de datos. Los espectros de la biblioteca comparados
por el “software” del sistema CG-EM, realizan la comparación de los compuestos
encontrados en las muestras analizadas mediante el uso de la computadora
acoplada al sistema CG-EM. Con las áreas de compuestos y del estándar interno
(metil éster del ácido heptadecanoico) se realizaron las determinaciones de cada
uno de los ácidos grasos presentes.
76
Figura 27. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Argemone mexicana,(muestra 1) 1.C16= ácido
palmítico, 2. C17= estándar interno, 3. C18:2=ácido linoleíco, 4. C18:3=ácido linolénico.
Tabla 20. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 1). La cantidad de cada ácido graso
se calculo en base al estándar interno (ácido heptadecanoico) que presentó un Rt= 26.509
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 24.195 107315 2987788 31.99% 12.549%
2 24.592 12787 350287 3.75% 1.471%
3 26.509 106370 2951170 31.60% 12.395%
4 27.635 39436 1052948 11.27% 4.423%
5 27.979 83180 2370380 25.38% 9.956%
6 28.086 332302 9339056 100.00% 39.226%
7 28.154 24016 547554 5.86% 2.300%
8 28.741 24016 547554 5.86% 2.300%
9 32.710 15659 371310 3.98% 1.560%
10 34.686 25040 722550 7.74% 3.035%
11 36.632 37834 1080459 11.57% 4.538%
12 36.771 13440 372850 3.99% 1.566%
13 38.737 37588 1214885 13.01% 5.103%
1 3
5
6
77
Figura 28. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Argemone mexicana,(muestra 2) 1.C14= ácido
tridecílico, 2. C16= ácido palmítico, 3. C17= estándar interno, 4. C18:2=ácido linoleíco, 5. C18:3= ácido
linolénico, 6. C18= ácido Esteárico, 7. C20= ácido araquídico, 8.C22= ácido behénico
Tabla 21. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 2). La cantidad de cada ácido graso
se calculo en base al estándar interno (ácido heptadecanoico) que presentó un Rt= 26.541
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 19.372 48090 1417546 1.88% 0.801%
2 24.222 863007 25333551 33.52% 14.322%
3 26.541 876808 26454002 35.00% 14.955%
4 27.046 105445 2824678 3.74% 1.597%
5 28.012 27545 911336 21.57% 9.216%
6 28.151 1856534 75584618 100.00% 42.729%
7 28.747 117700 3152908 4.17% 1.7282%
8 31.415 27841 837899 1.11% 0.474%
9 36.915 47686 2085108 2.76% 1.179%
9 8
7
5
3 2
1
6
78
5.74
109.32 112.14
363.25
3.39 8.44
Ácidos grasos en Argemone mexicana
Figura 29. Cuantificación de ácidos grasos presentes en Argemone mexicana.
Al hacer el análisis cromatográfico de ácidos grasos presentes en hojas
secas en las muestras de Argemone mexicana se encontraron: ácido tridecílico
5.74 µg/mg, palmítico 109.32 µg/mg, linoleico112.14 µg/mg, linolénico 363.25
µg/mg, siendo este el de mayor abundancia, ácido araquídico 3.39 µg/mg y ácido
behénico 8.44 µg/mg.
79
Figura 30. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Bignonia unguis-cati, (muestra 1) 1.C16= ácido
palmítico, 2. C17= estándar interno, 3. C18:2= ácido linoleíco, 4. C18:3= ácido linolénico.
