analytik des ligninabbaus durch weißfäulepilze · bachelorstudiengang bio- und umwelttechnik...

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Fachbereich Versorgungstechnik Bachelorstudiengang Bio- und Umwelttechnik Sommersemester 2011 Analytik des Ligninabbaus durch Weißfäulepilze Erstprüfer Frau Prof. Dr. rer. nat. Wilharm Zweitprüfer: Prof. Dr. Ulrich Zaiß Bachelorarbeit Riccardo Gengerke, Matrikel-Nr. 20822132 Geb. am 04.09.1975 in Teterow - Deutschland

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  • Fachbereich Versorgungstechnik

    Bachelorstudiengang Bio- und Umwelttechnik

    Sommersemester 2011

    Analytik des Ligninabbaus

    durch Weißfäulepilze

    Erstprüfer Frau Prof. Dr. rer. nat. Wilharm

    Zweitprüfer: Prof. Dr. Ulrich Zaiß

    Bachelorarbeit

    Riccardo Gengerke, Matrikel-Nr. 20822132

    Geb. am 04.09.1975 in Teterow - Deutschland

  • 1

    Eigenständigkeitserklärung

    Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Bachelorarbeit selbstständig angefertigt

    und mir zuteilgewordenen Hilfen sowie das benutzte Schrifttum am Ende dieser

    Arbeit angegeben habe.

    Diese Arbeit hat in dieser oder abgeänderter Form keiner anderen Prüfungsbehörde

    vorgelegen.

    Wolfenbüttel, den 24.08.2011 Riccardo Gengerke

  • 2

    Inhaltsverzeichnis

    1. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................................. 7

    2. EINLEITUNG ................................................................................................................................................ 8

    3. ZIELSTELLUNG ........................................................................................................................................ 11

    4. GRUNDLAGEN ......................................................................................................................................... 12

    4.1. LIGNIN .................................................................................................................................................. 12

    4.2. CELLULOSE .......................................................................................................................................... 13

    4.3. HEMICELLULOSE .................................................................................................................................. 15

    4.4. WEIßFÄULEPILZE (PLEUROTUS OSTREATUS UND DONKIOPORIA EXPANSA) ...................................... 15

    4.5. ENZYME ............................................................................................................................................... 17

    4.5.1. Enzymkinetik ............................................................................................................................. 18

    4.5.2. Lignin-Peroxidase (EC 1.11.1.14).......................................................................................... 19

    4.5.3. Mangan-Peroxidase (EC 1.11.1.13) ...................................................................................... 20

    4.5.4. Laccase (EC 1.10.3.2) ............................................................................................................. 20

    4.6. PHOTOMETRIE ..................................................................................................................................... 21

    4.7. BIOGASPRODUKTION ........................................................................................................................... 23

    5. MATERIAL UND METHODEN ................................................................................................................ 24

    5.1. PILZKULTUREN ..................................................................................................................................... 24

    5.2. MEDIEN ................................................................................................................................................ 26

    5.2.1. Nähragar .................................................................................................................................... 26

    5.2.2. Nährbouillon .............................................................................................................................. 26

    5.2.3. Minimalmedium ........................................................................................................................ 26

    5.2.4. Substrate für den Ligninabbau ............................................................................................... 27

    5.3. KULTIVIERUNGSMETHODEN ................................................................................................................. 29

    5.3.1. Konservierung der Pilzkulturen .............................................................................................. 32

    5.4. LIGNINBESTIMMUNG ............................................................................................................................ 33

    5.4.1. Probenvorbereitung ................................................................................................................. 33

    5.4.2. Quantitative Ligninbestimmung nach (J. H. Ross, 1933); verändert nach Vasilic, 2011 33

    5.4.3. Bestimmung des Ligninanteils in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (DIN EN ISO

    13906, 2008) .............................................................................................................................................. 35

    5.5. ENZYMATISCHE AKTIVITÄT .................................................................................................................. 37

    5.5.1. Vorbereitung ............................................................................................................................. 38

    5.5.2. Puffer und Lösungen für die Enzymtests .............................................................................. 38

    5.5.3. Lignin-Peroxidase-Aktivität (EC 1.11.1.14) .......................................................................... 40

    5.5.4. Laccase-Aktivität (EC 1.10.3.2) ............................................................................................. 42

    5.5.5. Mangan-Peroxidase-Aktivität (EC 1.11.1.13)....................................................................... 42

    5.6. BIOGASPRODUKTION ........................................................................................................................... 42

    5.6.1. Quantitative Auswertung nach Entwurf VDI 4630 (VDI-Richtlinie, 2004) ........................ 43

    6. ERGEBNISSE ............................................................................................................................................ 46

    6.1. KULTIVIERUNG DER WEIßFÄULEPILZE ................................................................................................. 46

    6.1.1. Waldpilz ..................................................................................................................................... 46

    6.1.2. Pleurotus ostreatus Stamm 1833 .......................................................................................... 47

    6.1.3. Donkioporia expansa Stamm 9690 ....................................................................................... 51

    6.1.4. Kultivierung auf ligninhaltigen Substraten ............................................................................ 52

    6.2. LIGNINBESTIMMUNG ............................................................................................................................ 55

    6.2.1. Ligninbestimmung der verwendeten Substrate (nach J. H. Ross, 1933) ........................ 55

    6.2.2. Ligninbestimmung der verwendeten Substrate in Anlehnung an DIN EN ISO 13906

    (DIN EN ISO 13906, 2008) ...................................................................................................................... 56

    6.2.3. Ligninabbau durch Weißfäulepilze ........................................................................................ 57

    6.3. ENZYMATISCHE AKTIVITÄT .................................................................................................................. 58

  • 3

    6.3.1. Lignin-Peroxidase (EC 1.11.1.14).......................................................................................... 58

    6.3.2. Mangan-Peroxidase (EC 1.11.1.13) ...................................................................................... 63

    6.3.3. Laccase (EC 1.10.3.2) ............................................................................................................. 64

    6.4. BIOGASAUSBEUTEN ............................................................................................................................. 65

    7. DISKUSSION DER ERGEBNISSE ........................................................................................................ 67

    7.1. KULTIVIERUNG DER WEIßFÄULEPILZE ................................................................................................. 67

    7.1.1. Waldpilz ..................................................................................................................................... 67

    7.1.2. Pleurotus ostreatus .................................................................................................................. 68

    7.1.3. Donkioporia expansa ............................................................................................................... 70

    7.2. LIGNINBESTIMMUNG ............................................................................................................................ 70

    7.2.1. Ligninbestimmung nach (J. H. Ross, 1933 Volume 92, Numbers 3-4) ............................ 71

    7.2.2. Bestimmung des Ligninanteils in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (65..120, 2008) ... 71

    7.2.3. Ligninabbau durch Weißfäulepilze ........................................................................................ 72

    7.3. ENZYMATISCHE AKTIVITÄT .................................................................................................................. 73

    7.3.1. Lignin-Peroxidase (EC 1.11.1.14).......................................................................................... 74

    7.3.2. Mangan-Peroxidase (EC 1.11.1.13) ...................................................................................... 75

    7.3.3. Laccase (EC 1.10.3.2) ............................................................................................................. 76

    7.4. BIOGASPRODUKTION ........................................................................................................................... 76

    8. FAZIT/AUSBLICK ..................................................................................................................................... 77

    9. LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................................................... 78

    10. ANHÄNGE ............................................................................................................................................. 82

    10.1. TABELLEN ........................................................................................................................................ 82

    Abbildungsverzeichnis

    Abbildung 1: Heizöläquivalent Energiepflanzen (Quelle: www.bio-power.com) ....................... 10

    Abbildung 2: Möglich Produkte der Lignocellulose (Quelle: Kamm B., Umsicht Tage, 2003) 10

    Abbildung 3: Strukturformeln der Grundbausteine des Lignins Quelle: (Falk Saupe, 2003) .. 12

    Abbildung 4: Strukturformel eines Ausschnittes aus einem Ligninmolekül Quelle: (Falk

    Saupe, 2003) ....................................................................................................................................... 13

    Abbildung 5: β-1,4- Glucankette eines Cellulose-Moleküls Quelle: (Gerard Tchetseubu Saha,

    2010) ..................................................................................................................................................... 14

    Abbildung 6: Die Ultrastruktur der unlignifizierten Zellwand ........................................................ 14

    Abbildung 7: Reaktion Lignin-Peroxidase Quelle: (IUBMB, 2006) .............................................. 19

    Abbildung 8: Oxidation von ABTS (A) zum Kationenradikal (B) und zum Dikation (C) Quelle:

    (Falk Saupe, 2003) ............................................................................................................................. 21

    Abbildung 9: Lambert-Beer'sche Gesetz Quelle: (Ott, 2004) ...................................................... 22

    Abbildung 10: Schema des anaeroben Abbaus organischer Substanz Quelle: (Andreas

    Lemmer, 2010) .................................................................................................................................... 24

    Abbildung 11: Schottflasche mit Pleurotus ostreatus auf Holzspäne ......................................... 25

    Abbildung 12: Fritsch Schneidemühle (Keller im Geb. 4 am Exer) ............................................ 28

    Abbildung 13: Zellkulturflasche mit Pleurotus ostreatus 8 d alt in Minimalmedium ................. 31

    Abbildung 14: Versuchsaufbau Gewinnung Säure-Detergens-Lignin durch Kochen mit einer

    starken Säure ...................................................................................................................................... 34

    Abbildung 16: Waldpilz und Bakterien nach 3 d in 1000-facher Vergrößerung (Aufnahme mit

    Digitalkamera) ..................................................................................................................................... 46

  • 4

    Abbildung 17: Waldpilz nach 21 d bei 1000-facher Vergrößerung (Aufnahme über die PC-

    Anwendung NIS-Elements) ............................................................................................................... 46

    Abbildung 18: Grünschimmelbefall (7 d alte Kultur) ...................................................................... 47

    Abbildung 19: Mikroskopische Aufnahme von Konidiophoren und Phialiden bei 1000-facher

    Vergrößerung (Aufnahme über die PC-Anwendung NIS-Elements) .......................................... 47

    Abbildung 20: Pilzmycel nach 7 d Wachstum in Flüssigmedium ................................................ 48

    Abbildung 21: Pilzmycel in Malzextrakt-Bouillon; links eine 6 d alte Kultur mit weißen Mycel

    und rechts eine 8 d alte Kultur mit schwarzen Konidien ............................................................... 48

    Abbildung 22: Auf der linken Seite ist eine Sporangie bei 1000-facher Vergrößerung zu

    sehen (Aufnahme mit Digitalkamera), ............................................................................................. 49

    Abbildung 23: geschlossene Sporangie bei 1000-facher Vergrößerung (Aufnahme mit PC-

    Anwendung NIS-Elements) ............................................................................................................... 49

    Abbildung 24: Pleurotus ostreatus auf Malzextrakt-Agar; Links eine 15 d alte und Rechts eine

    9 d alte Pilzkultur ................................................................................................................................ 50

    Abbildung 25: Mycel des Pleurotus ostreatus bei 1000-facher Vergrößerung (aufgenommen

    mit PC-Anwendung NIS-Elements); ................................................................................................ 50

    Abbildung 26: Pilzmycel des Donkioporia expansa nach 6 d Wachstum auf Malextrakt-Agar

    ............................................................................................................................................................... 51

    Abbildung 27: Mycel des Donkioporia expansa bei 1000-facher Vergrößerung

    (aufgenommen mit der PC-Anwendung NIS-Elements); .............................................................. 51

    Tabellenverzeichnis

    Tabelle 1: internationale Klassifizierung von Enzymen Quelle: (Nelson & Cox, 2001) ........... 18

    Tabelle 2: Kultivierung von Pleurotus ostreatus und Waldpilz auf ligninhaltigen Substraten mit

    PBS-Puffer pH 5,5 .............................................................................................................................. 52

    Tabelle 3: Kultivierung von Pleurotus ostreatus auf ligninhaltigen Substraten mit

