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Analytik und Transformation von Flavonoiden durch anaerobe und aerobe Bakterien vorgelegt von Dipl.-Chem. Denise Schütt aus Duisburg Von der Fakultät III - Prozesswissenschaften - der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktorin der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. - genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dr. Roland Lauster Gutachter: Prof. Dr. Leif-Alexander Garbe Gutachter: Prof. Dr. Johannes Bader Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 20.06.2014 Berlin 2014 D83

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Analytik und Transformation von Flavonoiden durchanaerobe und aerobe Bakterien

vorgelegt vonDipl.-Chem.Denise Schüttaus Duisburg

Von der Fakultät III - Prozesswissenschaften -der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktorin der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. -

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:Vorsitzender: Prof. Dr. Roland LausterGutachter: Prof. Dr. Leif-Alexander GarbeGutachter: Prof. Dr. Johannes BaderTag der wissenschaftlichen Aussprache: 20.06.2014

Berlin 2014

D83

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 91.1 Polyphenole und Polyphenolsubstanzklassen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.2 Flavonoide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.2.1 Anthocyane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101.2.2 Flavonole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.2.2.1 Quercetin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121.2.2.2 Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.3 Physiologische Eigenschaften von Polyphenolen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121.3.1 Antioxidative Eigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131.3.2 Schutz vor Krebserkrankung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141.3.3 Schutz vor koronarer Herzerkrankung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151.3.4 Entzündungshemmende Eigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161.3.5 Antibakterielle und antivirale Eigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161.3.6 Weitere positive Eigenschaften der Flavonoide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.4 Übersicht Verdauungstrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171.4.1 Mundhöhle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171.4.2 Magen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181.4.3 Dünndarm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181.4.4 Dickdarm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

1.5 Bioverfügbarkeit und Metabolismus der Flavonoide im Verdauungstrakt . . . . . . . . 191.6 Vorteile des etablierten in vitro Modells im Vergleich zu bekannten in vivo Modellen . 211.7 Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) Katabolismus in Rhodococcus erythropolis DSM 44534 21

1.7.1 Rutinase und Rutin-Synthase aus Pflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221.7.2 Rutinase aus Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221.7.3 Rhodococcus erythropolis DSM 44534 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.8 Bedeutung der Mykolsäure für den Aufbau der Zellhülle in Aktinobakterien (Mykolata)und dem Rhodococcus erythropolis DSM 44534 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251.8.1 Die Mykolsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251.8.2 Biosynthese der Mykolsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

1.8.2.1 Bildung von Doppelbindungen und funktionellen Gruppen währendder Biosynthese der Mykolsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

1.8.3 Aufbau der Zellhülle der Gattung Rhodococcus . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271.8.3.1 Mykolsäuren in Rhodococcus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271.8.3.2 Zellhüllenstruktur: Peptidoglykan-Arabinogalaktan-Mykolsäure . . . . 281.8.3.3 Aufbau der Zellhülle unter Berücksichtigung des Minnikin-Modells . . 291.8.3.4 Zellhüllenproteine des Rhodococcus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

1.8.4 Substratspezifischer Einfluss auf die Zellhüllenpermeabilität beim Rhodococcus 31

2 Zielsetzung 32

INHALTSVERZEICHNIS

3 Material und Methoden 333.1 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.1.1 Kitsysteme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343.2 Materialien und Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343.3 Methodenvalidierung für die Anthocyan-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.3.1 Herstellung der Standardlösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 353.3.2 Herstellung der Kalibrierkurven . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 353.3.3 Herstellung der Matrixstandards . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363.3.4 Selektivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363.3.5 Linearität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363.3.6 Richtigkeit aus Wiederfindungsexperimenten und Reproduzierbarkeit der Anthocyan-

Extraktion aus dem Protein-Anthocyan-Komplex . . . . . . . . . . . . . . . . . 363.3.7 Nachweis- und Bestimmungsgrenze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373.3.8 Präzision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.3.8.1 Methodenpräzision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383.3.9 Arbeitsbereich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383.3.10 Stabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.4 Aufbau des simulierten in vitro Verdauungsmodells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383.4.1 Eingesetzte Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393.4.2 Verwendete Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393.4.3 Stammführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.4.3.1 Lagerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413.4.3.2 Anaerobe Vorkulturführungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413.4.3.3 Aufbau des in vitro Verdauungsmodells und der einzelnen Verdauungs-

stufen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413.5 Probenvorbereitung und Analyse der Flavonoide aus dem simulierten in vitro Verdau-

ungsmodell mittels HPLC und LC-MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423.5.1 RP-HPLC-Methode zur Analyse der Anthocyane und ihrer Abbauprodukte im

Magen- und Duodenalsaft . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423.5.2 Probenvorbereitung der Anthocyan-Proben aus der Fermentation . . . . . . . . 433.5.3 Probenvorbereitung der präzipitierten Anthocyane . . . . . . . . . . . . . . . . 433.5.4 LC-MS-Methode zur Analyse von Delphinidin nach der enzymatischen Umsetzung 433.5.5 RP-HPLC-Methode zur Analyse des Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) und de-

ren Abbauprodukte im Magen- und Duodenalsaft . . . . . . . . . . . . . . . . . 443.5.6 Probenvorbereitung der Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) Proben aus der Fer-

mentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 443.5.7 Probenvorbereitung des präzipitierten Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) . . . . 44

3.6 Bestimmung der antioxidativen Kapazität, des Monomerindexes und des Gesamtphe-nolgehaltes der Proben aus dem Verdauungsmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 443.6.1 Folin-Ciocalteau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 443.6.2 Bestimmung der monomeren und polymeren Anthocyane . . . . . . . . . . . . 453.6.3 Bestimmung der antioxidativen Kapazität mittels Trolox Equivalent Antioxida-

tive Capacity (TEAC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453.7 Kultivierung und Aufreinigung von Rhodococcus erythropolis DSM 44543 unter aeroben

Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463.7.1 Herkunft und Lagerung des Rhodococcus erythropolis Stamms . . . . . . . . . . 463.7.2 Zusammensetzung der Wachstumsmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463.7.3 Kultivierungsbedingungen für Rhodococcus erythropolis DMS 44534 . . . . . . . 463.7.4 Aufschluss der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 473.7.5 Ammoniumsulfatfällung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 473.7.6 Dialyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 473.7.7 Isoelektronische Fokussierung (IEF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 473.7.8 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE) . . . . . 48

2

INHALTSVERZEICHNIS

3.7.9 Silberfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 483.7.10 Aktivitätstest der IEF-Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 493.7.11 RP-HPLC-Methode zur Analyse der Umsetzung von Quercetin-3-O-rutinosid

(Rutin) während des Aktivitätstests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 503.8 Kultivierung von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 auf verschiedenen C-Quellen und

Analyse der entstehenden Mykolsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 503.8.1 Kultivierungsbedingungen für Rhodococcus erythropolis . . . . . . . . . . . . . 503.8.2 Probenvorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513.8.3 ESI-MS/MS-Methode zur Bestimmung der Mykolsäure Zusammensetzung . . . 513.8.4 Ziehl-Neelsen-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

4 Ergebnisse und Diskussion 524.1 Etablierung und Validierung eines HPLC-Systems zur Anthocyan Analyse . . . . . . . 52

4.1.1 Probenvorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 534.1.2 Selektivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 544.1.3 Kalibrierung (Laufmittel vs. Verdauungssäfte), Linearität und Matrixeffekt . . 564.1.4 Resolubilisierung und Wiederfindung der Anthocyane aus dem Präzipitat . . . 594.1.5 Nachweis- und Bestimmungsgrenze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 604.1.6 Methodenpräzision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 604.1.7 Arbeitsbereich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 614.1.8 Stabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 614.1.9 Robustheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 614.1.10 Diskussion Validierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

4.2 Analyse der Flavonoide und deren Metabolite während der anaeroben Umsetzung im si-mulierten in vitro Verdauungsmodell unter enzymatischen und enzymatisch-mikrobiellenBedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 624.2.1 Analyse des schwarzen Johannisbeersaftes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 624.2.2 Analyse der Anthocyane und deren Metabolite - Analytik von potentiellen Re-

aktionsprodukten beim Abbau der Aglykone in Gegenwart von Enzymen unteranaeroben Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 634.2.2.1 Analytik der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin im in vitro Ver-

dauungsmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 634.2.2.2 Analytik der enzymatischen Umsetzung von Delphinidin im in vitro

Verdauungsmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 664.2.2.2.1 LC-MS Analysen der Metabolisierung von Delphinidin . . . . 70

4.2.2.3 Analytik der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin-3-O-rutinosid(Cy-3-O-rut) im in vitro Verdauungsmodell . . . . . . . . . . . . . . . 71

4.2.3 Analytik der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung von Anthocyanen inverschiedenen Matrices im in vitro Verdauungsmodell unter anaeroben Bedin-gungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 744.2.3.1 Umsetzungen von Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut) . . . . . . . . 74

4.2.3.1.1 Analytik der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung vonCyanidin-3-O-rutinosid im in vitro Verdauungsmodell . . . . 74

4.2.3.1.2 Analytik des präzipitierten Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

4.2.3.1.3 Analytik der polymeren Anthocyane und der antioxidativenKapazität der Proben in den verschiedenen Verdauungsstufen 78

4.2.3.2 Umsetzung von Heißwasserextrakt hergestellt aus Johannisbeertrester 804.2.3.2.1 Analytik der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung von

Heißwasserextrakt im in vitro Verdauungsmodell . . . . . . . 804.2.3.2.2 Analytik der präzipitierten Anthocyane aus dem Heißwasser-

extrakt von Johannisbeertrester . . . . . . . . . . . . . . . . 824.2.3.2.3 Analytik der polymeren Anthocyane und der antioxidativen

Kapazität der Proben in den verschiedenen Verdauungsstufen 83

3

INHALTSVERZEICHNIS

4.2.3.3 Umsetzung des Johannisbeersaftes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 854.2.3.3.1 Analytik der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung des

Johannisbeersaftes im in vitro Verdauungsmodell . . . . . . . 854.2.3.3.2 Analytik der präzipitierten Anthocyane aus dem Johannis-

beersaft . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 884.2.3.3.3 Analytik der polymeren Anthocyane und der antioxidativen

Kapazität des Johannisbeersaftes in den verschiedenen Ver-dauungsstufen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

4.2.3.4 Umsetzung des Gärgetränkes auf Basis von vergorener Bierwürze undJohannisbeersaft . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

4.2.3.4.1 Analytik der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung desGärgetränkes auf Basis von vergorener Bierwürze und Johan-nisbeersaft im in vitro Verdauungsmodell . . . . . . . . . . . 91

4.2.3.4.2 Analytik der präzipitierten Anthocyane aus dem Gärgetränkauf Basis von vergorener Bierwürze und Johannisbeersaft . . 93

4.2.3.4.3 Analytik der polymeren Anthocyane und der antioxidativenKapazität des Gärgetränkes auf Basis von vergorener Bier-würze und Johannisbeersaft in den verschiedenen Verdauungs-stufen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

4.2.4 Umsetzung von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) . . . . . . . . . . . . . . . . . 954.2.4.1 Analytik der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung von Quercetin-

3-O-rutinosid (Rutin) im in vitro Verdauungsmodell . . . . . . . . . . 954.2.4.2 Analytik des präzipitierten Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) und des-

sen Abbauprodukte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 974.2.4.3 Analytik der antioxidativen Kapazität von Quercetin-3-O-rutinosid (Ru-

tin) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 984.2.5 Diskussion der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung der Flavonoide unter

anaeroben Bedingungen im in vitro Verdauungsmodell . . . . . . . . . . . . . 994.2.5.1 Enzymatische und mikrobielle Umsetzung der Aglykone und Glykoside

der Anthocyane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 994.2.5.2 Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1034.2.5.3 Weitere Reaktionen von Flavonoiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1044.2.5.4 Protein-Polyphenol-Interaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1054.2.5.5 Antioxidative Wirkung der Analyten während der Umsetzung im si-

mulierten in vitro Verdauungsmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1084.3 Umsetzung von Flavonoiden unter aeroben Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . 110

4.3.1 Metabolisierung von Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) innerhalb der verschiede-nen Stufen der Enzymaufreinigung aus Rhodococcus erythropolis DSM 44534 . 1104.3.1.1 Metabolisierung von Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) mit ganzen und

aufgeschlossenen Zellen von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 . . 1104.3.1.2 Umsetzung des Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) nach der isoelektri-

schen Fokussierung (IEF) des Rhodococcus erythropolis DSM 44534 . 1144.3.2 Mykolsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

4.3.2.1 Einfluss verschiedener C-Quellen auf das Wachstum von Rhodococcuserythropolis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

4.3.2.2 Ziehl-Neelsen-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1184.3.2.3 Bestimmung der Mykolsäuren in den Zellhüllen von Rhodococcus ery-

thropolis DSM 44534 Zellen mittels ESI-MS/MS . . . . . . . . . . . . 1204.3.3 Diskussion der mikrobiellen Umsetzungen der Flavonoide am Beispiel von Quercetin-

3-O-rutinosid (Rutin) unter aeroben Bedingungen durch Rhodococcus erythropo-lis DSM 44534 und die Auswirkung des Quercetin-3-O-rutinosids auf die Zellhülle1254.3.3.1 Enzymatische Umsetzung von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) durch

die Rutinase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

4

INHALTSVERZEICHNIS

4.3.3.2 Einfluss unterschiedlicher C-Quellen auf das Wachstum und die Per-meabilität der Zellhülle von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 . . 128

4.3.3.3 Aufbau der Mykolsäuren in der Zellhülle von Rhodococcus erythropolisDSM 44534 durch Variation der C-Quellen . . . . . . . . . . . . . . . 129

5 Zusammenfassung 132

6 Abkürzungsverzeichnis 163

7 Anhang 165

5

Danksagung

Die vorliegende Arbeit entstand von April 2009 bis April 2013 am Lehrstuhl für Bioanalytik der techni-schen Universität Berlin sowie im Forschungsinstitut für Spezialanalytik der Versuchs- und Lehranstaltfür Brauerei Berlin. Ein Teil der Arbeit wurde im Rahmen des Projektes „Ernährungsforschung – fürein gesundes Leben“ des Bundesministeriums für Bildung und Forschung finanziell gefördert. Die Un-tersuchungen gehörten zum Modul „Biomedizinische Ernährungsforschung im Rahmen der Hightech-Strategie für Deutschland und im Rahmenprogramm „Biotechnologie-Chancen nutzen und Gestalten“an, mit dem Titel „Nachweis der Funktionalität von pflanzlichen und mikrobiellen Nahrungsinhalts-stoffen im simulierten Darmmodell“.Zuerst möchte ich Prof. Dr. Leif-Alexander Garbe für die Überlassung des Themas, die wissenschaft-liche Betreuung und stetige Diskussionsbereitschaft sowie den großzügigen Freiraum und das entge-gengebrachte Vertrauen danken.Dann Prof. Dr.-Ing. Johannes Bader für die Übernahme des Koreferates und die gute Zusammenarbeitwährend der Bearbeitung des BmBF-Projektes. In diesem Zusammenhang möchte ich auch Prof. Dr.-Ing. Ulf Stahl und Fr. Dr. Edeltraud Mast-Gerlach für die hilfreiche Unterstützung und die anregendenDiskussionen im Rahmen des BmBF-Projektes danken.Danken möchte ich auch Fr. Dr. Enriqueta Martinez-Rojas für die Einarbeitung in die Mikrobiologie,ihre wertvollen Ratschläge, Ideen, Hilfestellungen und Vorschläge, welche wesentliche zu den Arbeitenum den Rhodococcus erythropolis DSM 44534 beigetragen haben. Fr. Dr. Renate Burkhardt, die michnicht nur durch die Durchführung zahlreicher IEF´s unterstütz hat, sondern auch durch stetige Dis-kussionen meine Arbeit bereicherte. Zudem möchte ich ihr für die gute Zeit im Gemeinschaftslaborund das akribische Korrigieren meiner Promotionsarbeit danken.Mein Dank gilt auch dem Projektpartner Herrn Frank Lienig von der Firma Liven GmbH c/o LienigWildfrucht-Verarbeitung für die Bereitstellung des schwarzen Johannisbeersaftes und seiner Mitarbeitbeim BMBF-Projekt.Ein großer Dank geht an meinem Projektpartner Dr. Martin Hageböck für die Durchführung der Ver-suche im in vitro Verdauungsmodell sowie den regen Ideenaustausch während des BmBF-Projektes.Danke auch allen Mitarbeitern und ehemaligen Mitarbeitern des Arbeitskreises Garbe, vor allem Wal-traud Poppe, Iris Tegler, Lina Hoppe, Martina Mengdehl und Mirja Rothe die mich in verschiedenenPhasen meiner Arbeit unterstützt haben und für mich mehr als nur Kollegen sind. Herzlichen Dankauch an Konrad Neumann, der immer da war wenn man ihn brauchte und stets geholfen hat wo erkonnte. Danke auch an Tutku Cansun Kurt für ihre Hilfe bei mikrobiologischen Fragen. Meinen Kor-rekturlesern dieser Arbeit danke ich für die sorgfältige Durchsicht und konstruktive Kritik.Danken möchte ich auch meinen Freunden die immer an den Erfolg dieser Arbeit glaubten. MeineEltern die mich stets in allem Unterstützt haben und mir immer die Freiheit gaben meine eigenenWege zu gehen. Meiner Schwester Lisa dafür, dass sie seit Anbeginn meines Studium immer da warum mich zu unterstützen und mir Mut zu machen.Mein allergrößter Dank gilt meinem Mann Christian, der wirklich immer an mich geglaubt hat. Derstets Verständnis für lange Arbeitszeiten und unendlich viele Wochenenden ohne mich aufgebracht hat.Der bis zum Schluss am gelingen dieser Arbeit mitgewirkt hat und ohne den ich es niemals geschaffthätte.

AbstractIm ersten Teil der Arbeit wurde eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Methode zur Analyse der Fla-vonoide und ihrer Abbauprodukte etabliert und validiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die AnthocyaneCyanidin-3-O-glucosid, Cyanidin-3-O-rutinosid, Delphinidin-3-O-glucosid, Delphinidin-3-O-rutinosid und dasFlavonol Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) für anaerobe, enzymatische bzw. mikrobiellen Abbaustudien in einemsimulierten, reproduzierbaren in vitro Verdauungsmodell eingesetzt. Die Anthocyane wurden als Reinsubstanzbzw. aus verschiedenen Nahrungsmittelmatrices auf Basis von schwarzem Johannisbeersaft eingesetzt. Rutinwurde ausschließlich als Reinsubstanz verwendet. Sowohl bei der enzymatischen als auch der enzymatische-mikrobiellen Umsetzung wurden die o.g. Substrate zu Delphinidin, Cyanidin, Quercetin-3-O-glucosid und Quer-cetin sowie zu den korrespondierenden Zuckern Glucose und Rutinose hydrolysiert. Durch die anschließendeRingspaltung der Aglykone wurden die Metaboliten 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure, 3,4-Dihydroxybenzoesäure,2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd und 1,3,5-Trihydroxybenzen gebildet. Bei der rein enzymatischen Umsetzung derAglykone wurden bereits am Ende der Duodenumpassage nur noch 0,5 % der Ausganskonzentration an Agly-konen gefunden. Bei den Glucosiden sank die Konzentration der Anthocyane im Überstand (Verdauungssaft,die präzipitierten Analyten wurden hier nicht berücksichtigt) während der enzymatisch-mikrobiellen Umset-zung bis zum Ende des simulierten Ileums nur auf 11 - 43 % ab. Am Ende der Metabolisierungsversuche lagdie Restmenge an Anthocyan im Überstand in den verschiedenen Ansätzen zwischen 11 % und 20 %. Parallelzur Metabolisierung wurde eine Komplexierung der Analyten durch Proteine der künstlichen Verdauungssäfteund den Lebensmittelmatrices beobachtet. Durch den Protein-Flavonoid-Komplex wurden die Flavonoide fürdie Analytik maskiert, was wiederum deren geringeren Wiederfindungsraten bei der Analytik erklärt. Bei derenzymatischen Umsetzung der Aglykone wurden für Cyanidin nur 76 % und für Delphinidin nur 69 % dereingesetzten Konzentration der Analyten zu Beginn des Versuches gefunden. Aus diesem Grund wurde eine Re-solubilisierungsmethode erfolgreich etabliert und validiert, wodurch eine korrekte Bilanzierung des Metabolismusmöglich wurde. So lagen bei der Inkubation von Delphinidin und Cyanidin (200 µg/ml Ausgangskonzentration)im Magensaft 15 % bzw. 17 % des Aglykons zu Beginn des Modells in präzipitierter Form vor. Beim Cyanidin-3-O-rutinosid lagen nur 7 % zu Beginn des Versuches in komplexierter Form vor. Neben dem Magensegment wurdeein Großteil der Anthocyane bei der Probenvorbereitung präzipitiert. Für die Proben des Gärgetränkes am En-de des Duodenums lagen 63 % der Anthocyane nach der Probenvorbereitung in präzpitierter Form vor. Diesemaskierten Anthocyane beeinflussen die Ergebnisse des Konzentrationsverlaufens während der Umsetzung imin vitro Modell maßgeblich. Zusätzlich konnten Polymerisierungen und Copigmentierungen der Anthocyane undihrer Abbauprodukte nachgewiesen werden. Eine deutliche Zunahme des Anteils an polymeren Anthocyanenkonnte im Verlauf des in vitro Modells beobachtet werden. Der gleiche Verlauf wurde auch bei der Bestimmungder antioxidativen Kapazität in den einzelnen Verdauungsstufen gefunden, hier steigt das antioxidative Poten-zial exemplarisch für den Heißwasserextrakt von 5,4 mmol/ml Troloxequivalent zu Beginn des Magensegmentesauf 24,6 mmol/ml Troloxequivalent am Ende des absteigenden Dickdarms an.Im dritten Teil der Arbeit wurde die aerobe Umsetzung von Rutin durch das Bakterium Rhodococcus erythropolisDSM 44534 untersucht. Durch die Zugabe von Rutin zum Kultivierungsmedium wurde die Bildung einer Rutina-se induziert, welche Rutin zu Quercetin und Rutinosid spaltet. Das Enzym wurde im Rahmen der Arbeit teilweisemittels isoelektrischer Fokussierung aufgereinigt und mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophoresesowie der Biotransformation von Rutin charakterisiert. Es wurde für das Enzym ein isoelektrischen Punkt von6,4 gefunden und die markanten Proteinbanden lagen zwischen 48 kDa bis 74 kDa. Neben der Rutinase wurdenauch Hinweise auf eine Quercetinase gefunden, welche Quercetin zu einem Depside spaltet. Weiterhin wurdeder Einfluss verschiedener Kohlenstoff-Quellen auf den Aufbau der Zellhülle von R. erythropolis und die damitkorrelierende Veränderung der Permeabilitätsbarriere untersucht. Die gezielte Untersuchung der Mykolsäurenmittels Elektronenspray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie zeigte, dass ein Zusammenhang zwischen derAnzahl an Doppelbindungen in der Meromykolatkette sowie dem α-Alkylzweig und der C-Quelle besteht. Soerhöhte sich in Gegenwart von Zitronensäure im Kultivierungsmedium der Anteil an mehrfach ungesättigtenMykolsäuren (zwei-, drei- und vierfach ungesättigt) auf 35 % für die Meromykolatkette im Vergleich zu Rutinals C-Quelle mit 17 %. Im α-Akylzweig lag der Anteil bei nur 3 % für das Rutin und 23 % für die Zitronensäure.Beim Einsatz von Rutin als einziger C-Quelle wurden keine vierfach ungesättigten Mykolsäuren gebildet. Mit derZunahme der ungesättigten Mykolsäuren ging eine Veränderung der Permeabilitätsbarriere einher. Dies konnteanhand der Ergebnisse aus der Ziehl-Neelsen-Färbung belegt werden. In allen Proben, die auf Zitronensäure alsC-Quelle wuchsen, ließen sich Hinweise auf die veränderte Permeabilität der Zellen finden.

Abstract

For some time, the physicochemical properties of secondary plant material have been the focus ofmany in vitro and in vivo studies, especially with regard to human health. However, neither theunderlying metabolic mechanisms nor the modification of the flavonoids and their decomposition pro-ducts have been fully elucidated. The present dissertation consists of three work packages. In the first,a reproducible high performance liquid chromatography method for the analysis of cyanidin-3-O-glucoside, cyanidin-3-O-rutinoside, delphinidin-3-O-glucoside, delphinidin-3-O-rutinoside, quercetin-3-O-rutinoside (rutin) and their degradation products was established and validated. The other packa-ges consider the conversion of the flavonoids by microorganisms through creating aerobic conditionsin a reproducible in vitro digestion model, on the one hand, and anaerobic conditions through thebacterium Rhodococcus erythropolis DSM 44534, on the other. The conversion of the flavonoids underenzymatic or microbial degradation was examined in the in vitro digestion model. The anthocyaninscame as pure substances or in different food matrices based on black-currant juice. Only 0,5 % ofthe initial concentration of aglycones was found after the enzymatic conversion. The glycosides, incontrast, amounted to between 6 % and 20 % of the initial concentration of anthocyanin in diffe-rent formulations. The rutin concentration decreased ultimately to 40 % of the simulated digestionmodel during the enzymatic and microbial degradation. Besides metabolization, the model showedthat the analytes complexed through proteins from the artificial digestive juice and food matrices.This protein-flavonoide complex masked the flavonoids, which explains the low recovery rate of thesecompounds in analytic results. In order to correct for this, a resolubilisation method was developedand validated successfully. Apart from the flavonoids complexing extensively in the stomach, a majorpart of anthocyanins was precipitated during the sample preparation. Regarding the samples of fer-mented beverages, 63 % of the anthocyanins was bound by proteins at the end of the ileum. Thesemasked anthocyanines significantly influenced the results of the concentration progress during theconversion in the in vitro digestion model. The model illustrated additionally the polymerization andco-pigmentation of the anthocyanins and their degradation products. In the process of the in vitrodigestion model, the amount of polymeric anthocyanins increased. In determining the antioxidant ca-pacity at the individual digestion levels, the same was true for anthocyanins and rutin. The antioxidantpotential of the hot water extract, for example, increased from 5,4 mmol/ml trolox equivalent at thebeginning of the stomach segment to 24,6 mmol/ml trolox equivalent at the end of the descendingcolon.The results reveal that the degradation of anthocyanins in the in vitro digestion model mainly baseson physicochemical influences, in addition to a great number of secondary reactions (polymerization,co-pigmentation). Rutin, by contrast, is metabolized by enzymatic-microbial influences.

In a third step, rutin was degraded aerobically through the bacterium Rhodococcus erythropolis DSM44534. A rutinase was thus induced to decompose rutin into quercetin and rutinosid. The tentativerutinase was partially purified, whereby an isoelectric point of 6,4 and a molecular weight of 48 kDaand 74 kDa was found for enzyme fractions, which decomposed rutin. Furthermore, the influenceof different carbon sources on the assembly of the cell layer of R. erythropolis and their correlatedchanges in the permeability barrier was examined. The targeted analysis of mycolic acid by electrosprayionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) showed a correlation between the number ofdouble bonds and the carbon source. In the presence of citric acid in the culture medium, the numberof polyunsaturated mycolic acids increased to 35 % for the meromycolate chain compared to rutinas a carbon source to 17 %. The number of polyunsaturated mycolic acids in the α-alkyl-branch was3 % and 23 % for the rutin and citric acid respectively. When rutin was used as a sole carbon source,no fourfold unsaturated mycolic acid occurred. Through the increase in unsaturated mycolic acid, thepermeability barrier changed. The results obtained from Ziehl-Neelsen staining confirmed this change.Both citric acid and rutin influenced during cultivation in different ways not only the enzymes formed,but also growth and permeability barrier of the Rhodococcus erythropolis DSM 44534 cell layer.

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1.1 Polyphenole und PolyphenolsubstanzklassenPolyphenole sind natürlich vorkommende chemische Verbindungen, welche die größte Gruppe der se-kundären Pflanzenstoffe darstellen. Sie gehören zu den Sekundärmetaboliten und sind damit nicht wiedie primären Pflanzenstoffe (Proteine, Lipide und Kohlenhydrate), für die Pflanze essentielle Ener-gielieferanten. Sekundäre Pflanzenstoffe liegen nur in geringen Mengen in den Pflanzen vor und fun-gieren dort unter Anderem als Duft- und Lockstoffe sowie Geschmacksträger. Die Polyphenole sindaromatische Verbindungen mit mindestens zwei Hydroxylgruppen je aromatischem Ring. Unterschie-den werden die einzelnen Substanzklassen nach den folgenden Kriterien: Anzahl und Verteilung ihrerHydroxylgruppen, Vorliegen eines methylierten oder glykosylierten Zustandes (Abb. 1). Die Gruppeder Polyphenole unterteilt sich in die Substanzklassen: Flavonoide, Stilbene und Phenolcarbonsäuren(Benzoesäurederivate und Zimtsäurederivate). Neben den monomeren Polyphenolen gibt es auch nochdie polymeren Phenole.

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Abbildung 1: Einteilung der Polyphenole nach ihrer Struktur

1.2 FlavonoideVon den Flavonoiden gibt es 8000 verschiedene natürliche Verbindungen [Hänsel und Sticher, 2009].In der Natur liegen sie hauptsächlich als Flavonoidglykoside vor und sind in Pflanzen im WesentlichenBestandteil von Früchten und Blättern [Harborne, 1988; Mazza und Miniati, 1993]. Das Grundgerüstder Flavonoide ist das Flavan (2-Phenylbenzodihydropyran). Die Vielfalt der Flavonoidverbindungenergibt sich durch die verschiedenen Substitutionsmuster der Aromatenringe A und B (A- und B-Ring) sowie das Anbinden verschiedener Zuckern. Der Flavonoidgehalt in den Pflanzen ist je nachPflanzensorte unterschiedlich und zudem abhängig von Lichteinfluss und klimatischen Bedingungen.Die Flavonoide sind zum Großteil sehr oxidationsanfällig.

1.2.1 Anthocyane

Der Begriff Anthocyan leitet sich von den griechischen Worten Anthos = Blüte und kyanos = blaueFärbung ab. Anthocyane bilden die größte Gruppe der wasserlöslichen Farbpigmente. In der Naturliegen sie hauptsächlich als Glykoside vor. Als Zuckerkomponenten sind meist Glucose, Rutinose, Ga-lactose und Rhamnose zu finden. Die Anthocyane stellen eine farbgebende Komponente für Blüten

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und Früchte dar und sind in der äußeren Zellwand lokalisiert. Dort schützen sie die Pflanzen als Ra-dikalfänger vor den negativen Einflüssen der UV-Strahlung. UV-Strahlung kann bei Pflanzen, wieauch Menschen, zur Bildung von oxidative wirkenden Stoffen führen, welche die Pflanze schädigen.Aus diesem Grund lagern Pflanzen Flavonoide als Antioxidantien in ihrer äußeren Gewebsschicht(meist Epidermis) ein [Bilger et al., 1997; Burchard et al., 2000]. Neben ihren antioxidativen Eigen-schaften liegt das Anthocyan auch als positiv geladenes Flavyliumkation mit Chlorid als Gegenion inPlanzen und Früchten vor. Den höchsten Anteil an Anthocyanen besitzen die Apfelbeere, schwarzeJohannisbeere, Heidelbeere und Holunderbeere. Die Anthocyane unterscheiden sich in ihren gebun-denen Zuckerkomponenten sowie ihren Substituenten am B-Ring. Ihr Farbspektrum verläuft von rotüber violett nach blau, wobei sich das Farbspektrum mit zunehmendem Grad der Hydroxylierungin Richtung blau verschiebt (Hypsochromer Shift) [Markakis und Jurd, 1974]. Eine Verschiebung inRichtung rot geschieht dagegen durch einen zunehmenden Grad an Glykosylierung und Methylierung(Bathochromer Shift) [Ackermann, 2010]. Neben den antioxidativen Eigenschaften wird den Antho-cyanen auch der Schutz vor koronaren Herzerkrankungen sowie Krebserkrankungen zugesprochen. InAbschnitt 1.3 werden die physiologischen Eigenschaften näher erläutert.Die stabilste Form des Anthocyans, das Flavyliumkation, liegt bei einem pH von 1 - 3 vor. Bei Erhö-hung des pH-Wertes auf 4 - 5 wird an die C 2 - Position ein Hydroxyanion gebunden und es bildetsich das farblose Chromenol. Bei pH 6 - 7 wird Wasser abgespalten und das Anthocyan liegt dannals purpurfarbene chinoide Anhydrobase vor. Bei pH 7 - 8 bildet sich schließlich eine tiefblaue ioni-sche Anhydrobase aus [Jurd, 1972; Harborne, 1988; Mazza und Miniati, 1993]. Durch Öffnung desAromatenrings geht die ionische Anhydrobase in das gelbe Chalkon über (Abb. 2).