Tabla 22. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 1). La cantidad de cada ácido graso
se calculo en base al estándar interno (ácido heptadecanoico) que presentó un Rt= 26.508
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 20.900 4121 32172 0.42% 0.102%
2 24.192 53512 1473405 19.04% 4.672%
3 24.929 28340 949060 12.26% 3.009%
4 26.508 71906 1959994 25.33% 6.215%
5 27.155 50740 1368272 17.68% 4.339%
6 27. 237 43025 1485968 19.20% 4.712%
7 27.978 45303 1290028 16.67% 4.091%
8 28.154 90052 2617720 33.83% 8.301%
9 28.746 26117 682408 8.82% 2.164%
8
7
4 2
80
Figura 31. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Bignonia unguis-cati, (muestra 2) 1.C14= ácido
tridecílico, 2. C16= ácido palmítico, 3. C17= estándar interno, 4. C18:2= ácido linoleíco, 5.C18:3= ácido
linolénico, 6.C18:1= ácido elaidico, 7.C18=ácido esteárico, 8.C20= ácido araquídico.
Tabla 23. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 2). La cantidad de cada ácido graso
se calculo en base al estándar interno (ácido heptadecanoico) que presentó un Rt= 26.523
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 19.368 44499 1239660 6.20% 1.558%
2 24.205 430172 12124701 60.63% 15.235%
3 24.596 17013 444293 2.22% 0.558%
4 26.523 478238 13267557 66.34% 16.671%
5 27.993 321162 9793531 48.97% 12.306%
6 28.103 658752 19998899 100.00% 25.130%
7 28.164 212008 5329651 26.65% 6.097%
8 28.745 127619 3427918 17.14% 4.307%
9 32.956 51003 1285249 6.43% 1.615%
1
2 3
8 7
6
5
4
81
9.04
118.545
68.115
138.675
38.86
25
9.37
Ácidos grasos en Bignonia unguis-cati
Figura 32. Cuantificación de ácidos grasos presentes en Bignonia unguis-cati.
En el análisis cromatográfico de ácidos grasos presentes en las muestras
de Bignonia unguis-cati se encontraron: ácido tridecílico 9.04 µg/mg, ácido
palmítico 118.545 µg/mg, ácido linoleíco 68.115 µg/mg, ácido linolénico 138.675
µg/mg, siendo este el de mayor abundancia, ácido elaidico 38.86 µg/mg, ácido
araquídico 9.37 µg/mg y ácido esteárico 25 µg/mg.
82
Figura 33. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Diospyros sinaloensis, (muestra 1) 1.C16= ácido
palmítico, 2. C17= estándar interno, 3. C18:2= ácido linoleíco, 4.C18:3= ácido linolénico, 6.C18=ácido
esteárico.
Tabla 24. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 1). La cantidad de cada ácido graso
se calculo en base al estándar interno (ácido heptadecanoico) que presentó un Rt= 26.509
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. %
max.
% of total
1 24.196 227756 6219534 100.00% 22.644%
2 26.509 130570 3573166 57.45% 13.009%
3 27.980 84358 2271888 36.53% 8.271%
4 28082 221157 6087461 97.88% 22.163%
5 28.152 27215 744073 11.96% 2.709%
6 28.744 71384 1953127 31.40% 7.111%
1
3
2
6
4
83
Figura 34. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Diospyros sinaloensis, (muestra 2) 1.C14= ácido
tridecílico, 2.C16:1= ácido valérico, 3.C17= estándar interno, 4.C18:3=ácido linoleíco, 5.C18= ácido
esteárico, 7.C20= ácido araquídico.
Tabla 25. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 2). La cantidad de cada ácido graso
se calculo en base al estándar interno (ácido heptadecanoico) que presentó un Rt= 26.521
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 19.367 70148 1926923 7.95% 1.789%
2 23.988 39025 997189 4.11% 0.926%
3 26.521 458481 12727141 52.50% 11.815%
4 28.105 799656 24241200 100.00% 22.504%
5 28.158 103697 2101058 8.67% 1.950%
6 28.748 245267 6843423 28.23% 6.353%
7 32.954 36285 988196 4.08% 0.917%
3
2
5
1
4
7
84
14.05
170.36
7.27
62.59
182.07
59.515
7.207
Ácidos grasos en Diospyros sinaloensis
Figura 36. Cuantificación de ácidos grasos presentes en Diospyros sinaloensis
En el análisis cromatográfico de ácidos grasos presentes en las muestras
de Diospyros sinaloensis se encontraron: ácido tridecílico 14.05 µg/mg, ácido
palmítico 170.36 µg/mg, ácido valérico 7.27 µg/mg, ácido linoleíco 62.59 µg/mg,
ácido linolénico 182.07 µg/mg, siendo este el de mayor abundancia, ácido
esteárico 59.515 µg/mg y ácido araquídico 7.207 µg/mg.
