1

AnalitiAnalitiččke metode u klinike metode u kliniččkoj koj enzimologijienzimologiji

Predavanja iz Kliničke enzimologijeIntegrisane akademske studije: Farmacija-

medicinska biohemijaŠkolska 2014/2015. godina

2

Preanalitičkafaza

AnalitiAnalitiččka ka fazafaza

?

Tumačenjerezultata

Laboratorijsko odreñivanje aktivnosti enzima

3

Enzimska analizaEnzimska analiza

1. Odreñivanje katalitičke aktivnosti enzima u biološkim materijalima

2. Odreñivanje koncentracije pojedinih supstanci pomoću enzima

3. Odreñivanje koncentracije supstanci pomoću reagenasa obeleženih enzimima

4

Teorijska osnova odreñivanjaTeorijska osnova odreñivanja: principi i : principi i terminologijaterminologija

• Katalitička aktivnost enzima– Brzina konverzije– Brzina enzimske reakcije

• Enzimska aktivnost se meri na osnovu:– Povećanja produkta– Smanjenja supstrata– Smanjenja koenzima– Povećanja promenjenog koenzima

• Meri se promena apsorbancije ∆A u vremenskom intervalu ∆t

5

Metode odreñivanja aktivnosti enzimaMetode odreñivanja aktivnosti enzima

Tri parametra V-brzina; E-aktivnost enzima; S- koncentracija supstrata;A. [S ] - konstantaB. [S ] - raste

Dva osnovna postupka odreñivanja aktivnosti enzima• Diskontinuirani• Kontinuirani

Merenje brzine enzimske reakcije

A B

6

Diskontinuirani postupakDiskontinuirani postupak merenja aktivnosti merenja aktivnosti enzimaenzima

Sinonimi• Statički postupak• Metoda dve tačke • Metoda fiksnog vremena

Karakteristike metode• Svi reaktanti se pomešaju • Enzimska reakcija se odvija u fiksnom vremenskom intervalu• Reakcija se zaustavlja inaktivacijom enzima (obično dodatkom slabe

kiseline)• Meri se ukupna promena koncentracije supstrata ili produkta u

željenom vremenskom intervalu• Predpostavka je da je reakcija linearna tokom vremena odreñivanja• Problem je kod visokih aktivnosti enzima• Primena

7

Kontinuirani postupak merenja aktivnosti Kontinuirani postupak merenja aktivnosti enzimaenzima

Sinonim•KinetičkiKarakteristike metode:•Kinetički postupak jer se prati kinetika reakcije•Preduslov je mogućnost direktnog merenja jednog reaktanta: supstrata, produkata ili koenzima•Više merenja promene apsorbancije u kratkim vremenskim intervalima (30 ili 60 sekundi)•Obično se meri više promena apsorbancije (minimum 3) čime se postiže veća tačnost•Kontinuirano praćenje kinetike enzimske reakcije sa spektro-fotometrom koji ima recorder •Automati koriste isključivo kontinuirane metode•Prednost u odnosu na diskontinuirane jer se merenje aktivnosti vrši isključivo u području linearnosti enzimske reakcije i svako odstupanje se može uočiti

8

v

Piruvat

Promene koncentracije supstrata i brzine enzimske reakcije Odreñivanje aktivnosti laktat dehidrogenaze sa supstratima:

piruvatom i NADH

9

Merenje brzine enzimske reakcjeMerenje brzine enzimske reakcje

1. Lag faza •Male promene u apsorbanciji po jedinici vremena•Reaktanti se mešaju•Dostiže se termalna i kinetička ravnoteža2. Linearna faza•Konstantna promene apsorbancija u jedinici vremena3. Faza istrošenosti supstrata •Male promene u apsorbanciji po jedinici vremena

10

Merenje hemijskih promenaMerenje hemijskih promena

• Spektrofotometrija, fluorimetrija i hemiluminiscencija

• Samoindikativne reakcije – supstrat ili produkt apsorbuju u vidljivom ili UVspektru

• Pogodne za kinetičke metode

• Primeri

1. Merenje aktivnosti dehidrogenaza

– Meri se apsorbancija na 339 nm (340 nm) NADH ili NADPH u toku oksidacije ili redukcije

2. Merenje alkalne fosfataze

– sa 4-nitrofenilfosfatom pri čemu se oslobaña žuti p-nitrofenat u alkalnoj sredini koji se meri na 405 nm

• Fotometar

– termostatirana kiveta i rikorder za beleženje promene apsorbancije

• Samo-indikativne reakcije su važne i praktične i omogućavaju kontinuirano praćenje.