    Leitungswasser am 06.07. und 20.07.2011 ................................................................................... 53

    Tabelle 4: Kultivierung von Pleurotus ostreatus und Donkioporia expansa auf ligninhaltigen

    Substraten mit Leitungswasser am 26.07., 05.08. und 09.08.2011 ........................................... 54

    Tabelle 5: Soll/Ist-Vergleich der Ligningehalte nach (J. H. Ross, 1933 Volume 92, Numbers

    3-4) ........................................................................................................................................................ 55

    Tabelle 6: Soll/Ist-Vergleich der in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (DIN EN ISO 13906,

    2008) ermittelten Ligningehalte ........................................................................................................ 56

    Tabelle 7: Ligninabbau von Pappelholzsubstraten mit und ohne Pilzbewuchs (Schimmelpilz),

    bestimmt in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 .............................................................................. 57

    Tabelle 8: Ligninbestimmung nach (Ross, 1933) .......................................................................... 82

    Tabelle 9: Ligninbestimmung in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (65..120, 2008) ............... 83

    Tabelle 10: Ligninabbau durch Weißfäulepilze .............................................................................. 84

    Tabelle 11: Test des ABTS mit gekaufter LiP 0,0025 mM und 0,000625 mM ......................... 85

    Tabelle 12: Test des ABTS mit gekaufter LiP 0,00025 mM bei 20 und 35 °C .......................... 86

    Tabelle 13: Test des ABTS mit gekaufter LiP 0,00025 mM bei 55 und 75 °C .......................... 87

    Tabelle 14: Test OPD mit gekaufter LiP 0,0025 und 0,000625 mM ........................................... 88

    Tabelle 15: Test OPD mit gekaufter LiP 0,0025 mM (7d gelöst gelagert) und 0,001 mM ...... 89

    Tabelle 16: Test OPD mit gekaufter LiP 0,0025 mM (doppelte Substratmenge) und 0,005 mM

    ............................................................................................................................................................... 90

    Tabelle 17: LiP-Substratumsatz mit OPD durch Pleurotus ostreatus von den alten

    Stammkulturen .................................................................................................................................... 91

  • 5

    Grafikverzeichnis

    Figure 1: Soll/Ist-Vergleich der nach nach (J. H. Ross, 1933 ) ermittelten Ligningehalte ....... 55

    Figure 2: Soll/Ist-Vergleich der in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (DIN EN ISO 13906,

    2008) ermittelten Ligningehalte ........................................................................................................ 56

    Figure 3: Ligninabbau von Pappelholzsubstraten mit und ohne Pilzbewuchs (Schimmelpilz),

    bestimmt in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 .............................................................................. 57

    Figure 4: ABTS-Oxidation mit gekaufter LiP bei verschiedenen Temperaturen ....................... 58

    Figure 5: OPD-Oxidation mit verschiedenen Konzentrationen der gekauften LiP ................... 59

    Figure 6: Test der LiP-Aktivität mit OPD ......................................................................................... 60

    Figure 7: Nachweis der Lignin-Peroxidase in Flüssigkulturen des Donkioporia expansa und

    Pleurotus ostreatus ............................................................................................................................ 62

    Figure 8 : Nachweis Mangan-Peroxidase in Flüssigkulturen Donkioporia expansa und

    Pleurotus ostreatus ............................................................................................................................ 63

    Figure 9: Nachweis Laccase in Flüssigkulturen des Pleurotus ostreatus und Donkioporia

    expansa ................................................................................................................................................ 64

    Figure 10: Methanerträge aus ligninhaltigen Substraten mit und ohne Pilz .............................. 66

    Abkürzungs- und Symbolverzeichnis

    ∑VN Netto-Gasvolumen des Substrats für die betrachtete Versuchsdauer ∑VIS Summe der Gasvolumina des Versuchs mit Impfschlamm für die

    betrachtete Versuchsdauer ε molarer Extinktionskoeffizient A Absorption ABTS 2,2´- Azino- bis(3- ethylbenzthiazolin- 6- sulfonsäure) ADL Säure-Detergens-Lignin (acid detergent lignin) ADF Säure-Detergens-Faserrückstände (acid detergent fiber) Akt. Aktivität BHKW Blockheizkraftwerk CCH4f Methankonzentration im feuchtem Gas in Vol.-% CCH4tr Methankonzentration im trockenem Gas in Vol.-% CH4 Methan Ckorrtr korrigierte Konzentration der Biogaskomponente im trockenen Gas in

    Vol.-%. C:N Kohlenstoff:Stickstoff-Verhältnis CO2 Kohlenstoffdioxid Ctr gemessene Konzentration der Biogaskomponente im trockenen Gas in D.E. Weißfäulepilz Donkioporia expansa deion. deionisiert EC Effektkonzentration EK Endkonzentration Fa. Firma gem. gemäß GPS Getreide-Ganzpflanzsilage GV Glühverlust H2 Wasserstoff H2O Wasser H2S Schwefelwasserstoff

  • 6

    Lacc Laccase LiP Lignin-Peroxidase lN Liter Volumen unter Normbedingungen Lsg. Lösung mf die Masse des Tiegels mit der Frischmasse mg Milligramm mg/l Milligramm pro Liter mIS Masse des für die Mischung benutzten Impfschlammes mM Millimolar mM Masse des im Kontrollversuch benutzten Impfschlammes MM Malzmedium MnP Mangan-Peroxidase MR Maissilage/Roggensilage (GPS) MS Massenspektrometrie mT die Masse des leeren Tiegels mtr die Masse des Tiegels mit der getrockneten Frischmasse mU Milliunits N Normal NH3 Ammoniak OPD ο- Phenylendiamin oTM organische Trockenmasse oTR organische Trockenrückstand oTS organische Trockensubstanz p0 Normdruck = 1013 hPa p Druck der Gasphase pH dekadische Logarithmus der Wasserstoffionen-Aktivität POD Peroxidase P.O. Pleurotus ostreatus pw Dampfdruck des Wassers RT Raumtemperatur spez. spezifische T0 Normtemperatur = 273 K TM Trockenmasse TR Trockenrückstand UV Ultraviolett va Veratrylalkohol VB Volumen des produzierten Biogases VIS(korr.) Gasvolumen, das aus dem Impfschlamm entwickelt wurde VK Kopfraumvolumen in ml Vol.-% prozentualer Anteil am Volumen VS spezifische auf die Glühverlustmasse bezogene Faulgasproduktion

    während der Versuchszeit Vtr0 Volumen des trockenen Gases im Normzustand wT Gewichtsprozent Trockenrückstand der Probe wV Gewichtsprozent Glühverlust der Trockenmasse

  • 7

    1. Zusammenfassung

    Das primäre Ziel war es, analytische Verfahren für die Ligninbestimmung bzw. für

    den Ligninabbau und für die enzymatische Aktivität der Weißfäulepilze zu etablieren.

    Zur Bestimmung des Ligningehalts bezogen auf die Trockenmasse wurden

    gravimetrische Verfahren getestet. Bei diesen Verfahren werden, bis auf das Lignin

    und die Mineralstoffe, alle Bestandteile mit einer starken Säure hydrolysiert. Nach

    Filtern des Säure-Lignin-Detergens und anschließendem Trocknen des Filtrats kann

    das Lignin ausgewogen werden. Nach der selbst abgeänderten Methode, die sich in

    den Grundzügen an die (DIN EN ISO 13906, 2008) anlehnt, konnten gute

    Ergebnisse erzielt werden. Jedoch kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob

    dieses Verfahren auch auf Futtermittel und Gärreste übertragbar ist.

    Weiterhin wurde die Enzymaktivität mit verschiedenen Substraten photometrisch

    bestimmt. Hier eignet sich ABTS aufgrund seiner Nachweisempfindlichkeit und

    seiner Einsatzmöglichkeit für zwei Enzyme (Laccase und Lignin-Peroxidase)

    insbesondere als Substrat.

    Das Verfahren zur Bestimmung der Mangan-Peroxidase-Aktivität ist noch nicht

    optimal, da die spektrale Grundabsorption zu hoch lag und die spektrale Absorption

    auf über 1 anstieg. Eine Verdünnung kommt nicht infrage, weil dies die Konzentration

    der Enzyme senkt. Hier ist die Enzymgewinnung zu optimieren.

    Laccase konnte bei Pleurotus ostreatus nachgewiesen werden. Diese produzierte er

    jedoch nur im Minimalmedium. Lignin-Peroxidase und Mangan-Peroxidase konnten

    sowohl Pleurotus ostreatus als auch Donkioporia expansa nachgewiesen werden.

    Auch hierfür eignete sich das Minimalmedium am besten.

    Auf Standardnährmedien wie z. B. Malzextrakt-Agar oder in Flüssigmedien war die

    Anzucht von Pilzen problemlos möglich. Voraussetzung hierfür ist, dass frische und

    lebensfähige Pilzkulturen zur Verfügung stehen und steril gearbeitet wird.

    Die Kultivierung auf ligninhaltigen Substraten gestaltete sich schwieriger, da hier trotz

    der Verwendung frischer und lebensfähiger Kulturen ein Schimmelbefall stattfand.

    Was evtl. an einer ungenügenden Sterilisation der Substrate gelegen haben könnte.

    Jedoch bildeten sich auch Pilzkulturen ohne Schimmelbefall aus.

  • 8

    2. Einleitung

    Ein zentrales Thema unserer Zeit ist die Erschließung oder effektivere Nutzung von

    Rohstoff- und Energiequellen. Diese Quellen sollten erneuerbar, umweltverträglich,

    sicher und möglichst kostengünstig sein. Um diesen Anforderungen gerecht zu

    werden, bedarf es einer sorgfältigen Prüfung hinsichtlich der Umsetzbarkeit und

    Umweltverträglichkeit.

    Dabei spielen Pflanzen als Energiequelle und nachwachsender Rohstoff eine

    besondere Rolle. Denn sie sind mit einem relativ geringen Energieeintrag schnell in

    großen Mengen verfügbar. Pflanzen und Algen - auch einige Bakteriengruppen -

    betreiben Fotosynthese, um ihren Energiebedarf zu decken. Bei diesem

    biochemischen Prozess wandeln diese Organismen die Strahlungsenergie der

    Sonne in chemische Energie um. Diese wird unter anderem dazu verwendet, um aus

    Kohlenstoffdioxid (CO2) und Wasser (H2O) energiereiche organische Verbindungen -

    Biomasse - zu synthetisieren. Diese Biomasse ist ein wertvoller Energiespeicher, der

    durch den Menschen als Nahrungsmittel, Futtermittel oder zur Energiegewinnung

    genutzt wird. Auch die heutzutage von uns genutzten fossilen Energieträger

    entstanden vor mehreren Hunderttausend bis mehreren Millionen Jahren aus

    Mikroorganismen wie Algen. Die Algen bildeten die Grundlage für Erdöl sowie

    Erdgas und Pflanzen wie z. B. Farne die Grundlage für Stein- sowie Braunkohle

    (http://de.wikipedia.org/ vom 12.07.2011 um 18:30 Uhr). Die fossilen Energieträger

    bildeten sich im Laufe der Jahrmillionen aus diesen abgestorbenen Organismen

    durch hohen Druck und hohe Temperaturen in sauerstofffreien

    Sedimenteinschlüssen.