85
Figura 37. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Maytenus phyllanthoides, (muestra 1) 1.C14= ácido
tridecílico, 2.C16= ácido palmítico, 3.C17= estándar interno, 4.C18:2=ácido linoleico, 5.C18:3= ácido
linolenico, 6.C18:1= ácido elaidico, 7.C18= ácido esteárico.
Tabla 26. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 1). La cantidad de cada ácido graso
se calculo en base al estándar interno (ácido heptadecanoico) que presentó un Rt= 26.516
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 19.367 31379 877945 5.28% 2.196%
2 24.211 595643 16639522 100.00% 41.613%
3 26.516 269138 7604937 45.70% 19.019%
4 27.979 91269 2502977 15.04% 6.260%
5 28.077 75367 2048083 12.31% 5.122%
6 28.160 174442 4834627 29.06% 12.091%
7 28.743 28490 840112 5.05% 2.101%
4
2
3
1
6
5
7
86
Figura 38. Perfil cromatográfico de ácidos grasos en Maytenus phyllanthoides, (muestra 2) 1.C14= ácido
tridecílico, 2.C16= ácido palmítico, 3.C17= estándar interno, 4.C18:2=ácido linoleico, 5.C18:3= ácido
linolenico, 6.C18:1= ácido elaidico, 7.C18= ácido esteárico.
Tabla 27. Contenido de ácidos grasos trans-esterificados (muestra 2). La cantidad de cada ácido graso
se calculo en base al estándar interno (ácido heptadecanoico) que presentó un Rt= 26.521
Peak # R.T. min Peak height Corr. area Corr. % max. % of total
1 19.368 30464 770659 4.22% 1.633%
2 24.213 644679 18248659 100.00% 38.661%
3 26.521 393927 11026651 60.42% 23.361%
4 27.981 98434 2755026 15.10% 5.837%
5 28.077 84927 2344354 12.85% 4.967%
6 28.160 201887 5577175 30.56% 11.816%
7 28.741 36243 1026423 5.62% 2.175%
7
5
3
1
6
4
2
87
9.13
189.195
28.5 23.72
56.195
10.015
Ácidos grasos en Maytenus phyllanthoides
Figura 39. Cuantificación de ácidos grasos presentes en Maytenus phyllanthoides
En el análisis cromatográfico de ácidos grasos presentes en las muestras
de Maytenus phyllanthoides se encontraron: ácido tridecílico 9.13 µg/mg, ácido
palmítico 189.195 µg/mg, siendo este el de mayor abundancia, ácido linoleíco 28.5
µg/mg, ácido linolenico 23.72 µg/mg, ácido elaidico 56.195 µg/mg y ácido esteárico
10.015 µg/mg.
88
VIII. Discusión de resultados
Al realizar las pruebas se determinó la presencia de ácidos grasos y de
alcaloides de importancia biológica.
Se detectó la presencia de un alcaloide del tipo furoquinolona,
conocida como ϒ- fagarina que se deriva de las quinolonas, en las hojas frescas y
secas de Argemone mexicana y Diospyros sinaloensis, la literatura reporta que
estas plantas tienen alto contenido de alcaloides, sin embargo en la literatura no
se ha reportado la presencia del alcaloide ϒ- fagarina para estas plantas.
En Argemone mexicana en hojas en fresco usando metanol se encontró el
36.35%, encontradosé en mayor cantidad en hojas en seco con 43.83%, al usar
diclorometano en hojas en fresco no se detectó la presencia de este compuesto en
cambio en hojas secas se encontró con un 2.32%.
