analitika hiralnih jedinjenja

24
1 1 ANALITIKA HIRALNIH JEDINJENJA 2 odgovarajuće grupe jedinjenja u živom organizmu su u obliku samo jednog enantiomera ugljeni hidrati (D), aminokiseline (L), proteini, hormoni, enzimi, alkaloidi... Biološki organizam Hiralni selektor (hiralna sredina) Lekovi na tržištu – 50 % racemati Lekovi sa 50 % nečistoća ??? Homohiralnost prirode

Upload: mirela-mehic

Post on 03-Jan-2016

156 views

Category:

Documents


6 download

DESCRIPTION

Analitika hiralnih jedinjenja, Univerzitet u Beogradu

TRANSCRIPT

Page 1: Analitika hiralnih jedinjenja

1

1

ANALITIKA HIRALNIH JEDINJENJA

2

• odgovarajuće grupe jedinjenja u živom organizmu su u obliku samo jednog enantiomera

• ugljeni hidrati (D), aminokiseline (L), proteini, hormoni, enzimi, alkaloidi...

Biološki organizam Hiralni selektor(hiralna sredina)

Lekovi na tržištu – 50 % racemati

Lekovi sa 50 % nečistoća ???

Homohiralnost prirode

Page 2: Analitika hiralnih jedinjenja

2

3

Hiralne molekule

Hiralnost – molekule se odnose kao predmet i lik u og ledalu.

Par hiralnihmolekula u

rukama

par enantiomera

Podsetimo se...

4

Nehiralne molekule :

� Nemaju asimetrični centar

� Imaju ravan simetrije

� Nisu optički aktivni

Hiralne molekule :

� Imaju jedan asimetrični centar –

atom povezan sa 4 različita

supstituenta

� Optički aktivni

Hiralne i nehiralne molekule

Page 3: Analitika hiralnih jedinjenja

3

5

Osobine enantiomera

Iste fizi čko-hemijske osobine

(MS spektar, NMR spektar, IR spektar, hemijske reakcije...)

Razlikuju se po ravni skretanja polarizovane svetlosti:

-jedan skre će u smeru kazaljke na satu (+) - dekstrogiri

- jedan skre će u smeru suprotnom kazaljke na satu (-) -levogiri,

-smeša (+) i (-) oblika u odnosu 50:50 je racemat

-racemat ne obr će ravan polarizovane svetlosti

6

Bitne osobine hiralnih lekova

� Farmakološki aspekt� Toksikološki aspekt

� Farmakokinetički aspekt

� Aspekt analitike hiralnihlekova

� Komercijalni aspekt

Page 4: Analitika hiralnih jedinjenja

4

7

Farmakološki aspekt

Upotreba lekova racemata u kliničkoj praksi:

1. jedan enantiomer aktivan (eutomer) , a drugi inaktivan ili je

aktivnost smanjena (distomer) ili prouzrokuje toksičnost ili

neki drugi željeni ili neželjeni efekat

2. oba enantiomera imaju istu aktivnost

3. jedan ili oba enantiomera podležu hiralnoj inverziji

8

1. Enantiomeri sa različitom aktivnošću

S(-) - propranolol

100 x aktivniji kao β-blokator

R(+) - propranolol

Terapija hipertireoidizma

R(-) - albuterol S(+) - albuterol

aktivan, 5 x skuplji od racemata inaktivan i neželjeni efekti

O NH

OHH

O NH

H OH

HO

HO

HN

HO H

HO

HO

HN

HHO

Page 5: Analitika hiralnih jedinjenja

5

9

2. Oba enantiomera sa istom aktivnošću

R,S flekainid(antiaritimik)

R,S fluoksetin(antidepresiv)

O

F3C

HN

CH3 O

NH

O

F3C

CF3

HN

O

10

3. Enantiomer(i) podležu hiralnoj inverziji

R(-) - ibuprofen S(+) - ibuprofen

R(-) - oksazepam S(+) - oksazepam

CH3

H3C

COOH

CH3H

CH3

H3C

COOH

CH3H

in vivo

100 x aktivniji

N

HN

Cl

O

OH

H N

HN

Cl

O

OH

Hin vitro

100 x aktivniji

Page 6: Analitika hiralnih jedinjenja

6

11

Toksikološki aspekt

HO

OH

COOH

NH2H

L - dopa D - dopa

(antiparkinsonik) (agranulocitoza)

S(-) - sekobarbitalR(+) - sekobarbital

(antikonvulziv) (antikonvulziv)

potentniji i toksičniji anestetik

HO

OH

COOH

H NH2

HN N

O O

OH

CH3

H

HN N

O O

OH

H

CH3

12

N

NH

O

O O

O N

NH

O

O O

Oin vivo

R(+) - talidomid S(-) - talidomid

sedativ, imunomodulator, teratogen??