Abbildung 2: Strukturelle Veränderung der Anthocyane in Abhängigkeit vom pH-Wert (nach Fleschhutet al. [2006])

Die Anthocyane sind Licht-, Temperatur- und Sauerstoffempfindlich. Der genaue Zerfallsmechanismusder Anthocyane ist noch ungeklärt, bekannt ist jedoch, dass das Chromenol über das alpha-Diketonzum Aldehyd und der korrespondierenden phenolischen Carbonsäure zerfällt. Die dabei gebildete Car-bonsäure ist charakteristisch für das jeweilige Ausgangsanthocyan, während bei allen Anthocyanender gleiche Aldehyd gebildet wird (Abb. 3). Bei den Cyanidinen wird die 3, 4-Dihydroxybenzoesäure(Protocatechusäure) gebildet und bei den Delphinidinen die 3, 4, 5-Trihydroxybenzoesäure (Gallus-säure). Als Aldehydformen sind prinzipiell zwei Formen möglich: 2, 4, 6-Trihydroxybenzaldehyd (Phlo-

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roglucinolaldehyd) [Piffaut et al., 1994; Kern et al., 2007] und 2, 4, 6-Trihydroxyphenylacetaldehyd(Phloroglucinacetaldehyd) [Jurd, 1972]. Nach dem bislang anerkannten Zerfallsmechanismus wird derPhloroglucinacetaldehyd postuliert. Allerdings wurde in der Literatur dieser Aldehyd noch nicht näherals Abbauprodukt analysiert und nachgewiesen.

Abbildung 3: pH-abhängiger Zerfallsmechanismus der Anthocyanidine [nach Markakis und Jurd, 1974]

1.2.2 Flavonole

Die Flavonole liegen hauptsächlich als Glykoside vor, wobei sie an der 3-Position des C-Ringes ver-knüpft sind. Die am häufigsten vorkommenden Flavonole sind Quercetin, Rutin, Myricetin und Kämp-ferol. Die Flavonole sind meist farblos bis gelb. Brokkoli, Zwiebeln, Äpfel, Grünkohl, Beeren undRotwein sind reich an Flavonolen.

1.2.2.1 Quercetin

Quercetin ist das Aglykon der Flavonole und liegt in der Natur nur in seiner glykosylierten Form vor.Es ist blass gelb und besitzt antioxidative sowie antikanzerogene Eigenschaften. Quercetin kommtunter anderem in Trauben, Äpfeln und Zwiebeln vor. Für das Quercetin sind bisher 179 Glykosidebekannt [Watzl und Rechkemmer, 2001].

1.2.2.2 Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin)

Beim Rutin handelt es sich um das Rutinosid des Quercetin. Es ist ein blass gelbes Pulver, das schwerlöslich in Wasser ist. Allgemein ist Rutin in unpolaren Lösungsmittel besser löslich als in polaren.Im Vergleich zu den Anthocyanen ist Rutin sehr stabil. Es besitzt entzündungshemmende, bakterizideund antioxidative Eigenschaften und setzt im menschlichen Körper an den Blutgefäßen und dem Darman. Rutin wird bei Venenleiden eingesetzt, da es gefäßstärkende Eigenschaften besitzt. In den Pflanzennimmt es als Radikalfänger eine Schutzfunktion vor der UV-Strahlung ein. Rutin ist in Zitrusfrüchten,Paprika, Buchweizen, Himbeeren, Holunder und Rotwein enthalten und wird hauptsächlich aus Chinaund Brasilien importiert.

1.3 Physiologische Eigenschaften von PolyphenolenDie Polyphenole zählen zu den bioaktiven Pflanzenbestandteilen, denen eine gesundheitsförderndeWirkung zugesprochen wird. Sie weisen antioxidative, blutdrucksenkende, entzündungshemmende und

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antikanzerogene Eigenschaften auf.

1.3.1 Antioxidative Eigenschaften

Der Organismus wandelt in verschiedensten biochemischen Prozessen den lebensnotwendigen Sauer-stoff in reaktive Sauerstoffspezies (ROS) um. Solche Radikale werden u. A. als Nebenprodukte derZellatmung in den Mitochondrien, in der Atmungskette in Komplex I und II und in Entzündungszellenfrei [Nohl et al., 2003]. Dabei werden die folgenden reaktiven Intermediate gebildet: HydroxylradikalOH ., Alkoxylradikal RO., Peroxylradikal ROO., Superoxidradikalanion O.−2 , sowie auch nicht radikali-sche Verbindungen wie Wasserstoffperoxid H2O2 und Singulettsauerstoff 1O2. Im menschlichen Körperverursachen ROS die Peroxidation von Proteinen und Lipiden. Verstärkt wird die Radikalbildung beimMenschen durch äußere Einflüsse wie Umweltgifte, Zigarettenrauch und UV-Strahlung. Für den Abbaudieser schädlichen Radikale stehen dem menschlichen Organismus enzymatische Schutzmechanismenzur Verfügung, sowie selbst synthetisierte niedermolekulare Substanzen wie das Gluthation und dieHarnsäure. Zudem werden mit der Nahrung Antioxidantien aufgenommen. Wertvolle Antioxidantiensind z.B. Vitamin-C, sekundäre Pflanzenstoffe wie Flavonoide (darunter vor allem die Anthocyane)[Kong et al., 2003] und Carotinoide. Kaffee, Bananen, Tee und Rotwein gehören dabei zu den häufig-sten Lebensmittelquellen für Antioxidantien.Der Begriff „oxidativer Stress“ bezeichnet den Zustand, bei dem der Anteil an ROS durch eine ex-zessive Radikalproduktion gegenüber der Anzahl an Antioxidantien im Organismus überwiegt. Diefreien Radikale können dann ungehindert mit Zielmolekülen der DNA, Proteinen und Lipiden reagie-ren und so den Organismus nachhaltig schädigen. In den letzten Jahren wurde der Zusammenhangzwischen oxidativem Stress und neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Crohn, Morbus Alz-heimer, Morbus Parkinson und amytrophe Lateralsklerose untersucht [Spector, 1995; Harman, 2003].Es wird ebenfalls eine Beziehung zwischen der Entstehung von degenerativen Erkrankungen wie ko-ronarem Herzinfarkt und Krebs bei oxidativem Stress vermutet [Fleschhut, 2004].Eine mögliche Schutzfunktion von Antioxdantien, wie den Polyphenolen, gegenüber der Entwicklungeiner koronaren Herzerkrankung oder Krebs wurde bereits mehrfach in vitro und in vivo untersucht[Hertog et al., 1993]. Flavonoide wirken antioxidativ, indem sie Elektronen oder Wasserstoff aus ih-ren Hydroxylgruppen auf die „freien Radikale“ im Organismus transferieren. Damit wird die Bildungweiterer ROS unterbunden und die Lipid- und Proteinoxidation verhindert [Ramirez-Tortosa et al.,2001; Katsube et al., 2003; Viljanen et al., 2004]. Bei diesem Vorgang gebildete Polyphenylradikalesind weniger aktiv [Bors et al., 1997] und können durch Reaktion mit weiteren Radikalen in die stabileChinonstruktur übergehen [Pietta, 2000].Eine wesentliche strukturelle Voraussetzung für die antioxidative Eigenschaft der Flavonoide ist ih-re ortho-ständige Hydroxylgruppe am B-Ring [Rice-Evans et al., 1996]. Diese dient nicht nur zurStabilisierung des Phenoxylradikals, sondern ist auch für die Elektronendelokalisierung wichtig. EineC2-C3-Doppelbindung mit einer Carbonylgruppe in Position 4 am C-Ring unterstützt ebenfalls dieDelokalisierung und zusätzliche Hydroxylgruppen in 3‘ und 5‘ Position erhöhen das Radikalfängerpo-tential (Abb. 4) [Cotelle et al., 1996; Rice-Evans et al., 1996; Pannala et al., 2001]. Die verschiedenenAntioxidantien wirken auf die einzelnen ROS unterschiedlich gut. Quercetin z.B. erfüllt alle obengenannten Voraussetzungen und ist im Vergleich zu Morin ein starker Hydroxylradikalfänger. BeimSuperoxidradikalanion hingegen ist Morin der bessere Radikalfänger [Huguet et al., 1990; Husain et al.,1987]. Anthocyane sind im Vergleich zu den Flavonolen weniger starke Antioxidantien, da ihnen dieCarbonylgruppe am C-Ring fehlt [Yamada et al., 1999; Ackermann, 2010].

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Abbildung 4: Struktur-Wirkbeziehung der antioxidativen Kapazität von Flavonoiden am Beispiel vonQuercetin [modifiziert nach Bors et al., 1990]

Ein weiterer Ansatzpunkt der Flavonoide ist die Chelatisierung von redoxaktiven Metallionen. Fla-vone und Flavonole besitzen durch ihre strukturellen Eigenschaften die Fähigkeit Eisen (II)-Ionenzu chelatisieren und damit die Lipidoxidation und die Fenton-Reaktion zu hemmen [Afanasev et al.,1989; Cheng und Breen, 2000; Mira et al., 2002]. Anthocyane hingegen können die Bindungsstellen desLow density Lipoprotein (LDL) für Kupfer belegen und auf diesem Weg die Oxidation dieses Proteinsverhindern [Satue-Gracia et al., 1997].Der dritte Ansatzpunkt der Flavonoide ist die Hemmung der ROS-produzierenden Enzyme wie Xan-thinooxidase und Myeloperoxidase. Der Einfluss verschiedener Flavonoide auf die Aktivität der Li-pooxygenase und Cyclooxygenase wurde bereits umfassend untersucht [Horie et al., 1986; Wheelerund Berry, 1986; Moroney et al., 1988]. Dabei konnte beobachtet werden, dass die Hemmung der En-zyme stark strukturabhängig ist. Verbindungen, die ähnlich aufgebaut sind wie das Quercetin, hemmendie Lipooxygenase stärker, während Verbindungen wie Chrysin selektiv die Cyclooxygenase hemmen.Zudem sind die Flavonoide in der Lage andere Antioxidantien vor deren Oxidation zu schützen (To-copherol und Ascorbinsäure) bzw. diese rückgängig zu machen (Regeneration von Vitamin C und E)[Kandaswami und Middleton, 1994; Bors et al., 1995; Formica und Regelson, 1995; Miura et al., 2000;Pietta, 2000].

1.3.2 Schutz vor Krebserkrankung

Epidemiologische Studien sowie Ergebnisse aus Tierversuchen und in vitro Studien postulieren fürnicht-nutritive Inhaltsstoffe in Lebensmitteln ein antikanzerogenes Potential [Jacobasch et al., 2000;Wang und Stoner, 2008; Yang et al., 2001]. Dabei erklärt man die chemopräventive Wirkung der An-thocyane durch deren Fähigkeit in drei verschiedenen Phasen der Krebsentstehung einzugreifen: dieInitiation, Promotion und Progression des Tumors.In der Initiationsphase der Krebsentstehung wird die DNA durch chemische, physikalische oder vi-rale Einflüsse modifiziert. Wird diese Mutation nicht durch DNA-Reparaturmechanismen beseitigtoder die Zelle durch Apoptose ausgeschaltet, bleibt die Mutation bestehen und ist irreversibel. Beider Tumorgenese liegt die Mutation in einem Gen vor, das für die Zellteilung oder die Kontrolledes Zellzyklus verantwortlich ist. Beispielsweise können sich in Anwesenheit von Anthocyanen, durchihre strukturelle Ähnlichkeit mit den Nukleotiden, Anthocyan-DNA-Copigmente ausbilden. Auf die-se Weise können die Bindungsstellen der Kanzerogene maskiert werden [Duthie und Dobson, 1999].Flavonoide wie Quercetin und Procyanidin können die Expression der Monooxygenasen, die zur Cy-tochrom P450-Familie gehören, hemmen [Edenharder et al., 1994; Hodnick et al., 1998; Yoshimotoet al., 2001; Konczak-Islam et al., 2003]. Für Cyanidin und Delphinidin konnte eine Hemmung derTyrosinkinase-Aktivität des Epidermal Growthfactor Receptors (EGFR) nachgewiesen werden [Crossund Dexter, 1991]. Belegt ist mittlerweile auch, dass die Anzahl der Hydroxylgruppen sowie die An-wesenheit von Hydroxylgruppen im B-Ring bei diesen Inhibierungsvorgängen eine entscheidende Rollespielen. So konnte Pool-Zobel et al. [2005] die Reduktion H2O2-induzierter Strangbrüche durch antho-cyanreiche Pflanzenextrakte zeigen. In der Promotionsphase regen Promotoren die initiierten Zellendann zum Wachstum und damit zur Tumorbildung an. Durch den stetigen Wachstumsreiz und die

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Zellproliferation entsteht so eine präneoplastische Zelle, welche eine Karzinomvorstufe darstellt. ImZellkulturmodell zeigte Hou [2003] dass Delphinidin, Petunidin und Cyanidin die Induzierung der AP-1-Aktivität und die neoplastische Transformation durch eine Aktivierung der MAP-Kinasen blockierenkönnen. Bildung und Wachstum des Tumors kann so unterbunden werden. Für diese Eigenschaft istdie ortho-Dihydroxyphenyl-Struktur am B-Ring entscheidend. Auf das Wachstum der normalen Ge-webezellen nehmen die Polyphenole allerdings keinen Einfluss [Wang und Stoner, 2008].Die Progression ist die dritte Phase zu der Tumorgenese. Es findet nun die eigentliche maligne Trans-formation statt. Die mutierte Zelle teilt sich fortlaufend und unterliegt dabei nicht mehr dem normalenZelltod. Für reine Anthocyane und Beerenextrakte wurde in den Studien von Hou [2003], Katsube et al.[2003] und Fimognari et al. [2004] ein induktiver Einfluss auf die Apoptose in Tumorzellen gezeigt.Auch hierbei scheint die ortho-Dihydroxyphenyl-Struktur am B-Ring wieder eine entscheidende Rollezu spielen. Zahlreiche in vitro Studien belegen diese Ergebnisse, geben aber noch keinen Aufschlussüber die exakten Mechanismen der apototischen Wirkung auf Tumorzellen.In zahlreichen Tierstudien konnte mittlerweile die positive Wirkung der Polyphenole auf den Krank-heitsverlauf bei Krebspatienten gezeigt werden [Stoner et al., 2007; Wang und Stoner, 2008]. DieArbeitsgruppe um Kang et al. [2003] untersuchte beispielsweise die Reduktion verschiedener Darm-krebsarten an APC Mäusen nach der Gabe von 3 g/kg Anthocyanen. Es konnte zwar ein Effekt auf dieTumor- und Kolonkarzinombildung gefunden werden, die Ergebnisse waren allerdings für die Dünn-und Dickdarmtumore nicht signifikant. Eine Supplementierung von Darmkrebspatienten mit getrock-neten Früchten zeigte Einfluss auf die Apoptose und verringerte die Proliferation der Krebszellen[Arnold et al., 2007]. Bei Hautkrebs und Lungenkrebs konnte die Hemmung durch Anthocyane jedochbereits eindeutig gezeigt werden [Wang und Stoner, 2008].Die aus Tierversuchen erworbenen Ergebnisse konnten jedoch bislang nicht verlässlich auf den mensch-lichen Organismus übertragen werden. Sowohl Bode et al. [1999] als auch Bosetti et al. [2006] konntenkeine präventiven oder therapeutischen Auswirkungen der Anthocyane auf die Krebserkrankung auf-zeigen. Zusammenfassend konnten bislang keine einheitlich belegte positive Wirkung der Anthocyaneauf den Verlauf der Krebserkrankung beim Menschen gezeigt werden.

1.3.3 Schutz vor koronarer Herzerkrankung

Viele epidemiologische Studien haben sich mit dem möglichen protektiven Einfluss von Polyphenolenauf koronare Herzkreislauferkrankungen (HLK) beschäftigt. Resveratrol und die Anthocyane stehendabei im Fokus dieser Annahme und deren Wirkung wird mit dem sogenannten „French Paradox“in Zusammenhang gebracht. Das Phänomen des „French Paradox“ beschreibt laut einer Studie denUmstand, dass die Bevölkerung Frankreichs trotz sehr fettreichem Essen und ungesunder Ernährungeine niedrigere Sterberate an HLK aufweisen, als vergleichbare westliche Industrieländer. Der hoheKonsum an Rotwein und die damit verbundene hohe Konzentration an Polyphenolen im Blut werdenmit diesem Phänomen in Zusammenhang gebracht. Einige Arbeiten belegten den protektiven Effektder Anthocyane auf die Bildung einer Arteriosklerose und die damit korrelierte HLK [Iijima et al.,2000; da Silva et al., 2000; Staprans et al., 2005]. Fuhrmann et al. [1995] zeigten ebenfalls einen Zu-sammenhang zwischen der Aufnahme von Rotwein und der Reduktion der Lipidperoxidation, die exvivo durch Kupfer(II)-Ionen induziert werden. Andere Studien konnten trotz analogem Versuchsauf-bau keinen protektiven Einfluss nach Konsum von Rotwein nachweisen [de Rijke et al., 1996; van hetHof et al., 1997; Caccetta et al., 2000]. Umstritten sind auch weiterhin die wirksamen Komponenten.Einige Arbeitsgruppen gehen davon aus, dass der Alkohol maßgeblich Einfluss auf die LDL und HDLOxidation nimmt [Gaziano et al., 1993; Criqui und Ringel, 1994; Johansen et al., 2003]. In einer Studievon Burns et al. [2000] wurde die gefäßerweiternde Eigenschaft des Rotweins auf den Anthocyange-halt zurückgeführt. Neben den Anthocyanen sollen vor allem die polymeren Proanthocyanidine einenEinfluss haben [Andriambeloson et al., 1998].In Kohortenstudien von Hertog et al. [1993] wurde ebenfalls die Assoziation zwischen einer Flavo-noidaufnahme zum Risiko einer HLK untersucht. Es konnte anhand der Ergebnisse keine schützendeFunktion der Flavonoide postuliert werden, lediglich ein Schutz vor dem tödlichen Verlauf der Erkran-kung konnte aufgezeigt werden [Rimm et al., 1996]. Für den Menschen gibt es jedoch bislang keineverlässlichen Aussagen.

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1.3.4 Entzündungshemmende Eigenschaften

Die Flavonoide besitzen entzündungshemmende Eigenschaften, indem sie unter anderem die Bildungvon Stickstoffmonoxid (NO) inhibieren und NO-Radikale abfangen, die an chronischen Entzündungs-prozessen beteiligt sind. Zudem hemmen sie das COX-2 Enzym, das für die Bildung von Entzündungs-mediatoren, wie dem Prostaglandin verantwortlich ist. Zusätzlich können Flavonoide die Bildung vonInterleukinen hemmen, die an Entzündungsprozessen beteiligt sind [Wang und Stoner, 2008]. In zahl-reichen in vitro Tests konnte gezeigt werden, dass die Ausschüttung von Entzündungsproteinen nachGabe von Flavonoiden unterbunden werden kann [Mulabagal et al., 2009]. So zeigten Wang et al. [1999]in ihrer in vitro Studie, dass die Aglykone der Anthocyane die Prostagladin-Endoperoxid H-Synthase1 und 2 inhibieren können. Weitere in vivo Studien an Tieren bestätigten die Verringerung von Ent-zündungserscheinungen durch Zugabe von Flavonoiden [Wang und Mazza, 2002; Valcheva-Kuzmanovaet al., 2005].

1.3.5 Antibakterielle und antivirale Eigenschaften

Neben den bisher genannten Eigenschaften weisen einige Flavonoide gegenüber verschiedenen Typenvon Viren eine antivirale Wirkung auf. Es wird vermutet, dass diese Eigenschaft im Zusammenhangmit der Phytolaxin-Wirkung steht. Dies kann zum einen Änderungen der Zellwandpermeabilität zurFolge haben und zum anderem die Denaturierung und Bindung an für Viren, Pilze und Bakterienlebenswichtige Enzyme bewirken. So konnte für Quercetin in vitro die Wirksamkeit gegen Herpes sim-plex Typ I und Tollwut gezeigt werden. Die Flavonoide lindern nicht nur die Infektiosität sondernreduzieren auch die interzelluläre Replikation der Viren. Aus der Volksmedizin ist lange bekannt, dassMoosbeeren und Holunder präventiv gegen Harnwegsentzündung wirken und auch zu deren Thera-pie eingesetzt werden können [Avorn et al., 1994]. Sobota [1984] zeigte, dass Cranberries ebenfallsdiese Eigenschaften aufweisen. Howell et al. [1998] führten diesen Effekt allerdings nicht auf die An-thocyane, sondern auf die antibakterielle und antiadhäsive Wirkung der Proanthocyane zurück. Invitro wurden antibakterielle Eigenschaften der Flavonoide auf grampositive Bakterien wie Staphylo-coccus aureus und Bacillus cereus sowie auf einige gramnegative Erreger wie Escherichia coli oderden Aktenomyzeten in der Mundhöhle gefunden [Ammar et al., 1990]. Knox et al. [2001] stellten inihren Arbeiten einen Zusammenhang zwischen Flavonoiden aus Johannisbeer- und Holunder-Extraktund einer Deaktivierung von Influenza A und B- sowie Herpesviren 1 und 2 her. In seinen in vitroStudien untersuchte Knox das Wachstum von Influenza- und Herpesviren auf Medium, welches mitverschiedenen Konzentrationen von Flavonoiden im Extrakt versetzt wurde. Ab einer Konzentrationvon 100 µg/ml bzw. 10 µg/ml fand kein Zellwachstums mehr statt, während bei kleineren Konzentra-tionen die Wachstumskurve deutlich flacher verlief. Knox et al. [2001] vermuteten, dass die antiviraleEigenschaft auf einer Verhinderung der Adsorption an den Zellen oder auf einer Inaktivierung derZelle beruht.

1.3.6 Weitere positive Eigenschaften der Flavonoide

In Arbeiten von Matsui et al. [2001a,b, 2002] wurde ein antidiabetischer Einfluss von Anthocyanenauf Ratten beschrieben, welcher von Tsuda et al. [2003] mit Versuchen an Mäusen bestätigt werdenkonnte [Matsui et al., 2001a,b, 2002; Tsuda et al., 2003]. Zudem postulierten Tsuda et al. [2003] eineschützende Wirkung der Anthocyane vor Fettleibigkeit.In der Augenheilkunde hat man positive Auswirkungen auf die Nachtsicht, progressive Myopie (Kurz-sichtigkeit) und diabetische Retinopathie (durch Diabetes hervorgerufene Netzhauterkrankung) gefun-den. Neuere Studien befassen sich ebenfalls mit dem Einfluss der Flavonoide auf das Sehvermögen. Sozeigten Matsumoto et al. [2003], dass Anthocyane einen Effekt auf die Regeneration von Rhodopsinhaben, welches in den Stäbchen der Netzhaut des Auges vorhanden ist und dort für das Hell-Dunkel-Adaption verantwortlich ist. Daneben wurden noch die Verbesserung der Adaption [Nakaishi et al.,2000], der Rückgang von Ermüdungserscheinungen und subjektive ophthalmologische Beschwerdennach Überspannung diskutiert. Jedoch konnten weder Zadok et al. [1999] noch Muth et al. [2000] inihren Studien den Einfluss von Anthocyanen auf die Nachtsicht und Kontrastsensitivität nicht bestä-tigen.

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1.4 Übersicht VerdauungstraktDie Aufgabe des Verdauungstrakts ist es, die aufgenommene Nahrung soweit abzubauen, dass dieNahrungsbestandteile vom Organismus absorbiert werden können. Dazu werden eine Vielzahl vonspezifizierten Enzymen und Mikroorganismen eingesetzt, die an die physiologischen Bedingungen derunterschiedlichen Abschnitte angepasst sind. Das Hauptaugenmerk liegt in den folgenden Abschnittenauf den einzelnen Verdauungsabschnitten, die für das simulierte Darmmodell verwendet werden.

Abbildung 5: Menschlicher Verdauungstrakt [Wikimedia commons]

1.4.1 Mundhöhle

In der Mundhöhle wird die aufgenommene Nahrung zerkleinert, mit Speichelsekret verschleimt und derVerdauungsprozess eingeleitet. Das Sekret wird von den 3 großen Mundspeicheldrüsen, der Unterzun-gendrüse, der Unterkieferdrüse und der Ohrspeicheldrüse in drei verschiedenen Zähigkeiten produziert.Pro Tag werden dabei 1 – 1,5 l Speichel produziert, der aufgrund des vorhandenen Hydrogencarbonatseinen pH von 7 aufweist. Dem Speichel werden verschiedene positive Einflüsse auf die Zahngesundheitzugesprochen; er erleichtert das Sprechen, löst Geschmacksstoffe aus der Nahrung und transportiertdiese zu den Geschmacksrezeptoren. Die Speichelbildung wird vom vegetativen Nervensystem gesteu-ert und wird durch äußere Reize wie z.B. Geruch ausgelöst. Der Speichel enthält Proteine wie Ptyalin,Mucin, Lysozym und Immuglobin A. Ptyalin ist eine α-Amylase, die die α-1,4-glykosidische Bindungder Kohlenhydratpolymere hydrolysiert. Das Enzym wird im Magen durch die Absenkung des pH-Wertes deaktiviert. Mucin ist ein Glykoprotein, das zu ca. 50 % aus Kohlenhydraten besteht. Es dientdem Einschleimen der Nahrung und macht diese gleitfähiger [Bansil et al., 1995]. Immunoglobin Aund Lysozym dienen zur Abwehr von körperfremden Mikroorganismen und sind in der Lage Zellwand-bestandteile grampositiver Bakterien anzugreifen [Horn et al., 2005]. Trotz der kurzen Verweildauerwird die Nahrung so weit zerkleinert, dass ihre Viskosität abnimmt und somit das Herunter schluckenerleichtert wird.In der Mundhöhle befindet sich eine ausgeprägte Mikrobiota mit 600 unterschiedlichen Spezies, dar-unter sind alleine 600 verschiedene Prokaryoten [Human Oral Mikrobiome Database; Dewhirst et al.,

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2010]. Dabei wird die Mundhöhle durch die Nahrung ständig neu besiedelt. Der zerkleinerte Speisebrei(Chymus) wird dann durch die Speiseröhre (Ösophagus) in den Magen überführt.

1.4.2 Magen

Beim Magen handelt es sich um ein Hohlorgan, das ein Volumen von 1,2 - 1,6 l umfasst. Die Nahrunggelangt über die Speiseröhre in den Magenkörper und verweilt dort so lange, bis sie einen ungefährenDurchmesser von 1 mm aufweist. Dabei führen Kontraktionen im Abstand von 20 sek zu einer Durch-mischung des Chymus und eine Emulgierung der Fette. Parallel findet auch eine erste Aufspaltung derProteine in der Nahrung statt. Zu diesem Zweck wird der Speisebrei mit Salzsäure auf pH 0,8 – 2,5 (imnüchternen Zustand) eingestellt und mit den Proteasen Pepsin und Kathepsin sowie dem GlykoproteinMucin, welches vor Selbstverdauung schützt, versetzt. Der Magensaft wird von den Magendrüsen pro-duziert, wobei diese täglich zwischen 2 und 4 Liter herstellen. Die Proteine denaturieren im Magen undwerden in kleinere Polypeptide mit einer Molmasse von 600 - 3000 Da zersetzt. Je nach Beschaffenheitder Nahrung erhöht sich der pH-Wert im Magen für eine Dauer von ca. 1 h auf pH 4,5 - 6,5. DieVerdauung dauert im Durchschnitt 2 h, wobei die Zeit sowohl von der Zusammensetzung der Nahrungabhängig ist, als auch vom jeweiligen Organismus. Parallel zur Verdauung werden unter anderem dieAnthocyane von der Magenschleimhaut absorbiert.Die Magenentleerung wird hormonell und vegetativ gesteuert. Wenn die Nahrung ausreichend zerklei-nert wurde, wird sie mit Hilfe von Kontraktionen portionsweise in den Zwölffingerdarm transportiert.Wie bereits oben erwähnt verlässt die feste Nahrung den Magen erst, wenn die Nahrung in Teilchen bis< 1 mm suspendiert ist. Dabei werden die Kohlenhydrate am schnellsten zerkleinert, während die Pro-teine und vor allem die Fette die längste Zeit in Anspruch nehmen [Moore, 1981; Schmidt und Lang,2005; Kahle, 2008]. Je fettiger die Speise umso länger die Verweildauer im Magen. Die unverdaulichenNahrungsbestandteile, wie z.B. Fasern, werden in der interdigestiven Phase (Verdauungsruhe) überca. 1,5 h durch spezielle Kontraktionswellen in den Dünndarm befördert.

1.4.3 Dünndarm

Der Dünndarm reicht vom Magenpförtner (Pylorus) bis zum Dickdarm und ist 3 - 6 m lang [Lüllmann-Rauch, 2006]. Er lässt sich in 3 Abschnitte unterteilen: das Duodenum (Zwölffingerdarm), der Jejunum(Leerdarm) und das Ileum (Krummdarm). Das Duodenum ist ca. 25 - 50 cm lang, das Ileum nimmt40 % der Restlänge ein und der Jejunum 60 %. Im Duodenum befinden sich auch die Ausführungsgängedes Pankreas und der Galle. Um die Nahrungsbestandteile gut zu resorbieren, ist die innere Oberflä-che des Dünndarms durch Falten (Kerckring-Falten, 3-fach vergrößert), Zotten (7 - 14-fach vergrößert)und Mikrovilli (15 - 40-fach vergrößert) auf ca. 100 m2 vergrößert. Zwischen den Zotten befinden sichKrypten, welche die Oberfläche weiter vergrößern und der Sekretion dienen. Die Krypten enthaltenZellen zur Immunabwehr und zur Hormonproduktion. Vom Duodenum zum Ileum nimmt die Anzahlder Zotten und die Höhe der Falten ab, dafür nimmt die Anzahl der Krypten zu. Ein besonderer Be-standteil des Duodenums sind die Brunner-Drüsen, welche Mucin und Bicarbonate sekretieren. In derIleummukosa finden sich Lymphfollikel, die das darmassoziierte lymphatische System darstellen. Diesist Bestandteil eines spezifischen Abwehrsystems, welches für eine effiziente Immunantwort gegenüberkrankheitsauslösenden Bakterien, Viren und allergenen Nahrungsbestandteile sorgt [Hillgren et al.,1995].Die Funktion des Dünndarms beruht auf der Neutralisierung des angesäuerten Chymus und der Ver-dauung und Aufnahme der Nahrungsbestandteile (Fette, Kohlenhydrate, Vitamine, Salze und Eiwei-ße). Die Stoffwechselrate ist in diesem Abschnitt am höchsten. Zu Beginn des Duodenums findet dieenzymatische Umsetzung der Nahrungsbestandteile durch Lipasen, Amylasen und Proteasen statt.Dabei werden die Fette, Kohlenhydrate und Proteine (Di- und Tripeptide) aufgespalten. Die Abbau-produkte der Kohlenhydrate und der Proteine gelangen bereits im Duodenum in die Blutbahn, die derFette gelangen erst im Ileum durch die Darmwand, da ihre Aufspaltung länger dauert.Die Bakterienkonzentration im Duodenum beträgt 103 - 104 Z/g, wobei die Bakterien hauptsächlichaus der Nahrung kommen [Berg, 1996; Holzapfel et al., 1998; Blaut und Clavel, 2007]. Im Ileum undJejunum steigt die Konzentration auf 108 Z/g an. Beim Großteil der Bakterien handelt es sich dabei

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um Bifido- und Lactobacillen, wobei auch obligat anaerobe Bakterien wie Bacteroides und Fusobac-terium [Holzapfel et al., 1998] identifiziert wurden.Durch die Darmbewegung wird der Chymus durchmischt und mit 1 cm/min zum Dickdarm beför-dert. Dabei wird die Motilität autonom durch enterische Nervensysteme und äußere Innervation undHormone gesteuert.

