analisis mikrobiologi farmasiffar.usu.ac.id/images/buku_penuntun_laboratorium/buku...laboratorium...

LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

1 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I

PENUNTUN PRAKTIKUM

ANALISIS MIKROBIOLOGI

FARMASI

Tim Penyusun:

Dr. Marline Nainggolan, M.S., Apt.

Popi Patilaya, S.Si., M.Sc., Apt.

Imam Bagus Sumantri, S.Si., M.Si., Apt.

Dra. Erly Sitompul. M.Si., Apt.

Dr. Panal Sitorus, M.Si., Apt.

LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI)

FARMASI

PROGRAM STUDI S1-REGULER-INTERNASIONAL

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UITARA

MEDAN 2019



BIODATA PRAKTIKAN

Pas

Foto

3x4

Terbaru

(tidak boleh foto

Berpakaian seragam

Sekolah)

Nama Lengkap : ................................................................

NIM : ................................................................

Hari Praktikum : ................................................................

Gelombang : ................................................................

Kelompok : ................................................................

Asal Sekolah : ................................................................

Tanda tangan :



PERCOBAAN I

UJI ANGKA LEMPENG TOTAL BAKTERI PRODUK HERBAL

Tujuan Instruksional

Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analis

Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:

a) Melakukan pemeriksaan cemaran mikroba pada produk herbal berdasarkan

angka lempeng total;

b) Membandingkan hasil pemeriksaan dengan standar WHO dan Depkes RI.

Alat

Cawan petri, mat pipet, Erlenmeyer, gelas ukur, jarum ose, pipet mikro, neraca

analitik, tabung reaksi, stomaker, dan colony counter.

Bahan

Plate Count Agar (PCA), Peptone Dilution Fluid (PDF), air suling, dan produk

herbal yang beredar di Kota Medan.

Prosedur

Timbang 1 gram sampel dan pindahkan secara aseptic ke dalam tabung steril,

tambahkan 10 mL air suling steril. Homogenkan sehingga diperoleh suspensi

dengan pengenceran 10-1 dan saring dengan kertas saring steril. Ambil 1 mL filtrat

dan encerkan secara bertingkat dengan PDF hingga diperoleh suspensi

pengenceran 10-2 dan 10-3. Tuang 0,1 mL dari masing-masing pengenceran ke

dalam 15 – 20 mL media PCA pada cawan petri, homogenkan (buat duplo). Buat

uji blanko untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer. Setelah media

memadat, inkubasi seluruh cawan pada suhu 35 – 37oC selama 24 – 48 jam dengan

posisi dibalik. Amati dan hitung jumlah koloni yang tumbuh.

Interpretasi

1. Pilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni

antara 30 -300. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung, lalu

dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai angka

lempeng total dalam tiap mL contoh.



2. Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni 30 atau 300.

Hitung jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan faktor

pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai angka lempeng total dalam tiap mL

contoh.

3. Jika terdapat cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan

menunjukkan jumlah koloni 30 – 300, maka hitung jumlah koloni dari masing

– masing tingkat pengenceran kemudian dikalikan dengan faktor

pengencerannya. Apabila hasil perhitungan pada tingkat yang lebih tinggi

diperoleh jumlah koloni rata-rata lebih besar dari dua kali jumlah koloni rata-

rata dari pengenceran dibawahnya, maka angka lempeng total dipilih dari

tingkat pengenceran yang lebih rendah (missal pada pengenceran 10-2 jumlah

koloni rata-rata 140, pada pengenceran 10-3 jumlah koloni rata-rata 32, maka

dipilih jumlah koloni 140 x 102).

4. Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih tinggi diperoleh jumlah

koloni rata-rata kurang dari 2 kali jumlah koloni rata-rata pada pengenceran di

bawahnya, maka angka lempeng total dihitung dari rata-rata jumlah koloni

kedua tingkat pengenceran tersebut. Misal, pada pengenceran 10-2 jumlah

koloni rata-rata 293, pada pengenceran 10-3 jumlah koloni rata-rata 41, maka

angka lempeng total adalah:

293 + 41

2 𝑥 103 = 167 𝑥 102

5. Bila tidak ada satupun koloni tumbuh dalam cawan, maka angka lempeng total

dinyatakan sebagai < dari satu dikalikan faktor pengenceran terendah.

6. Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni lebih dari 300, dipilih cawan

dari tingkat pengenceran tertinggi kemudian dibagi menjadi menjadi beberapa

sector (2,4 atau 8) dan dihitung jumlah koloni dari satu sector, angka lempeng

total adalah jumlah koloni dikalikan dengan jumlah sector, kemudian dihitung

rata-rata dari kedua cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran.

7. Jika jumlah koloni rata-rata dari ¼ bagian cawan lebih dari 200, maka angka

lempeng total dinyatakan lebih besar dari 200 x 8 dikalikan dengan faktor

pengenceran.

8. Perhitungan dan pencatatan hasil angka lempeng total hanya ditulis dalam dua

angka. Angka berikutnya dibulatkan ke bawah bila kurang dari lima dan



dibulatkan ke atas bila lebih dari lima. Sebagai contoh 523 x 103 dibulatkan

menjadi 52 x 104, sedangkan 83,6 x 103 dibulatkan menjadi 84 x 103.

9. Jika dijumpai koloni “spreader” meliputi seperempat sampai setengah bagian

cawan, maka diitung koloni yang tumbuh di luar daerah “spreader”. Jika 75%

dari seluruh cawan mempunyai koloni “spreader” dengan keadaan di atas,

maka dicatat sebagai “Spr”. Untuk keadaan ini harus dicari penyebabnya dan

diperbaiki cara kerjanya (pengujian ulang).

10. Jika dijumpai “spreader” tiper rantai, maka tiap satu deret koloni yang terpisah

dihitung sebagai satu koloni, dan bila dalam kelompok “spreader” terdiri dari

beberapa rantai dihitung sebagai satu koloni.