En Diospyros sinaloensis, en diclorometano hojas en fresco se encontró con
un 90.92%, que fue donde se encontró en mayor cantidad, en cambio en hoja
seca se encontró un 28.59%. Usando metanol para hojas secas como para hojas
frescas no se detectó la presencia de este alcaloide.
En el caso de Bignonia unguis-cati y Maytenus phyllanthoides, tanto en
hojas secas como en frescas, usando ambos disolventes de extracción no se
detectó la presencia de ϒ- fagarina en ellas.
89
Las quinolonas inhiben la síntesis de DNA en las células bacterianas, a
través de la inhibición de las topoisomerasas del DNA (girasas). Las
furoquinolonas son considerablemente más activas y su espectro de acción es
mayor ya que abarca microorganismos Gramnegativos y Grampositivos (27).
Olivia Jansen aisló ϒ- fagarina de Haplophyllum A. Juss. Porque presentó
propiedades citotóxicas en contra de las líneas celulares HeLa, Ming-Jen Cheng,
aisló de Zanthoxylum ailanthoides, ϒ- fagarina para la inhibición de la replicación
de VIH en células linfociticas, José Manuel Lozano aisló ϒ- fagarina, de
Peltostigma guatemaltense debido a las propiedades antibacterianas que
presentó, al usarlo contra las bacterias Staphylococcus aureus, Enterococcus
faecalis y Salmomella typhimurium. Milijaona Randrianarivelojosia, aisló de la
corteza de Zanthoxylum tsihanimposa ϒ- fagarina, probados contra el parasito del
paludismo, ya que el alcaloide ϒ- fagarina fue el que presentó la actividad
plasmodial más alta.
Por lo que se puede suponer que el alcaloide ϒ- fagarina se podría utilizar
como antibiótico.
90
Los ácidos grasos saturados encontrados en Argemone mexicana son el
ácido palmítico (13.43%) es el mayoritario y es muy común encontrarlo en los
vegetales, no así el ácido araquídico que se encontró en bajas concentraciones
(0.474%). Los ácido linoleíco (9.58%) y linoleíco (40.97%), son ácidos grasos
poliinsaturados, y además considerados esenciales porque el organismo no puede
sintetizarlos. El primero de ellos es conocido también como w3 y el segundo como
w6. Estos compuestos tienen que ser consumidos del 1 al 2% del total de los
lípidos porque tienen la propiedad de ser antioxidantes.
En Bignonia unguis cati, de los ácidos grasos saturados fueron encontrados
ácido palmítico (9.95%), ácido esteárico (1.782%) y ácido araquídico (1.615%). De
los ácidos grasos poliinsaturados se encontraron en mayor proporción el ácido
linolénico (16.71%) y ácido linoleíco (8.195%).
Diospyros sinaloensis presentó de los ácidos grasos saturados, que se
encontraron en menor proporción a excepción del ácido palmítico (22.33%), ácido
esteárico (5.138%), ácido valérico (0.926%) y el ácido araquídico (0.917%). Ácido
linolénico (22.644%) y ácido linoleíco (8.271%) de los ácidos grasos
poliinsaturados.
91
En Maytenus phyllanthoides, de los ácidos grasos saturados se encontraron
ácido palmítico mayoritariamente (40.137%) y ácido esteárico (2.138%). De los
ácidos poliinsaturados están presentes los ácidos linolénico (5.04%) y linoleíco
(6.04%).
De las cuatro especies de plantas estudiadas, se encontró que en tres de
ellas Argemone mexicana, Bignonia unguis-cati y Diospyros sinaloensis, el ácido
graso poliinsaturado ácido linolénico se encontró en mayores cantidades. A
diferencia de Maytenus phyllanthoides que se encontró en bajas cantidades, no
así el ácido palmítico que se presento en altas cantidades.