1.4.4 Dickdarm

Durch die Dickdarmklappe gelangt der Chymus vom Dünndarm in den Dickdarm. Dieser besitzt eineLänge von 1,5 – 1,8 m und besteht aus 3 Abschnitten: Caecum (Blinddarm), Kolon (Grimmdarm)und Rektum (Mastdarm). Das Kolon nimmt mit 1 m den längsten Abschnitt ein [Schwegler, 1998],wobei sich das Kolon wiederum in 4 Abschnitte unterteilen lässt (Abb. 6): Colon ascendens (aufstei-gend), Colon transversum (querverlaufend), Colon descendens (absteigend) und Colon sigmoideum(Sigma-Schlinge). Der pH-Wert im Dickdarm verläuft von pH 5,5 über pH 6,2 bis pH 6,8. In derSchleimhaut des Dickdarms sind keine Zotten zu finden, dafür zahlreiche Krypten, die mit schleimbil-denden Becherzellen ausgekleidet sind. Ein Teil der Zellen an der Oberfläche dient der Absorption. ImDickdarm werden hauptsächlich Wasser und Elektrolyte absorbiert. Pro Tag werden 0,5 – 1,5 l Wasseraufgenommen und auf 100 – 200 ml eingedickt [Löffler und Petrides, 1998]. Weitere Funktionen desDickdarms sind die Bildung von Vitaminen und Aminosäuren durch Bakterien, die Immunabwehr, dieSpeicherung des Stuhlinhaltes bis zur Entleerung, der Abbau von schwer verdaulichen Nahrungsmit-teln [Tuohy et al., 2009] und die bereits erwähnte Sekretion von Schleim. Täglich werden im Dickdarm60 – 80 g Fäzes produziert, was zu 76 % aus Wasser, zu 8 % aus Darmepithelzellen, Bakterien undunverdaulicher Nahrung besteht.

Abbildung 6: Aufbau des Kolon. 1 = aufsteigendes Kolon (Colon ascendens), 2 = querverlaufendes Kolon (Co-lon transversum), 3 = absteigendes Kolon (Colon descendens), 4 =Sigma-Schlinge (Colon sigmoideum), 5 = Rectum,[Wikimedia commons]

Im Dickdarm befinden sich durchschnittlich 1011 - 1012 Z/g [Berg, 1996], wobei sich mehr als 90 % nur2 phylogenetischen Gruppen zuordnen lassen, den Bacteroides und Firmicutes [Eckburg et al., 2005;Gill et al., 2006; Kurokawa et al., 2007; Turnbaugh et al., 2009; Qin et al., 2010].

1.5 Bioverfügbarkeit und Metabolismus der Flavonoide im Verdau-ungstrakt

Spricht man über die Bioverfügbarkeit eines Stoffes, so meint man damit die Form, das Ausmaß und dieGeschwindigkeit, mit denen ein Wirkstoff absorbiert wird und anschließend an seinen Wirkort gelangt[Gugeler und Klotz, 2000]. Dieser aus der Pharmakologie stammende Begriff wird auch in der mo-dernen Ernährungsphysiologie verwendet und beschreibt dort das Ausmaß und die Geschwindigkeit,mit der Lebensmittelinhaltsstoffe aus der Nahrung in den Gastrointestinaltrakt und nach Resorptionan den Wirkort gelangen. In zahlreichen Studien wird immer wieder auf die geringe Bioverfügbarkeitvon Polyphenolen und besonders der Anthocyane hingewiesen. Das liegt zum einen an der schlechten

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Absorption, den physiologisch bedingten Zerfallsreaktionen und hohen Metabolisierung- und Elimi-nierungsraten [Bub et al., 2001; Woodward et al., 2009; Nurmi et al., 2009]. Zum anderen spielenFaktoren wie weitere Modifizierungen und Wechselwirkungen mit anderen Substanzen oder Proteineneine wichtige Rolle. In der Arbeit von Ackermann [2010] konnte eine Maskierung der Anthocyane durchdie Bindung an Serumalbumin gezeigt werden. Diese Faktoren erschweren eine verlässliche Aussageüber die Bioverfügbarkeit der Flavonoide.Wie bereits unter 1.4 beschrieben, erfolgt bei der Verdauung der erste Schritt im Mundraum. Dort wirddie Nahrung zerkleinert, mit Speichel und der darin enthaltenen α-Amylase vermischt. Wiese et al.[2008] zeigten in ihrer Arbeit, dass die α-Amylase mit den Anthocyanen Wechselwirkungen einge-hen. Welche Auswirkungen diese Wechselwirkungen haben, konnte bisher jedoch nicht geklärt werden.Ähnliche Effekte wurden auch für Quercetinglykoside und Enzyme zur Deglykosylierung nachgewie-sen, unter Hydrolysierung der Zuckerreste [Walle et al., 2005].Das im Magen vorliegende saure Milieu hat einen stabilisierenden Einfluss auf die Flavonoidglykosideim Allgemeinen und auf die Anthocyane im Speziellen [Bermudez-Soto et al., 2007; Kahle et al., 2011].Die Anthocyane liegen im sauren Bereich in ihrer stabilsten Form vor, dem Flavyliumkation, und ihreStabilität wird von den Enzymen des Magens in keinster Weise beeinflusst. Im Gegensatz zu früherenAnnahmen findet im Magen bereits die Resorption der Anthocyane, wenn auch im geringen Maße,statt [Passamonti et al., 2003] [Talavéra et al., 2003]. Die Aufnahme findet mit Hilfe des Anionentrans-porters Bilitranslokase statt [Passamonti et al., 2002, 2005]. Der überwiegende Teil der Anthocyanegelangt jedoch unverändert in den Dünndarm.Aufgrund des veränderten pH-Wertes im Dünndarm durchläuft ein Teil der Anthocyane eine pH-bedingte Umlagerung (siehe Abschnitt 1.2.1, Abb. 2), die eine Änderung der Eigenschaften der Sub-stanz mit sich bringt. Im alkalischen Milieu liegt das Anthocyan in der Chalkonstruktur vor, diegegenüber einem chemischem Abbau äußerst instabil ist. Neben dem physiologisch bedingten Abbaufindet im Dünndarm auch die Adsorption der Anthocyane und Flavonoidglykoside statt. Dabei nimmtder natriumabhängige Glukosetransporter (SLGT-1) eine bedeutende Rolle ein [Mülleder et al., 2002].Der Transfer durch die Darmmukosa wird von Zuckerresten der Flavonoidglykoside beeinflusst. Un-tersuchungen zeigten, dass das Quercetinglykosid im Vergleich zum Quercetin besser aufgenommenwird [Hollman et al., 1995; Morand et al., 2000a,b]. Die Anthocyane können aber auch als Aglykone,nach der hydrolytischen Spaltung durch die Glykosidase, durch die Mukosa diffundieren [McGhie undWalton, 2007]. In der Dünndarmmukosa unterliegen die Substanzen Phase 1 und 2 Reaktionen undwerden durch Enzyme sulfatiert, glukoronidiert und methyliert [Scalbert und Williamson, 2000].Je nach Zuckerrest wurden in Studien mit Wildheidelbeeren 28 % und 85 % der aufgenommenenAnthocyane am Ende des Dünndarms wiedergefunden. Dabei wurden vor allem die Glukoside undGalaktoside resorbiert und abgebaut, während die Arabinoside in den Dickdarm gelangten. Bei denAglykonen gelangen die methylierten Verbindungen unbehelligt durch den Magen und den Dünndarm,während Aglykone ohne Methoxygruppen resorbiert, abgebaut und metabolisiert werden [Kahle et al.,2006; Kraus et al., 2010]Im Dickdarm findet eine Vielzahl von Metabolisierungsprozessen durch die Mikroorganismen statt.Dabei laufen vor allem die Hydrolyse der Glukuronide und Glykoside, die Reduktion von Doppelbin-dungen, die enzymatische Abspaltung von Zuckern und die Aufspaltung des C-Rings ab [Scalbert undWilliamson, 2000; Das und Rosazza, 2006; van Duynhoven et al., 2011]. Die für den Abbau verantwort-lichen Bakterien im Dickdarm sind Enterococcus , Bacteroides-Stämme, Clostridien und Eubacterien[Bokkenheuser et al., 1987; Scalbert und Williamson, 2000; Herles et al., 2004; Schoefer et al., 2004].Die durch die Abspaltung des Zuckers entstehenden Aglykone werden entweder durch physiologischeBedingungen zersetzt oder durch die Mikrobiota metabolisiert. Dabei wird zuerst die Doppelbindungam C-Ring reduziert, wobei ein Chalkon Intermediat gebildet wird. Dieses Intermediat wird durchdie Chalkon-Isomerase zu Dihydrochalkon abgebaut und die Polyphenol-Ringstruktur wird durch diePhloretin-Hydrolase zerlegt. Am Ende entstehen die korrespondierenden phenolischen Säuren und2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd (Phloroglucinolaldehyd) [Piffaut et al., 1994; Keppler und Humpf, 2005;Kern et al., 2007]. Die hydroxylierte Phenylessigsäure oder Phenylpropionsäure bildet den Hauptanteilder entstehenden phenolischen Säuren [Moco et al., 2012]. Die phenolischen Säuren werden absorbiertoder zu Kohlendioxid und kurzkettigen Fettsäuren abgebaut [van Duynhoven et al., 2011; Moco et al.,

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2012].Während die Umsetzung anderer Flavonoide teilweise sehr gut erforscht ist, wird der Abbau der An-thocyane im Dickdarm noch immer diskutiert und ist weitgehend unerforscht. Bei der Untersuchungvon Fäces auf Anthocyane wurden diese nur bei sehr hohen Ausgangskonzentrationen gefunden, wasfür einen Abbau der Anthocyane durch die Mikrobiota im Kolon spricht. Die Abbauprodukte werdenausgeschieden oder in der Dickdarmmukosa resorbiert [McGhie und Walton, 2007]. Die Ergebnisseschwanken allerdings sehr stark, wobei die Ergebnisse von dem jeweiligen Probanden und dem Studi-endesign abhängen. Verschiedene Studien liefern unterschiedliche Daten [Ichiyanagi et al., 2007; Nurmiet al., 2009], was zu kontroversen Diskussionen führt. Weitere Forschungen in diesem Bereich sind alsounablässig.

1.6 Vorteile des etablierten in vitro Modells im Vergleich zu be-kannten in vivo Modellen

Um die Einflüssen von Nahrungsinhaltsstoffen und ihren Abbauprodukten beurteilen zu können istes dringend von Nöten die Bioverfügbarkeit der Wirkstoffe im menschlichen Organismus beurteilenzu können. Da die Übertragung der Ergebnisse von in vitro Studien auf in vivo Testsystem ohne dasWissen über die Bioverfügbarkeit nicht möglich ist wurden in der Vergangenheit eine Vielzahl vonin vivo Tier- und Humanstudien durchgeführt. Bei der Untersuchung der Polyphenole stößt man beiden in vivo Untersuchungen auf einige Schwierigkeiten. Wie bereits oben erwähnt sind die Ergebnissedieser Studien stark von den Probanden, deren Lebensweise und Stoffwechsel abhängig. In Human-studien lassen sich keine kontrollierten Bedingungen schaffen. Neben der schwierigen Probenentnahmebei der Untersuchung der Metabolite im Magen und Darm sorgt auch die unterschiedliche Handha-bung, Probenvorbereitung und Analyse für eine hohe Variation der Daten. Bei der Untersuchung vonLebensmittel kommen noch deren Komplexität und die damit verbundenen Wechselwirkungen mit deneigentlichen Zielanalyten hinzu. Eine Vergleichbarkeit der einzelnen Studien untereinander ist somitfragwürdig und hat in der Vergangenheit zu einigen Kontroversen geführt.Ein in vitro Modell wie es in dieser Arbeit eingesetzt wurde ermöglicht es, unter kontrollierten Be-dingungen zu arbeiten und damit ein reproduzierbares Ergebnis zu gewährleisten. Dabei lassen sichsowohl reine Naturstoffe als auch komplexe Matrices einsetzen, die mit Enzymen, ausgewählten Stäm-men oder Stammgemischen von Mikroorganismen versetzt werden. Dabei ermöglicht das Modell auchden Einsatz von fragwürdigen Stoffen, die eventuell toxische Wirkungen zeigen könnten. Zudem ist derEinsatz dieses Modells ethisch völlig unbedenklich. Selbstverständlich weist auch das in vitro Modelleinige Fehlerquellen auf, ist aber eine hervorragende Ergänzung zu den Tier- und Humanstudien.

1.7 Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) Katabolismus in Rhodococcuserythropolis DSM 44534

In den letzten 50 Jahren wurde der Abbau von Flavonoiden durch aerobe, anaerobe, eukaryotischeund prokaryotische Mikroorganismen in unterschiedlichen Studien untersucht. Dabei wurden vor allemVerbindungen betrachtet, die in Pflanzen häufig zu finden sind, wie z.B. das Rutin und das Querce-tin. Zu Beginn dieser Arbeiten wurden nur die Abbauwege und die Metabolite untersucht, später lagder Fokus dann auf der Aufklärung von Struktur und Genom der beteiligten Enzyme. Dabei war derKatabolismus von Rutin einer der ersten, der aufgeklärt werden konnten [Hattori und Noguchi, 1959;Westlake et al., 1959]. Vor allem für Mikroorganismen wie z.B. Hefen, Schimmel- und hefeähnlichePilze wurden verschiedenste Abbauwege durch unterschiedliche Enzyme und damit auch unterschied-liche Abbauprodukte gefunden (Abb. 7 + 8) [Tranchimand et al., 2010]. In Zusammenhang mit derAufklärung der Synthase von Flavonolen wurden die Bildung und der Abbau von Rutin auch in Pflan-zen untersucht, wo es vor allem als Antioxidans fungiert.Beim Rutin handelt es sich um das stabile Rutinosid des Quercetin. Rutin ist ein blass gelbes Pulver,das in Wasser schwer löslich und in unpolaren Lösungsmitteln gut löslich ist. Es weist im menschli-chen Körper entzündungshemmende, bakterizide und antioxidative Eigenschaften auf und nimmt in

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den Pflanzen eine Schutzfunktion als Radikalfänger ein. In den folgenden Abschnitten wird näher aufdie Rutinase in Pflanzen und Mikroorganismen als Stellvertreter der Flavonoide eingegangen.

1.7.1 Rutinase und Rutin-Synthase aus Pflanzen

Beim Katabolismus von Rutin im Zusammenhang mit Pflanzen sind sowohl die Rutinase, als auch dieRutin-Synthase beteiligt. Der enzymatische Abbau von Rutin durch eine Rutinase, sowie die Bildungvon Rutin aus Quercetin über die Synthase des Rutins in Obst und Gemüse, rückte in den letztenJahren immer mehr in den Mittelpunkt der Lebensmittelforschung. Während die Rutinase das Rutinhydrolysiert [Suzuki et al., 2005], findet in Gegenwart der Synthase die Transglykosylierung in denPflanzen statt [Lucci und Mazzafera, 2009]. In den meisten Studien wurde die aus Buchweizensamengewonnene Rutinase und Synthase eingesetzt [Yasuda und Nakagawa, 1994; Suzuki et al., 2002, 2005].Es gibt jedoch auch Publikationen, die sich mit der Aufreinigung der Synthase aus anderen Pflanzenbeschäftigten [Chua et al., 2008; Lucci und Mazzafera, 2009]. Die Anwendungsbereiche der Rutinasebeschränken sich dabei nicht nur auf die Bildung von Quercetin und Rutinosid, sondern auch auf derenNutzen für die Pflanzen. So untersuchten Sun et al. [2007] beispielsweise den Einfluss der Rutinase aufdie Zusammensetzung der Phenole und die Erhöhung ihrer antioxidativen Kapazität in Asparagussaft.Katayama et al. [2013] dagegen nutzten die Eigenschaften der Synthase, um phenolische Säure mitRutinosiden zu verbinden. Auf diesem Wege kann die Löslichkeit der Substanzen erhöht werden. Siewerden damit zellgängiger und die antivirale Fähigkeit der Rutinoside kann so besser genutzt werden.

1.7.2 Rutinase aus Mikroorganismen

Neben dem Abbau von Rutin in Pflanzen ist der Abbau des Rutins durch Mikroorganismen, vor allemdurch Schimmelpilze, gut untersucht. Der postulierte Abbauweg beinhaltet eine Glykosidase, eine Di-oxygenase und eine Esterase. Die finalen Abbauprodukte sind dann Rutinose, Phloroglucincarbonsäureund Protocatechusäure (Abb. 7) [Narikawa et al., 1998; Mamma et al., 2005]. Die erste Glykosidasein diesem Zusammenhang wurde in den 60er Jahren beschrieben, die Rutinase [Hay et al., 1961] oderauch β-Rutinosidase genannt [Narikawa et al., 2000]. Dieses Enzym wird beim Wachstum auf Gly-kosiden wie Rutin, Quercetin, Hyperosid und Nariginin induziert. Die Rutinase wurde bisher in denSchimmelpilzen von Aspergillus flavus und niger, Penicillium brevocampactum, funicolosum, rugulo-sum und herquei, sowie in dem hefeähnlichen Pilz Pullularia pullulans und den Hefen Cryptococcusalbidus und diffluens gefunden. Bisher ist das Enzym nur für ein grampositives Bakterium bekannt,dem Streptomyces sp. Dabei wurde das Enzym bislang laut Literatur nur aus dem Aspergillus flavusund Penicillium rugulosum aufgereinigt [Hay et al., 1961; Narikawa et al., 2000].

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Abbildung 7: Abbauweg des Rutins in Schimmelpilzen [nach Westlake et al., 1961]

Die Rutinase aus dem Aspergillus flavus hat ein pH Optimum bei 5,6, wird von Pyridin und Di-methylamin inhibiert und hydrolysiert nur Rutin und Hyperosid. Der Km-Wert für Rutin beträgt7,3 x 10−5 M. Beim Penicillium lag das pH Optimum der Rutinase bei 2, der IEP bei 5 und die opti-male Temperatur bei 50 °C. Das gereinigte Protein ist ein Homotetramer mit einem Molekulargewichtvon 245 kDa für das native Enzym und 65 kDa für das Monomer. Das gereinigte Enzym kann nurRutin und Isoquercetin umsetzen. Die gereinigten Proteine aus den beiden Schimmelpilzen dagegenkönnen zwischen dem Zuckerteil und dem Aglykonteil unterscheiden, daher kann man bei diesem En-zym nicht von einer reinen Glykosidase sprechen [Tranchimand et al., 2010]. Im Laufe der Forschungwurden weitere Abbauwege für das Rutin postuliert (Abb. 8).

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Abbildung 8: Zusammenfassung der verschiedenen Abbauwege des Rutins [nach Tranchimand et al., 2010]

1.7.3 Rhodococcus erythropolis DSM 44534

Bei den Rhodococcus Bakterien handelt es sich um grampositive, aerobe, säureresistente und stäbchen-förmige Bakterien, die ubiquitär im Boden zu finden sind. Der Rhodococcus gehört zu den Aktinobak-terien, deren Zellwandaufbau weitgehend dem Wandaufbau der grampositiven Bakterien entspricht.Anstatt eine äußeren Zellwand besitzen die Aktinobakterien mehrere Peptidoglykanschichten, die eineäußere Schicht um die Zelle bilden. In weiteren Verlauf der Arbeit wird für diese „Zellwand“der BegriffZellhülle verwendet.Mit ca. 9,7 Millionen Basenpaaren besitzt der Rhodococcus das größte Bakteriengenom, was die ho-he Anpassungsfähigkeit erklärt [McLeod et al., 2006]. Selbst auf Böden mit hoher Verschmutzung,durch langkettige Alkane oder hochmolekulare polyaromatische Hydrocarbone, können die Bakterienwachsen [Berekaa und Steinbüchel, 2000; Solano-Serena et al., 2000; Cheung und Kinkle, 2001; Watti-

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au, 2002]. In der Industrie wird Rhodococcus für die Herstellung bioaktiver Steroide, Acrylamide undAcrylsäuren genutzt. Der Rhodococcus erythropolis besitzt wie alle grampositiven Bakterien eine dickeZellhülle aufgrund einer Vielzahl von Peptidoglykanschichten. Die gramnegativen Bakterien unter-scheiden sich von den grampostiven Bakterien durch Aufbau, Struktur und Dicke ihrer Zellmembran.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Rhodococcus erythroplis auf einer Rutinlösung als einzigerC-Quelle kultiviert, um die Verstoffwechselung des Flavonols durch den Rhodococcus im Hinblickauf die Induktion von Rutinase zu analysieren. Neben den Flavonoiden werden dabei weitere C- undN-Quellen, insbesondere Nebenprodukte biotechnologischer Prozesse, wie z.B. Treber aus der Bier-produktion für die Kultivierung von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 genutzt. Ziel war es, dieAbbauprozesse zu untersuchen und nach Möglichkeit gleichzeitig hochwertige biotechnologische Pro-dukte zu gewinnen [Martinez 2013, persönliche Mitteilung].

1.8 Bedeutung der Mykolsäure für den Aufbau der Zellhülle in Ak-tinobakterien (Mykolata) und dem Rhodococcus erythropolisDSM 44534

1.8.1 Die Mykolsäure

Die Bezeichnung Mykolsäure wurde erstmals 1938 vom Chemiker R.J. Anderson der Universität Ya-le in Zusammenhang mit dem Tuberculosis Bakterium veröffentlicht [Anderson, 1939, 1941]. IhreGrundstruktur ist eine β-Hydroxy-α-alkyl-verzweigte Fettsäure. Wird die Mykolsäure proteolytisch,thermisch oder durch Hydrolyse gespalten, erhält man den Meroaldehyd (die Meromykolatkette) undeinen α-Alkylzweig mit einer Carbonsäure als funktionelle Gruppe (Abb. 9).

Abbildung 9: Fragmentierung der Mykolsäure in den Meroaldehyd (Meromykolatkette) und den α-Alkylzweig durch thermisch induzierte Spaltung der β-Hydroxycarbonsäure.

1998 waren bereits 500 chemische Strukturen der Mykolsäure bekannt [Barry et al., 1998]. Sie ist derHauptbestandteil der Zellhülle von Bakterien der Gattung Aktinobakterien oder auch Mykolata [Bren-nan und Nikaido, 1995]. Zur Gattung Mykolata gehören Corynebacterium, Gordonia, Mycobacterium,Rhodococcus, Skermania, Dietzia, Norcardia und Tsukamurella [Goodfellow, 1992; Rainey et al., 1995;Chun et al., 1996, 1997]. Es wird angenommen, dass die Art der Mykolsäuren, die sich durch ihrelangen aliphatischen Ketten unterscheiden, oftmals die Pathogenität von Mykobakterien bestimmen.Diese säurefeste Zellwand bezeichnet bei den Mykobakterien eine besondere Art von Zellwand, der die-sen Bakterien eine Resistenz gegenüber chemischen Einflüssen, eine geringe Permeabilität gegenüberhydrophobem Antibiotikaeinfluss, eine sehr geringe Permeabilität gegenüber hydrophilen Substanzenverleiht und die Dehydrierung der Zellen verhindert[Barry et al., 1998]. Mykolsäuren unterscheidensich in ihrem Aufbau, ihrer Kettenlängen, der Anzahl an Doppelbindungen und ihren funktionellenGruppen [Yang et al., 2012]. Mykolsäuren kommen zudem in drei verschiedenen Formen vor und wer-den von den Mykobakterien exprimiert. Der Großteil der Mykolsäuren ist über das Arabinogalaktanan die Zellhülle gebunden. Neben den gebundenen Mykolsäuren liegen diese auch als ungebundene,lösliche, extrahierbare Ester vor, wie z.B. Trehalosemono- und dimykolat, Glukosemonomykolat undGlycerolmonomykolat oder als freie Mykolsäuren [Verschoor et al., 2012]. Die ersten beiden Formenbilden die Außenschicht der Zellhülle und somit auch eine äußere Permeabilitätsbarriere [Draper, 1998;Sutcliffe, 1998].

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Bei den pathogenen Mykobakterien (z.B. Mycobacterium tuberculosis) liegen distal chirale sauerstoff-haltige und proximal und/oder distal nicht-sauerstoffhaltige funktionelle Gruppen in der Meromyko-latkette vor [Verschoor et al., 2012].

1.8.2 Biosynthese der Mykolsäure

Die Biosynthese der Mykolsäure durch die Mykolata wurde bisher nur ausführlich in Mykobakterienuntersucht. Bei der Gattung Rhodococcus wurde die Fettsäuresynthese in Rhodococcus jostii näheruntersucht und mit der in Mykobakterien verglichen. Der Hauptteil der Synthese ist eine geradlini-ge Fettsäuresynthese. Während der Synthese laufen 4 Reaktionen in einem Loop ab. Jeder Zykluswird durch eine Verlängerung der Alkylkette um eine Carboneinheit vollendet. Zwei Fettsäuresynt-hasen (FAS) sind bekannt: FAS I und FAS II. FAS I ist ein Homodimer, welches alle notwendigenFunktionen für eine de novo Fettsäuresynthese enthält [Smith et al., 2003; Sydor et al., 2012]. FAS IItransportiert die wachsende Fettsäure zwischen den aktiven Seiten der Enzymkomponenten. Die Ketteist dabei über eine kovalente Bindung an den Acylthioester des Acyl-Carrier-Proteins (ACP) gebun-den. Im Vergleich zu anderen Bakterien sind bei der Biosynthese in R. jostii beide Systeme zu finden.Bei der Synthese der Meromykolsäure produziert FAS I die Fettsäuren mit einer Kettenlänge vonC14 - 24, während FAS II die Verlängerung der gebildeten Fettsäuen übernimmt [Takayama et al.,2005]. AcpM (RHA_ro01200 ), eine Einheit des FAS II, besitzt C-terminal eine Verlängerung, derenSignifikanz bisher nicht bekannt ist. Ein Abgleich von AcpM mit anderen Mykolata zeigte eine Verbin-dung zwischen der Größe der verlängerten Region und der Größe der Mykolata. Es wird angenommen,dass die Länge dieser Region Einfluss nimmt auf die Fähigkeit des Bakteriums, längere Meromykolatezu bilden [Sutcliffe et al., 2010]

Die Verbindung zwischen FAS I und II kommt durch die β-Ketoacyl-ACP-Synthase III FabH(RHA1_ro05206 ) zustande [Choi et al., 2000; Brown et al., 2005]. FabH hat die Aufgabe den Acyl-CoA Primer durch eine Kondensierung mit dem Malonylthioester des AcpM zu verlängern, wobeiein β-Ketoacyl-AcpM Thioester gebildet wird [Choi et al., 2000; Brown et al., 2005]. Das Malonyl-AcpM wird von der Acyl-CoA/ACP Transacylase FabD produziert [Kremer et al., 2001]. Das gebildeteβ-Ketoacyl-AcpM wird durch die β-Ketoacyl-Reduktase zu β-Hydroxyacyl-AcpM reduziert [Banerjeeet al., 1998] und anschließend durch den FabZ Proteinkomplex dehydriert. Das trans-2-Enoyl-AcpMist Bestandteil des letzten Schrittes des FAS II Zyklus, welcher durch die Enoyl-ACP-Reduktase ka-talysiert wird [Banerjee et al., 1994]. Am Ende des Zyklus entsteht ein aliphatisches Acyl-ACP welche2 C-Einheiten länger ist als sein Acyl-Primer [Banerjee et al., 1994]. Im Mycobacterium tuberculosisfindet an dem Punkt eine weitere Acyl-Verlängerung der FAS II statt, welche durch die β-Ketoacyl-AcpM Synthase KasA und KasB initiiert werden. In R. jostii konnte im Vergleich zu M. tuberculosisnur KasA gefunden werden [Kremer et al., 2000, 2002; Schaeffer et al., 2001; Bhatt et al., 2007; Sydoret al., 2012]. Dies lässt die Hypothese zu, dass die Kettenlänge der Meromykolate beim den Rhodococciaufgrund der Abwesenheit von KasB kürzer ist als bei anderen Mykobakterien. Die Bildung von Dop-pelbindungen und funktionellen Gruppen während der Biosynthese von Mykolsäuren wird in einemextra Kapitel (siehe 1.8.2.1) behandelt [Sutcliffe et al., 2010]

Der vorletzte Schritt der Mykolsäure Synthese ist eine Claisen-Kondensation von Acyl-S-CoA (dieseliefert den Alkylzweig) und einem Meromykolyl-AMP, welche durch die Polyketide-Synthase Pks 13katalysiert wird [Gokhale et al., 2007]. Vor der Kondensation wird der Precursor des 2-Alkylzweigesdurch die Acyl-CoA Caboxylase zu 2-Carboxyl-Acyl-CoA caboxyliert [Gande et al., 2007]. Die Kon-densation der beiden Acylgruppen von Meromycolyl-AMP und 2-Carboxyl-Acyl-CoA wird durch dieβ-Ketoacyl Synthase des Pks 13 initiiert. Bevor das β-Ketomykolat in die Zellhülle eingebaut wird,findet meistens noch eine Reduktion zu (β-Hydroxy)-mykolat statt [Gande et al., 2004].

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1.8.2.1 Bildung von Doppelbindungen und funktionellen Gruppen während der Biosyn-these der Mykolsäuren

Für die Bildung der Doppelbindung in den Mykolsäuren gibt es zwar einige Thesen, aber nach demaktuellen Wissensstand keine eindeutigen Synthesewege. Barry et al. [1998] gehen in ihrer Arbeit vonzwei möglichen Wegen aus. Der erste Ansatz beschäftigt sich mit der Entsättigung der gesättigtenFettsäure durch eine terminale Desaturase nach der Bildung der Meromykolatkette. Der zweite An-satz geht von einer Verlängerung eines ungesättigten Fettsäure Precursors und/oder der Einführungeine distalen Doppelbindung durch Dehydrierung während der Fettsäuresynthese aus. Die Einführungeiner Doppelbindung in die Mykolsäure durch Entsättigung ist eine Annahme, die auch Cole et al.[1998] beim M. tuberculosis verfolgten. Nach ihren Ergebnissen sind vermutlich die ACP Desaturasen(Des) A1 und A2 für die Entsättigung verantwortlich. Auch für R. jostii wurden Homologe von Des A1gefunden. Phetsuksiri et al. [2003] entdeckten und decodierten ein weiteres Acyl-CoA Desaturase Gen,Des A3. Sie zeigten, dass dieses Gen Teil der Oleat-Produktion aus Stearoyl-CoA ist, weshalb sie es als∆9-Desaturase kennzeichneten. Von den sechs weiteren Des A-Homologen in R. jostii weisen fünf eineAminosäure-Sequenz-Homologie zum Des A3 des M. tuberculosis von über 55 % auf [Sutcliffe et al.,2010]. Die Vermutung liegt nahe, dass diese Des A3 eine Rolle bei der Mykolsäureentsättigung spielt.Auch Barry et al. [1998] vermuteten, dass eine enzymatische Entsättigung durch eine aerobe terminaleDesaturase stattfindet. Dabei läuft die Oxidation der gesättigten Fettsäure simultan zur Oxidationvon NADPH und Reduktion von molekularem Sauerstoff ab.