Page 7: Analitika hiralnih jedinjenja

7

13

1. Transformacija prohiralne supstance u hiralni metabolit

ketoni 2°alkoholi

fenitoin (R,S)-4-hidroksifenitoin

2. Transformacija hiralne supstance u hiralni metabolit

(S)-varfarin (S)-7-hidroksivarfarin

redukcija

oksidacija

oksidacija

HN

NH

O

O

HN

NH

O

O

OH*

O O

OOH

H

O O

OOH

H

OH

Farmakokinetički aspekt

14

3. Transformacija hiralne supstance u dijastereoizomerni metabolit

(-)-mentol (-)-mentol glukuronid T1/2 = 2,4h

(+)-mentol (+)-mentol glukuronid T1/2 = 4,0h

OH

OH

OGlu

OGlu

2°met.

2°met.

Page 8: Analitika hiralnih jedinjenja

8

15

Razvoj postupka za dobijanje čiste hiralne aktivne farmaceutske supstance

zahteva:

�Određenu kontrolu procesa sinteze

�Farmakološku i toksikološku procenu oba enantiomera

� Odgovarajuću procenu metabolizma i distribucije

�Odgovarajuću kliničku procenu lekova

Da li je lako dobiti čist aktivan enantiomer?

Odgovor: Dobijanje čistih enantiomera je složen i skup postupak!

16

Analitika enantiomera

Određivanje enantiomerne čisto će:

1.Polarimetrija2.GC3.HPLC

Veliki zna čaj u:

1.Farmaceutskoj industriji 2.Analizi iz biološkog materijala

Page 9: Analitika hiralnih jedinjenja

9

17

1. Polarimetrija

PrednostiBrza, jednostavna i jeftina metodaNajčešće se upotrebljava za određivanje optičke aktivnosti

NedostaciZahteva da uzorci budu homogeniNe sme doći do kristalizacijeUgao rotacije čistog enantiomera mora biti poznatUgao rotacije osetljiv na promene temperature i koncentracije rastvoraKod koncentrovanih rastvora specifična optička rotacija i koncentracija nisu u linearnoj zavisnosti

α= dobijeni ugao rotacijel = dužina ćelije u dm

c = koncentracija u g/mL

18

Hiralna stacionarna faza koja sadrži hiralni agens visoke enantiomerne čistoće, adsorbovan na površinu silikeReverzibilne dijastereoizomerne interakcije – razdvajanje enantiomera

PrednostiBrza i jednostavna metoda

Nečistoće u tragovima ne utiču na rezultateVeoma osetljiva metodaNa osnovu faktora selektivnosti, α moguće je odrediti jačinu interakcije između pojedinačnih enantiomera i hiralne stacionarne faze

Moguće određivanje apsolutne konfiguracije (uz standard)NedostaciSkupa metoda

Analizirane supstance moraju biti isparljive i termostabilne

2. Gasna hromatografija

U Ph. Eur. za određivanje hiralne čistoće.

Page 10: Analitika hiralnih jedinjenja

10

19

Hiralno razdvajanje:−građenje dijastereoizomernih soli−enzimsko razlaganje enantiomera (mikroorganizmi)−klasična HPLC−hiralna HPLC

najkorisnija u analizi hiralnih lekova

3. Tečna hromatografija pod visokim pritiskom

20

Hiralna HPLC

Direktna Indirektna

Hiralni derivatizacioni agens�hiralna mobilna faza�hiralna stacionarna faza(oko 100 tipova komercijalnodostupnih, nijedna nije univerzalna)

Mehanizam razdvajanjaFormiranje kompleksa između enantiomera i stacionarne faze različite energije vezivanja razdvajanje

Page 11: Analitika hiralnih jedinjenja

11

21

Za razdvajanje enantiomera HPLC metodom potrebno je obezbediti hiralnu sredinu!

Načini postizanja hiralne sredine su:

� Primenom hiralne mobilne i nehiralne stacionarne faze

� Primenom hiralne tečne stacionarne i nehiralne mobilne faze

� Primenom hiralne čvrste stacionarne i nehiralne mobilne faze

22

Najznačajniji hromatografski parametar za razdvajanje enana tiomeraje faktor selektivnosti:

Pri čemu je k2 > k1

Cilj : razdvajanje na baznoj liniji uz α<3

Page 12: Analitika hiralnih jedinjenja

12

23

���� Hiralne mobilne faze

Hiralni agens

+ enantiomeri dijastereoizomeri

Različita raspodela između stacionarne i mobine faze

24

Primer: razdvajanja enantiomera N-(1-feniletil)ftalamske kiseline uz upotrebu hinina kao hiralnog agensa

Hromatografski uslovi: stacionarna faza, LiChrosorb SI 100, 5 µm; mobilna faza, dihlormetan–butan-1,2-diol (99:1 V/V) koja sadrži 0,35 mM hinina i sirćetne kiseline; UV detektor.