    Da diese Energieträger nur begrenzt zur Verfügung stehen und der in Ihnen über

    Jahrtausende gespeicherte Kohlenstoff durch Verbrennung innerhalb kürzester Zeit

    als CO2 in die Atmosphäre abgeben wird, müssen diese fossilen Energieträger durch

    erneuerbare umweltverträgliche Energien ersetzt werden. Deshalb werden vermehrt

    Energiepflanzen wie zum Beispiel Mais angebaut, deren Körnermaissilage 42,4 %

    Stärke, 5,8 % Rohprotein und 2,5 % Fett enthält (Hermann Englert, 2009). Diese

    energiehaltigen Bestandteile können durch Mikroorganismen leicht abgebaut

    werden. Bei einem Abbau unter Ausschluss von Sauerstoff (anaerobe Verhältnisse)

    entsteht Biogas. Das Biogas besteht zu 50 bis 75 % aus Methan. Methan enthält viel

    Energie, die bei Verbrennung freigesetzt wird. Diese Energie wird zur Strom- und

    Wärmeerzeugung genutzt. Aber auch die weiteren Bestandteile der Pflanze wie

  • 9

    Lignin, Cellulose und Hemicellulose sind mit einen Anteil von 17 bis 20 % auf die

    Trockensubstanz der Maissilage bezogen (http://de.wikipedia.org/wiki/Silage vom

    01.08.2011 um 16:30 Uhr) ein wichtiger Energiespeicher. Diese Bestandteile werden

    bei Futterpflanzen Rohfaser genannt werden. Die Cellulose kann auch durch die am

    Gärprozess beteiligten Mikroorganismen abgebaut und zu Biogas umgewandelt

    werden. Jedoch gestaltet sich der Abbau der Cellulose und Hemicellulose für die

    Mikroorganismen schwieriger als der von der Stärke. Der Abbau ist teilweise gar

    nicht möglich, da die Cellulose/Hemicellulose mit Lignin, das nur durch wenige

    Organismen abgebaut werden kann, umschlossen/durchwachsen ist. Mit Maissilage

    kann ein Methanertrag zwischen 295 und 380 l Methan/kg organische Trockenmasse

    erzielt werden (Hermann Englert, 2009). Dadurch, dass hauptsächlich Mais als

    Energiepflanze dient und wir in Deutschland laut des Fachverband Biogas e. V.

    (http://www.biogas.org, vom 26.07.2011 um 19:45 Uhr) bis Ende 2011

    siebentausend Biogasanlagen haben werden, findet auf den landwirtschaftlichen

    Anbauflächen eine Monokultivierung statt. Ansonsten kann der Bedarf an

    Energiepflanzen nicht abgedeckt werden. Dies hat einen Humusabbau, eine

    Bodenverdichtung und Bodenerosion zur Folge. Weiterhin muss intensiv mit

    Stickstoff gedüngt werden, was zu klimaschädlichen Lachgasemissionen führt

    (http://www.greenpeace.de/fileadmin/gpd/user_upload/themen/landwirtschaft/FS_Bio

    gas_03_2011.pdf vom 26.07.2011 um 19:50 Uhr). Nachteilig ist auch, dass für die

    Erzeugung des Biogases Nahrungsmittel wie Mais, Roggen und Weizen eingesetzt

    werden. Deshalb muss an der Verwertung der organischen Reststoffe geforscht

    werden, um das Potenzial der Energiepflanzen besser auszuschöpfen. Denkbar

    wäre den Gärrest der Biogasanlagen so aufzubereiten, dass die nicht verwertbare

    Rohfaser den am Biogasprozess beteiligten Mikroorganismen zugänglich wird.

    Weiterhin könnten dann Grünschnitt, Stroh und andere Pflanzenreste bei

    entsprechender Aufbereitung mit in den Biogasprozess einfließen. Ein anderer

    Ansatzpunkt ist schnell wachsende Hölzer einzusetzen, denn diese habe bezogen

    auf die Anbaufläche einen höheren Energieertrag (siehe Abb. 1).

    http://www.biogas.org/

  • 10

    Abbildung 1: Heizöläquivalent Energiepflanzen (Quelle: www.bio-power.com)

    Die in der Abb. 1 genannten Triticale sind laut (http://de.wikipedia.org/wiki/Triticale,

    vom 12.07.2011 19:00 Uhr) eine Kreuzung aus weiblichem Weizen (Triticum

    aestivum L.) und männlichem Roggen (Secale cereale L.).

    Schnell wachsende Baumarten wie Pappel können 20 bis 30 Jahre als Dauerkultur

    genutzt werden (Boelcke, 2006). Die Ernte der Sprossmasse kann laut (Boelcke,

    2006) alle 3 bis 10 Jahre erfolgen. Der Vorteil liegt in einer geringeren

    Bodenbelastung und einer geringeren Düngung als beim Mais. Hölzer werden bisher

    vielseitig eingesetzt z. B. als Baumaterial, für die Zellstoffherstellung, in Bioraffinerien

    oder zur Holzgasherstellung. Dabei ist ihr Potenzial als Lieferant von Lignocellulose-

    Produkten sehr viel größer (Abb. 2).

    Abbildung 2: Möglich Produkte der Lignocellulose (Quelle: Kamm B., Umsicht Tage, 2003)

  • 11

    Um an die einzelnen Bestandteile der Lignozellulose, die auch aus Stroh und

    anderen ligninhaltigen Pflanzen gewonnen werden kann, zu gelangen, würde sich

    eine biochemische Vorbehandlung durch Pilze anbieten. Denn besonders

    Weißfäulepilze sind in der Lage Lignin zu lösen und die Cellulose freizulegen. Die

    Gruppe der Rotfäulepilze kann die Cellulose vollständig abbauen und lässt das

    Lignin übrig. Im Bereich der Lignocelluloseprodukte wird an vielen Stellen z. B. an

    der Technischen Universität Wien am Institut für Verfahrenstechnik, Umwelttechnik

    und Technische Biowissenschaften oder dem Institut für Lebensmittelchemie und

    Lebensmittelbiotechnologie (LCB) der Justus-Liebig-Universität Gießen (JLU)

    geforscht, um diese bisher wenig genutzte Rohstoffquelle zugänglich zu machen. Die

    Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Braunschweig hat verschiedene

    Weißfäulepilze zur Erhöhung des Futterwerts von Getreidestroh getestet. Dabei

    sollte durch den Ligninabbau der Weißfäulepilze die Verdaulichkeit des Strohs

    verbessert werden. Die in-vitro getestete Verdaulichkeit konnte durch die

    Vorbehandlung mit Pilzen je nach verwendetem Pilz laut (Peter Lebzien & Institut für

    Tierernährung, 2003) um 9,5 bis 16,9 % verbessert werden. Diese Beobachtungen

    könnten sich evtl. auf eine Vorbehandlung ligninhaltiger Substrate durch Pilze für

    eine anschließende anaerobe Fermentation übertragen lassen. Dann könnten nach

    dem Ligninabbau die Zellwandkohlenhydrate z. B. der schnell wachsenden Hölzer,

    des Gärrests oder des Strohs zu Biogas umgesetzt werden. Entweder setzt man den

    ligninhaltigen Substraten Lignin abbauende Enzyme, die aus Pilzen gewonnen

    wurden, vor bzw. während des Biogasprozesses zu oder man lässt den Pilz die

    Substrate vor der Fermentation zersetzen. Wenn man für die Pilz-Variante einen

    Speisepilz einsetzt, dann würde sich durch den Verkauf der Speisepilze eine

    zusätzliche Einnahmequelle erschließen.

    3. Zielstellung

    In dieser Arbeit liegt der Schwerpunkt auf der Analytik der enzymatischen Aktivität

    der Weißfäulepilze und dem Ligninabbau der Substrate. Für eine Vergleichbarkeit

    sollen verschiedene Weißfäulepilzarten zum Ligninabbau eingesetzt werden. Durch

    diese Arbeit sollen analytische Verfahren etabliert werden, die eine Aussage über die

    Quantität des Ligninabbaus und das Potenzial des zum Ligninabbau eingesetzten

    Pilzes ermöglichen. Dabei kommen analytische Standardverfahren zum Einsatz, bei

  • 12

    denen geprüft werden soll, ob sie für die örtlichen Gegebenheiten infrage kommen

    und inwieweit eine Abänderung zur Reduzierung des Arbeitsaufwands möglich ist.

    Einhergehend mit den primären Zielen fallen weitere Fragestellung an. Zum einen

    müssen die Pilze angezüchtet werden und zum anderen sind geeignete Substrate zu

    beschaffen, die für die Pilzzucht vorzubereiten sind. Weiterhin soll zusätzlich die

    Auswirkung des Ligninabbaus auf den Biogasprozess untersucht werden. Hierzu

    sind Gärversuche im Batch-Verfahren gemäß (VDI-Richtlinie, 2004) durchzuführen

    und auszuwerten.

    4. Grundlagen

    4.1. Lignin

    Der Aufbau des Lignins erfolgt aus definierten Untereinheiten. Diese Untereinheiten

    werden offensichtlich nach dem Zufallsprinzip zusammengesetzt, wobei ein

    Riesenpolymer entsteht, das sich durch die ganze Pflanze zieht. Die

    Grundbausteine/Untereinheiten sind p- Cumarylalkohol, Coniferylalkohol und

    Sinapylalkohol (Abb. 3).

    Abbildung 3: Strukturformeln der Grundbausteine des Lignins Quelle: (Falk Saupe, 2003)

    A: p- Cumarylalkohol; B: Coniferylalkohol; C: Sinapylalkohol

    Diese methoxylierten Phenylpropaneinheiten werden dreidimensional zu einem

    Polymer verknüpft (Abb. 4). Die Zusammensetzung des Lignins variiert je nach

    Pflanzengruppe. Bei Nadelbäumen z. B. macht Coniferylalkohol den

    Hauptbestandteil aus.

  • 13

    Abbildung 4: Strukturformel eines Ausschnittes aus einem Ligninmolekül Quelle: (Falk Saupe, 2003)

    Lignin wird nachträglich in die sekundäre Zellwand, die hauptsächlich aus Cellulose

    besteht, eingelagert und schützt so die Cellulose und die darunter liegende primäre

    Zellwand, die größtenteils aus Hemicellulose besteht. Dieser Verholzungsprozess -

    Lignifizierung - verhindert einen enzymatischen Verdau durch andere Organismen,

    da es nur von einigen Pilzen abgebaut werden kann. Weiterhin verleiht Lignin der

    Pflanze mechanische Stabilität. Dadurch, dass Lignin aufgrund seiner phenolischen

    Gruppen hydrophob ist, werden die Seitenwände vom wasserleitenden Gewebe

    versiegelt und eine Verdunstung des Wassers verhindert. Zwischen den beiden

    Zellwandschichten befindet sich eine dünne Schicht Pektin, die die Zellwand

    zusammenhält.

    4.2. Cellulose

    Cellulose ist der Hauptbestandteil der Pflanzen-Zellwand und die häufigste

    organische Verbindung auf der Erde. Die Cellulose ist ein Polysaccharid, das aus

    Monosacchariden (β-D-Glucose-Molekülen) aufgebaut ist. Die Glukosebausteine

  • 14

    werden dabei ß-1,4-glycosidisch über das C-Atom 1 des einen Monosaccharids mit

    dem C-Atom 4 des darauffolgenden Monosaccharids verbunden (Abb. 5).

    Abbildung 5: β-1,4- Glucankette eines Cellulose-Moleküls Quelle: (Gerard Tchetseubu Saha, 2010)

    Ein Cellulosemolekül kann aus mehreren tausend Monosacchariden aufgebaut sein.

    Cellulose kann durch Wasser und die meisten organischen Lösungsmittel nicht

    aufgelöst werden. Hierzu bedarf es einer starken Säure oder bestimmter Reagenzien

    wie z. B. Dimethylsulfoxid/Lithiumchlorid laut (http://de.wikipedia.org/wiki/Cellulose

    vom 04.0.2011 um 20:15 Uhr). Bei der Lösung in starken Säuren in Verbindung mit

    erhöhten Temperaturen wird die Cellulose zu Glucose gespalten.

    Die Cellulose ist eine Struktursubstanz indem sie Fibrillen bildet. Die fibrillären

    Strukturen entstehen durch die parallele Anordnung von Cellulosemolekülen. Eine

    Vielzahl von Fibrillen bilden dann Pflanzenfasern, die verholzt sein können (Abb. 6).