PERCOBAAN II

UJI ANGKA KAPANG DAN KHAMIR SIMPLISIA




a) Melakukan pemeriksaan angka kapang dan khamir pada simplisia;

b) Membandingkan hasil pemeriksaan dengan standar WHO dan Depkes RI

Alat

Cawan petri, mat pipet, erlenmeyer, gelas ukur, jarum ose, pipet mikro, neraca

analitik, tabung reaksi, stomaker, dan colony counter.

Bahan

Potato Dextrose Agar (PDA), Peptone Dilution Fluid (PDF), Air suling agar (ASA),

dan simplisia tumbuhan.

Prosedur

Timbang 1 gr sampel dan pindahkan secara aseptik dalam tabung steril. Tambahkan

10 mL PDF, sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10-1, saring dengan

kertas saring steril. Encerkan filtrat hingga diperoleh larutan pengenceran 10-2, 10-

3. Ambil 0,5 mL dari masing-masing pengenceran, dituangkan pada permukaan

PDA, sebarkan hingga merata dan dibuat duplo. Inkubasi seluruh cawan pada suhu

20 - 25oC. Amati pertumbuhan kapang/khamir pada hari ke-3 sampai hari ke-5.

Koloni khamir (ragi) memiliki bentuk bulat kecil, putih, hampir menyerupai

bakteri. Hitung jumlah koloni yang tumbuh.

Perhitungan

Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni

antara 10-150. Jumlah koloni dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan

faktor pengencerannya. Bila pada cawan petri dari dua tingkat pengenceran yang

berurutan menunjukkan jumlah antara 10-150, maka dihitung jumlah koloni dan

dikalikan dengan faktor pengenceran, kemudian diambil angka rata-ratanya. Hasil

dinyatakan sebagai angka kapang dan khamir dalam tiap gram sampel.

tel:10150

tel:10150



Untuk beberapa kemungkinan lain yang berbeda dari pernyataan diatas, maka

diikuti petunjuk berikut:

i. Bila hanya salah satu diantar kedua cawan petri dari pengenceran yang sama

menunjukkan jumlah antara 10-150 koloni, dihitung jumlah koloni dari kedua

cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran.

ii. Bila pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah koloni pada

pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran terendah.

iii. Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satupun yang menunjukkan jumlah

antara 10-150 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran.

iv. Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan disebabkan karena

faktor inhibitor, maka Angka Kapang dan Khamir dilaporkan sebagai kurang

dari satu dikalikan faktor pengenceran terendah.

Persyaratan

Angka Kapan dan Khamir jamur bentuk serbuk tidak lebih dari 104 koloni per gram

bahan uji.

tel:10150



PERCOBAAN III

UJI ANGKA STAPHYLOCOCCUS AUREUS DALAM SARI BUAH


Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analisis

Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk :

a) Melakukan pemeriksaan angka Staphylococcus aureus pada simplisia


Alat

Pipet ukur mulut besar, batang gelas bengkok, alat hitung koloni.

Bahan

Brain heart influsion broth (BHIB), Brain Parker agar-emulsion yolk (BPA-EY),

buffered pepton water (BFW), plasma kelinci, 5% emulsi kuning telur (EY) dalam

larutan Nacl (1:1).

Prosedur :

Prosedur Penyiapan Sampel

Ambil 10 ml sampel dan masukkan ke dalam erlenmeyer steril. Tambahkan 90 ml

BPW, kocok hingga diperoleh suspensi homogen dengan pengerceran 10-1, Siapkan

2 tabung yang masing-masing telah diisi dengan 9 ml BPW.Ambil 1 ml

pengenceran 10-1 ke dalam tabung yang berisi 9 ml BPW hingge diperoleh suspensi

dengan pengenceran 10-2, kocok sampsi homogen. Buat pengenceran berikutnya

hingga 10-3, Dari sampel langsung dan dari setiap pengenceran dipipet 0,25 ke

cawan petri berisi 15-20 ml media BPA-EY yang telah memadat dan dibuat duplo.

Segera sebar ratakan suspensi dengan menggunakan batang gelas bengkok. Biarkan

beberapa saat sampai inokulum terserap dalam media. Untuk mengetahui sterilitas

pengencer dan media membuat uji blangko. Masukkan 0,25 ml pengencer pada satu

cawan berisi media BPA-EY yang telnh me.uadat, lalu disebar ratakan dengan

batang gelas bengkok. Cawan yang lain hanys dipenuhi media BPA-EY. Inkubasi

semua cawan petri pada suhu 35-37oC "selama 24-48 jam. Setelah 24 jam, pilih

cawan dengan jumlah antara 20-200 koloni berwarna hitam mengkilat dengan

garis-garis berwarna disekelilingnya. Posisi koloni pilih tarda dan inkubasi tambah

selai. yang tumbuh selama periode inkubasi dengan ciri-ciri seperti diatas. Bila dari

pengenceran terendah diperingkat jumlah koloni spesifik <20, maka dapat

digunakan untuk uji konfirmasi. Sedangkan bila dari pengenceran.

Tertinggi diperoleh jumlah koloni spesifik >200 , maka dapat digunakan untuk uji

konfirmasi.

Konfirmasi

pilih 10 koloni yang mengandung sebagai Staphylocoocus aureus, masing-masing

diinokulasikan ke dalam tabung berisi BHIB. Inkubasi pada suhu 35oC-37oC"

selama 20-24 jam. Pipet 0,1 ml biakan BHIB ke dalam tabung reaksi steril,

tambahkan 0,3 ml plasma kelinci, inkubasi pada suhu 35o-37oC" selama 4-6 jam.



Amati adanya koagulasi plasma. Jika teriadi kongulasi maka dinyatakan

Staphylococcus aureus positif.