Die ungesättigten Bindungen sind eine Voraussetzung für die Bildung von funktionellen Gruppenim proximalen und distalen Bereich der Mykolsäuren durch Methyltransferasen [Dover et al., 2004;Takayama et al., 2005]. Obwohl die Mykolsäuren der Gattung Rhodococcus bis zu 4 Doppelbindungen ineiner Säure aufweisen, sind keine komplexen Mykolsäuren für die Rhodococci bekannt. Die Abwesenheitvon Methoxyl-Mykolsäure-Synthasen und Cyclopropan-Mykolsäure-Synthasen im Genom von R. jostiierklärt das einfache Mykolatprofil der Rhodococci.

1.8.3 Aufbau der Zellhülle der Gattung Rhodococcus1.8.3.1 Mykolsäuren in Rhodococcus

Die Mykolsäuren der Rhodococcus Bakterien bestehen aus 30 - 54 C-Atomen [Klatte et al., 1994] undnehmen bis zu 40 % des Zellhüllengerüstes ein [Sutcliffe, 1998; Sokolovská et al., 2003]. Charakteristischfür die Mykolsäuren ist die Vielfalt der kürzeren α-Alkyl-Seitenkette, bestehend aus 10 - 14 C-Atomen.Der β-Hydroxyteil ist länger, weist bis zu 4 Doppelbindungen auf, aber keine funktionellen Gruppen[Barton et al., 1989]. Die ungesättigten Bindungen der gebundenen Mykolsäuren sind im hinterenTeil der β-hydroxylierten Fettsäure, auch Meromykolat–Ast genannt, lokalisiert. Die Mykolsäure istmit ihrem gesättigten Teil über das Arabinogalaktan kovalent mit dem Peptidoglykangerüst der Zell-membran verestert. Durch ihre palisadenartige Aneinanderlagerung bilden sie die äußere hydrophobemembranähnliche Schicht, welche für die Permeabilität der Zelle verantwortlich ist. Bisher wird ange-nommen, dass die Doppelbindungen im distalen Teil der Meromykolatkette liegen, womit der proximaleTeil an der Ersterbindung gesättigt wäre [Minnikin und O’Donnell, 1984]. Die Säuren in der freienLipidfraktion besitzen die gleiche Größe wie die gebundenen Mykolsäuren [Takaichi et al., 1997].

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Abbildung 10: Modell des Aufbaus der Zellhülle des Rhodococcus. Die vertikal angeordneten Mykolsäuren bildendie äußere Permeabilitätsbarriere. Der Peptidoglykan-Arabinogalaktan-Komplex nimmt hier keine spezielle Konformationein. Die Größe und Konformation der Mykolsäuren im Rhodococcus lassen vermuten, dass Lipide die Leerräume füllen(wahrscheinlich Lipoglykane und Lipoproteine) um eine geschlossene äußere Schicht zu bilden (grauer Kasten). In derAbbildung fehlen die äußersten Schichten, welche aus Polysacchariden und/oder verkapselnde Polysacchariden die fürviele Rhodococci bekannt sind. a = Membranmodell, b = Legende [Sutcliffe et al., 2010]

In wieweit die Kultivierungsparameter die Zusammensetzung der Mykolsäuren in der Zellhülle beein-flusst, wird in Abschnitt 1.8.4 diskutiert.

1.8.3.2 Zellhüllenstruktur: Peptidoglykan-Arabinogalaktan-Mykolsäure

Das von Minnikin [1982, 1991] postulierte Modell des Aufbaus der Zellhülle für die Gattung Mykolatawurde in den vergangenen Jahren als das wahrscheinlichste Modell anerkannt [Brennan und Nikaido,1995; Daffé und Draper, 1998; Sutcliffe et al., 2010]. Allerdings konnte durch Untersuchungen in derKryo-Elektronentomografie gezeigt werden, dass dieses Modell zwar gut ist, aber dennoch nicht dennativen Zustand widerspiegelt [Hoffmann et al., 2008]. Dennoch wurde das Modell von einer Vielzahlan Wissenschaftlern verwendet. Sutcliffe [1998] wandte das Modell von Minnikin in seiner Arbeit aufden Rhodococcus an.

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Peptidoglykan, auch Murein (Mauermolekül) genannt, ist ein Polymer aus peptidverknüpften Amino-zuckern. Es besteht aus parallelen Polymeren von Disacchariden (N-Acetylglucosamin und N-Acetyl-muraminsäure), den Glykanketten, welche mit Aminosäuren quervernetzt sind und so die äußere Plas-mamembran bilden. Die Peptidoglykanschicht ist 20 – 80 Nanometer dick. Beim Rhodococcus handeltes sich um einen A1γ-Typ des Peptidoglykans mit meso-Diaminopimelinsäure als Aminosäure anPosition drei und vier des Tetrapeptids [Goodfellow, 1992]. Das Peptidoglykan ist über eine Verbin-dungseinheit direkt mit dem Arabinogalaktan verbunden (Abb. 10) [Minnikin, 1982, 1991].Arabinogalaktan ist ein Biopolymer, bestehend aus den Monosacchariden der Arabinose und Galak-tose [Nothnagel et al., 2000]. Beide Teile liegen ausschließlich in der Konfiguration der Furanose vor[Alderwick et al., 2005]. Der Galaktanteil des Arabinogalaktans ist linear und besteht aus ungefähr30 Einheiten, die je nach Rhodococcus Stamm unterschiedliche alternierende, glykosidische Bindungenbesitzen (z.B. R. equi 1 -> 3, 1 -> 5 und 1 -> 6) [Sutcliffe, 1998; Alderwick et al., 2005]. In allen Speziesist die reduzierte terminale Galaktose mit einer Rhamnose eines Rhamnose 1 -> 3 N-Acetylglukosaminverknüpftem Disaccharid verbunden. Die Arabinankette ist an drei Verzweigungen, an den Resten 8,10 und 12, mit dem Galaktanteil verbunden. Beim Arabinan befindet sich am Ende des Zweiges ei-ne Pentaarabinosyl-Einheit, welche vier Mykolsäuren über Esterbindungen tragen kann [Besra et al.,1995]. Andere Arbeiten zeigten, dass nur zwei Mykolsäuren über eine Esterbindung mit dem Ende derArabinanverzweigung verknüpft sind [Sutcliffe, 1998]. Im Vergleich zum Aufbau der Zellhülle im My-cobacterium ist die Anzahl an Mykolsäuren im Rhodococcus geringer [Sutcliffe, 1998]. Die Konsequenzdieser Modifikation wird immer noch diskutiert.

1.8.3.3 Aufbau der Zellhülle unter Berücksichtigung des Minnikin-Modells

Im Zellhüllen-Modell von Minnikin [1982, 1991] sind die Mykolsäuren kovalent ans Arabinogalaktangebunden. Dabei sind sie senkrecht ausgerichtet zur Oberfläche der Plasmamembran. Sie bilden so-mit die Grundlage einer zweiten hydrophoben Permeabilitätsbarriere außerhalb der Plasmamembran,eine Monoschicht aus gebundenen Mykolsäuren. Die gesättigte proximale Region der Meromykolat-kette liegt parallel zur gesättigten Alkyl-Seitenkette. Die angrenzenden Mykolsäuren sind über eineWasserstoffbrückenbindung zwischen dem C-3 der Hydroxylgruppe und dem C-1 der Carbonylgruppemiteinander verbunden. Diese dicht gepackte Struktur besitzt aufgrund der Arabinogalaktanmoleküleund ihrer Bindungseinheiten die nötige Flexibilität. Der Anteil an Mykolsäuren in den RhodococcusZellen ist so hoch, dass diese Monoschicht die kompletten Zellen bedecken können [Dufrêne et al.,1997], wobei die Leerräume von glykolipidhaltigen Mykolsäuren gefüllt werden [Puech et al., 2001;Zuber et al., 2008]. Die Glykolipide der Mykolate (z.B. Trehalose Mykolate) dienen nicht nur zumAuffüllen der Monoschicht, sondern auch als Carrierer für die neu synthestisierten Mykolsäuren, dieauf die Seite der Arabinogalaktane transportiert werden sollen [Tropis et al., 2005]. Neben dem pro-ximalen Teil der Meromykolatkette nimmt auch der distale Teil eine wichtige Rolle ein. Dabei ist derEinfluss abhängig von Länge des Meromykolatzweiges und dem Grad an ungesättigten Bindungen. Jelänger der Zweig, umso mehr ragt dieser aus der gepackten Struktur des proximalen Zweiges und derAlkylkette heraus. Der frei herausstehende Teil der Meromykolatkette kann sowohl mit den komple-xeren Lipiden der Oberfläche, als auch mit einfachen Lipiden der Plasmamembran (z.B. Triglyceride)mit bis zu 19 C-Atomen agieren. Die Interaktionen mit kleineren Amphiphilen stützt die Permeabi-litätsbarriere der Mykolatschicht [Puech et al., 2001]. Diese Interaktionen waren im ursprünglichenModell nicht berücksichtigt [Sutcliffe, 1998]. Der äußere Teil der Zellhülle besteht zum größten Teilaus Polysacchariden, welche ebenfalls mit dem distalen Teil der Meromykolatkette interagieren kann.Inwieweit diese Interaktionen die Hydrophobizität der Zellen beeinflussen ist noch immer nicht klar.Bendinger et al. [1993] stellten die Vermutung auf, dass die Hydrophobizität mit der Länge der My-kolsäuren zunimmt. Sunairi et al. [1997] beobachteten, dass die Hydrophobizität in Gegenwart vonKomponenten wie z.B. den komplexen Amphiphilen sinkt.Zum Schluss sollte noch erwähnt werden, dass der Raum zwischen der äußeren Permeabilitätsschichtund der Plasmamembran eine Art Pseudo-Periplasma darstellt, was vermuten lässt, dass es einen Pa-thway für die Aufnahme von sowohl löslichen wie auch sekretierten Substanzen geben muss [Sutcliffeet al., 2010].

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1.8.3.4 Zellhüllenproteine des Rhodococcus

Channelprotein Porin: Das Transmembranprotein Porin, welches in der äußeren Permeabilitätsbar-riere (Abb. 10) zu finden ist, ermöglicht die Akkumulation der hydrophil gelösten Stoffe. Porin wurde ineine Vielzahl von mykolsäurehaltigen Aktinomyceten gefunden [Ziegler et al., 2008]. In verschiedenenRhodococcus-Stämmen wurden in unabhängigen Studien sowohl Kationen- als auch Anionen-Kanälegefunden [Lichtinger et al., 2000; Riess et al., 2003]. Während eines der gefundenen Proteine keineÄhnlichkeit zu bisher bekannten Proteinen aufwies, zeigten drei der gefundenen Proteine eine signifi-kante Homologie in ihrer Sequenz zu MspA aus M. smegamatis [Faller, 2004; Sutcliffe et al., 2010]. Eswird angenommen, dass noch weitere unbekannte Porine in der Zellhülle enthalten sind.

Lipoglykane: Bei den Lipoglykanen handelt es sich um Polysaccharide, die in der Membran verankertsind und zur Familie der Lipoarabinomannane (LAM) gehören. Die umgekehrte Kernstruktur bestehtaus einem auf Phospahtidylinositolmannosid basierenden Anker welcher zu einer 1 -> 6 verknüpf-ter Mannandomäne mit variabler Länge verlängert ist [Nigou et al., 2003]. Das Mannankernstückträgt neben der Mannoseseitenkette Arabinose- oder Arabinanzweige, die wiederum verschiedenenSubstituenten tragen (z.B. Mannose) [Nigou et al., 2003]. Die Feinstruktur der LAM ist Stamm- undSpeziesabhängig. Die LAM-ähnlichen Lipoglykane der Rhodococci (Req-LAM) wiesen ein „gestütztes“LAM auf, in welchem die Phospahtidylinositol-Anker Lipomannan mit einer 1 -> 2 Verknüpfung mitMannose zweigen aufweisen, von denen einige eine einzelnen t-Arabinosefuranoserest tragen [Gartonet al., 2002]. Die Lipoglykanstruktur ist nicht zwangsläufig in allen Rhodococci gleich, aber sie weisenalle ein ähnliche Grundstruktur auf. Im Vergleich zu anderen Mykobakterien sind die Req-LAM beiden Rhodococci ausschließlich in der Membran verankerte Polysaccharide [Nigou et al., 2003]. IhreFunktion ist bisher noch nicht vollständig geklärt. Untersuchungen mit verschiedenen Mutanten er-gaben, dass die Req-LAM´s für das Wachstum der Mykolsäure prinzipiell nicht nötig sind, für einoptimales Wachstums allerdings schon.

Lipide: Die Zellhülle der Rhodococci enthält eine Fülle von strukturell unterschiedlichen Lipiden de-ren Funktionalität weitestgehend unbekannt ist. Dabei handelt es sich Hauptsächlich um Acyl- undMykolylglykolipide. Es sind aber auch eine große Vielfalt an Lipopeptiden und Glykolipopeptidenzu finden. Ob die Lipide vor allem als Lückenfüller dienen um die äußere Permeabilitätsbarriere zukomplettieren (siehe auch 1.8.3.3) oder Einfluss auf die physikochemischen Eigenschaften der Zellhüllenehmen, ist zum jetzigen Zeitpunkt noch unklar [Sutcliffe et al., 2010].

Verkapselnde Polysaccharide und Zellhüllen Polysaccharide: Prescott [1981] fand in seinenArbeiten mit R. equi sieben Kapsel Serotypen von denen bei sechs durch die Forschung von Richards[1994] die Struktur aufgeklärt werden konnte. Es handelt sich dabei um verschiedene saure Heteropo-lysaccharide, welche charakteristische Acetal verknüpfte Pyruvate und Milchsäureester-Substituentenaufweisen. Für die Stämme von R. jostii [Perry et al., 2007], R. rhodochrous [Urai et al., 2006] undR. erythropolis [Urai et al., 2007] konnte die Struktur der Polysaccharide aufgeklärt werden. Bei derCharakterisierung der Zellhüllen-Polysaccharide sowie der verkapselnden Polysaccharide zeigte sich,dass einige strukturelle Ähnlichkeiten zwischen diesen Polysacchariden bestehen [Richards, 1994; Uraiet al., 2006, 2007]. Die verzweigten Polysaccharide in Rhodoccoci wirken verkapselnd, was bisher nurwenig erforscht wurde. Dabei weisen die Rhodococci eine große strukturelle Vielfalt an verkapselndenPolysacchariden und Zellhüllen-Polysacchariden auf. Es wird weiterhin angenommen, dass diese Ober-flächenpolymere den Bakterien ermöglichen, hydrophobe Substanzen zu nutzen [Perry et al., 2007].Für die Zukunft sollten weitere Forschungen vor allem an diesen Punkten ansetzen.

Lipoproteine: Bakterien besitzen die Eigenschaft, Proteine durch die kovalente Bindung einer Lipid-gruppe an einen Cysteinrest zu modifizieren. Dieser Rest wird dann zum N-terminus der reifen Prote-ine, welche die Lipoproteine synthetisieren [Hutchings et al., 2009]. Bei den grampositiven Bakteriensind die Lipoproteine in der äußeren Faltstruktur der Plasmamembran verankert. Es ist allerdingsmöglich, dass einige Lipoproteine auch in der Mykolatschicht zu finden sind [Sutcliffe und Harrington,2004]. Bei der Analyse des Genoms von R. jostii fanden sich Hinweise, dass 2 % (> 100 Proteine)

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des vorausgesagten Proteoms vermutlich Lipoproteine sind [Sutcliffe und Harrington, 2004; Sutcliffeet al., 2010]. Die vermeintlichen Lipoproteine können mit membrangebundenen Komponenten einenZellhüllenkomplex bilden, der an der Substrataufnahme und dem Transport zur Membranpermeasebeteiligt sind. In Übereinstimmung mit ihrer Nähe zur Zellmembran und Zellhülle kann angenommenwerden, dass die vermeintlichen Lipoproteine Bestandteile einiger aktiver Enzyme in der Zellhüllesind. Für R. jostii zeigten Hutchings et al. [2009] einen Einfluss von vermeintlichen Lipoproteinenin membranassoziierten Redoxprozessen. In weiteren Arbeiten wurden zwei vermeintliche Lipoprotei-ne gefunden, welche in das Drei-Komponenten-System involviert sind, welches wiederum ein Teil derWahrnehmungs- und Signalprozesse der Zellhülle ist [Hoskisson und Hutchings, 2006; Ortiz de OruéLucana und Groves, 2009]. Bei vielen vermeintlichen Lipoproteinen sind die Funktionalitäten bisherallerdings nicht klar.

1.8.4 Substratspezifischer Einfluss auf die Zellhüllenpermeabilität beim Rhodo-coccus

Der Zellhüllenaufbau von Mykobakterien kann durch verschiedenste Parameter während der Wachs-tumsphase der Bakterien beeinflusst werden, wie z.B. Temperaturänderungen, niedrige pH-Werte,Nährstoffmangel, Art der C-Quelle und organische Lösungsmittel. Diese Faktoren können das Verhält-nis von gesättigten zu ungesättigten Mykolsäuren in den Zellen verändern und eine Cis/trans-Isomerieinduzieren [Beney und Gervais, 2001; Cronan, 2002; Ramos et al., 2002]. Mit den Veränderungen inder Zellhülle gehen die Veränderung der Fluidität und Permeabilität der Zellmembran einher. Den-selben Effekt weisen die Zellen auf, wenn sie auf „untypischen“ Kohlenstoffquellen (z.B. Alkanen)gewachsen sind [Espuny et al., 1996; Kolouchová et al., 2012]. In einigen Studien wurden Mykobakte-rien auf unterschiedlichen C-Quellen kultiviert und anschließend die Permeabilität der Zelle und/oderdie Zusammensetzung der Mykolsäuren untersucht. Ein Zusammenhang konnte bisher nicht eindeutiggeklärt werden [Espuny et al., 1996; Schneider et al., 1996; Cheung und Kinkle, 2001; Wick et al.,2002b; Sokolovská et al., 2003; Kolouchová et al., 2012]. Auch der Einfluss der Channelproteine aufdie Permeabilität ist bisher noch ungeklärt.

Dabei gibt es einige Thesen, die den Zusammenhang zwischen der C-Quelle und der Mykolsäure zuerklären versuchen. Die Annahme, dass die Permeabilität der Zellhülle durch die Kettenlänge derMykolsäuren beeinflusst wird, konnte bereits von Stratton et al. [2003] und Sokolovská et al. [2003]widerlegt werden. Ebenso die Annahme, dass die Kettenlänge der C-Quelle Einfluss auf die Ketten-länge der Mykolsäure nimmt [Wick et al., 2002b]. Eine weitere These ist, dass ein Zusammenhangzwischen der Anzahl der ungeraden und geraden C-Atome in der C-Quelle und den Mykolsäurenbesteht. Wachsen die Mykolsäuren auf linearen C-Quellen mit einer geraden Anzahl an C-Atomen,weisen die gebildeten Mykolsäuren nur gerade Anzahlen von C-Atomen auf. Bei linearen C-Quellenmit einer ungeraden Anzahl an C-Atomen werden Ketten mit einer geraden und ungeraden Anzahl anC-Atomen gebildet. Wick et al. [2002b,a] zeigten, dass die Permeabilität der Zellhülle für hydrophobeVerbindungen zunimmt, wenn R. erythropolis auf einer hydrophoben C-Quelle wächst. Inwieweit dieStruktur der Mykolsäuren durch die C-Quellen beeinflusst wird, muss in zukünftigen Untersuchungenweiter erforscht werden.

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Zielsetzung

Seit einiger Zeit steht der Einfluss von sekundären Pflanzenstoffen auf die Gesundheit des Menschenim Fokus vieler in vitro und in vivo Studien. Dabei werden mittlerweile vor allem den Anthocyanengesundheitsfördernde und präventive Eigenschaften zugesprochen. Dennoch sind bis heute die genauenMechanismen der Metabolisierung und Modifikation der Flavonoide und deren Abbauprodukte unge-klärt.

Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Validierung einer geeigneten Analysemethode für die Fla-vonoide und deren Metabolite während der enzymatischen und mikrobiellen in vitro Umsetzung unteranaeroben Bedingungen im simulierten in vitro Verdauungsmodell und für die Umsetzung unter ae-roben Bedingungen durch den Rhodococcus erythropolis DSM 44534. Die Etablierung des simuliertenin vitro Verdauungsmodells erfolgte am Forschungsinstitut für Mikrobiologie der TU Berlin durchM. Hageböck. Für die Analyse der Abbauprodukte und weiteren Metaboliten in einer komplexen Ma-trix, wurde eine RP-HPLC-Methode etabliert und validiert. Bei den Bestandteilen dieser komplexenMatrices handelt es sich um künstlichen Magen- und Duodenalsaft, welcher mit den Enzymen Trypsin,Pankreatin und Pektin sowie den, für den Humanstoffwechsel bekannte Mikroorganismen, versetzt war.Dazu wurden zum einen die Reinsubstanzen enzymatisch und dann sequentiell enzymatisch-mikrobielluntersucht. Anschließend wurden verschiedene anthocyanhaltige Matrices für die Untersuchung einge-setzt.Bei der Umsetzung des Rutins unter aeroben Bedingungen durch Rhodococcus erythropolis DSM 44534wurde neben der Verstoffwechslung auch der Einfluss verschiedener C-Quellen auf die Zusammenset-zung und Permeabilität der Zellhülle untersucht. Dazu wurde eine ESI-MS/MS-Methode etabliert undder Aufbau der Mykolsäuren für die einzelnen C-Quellen analysiert.

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Material und Methoden

3.1 ChemikalienQuercetin-3-O-rutinosid (Rutin, Fa. Extrasynthese, Genay Cedex, France)Quercetin (Fa. Extrasynthese, Genay Cedex, France)Quercetin-3-O-glucosid (Isoquercetin, Fa. Sigma Aldrich, Steinheim)Cyanidin (Fa. Extrasynthese, Genay Cedex, France)Delphinidin (Fa. Extrasynthese, Genay Cedex, France)Delphinidin-3-O-glucosid (Myrtillin, Fa. Extrasynthese, Genay Cedex, France)Cyanidin-3-O-glucosid (Kuromanin, Fa. Extrasynthese, Genay Cedex, France)Cyanidin-3-O-rutinosid (Keracyanin, Fa. Extrasynthese, Genay Cedex, France)3,4-Dihydroxybenzoesäure (Protocatechusäure, Fa. Roth, Karlsruhe)3,4,5-Trihydroxybenzoesäure (Gallussäure, Fa. Alfa Aesar, Karlsruhe)1,3,5-Trihydroxybenzen Dihydrat (Phloroglucinol, Fa. Extrasynthese, Genay Cedex, France)2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd (Phloroglucinolaldehyd, Fa. Extrasynthese, Genay Cedex, France)3-Hydroxyphenylessigsäure (Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim)1,2-Dihydroxybenzen ((+)-Catechol, Fa. Roth, Karlsruhe)3,5,7-Trihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-4-chromenon (Myricetin, Fa. Extrasynthese, Genay Ce-dex, France)2’,3,4’,5,7-Pentahydroxyflavon (Morin, Fa. Extrasynthese, Genay Cedex, France)6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure (Trolox, Fa. Cayman Chemicals, Tallin, Esto-nia)2,2’-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS, Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim)Folin-Ciocalteau-Reagenz (Fa. Roth, Karlsruhe)Natriumcarbonat (Fa. Roth, Karlsruhe)Ammoniumsulfat (Fa. Roth, Karlsruhe)Ammoniumchlorid (Fa. Fluka Analytical, Buchs)Natriumsulfat (Fa. Roth, Karlsruhe)Natriumdihydrogenphosphat (Fa. Roth, Karlsruhe)di-Natriumhydrogenphosphat (Fa. Roth, Karlsruhe)Natriumchlorid (Fa. VWR, Darmstadt)TRIS (Fa. Roth, Karlsruhe)TRIS-HCl (Fa. Roth, Karlsruhe)30 % Acrylamid (Fa. Roth, Karlsruhe)N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (Fa. Bio-Rad Laboratories, München)Natriumdodecylsulfat (Fa. Fluka Analytical, Buchs)Ammoniumpersulfat (Fa. Roth, Karlsruhe)Dithiothreitol (Fa. Roth, Karlsruhe)Albumin Fraktion V (Fa. Roth, Karlsruhe)Kaliumdihydrogenphosphat (Fa. Roth, Karlsruhe)di-Kaliumhydrogenphosphat (Fa. Merck, Darmstadt)

Material und Methoden

Kaliumdisulfit (Fa. Merck, Darmstadt)Kaliumpersulfat (Fa. Merck, Darmstadt)Salzsäure 32% (Fa. Roth, Karlsruhe)Magnesiumsulfat Heptahydrat (Fa. Fluka Analytical, Buchs)Zitronensäure (Fa. Fluka Analytical, Buchs)Thiamin hydrochlorid (Fa. Merck, Darmstadt)di-Ammoniumhydrogencitrat (Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim)Calciumchlorid Dihydrat (Fa. Roth, Karlsruhe)Zinksulfat Heptahydrat (Fa. Merck, Darmstadt)Mangan-(II)-chlorid (Fa. Merck, Darmstadt)Natrium-EDTA Dihydrat (Fa. Roth, Karlsruhe)Kupfer-(II)-sulfat Pentahydrat (Fa. Merck, Darmstadt)Eisen-(III)-sulfat Heptahydrat (Fa. Roth, Karlsruhe)Magnesiumsulfat Monohydrat (Fa. Roth, Karlsruhe)Zinksulfat Heptahydrat (Fa. Roth, Karlsruhe)Cobalt-(II)-chlorid Hexahydrat (Fa. Roth, Karlsruhe)Natriumselenit (Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim)Natriummolybdat Dihydrat (Fa. Roth, Karlsruhe)Nickelsulfat Hexahydrat (Fa. Roth, Karlsruhe)Thiaminchlorid (Fa. Merck, Darmstadt)Pyrioloxamine Dichlorid (Fa. Alfa Aesar, Karlsruhe)Nicotinsäure (Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim)Calcium-D(+)-Pantothenat (Fa. Roth, Karlsruhe)4-Aminobenzoesäure (Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim)Vitamin B 12 (Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim)Ethanol absolut (Fa. Merck, Darmstadt)Ampholyte (Fa. Bio-Rad Laboratories, München)Braode Range Prestaind Standard (Fa. Bio-Rad Laboratories, München)20 % Glycin (Fa. Roth, Karlsruhe)Basisches Fuchsin (Fa. VWR, Darmstadt)Phenol (Fa. VWR, Darmstadt)Methylenblau (Fa. Fluka Analytical, Buchs)Methanol (Fa. Roth, Karlsruhe)Acetonitril (Fa. VWR, Darmstadt)Destilliertes und UV-behandeltes Wasser (Fa. Merck Millipore, Darmstadt)n-Hexan (Fa. Roth, Karlsruhe)Diisopropylether (Fa. Roth, Karlsruhe)Dimethylsulfoxid (Fa. Roth, Karlsruhe)Ethylacetat (Fa. VWR, Darmstadt)Ameisensäure (Fa. Roth, Karlsruhe)Essigsäure (Fa. Roth, Karlsruhe)99 % o-Phosphorsäure (Fa. Merck, Darmstadt)25 % Ammoniak (Fa. Roth, Karlsruhe)

3.1.1 Kitsysteme

Roti®-Black P, Silberfärbungskit für Proteine (Fa. Roth, Karlsruhe)

3.2 Materialien und Geräte1,5 ml Vials (Fa. Roth, Karlsruhe)Deckel ND 8 (Fa. VWR, Darmstadt)

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Material und Methoden

Septen ND 8, 60°, Naturkautschuk/TEF (Fa. Roth, Karlsruhe)Mikroskopgläser (Fa. Roth, Karlsruhe)3 ml/ 200 mg Amino Chromabond Sep Pek Kartuschen (Fa. Machery-Nagel, Düren)SPE-Kammer (Fa. Machery-Nagel, Düren)Membran Vakuumpumpe M7 2C (Fa. Vaccubrand, Wertheim)Gefriertrockner GT2 (Fa. Oerlikon Leybold Vacuum, Köln)Heizbad mit Thermostatregelung (Fa. Daglef Patz, Wankendorf)Kulturstopfen (Fa. Roth, Karlsruhe)Dialyseschlauch VIKING (MW 14000) (Fa. Roth, Karlsruhe)Centrifuge 5804 R (Fa. Eppendorf, Hamburg)Rotofor Zelle (Fa. Bio-Rad Laboratories, München)Bead Beater (Fa. Biospec Products, Bartlesville, USA )Vortex MS1 Minishaker IKA (Fa. Labortechnik Ziege, Luckenwalde)Analysenwaage Satorius Analytic (Fa. Sartorius, Göttingen)Rundschüttler Certomat U (Fa. Satorius, Göttingen)Temeperierhaube Certomat HK (Fa. Satorius, Göttingen)Temperierbare Schüttelwasserbäder GFL 1083 (Fa. GFL, Burgwedel)Ultraschallreiniger Bandelin Sonorex Super RK 106 (Fa. Bandelin, Berlin)Photometer Uvikon 920 Spectrophotometer (Fa. Kontron Instruments, Rossdorf)Photometer Specord 200 Plus (Fa. Analytik Jena, Jena)Mikroskop Zeiss Axioskop 2 Plus (Fa. Zeiss, Oberkochen)Laborgläser (Fa. Schott, Mainz)Bioreaktoren BIOSTAT® Aplus (Fa. Sartorius Stedim Biotech, Göttingen)

HPLC

HPLC-Anlage Degasser, Autosampler, Kappilar-Pumpe, DAD-Detektor 20-A Serie(Fa. Shimadzu, Duisburg)

Säulenofen 655A-52 (Fa. Merck Hitachi, Darmstadt)Software Lab-Solution 1.5 (Fa. Shimadzu, Duisburg)LC-MS/MS

MS-System QTrap 5500 mit Harvard Spritzenpumpe (Fa. AB SCIEX,Darmstadt)

HPLC-Anlage Kappiler-Pumpe, Säulenofen, Degasser, Autosampler 20 ASerie (Fa. Shimadzu, Duisburg)

Software Analyst 1.4.2 (Fa. AB SCIEX, Darmstadt)

3.3 Methodenvalidierung für die Anthocyan-Analyse

3.3.1 Herstellung der Standardlösungen

Je 2 mg Cyanidin-3-O-glycosid, Cyanidin-3-O-rutinosid, und Delphinidin-3-O-glycosid wurde in Braun-glasflaschen eingewogen und gravimetrisch in 2 ml absolutem Ethanol gelöst. Die Lösung wurden an-schließend mit 85 % Phosphorsäure auf pH 2 eingestellt, da die Anthocyane im sauren Bereich in ihrerstabilsten Form dem Flavyliumkation vorliegen. Die gleiche Menge an Myricetin wurde gravimetrischin 2 ml gelöst und ebenfalls auf pH 2 eingestellt. Die Stammlösungen (1 mg/ml) wurden bei -20 °Cgelagert. Die Anthocyanlösungen wurden immer frisch angesetzt, da die Anthocyane in Lösung nurkurze Zeit stabil sind.

3.3.2 Herstellung der Kalibrierkurven

Für die Kalibrierung wurde ein Standardmix aus den Anthocyanen mit Methanol / Wasser /o-Phosphorsäure 85 % (50/49,5/0.5, v/v/v) hergestellt und ebenfalls bei -20 °C aufbewahrt. Die

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Material und Methoden

Standardmischung wurde mit Methanol / Wasser / o-Phosphorsäure 85 % (50/49,5/0.5, v/v/v) aufdie Konzentrationen 100, 50, 10, 5 und 1 µg/ml verdünnt. Für die Quantifizierung wurde Myricetinals externer Standard verwendet, da Myricetin im Vergleich zu den Anthocyanen in Lösung stabilerist. Alle Proben wurden vor dem Messen 5 min bei 13371 x g und 4 °C zentrifugiert.