    Abbildung 6: Die Ultrastruktur der unlignifizierten Zellwand

    (a) Teil der Zellwand mit Mittellamelle, Primärwand und dreischichtiger Sekundärwand;

    (b) Makrofibrillen; (c) Makrofibrillen bestehen aus Mikrofibrillen von ungefähr 10 nm Durchmesser;

    (d) Micellen sind Teile der Mikrofibrillen in denen die Cellulosemoleküle parallel liegen;

    (e) Teile einer Micelle mit parallel verlaufenden, gitterförmig angeordneten Cellulosemolekülen

    Quelle: (w3.forst.tu-muenchen.de/~scriptmaster/skripte/holzaufbau/Holzchemie.pdf vom 29.07.2011

    um 22:10 Uhr)

    Die in der Abb. 6 gekennzeichneten Tüpfel sind dünne Stellen oder Aussparungen in der

    Sekundärwand von Pflanzen. Sie dienen dem Stoffaustausch zwischen benachbarten Zellen.

  • 15

    4.3. Hemicellulose

    Die Hemicellulosen sind neben Cellulose und Lignin eine Hauptkomponente der

    Zellwand. Sie bilden mit Pektin eine Matrix, in die Cellulosefibrillen eingebettet sind

    (PEÑA et al., 2001; CARPITA und MCCANN, 2002; BUNZEL und STEINHART,

    2003). Hemicellulosen lassen sich nicht klar definieren. So bilden die Hauptketten

    heterogene oder monomere Polysaccharide, die aus verschiedenen

    Grundbausteinen aufgebaut sein können. Die häufigsten Monosaccharid

    Grundbausteine sind zum einen Pentosen mit D-Xylose und L-Arabinose sowie zum

    anderen Hexosen wie D-Glucose, D-Mannose und D-Galactose. Der Name des

    Polymers leitet sich vom am häufigsten verbauten Monosaccharid ab und wird mit

    der Endung ane versehen. Hauptvertreter des Heteropolymers sind z. B.

    Arabinoxylane und Xyloglucane (CARPITA und MCCANN, 2002; BUNZEL und

    STEINHART, 2003) und die der Homopolymere Xylan, Mannan und Galactan. An

    den Hauptketten verzweigen sich weitere Monosaccharide, sodass ein

    unregelmäßiges Makromolekül entsteht.

    Hemicellulose lässt sich durch Alkalibehandlung oder kurzzeitige Extraktion mit

    verdünnter, heißer Säure lösen. Dabei gehen Lignin und Cellulose nicht in Lösung

    (http://de.wikipedia.org/wiki/Hemicellulose vom 04.08.2011 um 18:10 Uhr).

    4.4. Weißfäulepilze (Pleurotus ostreatus und Donkioporia expansa)

    Die für diese Arbeit verwendeten Pilze Pleurotus ostreatus (Trivialname:

    Austernseitling) und Donkioporia expansa (Trivialname: ausgebreiteter Hausporling

    oder auch „Eichenporling“) zählen zu den Weißfäulepilzen, die vornehmlich Lignin

    umsetzen. Die Bezeichnung Weißfäulepilze bezieht sich auf die Weißfärbung des

    vom Pilz befallenen Holzes. Denn nach dem Ligninabbau bleibt die weißliche

    Cellulose zurück. Hierdurch wird das Holz aufgehellt. Die Weißfäulepilze zeichnen

    sich dadurch aus, dass sie komplexe Stoffe wie Lignin abbauen können. Die Pilze

    sekretieren dazu über ihr Mycel Enzyme nach außen. Diese Enzyme spalten dann

    Polymere wie z. B. Lignin. Im Anschluss werden die Abbauprodukte zur weiteren

    Verwertung durch den Pilz aufgenommen. Während Pleurotus ostreatus in der Natur

  • 16

    vorwiegend auf Laubholz zu finden ist, kann Donkioporia expansa auch Nadelholz

    zersetzen.

    Pleurotus ostreatus und Donkioporia expansa gehören laut (http://de.wikipedia.org;

    Suche der Pilzgattung vom 11.08.2011 um 17:45 Uhr) zu den höheren Pilzen

    (Eumycota) und hier zur Abteilung der Basidiomyceten (Ständerpilze). Sie leben als

    Saprophyten vom toten oder geschwächten organischen Material. Pilze gehören zu

    den Eukaryoten,aber bilden neben Tieren und Pflanzen eine eigene Klassifikation.

    Sie besitzen eine feste Zellwand, die als Strukturkomponente Chitin besitzt. Beide

    Pilze leben in Zellverbänden, die durch Hyphen gebildet werden. Das

    Hyphenwachstum ist eine asexuelle Vermehrung durch Querteilung. Bei dieser

    Wachstumsform verlängern sich die gestreckten Einzelzellen, die sich durch eine

    Querwand in mehre Zellen teilen können. Die Hyphen verzweigen sich und bilden ein

    Pilzgeflecht, das Mycel. Diese Wachstumsform kommt bei den meisten Pilzen vor,

    zum Beispiel bei Schimmelpilzen oder höheren Pilzen. Pilzarten, die als runde bzw.

    ovale Einzelzellen vorkommen und sich durch Sprossung vermehren bezeichnet man

    als Hefen. Eine besondere Form der Sprossung ist die Bildung von Konidien, die der

    asexuellen Verbreitung der Pilze durch die Luft dienen. Konidien werden von

    Schimmel- und Fadenpilzen gebildet. Die Konidien sind resistent gegenüber

    Trockenheit und UV-Licht. Die Basidiomyceten bilden vorwiegend ein Mycel. Zur

    Bildung eines Fruchtkörpers (Basidie) kommt es nur zu bestimmten Jahreszeiten

    oder erst nach einigen Jahren. An der Basidie bilden sich Konidien mit einem

    haploiden Chromosomensatz. (Pilze, 2011)

    Pleurotus ostreatus ist vorwiegend als Speisepilz bekannt. Er wird aber auch mit

    großem Erfolg in der Umweltsanierung zum Abbau von polycyclischen aromatischen

    Kohlenwasserstoffen (PAKs) und polychlorierten Biphenylen (PCBs) eingesetzt

    (Ulbricht, 2001). Laut (Thorn, 1984) ist Pleurotus ostreatus nematophag. Dies

    bedeutet, dass er in der Lage ist, Nematoden mit Toxocysten zu vergiften, um ihn im

    Anschluss durch in den Nematoden eindringende Pilzhyphen zu verdauen.

    Donkioporia expansa ist ein bekannter Holzschädling, der durchfeuchtete Hölzer in

    Gebäuden befällt und zerstört.

    Pilze werden seit Langem vom Menschen genutzt. So setzten Hefen wie

    Saccharomyces cerevisiae durch Gärung Glucose zu Ethanol um. Schimmelpilze wie

    Aspergillus niger werden für die Herstellung von Citronensäure eingesetzt. Andere

    Pilze veredeln wiederum Käse oder produzieren Antibiotika für medizinische Zwecke.

    Die Stoffwechselprodukte oder Enzyme finden in vielen Bereichen wie z. B. in der

  • 17

    Lebensmittel- und Pharmaindustrie, Medizin und im Haushalt als Backmittel

    Anwendung (Antranikian, 2006). Das Pilzmycel wird sogar als Verpackungsmaterial

    verwendet und ersetzt so Styropor. Diese Idee wurden von Eben Bayer und Gavin

    McIntyre durch die Gründung ihres Unternehmens Ecovative design

    (http://www.innovationstuntmen.com/?p=2405, vom 12.08.2011 um 14:55 Uhr)

    erfolgreich umgesetzt.

    4.5. Enzyme

    Enzyme sind Proteine, die biochemische Reaktionen katalysieren können. Sie

    übernehmen in Organismen wichtige Funktionen z. B. im Stoffwechsel, beim

    Kopieren der Desoxyribonukleinsäure (DNA) und beim Transkribieren der

    Ribonukleinsäure (RNA). Enzyme setzten die Aktivierungsenergie einer

    biochemischen Reaktion herab und beschleunigen oder ermöglichen diese so. Das

    passende Substrat wird dabei spezifisch im aktiven Zentrum des Enzyms gebunden.

    Nachdem das Substrat in das Reaktionsprodukt umgewandelt wurde, wird es

    freigesetzt. Das Enzym verbraucht sich dabei nicht und nimmt seine Funktion so

    lange war, wie passendes Substrat vorhanden ist oder ein Inhibitor die

    Substrataufnahme verhindert. Inhibitoren sind Proteine, die z. B. das aktive Zentrum

    entweder dauerhaft oder kurzzeitig blockieren. Sie werden vom Organismus

    produziert, um die Enzymaktivität entsprechend ihren Bedürfnissen zu regeln. Die

    Enzyme haben je nach Organismus und Funktion verschiedene pH- und

    Temperaturoptima.

  • 18

    Weiter werden sie gemäß unten aufgeführter Tabelle 1 in verschiedene Klassen

    eingeteilt.

    Tabelle 1: internationale Klassifizierung von Enzymen Quelle: (Nelson & Cox, 2001)

    In dieser Arbeit liegt das Hauptaugenmerk auf den Oxidoreduktasen. Da den

    dazugehörigen Enzymen Mangan-Peroxidase, Lignin-Peroxidase und Laccase eine

    Beteiligung am Ligninabbau nachgewiesen wurde. Diese Enzyme werden durch

    Weißfäulepilze produziert und liegen extrazellulär vor.

    4.5.1. Enzymkinetik

    Die Reaktionsgeschwindigkeit gibt an, welche Stoffmenge an Substrat pro Zeiteinheit

    in einem bestimmten Volumen umgesetzt wurde. Sie ist abhängig von der

    Temperatur, dem pH-Wert, der Salzkonzentration sowie der Konzentration der

    Substrate und Produkte. Das Steigern der Temperatur führt zu einer erhöhten

    Reaktionsgeschwindigkeit, bis das Enzym denaturiert.

    Im Zusammenhang mit der Reaktionsgeschwindigkeit steht die Enzymaktivität, die

    die Menge des aktiven Enzyms in der Probe angibt. Sie ist proportional zur

    Reaktionsgeschwindigkeit. Die Enzymaktivität wird in Units (U) angegeben. Ein U ist

    diejenige Menge Enzym, welche unter angegebenen Bedingungen ein Mikromol

    Substrat pro Minute umsetzt (1 U = 1 µmol/min).

    Die spezifische Aktivität gibt an, wie viel des gesuchten Enzyms in der Probe ist

    (U/mg). Hierzu muss die Proteinmenge bekannt sein oder durch Bestimmung der

    Trockensubstanz in der Probe ermittelt werden (Ulbricht, 2001).

  • 19

    4.5.2. Lignin-Peroxidase (EC 1.11.1.14)

    Die Lignin-Peroxidase wird z. B. aus Kulturen des Weißfäulepilzes Phanerochaete

    chrysosporium gewonnen. Es ist ein Hämprotein, das Wasserstoffperoxid als

    Elektronenakzeptor benötigt. Lignin-Peroxidasen oxidieren phenolische und

    aromatische Substrate. Sie oxidieren aber auch nicht-phenolische aromatische

    Verbindungen, wie Veratrylalkohol (3,4-Dimethoxybenzylalkohol) (HEINFLING,

    1998). Durch eine Elektronenübertragung wird ein Kation gebildet, das Spaltungen

    an aromatischen Ringstrukturen bewirkt. Dadurch bilden sich instabile, radikalische

    Strukturen.

    Abbildung 7: Reaktion Lignin-Peroxidase Quelle: (IUBMB, 2006)

    Die nachfolgende Angaben beziehen sich auf die vom Phanerochaete chrysosporium

    gewonnene Ligin Peroxidase. Diese Daten stammen aus der biologischen

    Datenbank (BRENDA, 2011).