Perhitungan

Hitung Jumlah sampel yang diperhitungkan berdasarkan persentase koloni uji yang

dikonfirmasikan sebagai Staphylocoorus aureus, dikalikan 4 dan faktor

pengenceran. Misalnya penghitungan koloni dinyatakan dengan pada pengenceran

10-2 adalah 56. Dari koloni yang dikonfirmasi , 9 koloni dinyatakan sebagai

Staphylococcus aureus. Maka jumlah Staphylococous aureus per ml contoh

dihiyung menggunakan rumus:

JB- jumlah koloni x rasio konfirmasi x faktor koreksi x faktor pengenceran

JB = 56x (910) x (1 / 0,25) x 100

= 56 x 9 x 4 x 10

= 20160 koloni = 2x 104 koloni

Pernyataan

Minimum sari buah tidak diperbolehkan mengandung bakterl staphylococcus

aureus atau dengan kata lain angka Staphylccoccus aureus adalah 0 koloni per ml.



PERCOBAAN IV

UJI PSEUDOMONAS AERUGINOSA

DALAM SEDIAAN PENCUCI MATA



Farmasi dan Makanan Fakuktas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:

a) melakukan pemeriksaan Pseudomaras aerugirosa dalam sediaan pencuci mata,

b) Membandingkan hasil pemeriksaan dengan standar WHO dan Depkes RI .

Alat

Lampu ultraviolet, suhu udara 41oC, batang kaca bengkok, dan tabung reaksi

Bahan

Cetrimide agar (CETA), Pseudomonas agar P (PAP), nutrien agar (NA), tryptic soy

broth (TSB). Letheen broth (LB) atau fluid casein digest soy lecithin polysorba te

(FCDSLP), kloroform, dan BB-N’N '- tetrametil-p-fenilen-diamin dihidroklorida

0,5%.

Prosedur

Homogenisasi Sampel

Ambil secara aseptik 10 ml sampel dan masukkan ke dalam wadah steril yang

sesuai. Tambahkan 9 mi LB, kocok homogen hingga diperoleh suspensi dengan

pengenceran 10-1.

Pengkayaan

Dari suspensi pengenceran 10-1 dipipet 10 ml kecalam 90 ml TSB, 1 ml ke dalarm

10 ml TSB dan 0,1 ml ke dalam 10 ml TSB dan kernudian semuanya diinkubasi

pada suhu 35oC-37oC "se3lama 48 jam.

Isolasi

Ambil 1 sangkelit biakan pengkayaan yang menunjukkan pertumbuhan positif ,

goreskan atau seharkan pada permukaan media lempeng CETA. inkubasi pada suhu

35-37°C selama 48-72 jam. Amati adanya pertumbuhan koloni spesifik berwarna

kehijauan. Selanjutnya buat suspensi pekat dalam 0,5 ml TSB, inokulasikan pada

media lempeng PAP , PAF dan NA miring. Inkubasi semua media pada suhu 35oC-

37oC selama 24 jam untuk NA miring, 72 jam untuk PAP dan PAF. Lakukan juga

uji terhadap biakan kontrol positif Pseudomonas aeruginosa

Konfirmasi

Uji Pigmen

a) Biakan PAP yang berwarna kuning kehijauan akan berfluorosensi kekuningan

di bawah sinar ultra violet. Ambil lebih kurang 1 gram biakan berpigmen,

masukkan ke dalam tabung reaksi, tambahkan 2 ml air suling, kocok kuat.



Kemudian tambahkan 2 ml kloroform dan kocok lagi. Pigmen fluoresin larut

dalam air dan tidak larut dalam kloroform.

b) Biakan PAP yang berwarna hijau kebiruan akan berfluoresensi kebiruan di

bawah sinar ultra violet. Ambil lebih kurang 1 gram biakan berpigmen,

masukkan ke dalam tabung reaksi, tambahkan 2 ml air suling, kocok kuat.

Kemudian tambahkan 2 ml kloroform dan kocok lagi. Pigmen piosianin larut

dalam air dan kloroform.

Uji Oksidase

Ambil 1 sangkelit biakan dari tabung NA miring, kemudian totolkan pada kertas

sitokrom atau kertas saring yang telah diimpregnasi (dijenuhkan) dengan N, N-

N’N’ tetrametil-p-fenilendianin dihidroklorida 0,5%. Pembentukan warna merah

muda yang beruban menjadi ungu membuktikan uji oksidase positif.

Uji Mengukur Suhu 41oC

Ambil 1 sengkelit biakan dari NA miring, diinokulasikan pada media TSB dan

inkubasi pada suhu 41oC selana 24-48 jam. Jike terjadi kekeruhan menunjukkan

pertumbuhan positif.

Uji Milcroskopik

Buat pewarnaan gram dari biakan NA miring dan ditangkap dengan mikroskop.

Tabel 1. Ciri-ciri Pseudomonas aeruginosa

Hasil Pengamatan Media

Koloni

Fluorosensi UV

Uji Pigmen

Uji Oksidase

Uji Pertumbuhan suhu

41oC

CETA PAF PAP

Kehijauan

Kehijauan

--

Hijau

Kekuningan

Kekuningan

Larut dalam air,

Tidak larut

dalam

kloroform

Hijau Kebiruan

Kebiruan

Larut dalam air

dan kloroform

Positif

Positif

Pewarnaan Gram Gram negatif , berbentuk batang pendek

Pernyataan Hasil

Jika dari ketiga biakan TSB diperoleh hasil seperti tersebut diatas , maka dinyatakan

pseudomonas aeruginosa positif dalam tiap 1,0; 0,1; dan 0,01ml sampel.

Persyaratan

Sediaan pencuci mata tidak boleh mengandung pseudomonas aeruginosa (negatif

per 0,01 ml).