Page 13: Analitika hiralnih jedinjenja

13

25

Prednosti primene hiralnog agensa:

� postojanje velikog broja hiralnih agenasa

� ekonomična (hiralni agensi se dodaju u malim količinama)

� nema ograničenja pri izboru mobilne faze

� ne mora imati visok stepen optičke čistoće

Ograni čenja primene hiralnog agensa:

� nakon razdvajanja enantiomeri nalaze u obliku dijastereoizomernih

kompleksa, čija je disocijacija u nekim slučajevima onemogućena

26

� Hiralne te čne stacionarne faze

Primer: razdvajanja β aminoalkohola norefedrina na (+)-dibutil tartarat stacionarnoj fazi

Hromatografski uslovi: kolona, (+)-dibutil tartarat Phenyl Hypersil 150 mm × 4,6 mm, 5 µm veličina čestica; mobilna faza, fosfatni pufer (pH 6,0) koji sadrži heksafluorofosfat, zasićena dibutil tartaratom; UV detektor, 254 nm.

Page 14: Analitika hiralnih jedinjenja

14

27

���� Hiralne čvrste stacionarne faze

Da bi hiralna stacionarna faza mogla da interaguje sa svakim enantiomerom i prevede ga u odgovarajući dijastereoizomerni kompleks potrebno je da se ostvare najmanje 3 od sledećih interakcija:

1. vodonične veze

2. π-π interakcije

3. dipol interakcije

4. stvaranje inkluzionih kompleksa

5. sterno uslovljene interakcije

CSP Biphenyl derivative

28

Na osnovu mehanizma razdvajanja hiralne stacionarne faze dele sena:

1) „ Brush-type” hiralne stacionarne faze , u kojima su mali molekuli,

najčešće sa grupama koje sadrže π – elektrone vezane za površinu silike

2) spiralni polimeri , uglavnom celuloza i njeni derivati

3) šuplje faze tipa ciklodekstrina, policikličnih etara i makrocikličnih

glikopeptidnih antibiotika

4) proteinske faze

5) ligand – izmenjiva čke faze

Page 15: Analitika hiralnih jedinjenja

15

29

1. “Brush-type” hiralne stacionarne faze

Primer: prva sintetisana i najviše korišćena je sa dinitrobenzoilfenilglicinom – Pirklefaza

Osnovne karakteristike:

Ima dve amidne grupe

Mogu da ostvare dipol-dipolinterakcije, vodonične veze

dinitrobenzoilgrupa

akceptor π – elektrona

Stupa u interakciju sa donorima

π – elektrona

Jedinjenje mora imati u strukturi aromatičan

prsten!!!

30

Primer: Primena DNBPG silike za razdvajanje (D, L)-propranolola(u obliku oksazolidonskog derivata) iz krvi.

Hromatografski uslovi: uzorak, puna krv, 2,5 h nakon primenjene doze od 80 mg racemske smeše propranolola, koji je derivatizovan fozgenom do oksazolidonske strukture; kolona, 3,5-DNB-fenilglicin silika, 25 cm × 4,6 mm, 5 µm veličina čestica; mobilna faza, heksan – izopropanol –acetonitril (97:2:1 V/V/V), protok, 2 ml min-1; fluorescentni detektor, 290 – 335 nm; IS, interni standard (oksazolidonski derivat pronetalola).

Page 16: Analitika hiralnih jedinjenja

16

31

Primeri brush type hiralnih stacionarnih faza

32

2. Spiralni polimeri

Vrste:

a) nederivatizovana mikrokristalna celuloza

b) derivatizovana mikrokristalna celuloza – triacetil, tribenzoat, trifenilkarbamat...

Nederivatizovana mikrokristalna celuloza

Page 17: Analitika hiralnih jedinjenja

17

33(a) celuloza tris(3,5-dimetillfenilkarbamat) ; (b) amiloze tris(3,5-dimetilfenilkarbamat) i

(b) celuloza tris(4-metilbenzoat)

Derivatizovana mikrokristalna celuloza

34

Primeri spiralnih hiralnih stacionarnih faza

Page 18: Analitika hiralnih jedinjenja

18

35

3. Šuplje faze

a) Ciklodekstrinske

α - cikodekstrin – sadrži 6 jedinica glukoze

β - cikodekstrin– sadrži 7 jedinica glukoze

γ - cikodekstrin– sadrži 8 jedinica glukoze

struktura zarubljene kupe

Koriste se u :

-hromatografiji reverznih faza

-hromatografiji normalnih faza

-hromatografiji sa veoma polarnim mobilnim fazama

36

b) policiklični etri

-selektivno interaguju sa aminokiselinama i primarnim aminima

Page 19: Analitika hiralnih jedinjenja

19

37

c) makrociklični antibiotici

vankomicin

-voluminozni molekuli koji pored nekoliko benzenovih prstenova sadrže i nekoliko prstenova peptidnog tipa

aglikon

glikon

38

Neke osobine stacionarnih faza sa makrolidnimantibioticima:

