1Analitika biolokih lekova

2

Sadraj

Struktura proteina Bioloki lekovi definicija i karakteristike HPLC metode u analitici biolokih lekova Metode masene spektrometrije Primena mikrotalasnog zraenja Elektroforeza

31. Struktura proteina Primarna struktura odreena je sekvencom amino kiselina (oko 20) Sekundarna struktura trodimenzionalan oblik polipeptidnog lanca

Tercijarna struktura trodimenzionalna konformacija koja nastaje prostornim organizovanjem delova polipeptidnog lanca sa odreenom sekundarnom strukturomKvaternerna struktura povezivanje proteinskih subjedinica u agregate proteina

Primer heliksa

4

Primer primarne, sekundarne, tercijalne i kvaternerne strukture proteina

52. Bioloki lekovi

Bioloki lekovi ili biofarmaceutici proizvodi ije se aktivne komponente proizvode u ivim sistemima procesom kultivacije genetski modifikovanih mikroorganizama ili elija (bakterija, kvasaca, kao i elijskih kultura sisara).

6

Slini bioloki medicinski proizvodi ili biosimilari

predstavljaju bioloke lekove koji su slini sa drugim biolokim lekovima koji su ve odobreni za upotrebusadre aktivnu supstancu ija je patentna zatita istekla. proizvoa mora da pokae da je biosimilarni proizvod identian sa referentnim proizvodom u pogledu kljunih fiziko-hemijskih osobina i bioloke aktivnosti

proizvoa mora da pokae da je biosimilarni proizvod uporediv sa referentnim proizvodom u pogledu klinike bezbednosti i efikasnosti.

Slini a ne isti.

7Poreenje generikih lekova i slinih biolokih medicinskih proizvodaGeneriki lekovi Biosimilari

Molekulska masa Do priblino 5 kDa Izmeu 5 kDa i 500 kDaProizvodnja Hemijska sinteza

Jednostavna mikrobiolokafermentacija

Genetski modifikovaneelijske linijeSloeni postupcifermentacijeSloeni postupcipreiavanja

Analitika leka Standardna analitika leka Sloeni analitiki postupciPreklinike studije In vitro i in vivo

bioodreivanjeStudije toksinostiStudije lokalne tolerancije

Klinike studije Studije bioekvivalencije o apsorpciji

Studije bioekvivalencije o apsorpciji i eliminacijiStudije faze III Studije faze III b - IV Dugotrajnepostmarketinke studijePlan o upravljanju rizikom

Postupak za odobrenje Decentralizovan ilicentralizovan

Centralizovan postupak

8

9Za razliku od tradicionalnih lekova koji su molekule male molekulske mase sa jednostavnom hemijskom strukturom, supstance proizvedene biotehnolokim metodama su sloeni molekuli velike molekulske mase.

Analitika biolokih lekova predstavlja mnogo zahtevniji i sloeniji zadatak.

10

RanijeAnalitike tehnologije nisu bile dovoljno razvijene da omogue detaljnu fiziko-hemijsku karakterizaciju i poreenje sloenih molekula proteina

Konzistentnost kvaliteta proizvoda je u velikoj meri zavisila odkonzistentnosti i kontrole procesa proizvodnje

SadaNapredne tehnike za analitiku omoguile direktno detaljno poreenje kvaliteta i karakteristika biofarmaceutika.

11

3. HPLC metode u analitici biolokih

lekova

1. Size-exclusion chromatography hromatografija

zasnovana na razlikama u veliini molekula

2. Jonoizmenjivaka hromatografija

3. Reverzno-fazna tena hromatografija

4. Hromatografija hidrofobnih interakcija

5. Afinitetna hromatografija

12

Razdvajanje proteina na osnovu njihove razlike u veliinama molekula

Size-exclusion chromatography - hromatografija zasnovana na razlikama u veliini molekula

Najpre se eluiraju proteini velike molekulske mase a zatim proteini manje molekulske mase.

13

Znaajni faktori u razvoju metode: dodatak soli do odreene koncentracije smanjuje interakcije izmeu proteina i stacionarne faze

pH vrednost nia od 7,0 smanjuje mogunost nastajanja silanolnih anjona (uobiajen je dodatak pufera niskog molariteta i pH blizak fiziolokom 6,8) brzina protoka mobilne faze od 0,5 mL min.-1 do 1,0 mL min-1, pri niem protoku postie se bolje razdvajanje pikova Injekciona zapremina do 5% zapremine punjenja koloneKoncentracija uzorka poeljno je injektovati koncentrisane uzorke proteina vodei rauna da ne doe do precipitacije Prednost:Bioloka aktivnost proteina ostaje ouvana tokom analize.

14

Jonoizmenjivaka hromatografija

Zasniva se na reverzibilnim, elektrostatikim (ili jonskim) interakcijama izmeu naelektrisanih proteina/peptida u mobilnoj fazi i naelektrisanih jonoizmenjivakih grupa stacionarne faze

15

Proteini/peptidi normalno poseduju neto pozitivno ili neto negativno naelektrisanje zavisno od pH vrednosti mobilne faze.