PERCOBAAN V

UJI SALMONELLA DALAM BUBUR BAYI



farmasi dan Makanan fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:

a) Melakukan identifikasi Salmonella dalam bubur bayi;


Alat

Bahan

Lactose broth (LB), tetrathionate brilliant green broth (TBGB), selenite cysteine

broth (SCB), brilliant green agar (BGA), bismuth sulfite agar (BSA), triple sugar

iron agar (TSIA), lisin iron agar (LIA) , nutrient agar (NA), pepton dilution fluid

(PDF), larutan natrium klorida 0,805%, salmonella antisera polivalen 0, produk

bubur bayi.

Prosedur

Pra-pengkayaan

Timbang 25 g sampel ke dalam kantong stomaker steril, tambahkan 225 ml PDF.

Homogenkan menggunakan stomaker selama 30 detik kemudian ambil 10 ml dan

masukkan ke dalam 90 ml LB. Inkubasi pada suhu 35°-37° selama 18-24 jam.

Pengkayaan

Ambil 10 ml biakan pra-pengkayaan, masukkkan masing-masing ke dalam 100 ml

media TBGB dan 100 ml SCB. Inkubasi pada 43°C selama 24 jam.

Isolasi

Inokulasi 1 sengkelit dari setiap biakan TBGB dan SCB pada permukaan BGA dan

BSA. Inkubasi pada suhu 35°-37° C selama 24-48 jam. Amati koloni yang tumbuh.

Biakan diduga mengandung Salmonella jika:

Pada BGA: koloni dari tidak berwarna, merah muda hingga merah, dari translusen

hingga keruh (opaque) dengan lingkaran merah muda hingga merah.

Pada BSA: koloni berwarna cokelat abu-abu sampai hitam dan kadang-kadang

dengan kilap logam. Warna media di sekitar koloni mula-mula

coklat, jika masa inkubasi ditambah warna koloni menjadi hitam.

Identifikasi

Pilih dua atau lebih koloni spesifik pada BGA dan BSA. Inokulasi pada media NA,

TSIA, dan LIA dengan cara tusukan dan goresan. Inkubasi pada 35°-37°C selama

24 jam. Biakan diduga mengandung Salmonella jika:



Pada TSIA: terlihat warna merah pada permukaan miring, warna kuning pada

biakan di dasar tabung dengan atau tanpa pembentukan hidrogen

sulfida (hitam).

Pada LIA: terlihat warna ungu lebih tua, diseluruh biakan.

Uji Serologi

Ambil 1 sengkelit biakan dari biakan NA miring dan suspensikan dengan 1 tetes

laruatan NaCl 0,85% pada kaca objek. Jika terjadi aglutinasi spontan, suspense

tersebut tidak dapat digunakan untuk uji serologi. Jika tidak, teteskan antisera

Salamonella polivalen O pada suspensi. Kemudian homogenkan dengan cara

menggoyang kaca objek atau mengunakan sengkelit. Amati selama 1 menit jika

terjadi aglutinasi menunjukkan bahwa Salmonella positif.



PERCOBAAN VI

ANALISIS ANGKA PALING MUNGKIN PRODUK MINUMAN


Setelah mengkuti proyek ini, mahasiswa Program Studi Diploma IIl Analis Farmasi

dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:

a) Melakikan pengujian angka paling mungkin pada produk minuman;

b) Menghitung angka paling mungkin pada produk minuman;

c) Menginterpretasi angka paling mungkin pada produk minuman.

Alat

Stomaker, pipet ukur mulut lebar, tabung reaksi dilengkapi tabung Durham.

Bahan

Peptone Dilution Fluid (PDF), MacConkey Broth (MCB). Brilliant Green Lactose

Bile 2% Broth (BGB), produk minuman.

Prosedur

Timbang 25 ml cuplikan sampel danpindah secara aseptic ke dalam kantong

stomaker plastik steril. Tambahkan 225 ml Pepton Dilution Fuid (PDF) dan kocok

hingga diperoleh suspensi homogen dengan pengenceran 10-1. Buat pengenceran

bertingkat dalam tabung reaksi berisi 9 ml PDF hingga diperoleh suspensi dengan

pengenceran 10-2 dan 10-3.

Uji Presumtif

Siapkan 3 tabung reaksi berisi 9 ml MCB yeng dilengkapi tabung Durham untuk

setiap pengenceran. Ke dalam tabung dari masing-masing seri masukkan 1 ml

suspensi pengenceran. Inkubasi semua tabung pada suhu 37°C selama 24-48 jam.

Setelah inkubasi, catat dan amati ada tidaknya gas dalam tabung Durham pada tiap

tabung reaksi. Kemudian lanjutkan inkubasi hingga 48 jam dan catat tabung-tabung

yang menghasilkan gas.

Uji Konfirmasi

Pindahkan 1 sengkelit biakan dari tabung yang menunjukkan uji presumtif positif

ke dalam tabung reaksi berisi 10 ml BGLB yang telah dilengkapi dengan tabung

Durham. Inkubasi seluruh tabung pada suhu 37°C selama 24-48 jam. Amati ada

tidaknya gas pada tabung Durham.

Interpretasi

Catat jumlah tabung yang menghasilkan gas dari uji konfirmasi dan rujuk ke Tabel

MPN. Angka yang diperoleh pada Tabel MPN menyatakan jumlah bakteri koliform

dalam tiap gram atau tiap ml contoh yang diuji.



Tablel MPN (Cara 3 Tabung)

Indeks MPN dan batas kepercayaan 95% bila digunakan 3 tabung

Catatan:

Bila seri pengenceran yang digunakan melebihi dari yang tertera pada Tabel MPN,

maka hasil yang diperoleh dari Tabel dikalikan factor 10, 100, 1000, dan seterusnya.

Misal: Bila yang dipilih adalah dari pengenceran 10-2, 10-3,10-4 maka hasilnya

dikalikan dengan 10. Bila yang dipilih adalah pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-5

maka hasil dikalikan 100.