    Molekulargewicht: 40 kDa

    pH-Optimum: 2,6; 3; 3,5; 3,6; 4,5; 4,8; 5 (Mehrfachnennungen in der Literatur)

    Temperaturbereich: 25 bis 75°C

    (bei pH 5 werden 100 % Peroxidaseaktivität bei 55 °C erreicht

    und bei 35°C mehr als 75 %; steigen die Temperaturen über

    75°C verliert die Peroxidase 66% ihrer Aktivität)

  • 20

    4.5.3. Mangan-Peroxidase (EC 1.11.1.13)

    Die Mangan-Peroxidase, welche ebenfalls von Phanerochaete chrysosporium

    produziert wird und extrazellulär vorliegt, ist auch ein Hämprotein. Das Enzym

    benötigt Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor und oxidiert zweiwertige

    Manganionen, die im Holz enthalten sind, zu dreiwertigen Ionen. Dreiwertige

    Manganionen sind Oxidationsmittel, die als Chelatkomplexe durch organische

    Säuren, welche der Pilz bildet, stabilisiert werden. Dieser Redox-Mediator greift unter

    Radikalbildung aromatische Strukturen im Ligninmolekül an (Martin Hofrichter, 6. J A

    H R G A N G).

    Die Merkmale der Mangan-Peroxidase von Phanerochaete chrysosporium stammen

    aus der biologischen Datenbank (BRENDA, 2011).

    Reaktionsgleichung: 2 Mn+2 + 2 H+ + H2O2 = 2 Mn+3 + 2 H2O

    Molekulargewicht: ca. 40 kDa

    pH-Optimum: 3; 3,5; 4; 4,5; 4,8; 5 (Mehrfachnennungen aufgrund

    unterschiedlicher Literaturangaben)

    Temperaturbereich: 25 bis 45 °C

    (bei 25°C ca. 80 % der maximalen Enzymaktivität und bei

    45 °C werden ca. 60% erreicht)

    4.5.4. Laccase (EC 1.10.3.2)

    Die Laccase (Polyphenoloxidase) ist sauerstoffabhängig. Sie kommt in Pilzen,

    Pflanzen sowie in einigen Insekten und Bakterien vor. Hauptsächlich ist Laccase in

    Lignin abbauenden Weißfäulepilzen zu finden. Es ist ein kupferhaltiges Glykoprotein

    (Falk Saupe, 2003). Auch sie katalysieren, wie Mangan-Peroxidase, eine Ein-

    Elektronen-Oxidation. Es werden Radikale gebildet, die die phenolischen und nicht

    phenolischen aromatischen Verbindungen dann oxidierten. Dabei wird molekularer

    Sauerstoff reduziert und Wasser gebildet.

  • 21

    Durch Mediatoren wie z. B. 2,2´- Azino-bis(3- ethylbenzthiazolin- 6- sulfonsäure)

    (ABTS) werden auch nicht-phenolische Untereinheiten des Lignins angegriffen (Falk

    Saupe, 2003).

    Abbildung 8: Oxidation von ABTS (A) zum Kationenradikal (B) und zum Dikation (C)

    Quelle: (Falk Saupe, 2003)

    Angaben der biologischen Datenbank BRENDA zur Laccase des Pleurotus

    ostreatus.

    Molekulargewicht: 59 bis 66 kDa

    pH-Optimum: 3; 3,6; 4; 4,5; 5,3; 5,5; 6; 6,2 (Mehrfachnennungen

    aufgrund der unterschiedlichen Literaturangaben)

    Temperaturbereich: 30 bis 80 °C

    4.6. Photometrie

    Photometrie ist die Bestimmung der Konzentration eines Stoffes in Lösung. Dabei

    wird die Änderung der Intensität eines definierten Lichtstrahls einer bestimmten

    Wellenlänge gemessen. Die elektromagnetische Strahlung tritt in Wechselwirkung

    mit dem gelösten Stoff des Probematerials. So erzeugt z. B. die ultraviolette

    Strahlung (200 – 380 nm) eine Anregung innerer Elektronen bzw. von

    Valenzelektronen oder die Strahlung im sichtbaren Bereich (380 – 780 nm) eine

    Anregung der Valenzelektronen. Je nach Atom- und Molekülart werden eng

    begrenzte gequantelte Energiebeträge aus dem Lichtstrahl absorbiert. Durch eine

    Spektralanalyse können für ein Atom oder Molekül die Wellenlängen ermittelt

    werden, bei denen Absorptionen auftreten. Diese ermittelten Wellenlängen sind

  • 22

    charakteristisch für diesen Stoff. Die Wellenlänge, die durch den Stoff am stärksten

    absorbiert wurde, kann gezielt eingesetzt werden, um die Konzentration dieses

    Stoffes zu ermitteln.

    Zwischen der Konzentration eines absorbierenden Stoffes und der Lichtabsorption

    besteht ein proportionaler Zusammenhang, der durch das Lambert-Beer’sche Gesetz

    beschrieben wird. Voraussetzung für das Lambert-Beer’sche Gesetzt ist eine

    monochromatische Strahlung und ein absorbierender Stoff in stark verdünnter

    Lösung. Dieses Gesetz beschreibt die Absorption der Intensität (Φ0) der

    monochromatischen Strahlung, die beim Durchgang durch eine absorbierende

    Lösung mit Schichtdicke (d) auf den Betrag Φ geschwächt wird.

    Abbildung 9: Lambert-Beer'sche Gesetz Quelle: (Ott, 2004)

    Durch das Vermessen von Standardlösungen deren Stoffmengenkonzentration

    bekannt ist, kann eine Kalibrierkurve erstellt werden. Für den linearen Bereich der

    Kalibrierkurve wird der bezogene molare spektrale Absorptionskoeffizient ermittelt.

    Dieser Absorptionskoeffizient dient zur Berechnung der Konzentration dieses Stoffes,

    der in unbekannter Menge in Lösung vorliegt, zusammen mit der Schichtdicke und

    dem ermittelten spektralen Absorptionsmaß. Die Kalibrierkurve verläuft unterhalb des

    spektralen Absorptionsmaßes 1 linear. Deshalb muss die Probe entsprechend

    verdünnt werden, damit das Lambert-Beer’sche Gesetz angewendet werden kann.

    Je steiler die Kalibriergerade verläuft, desto empfindlicher ist der Nachweis des

    entsprechenden Stoffes. Um die Absorption der Lösung, in der sich der Stoff

    befindet, zu berücksichtigen, wird nur das Absorptionsmaß des Lösungsmittels

    vermessen und als Blindwert von den Werten der Proben abgezogen.

  • 23

    4.7. Biogasproduktion

    Der Biogasprozess läuft unter anaeroben Bedingungen ab. Dabei bilden

    Mikroorganismen durch den Abbau organischer Materialien Biogas. Biogas besteht

    hauptsächlich aus Methan (CH4) – 50 bis75 Vol.-% - und Kohlenstoffdioxid (CO2) –

    25 bis 50 Vol.-%. Die weiteren Komponenten, wie Ammoniak (NH3),

    Schwefelwasserstoff (H2S), Wasserdampf und andere gasförmige oder

    verdampfbare Bestandteile, entstehen in Abhängigkeit von dem eingesetzten

    Substrat.

    Die Biogasentstehung ist ein vierstufiger Prozess, an dem unterschiedliche

    Bakteriengruppen beteiligt sind. Bei der Hydrolyse (1. Schritt) werden die Polymere

    wie z. B. Kohlenhydrate, Eiweiße und Fette in Oligomere und Monomere wie

    Aminosäuren, Mehrfach- sowie Einfachzucker und Fettsäuren gespalten. Diese

    Zwischenprodukte werden bei der Acidogenese (2. Schritt) zu niederen organischen

    Säuren (Essig-, Propion- und Buttersäure), Milchsäure, Alkohole und H2 sowie CO2

    abgebaut. H2 und CO2 können durch Methan bildende Bakterien direkt zu Methan

    umgesetzt werden. Während der Acetogenese (3. Schritt) werden Fett- und

    Carbonsäuren sowie die niederen Alkohole zu Essigsäure, Wasserstoff und

    Kohlenstoffdioxid abgebaut. Die acetogenen Wasserstoffbildner sind das schwächste

    Glied im Biogasprozess und aus energetischen Gründen von den Methan bildenden

    Bakterien abhängig. Diese müssen den Wasserstoffpartialdruck niedrig halten, damit

    die Abbaureaktion der Wasserstoffbildner möglich ist. Deshalb sollte der pH-Wert

    (6,5 bis 8) und die Temperatur (37°C – mesophil bzw. 55 °C – thermophil) an das

    Optimun der acetogenen Wasserstoffbildner angepasst werden (FNR, 2010).

  • 24

    Bei der Methanogenese (4. Schritt) wird aus Essigsäure sowie Wasserstoff und

    Kohlenstoffdioxid Methan gebildet.

    Abbildung 10: Schema des anaeroben Abbaus organischer Substanz Quelle: (Andreas Lemmer, 2010)

    5. Material und Methoden

    5.1. Pilzkulturen

    Pleurotus ostreatus Stamm 1833 und Donkioporia expansa Stamm 9690 wurden von

    der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in

    Braunschweig bezogen. Die Pilzkulturen befanden sich bei Anlieferung auf

    Schrägagarröhrchen, die verschlossen waren. Davon wurden Stammkulturen auf

    dem vom DSMZ empfohlenen Medium angelegt. Die verwendeten Stammkulturen

    des Pleurotus ostreatus waren bereits ca. 5 Monate alt und wurden bei 25 °C im

    Brutschrank aufbewahrt. Sie wurden zuvor für eine andere Arbeit benutzt. Daher

    stammte auch noch eine andere Kultur des Pleurotus ostreatus auf gehäckseltem

    Holz.

  • 25

    Diese Kultur befand sich in einer steril verschlossenen 5 Liter Schottflasche auf dem

    Dachboden (Abb. 10).

    Abbildung 11: Schottflasche mit Pleurotus ostreatus auf Holzspäne

    Zudem wurde noch Körnerbrut des Pleurotus ostreatus (Austernseitling oder Pearl

    Oyster) über die Fa. Samentraum Gassmann GmbH unter www.samentraum.de

    gekauft. Die mit Pilzmycel bewachsenen Getreidekörner waren getrocknet und

    luftdicht verpackt. Diese Körnerbrut wurde von der Fa. Mr Fothergill’s Seeds Ltd in

    Suffolk Großbritannien hergestellt und ist für die Anzucht auf Stroh oder Holz für den

    privaten Gebrauch gedacht.

    Weiterhin wurde ein Waldpilz benutzt, der in einem Waldstück auf einen

    abgestorbenen Baumstamm gefunden wurde und darauf eine schleimige Kultur

    bildete. Den Waldpilz fand Frau Prof. Dr. rer. nat. Wilharm und brachte hiervon eine

    Probe mit.

  • 26

    5.2. Medien

    5.2.1. Nähragar

    Die Nährmediumempfehlung des DSMZ war für beide Pilze identisch.

    Es wurde ein Malzextrakt Pepton Agar empfohlen. Mit der Zusammensetzung:

    Malzextrakt 30,0 g

    Soya-peptone 3,0 g

    Agar 15,0 g

    deion. Wasser 1000,0 ml

    pH 5,6

    Verwendet wurde ein Malzextrakt-Agar mit dieser Zusammensetzung von der Fa.

    Merck.

    5.2.2. Nährbouillon

    Als Flüssigmedium diente eine Malzextrackt-Bouillon ebenfalls von der Fa. Merck.

    Von der Bouillon wurde soviel eingewogen, dass 30 g Malzextrakt pro 1000 ml deion.

    Wasser enthalten waren. Zusätzlich kamen auf diese Menge 3 g Pepton, das

    allerdings abweichend von der Vorgabe aus einem Fleischextrakt anstatt aus Soya

    stammte.

    5.2.3. Minimalmedium

    Um die Bildung extrazellulärer lignocellulytischer Enzyme zu fördern, wurde ein

    flüssiges Minimalmedium eingesetzt, das als einzige Kohlenstoffquelle Strohmehl

    enthielt.