• Kontrola kvaliteta

11

Merenje aktivnosti dehidrogenaza sa Warburgovim optiMerenje aktivnosti dehidrogenaza sa Warburgovim optiččkim kim testom testom -- kontinuiranom metodomkontinuiranom metodom

Warburg-Christianov optički testApsorbancija NADH (NADPH) se meri na 340 nm (339 nm) ili 366 nm

Oksidoredukciona reakcija u piridinskom jezgru

12

Progresivna redukcija apsorbancije na 339 nm tokom oksidacije NADH u NAD+

transferom hidrogena na piruvat pri čemu nastaje laktat dejstvom laktat dehidrogenazeNestabilnost koenzima

WarburgWarburg--ChristianChristian--ov optiov optiččki testki test

13

IzraIzraččunavanje aktivnosti enzimaunavanje aktivnosti enzima

• Spektrofotometrijske metode meri se ∆A/∆t

• ∆A/min• 340 nm; 339 nm• Putem molarnog apsorpcionog koeficijenta

• NADH na 339 nm je 6,3 x 103 L x mol-1x cm-1

1 UZU/L= ∆A/min x x

6,3x10-3 ZA

U/L = F x ∆A/min

Ranije.

6,22 x 103 L x mol-1x cm-1

14

1.Warburg-Christian-ov optički test

1.a. Direktan test– Odreñivanje aktivnosti laktat dehidrogenaze

LD

– Piruvat + NADH + H+ → Laktat + NAD+

1.b. NADNAD--test sa indikatorskom reakcijomtest sa indikatorskom reakcijom

– Odreñivanje aktivnosti aspartat aminotransferaze

Merna reakcija AST

L-aspartat + -ketoglutarat ↔ oksalacetat + L-glutamat

Indikatorska reakcijaMD

Oksalacetat + NADH + H+ → L-malat + NAD+

Primena optiPrimena optiččkog testakog testa

15

1.c. NADNAD--test sa pomotest sa pomoććnom i indikatorskom reakcijomnom i indikatorskom reakcijom– Odreñivanje aktivnosti kreatin kinaze

Merna reakcija kreatin kinazaCK

Kreatin + ATP → kreatin fosfat + ADP

Pomoćna reakcija piruvat kinazaPK

ADP + fosfoenolpiruvat → piruvat + ATP

Indikatorska reakcija laktat dehidrogenaza

LD

Piruvat + NADH + H+ → Laktat + NAD+

2. Primena indikatorskih reakcija u vidljivom područjuVizuelizacija optičkog testa - merenje u vidljivom delu spektraPrenosilac H jona je PMS 5-metilfenazonijum metilsulfatHromogen je MTT – tetrazolijum soli

Primena optiPrimena optiččkog testakog testa

16

3. Merenje aktivnosti alkalne fosfataze3. Merenje aktivnosti alkalne fosfatazepreko obojenog produktapreko obojenog produkta

Hromogeni supstrati 1. Derivati p-nitroanilina (p-NA) 4-nitroanilin na 405 nm

Za peptidaze i proteinaze; GGT2. Estri 4-nitrofenola (4-NP) ili 2,4-dinitrofenola na 405 nm

Za esteraze

17

Merenje i izražavanje aktivnosti enzima

• Katalitička aktivnost enzima

• Specifična katalitička aktivnost• Molarna katalitička aktivnost

18

• Katalitička aktivnost enzima• Jedinice za izražavanje aktivnosti enzima u SI sistemu• Katal mol/s• Katalitička količina nekog enzima koja transformiše 1 mol

supstrata za sekund pod odreñenim uslovima• Mikrokatal, nanokatal, pikokatal

• Internacionalna jedinica (IJ,U, IU)• Količina enzima koja transformiše jedan mikromol

supstrata u jednom minutu pod standardnim uslovima• 1 U = 1 µ mol/min = 1/60 µmol/s = 1/60 µkat =16,67 nkat

Merenje i izražavanje aktivnosti enzima

19

• Koncentracija katalitičke aktivnosti = katalitička aktivnost• Katalitička koncentracija• Katalitička aktivnost enzima podeljena sa zapreminom sistema

– Kat x L -1– µkat x L-1– nkat x L-1

• Specifična katalitička aktivnost• Katalitička aktivnost enzima podeljena sa masom proteina

– Kat x kg -1, kat x mg -1• Molarna katalitička aktivnost• Katalitička aktivnost sistema podeljena sa količinom enzima kao

supstance (izražene u molima) – Kat x mol-1

• Aktivnost enzima u odnosu na broj ćelija– Enzimi eritrocita, leukocita

Merenje i izraMerenje i izražžavanje aktivnosti enzimaavanje aktivnosti enzima

20

Automatizacija u dijagnostiAutomatizacija u dijagnostiččkoj enzimologijikoj enzimologiji