Jumlah Tabung

Positif

MPN per g/ml Batas Kepercayaan 95%

1:10 1:100 1:1000 Terendah Tertinggi

0 0 0 <3 -- --

0 0 1 3 <0,5 9

0 1 0 3 <0,5 13

1 0 0 4 <0,5 20

1 0 1 7 1 21

1 1 0 7 1 23

1 1 1 11 3 36

1 2 0 11 3 36

Jumlah Tabung

Positif

MPN per g/ml Batas Kepercayaan 95%

1:10 1:100 1:1000 Terendah Tertinggi

2 0 0 9 1 36

2 0 1 14 3 37

2 1 0 15 3 44

2 1 1 20 7 89

2 2 0 21 4 47

2 2 1 28 10 150

3 0 0 23 4 120

3 0 1 39 7 130

3 0 2 64 15 380

3 1 0 43 7 210

3 1 1 75 14 230

3 1 2 120 30 380

3 2 0 93 15 380

3 2 1 150 30 440

3 2 2 210 35 470

3 3 0 240 36 1300

3 3 1 460 71 2400

3 3 2 1100 150 4800

3 3 3 >2400 -- --



PERCOBAAN VII

IDENTIFIKASI BAKTERI PADA KEMASAN MINUMAN




a) Melakukan identifikasi bakteri menggunakan pengecetan Gram;

b) Mendeskripsikan morfologi bakteri pencemar pada kemasan minuman kaleng;

Alat

Gelas objek, jarum ose, Bunsen, botol air suling, pinset, dan mikroskop.

Bahan

Produk minuman kaleng, nutrient broth, alkohol, gentian violet, lugol, safranin, air

suling, dan minyek imersi.

Prosedur

1. Bilassecara aseptic kemasan kaleng bagian atas dengan air suling steril dan

tampung Erlenmeyer steril, Ambil 1 ml cupliken dan dipindahkan secara aseptik

ke dalam tabung berisi nutrient broth. Inkubasi pada 35-37°C selama 24-48 jam.

2. Cuci gelas objek dengan alkohol 70% lalu difiksasi. Letakkan satu tetes air

suling pada gelas objek. Suspensikan satu ose sampel, ratakan dan fiksasi.

3. Tambahkan satu tetes gentian violet lalu tambahkan satu tetes larutan lugol

ratakan dan fiksasi. Cuci gelas objek dengan alkohol 70% sampai tetesan

terakhir tidak berwarna, keringkan.

4. Tambahkan satu tetes safranin, biarkan 15-30 detik, cuci larutan safranin

dengan air suling steril, keringkan. Tetesi dengan minyak imerei (imersi oil).

5. Lihat pada mikroskop dengan pembesaran 100 kali, amati warna dan bentuk

dari bakteri. Warna ungu / violet menunjukkan bakteri Gram positif, dan warna

merah jambu (pink) menunjukkan bakteri Gram negatif.



PERCOBAAN VIII

UJI STERILITAS


Seteah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analisis

Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki ketrampilan untuk :

A) Melakukan pengujian sterilitas sediaan farmasi dan alat kesehatan

B) Melakukan pengujian fertilitas media pertumbuhan

C) Menginterpretasi hasil uji sterilitas dan fertilitas

Alat

Tabung reaksi, pipet kamagome atau alat suntik, mat pipet, dan neraca analitik

Bahan

Fluid Thioglycollate Medium (FT), Tryptic Soy Broth (TSB), Etanol 70%, Larutan

Benzalkonium Klorida 0,2%, Biakan bakteri Bacillus subtilis dan Clostridium

sporagenes , Sediaan Farmasi steril

Prosedur

Uji Fertilitas Media

Siapkan 4 tabung berisi 15 mL FTM dan 2 Tabung berisi 15 mL TSB. Inokulasi

masing-masing 0,1 mL suspensi Bacilus subtilis ATCC 6633 (1000 Spora hidup

per ml) ke dalam 2 tabung FTM dan 0,1 mL suspensi Clostridium sporagenes NIHJ

(1000 sel hidup per mL) ke dalam 2 tabung FTM lainnya. Inokulasi 0,1 mL suspensi

Candida albicans NIHJ (1000 sel hidup per ml) masing-masing ke dalam 2 tabung

TSB. Pengujian ini dilakukan bersamaan dengan uji sterilitas. Tabung berisi FTM

diinkubasi pada suhu 35o-37oC dan tabung berisi TSB pada suhu 20-25oC selama

tidak kurang dari 7 hari.

Uji Sterilitas Media

Inkubasi 2 tabung berisi masing-masing media 15 mL FTM dan 15 mL TSB dari

bets yang sama pada suhu dan waktu yang sama dengan media yang digunakan

untuk uji sterilitas.

Cara Penetapan

Pengujian dilakukan dalam Laminar Airflow Cabinet yang sebelumnya telah

disucihamakan dengan etanol 70% atau larutan benzalkonium klorida 0,2% steril

dan telah dijalankan selama 30-60 menit. Ambil secara aseptic 2 bagian cuplikan

seberat 200-500 mg dari bagian paling dalam sampel atau keseluruhan sampel bila

ukurannya kecil. Masukkan masing-masing cuplikan ke dalam 100 mL FTM dan

100 mL TSB. Inkubasi media FTM pada suhu 35-37oC dan media TSB 20-25oC

selama tidak kurang dari 14 hari.

Pengamatan dan Penafsiran Hasil Uji

Tahap Pertama



Pada interval waktu tertentu dan pada akhir periode inkubasi, amati secara

makroskopis adanya pertumbuhan jasad renik di dalam semua tabung. Bila tida

terdapat pertumbuhan, makan dikatakan bahwa sampel memenuhi syarat fertilitas.

Bila terdapat pertumbuhan dan dapat dibuktikan dari pemantauan bahwa fasilitas

pengujian, bahan yang digunakan, prosedur pengujian dan control negatif atau

teknik aseptic digunakan tidak valid, makan hasil pengujian dinyatakan tidak abash

dan tahap pertama harus diulang. Bila terdapat pertumbuhan dan terbukti pengujian

tahap pertama abash, dilakukan tahap kedua.