    Als Anhalt diente ein Rezept, das sich laut einem Forschungsprojekt der Protagen

    AG (Dr. H. Bouws, et al., 2008) besonders eignete. Das verwendete Medium enthielt

    3 % (abgeändert von 2 % auf 3 %) fein gemahlenes Rapsstroh mit einer

    Partikelgröße < 0,25 mm (empfohlen wurden Ø 2 - 4 mm).

  • 27

    Inhaltsstoffe für 100 ml deion. Wasser:

    MgSO4 0,05 g

    KH2PO4 0,15 g

    Hefeextrakt 0,2 g

    Spurenelementlösung 0,1 ml

    Rapsstroh (gemahlen) 3,0 g

    Zusammensetzung der Spurenelementlösung:

    FeCl3 × 6 H2O 0,08 g/l

    ZnSO4 × 7 H2O 0,09 g/l

    MnSO4 × H2O 0,03 g/l

    CuSO4 × 5 H2O 0,005 g/l

    EDTA 0,4 g/l

    5.2.4. Substrate für den Ligninabbau

    5.2.4.1. Stroh

    Getreidestroh wird von vielen Pilzzüchtern empfohlen. Es ist auch das im

    professionellen Bereich meist genutzte Pilzsubstrat. Laut der Internetseite

    www.biopilze-Berlin.de (Klein, 2011) kann Getreidestroh besonders gut verwertet

    werden, da der Lignin/Cellulose/Hemicellulose-Komplex des Strohs für den Pilz

    leichter aufzuschließen ist als der von Holz. Weiterhin ist das Kohlenstoff-Stickstoff-

    Verhältnis (C:N-Verhältnis) im Stroh mit 40:1 für den Pilz wesentlich günstiger als

    beim Holz, wo das C:N-Verhältnis bei 500:1 liegt (Klein, 2011). Dadurch ist eine

    schnellere Besiedlung des Substrates durch den Pilz möglich. Die Eigenschaften des

    Getreidestrohs bringen auch Nachteile mit sich. Denn durch die leichtere

    Verfügbarkeit der Nährstoffe im Stroh können sie auch durch andere Organismen als

    dem inokulierten Pilz abgebaut werden. Zum Beispiel könnten sich Schimmelpilze

    durchsetzen, die ein schnelleres Mycelwachstum haben als z. B. Pleurotus ostreatus.

  • 28

    Das trockene Getreidestroh wurde von einem Bauern geholt und mit einer

    Schneidemühle der Fa. Fritsch GmbH (Abb. 11) auf eine Partikelgröße < 10 mm

    gebracht.

    Abbildung 12: Fritsch Schneidemühle (Keller im Geb. 4 am Exer)

    5.2.4.2. Pappelholz

    Als schnell wachsende Holzart wurde Pappel ausgewählt. Das Substrat wurde

    einmal aus Kaminholz, das bereits 2 Jahre zum Trocknen lagerte, und frischen

    Pappelzweigen gewonnen. Ein Gartenhäcksler der Fa. Bosch mit der Bezeichnung

    AXT 2500HP (Standort: Keller Geb. 4 am Exer) brachte die frischen Pappelzweige

    auf eine für die Schneidemühle der Fa. Fritsch geeignete Größe. Die Schneidemühle

    machte dann aus den Holzstücken Holzsplitter, die kleiner als 10 mm waren.

    Um aus dem Kaminholz ein Substrat mit größtmöglicher Oberfläche zu schaffen,

    wurden aus ihm Späne herausgebohrt. Die Rinde des Kaminholzes wurde nicht

    mitbenutzt.

  • 29

    5.2.4.3. Gärrest

    Der Gärrest stammte aus einer Biogasanlage, die nur Maissilage und

    Ganzpflanzensilage als Substrat einsetzt. Der Gärrest wurde bereits auf der Anlage

    eingedickt, indem Wasser und Substrat separiert wurden. Eine weitere Aufbereitung

    war nicht erforderlich, da sich im Gärrest keine großen Partikel befanden. Bis zur

    Benutzung befand sich der Gärrest im Kühlschrank.

    5.3. Kultivierungsmethoden

    Für ein gutes Wachstum der Weißfäulepilze müssen optimale Bedingungen

    geschaffen werden.

    Da beide Pilze, Pleurotus ostreatus und Donkioporia expansa bei einer Temperatur

    von 25 °C sowie einem pH-Wert von 5,6 (Empfehlung DSMZ) gut wachsen, musste

    hier nicht unterschieden werden. Für den Waldpilz wurden dieselben

    Wachstumsbedingungen angenommen.

    Für die Kultivierung des Pleurotus ostreatus auf Stroh oder Holz existieren zahlreiche

    Anleitungen. Umfassende Angaben zur Handhabung und Aufzucht des

    Austernseitlings liefert (Hyungjong Kwon, 2004). Dieses Pilzhandbuch beschreibt die

    Speisepilzzucht im großtechnischem Stil für kommerzielle Zwecke. Demnach

    benötigt der Pilz 20 bis 25 °C und Dunkelheit für sein Mycelwachstum. Die

    Kolonisationszeit auf ligninhaltigen Substrat wird mit 15 bis 25 Tagen angegeben.

    Weiter steht im Kapitel 5-1 des Mushroom Growers Handbooks 1, dass der pH-Wert

    des Substrats in einem Bereich von 5,0 bis 6,5 (Hyungjong Kwon, 2004) liegen sollte.

    Es wird beschrieben, dass man diesen pH-Wert durch die Zugabe eines Puffers wie

    z. B. Gips oder Kalk mit 3 % Massenanteil halten kann. Der Wasseranteil des

    Substrats soll laut Kapitel 3 (Hyungjong Kwon, 2004) bei 65 % liegen und der der

    Luft zwischen 65 und 70 %. Wenn der Wasseranteil im Substrat zu hoch ist, dann

    kann es gemäß (Hyungjong Kwon, 2004) leichter zu Kontaminationen kommen.

    Durch Belüftung ist die Kohlenstoffdioxidkonzentration unterhalb 600 bis 1000 ppm

    zu halten. Zur Ausbildung von Fruchtkörpern kommt es erst bei einer Temperatur von

    15 °C. Im Internetforum kulturpilz.de (http://kulturpilz.de/viewtopic.php?t=863, vom

    15.08.2011 um 22:40 Uhr) wird darauf hingewiesen, dass gemäß dem Buch

  • 30

    „Pilzanbau“ von Prof. Jan Ivan Lelley (Gesellschafter-Geschäftsführer der

    Gesellschaft für angewandte Mykologie und Umweltstudien GmbH (GAMU), Institut

    für Pilzforschung in Krefeld) Pleurotus ostreatus vorwiegend Lignin abbaut, solange

    er die Strukturproteine der Zellwand, die an das Lignin gebunden sind, als einzige

    Stickstoffquelle nutzen kann. Wenn eine andere Stickstoffquelle vorliegt, wird auch

    die Cellulose abgebaut. Weiterhin wird erwähnt, dass das Pilzmycel des

    Austernseitlings bei einer Substratmischung aus niedermolekularen Kohlenhydraten

    wie z. B. Saccharose und Maltose und Stäre mit hochmolekularen wie Cellulose,

    Hemicellulose und Lignin schneller wächst als ohne diese Substratbeimischung.

    Da Donkioporia expansa Bausubstanz aus Holz zerstört, findet man zu ihm häufig

    Publikationen zu diesem Thema, aber keine Untersuchungen, die die optimalen

    Wachstumsbedingungen beschreiben. Jedoch ist Donkioporia expansa ebenso wie

    Pleurotus ostreatus ein Waldpilz, der unter anderem in Mitteleuropa beheimatet ist.

    Darum wurde davon ausgegangen, dass Donkioporia expansa auf ligninhaltigen

    Substraten dieselben Lebensbedingungen wie Pleurotus ostreatus benötigt.

    Um Verunreinigungen durch andere Organismen wie z. B. Schimmelpilze zu

    vermeiden, war steril zu arbeiten. Prinzipien des sterilen Arbeitens sind in (Munk,

    2001) ab Seite 7-22 zu finden. Das Befüllen der Kulturgefäße, Gießen der

    Kulturplatten und das Animpfen erfolgten unter einer Sterilbank mit einer vertikalen

    turbulenzarmen Luftströmung. Die Medien und Kulturgefäße wurden zur Sterilisation

    bei 121 °C gesättigtem Wasserdampf für 15 min autoklaviert. Die Arbeitsgeräte und

    Sterilbank sind vor und nach der Benutzung mit 70 % Ethanol bzw.

    Desinfektionsmittel gereinigt worden. 100 g der Desinfektionslösung enthielten 50,0 g

    1-Propanol und 0,08 g Glyoxal. Unter der Sterilbank befand sich zusätzlich noch ein

    Bunsenbrenner, mit dem das Impfbesteck ausgeglüht wurde. Während des Arbeitens

    waren Latexhandschuhe zu tragen und der Kontakt mit verunreinigten Flächen zu

    vermeiden.

    Als Erstes wurden Stammkulturen auf Agar-Platten inokuliert, die in einem

    Brutschrank dunkel bei konstanten 25 °C inkubierten. Durch ständiges Erneuern der

    Stammkulturen blieben diese frisch und verfügbar. Zum Animpfen einer neuen

    Malzextrakt-Agar-Platte oder einer Malzextrakt-Bouillon erwies es sich am

    geeignetsten, ein kleines rechteckiges Stück Agar mit Mycel aus der Stammplatte

    auszustechen und auf die neue Platte oder Bouillon zu überführen. So wird auch das

    Substratmycel und nicht nur das Luftmycel übertragen.

  • 31

    Nachdem sich genügend Mycel auf den Platten gebildet hatte, wurden diese

    komplett zerkleinert, ausgewogen und in das Gefäß mit dem Substrat überführt.

    Gutes durchmischen mit einem sterilen Spatel sorgte für einen optimalen Kontakt

    zwischen Substrat und Pilzmycel. Ein Gummistopfen, der mit zwei PVC-Schläuchen

    durchstochen war und an dessen Ende Sterilfilter (< 0,22 µm) saßen, verschloss die

    Kulturgefäße. Die so vor Luftkeimen geschützten Kulturen kamen bei

    Zimmertemperatur in einen Schrank, damit die Pilzkulturen vor der

    Sonneneinstrahlung geschützt waren.

    Als Kulturgefäße dienten 1 l Erlenmeyerkolben. Diese wurden mit zuvor

    getrocknetem Substrat bzw. frischem Substrat, dessen Gehalt an Trockensubstanz

    vorher bestimmt wurde, und Leitungswasser befüllt, sodass der Massenanteil des

    Wassers zwischen 60 und 70 % lag. Dieser Wasseranteil wird von verschiedenen

    Pilzzüchtern empfohlen unter anderem von www.seiberts.de

    (http://agrar.seibertz.de/pilze/PILZ.html, vom 25.05.2011) und (Hyungjong Kwon,

    2004). Der Wasseranteil wurde nach dem Autoklavieren noch einmal gravimetrisch

    überprüft.

    Zusätzlich wurden Pilzkulturen in Flüssigmedium angesetzt, um aus ihnen leichter

    extrazelluläres Enzym gewinnen zu können. Hierzu wurden zum Einen 100-ml-

    Erlenmeyerkolben benutzt, die mit 20 bzw. 50 ml Flüssigmedium gefüllt waren. Nach

    Inokulation sollte ein autoklavierter Cellulosestopfen das Eindringen von Luftkeimen

    verhindern. Weiterhin wurden von Herrn Prof. Dr. Ulrich Zaiß Zellkulturflaschen (Abb.

    13) bereitgestellt, die bei gleichen Füllvolumen, wie die Erlenmeyerkolben, eine

    größere Oberfläche haben. Ein Schraubverschluss mit Belüftungsmembran schützt

    die Zellkulturen vor Kontamination mit Fremdorganismen.