1. stabilne u većini rastvarača

2. bilo koja promena u stacionarnoj fazi je reverzibilna

3. visoka selektivnost u svim tipovima hromatografije (može se koristiti i u

hromatografiji normalnih i u hromatografiji reverznih faza)

4. pogodne je za optimizaciju i razvoj metode

Page 20: Analitika hiralnih jedinjenja

20

39

4. Proteinske faze

Komercijalno dostupne: albumini, α-kiseli glikoprotein, ovomukoid, avidin, celobiohidrolaza I i pepsin

Proteini se nalazi vezan za sferne čestice veličine 5 µm. Enantiomeri pretežno kiselih jedinjenja mogu se razvojiti direktno bez prethodne derivatizacije.

40

5. Ligand izmenjiva čke faze

Aminokiseline vezane za površinu stacionarne faze u prisustvu Cu2+ jona mogu stereoselektivno da interaguju sa aminokiselinama iz vodenih rastvora.

Grafički prikaz dijastereoizomernog kompleksa D- i L-fenilalanina na L-prolinsilika stacionarnim fazama u prisustvu jona bakra

Page 21: Analitika hiralnih jedinjenja

21

41

Primeri ligand-izmenjivačkih hiralnih stacionarnih faza

Prolin-bakar kompleks

42

Indirektno razdvajanje enantiomera

Derivatizacija sa hiralnim, optički čistim reagensom.

Nastaje par dijastereoizomera.

Dijastereoizomeri imaju različite fizičko-hemijske osobine

Page 22: Analitika hiralnih jedinjenja

22

43

Reakcija (R,S)-metoprolola sa (S)-terc-butil-3-(hloroformoksi)-butirat i određivanje odnosa enantiomera u humanoj plazmi.

Hromatografski uslovi: stacionarna faza, oktadecil silika; mobilna faza, fosfatni pufer – acetonitril (50:50 V/V); fluorescentni detektor, 272/312 nm.

Primer

Pogodno za analizu bioloških

uzoraka

44

Primeri ispitivanja enatiomerne čisto će

Levodopa

1.

Ph. Eur za određivanje enantiomerne čistoće propisuje metodu tečne hromatografije.

Određuje se D-dopa (nečistoća D).

Hromatografski uslovi:

Kolona: C18 150 mm × 4,6 mm, 10 nm veličina čestica

Mobilna faza: rastvor bakar(II)-acetata i N, N-dimetil-L-fenilalanina u vodi sa pH podešenim glacijalnom sirćetnom kiselinom na 4,0 i metanol.

Talasna dužina: 280 nm.

Protok: 1 mL min-1

Limit za ne čisto ću D je 0,5 %.

Page 23: Analitika hiralnih jedinjenja

23

45

Metotreksat

2.

Ph. Eur za određivanje enantiomerne čistoće propisuje metodu tečne hromatografije.

Određuje se (R)-metotreksat (nečistoća F).

Hromatografski uslovi:

Kolona: 150 mm × 4,6 mm pakovana sa goveđim albuminom vezanim za silika gel za hromatografiju veličine čestica 7 µm sa porama veličine 30 nm

Mobilna faza: rastvor anhidrovanog dinatrijum-hidrogenfosfata i natrijum-dihidrogenfosfata, pH podešen na 6,9 pomešan sa propanolom.

Talasna dužina: 302 nm.

Protok: 1,5 mL min-1

Limit za ne čisto ću F je 3,0 %.

46

Naproksen

3.

Ph. Eur za određivanje enantiomerne čistoće propisuje metodu tečne hromatografije.

Određuje se (R)-naproksen (nečistoća G).

Hromatografski uslovi:

Kolona: 250 mm × 4,6 mm pakovana sa stacionarnom fazom tipa π-akceptor/π-donor za hiralno razdvajanje, 5 µm veličine čestica

Mobilna faza: glacijalna sirćetna kiselina, acetonitril, 2-propanol i heksan.

Talasna dužina: 263 nm.

Protok: 2,0 mL min-1

Limit za ne čisto ću G je 2,5 %.

Page 24: Analitika hiralnih jedinjenja

24

47

Zaklju čak

1. Razdvajanje enantiomera je od velikog značaja u farmaceutskoj inustriji

2. Zbog malih razlika u osobinama između enantiomera (samo u smeru okretanja ravni linearno polarizovane svetlosti) mora se posvetiti posebna pažnja razvoju metode

3. Najveći značaj u analitici enantiomera ima hiralna hromatografija

4. Hiralna hromatografija je složena i zahteva veliko iskustvo ekpserimentatora