Tahap Kedua

Jumkah sampel uji minimum dua kali jumlah sampel pada pengujian tahap pertama.

BIla tidak terdapat pertumbuhan jasad renik, maka dinyatakan sammpel memenuhi

syarat sterilitas. Bila terdapat pertumbuhan maka dinyatakan sampel tidak

memenuhi syarat sterilitas kecuali dapat dibuktikan bahwa tahap kedua tidak abash,

dalam hal ini pengujian tahap kedua dapat diulang dengan sampel dan cara yang

sama.

PERCOBAAN IX

UJI EFEKTIVITAS PENGAWET



Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memilik keterampilan untuk :

A) Melakukan pengujian efektivitas pengawet

B) Menentukan efektivitas pengawet terhadap bakteri uji

Alat

Vortex mixer, Cawan Petri, Alat penghitung Koloni, dan Neraca Analitik



Bahan

Tryptic Soy Agar (TSA), Potato Dextrose Agar (PDA), Lactose Broth (LB), Biakan

bakteri Staphylococcus aureus

Prosedur

Timbang 1 gram atau ambil 1 mL sampel, masukkan ke dalam wadah steril.

Tambahkan 00,1 ml suspensi inokulum bakteri Staphylococcus aureus dan

encerkan dengan LB hingga diperoleh pengenceran 10-1-10-6, ambil 1 mL dari

setiap pengenceran dan pindahkan secara aseptic ke dalam petri (masing-masing

duplo), tambahkan 15 ml media, homogenkan. Biarkan media memadat, kemudian

inkubasi cawan pada suhu 35-37oC selama 2 hari. Hitung jumlah koloni bakteri

pada hari ke 7, 14,21 dan 28.

Suatu pengawet dinyatakan efektif jika :

A) Pada hari ke-14 jumlah koloni bakteri tidak lebih dari 0,1% dari jumlah awal

B) Selama 14 hari pertama jumlah koloni ragi atau kapang sama dengan atau

kurang dari jumlah awal

C) Jumlah mikroba uji selama waktu tersisa dari 28 hari tetap atau kurang dari

bilangan yang disebut pada a) dan b)



PERCOBAAN X

UJI KOEFISIEN FENOL



Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki ketrampilan untuk :

a) Melakukan pengujian mutu desinfektan berdasarkan koefisien fenol

b) Menentukan koefisien fenol produk desinfektan

c) Menganalisis dan interpretasi efektivitas produk desinfektan

Alat

Tabung reaksi ukuran (20 x 150) mm dan (25 x 250)mm, sengkelit platina

diameter mata 4 mm

Bahan

Nutrien Broth, Nutrient Agar, Fenol Baku, Produk desinfektan, dan Biakan

Bakteri Salmonela typhi

Prosedur

Penyiapan Media

Buat media Nutrient Broth dengan melarutkan 10 gram Bacto Pepton, 5 gram

Beef Extract, 5 gram NaCl dalam 1 liter air suling, campur homogeny dan atur pH

6,8. Masukkan 10 mL media dalam tiap tabung dan sterilkan dalam autoklaf pada

121oC selama 15 menit.

Penyiapan Bakteri Uji

Biakan bakteri Salmonella typhi ATCC 6539 yang telah diinkubasi 48 jam pada

suhu 35-37oC dalam media NB, inkubasi pada suhu 35-37oC selama 24 jam.

Bakteri uji yang digunakan untuk uji koefisien fenol adalah biakan berusia 24 jam

dan telah mengalami peremajaan selama 3 kali dalam 3 hari berturut-turut, batas

maksimum peremajaan adalah 30 kali.

Penyiapan Larutan Fenol Baku

Timbang 50 gram Kristal fenol dalam gelas piala, larutkan dengan air suling

hingga 1 liter (Larutan A). Kadar fenol dari larutan dibakukkan dengan 0,1 N

KBr-KBrO3 dengan cara berikut : Pipet 25 mL larutan A ditambah air suling

hingga 500 mL, campur homogen (Larutan B). Pipet 15 mL laruta B ke dalam

Erlenmeyer bertutup, tambah 30 mL baku KBr-KBrO3 dan 5 mL HCL 0,1 N.

Segera tutup, kemudian kocok teratur selama 30 menit dan diamkan selama 15

menit. Buka sedikit tutup Erlenmeyer, tambahkan dengan cepat 5 mL larutan 20%

KI, usahakan tidak ada uap Br yang keluar, dan segera tutup rapat. Kocok dengan

hati-hati. Buka sedikit penutup Erlenmeyer, bilas bagian leher dengan sedikit air

sulit (larutan C), titrasi dengan 0,1 N Na2S2O3 (1 ml 0,1 N KBr-KBrO3 =

0,001569 gram fenol )



Kadar Fenol (%) = 30 – Vol .titer Na2S2O3 x 0,001569 x 1333 x 100

1000

30 : Volume larutan 0,1 N KBr-KBrO3 yang ditambahkan

0,001569 : Gram fenol ekivalen terhadap 1 mL 0,1 N Kbr-KBrO3

1333 : Faktor pengenceran

1000 : Volume larutan sediaan fenol baku

Larutan baku ini harus disimpan rapat dalam tempat yang sejuk dan terhindar dari

cahaya. Setelah diperoleh kadar fenol yang sebenarnya maka dibuat larutan fenol

baku 5% sebagai berikut :

Penyiapan Larutan Fenol Baku 5%

Timbang seksama 5 gram Kristal fenol baku sesuai kadarnya dalam 100 mL air

suling steril, kocok homogeny. Buat pengenceran 1 :80, 1 : 90, dan 1 :100 dalam

tabung steril ukuran (25 x 150)mm yang masing-masing berisi 5 ml air suling steril

Penyiapan Larutan Desinfektan Uji

Buat larutan desinfektan yang diencerkan sesuai dengan yang tertera pada etiket

kemasan atau buat sedemikian rupa sehingga berada pada kisaran pengenceran

dengan daya bunuh terhadap bakteri uji dalam waktu kontak 5 – 15 menit.