3.3.3 Herstellung der Matrixstandards

Um Aussagen über den Einfluss der künstlichen Verdauungssaft-Matrices auf die Analyten treffen zukönnen, wurden die Kalibrierkurven wie bei 3.3.2 in künstlichem Magensaft angesetzt. Der Einflussdes Duodenalsaftes wurde bei der Analyse der präzipitierten Anthocyane untersucht.

3.3.4 Selektivität

Die Selektivität sagt etwas über die Fähigkeit einer Methode aus eine Substanz eindeutig zu identifi-zieren und von anderen Komponenten abzutrennen. Um die Selektivität der Methode zu bestimmenwurden Leerproben der künstlichen Verdauungssäfte analog zur Probe aufgearbeitet und mit derAnthocyan-Methode mittels HPLC gemessen.

3.3.5 Linearität

Die Kalibrierkurven in Laufmittel und Matrix der Standards wurden mehrfach (n = 5) angesetzt undan fünf verschiedenen Tagen gemessen. Um die Linearität zu bestimmen wurde das Signal S gegen dieKonzentration c aufgetragen. Die Linearität wurde rechnerisch durch den Anpassungstest nach Man-del überprüft. Hierzu wurden die linearen Kalibrierfunktionen 1. Grades (y = a + bx) und 2. Grades(y = a + bx + cx2) sowie die dazugehörigen Standardabweichungen sy1 und sy2 herangezogen. DieDifferenz der Varianz wurde über folgende Formel berechnet:

DS2 = (N − 2)s2y1 − (N − 3)s2

y2 mit dem Freiheitsgrad f = 1Formel 1: Berechnung der Differenz der Varianz

Der Prüfwert PW wurde über folgende Formel berechnet:

PW = DS2/s2y

Formel 2: Berechnung des Prüfwertes

Anschließend mit den Tabellenwerten verglichen F (f1 = 1, f2 = N − 3, P = 99 %). Ist PW ≤ F istdie Kalibrierfunktion linear.Für die Bestimmung des Matrixeffektes wird der Quotient aus der Steigung des Standards in Lauf-mittel und Matrix gebildet:

[Quotient = SteigungMatrixkalibrierung/SteigungLM−Kalibrierung

Formel 3: Berechnung des Steigungsquotienten

Ergibt der Quotient einen Wert von eins stimmen die Steigungen überein, ist der Wert kleiner einsliegt eine Signalsupression vor und ist der Wert größer eins wird das Signal verstärkt.

3.3.6 Richtigkeit aus Wiederfindungsexperimenten und Reproduzierbarkeit derAnthocyan-Extraktion aus dem Protein-Anthocyan-Komplex

Die Richtigkeit ist ein Maß für die Abweichung des Messwertes vom richtigen Wert aufgrund einessystematischen Fehlers [Kromidas, 1999]. Für die Analyse komplexer biologischer Matrices sollte dieRichtigkeit über Wiederfindungsexperimente überprüft werden. Über das Verhältnis aus gefundenem

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Material und Methoden

Messwert und der richtigen Analytkonzentration in der Probe kann die gesamte Methode bewertetwerden und Rückschlüsse auf mögliche Auswirkungen von Matrix und Probenaufarbeitung gezogenwerden [Kromidas, 1999].Um die Wiederfindung der Anthocyane aus dem Komplex und die Reproduzierbarkeit der Extrak-tion auf zu zeigen wurden der Protein-Anthocyan-Komplex, welcher bei der Analyse der Standardsim Duodenalsaft gebildet wurde, mit einer dafür entwickelten Methode separat aufgearbeitet. Für dieUntersuchung wurden Blankproben des Duodenalsaft mit der Standardmischung (Abschnitt 3.3.1)dotiert, mit 85 % Phosphorsäure auf pH 2 - 3 angesäuert und zentrifugiert. Der Niederschlag in denProben mit Duodenalsaft wurden vom Überstand abgetrennt und wie in Abschnitt 3.5.3 beschriebenaufgearbeitet. Überstand und resolubilisierte Anthocyane wurden getrennt analysiert. Die Anthocyan-konzentration im Überstand des Duodenalsaftes und der resolubillisierte Anteil an Anthocyan wurdeüber die Geradengleichung berechnet und die Anthocyan Konzentrationen aus beiden Proben anschlie-ßend addiert. Alle Proben wurden 5-fach injiziert.Bei der Wiederfindung wurde ein sehr kleiner Konzentrationsbereich gewählt, da die Anthocyane imDarmsaft meist nur noch in geringer Konzentration vorlagen. Die Bestimmung der Wiederfindungfand hier nur auf einem Level statt.

Tabelle 1: Überprüfung der Richtigkeit aus Wiederfindungsexperimenten und Reproduzierbarkeit derResolubilisierung des Protein-Anthocyan-Komplexes. Um die Richtigkeit der Wiederfindung der präzipitiertenAnthocyane aus dem Duodenalsaft nachzuweisen, wurde der Standard in einem kleinen Konzentrationsbereich in Duo-denalsaft und Laufmittel mit kleinen Konzentrationen eingesetzt und wie in Abschnitt 3.5.3 beschrieben aufgearbeitet.

Anthocyan Proben Matrixstandard 80 % Matrixstandard 120 %

Level Gehaltdotiert Gehaltberechnet Gehaltberechnet[µg/kg] [µg/kg] [µg/kg]

Del-3-O-glc 1 12,6 10,1 15,1Cy-3-O-glc 1 9,8 7,8 11,8Cy-3-O-rut 1 14,9 11,9 17,9

Die Vollständigkeit der Extraktion erfolgt durch die Berechnung der Wiederfindung. Sie gibt Aufschlussdarüber, wie viel des Analyten während der Aufarbeitung „verloren geht“. Ein Level gilt als valide wenndie durchschnittliche Wiederfindung zwischen 70 % und 110 % liegt.

Wiederfindung [%] = Cgemessen/Czugesetzt ∗ 100%Formel 4: Berechnung der Wiederfindung

Der maximale zulässige Variationskoeffizient wurde über die Horwitz-Gleichung ermittelt.

V K = 2(1−0.5logC)

Formel 5: Horwitz-Gleichung

C entspricht dabei dem Massenanteil des Gehalts. Für einen Gehalt von 12,57 µg/ml ergibt sich:

C = 0, 00001257g/1000kgFormel 6: Berechnung des Massenanteils

3.3.7 Nachweis- und Bestimmungsgrenze

Bei der Nachweisgrenze (NG) handelt es sich um die kleinste qualitativ nachweisbare Analytenkon-zentration [Kromidas, 1999]. Die Bestimmungsgrenze (BG) ist die kleinste Analytenkonzentration diemit akzeptabler Richtigkeit und Präzision quantitativ bestimmt werden kann [Kromidas, 1999]. Diebeiden Werte wurden über die Kalibriermethode aus den Kalibriergeraden in Magensaft berechnet.Die Erfassungsgrenze wurde über die Nachweisgrenze ermittelt. Bei der Erfassungsgrenze handelt essich um die geringste Analytenkonzentration, welche mit einer bestimmten statistischen Wahrschein-lichkeit detektiert werden kann [Kromidas, 1999]. Der gemessene Wert für die Bestimmungsgrenze

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Material und Methoden

sollte dreimal höher sein als der Wert für die Nachweisgrenze, während das Signal der Nachweisgrenzeden dreifachen Wert des Signalrauschens betragen sollte.

3.3.8 Präzision

Die Präzision beschreibt die Streuung von Messwerten um einen Mittelwert aufgrund zufälliger Fehler[Kromidas, 1999]. Sie ist von der Analytenkonzentration abhängig, daher sollten immer mehrere Kon-zentrationen innerhalb eines Arbeitsbereiches untersucht werden. Für die Präzision werden homogeneProben mehrfach gemessen und aus deren Mittelwert und der Standardabweichung den Variationsko-effizienten über folgende Gleichung berechnet:

V K = s/x ∗ 100Formel 7: Berechnung des Variationskoeffizienten

3.3.8.1 Methodenpräzision

Die Methodenpräzision beschreibt die Streuung von Messwerten die unter Wiederholbedingungen auf-tritt [Kromidas, 1999]. Zur Bestimmung der Methodenpräzision wurde dasselbe Probenmaterial immergleich aufgearbeitet und über das gleiche Verfahren an der gleichen Anlage von der gleichen Personuntersucht. Der Werte für den Variationskoeffizient sollte nicht über 10 % liegen.

3.3.9 Arbeitsbereich

Der Arbeitsbereich beschreibt das Intervall zwischen niedrigster und der höchsten Analytenkonzen-tration für die die Linearität, Präzision und Richtigkeit experimentell überprüft wurden.

3.3.10 Stabilität

Die Stabilität beschreibt die Fähigkeit einer Methode über einen bestimmten Zeitraum reproduzierbareErgebnisse zu liefern [Kromidas, 1999]. Dazu wurden die Proben aus der Validierung an verschiedenenTagen gemessen und die Messergebnisse verglichen. Zwischen den Messungen wurden die Proben bei-20 °C gelagert.

3.4 Aufbau des simulierten in vitro VerdauungsmodellsDie Etablierung und Durchführung der Umsetzungsversuche im simulierten in vitro Verdauungsmodellwurden am Forschungsinstitut für Mikrobiologie der TU Berlin durch M. Hageböck durchgeführt. DerInhalt des folgenden Abschnittes (3.4) stammt aus der Dissertation des Projektpartners M. Hageböck[2013].

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Material und Methoden

3.4.1 Eingesetzte Mikroorganismen

Tabelle 2: Übersicht der eingesetzten Mikroorganismen mit DSM-Nummer, dem jeweiligen Vorkultur-medium und dem Einsatzort der Kultur im in vitro Verdauungsmodell. PYGm = modifiziertes Pepton-Hefeextrakt-Glukose-Medium, ST 1 = Standard 1 Nährmedium

Stamm DSM-Nr. Vorkulturmedium Einsatz in VerdauungsstufeBacteroides ovatus 1896 PYGm DickdarmBacteroides thetaiotaomicron 2079 PYGm DickdarmBacteroides vulgatus 1447 PYGm DickdarmBifidobacterium adolescentis 20083 MRS DickdarmBifidobacterium angulatum 20098 MRS DickdarmBifidobacterium boum 20432 MRS DickdarmBifidobacterium breve 20213 MRS DickdarmBifidobacterium catenulatum 20103 MRS DickdarmBifidobacterium infantis 20088 MRS DickdarmEnterococcus faecalis - St1 IleumEnterococcus faecalis - St1 IleumEscherichia coli 787 St1 IleumEubacterium aerofaciens 3979 PYGm DickdarmEubacterium hallii 3353 PYGm DickdarmEubacterium ramulus 3995 PYGm DickdarmLactobacillus reuteri 20016 MRS IleumLactobacillus brevis - MRS IleumLactobacillus rhamnosus - MRS IleumLactobacillus acidophilus - MRS IleumLactobacillus plantarum 20205 MRS IleumLactobacillus fermentum 20391 MRS IleumLactobacillus spec - MRS IleumMegasphaera elsdenii 20460 PYGm Dickdarm

3.4.2 Verwendete Medien

Alle käuflich erworbenen Medien wurden nach Angaben des Herstellers hergestellt und anschließendmit 1 g/l Tween 80 und 5 g/l Natriumacetat versetzt. Folgende kommerziell erhältliche Medien wurdeneingesetzt: Clostridien-Differential-Bouillon, Standard Nährmedium 1 (St1) und MRS. Alle verwen-deten Medien wurden vor der Benutzung bei 120 °C für 20 min autoklaviert. Die festen Nährmedienwurden durch Zugabe von 1,5 % Agar zum Medium hergestellt.

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Material und Methoden

Tabelle 3: Zusammensetzung der Vorkulturmedien und der dazugehörigen Salzlösungen bzw. Spurenele-mentlösung in g/l. Die Medien wurden vor dem Einsatz 20 min bei 120 °C autoklaviert. Das PYGm-Medium wurdevor dem Autoklavieren auf pH 7 eingestellt und nach dem Autoklavieren mit 40 ml Salzlösung, 10 ml Häminlösung und200 µl Vitamin K1-Lösung versetzt. Während des Abkühlens wurden die Medien in die Anaerobenkammer geschleust,um den Ausschluss von Luftsauerstoff zu gewährleisten.

Substanzen für dasPYGm-Medium

Konzentration Salzlösung Konzentration

(DSMZ Medium104)

[g/l] [g/l]

Trypton 5,0 CaCl2 * 2 H2O 0,25Pepton 5,0 MgSO4 * 7 H2O 0,5Hefeextrakt 10,0 K2HPO4 1,0Fleischextrakt 5,0 KH2PO4 1,0Glucose 5,0 NaHCO3 10,0K2HPO4 2,0 NaCl 2,0Tween 80 0,5Cystein-HCl *H2O 1,0Dest. Wasser 950

Substanzen für dasReduktionsmedium

Konzentration Spurenelementlösung Konzentration

[g/l] [g/l]NaHCO3 9,2 MgCl2 * 6 H2O 20,0Na2HPO4 7,1 CaCl2 * H2O 0,50NaCl 0,47 FeCl3 * 6 H2O 0,37KCl 0,45 ZnSO4 * 7 H2O 0,50Harnstoff 0,40 CoCl2 * 6 H2O 0,25CaCl2 0,10Na2SO4 0,10MgCl2 0,10Spurenelementlösung 10 mlResazurin (1 mg/ml) 1 ml

Hämin-Lösung: Für die Lösung wurden 50 mg Hämin in 1 ml 1 N NaOH gelöst, anschließend mit100 ml destilliertem Wasser aufgefüllt und die fertige Lösung steril filtriert und bei 4 °C aufbewahrt.

Vitamin K1-Lösung: In 20 ml 95 %-igem Ethanol wurden 100 µl Vitamin K1 gelöst, die Lösung sterilfiltriert und bei 4 °C lichtgeschützt aufbewahrt.

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Material und Methoden

Tabelle 4: Zusammensetzung des synthetischen Magen- bzw. Duodenalsaft in g/l. Die Medien wurden vordem Einsatz 20 min bei 120 °C autoklaviert. Während des Abkühlens wurden die Medien in die Anaerobenkammergeschleust, um den Ausschluss von Luftsauerstoff zu gewährleisten

Substanzen für Konzentration [g/l] Anmerkungden synthetischenMagensaftNaCl 3,0 Der Magensaft wurde mit 12 M HCl auf pH 1,5 eingestelltPepsin 2,8KCl 0,90KH2PO4 0,36Substanzen fürden synthetischenDuodenalsaftOchsengalle 9,0 Der Duodenalsaft wurde mit 0,38 M KOH auf pH 7 eingestelltNaHCO3 1,0KCl 0,30CaCl2 0,50MgCl2 0,20Pankreatin 1,5Trypsin 0,02

3.4.3 Stammführung

3.4.3.1 Lagerung

Für die Herstellung der Gefrierkulturen wurden die Stämme in den entsprechenden Vorkulturmedien(Tabelle 2) angezogen und mit Glycerol versetzt. Die Langzeitlagerung erfolgte als 20 %-iger Glyce-rolstock bei -70 °C.

3.4.3.2 Anaerobe Vorkulturführungen

Die Vorkulturen wurden in der Anaerobenkammer Whitley DG 250 unter Sauerstoffausschluss kul-tiviert. Wenn nicht anders angegeben, wurden für die Anzucht jeweils 250 µl der Gefrierkulturen in50 ml des entsprechenden Vorkulturmediums gegeben. Je nach Stamm betrug die Inkubationsdauer12 bis 48 Stunden.

3.4.3.3 Aufbau des in vitro Verdauungsmodells und der einzelnen Verdauungsstufen

Das in vitro Verdauungsmodell besteht aus vier miteinander verknüpften 5 Liter Bioreaktoren BIO-STAT® Aplus, welche die verschiedenen Stationen der menschlichen Verdauung darstellen. Das Modellspiegelt stufenweise die Umsetzung der Nahrungsmittelinhaltsstoffe wieder. Dabei spiegeln der Ma-gen und das Duodenum (Dünndarm) die enzymatischen Verhältnisse wieder und das Ileum sowie deraufsteigende und absteigende Dickdarm die mikrobiellen Verdauungsstufen. Für die mikrobiologischenStufen wurden definierte Mischkulturen von Bakterien eingesetzt, deren Stämme mit spezifischer Ak-tivität oder zahlenmäßig in hoher Anzahl in den jeweiligen Darmbereichen vorkommen. Die Steuerungerfolgte über die Software PC-Panel µDCU, die Aufzeichnung der Daten über das Programm BioPAT®MFCS/win von Satorius Stedim Biotech GmbH (Göttingen). Die Versuche wurden unter anaerobenBedingungen, Temperatur- (mittels Heizmanschette und Kühlfinger) und pH-kontrolliert (mittels 20 %KOH (w/v) und 20 % H3PO4 (v/v)) durchgeführt. Der pH-Wert und Sauerstoffgehalt wurde mittelsMesssonden kontrolliert: Gelöstsauerstoffelektrode: Oxyferm FDA 325 und pH-Elektrode: Easyfermplus K8 325. Die Verdauungssäfte (Tab. 4) wurden während der Umsetzung permanent mit einerRührerdrehzahl von 150 rpm durchmischt. Alle Stufen wurden bei 37 °C durchlaufen. Die rein en-zymatische Umsetzung der Anthocyane wurde in der Magenpassage und dem Darm durchgeführt.Vor Beginn jedes Versuches sowie bei jeder Probenentnahme wurden die Bioreaktoren mit Stickstoff

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Material und Methoden

begast. Für die Überführung der einen Verdauungsstufe in die nächste wurde eine Peristaltikpumpeeingesetzt.Magen: Im Magen wurden die Proben zu gleichen Teilen mit Magensaft (v/v) (Tab. 4) mit 1,4 g/lPepsin (Endkonzentration) versetzt und für 2 h bei 37 °C und pH 2 unter anaeroben Bedingungeninkubiert. Die Kontrolle enthielt keine Enzyme.Duodenum: Für das Duodenum wurde der Magensaft mit so viel Duodenalsaft versetzt (v/v) (Tab.4), wie noch an Magensaft vorhanden war. Anschließend wurde in einer Endkonzentration von 0,02 g/lTrypsin und 0,5 g/l Pankreatin hinzugegeben. Die Inkubation lief über 4 h bei 37 °C und pH 6,8 unteranaeroben Bedingungen. Die Kontrolle enthielt keine Enzyme.Ileum: Für die mikrobielle Umsetzung wurde der Magen- und Duodenumansatz in eine definierteMischkultur an Darmbakterien (Tab. 1) ins Reduktionsmedium (Tab. 2) transferiert. Das Volumender Mischkultur lag im gleichen Verhältnis wie der bisherige Ansatz (v/v) vor. Die Zellkonzentrationzu Beginn des Ileums betrugen: für die einzelnen Stämme der Enterococcen 5*105 Z/ml, für E. Coli1*107 Z/ml und für die einzelnen Lactobacillus-Stämme 2*106 Z/ml. Die Inkubation lief über 4 hbei 37 °C und pH 6,7 unter anaeroben Bedingungen. Zur Kontrolle wurde Reduktionsmedium ohneMikroorganismen hinzugegeben.Dickdarm: Für den aufsteigenden und absteigenden Dickdarm wurde der Ansatz wieder mit typischenBakterien (Tab. 1) im Reduktionsmittel (Tab. 2) versetzt. Hier betrug der Anteil des zugefügten Volu-mens nur 1/5 des Restvolumens aus dem vorherigen Ansatz. Die Zellkonzentration zu Beginn des Dick-darms betrugen: für die einzelnen Stämme der Bacteroides 3*108 Z/ml, fürM. elsdenii 1*105 Z/ml, fürdie einzelnen Eubakterien-Stämme 3*108 Z/ml und für die einzelnen Clostridien-Stämme 1*105 Z/ml.Die Umsetzung im aufsteigende Dickdarm verlief 12 h bei 37 °C und pH 5,5 unter anaeroben Bedin-gungen. Für den absteigenden Dickdarm wird der pH-Wert auf 6,5 eingestellt und der Versuch fürweitere 6 h inkubiert. Auch hier lief der Kontrollansatz ohne Mikroorganismen.Bei der rein enzymatischen Umsetzung der Anthocyane und der enzymatischen und mikrobiellen Um-setzung des Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) wurden zwei Blindwerte untersucht. Dabei wurde zumeinen das jeweilige Flavonoid in Magen- bzw. Darmsaft ohne die Zugabe von Enzymen und zum an-deren der Magen- bzw. Darmsaft versetzt mit Enzymen unter Ausschluss von Flavonoiden inkubiert.Die Ergebnisse dieser Blindwertstudien sollten Fehlinterpretationen (falsch Positive) der Messungenausschließen und damit den Einfluss der Enzyme und Mikroorganismen bei der Metabolisierung derFlavonoide aufzeigen.

3.5 Probenvorbereitung und Analyse der Flavonoide aus dem simu-lierten in vitro Verdauungsmodell mittels HPLC und LC-MS

3.5.1 RP-HPLC-Methode zur Analyse der Anthocyane und ihrer Abbauprodukteim Magen- und Duodenalsaft

Die qualitative und quantitative Bestimmung der in den Proben enthaltenen Flavonoide soll Infor-mationen über den enzymatischen und mikrobiellen Abbau der Naturstoffe liefern. Durch Vergleichder Retentionszeiten und UV/VIS-Spektren durch Standards wurde die Identifikation der Chromato-grammpeaks verifiziert.

Laufmittelsystem und Chromatographiebedingungen:Laufmittel A: bidest. Wasser / o-Phosphorsäure (85 %) (99,5 / 0,5, v/v/v)Laufmittel B: Methanol / bidest. Wasser / o-Phosphorsäure (85 %) (50/49,5/0,5, v/v/v )Flussrate: 1 ml/minSäulentemperatur: 30 °CInjektionsvolumen: 20 µlSäule: RP-18 luna (2) 5 µm, 250 x 4,6 mm (Fa. Phenomenex)Vorsäule: RP-18, 4 x 3,0 mm (Fa. Phenomenex)Wellenlängen: 520, 370, 320 und 280 nm

42

Material und Methoden

Tabelle 5: Gradientenprogramm für die Analyse der Anthocyane aus dem simulierten in vitro Verdau-ungsmodell

T [min] FMA [%] FMB [%]

0 80 205 80 2045 0 10055 0 10057 80 2068 80 20

3.5.2 Probenvorbereitung der Anthocyan-Proben aus der Fermentation

Alle Proben wurden mit 85 %-iger o-Phosphorsäure auf pH 2 - 3 eingestellt und anschließend für10 min bei 13371 x g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde in einen Braunglasvial überführtund analysiert. Der zurückgebliebene Niederschlag wurde separat weiter aufgearbeitet.

3.5.3 Probenvorbereitung der präzipitierten Anthocyane

Zum Präzipitat wurden 1 ml DMSO / MeOH (1/3) und 10 µl 85 %-ige o-Phosphorsäure gegeben,10 min im eisgekühlten Ultraschallbad behandelt und dann nochmals 5 min bei 13371 x g zentrifugiert.Dieser Vorgang wurde mehrmals wiederholt, bis die Anthocyane wieder vollständig in Lösung vorlagen.

3.5.4 LC-MS-Methode zur Analyse von Delphinidin nach der enzymatischen Um-setzung

Zur Identifizierung unbekannter Substanzen der Metabolisierung von Delphinidin wurde eine Me-thode zur Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS) etabliert unddurchgeführt. Das ESI-Massenspektrum wurde mittels AB Sciex Q Trap 5500 sowohl im ESI (+)([M + H]+) als auch ESI (-) ([M − H]−) Modus aufgenommen. Stickstoff wurde als Dry Gas undNebulizer Gas verwendet. Die Ionisierungs-Spannung wurde auf +/- 4000 V eingestellt.

Laufmittelsystem und Chromatographiebedingungen:Laufmittel A: bidest. Wasser / Ameisensäure (99,9/0,1, v/v)Laufmittel B: Acetonitril / Ameisensäure (99,9/0,1, v/v)Flussrate: 0,3 ml/minSäulentemperatur: 40 °CInjektionsvolumen: 5 µlQuellentemperatur: 400 °CSäule: RP-18 luna (2) 5 µm, 250 x 4,6 mm (Fa. Phenomenex)Vorsäule RP-18, 4 x 3,0 mm (Fa. Phenomenex)Massenscanbereich: 150 – 1000 m/z

Tabelle 6: Gradientenprogramm der LC-MS-Methode für die enzymatische Umsetzung im simuliertenin vitro Verdauungsmodell

T [min] FMA [%] FMB [%]

0 80 205 80 2035 0 10045 0 10048 80 2068 80 20

43

Material und Methoden

3.5.5 RP-HPLC-Methode zur Analyse des Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) undderen Abbauprodukte im Magen- und Duodenalsaft

Die qualitative und quantitative Bestimmung der in den Proben enthaltenen Flavonole soll Infor-mationen über den enzymatischen und mikrobiellen Abbau der Naturstoffe liefern. Durch Vergleichder Retentionszeiten und UV/VIS-Spektren mittels Standard wurde die Identifikation des Chromato-grammpeaks verifiziert.

Fließmittelsystem und Chromatographiebedingungen:

Fließmittel A: 0,2 % EssigsäureFließmittel B: ACN / 0,2 % Essigsäure (75/25, v/v)Flussrate: 1 ml/minSäulentemperatur: 30 °CInjektionsvolumen: 20 µlSäule: VDSpher C18-E, 5 µm, 250 x 4,6 mm (Fa. VDS Optilab)Vorsäule: RP-18, 4 x 3,0 mm (Fa. Phenomenex)Wellenlängen: 370 und 280 nm

Tabelle 7: Gradientenprogramm für die Analyse von Rutin aus dem simulierten in vitro Verdauungsmodell

T [min] FMA [%] FMB [%]

0 80 2010 80 2015 67 3325 67 3335 60 4040 60 4045 0 10046 80 2056 80 20

3.5.6 Probenvorbereitung der Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) Proben aus derFermentation

Alle Proben wurden 10 min bei 13371 x g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein Braunglas-vial überführt und analysiert. Der zurückgebliebene Niederschlag wurde separat weiter aufgearbeitet.

3.5.7 Probenvorbereitung des präzipitierten Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin)

Zum Präzipitat wurden 100 µl DMSO / MeOH (1/3) gegeben, 10 min im eisgekühlten Ultraschallbadbehandelt und dann nochmals 5 min bei 13371 x g zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde mehrmalswiederholt, bis Rutin wieder vollständig in Lösung vorlag.

3.6 Bestimmung der antioxidativen Kapazität, des Monomerinde-xes und des Gesamtphenolgehaltes der Proben aus dem Ver-dauungsmodell

3.6.1 Folin-Ciocalteau

Der Gesamtphenolgehalt in den Proben wurde mittels Folin-Ciocalteau-Reagenz ermittelt. Die Metho-de erfasst quantitativ den Gesamtanteil an phenolischen Verbindungen in der Probe. Die phenolischen

44

Material und Methoden

Substanzen reduzieren im alkalischen Milieu das phosphorsaure Wolframat und Molybdat der Rea-genzien, was eine Blaufärbung hervorruft, die bei 720 nm photometrisch erfasst wird. Zu je 1 ml Probewerden 7,5 ml dest. H2O und 0,5 ml Folin-Ciocalteau-Reagenz pipettiert, mittels Vortex gemischt und6 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zugabe von 1 ml gesättigter Natriumcarbonatlösungwurden die Proben nochmals gut durchmischt und für 30 min stehengelassen. Danach wurde die Ab-sorption bei 720 nm mittels UV-Photometer gemessen. Für die Standardkurve wurde Gallussäure ineinem Konzentrationsbereich von 10 - 100 mg/l eingesetzt.

3.6.2 Bestimmung der monomeren und polymeren Anthocyane

Die Bestimmung des polymeren Anteils an Anthocyanen beruht auf dem Prinzip der Entfärbung, wel-che durch die Anlagerung von Sulfit am Flavyliumkation bedingt ist. Die in der vorliegenden Arbeitverwendete Methode ist eine modifizierte Version der Methode von Giusti und Wrolstad [2001].Kaliumdisulfitlösung: 5,52 g Kaliumdisulfit wurden in 50 ml dest. Wasser gelöst.HCl-Lösung (7 mol/l): 5 ml Konz. HCl werden mit dest. Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

Alle Proben wurden vor der Messung 10 min bei 9000 rpm abzentrifugiert und gegebenenfalls mitbidest. Wasser verdünnt. Für die Bestimmung des Gesamtanteils an Anthocyanen (Ages) wurden je225 µl Probe mit 275 µl HCl (7 mol/l) und 150 µl bidest. Wasser versetzt. Für die Bestimmungdes polymeren Anteils (Apoly) wurden statt bidest. Wasser 150 µl Kaliumdisulfitlösung (0,5 mol/l)zur Probe gegeben. Alle Proben werden 20 min unter Lichtausschluss inkubiert und anschließend bei520 nm mittels UV-Photometer gemessen. Der Anteil an monomeren Anthocyanen (Amono) ergab sichaus der Differenz von der Extinktion des Gesamtanteils der Anthocyane und dem Anteil an polymerenAnthocyanen bei 520 nm.

A(mono) = A(gesamt) −A(poly)

A(gesamt) = Extinktion der gesamten Probe

A(poly) = Extinktion des polymeren Anteils der Probe

A(mono) = Extinktion des monomeren Anteils der Probe

3.6.3 Bestimmung der antioxidativen Kapazität mittels Trolox Equivalent Anti-oxidative Capacity (TEAC)

Bei dieser Methode wird ein blau-grün gefärbtes ABTS+∗-Radikalkation (ABTS = 2,2’-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)) gebildet, welches bei 734 nm photometrisch gemessen wird. Dieantioxidative Wirkung der Probe ist proportional zur Fähigkeit die ABTS-Lösung zu entfärben. BeimTrolox-Standard handelt es sich um ein Vitamin E-Derivat.PBS-Puffer : 7,14 g di-Kaliumhydrogenphosphat und 1,23 g Kaliumhydrogenphosphat werden mitdest. Wasser auf 1 l aufgefüllt. Der pH-Wert sollte zwischen 7,2 - 7,4 liegen.ABTS-Stammlösung: 96,25 mg ABTS und 16,25 mg Kaliumpersulfat werden mit dem PBS-Pufferauf 25 ml aufgefüllt. Die Lösung sollte eine Nacht bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss stehenbleiben.ABTS-Arbeitslösung: Die ABTS-Stammlösung wird 1:50 mit PBS-Puffer verdünnt und die Lösungüber einen Faltenfilter filtriert. Die Lösung sollte sofort eingesetzt werden und lichtgeschützt gelagertwerden.Trolox-Stammlösung (2,5 mmol/l): 64 mg Trolox werden in 3 ml Ethanol angelöst und mit PBS-Pufferauf 100 ml aufgefüllt.

Proben mit einem hohen Gesamtphenolgehalt bzw. antioxidativer Kapazität sollten vor der Messungmit PBS-Puffer verdünnt werden. 1,98 ml der ABTS-Arbeitslösung werden in der Küvette vorgelegtund 20 µl Probe hinzupipettiert. Die Proben wurden 6 min unter Lichtausschluss inkubiert und an-schließend bei 734 nm gemessen. Für die Standardkurve wurde Trolox in einem Konzentrationsbereichvon 62,5 – 2500 µmol/l eingesetzt.

45

Material und Methoden

3.7 Kultivierung und Aufreinigung von Rhodococcus erythropolisDSM 44543 unter aeroben Bedingungen

3.7.1 Herkunft und Lagerung des Rhodococcus erythropolis Stamms

Der Rhodococcus erythropolis-Stamm DSM 44534 wurde von der Deutschen Sammlung für Mikroorga-nismen (DSMZ, Braunschweig, Germany) bezogen. Die Zellen wurden in Mineralmedium mit 50 mMEthanol als C-Quelle bei 37 °C 4 Tage kultiviert und in 20 % Glycerol unter sterilen Bedingungen bei–23 °C gelagert. Um die Reinheit der Kultur zu kontrollieren, wurden diese auf Platten mit Hefeextraktals Nährmedium bei Raumtemperatur kultiviert.