    Abbildung 13: Zellkulturflasche mit Pleurotus ostreatus 8 d alt in Minimalmedium

    Bei dieser Variante stand den Pilzen mehr Wachstumsfläche als in den

    Erlenmeyerkolben zur Verfügung. Dadurch können sich mehr Enzyme im Medium

  • 32

    ansammeln. Auch die Flüssigkulturen inokulierten in einem Klimaschrank bei 25 °C

    und Dunkelheit.

    Die Überwachung der Zuchtergebnisse erfolgte mikroskopisch mit einem Mikroskop

    der Fa. Nikon (eclipse 50i). Für die Probenahme des Pilzmycels wurde gem. (Zaiß,

    2011) verfahren. Durch leichtes Aufdrücken eines durchsichtigen Klebestreifens auf

    das Pilzmycel konnte eine optimale Menge Mycel auf die Klebefläche übertragen

    werden. Der Klebestreifen mit Pilzmycel wurde auf einen Objektträger geklebt und

    konnte nun mikroskopiert werden. Das Mikroskop bot die Möglichkeit einen Laptop

    anzuschließen, auf dem die Bilder des Mikroskops übertragen wurden. Mithilfe der

    Computer-Anwendung NIS-Elements von Nikon konnten die Schwarz-Weiß-Bilder

    bearbeitet, ausgewertet und in einer Datei gespeichert werden. Mit einer

    Digitalkamera wurden zusätzlich Farbfotos erstellt. Hierzu wurde das Objektiv der

    Digitalkamera vor das Okular des Mikroskops gehalten. Die Digitalkamera musste

    richtig positioniert werden, bis das mikroskopierte Objekt im Sucher der Kamera zu

    sehen war. Nun war ein Aufnahme problemlos möglich.

    5.3.1. Konservierung der Pilzkulturen

    Um immer über aktive Pilzkulturen zu verfügen, müssen diese in regelmäßigen

    Abständen auf frisches Substrat überführt werden.

    Für eine längere Lagerung müssen die Pilzkulturen haltbar gemacht werden.

    Zum Einen ist dies möglich, indem man die mit Mycel bewachsenen Malzextrakt-

    Agar-Platten in einem Kühlschrank aufbewahrt. Dann bleiben die Pilzmycelien für ca.

    4 Monate lebensfähig (Mai, 2011). Eine andere Variante ist, das Pilzmycel in

    Reinstwasser zu suspendieren. Diese Suspension kann dann für ca. 2 Jahre im

    Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt werden (Mai, 2011). Jedoch gebe es zu dieser

    Methode seitens Frau Mai noch keine Erfahrungswerte.

    Es ist ohne Weiteres möglich das Pilzmycel bei -20 °C aufzubewahren

    (CABMICHAEL, 1962). Das Mycel wurde so wie es war eingefroren und keiner

    weiteren Behandlung unterzogen.

  • 33

    5.4. Ligninbestimmung

    Die Ligninbestimmung soll Aufschluss über die Lignin-Abbauleistung der Pilze geben

    und als Vergleichsparameter zwischen den Pilzarten dienen. Da sich mit der

    mikroskopischen Ligninbestimmung z. B. durch Einfärbung mit salzsaurem

    Phloroglucinol nur eine Aussage zur Qualität des Ligninabbaus treffen lässt, wurde

    ihr die gravimetrische Ligninbestimmung vorgezogen.

    5.4.1. Probenvorbereitung

    Die zuvor gehäckselten ligninhaltigen Materialien wurden für mindestens 24 h bei

    105 °C getrocknet. Danach wurde das Material in einer Schwingmühle der Fa.Fritsch

    GmbH fein gemahlen. Dieses Mehl wurde bei einer Maschenweite von 0,25 mm

    abgesiebt und der Siebdurchgang weiter verwertet. So konnte sichergestellt werden,

    dass das Mehl eine Partikelgröße < 0,25 mm hat. Diese Proben wurden dann für die

    Ligninbestimmung gem. den nachfolgend beschriebenen Verfahren benutzt oder

    trocken gelagert, wenn sie nicht sofort analysiert wurden.

    5.4.2. Quantitative Ligninbestimmung nach (J. H. Ross, 1933); verändert

    nach Vasilic, 2011

    Zur Entfernung störender Holzinhaltsstoffe erfolgte zunächst eine 16-stündige

    Extraktion des ligninhaltigen Materials mit gleichen Volumenanteilen Ethanol und

    Cyclohexan (Ethanol:Cyclohexan 1:1). Dieser Extrakt wurde im Anschluss 24 h bei

    105 °C getrocknet. Von dem getrockneten Material wurden dann 1 g in einen 100-ml-

    Erlenmeyerkolben überführt und mit 20 ml 72 %-iger Schwefelsäure übergossen. Der

    Kolben wurde mit einem Cellulosestopfen verschlossen. In dem Kolben befand sich

    ein Magnetrührer, der die Mischung mithilfe einer Magnetrührerplatte 16 h bei 300

    rpm umrührte. Es war darauf zu achten, dass sich keine Klumpen bildeten. Diese

    waren gegebenenfalls mit einem Glasrührer zu zerstoßen.

  • 34

    Nach dem Rühren in 72 %-iger Schwefelsäure wurde die Mischung in ein

    hitzebeständiges Gefäß umgefüllt und mit 875 ml deion. Wasser verdünnt. Das

    Gefäß wurde mit einem Rückflusskühler versehen und die Mischung dann 2 Stunden

    lang gekocht. Der Versuchsaufbau ist auf Abbildung 14 zu sehen.

    Abbildung 14: Versuchsaufbau Gewinnung Säure-Detergens-Lignin durch Kochen mit einer starken

    Säure

    Im Anschluss war das Lignin mit doppelten, zuvor ausgewogenen Cellulosefiltern

    abzufiltern. An den Wänden des zum Kochen benutzten Gefäßes blieb ein

    Niederschlag zurück. Damit kein Lignin verloren ging, wurde dieser Niederschlag mit

    deion. Wasser auf den Filter gespült. Der Filterrückstand war solange mit heißem

    deion. Wasser zu spülen, bis sich ein neutraler pH-Wert einstellte. Die Filter kamen

    zum Trocknen über Nacht bei 105 °C in einen Trockenschrank. Vor dem Wiegen

    wurden die getrockneten Filter in einem Exsikkator auf Raumtemperatur abgekühlt.

    Die beiden Filter wurden dann einzeln abgewogen. Die Gewichtsdifferenz aus Filter

    mit Filtrat und leerem Filter ergab nach (J. H. Ross, 1933) die Ligninmenge. Da die

    Cellulosefilter größere Gewichtsdifferenzen hatten, wurde für eine genauere

    Bestimmung des Ligningehalts die Bestimmung der Gewichtsdifferenz in dieser

    Arbeit folgendermaßen abgewandelt. Das Leergewicht für den tatsächlich zum

    Filtrieren benutzten Filter (F2) wurde von diesem nach Filtern und Trocknen

    abgezogen. Dann wurde noch zusätzlich der gemittelte durch trocknen verursachte

    Gewichtsverlust der Cellulosefilter Subtrahiert. Der mittlere Gewichtsverlust ergab

    sich aus allen Blindproben, also aus den Filtern (F1), auf denen sich kein Rückstand

    befand.

  • 35

    Der prozentuale Ligningehalt wurde nach folgender Formel berechnet.

    ̅ ̅

    Details zur Formel LigningehaltRoss

    :

    ̅ mittlere Masse von allen Blindproben (Filter ohne Rückstand)

    ̅ mittlere Masse von allen Blindproben (Filter ohne Rückstand) nach dem Trocknen

    mF2 Masse des zweiten leeren Filters

    mF2tr Masse des zweiten getrockneten Filters mit Filtrat

    mS Masse des eingewogenen Substrats

    5.4.3. Bestimmung des Ligninanteils in Anlehnung an DIN EN ISO 13906 (DIN

    EN ISO 13906, 2008)

    Die meisten Verfahren zur Bestimmung des Ligningehalts ähneln sich in ihren

    Verfahrensschritten (J. H. Ross, 1933; HALSE, 1926; Klason, 1908). Nach einer

    Extraktion der leicht löslichen Bestandteile (Proteine, kurzkettige Kohlenhydrate) folgt

    zunächst eine Vorhydrolyse der Hemicellulose. Im Anschuss wird die Cellulose durch

    das Kochen mit einer starken Schwefelsäure Hydrolysiert. Die Norm legt das

    Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an unlöslichen Säure-Detergens-

    Faserrückständen (ADF) und Säure-Detergens-Lignin (ADL) in Futtermitteln fest. In

    der Norm wird der ADL-Gehalt nicht durch Rückflusskochen mit einer starken Säure

    bestimmt, sondern durch Hydrolyse mit einer starken auf 15 °C gekühlten Säure,

    wobei die Reaktionstemperatur auf 20 bis 23 °C gehalten wird. Da dies eine

    Arbeitserleichterung darstellt und die Abarbeitung mehrerer Proben besser möglich

    ist, wurde die Norm in Abwandlung zur Ligninbestimmung eingesetzt.

    Im Nachfolgenden wird nur die Lingninbestimmung in Anlehnung an die DIN EN ISO

    13906 beschrieben. Hierbei wurde auf die Analyse des ADF-Gehalts verzichtet. Die

    Abänderung zur Bestimmung des ADL-Gehalts bestand darin, dass anstatt

    Frittentiegel (Porengröße 40 bis 60 µm) Glasfaser Vorfilter Bestell-Nr.: 13430-130-G

    von der Fa. Sartorius AG benutzt wurden. Weiterhin wurden die Kolben und die

    Schwefelsäure nicht gekühlt und der Filterrückstand wurde anstatt mit heißem

  • 36

    Wasser mit deion. Wasser, das Raumtemperatur hatte, säurefrei gewaschen. Die

    Massen wurden mit einer Feinwaage von Satorius bis auf 1 mg ermittelt. Als Erstes

    waren 1 g getrocknetes und gemahlenes Material, dessen Partikel nicht größer als

    0,25 mm waren, in einen 100-ml-Erlenmeyerkolben einzuwiegen. Dort kamen dann

    ein Magnetrührer und 20 ml 72 %-ige Schwefelsäure hinzu. Mit einem Glasstab

    wurden evtl. Verklumpungen aufgelöst. Der Inhalt der Erlenmeyerkolben wurden 3

    Stunden mithilfe einer Magnetrührerplatte bei 300 rpm ständig vermischt. Nach

    Ablauf der 3 h erfolgte die Filtration des Kolbeninhalts durch den Glasfaserfilter, der

    sich in einem Trichter befand. Das Filtrat konnte in ein geeignetes Gefäß oder in den

    Ausguss, der ständig mit Wasser nachgespült wurde, ablaufen. Der Filterrückstand

    wurde sofort mit deion. Wasser gespült, bis das Filtrat säurefrei war. Die Prüfung des

    pH-Werts erfolgte per Teststreifen oder pH-Meter. Bei der Prüfung des pH-Werts mit

    dem pH-Meter musste ein Teil des Filtrats in einem Gefäß aufgefangen werden.

    Damit kein Lignin verloren ging, wurden die Rückstände im Erlenmeyerkolben und

    am Magnetrührer mit deion. Wasser auf den Filter gespült. Die abgetropften Filter

    wurden in ein Porzelantiegel überführt und für mindestens 5 h, meistens jedoch über

    Nacht, bei 105 °C in einen Trockenschrank mit Umluft getrocknet. Nachdem die Filter

    im Exsikkator auf Raumtemperatur abgekühlt waren, konnte deren Masse bestimmt

    werden. Die Filter konnten ohne Tiegel gewogen werden, da sie fest und starr waren.