Pengenceran dibuat dalam tabung reaksi ukuran (25x150)mm dengan volume

masing-masing 5 Ml. Untuk larutan desinfektan uji dibuat 7 tingkat pengenceran.

Inokulasi

Siapkan rak tabung reaksi sesuai ukuran tabung dengan kapasitas 40 dalam 4

deretan. Deretan pertama untuk tabung fenol baku dan desinfektan. Deret ke-2,3,4

untuk tabung media NB untuk waktu kontak 5,10, dan 15 menit. Masukkan semua

tabung dan biakan bakteri uji ke dalam tangas air suhu 20oC dan biarkan selama 5

menit. Masukkan 0,5 mL suspensi bakteri uji ke dalam tiap tabung pengenceran

fenol baku dan desinfektan, kocok hingga homogeny. Waktu memasukkan bakteri

uji pada tabung pengenceran pertama dicatat sebagai 0 menit. Interval waktu

inokulasi antar tabung adalah 30 detik, sehingga untuk 10 tabung dapat diselesaikan

selama 4,5 menit, setiap kali inokulasi usahakan ujung pipet mendekati permukaan

cairan dan tidak menyentuh dinding tabung. Setelah 5 menit diinokulasi, segera

kocok tabung pertama, tabung dipegang dalam posisi miring ±60º di dekat nyala

api, tangan kanan memegang sengkelit platina. Pindahkan secara aseptik 1 sengkelit

suspensi ke dalam media NB deret ke 2 satu persatu dengan selang waktu 30 detik

sampai tabung ke 10. Setelah 10 menit dinokulasi, kocok tabung pengenceran

pertama, pindahkan 1 sengkelit suspensi dalam media NB deret ke 3 sama seperti

di atas. Setelah 15 menit diinokulasi kocok tabung pengenceran pertama, pindahkan



1 sengkelit suspensi ke dalam media NB deret ke 4. Kocok semua tabung yang telah

diinokulasi kemudian inkubasi pada suhu 35-37 ºC selama 43 jam dan amati

ada/tidaknya pertumbuhan bakteri pada setiap tabung. Jika ada pertumbuhan yang

masih meragukan maka dapat dilakukan konfirmasi dengan uji serologi.

Perhitungan

Koefisien fenol adalah hasil bagi dari faktor pengenceran tertinggi desinfektan

dengan faktor pengenceran tertinggi baku fenol yang masing-masing dapat

membunuh bakteri uji dalam masa kontak 10 menit tetapi tidak dalam masa kontak

5 menit (Lihat Tabel 1 dan 2),

Tabel 1. Contoh Hasil Pengamatan Baku Fenol

Pengenceran

Fenol Baku

Lama Kontak

5 menit 10 menit 15 menit

1:80 0 0 0

1:90 + 0 0

1:100 + + +

Tabel 2. Contoh Hasil Pengamatan Desinfektan

Pengenceran

Desinfektan

Lama Kontak


1:100 0 0 0

1:150 0 0 0

1:200 0 0 0

1:250 + 0 0

1:300 + + 0

1:350 + + +

1:400 + + +

Koefisien Fenol desinfektan = 250/90 = 2,77.

Pengujian dianggap memuaskan jika baku fenol memberikan hasil seperti pada

Tabel 3.

Tabel 3. Tabel Hasil Uji Baku Penol Yang Memenuhi Syarat

Pengenceran Lama Kontak


1:80 +/0 0 0

1:90 +/0 +/0 0

1:100 + + +/0



Bila dari dua pengenceran pertama dari baku fenol yang diuji tidak ada satupun

tabung pengenceran yang memberikan hasil positif dalam masa kontak 5 menit dan

memberikan hasil pertumbuhan negatif dalam masa kontak 10 menit, maka

diperkirakan bahwa pengenceran yang diharapkan berada di antara pengenceran

kedua (1:90) dan pengenceran ketiga (1:100). Lihat Tabel 4 dan 5.

Tabel 4. Contoh Hasil Perkiraan Uji Baku Fenol



1:80 0 0 0

1:90 0 0 0

1:100 + + 0

Tabel 5. Contoh Hasil Perkiraan Uji Desinfektan



1:300 0 0 0

1:350 0 0 0

1:400 + + 0

Jadi angka perkiraan untuk baku fenol antara 0 - 100, untuk desinfektan antara 50-

400. Koefisien fenol = 375/95 = 3,96.

Persyaratan

1. Jika koefisien fenol yang diperoleh dikalikan dengan faktor 20 menghasilkan

angka yang lebih kecil dari angka pengenceran yang tertera pada etiket, maka

desinfektan itu tidak memenuhi syarat.

2. Jika koefisien fenol yang diperoleh dikalikan dengan faktor 20 menghasilkan

angka yang sesuai dengan angka pengenceran yang tertera pada etiket, maka

desinfektan tersebut memenuhi syarat.



PERCOBAAN XI

UJI KEPEKAAN ESCHERICHIA COLI TERHADAP AMOKSILIN




a) Melakukan pengujian kepekaan mikroba terhadap antibiotik amoksilin

menggunakan metode Kirby-Bauer;

b) Menentukan zona hambat antibiotik amoksilin terhadap pertumbuhan mikroba;

c) Menginterpretasi kepekaan mikroba terhadap antibiotilk amoksilin.

Alat

Cawan petri, pencadang logam/gelas, pinset, labu tentukur, pipet volumetrik, dan

pipet mikro.

Bahan

Sediaan antibiotik uji dan amoksilin baku, Mueller-Hinton agar (MHA), air suling,

natrium klorida 0,99%, asan klorida 0,I N, biakan bakteri Escherichia coli.