3.7.2 Zusammensetzung der Wachstumsmedien

Zur Kultivierung der Zellen wurde ein Minimal-Salz-Medium und ein modifiziertes Minimal-Salz-Medium verwendet. Alle Medien wurden 20 min bei 120 °C autoklaviert und bei 4 °C gelagert. Vonden Spurenelementen und der Vitaminlösung wurde je 1 ml pro Liter Medium verwendet.

Zusammensetzung des Minimal-Salz-Mediums (MSM):

Substanz Einwaage [g/l]Na2SO4 2,0(NH4)2SO4 6,1NH4Cl 0,5KH2PO4 2,0Na2HPO4 4,5C6H8O7 x 2 NH3 0,77MgSO4 x 7 H2O 0,74Thiamin Hydrochlorid 0,10

Zusammensetzung des modifizierten Minimal-Salz-Mediums (mod. MSM):

Substanz Einwaage [g/l]Na2SO4 2,0(NH4)2SO4 6,1NH4Cl 0,5KH2PO4 2,0Na2HPO4 4,5Zitronensäure 0,77MgSO4 x 7 H2O 0,74Thiamin Hydrochlorid 0,10

Zusammensetzung der Spurenelemente, steril filtriert:

Substanz Einwaage [g/l]CaCl2 x 2 H2O 0,37ZnSO4 x 7 H2O 0,18MnCl2 0,07Natrium-EDTA Dihydrat 3,2FeCl3 x 6 H2O 1,7CuSO4 x 5 H2O 0,16CoCl2 x 6 H2O 0,18

3.7.3 Kultivierungsbedingungen für Rhodococcus erythropolis DMS 44534

Für die Vorkultur wurden 100 µl der in 20 % Glycerol gelagerten Zellen in 100 ml mod. MSM überführt,mit 50 mmol Ethanol und 100 µl Spurenelemente versetzt, mittels Wattestopfen verschlossen und bei

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Material und Methoden

37 °C und 160 rpm vier Tage im Schüttler kultiviert. Für die Hauptkultur wurde ein 2 l ErlenmeyerKolben mit Wattestopfen und 1 l mod. MSM verwendet. Es wurde eine entsprechende Menge anVorkultur in das mod. MSM überführt , um zu Beginn der Kultivierung eine optische Zelldichte bei620 nm (OD620nm) von 0,2 zu erhalten. Das Kultivierungsmedium wurde mit Quercetin-3-O-rutinosid(Rutin, in DMSO gelöst, Endkonzentration 100 µM, falls nicht anders beschrieben) versetzt und bei37 °C und 160 rpm inkubiert. Wenn nicht anders beschrieben, wurden die Zellen nach 5 Tagen geerntet,die optische Dichte bei 620 nm (OD620nm) bestimmt, die Zellen bei 10 °C und 5000 x g für 15 minabzentrifugiert und das Pellet dreimal mit 0,9 % Natriumchloridlösung gewaschen.

3.7.4 Aufschluss der Zellen

Für den Zellaufschluss wurden bei -20 °C gekühlte 0,1 mm Glasperlen verwendet. Die Zellen wurdenin 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 versetzt mit 1 mM DTT und 4 mM PMSF, aufgenommenund 5 x 1 min in der Kugelmühle mit 0,1 mm Glasperlen aufgeschlossen. Zwischen jedem Durchgangwurde eine Minute pausiert, damit die Zellsuspension sich nicht zu stark erwärmt. Die Kammer derKugelmühle wurde während des Aufschlusses von außen mit Eiswasser gekühlt. Der Rohextrakt wurdefür 30 min bei 10 °C und 6300 x g zentrifugiert.Die Proteinmenge vor und nach den einzelnen Aufreinigungsschritten wurde mittels Bradford-Methodebestimmt. Das Prinzip der Methode beruht auf der Zunahme des Absoptionsmaximums von 495 nmauf 595 nm, wenn Protein an Coumassie Brilliant Blue G 250 gebunden wird. Als Standard wurdeAlbumin Fraktion V verwendet. Die Stammlösung wurde für die Kalibrierkurve mit 40 mM Natri-umphosphat Puffer pH 7 frisch hergestellt. Die Kalibrierkurve lag im Bereich von 50 – 1000 µg/ml.Die Bradford-Stammlösung wurde vor jeder Messung 1:4 mit dest. Wasser verdünnt und ist bei 4 °Cmehrere Wochen haltbar. Für die Untersuchung wurden 20 µl Probe in 1 ml Bradfordlösung gegeben,5 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann bei 595 nm am UV/VIS-Photometer gemessen. Fürdie Referenz wurde Wasser anstatt der Probe verwendet.

Bradford Stammlösung:SubstanzCoumassie Blue G 10 mgMethanol 50 ml85 % Phosphorsäure 100 mlWasser 50 ml

3.7.5 Ammoniumsulfatfällung

Bei der Proteinfällung mit Ammoniumsulfat wird dem Protein die Hydrathülle „genommen“. DasProtein fällt aus der Lösung aus und präzipitiert. Für die Aufreinigung wurde eine 60 %-ige Fällungmit Ammoniumsulfat (0,37 g/ml Rohextrakt) bei 4 °C durchgeführt. Das Salz wurde in mehrerenPortionen über einen Zeitraum von 1 h hinzugegeben. Nach der Zugabe wurde die Probe noch 1 hgerührt. Das Präzipitat wird bei 10 °C 30 min bei 10414 x g abzentrifugiert und das Rohprotein in10 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 6 resolubilisiert.

3.7.6 Dialyse

Um die Probe nach der Fällung für die weitere Aufarbeitung vom Salz zu befreien, wurde das Dialysat24 h gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 6 (40-fache Menge des Dialysates) bei 4 °C dialysiert.Der Puffer wurde innerhalb der 24 h viermal gewechselt. Für die Dialyse wurde eine Visking 14000Membran (Fa. Roth) verwendet.

3.7.7 Isoelektronische Fokussierung (IEF)

Für die IEF wurde der dialysierte Proteinextrakt mit 1 ml Ampholyt 3/10 versetzt und mit 10 mMNatriumphosphatpuffer pH 6 auf 35 ml Gesamtvolumen aufgefüllt. Die Gesamtproteinmenge betrugzwischen 70 und 120 mg. Die Rotofor wurde mit der Proteinlösung beladen und mit einer konstanten

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Material und Methoden

Leistung von 12 Watt bei 4 °C betrieben. Aufgrund des elektrischen Feldes bildet sich ein pH-Gradientaus, durch den die Proteine zu ihrem isolelektrischen Punkt, an dem die Nettoladung gleich Null ist,wandern. Die IEF wurde beendet, wenn die Voltzahl 30 min konstant geblieben ist. Nach 3 bis 4 hwurden 20 Fraktionen geerntet, der pH-Wert bestimmt und die Aktivität der einzelnen Fraktionengetestet. Für den Aktivitätstest wurden die Fraktionen mittels 10 kDa Vivaspin vollständig aufkon-zentriert.

3.7.8 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE)

Bei der eindimensionalen Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE) wer-den die Proteine nach ihrem Molekulargewicht getrennt. Das Polyacrylamidgel besteht aus einemSammelgel gefolgt von einem Trenngel. Die SDS-PAGE wurde in einer Mini Protean 3 Apparaturdurchgeführt.Von Fraktion 3 bis 18 wurden je 40 µl Probe mit 40 µl Probenpuffer versetzt mit DTT (1 mmol pro250 µl), vermischt und mit Hilfe eines Vortex-Gerätes homogenisiert. Die Proben wurden im Wasser-bad für 5 min bei 85 °C erhitzt, um die Proteinwechselwirkungen zu unterbinden. Die Gele wurdenmit je 30 µl Probe beladen, 10 min bei 80 V und anschließend 40 min bei 200 V laufen gelassen. AlsReferenz diente der Prestained Broad Range Standard (1,5 µl) mit den Molekulargewichten von 17,27, 34, 48, 74, 114 und 201 kDa.

Pipettierschema zur Herstellung eines 8 x 10 x 0,1 cm Gels:

10 % Sammelgel (2 ml) Substanz Menge [ml]H2O 1,5330 % Acrylamid 0,334 x 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 0,6310 % APS 0,02510 % SDS 0,25TEMED 0,0025

10 % Trenngel (7,5 ml)H2O 3,1330 % Acrylamid 2,504 x 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 1,8810 % APS 0,07510 % SDS 0,10TEMED 0,0075

Zusammensetzung des Laufpuffers:

pH 8,3, 10-fach konzentriert Substanz Menge [g/l]Tris 30Glycin 144SDS 10

3.7.9 Silberfärbung

Die Silberfärbung ist im Vergleich zur Coomassie Färbung bis zu 100 mal sensibler und wurde füralle Gele der IEF-Fraktionen (siehe 4.6.2) verwendet. Die Coomassie Färbung konnte nicht verwendetwerden, da die Ampholyten die Färbung stören. Für die Silberfärbung wurde ein Roti®-Black P Sil-berfärbungskit für Proteine der Firma Roth verwendet.Das Gel wurde für 1 h bei Raumtemperatur fixiert und anschließend dreimal für 10 min mit einerWaschlösung gewaschen. Im nächsten Schritt wurde das Gel 1 min mit der Sensibilisierungslösungbehandelt und dreimal für 20 sek mit dest. Wasser gewaschen. Danach wurde das Gel 40 min indie Silberimprägnierlösung gegeben und anschließend zweimal für 20 sek mit dest. Wasser gewaschen.

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Material und Methoden

Zuletzt wurde das Gel mit der Entwicklungslösung behandelt und die Färbung des Gels mit der Stopp-lösung beendet.

Fixierungslösung (1 Gel): Substanz Menge [ml]Ethanol 20Essigsäure 12Formaldehyd (aus Gefäß D) 0,50dest. Wasser auf 100

Waschlösung (1 Gel): Substanz Menge [ml]Ethanol 45dest. Wasser 255

Sensibilisierungslösung (1 Gel): Substanz Menge [ml]Substanz A in dest. Wasser gelöst 1dest. Wasser auf 100

Silberimprägnierlösung (1 Gel): Substanz Menge [ml]Substanz B in dest. Wasser gelöst 1Formaldehyd (aus Gefäß D) 0,075dest. Wasser auf 100

Entwicklungslösung (1 Gel): Substanz Menge [ml]Natriumcarbonatlösung (E) 20dest. Wasser, gut durchmischen 60Reaktionsgefäß C mit 20 µlaus A in dest. Wasser gelöst 0,45Formaldehyd (aus Gefäß D) 0,075dest. Wasser auf 100

Stopplösung (1 Gel): Substanz Menge [ml]Ethanol 45Essigsäure 36dest. Wasser auf 300

3.7.10 Aktivitätstest der IEF-Proben

Aktivitätstest für die ganzen Zellen:Für den Aktivitätstest wurden 5 mg/ml Zellen in 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 mit Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin, in DMSO gelöst, Endkonzentration 100 µM) versetzt und für 6 h bei 37 °C und160 rpm im Inkubationsschüttler inkubiert. Zu Beginn des Versuchs und alle 2 h wurden 200 µl Pro-be für die HPLC-Messung entnommen und vor der Analyse 10 min bei 10 °C und 6300 x g zentrifugiert.

Aktivitätstest für die aufgeschlossenen Zellen:Für den Aktivitätstest wurden 5 mg/ml Protein in 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 mit Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin, in DMSO gelöst, Endkonzentration 100 µM) versetzt und für 4 h bei 37 °C und160 rpm im Inkubationsschüttler inkubiert. Zu Beginn des Versuches und alle 2 h wurden 200 µl Pro-be für die HPLC-Messung entnommen und vor der Analyse 10 min bei 10 °C und 6300 x g zentrifugiert.

Aktivitätstest für die IEF-Proben:Die auf konzentrierten Proben wurden in 400 µl 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6 resolubilisiertund mit 100 µl Quercetin-3-O-rutinosid-Lösung (Rutin, in DMSO gelöst, Endkonzentration 100µM)versetzt. Die Proben wurden 2 h bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Vor der Messung wurden alleProben 5 min bei 10 °C und 6300 x g zentrifugiert. Zu Beginn des Versuches wurden 200 µl Probe fürdie HPLC-Messung entnommen.

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Material und Methoden

3.7.11 RP-HPLC-Methode zur Analyse der Umsetzung von Quercetin-3-O-rutinosid(Rutin) während des Aktivitätstests

Der Konzentrationsverlauf von Quercetin und Rutin während des Aktivitätstests wurden mittelsHPLC-Analytik quantifiziert. Als externer Standard wurde Rutin verwendet.

Laufmittelsystem und Chromatographiebedingungen:Laufmittel A: bidest. Wasser / Ameisensäure (99/1, v/v)Laufmittel B: Acetonitril / Ameisensäure (99/1, v/v)Flussrate: 1 ml/minSäulentemperatur: 30 °CInjektionsvolumen: 20 µlSäule: VDSphere C18-E, 5 µm, 250 x 4,6 mm (Fa. VDS Optilab)Vorsäule RP-18, 4 x 3,0 mm (Fa. Phenomenex)Wellenlänge: 370 nm

Tabelle 8: Gradientenprogramm für die Analyse von Rutin und Quercetin aus dem Aktivitätstest

T [min] FMA [%] FMB [%]0 80 205 80 2030 0 10040 80 20

3.8 Kultivierung von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 auf ver-schiedenen C-Quellen und Analyse der entstehenden Mykolsäu-ren

3.8.1 Kultivierungsbedingungen für Rhodococcus erythropolisFür die Vorkultur wurden 200 µl der in 20 % Glycerol gelagerten Zellen in einem 250 ml Kolben mitWattestopfen und 100 ml mod. Mineral-Salz-Medium überführt und vier Tage bei 37 °C und 160 rpmkultiviert. Als weitere C-Quelle wurde 50 mM Ethanol verwendet.Der Versuch wurde in 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml Minimal-Salz-Medium und 10 % Vorkul-tur (OD620nm 0,2) durchgeführt. Als C-Quellen wurden Zitronensäure und Quercetin-3-O-rutinosid(Rutin) eingesetzt. Der Versuchsaufbau ist in Tab. 9 beschrieben. Die Kolben wurden 7 Tage bei160 rpm und 37 °C im horizontalen Schüttler kultiviert. Die Zellen wurden in ihrer stationären Phasegeerntet, für 15 min bei 3535 x g und 10 °C abzentrifugiert und dreimal bei 10414 x g mit einer0,9 %-igen NaCl-Lösung gewaschen. Anschließend wurden die Zellen über Nacht lyophilisiert und bei-20 °C gelagert.

Tabelle 9: Zusammensetzung der Medien für die vier Kultivierungsansätze und die eingesetzten Konzen-trationen der unterschiedlichen C-Quellen in den verschiedenen Ansätzen.

Ansatz Medium C-QuelleMSM Con1 Mineral-Salz-Medium, Spurenelemente Zitronensäure (4 mM)MSM Con2 Mineral-Salz-Medium, Spurenelemente Ohne C-QuelleMSM CR Mineral-Salz-Medium, Spurenelemente Zitronensäure (4 mM) und Rutin (1 mM)MSM R Mineral-Salz-Medium, Spurenelemente Rutin (1 mM)

50

Material und Methoden

3.8.2 Probenvorbereitung

Die Vorbereitung der Mykolsäureproben wurde wie bei Hsu et al. [2011] beschrieben durchgeführt.Das lyophlisierte Pellet wurde mit 4 µl Nonansäure (6,3 mM) als interner Standard versetzt und in4 ml 10 % KOH für eine Stunde im Wasserbad bei 80 °C hydrolysiert. Die Lösung wurde mittels 6 NHCl auf pH 2 eingestellt, dreimal mit 1 ml n-Hexan extrahiert und die organische Phase im N2-Stromentfernt. Der Rohextrakt wurde für die Festphasenextraktion in 300 µl CHCl3 / MeOH (2/1, v/v)gelöst und 10 min im Ultraschallbad behandelt. Die Kartuschen für die Festphasenextraktion wurdenmit 3 ml EtOAc / n-Hexan (15/85, v/v) konditioniert und anschließend mit der Probe beladen. DiePhase wurde mit 2 ml EtOAc / n-Hexan (15/85, v/v) gewaschen und die Mykolsäure mit 1,5 mlDiisopropylether / HOAc (98/2, v/v) eluiert. Das Eluat wurde im N2-Strom getrocknet und für dieESI-MS/MS in 1 ml CHCl3 / MeOH / NH3 (70/30/2, v/v/v) + 0,14 % Ammoniumacetat angelöstund mit ACN auf die gewünschte Konzentration verdünnt.

3.8.3 ESI-MS/MS-Methode zur Bestimmung der Mykolsäure Zusammensetzung

Zur Identifizierung der Mykolsäuren wurde eine Elektrospray-Massenspektrometrie-Methode (ESI-MS/MS) etabliert und durchgeführt. Das ESI-Massenspektrum wurde mittels AB Sciex Q Trap 5500im ESI (-) ([M−H]−) Modus aufgenommen. Stickstoff wurde als Dry Gas und Nebulizier Gas verwen-det. Als Laufmittel für die Analyse wurde CHCl3 / MeOH / NH3 (70/30/2, v/v/v) + 0,14 % Am-moniumacetat verwendet. Die Mykolsäureproben wurden kontinuierlich in die ESI-Quelle (5µl/2 min)injiziert bei einem Fluss von 0,2 ml/min Der Massenscanbereich wurde auf 450 – 750 m/z eingestellt,die Ionisierungsenergie lag bei 4500 V und die Quellentemperatur bei 400 °C.

3.8.4 Ziehl-Neelsen-Färbung

Um Aussagen über den Einfluss der C-Quellen auf die Permeabilität der Zellen treffen zu können,wurden 250 µl Zellen in Medium aus jedem Ansatz auf einen Objektträger gegeben und mittels Bun-senbrenner mit rußender Flamme fixiert. Die Zellen wurden mit einer heißen Fuchsinlösung für 30 minbedeckt und dann mit dest. Wasser gewaschen. Dann wurden die Zellen mit einer ethanolischen Salz-säurelösung (0,4 % in 70 % Ethanol) 100 sek gebleicht bis keine rote Farbe mehr vom Objektträgergespült wurde. Die Zellen wurden ein weiteres Mal mit dest. Wasser gewaschen, dann 5 min in eineMethylenblaulösung getaucht und nochmals mit dest. Wasser gewaschen. Vor dem Mikroskopierenwurden die Träger an der Luft getrocknet.

Zusammensetzung Fuchsinlösung:Substanz2,0 g basisches Fuchsin in 25 ml Ethanol absolut12,5 g Phenol250 ml dest. Wasser

Zusammensetzung Methylenblaulösung:Substanz140 mg Methylenblau100 ml dest. Wasser

51

4

Ergebnisse und Diskussion

Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Analyse von Abbaumechanismen und Metaboliten derFlavonoide durch anaerobe und aerobe Mikroorganismen. Die Arbeit besteht aus den drei folgendenArbeitspaketen:

(4.1) der Etablierung, Validierung und Durchführung einer geeigneten Analysemethode zur Untersu-chung ausgewählter Flavonoide auf deren physikochemisches Verhalten sowie deren enzymatischeund mikrobielle in vitro Umsetzung

(4.2) der rein enzymatischen und enzymatisch-mikrobiellen Umsetzung der Anthocyane und des Ru-tins unter anaeroben Bedingungen im in vitro Verdauungsmodell als Reinsubstanzen und inverschieden komplexen Nahrungsmittelmatrices sowie der Verlauf der Komplexierung, der Poly-merisierung und des antioxidativen Potentials der Flavonoide in den verschiedenen Segmentendes Verdauungsmodells

(4.3) die Umsetzung von Rutin unter aeroben Bedingungen durch Rhodococcus erythropolis DSM 44534und der Einfluss verschiedener C-Quellen auf den Aufbau der Zellhülle in der Wachstumsphasevon R. erythropolis

4.1 Etablierung und Validierung eines HPLC-Systems zur Antho-cyan Analyse

Die Analyse der Anthocyane und ihrer Abbauprodukte während der enzymatischen und mikrobiel-len Umsetzung im simulierten in vitro Verdauungsmodel erfolgte unter Verwendung eines LC-20AHPLC-Systems der Firma Shimadzu mit einer RP-Säule Luna (2) C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) derFirma Phenomenex. Für die Gradientenmethode wurden Wasser/H3PO4 (85 %) (99,9/0,1, v/v) undMeOH/Wasser/H3PO4 (85 %) (50/49,9 /0,1, v/v) als Laufmittel verwendet. Die Methode sorgte füreine optimale Auflösung und Trennung der relevanten Analyten. Um sicherzustellen, dass die etablierteMethode für die Analyse der Anthocyane und deren Abbauprodukte geeignet ist wurden folgende Va-lidierungselemente überprüft: Selektivität, Linearität, Wiederfindung, Methodenpräzision, Stabilität,Robustheit, Arbeitsbereich, Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze.

Die Selektivität sagt etwas über die Fähigkeit einer Methode aus, eine Substanz eindeutig zu identifi-zieren und von anderen Komponenten abzutrennen. Eine Methode ist selektiv wenn sie die zu bestim-menden Analyten ohne gegenseitige Störung oder Störpeaks aus der Matrix erfasst. Die Linearitäteiner Methode ist gegeben, wenn die Methode im vorgegebenen Konzentrationsbereich linear verläuft.Dazu muss das Messsignal direkt proportional zur Konzentration des Analyten in der Probe sein. DieLinearität wurde in Abschnitt 4.1.3 Anhand des Anpassungstest nach Mandel überprüft (siehe Ab-schnitt 3.3.5, Formel 1 und 2). Der Matrixeffekt ist die Summe aller Störkomponenten in der Matrix,welche die Analyse der Zielsubstanzen beeinflussen und das Ergebnis verfälschen. Für die Bestimmungdes Matrixeffektes wird der Quotient aus der Steigung des Standards in Fließmittel und Matrix gebil-det (siehe Abschnitt 3.3.5, Formel 3). Ergibt der Quotient einen Wert von eins stimmen die Steigungen

Ergebnisse und Diskussion

überein, ist der Wert kleiner eins liegt eine Signalsupression vor und ist der Wert größer eins wird dasSignal verstärkt. Anhand der Wiederfindung wird überprüft, ob die Probenvorbereitung umfassend istoder ein Teil des Analyten nicht analysiert wurde. Zur Überprüfung der Wiederfindung wurden Leer-proben des Duodenalsaftes mit Standard auf dotiert, der entstehende Protein-Anthocyan-Komplexseparat aufgearbeitet und der Überstand sowie der resolubilisierte Protein-Anthocyan-Komplex ge-trennt voneinander analysiert. Die Anthocyankonzentration im Überstand des Duodenalsaftes undder resolubilisierte Anteil an Anthocyan wurde über die Geradengleichung berechnet und die Antho-cyankonzentrationen aus beiden Proben anschließend addiert. Die Überprüfung der Vollständigkeitder Extraktion erfolgte durch die Berechnung der Wiederfindung (Abschnitt 3.3.6, Formel 4 - 6).Sie gibt Aufschluss darüber, wie viel des Analyten während der Aufarbeitung abgetrennt und analy-tisch nicht erfasst wurde. Ein Level gilt als valide wenn die durchschnittliche Wiederfindung zwischen70 % und 110 % liegt Im weiteren Verlauf der Arbeit wird für den Protein-Anthocyan-Komplex bzw.den Protein-Flavonoid-Komplex der Begriff Präzipitat verwendet. Der Begriff Verdauungssaft ist indiesem Zusammenhang ein Synonym für die Konzentration der Flavnoide im Überstand des Verdau-ungssaftes des jeweiligen Darmsegmentes. Die Methodenpräzision gibt Auskunft über die Präzisionder Probenvorbereitung und Analysemethode unter Wiederholbedingungen. Ein VK-Wert von 10 %liegt im akzeptablen Bereich. Bei der Stabilität wird überprüft, ob eine Abhängigkeit der Ergebnis-se von der Zeit vorliegt. Dazu wurden die Proben über einen Zeitraum von mehreren Tagen immerwieder analysiert. Für die Untersuchung der Robustheit wird die Beeinflussung der Analyseergebnissedurch Änderung der Analysebedingungen wie z.B. Säulentemperatur und pH-Bereich untersucht. DerArbeitsbereich gibt den Konzentrationsbereich in der Probe an, bei dem ein akzeptables Maß an Präzi-sion, Richtigkeit und Linearität vorliegt. Die Nachweisgrenze gibt die kleinste Analytenkonzentrationin der Probe an, die noch qualitativ erfasst werden kann. Die Bestimmungsgrenze gibt die kleinsteAnalytenkonzentration an, die mit der gegebenen Richtigkeit und Präzision quantitativ bestimmt wer-den kann. Die Probenvorbereitung für die Validierung sowie alle verwendeten Formeln finden sich imMethodenteil in Abschnitt 3.3.

4.1.1 Probenvorbereitung

Die Ergebnisse für die Anthocyankonzentrationen zeigen, dass bei pH < 3 die Anthocyane im schwar-zen Johannisbeersaft in der höchsten Konzentration vorliegen (Abb. 11). Es konnte kein signifikanterUnterschied für die Proben bei pH 1,5 und 2,9 gefunden werden.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 11: Anthocyankonzentration im Johannisbeersaft bei verschiedenen pH-Werten mittels HPLC.Der Saft wurde vor der HPLC-Messung mittels HCl bzw. NaOH auf pH 1,5 bzw. 6,8 eingestellt. Der natürliche pH-Wertdes Saftes liegt bei pH 2,9. (n = 3)

4.1.2 Selektivität

Um die Selektivität der Methode zu bestimmen wurden Leerproben der künstlichen Verdauungssäfteanalog zur Probe aufgearbeitet und mit der Anthocyanmethode mittels HPLC gemessen, um sicher-zustellen, dass keine Störpeaks in den Matrices enthalten sind, die mit den Zielanalyten koeluieren.Die Analyse der Leerproben von Magen- und Darmsaft zeigen bei den Retentionszeiten (RT) derAnthocyane und ihrer Abbauprodukte keine störenden Peaks (Abb. 12, 13, 14).

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 12: HPLC-Chromatogramme des Magensaftes (schwarz), Darmsaftes (rosa) ohne Analytenund einer Probe mit Delphinidin-3-O-glucosid (Del-3-O-glc), Cyanidin-3-O-glucosid (Cy-3-O-glc) undCyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut) (blau) bei 520 nm. Die Blankproben wurden vor der Messung genausoaufgearbeitet wie die Proben aus dem Verdauungsmodell.

Abbildung 13: HPLC-Chromatogramme des Magensaftes (schwarz), Darmsaftes (rosa) ohne Analytenund einer Probe mit 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure (Gallussäure) und 3,4-Dihydroxybenzoesäure (Proto-catechusäure) (blau) bei 280 nm. Die Blankproben wurden vor der Messung genauso aufgearbeitet wie die Probenaus dem Verdauungsmodell.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 14: HPLC-Chromatogramme des Magensaftes (schwarz), Darmsaftes (rosa) ohne Analytenund einer Probe mit 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd (Phloroglucinolaldehyd) (blau) bei 280 nm. Die Blank-proben wurden vor der Messung genauso aufgearbeitet wie die Proben aus dem Verdauungsmodell.

4.1.3 Kalibrierung (Laufmittel vs. Verdauungssäfte), Linearität und Matrixeffekt

Um den Matrixeffekt und die Linearität der Kalibrierkurve zu überprüfen, wurden aus den verschie-denen Anthocyan Stammlösungen je 5 Verdünnungsreihen mit Laufmittel und Magensaft hergestelltund an 5 verschiedenen Tagen gemessen. Die Mittelwerte der Peakflächen finden sich am Beispiel vonCyanidin-3-O-glucosid (Cy-3-O-glc) in Tabelle 10. Im Anhang finden sich die restlichen Tabellen derKalibriergeraden und die Abbildungen der Kalibriergeraden der Abbauprodukte.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 15: Vergleich der Steigung der Kalibrierkurven für den Standard Cyanidin-3-O-glucosid (Cy-3-O-glc), der im HPLC-Laufmittel (LM) bzw. der Magensaftmatrix angesetzt wurde. Um den Einflussdes Magensaftes und dessen Enzym Pepsin im Vergleich zum Laufmittel (LM) der HPLC-Methode, auf Cyanidin-3-O-glucosid zu untersuchen, wurden je fünf Kalibrierkurven mit fünf verschiedenen Cyanidin-3-O-glucosidkonzentration anfünf unterschiedlichen Tagen gemessen. (n = 5)

Tabelle 10: Mittelwert der Peakflächen für die Kalibrierkurven von Cyanidin-3-O-glucosid (Cy-3-O-glc) inFließmittel und Matrix. Das Cyanidin-3-O-glucosid wurde für die Messungen in Laufmittel bzw. Magensaft verdünnt.Aus den beiden Mittelwerten der Peakflächen wurden die Peakflächenverhältnisse berechnet. (n = 5)

Konzentration Peakfläche Peakfläche Peakflächenverhältnis[mg/l] Cy-3-O-glc in LM Cy-3-O-glc in Matrix100 7381987,4 7280660,8 0,9850 3636865,6 3478486,0 0,9510 693272,8 624213,2 0,905 297793,0 335671,3 1,121 66435,0 57931,4 0,87

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 16: Vergleich der Steigung der Kalibrierkurven für den Standard Delphinidin-3-O-glucosid(Del-3-O-glc), der im HPLC-Laufmittel (LM) und der Magensaftmatrix angesetzt wurde. Um den Einflussdes Magensaftes und dessen Enzym Pepsin im Vergleich zum Laufmittel (LM) der HPLC-Methode, auf Delphinidin-3-O-glucosid zu untersuchen, wurden je fünf Kalibrierkurven mit fünf verschiedenen Delphinidin-3-O-glucosidkonzentrationan fünf unterschiedlichen Tagen gemessen. (n = 5)

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 17: Vergleich der Steigung der Kalibrierkurven für den Standard Cyanidin-3-O-rutinosid(Cy-3-O-rut), der im HPLC-Laufmittel (LM) und der Magensaftmatrix angesetzt wurde. Um den Einflussdes Magensaftes und dessen Enzym Pepsin im Vergleich zum Laufmittel (LM) der HPLC-Methode, auf Cyanidin-3-O-rutinosid zu untersuchen, wurden je fünf Kalibrierkurven mit fünf verschiedenen Cyanidin-3-O-rutinosidkonzentrationan fünf unterschiedlichen Tagen gemessen. (n = 5)

Anhand der Ergebnisse aus der Versuchsreihe (Abb. 15 - 17) konnte belegt werden, dass der Konzen-trationsbereich von 1 - 100 mg/l im linearen Bereich liegt. Die Prüfwerte (PW-Werte) für die einzelnenKalibriergeraden ergaben einen Wert, der kleiner war als die Vergleichswerte aus der F-Tabelle, wasdie Linearität auch rechnerisch bestätigte (Tab. 28, Anhang). Der Quotient der Steigung für jede Ka-libriergerade ergab einen Wert von nahe eins (Tab. 28, Anhang), damit konnte ein Matrixeffekt imMagensaft ausgeschlossen werden. Tabelle 10 zeigt den Mittelwert der Peakflächen für die Kalibrier-kurven des Cyanidin-3-O-glucosid.

4.1.4 Resolubilisierung und Wiederfindung der Anthocyane aus dem Präzipitat

Die Ausbildung von Anthocyan-Protein-Komplexen stellte einen wesentlichen Störfaktor bei der Analy-se der Anthocyane im simulierten in vitro Verdauungsmodell dar. Bei den Umsetzungen im simuliertenVerdauungstrakt kam es vermehrt zu lilafarbenen Niederschlag bei den Proben im Darmsaft, welcherim weiteren Verlauf der Arbeit als Präzipitat bezeichnet wird. Im Zuge der Probenvorbereitung bildetesich aufgrund des niedrigen pH-Wertes ebenfalls ein Präzipitat aus. Ein vollständiges suspendieren desPräzipitats war nur durch Einsatz von organischem Lösungsmittel erfolgreich. Versuche zur basischen,sauren und enzymatischen Hydrolyse scheiterten. Tabelle 11 zeigt die erwarteten (durch Messung be-stimmt) und tatsächlich gefundenen Konzentrationen der Standards nach der Resolubilisierung ausdem Präzipitat.