    Damit konnten Gewichtsschwankungen des Tiegels ausgeschlossen werden. Um

    den Aschegehalt des Filterrückstandes zu ermitteln, kamen die getrockneten Filter

    mit Rückstand für 5 h bei 550 °C in einen Muffelofen. Anschließend kühlten die Filter

    in einen Exsikkator auf Raumtemperatur ab. Die Masse der Filter konnte wieder

    einzeln aufgezeichnet werden. Zur Bestimmung des mittleren Gewichtsverlusts der

    Filter wurden 3 leere Filter getrocknet sowie verascht und jedes Mal ausgewogen.

  • 37

    Die Auswertung erfolgte nach folgender Formel:

    ̅ ̅

    Details zur Formel Ligningehalt in %:

    Masse von Filter und Rückstand nach dem Trocknen

    Masse von Filter und Rückstand nach dem Veraschen

    ̅ mittlere Masse von allen Blindproben (Filter ohne Rückstand) nach dem Trocknen

    ̅ mittlere Masse von allen Blindproben (Filter ohne Rückstand) nach dem Veraschen

    Masse der Untesuchungsprobe

    5.5. Enzymatische Aktivität

    Die enzymatische Aktivität der Weißfäulepilze wurde mit einem Spektrometer

    (UNICAM UV/VIS Spektrometer UV2) photometrisch anhand der entstehenden

    Oxidationsprodukte über die Zeit bestimmt. Die Änderung der Absorption wurde

    minütlich für 5 bis 10 Minuten verfolgt. Die Berechnung der Aktivität erfolgte nach

    folgender Formel gem. (Falk Saupe, 2003), die ggf. an das eingesetzte Volumen und

    evtl. Verdünnungen anzupassen war.

    Formel 1: Berechnung der Enzymaktivität Quelle: (Falk Saupe, 2003)

  • 38

    5.5.1. Vorbereitung

    Vorbereitend wurde mit Pilzmycel bewachsenes Flüssigmedium zunächst

    geschüttelt. Dann wurde es mit einem Cellulosefilter (Porenweite von 8 bis 12 µm)

    abfiltriert. Sollte die Pilzkultur weiter bestehen bleiben, um den Verlauf der

    enzymatischen Aktivität aufzunehmen, wurde nur ein Teil des Flüssigmediums mit

    einer Spritze abgezogen und mit einem Cellulosefilter vorfiltriert. Das Filtrat wurde

    auf eine Spritze aufgezogen. Dann wurde der Spritzeninhalt durch einen

    Spritzenfilter mit einer Porenweite von 0,22 µm gedrückt. Dieses Filtrat konnte nun

    zur weiteren Analyse benutzt werden. Die Proben wurden am Tag der Analyse frisch

    vorbereitet.

    5.5.2. Puffer und Lösungen für die Enzymtests

    0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 4,5

    29,41 g Na3C6H5O7 x2 H2O wurden in 900 ml deion. Wasser gelöst. Der pH-Wert war

    mit 2M Salzsäure auf 4,5 einzustellen. Danach wurde die Lösung mit deion. Wasser

    auf 1 l aufgefüllt. Der Puffer lagerte im Kühlschrank für maximal eine Woche.

    0,1 M H2O2-Stammlösung

    Aus einer 30 %-igen H2O2-Lösung wurde durch Verdünnen mit deion. Wasser eine

    0,1 M H2O2-Lösung hergestellt. Die Stammlösung wurde jedes mal frisch angesetzt.

    1 mM ABTS (2,2´-Azino- bis(3- ethylbenzthiazolin- 6- sulfonsäure))

    Summenformel: C18H24N6O6S4

    Molare Masse 548,70 g/mol

    5 mg ABTS wurden in 10 ml Natriumcitratpuffer 0,1 M, pH 4,5 gelöst. Die Lösung

    wurde bei +4 °C für maximal eine Woche aufbewahrt.

  • 39

    18,49 mM o-Phenylendiamin (1,2-Diaminobenzol, 1,2-Phenylendiamin)

    Summenformel: C6H8N2

    Molare Masse: 108,14 g/mol

    20 mg OPD wurden in 10 ml Natriumcitratpuffer 0,1 M, pH 4,5 gelöst. Die Lösung ist

    bei Licht und Wärme unbeständig. Entweder wird ein Aliquote bei -20 °C gelagert

    oder die Lösung immer frisch angesetzt.

    0,25 M Weinsäure, pH 2,5

    2,3-Dihydroxybernsteinsäure (Weinsäure)

    Summenformel: C4H6O6

    Molare Masse: 150,09 g/mol

    7,504 g Weinsäure wurden in 200 ml deion. Wasser gelöst. Der pH-Wert von 2,5 war

    ggf. mit einer Natriumhydroxidlösung (NaOH) einzustellen.

    10 mM Veratrylalkohol (3,4-Dimethoxybenzylalkohol, va)

    Summenformel: C9H12O3

    Molare Masse: 168,19 g/mol

    0,084 g va wurden in 50 ml Weinsäurepuffer, pH 2,5 gelöst.

    1 M Weinsäure, pH 5,0

    2,3-Dihydroxybernsteinsäure (Weinsäure)

    Summenformel: C4H6O6

    Molare Masse: 150,09 g/mol

    15.09 g Weinsäure wurden in 100 ml deion. Wasser gelöst. Der pH-Wert von 5,0 war

    mit einer Natriumhydroxidlösung (NaOH) einzustellen.

    0,01 M Mangan(II)-sulfat-Lösung

    Summenformel: MnSO4

    Molare Masse: 223,06 g/mol (Tetrahydrat)

    0,0223 g wurden in 10 ml 0,1 M Weinsäurepuffer, pH 5,0 gelöst und bei nicht

    gebrauch bei +4 °C aufbewahrt.

  • 40

    5.5.3. Lignin-Peroxidase-Aktivität (EC 1.11.1.14)

    Zum Nachweis und Bestimmung der Aktivität der Lignin-Peroxidase, kamen drei

    unterschiedliche Substrate zum Einsatz ABTS, OPD und va.

    Zur Überprüfung des Analyseverfahrens wurde Lignin-Peroxidase als Puder mit einer

    angegebenen spezifischen Enzymaktivität von >0.1 U/mg von der Fa. Sigma-Aldrich

    bezogen. Eine Unit wird von der Fa. Sigma-Aldrich wie folgt angegeben: Ist die

    Menge an Enzym, welche 1 µmol 3,4-dimethoxybenzyl Alkohol (Veratrylalkohol) pro

    Minute bei pH 3,0 und 30 °C oxidiert (Quelle:

    https://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=de&N4=42603|SIGMA

    &N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=Customer_Favorit

    es-_-Detail_Page-_-Text-42603, vom 10.08.2011 um 21:45 Uhr). Bei den Tests mit

    der gekauften Lignin-Peroxidase wurde die Temperatur der zu vermessenden Probe

    variiert, um die Enzymaktivität zu steigern und dadurch evtl. die

    Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Hierzu wurde zunächst eine Enzymlösung mit

    1 g/l mit Reinstwasser erstellt. Diese Enzymlösung wurde vor der Analyse frisch

    angesetzt. Daraus wurden verschiedene Probemengen entnommen, sodass das

    Enzym in unterschiedlichen Stoffmengenkonzentration getestet werden konnte.

    Zum Erhitzen bzw. Warmhalten des Analyse-Mixes befand sich der Mix in

    Eppendorf-Caps und die wiederum in einem Thermomixer der Fa. Eppendorf. Der

    Thermomixer konnte auf die gewünschte Temperatur eingestellt und das Mixen

    abgestellt werden. Zum Vermessen des Mixes wurde dieser mit einer Pipette in eine

    Küvette überführt und nach dem Vermessen wieder in das Eppendorf-Cap im

    Thermomixer, um die Probe bis zum nächsten Messzeitpunkt auf Temperatur zu

    halten..

    5.5.3.1. 2,2´-Azino- bis(3- ethylbenzthiazolin- 6- sulfonsäure) (ABTS)

    Das Diammoniumsalz 2,2'-Azino- bis(3-ethylbenthia oder 2,2´-Azino- bis(3-

    ethylbenzthiazolin- 6- sulfonsäure) ist ein Redoxindikator, der in stabile Radikale

    gespalten werden kann. Die Radikale sind photometrisch nachweisbar. Zusätzlich

    wird das am Stoffwechsel beteiligte freie Radikal Wasserstoffperoxid benötigt.

  • 41

    Die Messung erfolgte in Anlehnung an (LEONTIEVSKY, 2001), anstatt einen 20 mM

    Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 5 zu verwenden, wurde ein 0,1 M

    Natriumcitratpuffer, pH 4,5 benutzt (Falk Saupe, 2003). Der Reaktionsmix enthielt

    0,4 ml Probe, 0,2 ml Substrat (0,2 mM), 5 µl von der 0,1 molaren H2O2-Stammlösung

    (0,5 mM). Das Restvolumen der 1 ml Einwegküvette mit einer Schichtdicke von 1 cm

    wurde mit 0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 4,5 aufgefüllt. In der Referenz-Küvette

    ersetzte 0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 4,5 die Probe. Die Zunahme der Absorption

    wurde minütlich bei einer Wellenlänge von 436 nm vermessen. Mit dem spezifischen

    Absorptionskoeffizienten ε436 = 29 300 l M-1cm-1 von (LEONTIEVSKY, 2001) konnte

    die Substratumsetzung und Enzymaktivität berechnet werden.

    5.5.3.2. o- Phenylendiamin (OPD)

    Der Reaktionsmix in der 1 ml Küvette bestand aus 0,1 ml Probe, 25 µl Substrat (0,46

    mM), 5 µl Wasserstoffperoxid (0,5 mM) und der Rest des Volumens wurde mit 0,1 M

    Natriumcitratpuffer, pH 4,5 aufgefüllt gemäß (Falk Saupe, 2003) in Anlehnung an

    (CARDEMIL, 2003). Auch hier ersetzte 0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 4,5 in der

    Referenz-Küvette die Probe. Die Änderung der Absorption wurde minütlich bei 450

    nm gemessen. Die Berechnung der Enzymaktivität erfolgte auf Grundlage des

    spezifischen Absorptions- oder Extinktionskoeffizienten ε450 = 1 010 l M-1cm-1 von

    (CARDEMIL, 2003).

    5.5.3.3. Veratrylalkohol (3,4-Dimethoxybenzylalkohol, va)

    Da die Messung im UV-Bereich bei 310 nm erfolgte, wurde für die Messung der

    Lignin-Peroxidase-Aktivität mit va eine 2 ml Quarzküvette mit einer Schichtdicke von

    1cm verwendet,. Der Mix enthielt 2 mM Veratrylalkohl, 0,4 mM Wasserstoffperoxid,

    50 mM Weinsäure, pH 2,5 und genügend enzymhaltige Probe. Die

    Absorptionszunahme soll laut (KIRK, 1988) 0,2 pro Minute erreichen.

    Mit dem spezifischen Absorptionskoeffizienten ε310 = 9300 l M-1cm-1 von (KIRK, 1988)

    wurde die Enzymaktivität berechnet.

  • 42

    5.5.4. Laccase-Aktivität (EC 1.10.3.2)

    Als Substrat diente ABTS. Der Reaktionsmix enthielt bis auf das Wasserstoffperoxid

    die selben Bestandteile wie die zur Messung der Lignin-Peroxidase (siehe Kapitel

    4.5.3.1.). Die Absorption wurde ebenfalls bei 436 nm gemessen. Der spezifische

    Absorptionskoeffizient war identisch.

    5.5.5. Mangan-Peroxidase-Aktivität (EC 1.11.1.13)

    Die Mangan-Peroxidase-Aktivität wurde nach Vorgabe (Maria J. MARTINEZ, 1996)

    analysiert. Die Enzymaktivität konnte direkt durch die Bildung des Mn+3-Weinsäure-

    Komplex aus Mangan(II)sulfat und Weinsäure bei einer Wellenlänge von 238 nm

    gemessen werden. Der spezifischen Absorptionskoeffizienten wird mit

    ε238 = 6500 l M-1cm-1 angegeben. Der Reaktionsmix befand sich in einer 2 ml