La composición de ácidos grasos de Argemone mexicana, Bignonia unguis-
cati, Diospyros sinaloensis y Maytenus phyllanthoides no se ha reportado con
anterioridad en la literatura.
92
IX. Conclusiones
Se logró la identificación y cuantificación de metabolitos: ácidos grasos y
algunos alcaloides presentes en Argemone mexicana, Bignonia unguis-cati,
Diospyros sinaloensis y Maytenus phyllanthoides por Cromatografía de gases
acoplado a espectrometría de masas (CG-EM).
Se identifico un alcaloide de tipo furoquinolona, conocida como ϒ- fagarina,
en hojas secas y frescas de Argemone mexicana y Diospyros sinaloensis, usando
metanol y diclorometano como solventes de extracción, siendo en Diospyros
sinaloensis en fresco donde se encontró en mayor cantidad usando
diclorometano, siendo este el solvente con el que mejores resultados se
obtuvieron.
Se identificaron nueve ácidos grasos en las diferentes especies de este
estudio siendo estos; el ácido palmítico, ácido linoleíco, ácido linolénico, ácido
tridecílico, ácido behenico, ácido araquídico, ácido elaidico, ácido esteárico y ácido
valérico, de los cuales los ácidos grasos esenciales linoleíco y linolénico se
encontraron en Argemone mexicana, Bignonia unguis-cati, Diospyros sinaloensis y
Maytenus phyllanthoides, siendo en Argemone mexica donde predomino en
cantidad el ácido linolénico.
93
Los resultados obtenidos sugieren que las plantas analizadas son fuente de
compuestos naturales de fármacos, antimicrobianos y de plaguicidas por lo tanto,
pueden ser explotados para desarrollar tecnologías que permitan la producción de
productos naturales a gran escala y así proteger los cultivos, evitando las pérdidas
de producción de alimentos necesarios para una población en constante aumento,
así como en la elaboración de antibióticos para combatir enfermedades de origen
bacteriano que afectan a la población en general.
Los metabolitos secundarios contenidos en los extractos de las plantas
incluyen una amplia variedad de ingredientes activos que tienen acción
nematicida, fungicida bactericida y plaguicida como alcaloides, terpenoides y otros
compuestos.
Estos resultados aportan evidencia que nos permitirá continuar con los
estudios tendientes a purificar la muestra e intentar aislar el o los principios
activos.
94
X. Glosario
Ácido graso. Biomolécula orgánica de naturaleza lipidica formada por una larga
cadena hidrocarbonada lineal, de número par de átomos de carbono, en cuyo
extremo hay un grupo carboxilo. Cada átomo de carbono se une al siguiente y al
procedente por medio de un enlace covalente sencillo o doble.
Actinomorfica. Dicho de una flor, que tiene más de dos planos de simetría.
Acuminado. Largamente agudo, terminado en punta larga.
Adventicia. Dicho de un órgano, especialmente una raíz, que se desarrolla a
partir de un tejido adulto, no de un tejido embrional o meristemático. Que utilizan
algunas plantas para trepar o para extenderse por la superficie del suelo.
Alcaloide. Compuestos con anillos nitrogenados producidos por las plantas que
son fisiológicamente activos en los vertebrados. Muchos alcaloides tienen un
sabor amargo y algunos son venenosos.
Ápice. Extremo superior de la planta en el que se localiza el meristemo.
Cima. Inflorescencia en la que el extremo de la rama florífera acaba en una flor y
las restantes flores proceden de ramas laterales.
Cromatografía. Es un método de separación para la caracterización de mezclas
complejas. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención
selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla,
permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.
Cromatografía de gases. Es una técnica cromatográfica en la que la muestra se
volatiza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se
produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos
de cromatografía, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su
única función es la de transportar el analito a través de la columna.
Cromatograma. Registro producido por Cromatógrafo de gas/ líquido.
Deciduas. Plantas que pierden sus hojas en una época determinada del año.