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Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 11: Analyse der Richtigkeit für Resolubilisierung und Wiederfindung der Anthocyane aus demPräzipitat. Für die Untersuchung der Resolubilisierung des Präzipitates wurden Blankproben des Duoldensaftes mitAnthocyanstandard versetzt und die Probe anschließend mit 85 % Phosphorsäure auf pH 2 - 3 eingestellt. Für die Be-stimmung der Konzentration des Sollwertes wurden die Standards parallel zu den Proben in Laufmittel statt Duoldensaftangesetzt und analysiert. Das Präzipitat wurde mittels Zentrifuge abgetrennt und wie im Methodenteil beschrieben (Ab-schnitt 3.5.3) aufgearbeitet. Für die Quantifizierung wurde die Laufmittelkalibrierung (4.1.3) verwendet. Aufgrund derermittelten Werte wurden die Wiederfindung und der VK bestimmt. Die Werte für die Wiederfindungen lag bei allendrei Anthocyanen > 90 %. (n = 5); SD = Standardabweichung, VK = Variationskoeffizient

Del-3-O-glc Cy-3-O-glc Cy-3-O-rutIstwert + SD 11,7 ± 0,9 9,79 ± 0,45 14,9 ± 0,78Sollwert 12,6 10,3 15,7V KnachHorwitz 30,6 32,1 30,1V Kberechnet 5,3 4,0 5,6Wiederfindung [%] 93,0 95,0 95,0

Anhand der Daten aus der Versuchsreihe konnte abgesichert werden, dass die Resolubilisierungsme-thode reproduzierbare Werte lieferte und die Anthocyane fast vollständig wieder in Lösung gebrachtwurden. Die Werte für die Wiederfindung entsprechen den angegebenen Kriterien und auch die Va-riationskoeffizienten sind nach Horwitz sehr gut. Die Daten zu den Resolubilisierungstests finden sichim Anhang. Die gemessenen Intensitäten stimmen mit den Werten aus der Matrixkalibrierung für denBereich von 0 %, 80 % und 120 % überein.

4.1.5 Nachweis- und Bestimmungsgrenze

Die Nachweis- und Bestimmungsgrenze wurde aus den Daten der Matrixkalibrierung mittels Kali-briermethode berechnet. Die Tabelle 12 zeigt die ermittelten Werte für die Nachweisgrenze und dieBestimmungsgrenze. Die Konzentrationen der Bestimmungsgrenzen sind dreimal höher als die Nach-weisgrenzen.

Tabelle 12: Nachweis-, Bestimmungs- und Erfassungsgrenze der Anthocyanstandards im Magensaft. DieWerte wurden aus den Kalibrierkurven in Magensaft mittels Kalibriermethode bestimmt. (n = 5)

Anthocyan Bestimmungsgrenze Erfassungsgrenze NachweisgrenzeDel-3-O-glc 1,5 mg/l 0,9 mg/l 0,4 mg/lCy-3-O-glc 4,9 mg/l 3,1 mg/l 1,5 mg/lCy-3-O-rut 1,9 mg/l 1,1 mg/l 0,6 mg/l

4.1.6 Methodenpräzision

Tabelle 13: Analyseergebnisse der Methodenpräzisionsmessung für Delphinidin-3-O-glucosid (Del-3-O-glc), Cyanidin-3-O-glucosid (Cy-3-O-glc) und Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut). Für die Methoden-präzisionsmessung wurde das Probenmaterial sechsmal aufgearbeitet und hintereinander vermessen. (n = 6); MW =Mittelwert, SD = Standardabweichung, VK = Variationskoeffizient

Probe Del-3-O-glc [mg/l] Cy-3-O-glc [mg/l] Cy-3-O-rut [mg/l]1 1,2 4,5 3,32 1,3 4,8 3,63 1,3 5,1 3,94 1,2 4,8 3,85 1,3 4,8 3,86 1,3 4,8 3,7MW 1,3 4,8 3,7SD 0,1 0,2 0,2VK [%] 3,7 3,9 5,6

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Ergebnisse und Diskussion

Die Analyseergebnisse wurden in Tabelle 13 von Delphinidin-3-O-glucosid, Cyanidin-3-O-glucosidund Cyanidin-3-O-rutinosid von zwei Proben unterschiedlicher Konzentrationen angegeben, die je-weils sechsmal aufgearbeitet und vermessen wurden, um die Methodenpräzision zu ermitteln. Für dasDelphinidin-3-O-glucosid lag die relative Abweichung der Messwerte vom Mittelwert bei einer Kon-zentration von 1,3 mg/l mit einem VK bei 3,8 %. Bei Cyanidin-3-O-glucosid mit 4,8 mg/l lag der VKbei 3,9 % und bei Cyanidin-3-O-rutinosid mit 3,7 mg/l bei einem VK von 5,6 %. Alle Werte für dieVariationskoeffizienten liegen unterhalb von 10 %.

4.1.7 Arbeitsbereich

Unter Berücksichtigung der ermittelten Linearitäts-, Präzisions-, und Richtigkeitsparameter ergab sichfür die Analyse der Anthocyane und ihrer Abbauprodukte ein Arbeitsbereich von 1 mg/l – 100 mg/l.

4.1.8 Stabilität

Die Stabilität der Anthocyane im Magensaft wurde mit den Proben aus der Validierung bestimmt.Die Proben wurden innerhalb der ersten 5 Tage täglich und einmalig nach 20 Tagen gemessen undzwischen den Messungen bei -20 °C im Tiefkühler gelagert, da die Anthocyane bei Raumtemperaturund 4 °C nicht stabil sind.Von den Anthocyanen ist auch bekannt, dass sie nicht Licht- und Luftstabil sind, daher werden dieStandards und Proben in Braunglasflaschen gelagert. Die Ergebnisse in Tabelle 14 zeigen, dass dieStabilität der Anthocyane konzentrationsabhängig ist. Bei geringen Konzentrationen ist der Varia-tionskoeffizient größer als bei der jeweils höheren Konzentration (ausgenommen Cy-3-O-glc). Ohnedie Werte für die 20 Tage Messung lagen alle Variationskoeffizienten von C2 in einem deutlich klei-neren Bereich. Die Stabilität der Proben wurde durch Ansäuern auf einen pH-Wert 2 - 3 ebenfallserhöht. Über einen kurzen Zeitraum (Tab. 14) waren die Standards unter Lichtausschluss bei niedri-gem pH-Wert und -20 °C stabil. Nach 20 Tagen nahm bei allen Proben die Konzentration deutlichab.

Tabelle 14: Ergebnisse des Stabilitätstest von Delphinidin-3-O-glucosid (Del-3-O-glc), Cyanidin-3-O-glucosid (Cy-3-O-glc) und Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut) über 5 Tage und nach 20 Tagen. ZurErmittlung der Stabilität von Delphinidin-3-O-glucosid, Cyanidin-3-O-glucosid und Cyanidin-3-O-rutinosid in Magen-saft wurden je zwei Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen (mg/l) verwendet, die bei -20 °C über 20 Tage gelagertwurden. Die Proben wurden über den Zeitraum von 5 Tagen täglich analysiert und nach 20 Tagen nochmals analysiert.MW = Mittelwert, SD = Standardabweichung, VK = Variationskoeffizient, n.d. = nicht detektiert

Del-3-O-glc Del-3-O-glc Cy-3-O-glc Cy-3-O-glc Cy-3-O-rut Cy-3-O-rutTag C1 [mg/l] C2 [mg/l] C1 [mg/l] C2 [mg/l] C1 [mg/l] C2 [mg/l]1 1,7 47,3 1,8 49,0 1,5 51,92 1,6 43,3 1,7 46,8 1,3 53,23 1,6 44,6 1,7 48,1 1,3 53,94 1,4 48,5 1,7 49,5 1,3 50,25 1,4 46,4 1,7 49,3 1,1 51,220 n.d. 38,7 n.d. 36,9 n.d. 45,5MW 1,6 44,8 1,7 46,7 1,3 51,0SD 0,1 3,5 0,1 4,9 0,2 3,0VK [%] 8,2 7,8 5,1 10,4 12,2 5,9

4.1.9 Robustheit

Die Anthocyane sind empfindlich gegen Luftsauerstoff und Licht. Im neutralen und alkalischen Milieulagern sich die Anthocyane in ihre instabilere Form, die chinoide Anhydrobase, um. Selbst bei –20 °Cim Tiefkühler wurden die Standardlösungen der Anthocyane mit der Zeit abgebaut (Tab. 14). Um denphysikochemischen Abbau der Anthocyane durch Umlagerung während der Lagerung und der Analysezu unterbinden, wurden die Standardlösungen und das Laufmittel auf einen pH 2,0 eingestellt. Die

61

Ergebnisse und Diskussion

Robustheit war nur gegeben, sofern die Parameter der Probenvorbereitung (niedriger pH-Wert, Licht-ausschluss, zeitnahe Aufarbeitung und Lagerung im Tiefkühler) und HPLC-Methode nicht variiertwurden.

4.1.10 Diskussion Validierung

Im Rahmen der Arbeit wurde eine reproduzierbare und präzise HPLC-Methode zur Analyse vonAnthocyanen und ihren Abbauprodukten im simulierten in vitro Verdauungsmodell etabliert. Die An-thocyane und ihre bekannten Abbauprodukte zeigen im Magensaft keinen Matrixeffekt, was mittelsKalibrierfunktion und dem Anpassungstest nach Mandel anhand der Linearität überprüft wurde. Fürdie Abbauprodukte 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd (Phloroglucinolaldehyd), 3,4-Dihydroxybenzoesäure(Protocatechusäure) und 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure (Gallussäure) wurde auch kein Matrixeffekt imDarmsaft gefunden. Die beim Ansäuern der Darmsaftproben präzipitierten Anthocyane ließen sich mitder etablierten Resolubilisierungs-Methode fast vollständig wieder in Lösung bringen. Die Werte fürdie Wiederfindung der Analyten und die Ermittlung ihrer Variationskoeffizienten lagen im validen Be-reich. Die Reproduzierbarkeit dieser Methode spiegelt sich auch in den Ergebnissen der enzymatischenUmsetzung der Aglykone (Tab. 15 und 16) wider. Dieser Umstand ermöglichte es, die Probenvorberei-tung so einfach wie möglich zu halten. Aufwendige Probenvorbereitungen haben den Nachteil, dass dieAnthocyane durch thermische und pH-bedingte Einflüsse abgebaut werden können oder stärker überWasserstoffbrückenbindungen, komplexe Bindungen oder kovalente Bindungen an Proteine binden.Dieser Umstand führte in früheren Untersuchungen oft zu schlechten Wiederfindungsraten der An-thocyane [Murkovic et al., 2000]. Die Analyse der präzipitierten Anthocyane ist also eine notwendigeMaßnahme, um exakte Aussagen über deren Abbau treffen zu können. Eine kurze Probenvorberei-tung unterbindet zudem weitere thermische und pH-bedingte Zerfallsprozesse der Glykoside und vorallem der instabileren Aglykone. Darüber hinaus besteht die Gefahr, dass bei einer aufwendigen Pro-benvorbereitung bisher unbekannte Metaboliten abgetrennt und analytisch nicht erfasst werden oderzerfallen bzw. abgebaut werden. Die hier verwendete Methode weist die für die Analyse der komplexenMatrices nötige Selektivität auf und die Kalibriergerade liegt im linearen Bereich.Die Anthocyane wurden im simulierten in vitro Verdauungsmodell einer Veränderung des pH-Wertesunterworfen. Im Magensegment liegt ein pH-Wert von ca. 3 vor, während im Darm ein pH-Wert von7 vorliegt. Die Struktur und das Absorptionsspektrum sowie die Stabilität der Anthocyane sind ver-gleichsweise stark vom pH-Wert abhängig [Lapidot et al., 1999]. Bei pH 7 liegen die Anthocyane ineiner labilen Form vor, während sie im sauren als stabiles Flavyliumkation vorliegen (Abb. 2). DieErgebnisse für die Probenvorbereitung zeigen, dass die Proben vor der Messung auf einen pH-Wertunter 3 eingestellt werden müssen, damit die Anthocyane in ihrer stabilsten Form vorliegt und einumfassend analysiert werden können (Abb.11).

4.2 Analyse der Flavonoide und deren Metabolite während der an-aeroben Umsetzung im simulierten in vitro Verdauungsmodellunter enzymatischen und enzymatisch-mikrobiellen Bedingun-gen

4.2.1 Analyse des schwarzen Johannisbeersaftes

Für die Umsetzung von Polyphenolen aus kommerziell erhältlichen Lebensmitteln wurde schwarzerJohannisbeersaft der Firma Liven GmbH (Dabendorf, Deutschland) ausgewählt, da Johannisbeersafteinen hohen Anteil an Polyphenolen, vor allem Anthocyanen, aufweist. Die Gesamtkonzentration anAnthocyanen des verwendeten schwarzen Johannisbeersaftes betrug 903,89 mg/l (SD +/- 35,1 VK13). Davon waren 16 % Myrtillin, 38 % Tulipanin, 10 % Kuromanin und 36 % Keracyanin. Es wurdeein Gesamtphenolgehalt von 1668,8 mg/l (SD +/- 69,0, VK 4) Catechinequivalenten ermittelt. Dieantioxidative Kapazität lag bei 31,5 mol/l (SD +/- 0,0, VK 1) Troloxequivalent.

62

Ergebnisse und Diskussion

4.2.2 Analyse der Anthocyane und deren Metabolite - Analytik von potentiellenReaktionsprodukten beim Abbau der Aglykone in Gegenwart von Enzymenunter anaeroben Bedingungen

Auf Grund der Komplexität der Matrices des schwarzen Johannisbeersaftes und des Gärgetränks aufder Basis von vergorener Bierwürze war eine Aufklärung der ablaufenden Reaktionen und der gebilde-ten Abbauprodukte der Anthocyane erschwert. Aus diesem Grund wurden die Anthocyane Cyanidin-3-O-rutinosid (Keracyanin), Cyanidin und Delphinidin als exemplarisches Beispiel ausgewählt. Cyanidinund Delphinidin sind die Aglykone der im Johannisbeersaft enthaltenen Anthocyane, welche durch dieAbspaltung des Glykosids bzw. Rutinosids gebildet werden. Die ausgewählten Anthocyane wurden ineinem wässrigen Medium gelöst und im in vitro Verdauungsmodell untersucht, um eine Übersicht überderen potentiellen Abbauprodukte zu erhalten.

4.2.2.1 Analytik der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin im in vitro Verdauungs-modell

Abbildung 18: HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin im Magensegment(pH 1,5, Pepsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 520 nm. Der Versuch verlief unter anaerobenBedingungen bei 37 °C mit Pepsin als Enzym über 4 h. Das schwarze Chromatogramm zeigt den Cyanidin-Peak bei 0 hund das rosa Chromatogramm zeigt den Cyanidin-Peak nach 4 h.

Beim Cyanidin begann bereits im Magensegment auch ohne Enzyme ein starker Abbau (Abb. 18),in dessen Verlauf nicht nur die erwarteten Abbauprodukte 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd (Phlorogluci-nolaldehyd) und 3,4-Dihydroxybenzoesäure (Protocatechusäure) [Piffaut et al., 1994; Sadilova et al.,2007] gebildet wurden, sondern auch unbekannte Metabolite (AP1, Abb. 20). Das Spektrum des PeaksAP 1 (Abb. 19) lässt vermuten, dass in der gebildeten Substanz Protocatechusäure enthalten ist. AP1wurde ebenfalls in der Cyanidin Referenz ohne Enzym (nur Inkubationssubstanz und Matrix) gefun-den. Neben den Metaboliten, die sich aus den Abbauprodukten gebildet haben, entstanden währendder enzymatischen Umsetzung auch Abbauprodukte aus den Bestandteilen der Verdauungssäfte. DerKonzentrationsverlauf des Cyanidins und der Abbauprodukte ist in Tabelle 15 und Abbildung 21 auf-geführt. Die Konzentration des Cyanidins (RT 38,9 min) nahm im Laufe der Fermentation über 4 him Magen um insgesamt (Präzipitat + Verdauungssaft) 75 % ab. Beim Präzipitat handelt es sich umeinen Protein-Anthocyan-Komplex, der vom Verdauungssaft separiert, aufgearbeitet und analysiertwurde. In der Referenzprobe (ohne Enzym, nur Inkubationssubstanz und Matrix) nahm die Kon-zentration um 72 % ab. Die Ergebnisse für die Probe und ihre Referenz belegen, dass vielmehr diephysikalisch-chemischen anstatt der enzymatischen Bedingungen im Magensaft für den Abbau desCyanidins verantwortlich sind.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 19: UV-Spektrum von AP 1 aus der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin im Magenseg-ment (pH 1,5, Pepsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 280 nm. Der Versuch verlief unteranaeroben Bedingungen bei 37 °C mit Pepsin als Enzym über 4 h.

Abbildung 20: HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin im Magensegment(pH 1,5, Pepsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 280 nm. Der Versuch verlief unter anae-roben Bedingungen bei 37 °C mit Pepsin als Enzym über 4 h. Das schwarze Chromatogramm zeigt den Beginn desMagensegmentes und das rosa Chromatogramm den Zustand nach 4 h.

Beim Übergang vom Magen ins Duodenum wurde der Magensaft 1 : 2 verdünnt und auf pH 7 einge-stellt. Die Konzentration des Cyanidins sank dabei von 45,5 mg/l auf 9,1 mg/l (Verdünnung rechnerischangepasst) im Duodenum (Tab. 15) ab. Auch unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors konntedie Konzentration der Magenprobe vor der Verdünnung nicht wiedergefunden werden. Grund dafürwar der höhere pH-Wert im Duodenum und die damit verbundene Umwandlung des Cyanidins in seine

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Ergebnisse und Diskussion

weniger stabile Form. Nachträgliches Ansäuern der Probe führte nicht zur vollständigen Rückreaktionin die stabilere Form.

Die Cyanidinkonzentration sank innerhalb einer Stunde im Duodenum von 9,1 mg/l zu Beginn desDuodenums auf 2,7 mg/l ab. Vergleicht man die Chromatogramme der Proben aus dem Duodenumnach 1,5 h und 5 h, zeigte sich ein weitgehend vergleichbares Bild. Während des Verdauungsprozessesim Duodenum wurden augenscheinlich keine neuen Abbauprodukte mehr gebildet, sondern nur eineVariation ihrer Konzentrationen verzeichnet. Die Konzentration der Protocatechusäure blieb weitest-gehend konstant. Beim Aldehyd liess sich eine Abnahme der Konzentration beobachten (Abb. 21). DieKonzentration der erwarteten Abbauprodukte in der Stoffbilanz spiegelte den Abbau stöchiometrischnicht hinreichend wieder (Abb. 21).

Abbildung 21: Konzentrationsverlauf von Cyanidin und dessen Abbauprodukte Protocatechusäure undPhloroglucinolaldehyd bei der sequentiellen enzymatische Umsetzung im simulierten in vitro Verdauungs-modell. Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C im Magen (pH 1,5, Pepsin, 4 h) und Duodenum(pH 7, Pankreatin und Trypsin, 5 h).

Während der Umsetzung im in vitro Verdauungsmodell bildete sich in beiden Verdauungssegmen-ten ein farbiges Präzipitat aus, welches separat analysiert wurde. Die Betrachtung der Analysen desPräzipitats zeigte, dass der Konzentrationsverlauf in den Proben mit Enzym und der Referenz ohneEnzym annähernd identisch waren. Anfangs- und Endwerte der Versuchsreihe stimmten gut über-ein. Der Verlauf der Gesamtkonzentration aus Präzipitat und Überstand des Verdauungssaftes für dieStandardproben mit und ohne Enzym bestätigten bisherige Beobachtungen, dass die Enzyme auf dieInkubationssubstrate einen geringeren Einfluss als der pH-Wert des Mediums ausüben.

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Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 15: Konzentrationsverlauf des Cyanidins bei der enzymatischen Umsetzung im in vitro Verdau-ungsmodell. Das in vitro Verdauungsmodell wurde für die sequentielle enzymatische Umsetzung im Magen und Darmmit 200 mg/l Cyanidin inkubiert. In der Tabelle ist der Konzentrationsverlauf des Cyanidins ohne Enzym (nur Inkuba-tiossubstanz und Matrix) und mit Enzym (Magen: Pepsin und Duodenum: Pankreatin und Trypsin + jeweilige Matrix)dargestellt. Die Cyanidinkonzentrationen sind für den Überstand (Lq), das Präzipitat (Prä) und die Summe (Lq+Prä) fürdie verschiedenen Segmente aufgeführt. Die Verdünnung des Übergangs vom Magen in das Duodenum wurde rechnerischangepasst.

Cyanidin Ohne Enzyme [mg/l] Mit Enzymen [mg/l]Magen 0 h Lq 159,8 151,8Magen 0 h Prä 18,0 33,4Summe 177,8 185,2

Magen 4 h Lq 32,5 45,5Magen 4 h Prä 12,1 7,7Summe 44,6 53,2

Darm 0 h Lq 4,5 9,1Darm 0 h Prä 3,9 6,7Summe 8,40 15,8

Darm 5 h Lq 0,5 0,5Darm 5 h Prä 0,5 0,5Summe 1,0 1,0

4.2.2.2 Analytik der enzymatischen Umsetzung von Delphinidin im in vitro Verdau-ungsmodell

Die Konzentration des Delphinidins (RT 38,9 min) nahm im Laufe der Fermentation im Magen uminsgesamt (Präzipitat + Verdauungssaft) 77 % Prozent ab. In der Referenzprobe ohne Enzym (nurInkubationssubstanz und Matrix) nahm die Konzentration um 78 % ab. Der Konzentrationsverlaufdes Delphinidins und der Abbauprodukte ist in Tabelle 16 und Abbildung 27 aufgeführt. Wie zuvorbei der enzymatischen Umsetzung des Cyanidins in Kapitel 4.2.2.1, beruht auch hier der Abbau desDelphinidins auf physikochemischen Einflüssen.

Abbildung 22: HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Delphinidin im Magenseg-ment (pH 1,5, Pepsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 280 nm. Der Versuch verlief unteranaeroben Bedingungen bei 37 °C mit Pepsin als Enzym über 4 h. Das schwarze Chromatogramm zeigt den Beginn desMagensegmentes und das rosa Chromatogramm den Zustand nach 4 h.

Das Chromatogramm bei 280 nm zeigt (Abb. 22), dass ebenso wie zuvor für das Cyanidin gezeigt,

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Ergebnisse und Diskussion

die für Delphinidin erwarteten Abbauprodukte 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd (Phloroglucinolaldehyd)und 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure (Gallussäure) gebildet wurden.

Abbildung 23: HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Delphinidin im Magenseg-ment (pH 1,5, Pepsin) und Duodenum (pH7, Pankreatin und Trypsin) des simulierten in vitro Verdau-ungsmodells bei 520 nm. Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C mit Pepsin als Enzym über4 h. Das schwarze Chromatogramm zeigt den Umsatz im Magensegment nach 4 h und das rosa Chromatogramm denBeginn des Duodenums.

Am Ende des Magensegmentes wurde bei 520 nm (Abb. 23) und einer Retentionszeit von 42,6 min einPeak (AP 2) detektiert, der weder in der Magenprobe nach 4 h noch in einer der Referenzen ersicht-lich war. Die Struktur der Verbindung konnte bislang nicht aufgeklärt werden. Das Spektrum ist inAbbildung 24 abgebildet. Die Absorptionsmaxima bei 279 nm und 528 nm lassen auf eine Verbindungaus einem Anthocyan und einer Säure schließen. Beim Übergang vom Magen ins Duodenum sank dieDelphinidinkonzentration von 26,4 mg/l im Überstand des Magens nach 4 h auf 4,6 mg/l (rechnerischangepasst) im Überstand des Duodenums ab. Beim Einstellen des pH-Wertes auf pH 7 bildete sichwie zuvor beim Cyanidin ein farbiges Präzipitat aus (siehe auch Abschnitt 4.2.2.1).

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 24: UV-Spektrum von AP 2 aus der enzymatischen Umsetzung von Delphinidin im Ma-gensegment (pH 1,5, Pepsin) und Duodenum (pH 7, Pankreatin und Trypsin) des simulierten in vitroVerdauungsmodell bei 520 nm. Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C mit Pepsin, Pankreatinund Trypsin als Enzyme über 9 h.

Abbildung 25: HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Delphinidin im Duodenum(pH 7, Pankreatin und Trypsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 320 nm. Der Versuchverlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C mit Pepsin, Pankreatin und Trypsin als Enzyme über 3,5 h. Das schwarzeChromatogramm zeigt den Beginn des Duodenums, das rosa Chromatogramm den Zustand nach 1,5 h und das blauenach 3,5 h.

Beim Abbau von Delphinidin im Duodenum des in vitro Verdauungsmodells wurden für die Inkuba-tionen mit Enzymen und Referenzen (ohne Enzym, nur Inkubationssubstanz und Matrix bzw. ohneInkubationssubstanz nur Enzym und Matrix) die gleichen eluierenden Substanzen nachgewiesen (Abb.25). Die Konzentrationen der Metabolite Gallussäure und Phloroglucinolaldehyd nahmen während derPassage im Duodenum nicht weiter zu. Im Fall des Aldehyds konnte sogar eine fast vollständige Reduk-

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Ergebnisse und Diskussion

tion beobachtet werden (Abb. 26). Auch beim Delphinidin bildete sich nach 1,5 h im Duodenum (Abb.26) keine neuen Reaktionsprodukte, die mit den eingesetzten Methoden detektiert werden konnten. DieKonzentration der erwarteten Abbauprodukte in der Stoffbilanz spiegelte den Abbau stöchiometrischnicht hinreichend wieder (Abb. 27).

Abbildung 26: HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Delphinidin im Duodenum(pH 7, Pankreatin und Trypsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 280 nm. Der Versuchverlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C mit Pepsin, Pankreatin und Trypsin als Enzyme über 3,5 h. Das schwarzeChromatogramm zeigt den Beginn des Duodenums, das rosa Chromatogramm den Zustand nach 1,5 h und das blauenach 3,5 h.

Abbildung 27: Konzentrationsverlauf von Delphinidin und dessen Abbauprodukte (Gallussäure und Phlo-roglucinolaldehyd) bei der sequentiellen enzymatischen Umsetzung im simulierten in vitro Verdauungs-modell. Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C im Magen (pH 1,5, Pepsin, 4 h) und Duodenum(pH 7, Pankreatin und Trypsin, 5 h).

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Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 16: Konzentrationsverlauf des Delphinidins bei der enzymatischen Umsetzung im in vitro Ver-dauungsmodell. Das in vitro Verdauungsmodell wurde für die sequentielle enzymatische Umsetzung im Magen undDarm mit 200 mg/l Delphinidin inkubiert. In der Tabelle ist der Konzentrationsverlauf des Delphinidins ohne Enzym(nur Inkubationssubstanz und Matrix) und mit Enzym (Magen: Pepsin und Darm: Pankreatin und Trypsin + jeweiligeMatrix) dargestellt. Die Delphinidinkonzentrationen sind für den Überstand (Lq), das Präzipitat (Prä) und die Summe(Lq + Prä) für die verschiedenen Segmente aufgeführt. Die Verdünnung des Übergangs vom Magen in das Duodenumwurde rechnerisch angepasst.

Probe Ohne Enzym [mg/l]) Mit Enzym [mg/l]Magen 0 h Lq 140,4 137,7Magen 0 h Prä 28,9 29,8Summe 169,3 167,5

Magen 4 h Lq 24,3 26,4Magen 4 h Prä 5,9 5,7Summe 30,2 32,1

Darm 0 h Lq 3,7 4,6Darm 0 h Prä 2,6 3,4Summe 6,3 8,0

Darm 5 h Lq 0,4 0,3Darm 5 h Prä 0,4 0,4Summe 0,8 0,7

4.2.2.2.1 LC-MS Analysen der Metabolisierung von DelphinidinBei der non-target LC-MS Analyse von Delphinidin wurden die Molekülmassen neuer Metabolitedetektiert, deren direkte Zuordnung und die Aufklärung ihrer chemischen Struktur bisher abschließendnicht möglich waren. Dabei wurden Molekülmassen gefunden, die größer als die des Delphinidins sind,was auf eine weitere Glykosylierung oder Bildung von Oligomeren hindeutete.

Abbildung 28: LC-MS Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung des Delphinidins im Magenseg-ment (pH 1,5, Pepsin) unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C bei 0 h (MIC m/z 435 - 440). Der Versuchverlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C im Magen (pH 1,5, Pepsin, 4 h).

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 29: LC-MS Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung des Delphinidins im Magenseg-ment (pH 1,5, Pepsin) unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C nach 4 h (MIC m/z 435 - 440). Der Versuchverlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C im Magen (pH 1,5, Pepsin, 4 h).

Die Abbildungen 28 und 29 zeigen Chromatogramme der Messungen der Umsetzung von Delphinidinim Magensegment bei 0 h und 4 h. Das Signal bei der Retentionszeit (RT) von 52,2 min (Abb. 29) warweder in der Ausgangsprobe des Magensegmentes (Abb. 28) noch in den Blindproben (ohne Enzym, nurInkubationssubstanz und Matrix) bzw. ohne Inkubationssubstanz (nur Enzym und Matrix) zu finden.Bis auf diese Substanz, wurden alle weiteren Signale in den Proben und Blindproben identifiziert,wenngleich auch in unterschiedlichen Konzentrationen.

4.2.2.3 Analytik der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut) im in vitro Verdauungsmodell

Abbildung 30: HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin-3-O-rutinosid imMagensegment (pH 1,5, Pepsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 320 nm. Der Versuchverlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C mit Pepsin als Enzym über 4 h. Das schwarze Chromatogramm zeigt denBeginn des Magensegmentes und das rosa Chromatogramm den Zustand nach 4 h.

Die Konzentration von Cyanidin-3-O-rutinosid (RT 34,4 min, 100 mg/l inkubiert), dem Rutinosid desCyanidins, änderte sich über 4 h im Magensegment nur geringfügig. Im Gegensatz zu den AglykonenDelphinidin und Cyanidin war das Glykosid Cyanidin-3-O-rutinosid im sauren Bereich des Magensstabil und präzipitierte nicht. Im Chromatogramm bei 320 nm konnte im Magensegment bei 26,8 minRT ein Abbauprodukt detektiert werden, dessen Konzentration über die Zeit stetig zunahm (AP 3,Abb. 30). Diese Verbindung wurde auch in der Blindprobe (ohne Enzym, nur Inkubationssubstanzund Matrix) und bei der Umsetzung von Cyanidin (Abschnitt 4.2.2.1) gefunden. Die Struktur derVerbindung konnte bisher nicht geklärt werden. Anhand des UV-Spektrums enthält die Substanz

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Ergebnisse und Diskussion

AP 3 Phloroglucinolaldehyd.

Im Gegensatz zu den Anthocyanaglykonen nahm die Konzentration des Cyanidin-3-O-rutinosid beimÜbergang vom Magen ins Duodenum nicht ab, sondern lag im Bereich der Ausgangskonzentration derMagenproben. Nach 5 h Inkubation im Duodenum betrug die Konzentration noch immer 54,1 mg/l.Die Chromatogramme der Inkubation im Duodenum zeigten überwiegend Konzentrationsveränderun-gen, jedoch keine Signale neuer Substanzen, die nicht schon im Magensegment zu finden waren. DieVerbindung (AP 3) nahm während der Umsetzung im Duodenum weiter zu (Abb. 31).