Prosedur

Penyiapan Larutan Amoksilin

Timbang sediaan uji setara dengan 100 mg amoksilin, larutkan dalam HCI 0,1 N

dan cukupkan hingga 100 ml (konsentrasi 1.000 g/ml). Ambil secara aseptik 0,2

ml larutan tersebut dan encerkan dengan air suling hingga 10 ml untuk memperoleh

konsentrasi 20 μg/ml.

Penyiapan Inokulum E. Coli

Ambil sengkelit koloni E. coli dari biakan agar yang telah dinkubasi selama 24 jam.

Pindahkan ke dalam tabung berisi larutan NaCl 0,9%, kocok hingga terdispersi

secara merata. Encerkan secara bertahap hingga diperoleh inokulum yang

menghasilkan transmitan 25% pada panjang gelombang 580 nm.

Pengujian Kepekaan Antibiotik

Siapkan 2 cawan petri steril. Campurkan 0,1 ml inokulum bakteri dengan 15 ml

MHA dalam masing-masing cawan petri, homogenkan, kemudian biarkan sampai



media memadat. Tanam 4 cincin pencadang logam/gelas pada masing masing

cawan. Kemudian masukkan larutan antibiotik uji pada cawan petri, salah satu

cincin pencadang diisi dengan larutan blanko. Inkubasi pada suhu 36-37°C selama

18-24 jam. Setelah inkubasi, ukur diameter zona hambat di sekitar cincin pencadang

menggunakan jangka sorong.



PERCOBAAN XII

UJI POTENSI ANTIBIOTIK




a) Melakukan pengujian potensi antibiotik dengan metode lempeng silinder;

b) Menghitung potensi antibiotik terhadap mikroba;

c) Mengevaluasi mutu produk antibiotik berdasarkan monografi uji potensi

Farmakope Indonesia Edisi IV.

Alat

Cawan petri, pencadang logam/gelas, pinset, labu tentukur, pipet volumetrik, dan

pipet mikro

Bahan

Antibiotik uji dan baku (kloramfenikol dan tetrasiklin), nutrient agar, air suling,

natríurn klorida 0,9%, asam klorida 0,1 N, mikroba uji (Escherichia coli dan

Staphylococcus aureus)

Prosedur

Penyiapan Larutan Induk Baku (LIB) Kloramfenikol

Timbang teliti 1 g kloramfenikol baku, larutkan dalam air suling dan cukupkan

hingga 100 ml untuk memperoleh konsentrasi 10 μg/ml. Encerkan dengan air suling

(perbandingan 1:1,25) untuk memperoleh konsentrasi kloramfenikol 1,6; 2,0; 2,5;

3,125; dan 3,906 /ml.

Sİ (1,6 μg/mL) : ambil 1,600 ml LIB, encerkan dengan air suling hingga 10

ml.

S2 (2,0 μg/ml) : ambil 2,000 ml LIB, encerkan dengan air suling hingga 10

ml.


ml.


ml.




ml.

Penyiapan Larutan Induk Baku (LIB) Tetrasiklin

Timbang teliti 1 g tetrasiklin, larutkan dalam asam klorida 0,1 N dan cukupkan

hingga 100 ml (konsentrasi 10 μg /ml). Encerkan dengan air suling untuk

memperoleh konsentrasi 0,1536; 0,192; 0,24; 0,30; dan 0,375 μg/ml.


ml.

S2 (0.192 μg/ml) : ambil 0,192 ml LIB, encerkan dengan air suling hingga 10

ml.


ml.

S4 (0,30 μg/m) : ambil 0,300 ml LIB, encerkan dengan air suling hingga 10

ml.

S5 (0,375 μg/ml) : ambil 0,375 ml LB, encerkan dengan air suling hingga 10

ml.

Penyiapan Larutan Kloramfenikol Uji

Timbang sediaan setara dengan 1 g kloramfenikol, larutkan dalam air suling dan

cukupkan hingga 100 ml untuk memperoleh konsentrasi 10 μg/ml. Ambil secara

aseptik 2,5 ml larutan dan encerkan dengan air suling hingga 10 ml untuk

memperoleh konsentrasi kloramfenikol 2,5 μg/ml.

Penyiapan Larutan Tetrasiklin Uji

Timbang sediaan setara dengan 1 g tetrasiklin, larutkan dalam asam klorida 0,1 N

dan cukupkan hingga 100 ml (konsentrasi 10 μg/m1). Ambil secara aseptik 0,24 ml

dan encerkan dengan air suling hingga 10 ml untuk memperoleh konsentrasi

tetrasiklin 0,24 μg/ml.

Penyiapan Inokulum E. coli dan S. aureus

Ambil sengkelit koloni E. coli dan S. aureus dari biakan agar yang telah diinkubasi

selama 24 jam. Pindahkan ke dalam tabung berisi larutan NaCl 0.9%, kocok hingga



terdispersi secara merata. Encerkan secara bertahap hingga diperoleh inokulum

yang menghasilkan transmitan 25% pada panjang gelombang 580 nm.

Pengujian Potensi Antibiotik

Siapkan 5 cawan petri, ambil 0.1 ml biakan bakteri dan campur dengan 15 ml media

dalam masing-masing cawan, biarkan memadat. Tanamkan 7 pencadang

logam/gelas pada 4 cawan, masukkan 0,1 ml LIB kloramfenikol secara berselang-

seling dengan S3, 1 pencadang diisi dengan 0,1 ml air suling sebagai kontrol.

Tanamkan 7 pencadang logam/gelas pada 1 cawan sisa, isi dengan larutan

kloramfenikol uji (U3) dan LIB kloramfenikol (S3). Inkubasi pada 37ºC selama 24-

48 jam. Setelah inkubasi ukur diameter zona hambat. Prosedur yang sama dilakukan

terhadap tetrasiklin (Depkes, 1995).

analisis mikrobiologi farmasiffar.usu.ac.id/images/buku_penuntun_laboratorium/buku...laboratorium...

Documents