Kiseli proteini i peptidi (pI < 6,0 ) razdvajaju se pomou anjonskih jonoizmenjivakih kolona jer su negativno naelektrisani.

Bazni proteini i peptidi (pI > 8,0) razdvajaju se pomou katjonskih jonoizmenjivakih kolona jer su pozitivno naelektrisani.

Isoelectric Point pI

16

Znaajni faktori u razvoju metode: pH vrednost mobilne faze - obino podeava se na vrednost koja se razlikuje bar za jednu pH jedinicu od pKa vrednosti jonoizmenjivake smole, kako bi 90 % kolone bilo jonizovano jonska jaina - soli koje ulaze u sastav puferskih rastvora daju jone koji moguda se kompetitivno sa proteinima/peptidima vezuju za jonoizmenjivake kolone. Ako se protein/peptid jako vezuje za jonoizmenjivaku kolonu, jon veeg afiniteta moe se iskoristiti da pobolja proces eluiranja. Neki uobiajeni joni koji se koriste u ove svrhe, predstavljeni u odnosu na njihovu relativnu jainu, su: Cs+ > K+ > NH4+ > Na+ i PO43- > CN- > HCOO- > CH3COO-.

Prednosti:Bioloka aktivnost proteina skoro uvek ostaje ouvana. Moe se upotrebiti za koncentrisanje razblaenih uzoraka proteina.

17

Reverzno-fazna tena hromatografija

Zasniva se na interakciji nepolarnih regiona proteina/peptida i stacionarne faze

18

Znaajni faktori u razvoju metode: odgovarajua veliina pora - za proteine koji imaju teinu veu od 10 kDa kolone sa veim porama (300 A) a za proteine sa teinom manjom od 10 kDa kolone sa manjim porama (150 A i manje) izbor kolone - C18 kolona se koristi za hidrofilne proteine/male peptide, a C4 ili C5 kolone se koriste za hidrofobne proteine/velike polipeptide upotreba jon-par reagenasa anjonski grade komplekse sa pozitivno naelektrisanim ostacima proteina dok katjonski grade veze sa negativno naelektrisanim ostacima proteina brzina protoka mobilne faze i uslovi gradijentnog eluiranja temperatura kolone via temperatura poboljava efikasnost kolone i oblik pika ali negativno utie na bioloku aktivnost proteina.

Prednost:

Kompatibilna sa masenom detekcijom1 Da = 1,661027 kg

19

Zasniva se na slabim interakcijama izmeu hidrofobnih zona, prisutnih na povrini intaktnog proteina, i nepolarnih grupa stacionarne faze

Hromatografija hidrofobnih interakcija

20

Hidrofobni ligandMembrana

Rastvor soli

Vodeni rastvor visoke jonske jaine i neutralne pH vrednosti

21

Znaajni faktori u razvoju metode: vrsta kolone silika gel modifikovan aril grupama, diolnim derivatima i kratkim alkil nizovima

prisustvo i vrsta soli znaajna je vrednost povrinskog napona koju stvaraju soli (KCl < NaCl < Na2HPO4 < (NH4)2SO4 < Na3PO4), obino su koncentracije od 1 M do 3 M. Najbitniji faktor!pH mobilne faze uobiajeno do 5,0 do 8,0 temperatura kolone u cilju ouvanja konformacije proteina izvodi se na to niim temperaturama

Prednosti:

Ne dolazi do denaturacije ili gubitka strukture proteinaZa detektovanje promena u konformaciji proteina

22

Metoda zasnovana na reverzibilnom, specifinom vezivanju jednog biomolekula za drugi

Specifini ligandi enzimski supstrati/inhibitori antigeni/antitela

Multifunkcionalni ligandi (npr. konkanavalin A)

Za ispitivanje interakcija tipa protein-protein, protein-peptid, i lek-protein

Afinitetna hromatografija

23

4. Masena spektrometrija

Zasniva se na odreivanju odnosa mase i naelektrisanja jona u gasovitoj fazi

Daje informacije i o molekulskoj masi, ali i o strukturi molekula

24

Elektrosprej jonizacija

1) rasprivanje rastvora uzorka i stvaranje naelektrisane estice2) oslobaanje jona iz kapi 3) prenos jona iz izvora sa atmosferskim pritiskom u region sa

vakuumom i analizator masenog spektrometra

25

MALDI tehnika (Matrix-assisted laser desorption/ionization) 1) Proteini se meaju sa matriksom koji apsorbuje u ultraljubiastoj ili infracrvenoj oblasti 2) Dobijeni uzorak se odlae, sui i injektuje u maseni spektrometar 3) Pomou kratkog pulsa laserske svetlosti proteini se jonizuju i desorbuju iz matriksa u polje visokog vakuuma