• Automatizacija mehaničkih sukcesivnih radnji:• merenja i mešanja odreñenih zapremina uzorka i reagens rastvora,

preinkubacija i kontrola temperature• inicijacija enzimskih reakcija• monitoring promene apsorbancije i • izračunavanje enzimske aktivnosti• Preko molarnog ekstinkcionog koeficijenta tj faktora• Kontinuirani postupak merenja aktivnosti enzima

• Zadovoljavaju sve analitičke parametre• Povećavaju broj urañenih analiza

21

Automatizacija u dijagnostiAutomatizacija u dijagnostiččkoj enzimologijikoj enzimologiji

• Optimizacija enzimskih metoda• Postupak optimizacije uslova enzimske reakcije:• Varira se jedan od faktora i ispituje njegov uticaj na

brzinu enzimske reakcije• Svaki faktor se posebno ispituje• Standardizacija u kliničkoj enzimologiji

– Propozicije IFCC

• Kontrola kvaliteta

22

Merenje masene koncentracije enzima i Merenje masene koncentracije enzima i izoenzimaizoenzima

• Imunoeseji mere masenu koncentraciju enzima i izoenzima umesto katalitičke aktivnosti

• Prečišćen enzim je potrebno izolovati i prečistiti:– koristi se kao kalibrator– može se obeležiti i– omogućava stvaranje specifičnog antitela na ispitivani enzim

• Ekvivalentnost odreñivanja aktivnosti enzima i masene koncentracije ?

• Primena imunoseja za ukupan enzim ?– Prednost odreñivanja aktivnosti na automatu zbog:– Brzine, preciznosti i cene– Prednost kod pankreasnih enzima – tripsina jer se u serumu

nalazi i prekurzor i inhibitor

• Veća primena za izoenzime i izoforme

23

Enzimi kao analitiEnzimi kao analitiččki reagensiki reagensi

• Merenje metabolita (supstrata)– Ravnotežne metode– Kinetičke metode

• Imunoeseji• Analitička primena imobiliziranih enzima

• Restrikcioni enzimi i analiza DNK• PCR – lančana reakcija polimerizacije

24

Merenje metabolita (supstrata)Merenje metabolita (supstrata)

• Upotreba enzima kao analitičkog reagensa za merenje metabolita se vrlo često koristi jer ima prednosti zbog velike specifičnosti za supstancu koja se odreñuje.

• Visoka specifičnost tipično uklanja potrebu za preliminarnu separaciju ili purifikaciju, tako da se reakcija može direktno primeniti na kompleksnu mešavinu kakav je serum.

• Visoko specifični enzimi: – Urikaza (urat oksidaza), ureaza i glukoza oksidaza

• Kuplovane reakcije se obično koriste za enzimski analitički sistem koji odreñuje neku supstancu

– Primer za ovo je odreñivanje glukoze sa heksokinazom

– Heksokinaza prevodi i druge šećere sem glukoze u njihove 6-fosfatne estre

– Indikatorska rekacija sa glukoza-6-fosfat dehidrogenazom, enzimom koji je visoko specifičan za njegov supstrat, ceo proces je visoko specifičan za glukozu

• U praksi postoje dve vrste metoda koje koriste enzime kao reagense:

1. ravnotežne (ekvilibrične)

2. kinetičke

25

1.1. RavnoteRavnotežžne metode odreñivanja supstratane metode odreñivanja supstrata

• Većina metoda za enzimsko odreñivanje supstrata se odvijaju do kraja tj dok se sav supstrat ne potroši - konvertuje u produkt koji se može meriti

• Ovo metode se nazivaju i end point – metoda završne tačke ili ono što je pravilnije ravnotežne metode, zato što reakcija prestaje kada se postigne ravnoteža.

• Teorijski vreme koje je potrebno za transformaciju fiksne količine Q supstrata u produkt je inverzno proporcionalno količini prisutnog enzima [E] :

– k1 konstanta brzine i t je proteklo vreme

– Ravnotežne metode zahtevaju i primetne količine enzima za svaki uzorak kako bi se izbeglo nekonvencionalni dug period inkubacije

– Kako opada koncentracija supstrata do niskih koncentracija pri kraju reakcije Kmenzima postaje važan u odreñivanju brzine reakcije

– Enzimi sa visokim afinitetom za njihove supstrate (nizak Km) su najpogodniji za ravnotežne metode

– Ravnotežne metode nisu osetljive na promene u reakcionim uslovima

26

2. Kineti2. Kinetiččke metode odreñivanja supstratake metode odreñivanja supstrata

• Za kinetičko odreñivanje supstrata važno je da reakcija bude:• prvog ili pseudo prvog reda

• U reakciji prvog reda koncentracija supstrata je [S]posle vremena t od starta reakcije je:

• S0 - inicijalna koncentracija supstrata• e - baza prirodnog logaritma, k - konstanta brzine

• Promena koncentracije supstrata u fiksnomvremenskom intervalu od t1 do t2

• Na osnovu jednačine promena koncentracije supstrata u toku odreñenog vremenskog perioda

je direktno proporcionalna inicijalnoj koncentraciji.