Dehiscente. Son aquellos frutos que se abren al madurar y dejan escapar las
semillas.
Elongado. Alargado
95
Esterificación. Proceso por el cual se sintetiza un éter.
Estípula. Apéndice generalmente laminar que aparece con frecuencia en la base
de las hojas de muchas especies.
Expectorante. Fármaco que tiene propiedades de provocar la expectoración.
Extracto. Esencia o disolución concentrada de una sustancia obtenida de una
planta u otra cosa. Estos preparados contienen grandes cantidades de
componentes, además de los principios activos.
Fasciculada. Dicho de una raíz, que, por atrofia de la principal, no tienen raíz
principal; está constituida por un manojo de raicillas del mismo o parecido grosor.
Fitoquímica. Es una disciplina científica que tiene como objeto el aislamiento,
análisis, purificación, elucidación de la estructura y caracterización de la actividad
biológica de diversas sustancias producidas por los vegetales.
Foliolo. Cada una de las láminas foliares de una hoja compuesta.
Glabro. Dicho de una estructura vegetal o micótica, carente de pilosidad o
glándulas.
Grupo amino. Grupo funcional derivado del amoníaco o alguno de sus derivados
alquilados por eliminación de uno de sus átomos de hidrógeno.
Grupo carbonilo. Que consiste en un átomo de carbono con un doble enlace a un átomo de oxígeno. La palabra carbonilo puede referirse también al monóxido de carbono como ligando en un complejo inorgánico u organometálico.
Hipogeo. Dícese de la planta o parte de ella que se desarrolla bajo la superficie de
la tierra.
Imbricado. Dicho de una serie de hojas o de piezas florales, que, estando muy
próximas, llegan a cubrirse por los bordes.
Inflorescencia. Sistema de ramificación o agrupación de flores.
Lanceolado. Que tiene forma de lanza, es decir con forma elíptica y alargada,
además estrechado en el ápice y la base.
Látex. Líquido generalmente lechoso de color blanco, aunque puede ser amarillo
o de otros colores, que fluye de algunas partes del carpófago.
96
Metabolismo secundario. En bioquímica se denomina a aquél conjunto de reacciones bioquímicas que se producen de forma paralela al metabolismo primario vertebrador de la biología celular. Si bien las rutas metabólicas básicas están muy conservadas entre especies, el metabolismo secundario, pese a que es también vital para la supervivencia del organismo, muestra una variación mayor.
Metabolito secundario. Compuestos orgánicos sintetizados por el organismo que no tienen un rol directo en el crecimiento o reproducción del mismo. A diferencia de lo que sucede con los metabolitos primarios, la ausencia de algún metabolito secundario no le impide la supervivencia, si bien se verá afectado por ella, a veces gravemente.
Metilación. Adición de un grupo metilo a una molécula.
Oliguria. Disminución en la excreción de orina.
Pedicelado. Provisto de pedicelo.
Perenne. Dicho de una hoja o del follaje de una planta, que se mantiene sobre ella durante más de dos años.
Pistilo. Órgano con frecuencia con forma de botella, compuesto por un carpelo o por varios carpelos soldados, en el que suele distinguirse el ovario, donde se encuentran los óvulos que darán lugar a las semillas, el estilo y el estigma.
Principio activo. Es aquella sustancia con actividad farmacológica extraída de un organismo vivo. Una vez purificada y/o modificada químicamente, se le denomina fármaco.
Saponificación. Es una reacción química entre un ácido graso y una base o álcali, en la que se obtiene como principal producto la sal de dicho ácido y de dicha base. Estos compuestos tienen la particularidad de ser anfipáticos, es decir tienen una parte polar y otra apolar (o no polar), con lo cual pueden interactuar con sustancias de propiedades dispares.
Zarcillo. Órgano filamentoso, considerado como una hoja o rama modificada empleado en ciertas plantas, que se enrolla a diversos soportes y que ciertas plantas utilizan para trepar.
97
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