26

Identifikacija proteina ili odreivanje sekvence

27

top-down pristupMerenje molekulske mase intaktnog molekula 100 % pokrivenosti sekvencepost-translacione promene ostaju intaktneFragmentacija se vri pomou MS/MS detektora i omoguava identifikaciju proteina pretraivanjem baze podataka, brzo odreivanje N- i C- terimalnog zavretka

bottom-up pristupVri se digestija proteina, dejstvom enzima dobijaju se peptidi mogu biti jedinstveni u pogledu njihove mase, sekvence aminokiselina i separacionih karakteristika pokrivenost sekvence ovim pristupom je od 5 % do 70 % postoji i verovatnoa gubitka post-translacionih promena tokom MS/MS fragmentacije na nivou peptida

28

Odreivanje sekvence proteina spregnutom masenom spektrometrijom

29

(a) Nakon proteolitike hidrolize rastvor polipeptida se injektuje u maseni spektrometar (MS-1). Razliiti peptidi se sortiraju a samo jedan tip se selektuje za dalju analizu. Selektovani peptid se dalje fragmentie u kolizionoj eliji, izmeu dva masena spektrometra, sudarima sa kolizionim gasom (malom koliinom plemenitog gasa kao to je helijum ili argon). m/z odnos svakog fragmenta se meri u drugom masenom spektrometru (MS-2). Mnogi joni koji se dobijaju tokom druge fragmentacije rezultat su raspada peptidne veze. Oni se redom nazivaju b-joni ili y-joni u zavisnosti od toga da li se naelektrisanje peptida zadralo na N-terminalnom ili C-terminatnom kraju.

(b) Tipian spektar sa pikovima koji predstavljaju peptidne fragmente dobijene iz uzorka jednog malog peptida (10 rezidua). Obeleeni pikovi predstavljaju jone y-tipa. Veliki pik pored y5 je dvostruko naelektrisani jon i nije deo y-seta. Susedni pikovi se razlikuju za vrednost mase odreene amino kiseline.

30

5. Primena mikrotalasa u analizi

proteina/peptida

Tipina hemijska reakcija moe se ubrzati i do 1000 puta pod dejstvom mikrotalasnog zraenja

Primer za analizu peptida pod dejstvom mikrotalasa je Akaborireakcija kojom se vri identifikacija C terminalnog zavretka

Ovaj pristup moe znatno da pobolja stepen proteolize, efikasnost digestije proteina i posledino, njihovu identifikaciju

31

32

6. Elektroforeza

Zasnovana na migraciji naelektrisanih proteina u elektrinom polju Proteini se mogu razdvojiti i vizuelno detektovati (brza procena broja

proteina u smei ili procena stepena istoe proteina) Omoguava odreivanje vanih osobina proteina kao to su

izoelektrina taka i priblina molekulska masa Kretanje proteina u gelu, tokom elektroforeze, je u funkciji njegove veliine i

oblika

33

Za procenu istoe i odreivanje molekulske mase esto se koristi povrinski aktivna materija natrijum dodecil sulfat (eng. Sodium Dodecyl Sulfate SDS)

SDS se vezuje za veinu proteina u koliini koja je grubo proporcionalna molekulskoj masi proteinaVezani SDS doprinosi ukupnom negativnom naelektrisanju Nastaje slian odnos mase i naelektrisanja na svakom proteinu Nativna konformacija proteina se menja kada se vee SDS i veina proteina zauzima slian oblik Elektroforezom uz prisustvo SDS dolazi do razdvajanja proteina gotovo iskljuivo na osnovu njihove molekulske mase, pri emu mali polipeptidi bre migriraju Proteini se mogu vizuelno uoiti dodavanjem boje kao to je Coomassie plavo, koja se vezuje za proteine ali ne i za gel

34

Procena molekulske mase proteina

Proteini poznate molekulske mase se elektroforetski razdvoje (traka 1). Oni se mogu upotrebiti za procenu molekulske mase nepoznatog proteina

35

Izoelektrino fokusiranje - za odreivanje izoelektrine take proteina

Uspostavlja se pH gradijent tako to se smea organskih kiselina i baza male molekulske mase raspodeli u gelu pod uticajem elektrinog polja. Kada se unese smea proteina, svaki protein e se kretati sve dok ne dostigne pH vrednost koja odgovara njegovoj pI.

36

Dvodimenzionalna elektroforeza - kombinacija izoelektrinog fokusiranja i elektroforeze

Dvodimenzionalnom elektroforezom se mogu razdvojiti proteini identine molekulske mase koji se razlikuju po pI vrednostima, ili proteini koji imaju sline pI vrednosti a razliite molekulske mase

Proteini se prvo razdvajaju pomou izoelektrinog fokusiranja. Zatim se taj gel polozi horizontalno na drugi, pa se proteini razdvoje pomou SDS poliakrilamid gel elektroforeze. Horizontalna separacija oslikava razlike u pI vrednostima, dok vertikalna separacija oslikava razlike u molekulskoj masi.

37