• Enzimska reakcija prvog reda• Ovo je jednačina reakcije prvog reda.• Za enzimske reakcije kinetika reakcije prvog reda

podrazumeva da je S malo u odnosu na KmK je

27

KinetiKinetiččka metoda u dve taka metoda u dve taččkeke

• Zasniva se na merenju nekog svojstva supstrata (apsorbancije, fluorescencije ili hemiluminiscencije) u dve fiksne tačke u toku enzimske reakcije.

• Teoretski ovo je najtačnije enzimsko odreñivanje supstrata– Ove metode su tehnički mnogo zametnije od ravnotežnih metoda

• Uslovi odreñivanja moraju biti konstantni– pH, temperatura i količina enzima i vremenski interval ova dva merenja

– Ovi uslovi su postignuti kod automatskih analizatora

• Referentni rastvor analita (supstrata) za kalibraciju• Kako bi obezbedili da reakcija bude prvog reda, koncentracija

supstrata mora biti manja u poreñenju sa Km (manja od 0,2 x Km)• Za kinetička odreñivanja se koriste enzimi sa visokim Km jer

omogućavaju jedan širi opseg merenja koncentracija supstrata

28

ImunoesejImunoesej• U imunoeseju, enzimski obeležena antitela ili antigeni prvo reaguju sa

ligandom, a zatim se dodaje supstrat ispitivanog enzima

• Kao enzimski obeleživači koriste se:

– Alkalna fosfataza

– Peroksidaza iz rena

– Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza

– Beta-galaktozidaza

• Modifikacija ove metode je enzyme linked immunoabsorbent assay (ELISA) u kome je jedna od reakcionih komponenti vezana za površinu

čvrste faze.

• Princip testa

29

AnalitiAnalitiččka primena imobiliziranih enzimaka primena imobiliziranih enzima

• Za neke tipove enzimskih reakcija, smanjena je potrošnja enzima korišćenjem imobiliziranih enzima, koji se više puta koriste.

• Imobilizirani enzimi su hemijski vezani za adsorbense kao što su:

1. Mikrokristalna celuloza

2. Diaminoetil (DEAE) celuloza

3. Karboksimetilceluloza

4. Agaroza

• Diazo, triazin i azidna grupa se koriste za vezivanje proteinskog enzima za nerastvorlji matriks, formirajući partikule u kontaktu sa rastvorom supstrata, kao što je membrana ili presvučena unutrašnja površina suda u kome se nalazi rastvor supstrata.

30

AnalitiAnalitiččka primena imobiliziranih enzimaka primena imobiliziranih enzima

• Imobilizirajući enzimi su:

1. ureaza

2. heksokinaza

3. alfa-amilaza

4. glukozaoksidaza

5. tripsin

6. leucin-aminopeptidaza

• Prednosti imobilizirajućih enzima– Kod ovih enzima veća je stabilnost na temperaturu i inaktivaciju u

poreñenju sa enzimima u rastvornom obliku

– Proteolitički enzimi ne podležu autodigestiji

– Neka svojstva enzima poput Km i pH optimum mogu biti izmenjeni

31

AnalitiAnalitiččka primena imobiliziranih enzimaka primena imobiliziranih enzima

Vrste imobiliziranih enzima i postupciimobilizacije enzima na- porozne nosače- polimerne matrikse- semipermeabilne membrane

32

AnalitiAnalitiččka primena imobiliziranih enzimaka primena imobiliziranih enzima

• Imobilizirani enzimi su primenjeni u elektrohemijskim tehnikama:

1. potenciometrija2. polarografija

3. mikrokalorimetrija

• Ukoliko su enzimi inkorporirani u membranu oni sačinjavaju deo elektrode

• Površina jon-osetljive elektrode je presvučena poroznim gelom u koji je enzim polimerizovan

• Kada se elektroda zaroni u rastvor sa supstratom enzim deluje i oslobañaju

se joni na koje je elektroda osetljiva

• Primeri– Odreñivanje glukoze sa glukoza oksidazom

– Kiseonična elektroda je presvučena slojem u kome se nalazi glukoza-oksidaza koja se koristi da bi se odredila glukoza koje se oksidiše i meri se kiseonik sa tom elektrodom.

– Ureja se odreñuje kombinacijom selektivne elektrode na amonijum jon i ureazne membrane.

Polarografska metodaKiseonična elektroda

Primer imobiliziranih enzima na elektrodi koja detektujegasove: O2, CO2, NH3 i razne jone

Odreñivanje glukoze sa glukozaOdreñivanje glukoze sa glukoza--oksidazomoksidazom