Abbildung 31: HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin-3-O-rutinosid imDuodenum (pH 7, Pankreatin und Trypsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 320 nm. DerVersuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C mit Pepsin, Pankreatin und Trypsin als Enzyme über 3,5 h. Dasschwarze Chromatogramm zeigt den Beginn des Duodenums, das rosa Chromatogramm den Zustand nach 1 h und dasblaue nach 3,5 h.

Die Tabelle 17 zeigt den Verlauf der Cyanidin-3-O-rutinosid-Konzentration bei der Umsetzung im in vi-tro Verdauungsmodell. Auffällig ist die geringe Konzentration der nachgewiesenen Inkubationssubstanzim Magen bei 0 h (75,3 mg/l) im Vergleich zur eingesetzten Substanzmenge von 100 mg/l. Wie bereitserwähnt, nimmt die Cyanidin-3-O-rutinosid-Konzentration im Vergleich zu den Aglykonen deutlichlangsamer ab. Das Präzipitat weist geringere Konzentrationen von Cyanidin-3-O-rutinosid (ca. 5 %der jeweiligen Summe) als die jeweiligen Präzipitate der Versuche mit Cyanidin bzw. Delphinidin auf(ca. 10 - 15 % der jeweiligen Summe). Die für Cyanidin-3-O-rutinosid erwarteten Abbauproduktewurden nicht gefunden.

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Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 17: Konzentrationsverlauf des Cyanidin-3-O-rutinosids bei der enzymatischen Umsetzung imin vitro Verdauungsmodell. Das in vitro Verdauungsmodell wurde für die sequentielle enzymatische Umsetzung imMagen und Darm mit 100 µg/ml Cyanidin-3-O-rutinosid inkubiert. In der Tabelle ist der Konzentrationsverlauf desCyanidin-3-O-rutinosid ohne Enzym (nur Inkubationssubstanz und Matrix) und mit Enzym (Magen: Pepsin und Darm:Pankreatin und Trypsin + jeweilige Matrix) dargestellt. In der Tabelle sind die Konzentrationen des Cyanidin-3-O-rutinosids für den Überstand (Lq), das Präzipitat (Prä) und die Summe (Lq + Prä) für die verschiedenen Segmenteaufgeführt. Die Verdünnung des Übergangs vom Magen in das Duodenum wurde rechnerisch angepasst.

Proben Ohne Enzym [mg/l] Mit Enzym [mg/l]Magen 0 h Lq 75,3 65,9Magen 0 h Pellet 2,0 6,9Summe 77,4 72,8

Magen 4 h Lq 66,1 69,4Magen 4 h Prä 6,3 2,1Summe 72,4 71,6

Darm 0 h Lq 78,1 71,0Darm 0 h Prä 4,3 3,8Summe 82,4 74,8

Darm 5 h Lq 52,3 49,3Darm 5 h Prä 2,6 2,1Summe 54,9 51,4

Die Abnahme der Cyanidin-3-O-rutinosid-Konzentration während der gesamten Versuchsreihe (Prä-zipitat + Verdauungssaft) lag bei nur 29 %. Bei den Aglykonen Cyanidin und Delphinidin war eineAbnahme von über 99 % zu beobachten (Abb. 32). Hier bestätigte sich experimentell insbesonderedie angesprochene pH-Stabilität des Cyanidin-3-O-rutinosid. Insgesamt ließ sich feststellen, dass dasCyanidin-3-O-rutinosid über den gesamten Zeitraum nahezu stabil blieb und das Anthocyanglykosidweniger stark an das Protein gebunden wurde als die Aglykone.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 32: Konzentrationsverlauf der Anthocyane Cyanidin, Delphinidin und Cyanidin-3-O-rutinosid(Cy-3-O-rut) bei der sequentiellen enzymatischen Umsetzung im simulierten in vitro Verdauungsmodell.Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen im Magen (pH 1,5, Pepsin, 4 h) und Duodenum (pH 7, Pankreatinund Trypsin, 5 h) bei 37 °C.

4.2.3 Analytik der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung von Anthocyanenin verschiedenen Matrices im in vitro Verdauungsmodell unter anaerobenBedingungen

Der zeitabhängige Konzentrationsverlauf der Anthocyane im simulierten in vitro Verdauungsmodellwurde in verschiedenen Matrices untersucht. Das Hauptaugenmerk bei der Umsetzung lag auf derMetabolisierung der Anthocyane zu deren potentiellen Abbauprodukten sowie neuen Abbauproduktenin Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Verdauungssaftes (enzymatisch, mikrobiell und pH-Wert) und der Probenmatrix (wässrig, stark zuckerhaltig oder sehr proteinhaltig).

4.2.3.1 Umsetzungen von Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut)

4.2.3.1.1 Analytik der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung von Cyanidin-3-O-rutinosid im in vitro Verdauungsmodell

Auf den enzymatischen Abbau von Cy-3-O-rut wurde bereits in Abschnitt 4.2.2.3 näher eingegangen.Im nächsten Schritt wurde die Umsetzung unter enzymatischen und mikrobiellen Bedingungen be-trachtet. Auf diesem Wege ließ sich eine klare Aussage über den realen Einfluss der Mikroorganismenauf das Cy-3-O-rut treffen.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 33: Zeitabhängige Metabolisierung von Cy-3-O-rut im simulierten in vitro Verdauungsmo-dell. Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h),aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h),absteigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C. Fehlerbalken gebendie Mittelwertabweichung an. (n = 2)

Im Vergleich zu Abschnitt 4.2.2.3 zeigte sich hier während des simulierten Magensegmentes eine Ab-nahme an Cy-3-O-rut von 10,5 mg/l (Abb. 33). Bezieht man nun die Werte für das präzipitierteCy-3-O-rut mit ein (siehe auch Abschnitt 4.2.3.1.2), konnte eine konstante Konzentration währendder simulierten Magenpassage beobachtet werden. Über die 2 h im Magensegment wurden wederdie erwarteten Abbauprodukte gebildet, noch neue Abbauprodukte registriert. Beim Übergang insDuodenum (enzymatische Dünndarmstufe) nahm die Konzentration an Cy-3-O-rut um 7,4 mg/l imÜberstand ab. Bis auf einen Ausreißer nach am Ende des Duodenums blieb die Cy-3-O-rut Konzentra-tion bis zum aufsteigenden Dickdarm weitestgehend konstant. Erst im absteigenden Dickdarm sank dieCy-3-O-rut Konzentration nochmal um 9,0 mg/l im Überstand ab. Das Chromatogramm bei 320 nmzeigte für die gesamte Darmpassage ein neues Abbauprodukt (AP 4, Abb. 34 und 35), dessen Strukturbisher noch nicht aufgeklärt werden konnte. AP 4 wurde weder in einer der beiden Kontrollen (ohneEnzym, nur Inkubationssubstanz und Matrix und mit Enzym, ohne Inkubationssubstanz nur Matrix)noch bei der rein enzymatischen Umsetzung (Abschnitt 4.2.2.3) gefunden.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 34: HPLC-Chromatogramme des zeitabhängigen Konzentrationsverlaufes des Abbauproduk-tes AP 4 des Cy-3-O-rut im Darmsegment des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 320 nm.Beginn des Duodenums (oliv, 4 h pH 6,8), Ende Duodenum (dunkelblau), Beginn Ileum (braun, 4 h pH 6,5), EndeIleum (schwarz), Beginn aufsteigender Dickdarm (rosa, pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme,Clostridien Stämme , 12 h), Ende aufsteigender Dickdarm (blau) und Ende absteigender Dickdarm (hellgrün, nach 6 hpH 6,5). Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C.

Abbildung 35: UV-Spektrum von AP 4 aus der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung des Cyanidin-3-O-rutinosid im Darmsegment des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 320 nm. Der Versuch verliefunter anaeroben Bedingungen bei 37 °C mit Pepsin, Trypsin und Pankreation als Enzymen und den MikroorganismenBacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme, Clostridien Stämme über 28 h.

Die Kurve für die Gesamtkonzentration an Cy-3-O-rut (Präzipitat + Verdauungssaft) verlief vomBeginn des Duodeums bis zum Ende des absteigenden Dickdarms gleich (Abb. 33). Auffällig warder Konzentrationsverlauf von Cy-3-O-rut in der Kontrolle. Die Daten für die Kontrolle sind nicht

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Ergebnisse und Diskussion

abgebildet, da es bei der Entnahme der Ausgangsprobe für das Magensegment der Versuchsansatz un-genügend durchmischt war und die gemessene Konzentration der Probe im Vergleich zu den restlichenWerten, sowie dem erwarteten Wert, zu klein war. Während in Abschnitt 4.2.2.3 die Konzentration desCy-3-O-rut über den gesamten Versuch konstant blieb, waren hier bereits beim Übergang ins Illeumnur noch 3,7 mg/l vorhanden und im Dickdarm lag die Cy-3-O-rut Konzentration für die Kontrolleaußerhalb der Nachweisgrenze.Von den erwarteten Abbauprodukten 3,4-Dihydroxybenzoesäure (Protocatechusäure) und 2,4,6-Tri-hydroxybenzaldehyd (Phloroglucinolaldehyd) konnte für die enzymatische und mikrobielle Umsetzungnur die Säure detektiert werden, jedoch erst zu Beginn des Duodenums. Während dieser Passage bliebdie Konzentration der Säure konstant bei 0,2 mg/l. Erst innerhalb der 4 h im Ileum stieg die Proto-catechusäurekonzentration auf 2,1 mg/l an und sank bis zum Ende des Ileums auf 1,7 mg/l ab. BeimÜbergang in den aufsteigenden Dickdarm stieg die Konzentration schlagartig auf 3,4 mg/l an und bliebüber die 12 h konstant. Innerhalb von 2 h im absteigenden Dickdarm erreichte die Protocatechusäureihren Maximalwert von 3,9 mg/l und sank bis zum Ende der 28 h dann auf eine Endkonzentration von1,9 mg/l ab. In der Kontrolle konnte erst zum Ende des Duodenums ein Anstieg der Protocatechusäu-re beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Zum Beginn des Ileums lag die Konzentration bei einemMaximum von 0,8 mg/l bis zum Ende der Passage. Im Dickdarm konnte dann kein Abbauproduktmehr detektiert werden.

4.2.3.1.2 Analytik des präzipitierten Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut)

Um eine verlässliche Aussage über die Umsetzung des Cy-3-O-rut im simulierten in vitro Verdau-ungsmodell treffen zu können, muss nicht nur die Anthocyankonzentration im Überstand bestimmt,sondern zudem der präzipitierte Anteil an Cy-3-O-rut betrachtet werden. Für die Resolubilisierung desPräzipitats wurde eine eigene Methode etabliert. Bei der Analyse der gebundenen Cy-3-O-rut mussman zwischen zwei Formen unterscheiden: dem Cy-3-O-rut vor dem Ansäuern der Proben und demPräzipitat, welches sich während des Ansäuerns der Probe bildet. Für die Analyse des Überstandeswurden alle Proben auf einen pH 2 - 3 eingestellt. Bei diesem pH-Wert lag das Cy-3-O-rut in seinerstabilsten Form vor. Bei einem so niedrigen pH-Wert fiel auch ein Großteil der in den Proben enthalte-nen Proteine aus, welche einen Teil des bisher ungebundenen Cy-3-O-rut mit gefällt haben. Abbildung36 zeigt den Konzentrationsverlauf des resolubilisierten Cy-3-O-rut (vor dem Ansäuern und nach demAnsäuern) und die Cy-3-O-rut-Konzentration im Überstand und im Präzipitat. Präzipitierte Abbau-produkte wurden nicht gefunden.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 36: Präzipitierung der Anthocyane von Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut) während desUmsetzungsversuches im simulierten in vitro Verdauungsmodell.Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum(pH 6,8, Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h), aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme,M. elsdenii, Eubacterien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h), absteigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verliefunter anaeroben Bedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalken geben die Mittelwertabweichung an. (n = 2)

Im Magensegment wurden bereits zu Beginn des Versuches 24 % der im Überstand gefundenen Cy-3-O-rut-Konzentration von Proteinen gebunden und somit für die Analytik des Überstands maskiert.Die Konzentration nahm über die Versuchsdauer von 2 h in der Magenpassage von 9,0 mg/l auf13,3 mg/l zu, bevor sie beim Übergang in das Duodenum auf 1,7 mg/l absank. Beim Übergang insIlleum sank die Konzentration auf 0,2 mg/l ab und blieb bis zum Ende des absteigenden Dünndarmskonstant. Die Konzentrationsänderungen hängen mit den Veränderungen des pH-Wertes im Verlauf desVersuches zusammen. Wie bereits oben erwähnt, wurde auch hier ein erheblicher Anteil des Cy-3-O-rutzusammen mit den Proteinen zu Beginn der Magenpassage ausgefällt und während des Duodenums(pH 6,8) fast vollständig wieder in Lösung gebracht bzw. kein neues Präzipitat gebildet.Der Konzentrationsverlauf des Präzipitates, welches nach dem Ansäuern der Proben gebildet wurde, istgenau gegenläufig. In der Magenpassage lag die Konzentration bei 0,1 mg/l und stieg im Duodenum auf10,3 mg/l an. Im Verlauf der Darmpassage nahm die Konzentration der im Präzipitat enthaltenen Cy-3-O-rut deutlich ab und lag zu Beginn des aufsteigenden Dickdarms nur noch bei 0,3 mg/l bis zum Endedes Versuches. Der Verlauf der Cy-3-O-rut Konzentration im Überstand und der Gesamtkonzentrationwaren ab dem Beginn des aufsteigenden Dickdarms identisch.

4.2.3.1.3 Analytik der polymeren Anthocyane und der antioxidativen Kapazität derProben in den verschiedenen Verdauungsstufen

Bei einer Bilanzierung der Abbauprodukte konnten die Ausgangswerte des eingesetzten Anthocyansnicht wiedergefunden werden, obwohl bereits die präzipitierten Anthocyane mit einkalkuliert wurden.Neben den Monomeren und Aglykonen wurden während des Verdauungsprozesses auch polymere An-thocyane gebildet. Bisher ist nur ein Teil dieser polymeren Anthocyane bekannt und für die wenigstenexistieren kommerziell erhältliche Standards, die zudem sehr teuer sind. Um dennoch eine Aussage

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Ergebnisse und Diskussion

über den Anteil an polymeren Anthocyanen treffen zu können, wurde eine Methode aus der Weinana-lytik angewandt. Die Grundlage dieser Methode ist die Entfärbung des Monomers und des Aglykonsdurch Anlagerung eines Disulfids, wobei die polymeren Anthocyane aus sterischen Gründen nicht ent-färbt werden können.

Abbildung 37: Zeitabhängiger Konzentrationsverlauf von Cy-3-O-rut und Verlauf der optischen Dichtebei 520 nm für Cy-3-O-rut und die Polymere im simulierten in vitro Verdauungsmodell. Magensegment(pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h), aufsteigender Dickdarm(pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h), absteigender Dickdarm(pH 6,5, 6 h). Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalken geben die Mittelwertabweichungan. (n = 2)

Abbildung 37 zeigt, dass bei der Umsetzung des Cy-3-O-rut im in vitro Verdauungsmodell der Mono-merindex parallel zur Anthocyankonzentration (Überstand und Präzipitat, siehe Abschnitt 4.2.3.1.2)verlief. Während der Anteil an Cy-3-O-rut immer weiter abnahm, stieg der Polymerindex stetig anund schnitt am Ende des absteigenden Dünndarms den Graphen des Monomerindex.Der stetig ansteigende Anteil an polymeren Anthocyanen erklärte auch die deutliche Zunahme der an-tioxidativen Kapazität (Abb. 38) im Verlauf des simulierten in vitro Verdauungsprozesses. Beim Über-gang vom Illeum in den aufsteigenden Dickdarm nahm die antioxidative Kapazität um 15,4 mmol/lzu. Dieser Anstieg ließ sich durch die gebildeten Abbauprodukte bzw. die Bilanzierung der Abbaupro-dukte nicht erklären. Zu bedenken ist jedoch, dass es sich hierbei nicht um eine quantitative Methodehandelt. Neben den Abbauprodukten und Polymeren bildeten die Mikroorganismen Essigsäure undMilchsäure, welche die antioxidative Kapazität beeinflussten. Für die Kontrolle verlief der Graph deut-lich flacher.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 38: Verlauf der antioxidativen Kapazität von Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut) im Über-stand der Versuchsansätze der enzymatisch-mikrobiellen Umsetzung sowie der Kontrolle und der Verlaufder Cyanidin-3-O-rutinosid- /Protocatechusäurekonzentration im simulierten in vitro Verdauungsmodell.Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h), aufsteigenderDickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h), absteigenderDickdarm (pH 6,5, 6 h). Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalken geben die Mittelwert-abweichung an. (n = 2), Kontrolle (n = 1)

4.2.3.2 Umsetzung von Heißwasserextrakt hergestellt aus Johannisbeertrester

Innerhalb des BMBF-Projektes sollte nicht nur die Verstoffwechselung der Anthocyane betrachtetwerden und eine geeignete Analyse etabliert werden, sondern auch ein Gärgetränk auf Basis vonBierwürze und Johannisbeersaft hergestellt werden. Ziel dieses Projektabschnittes war die Erhöhungdes Anteils an Antioxidantien im Getränk (Projektpartner Mikrobiologie, Fr. Baki). Ein Ansatz wardie Herstellung eines Heißwasserextraktes aus Jonhannisbeertrester. Dafür wurden 10 % Trester (w/v)in bidest. Wasser gegeben und das Ganze 20 min bei 100 °C gekocht. Der entstandene Extrakt weißteine unkomplizierte Matrix auf und stellte somit den zweiten Schritt in der Analytik der Umsetzungdar. Der Gesamtphenolgehalt des Heißwasserextraktes belief sich auf 1,6 g/l Gallussäureequivalent(GAE). Die Stickstoffbestimmung nach Dumas wurde vom Projektpartner Mikrobiologie durch M.Hageböck durchgeführt und belief sich auf einen Proteingehalt von 44,0 mg/l.

4.2.3.2.1 Analytik der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung von Heißwasserex-trakt im in vitro Verdauungsmodell

Das Delphinidin-3-O-glykosid (Del-3-O-glc) wies zu Beginn der Umsetzung mit 86,6 mg/l die höch-ste Anthocyankonzentration in allen vier Versuchsansätzen mit verschiedenen Matrices auf. Die bei-den Rutinoside des Cyanidins und Delphinidins lagen in ähnlichen Konzentrationen (Cy-3-O-rut mit67,6 mg/l und Del-3-O-rut mit 69,0 mg/l) vor. Mit 23,5 mg/l ist der Anteil an Cyanidin-3-O-glykosid(Cy-3-O-glc) am kleinsten (Abb. 39). Im Vergleich zum Cy-3-O-rut wurden bereits in der Magen-passage Abbauprodukte gefunden. Diese wurden bereits bei der Herstellung des Heißwasserextrak-

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Ergebnisse und Diskussion

tes gebildet. Die Anthocyane sind thermisch nicht stabil und zerfallen bereits beim Erhitzen in ihreAbbauprodukte, den 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd (Phloroglucinolaldehyd) und die analogen Säuren(3,4-Dihydroxybenzoesäure und 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure). Die Konzentration der vier Anthocya-ne nahm beim Übergang ins Duodenum signifikant ab. Beim Del-3-O-rut wurde mit 87 % die höch-ste Abnahme verzeichnet. Während der Umsetzung in den verschiedenen Darmsegmenten nahm dieKonzentration der vier Anthocyane langsam zu, wobei die Konzentrationen stetig zu- und abnahmen.Während des aufsteigenden Dickdarms blieb die Anthocyankonzentration stabil. Im absteigenden Dick-darm nahm die Konzentration nochmals deutlich ab. Nach 28 h lag die Konzentration der Anthocyanezwischen 13,2 mg/l für das Del-3-O-glc und 8,1 mg/l für das Cy-3-O-glc. Die Summe der Abbau-produkte wurde aus Übersichtsgründen in einem einzigen Graphen zusammengefasst. Zu Beginn desDuodenums stieg die Konzentration der Abbauprodukte auf 4,5 mg/l an und sank im Verlauf von 4 hwieder auf 1,9 mg/l ab. Beim Übergang ins Ileum nahm die Konzentration wieder auf 5,0 mg/l zu, umam Ende auf 3,1 mg/l abzusinken. Nach 12 h im aufsteigenden Dickdarm erreichte die Konzentrationder Abbauprodukte ihr Maximum bei 6,0 mg/l und lag am Ende des absteigenden Dickdarms nachinsgesamt 28 h Versuchsdauer bei 3,7 mg/l. Wie zuvor beim Cy-3-O-rut (Abschnitt 4.2.3.1.1) gab dieKonzentration der Abbauprodukte nicht ansatzweise den erwarteten Wert wieder.

Abbildung 39: Zeitabhängige Metabolisierung des Heißwasserextrakts aus Johannisbeertrester im simu-lierten in vitro Verdauungsmodell. Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsin und Pankreatin,4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h), aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme,Clostridien Stämme, 12 h), absteigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei37 °C. Die Fehlerbalken geben die Mittelwertabweichung an. (n = 2), Kontrolle (n = 1)

Das Chromatogramm bei 320 nm (Abb. 40) zeigt für die gesamte Darmpassage neben den bekanntenAbbauprodukt auch AP 4, welches bereits bei der Umsetzung von Cy-3-O-rut (Abschnitt 4.2.3.1.1)gefunden wurden.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 40: HPLC-Chromatogramme des zeitabhängigen Konzentrationsverlaufes des Abbauproduk-tes AP 4 aus dem Heißwasserextrakt des Johannisbeetresters im Darmsegment des simulierten in vitroVerdauungsmodells bei 320 nm. Beginn Ileum (schwarz, 4 h, pH 6,5), Ende Ileum (rosa), Beginn aufsteigenderDickdarm (blau, 12 h, pH 5,5), Ende aufsteigender Dickdarm (braun), Beginn absteigender Dickdarm (dunkelblau, 6 h,pH 6,5) und Ende absteigender Dickdarm (grün). Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C

Die Kurven für die einzelnen Anthocyankonzentrationen in der Kontrolle (Abb. 39) verliefen ähnlichwie zuvor bei der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung. Die Gesamtkonzentration an Anthocy-an lag zu Beginn der Umsetzung bei 191,2 mg/l, also deutlich unterhalb der Ausgangskonzentrationder Probe. Zu Beginn des Duodenums wurden nur noch 68,0 mg/l gefunden. Über die 4 h sinkt dieGesamtkonzentration dann auf 12,7 mg/l ab. Zu Beginn des Ileums stieg die Konzentration nochmalsleicht auf 28,4 mg/l an und erreicht ihr Maximum für die Darmpassage nach 12 h im aufsteigen-den Dickdarm bei 37,1 mg/l. Am Ende der Umsetzung konnten noch 31,8 mg/l der vier Anthocyanegefunden werden. Bei den Abbauprodukten in der Kontrolle wurden keine so starken Konzentrations-schwankungen gefunden wie in den Proben. Beim Übergang ins Duodenum stieg die Konzentrationder Abbauprodukte von 0,8 mg/l auf 2,2 mg/l an und nahm innerhalb der 4 h um 1,5 mg/l zu.Während der 4 h im Ileum sank die Konzentration nochmals ab und belief sich zu Beginn des aufstei-genden Dickdarms auf 5,6 mg/l. Das Maximum war nach 12 h im Dickdarm erreicht. Am Ende desVerdauungsmodells lagen noch 5,9 mg/l des Abbauproduktes vor.

4.2.3.2.2 Analytik der präzipitierten Anthocyane aus dem Heißwasserextrakt von Jo-hannisbeertrester

Die Analyse der präzipitierten Anthocyane lief analog zur Untersuchung in Abschnitt 4.2.3.1.2. Prä-zipitierte Abbauprodukte wurden nicht gefunden.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 41: Präzipitierung der Anthocyane des Heißwasserextraktes und der Konzentrationsverlaufder Anthocyane aus Überstand und Präzipitat während des Umsetzungsversuches im simulierten in vitroVerdauungsmodell. Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum(pH 6,5, 4 h), aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme, ClostridienStämme, 12 h), absteigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C. DieFehlerbalken geben die Mittelwertabweichung an. (n = 2)

Wie zuvor beim Cy-3-O-rut (Abschnitt 4.2.3.1.2), wurde beim Heißwasserextrakt ein Großteil derAnthocyane (79,1 mg/l) in der Magenpassage gebunden (Abb. 41). Die Anthocyankonzentration bliebüber die gesamte Magenpassage konstant. Beim Übergang ins Duodenum nahm die Konzentration derAnthocyane um 50 % ab, um im Laufe der 4 h nochmal von 44,9 mg/l auf 20,9 mg/l abzusinken.Trotz rechnerischer Anpassung sank die Konzentration beim Übergang ins Ileum ebenfalls um 50 %ab. Während der 12 h im aufsteigenden Dickdarm stieg die Konzentration von 5,3 mg/l auf 12,9 mg/lan. Zum Ende der 28 h sank die Konzentration auf ihren Minimalwert von 2,2 mg/l ab.Der Konzentrationsverlauf des Präzipitats, welches nach dem Ansäuern der Proben gebildet wurde,verläuft analog zur Kurve des Cy-3-O-rut (siehe Abschnitt 4.2.3.1.2). Während der Magenpassage lagdie Konzentration zwischen 2,6 und 5,0 mg/l und stieg im Duodenum auf 79,1 mg/l an. Währenddes Duodenums blieb die Konzentration annähernd konstant und sank beim Übergang ins Ileum auf13,2 mg/l. Innerhalb der 4 h im Ileum stieg die Konzentration noch mal auf 29,1 mg/l an. VomBeginn der Dickdarmpassage bis zu dessen Ende blieb die Konzentration an gebundenem Anthocyanbei durchschnittlich 3,0 mg/l. Berücksichtigt man die Konzentration der gebundenen Anthocyane beider Umsetzung der Anthocyane im Verdauungsmodell, verläuft die Konzentrationskurve im Duodenumund Ileum deutlich anders, als es für die Anthocyane im Überstand der Fall war (Abb. 39). Für denHeißwasserextrakt wurden keine gebundenen Abbauprodukte gefunden.

4.2.3.2.3 Analytik der polymeren Anthocyane und der antioxidativen Kapazität derProben in den verschiedenen Verdauungsstufen

Bei der Bilanzierung der Abbauprodukte für den Heißwasserextrakt zeigte sich, genau wie zuvor schonfür das Cy-3-O-rut, dass die Ausgangswerte des eingesetzten Anthocyans nicht erreicht werden konn-ten. In Abbildung 42 ist der Verlauf der Polymere und Monomere während der Umsetzung im simu-

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Ergebnisse und Diskussion

lierten in vitro Verdauungsmodell aufgeführt.

Abbildung 42: Zeitabhängiger Konzentrationsverlauf der Anthocyane aus dem Heißwasserextrakt desJohannisbeetresters und Verlauf der optischen Dichte bei 520 nm für die Anthocyane und die Polymereim simulierten in vitro Verdauungsmodell. Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsin undPankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h), aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacte-rien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h), absteigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unter anaerobenBedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalken geben die Mittelwertabweichung an. (n = 2)

Der polymere Anteil an Anthocyan blieb während der Magenpassage konstant und nahm nach derMagenpassage langsam aber stetig mit einer OD520nm von 0,26 auf 0,60 zu. Die Konzentration derMonomere verlief parallel zur Abnahme der Anthocyankonzentration aus Überstand und Präzipitat.

Die antioxidative Kapazität des Heißwasserextraktes blieb während der Magenpassage konstant, sankaber zu Beginn des Duodenums von 5,9 mmol/l Troloxequivalent auf 1,8 mmol/l ab (Abb. 43). Wäh-rend der je 4 h im Duodenum und Ileum nahm die Konzentration um 50 % zu und stieg beim Übergangin den absteigenden Dickdarm schlagartig an. Bis auf leichte Schwankungen blieb die Konzentrationbis zum Ende der Umsetzung bei 24,6 mmol/l Troloxequivalent. Der Maximalwert für die antioxidativeKapazität bei der Kontrolle lag bei 6,0 mmol/l Troloxequivalent.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 43: Verlauf der antioxidativen Kapazität im Überstand sowie der Anthocyankonzentrationdes Heißwasserextraktes aus Überstand und Präzipitat und Verlauf der Konzentration der Abbaupro-dukte im simulierten in vitro Verdauungsmodell. Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsinund Pankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h), aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubac-terien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h), absteigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unter anaerobenBedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalken geben die Mittelwertabweichung an. (n = 2), Kontrolle (n = 1)

4.2.3.3 Umsetzung des Johannisbeersaftes

Im nächsten Schritt wurde der Johannisbeersaft analysiert, welcher neben der Würze einen Grundbe-standteil des Gärgetränkes darstellte. Im Vergleich zum Heißwasserextrakt war die Matrix des Saftesdurch die große Menge an Zuckern sowie verschiedenster phenolischer Verbindungen eine deutlichschwierigere Matrix und erschwerte dadurch auch die Analyse der Proben sowie die Detektion neu-er Metabolite. Um die Zuckerkonzentration zu verringern, wurde der Saft zu Beginn des Versuchesim Verhältnis 1 : 10 mit bidest. Wasser verdünnt. Der Gesamtphenolgehalt des Saftes belief sich auf1668,8 mg/l Catechinequivalent (SD +/- 69,0, unverdünnt). Die Stickstoffbestimmung nach Dumaswurde vom Projektpartner Mikrobiologie durch M. Hageböck durchgeführt und belief sich auf einenProteingehalt von 27,0 mg/l.

4.2.3.3.1 Analytik der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung des Johannisbeer-saftes im in vitro Verdauungsmodell

Die Glukoside des Cyanidins und Delphinidins lagen zu Beginn des Magensegmentes in einer geringerenKonzentration (Cy-3-O-glc 5,4 mg/l und Del-3-O-glc 11,4 mg/l) vor, als die Rutinoside (Cy-3-O-rut52,1 mg/l und Del-3-O-rut 39,3 mg/l). Während der Magenpassage nahm die Konzentration der An-thocyane leicht zu und sank, wie auch schon beim Heißwasserextrakt beobachtet (Abschnitt 4.2.3.2.1),beim Übergang ins Duodenum deutlich ab (Abb. 44). Die Konzentration der Rutinoside sank um ca.50 % ab und nahm bis zum Ende des Ileums nochmals um mehr als die Hälfte ab. Für die Glukosideließ sich eine ähnliche Konzentrationsabnahme verzeichnen. Während des aufsteigenden und abstei-genden Dickdarms blieb die Konzentration für alle Anthocyane annähernd konstant und nur für diebeiden Rutinoside nahm die Konzentration zum Ende des Versuches nochmals um 45 % ab. Wie zu-

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Ergebnisse und Diskussion

vor beim Cy-3-O-rut (Abschnitt 4.2.3.1.1) gab auch hier die Konzentration der Abbauprodukte nichtansatzweise den erwarteten Wert wieder. Die Werte für die Abbauprodukte wurden wie bei den vor-herigen Versuchen addiert und graphisch dargestellt. Innerhalb der ersten 3 h im Verdauungsmodellnahm die Konzentration der Abbauprodukte um 50 % auf 4,3 mg/l zu und lag nach weiteren 3 h zumEnde des Duodenums bei 3,2 mg/l. Beim Übergang ins Ileum stieg die Konzentration auf 5,7 mg/l anund nahm während der Passage auf 4,6 mg/l ab. Zu Beginn des Dickdarms betrug die Konzentrationder Abbauprodukte 4,0 mg/l. Die Konzentration blieb bis zum Ende der Dickdarmpassage annäherndkonstant.

Abbildung 44: Zeitabhängige Metabolisierung des Johannisbeersaftes im simulierten in vitro Verdauungs-modell. Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h),aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h),absteigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalkengeben die Mittelwertabweichung an. (n = 2), Kontrolle (n = 1)

Der Konzentrationsverlauf der Kontrolle verlief parallel zur Konzentration in den Proben (Abb. 44).Zu Beginn der Magenpassage lagen 60,2 mg/l vom Cy-3-O-rut, 45,3 mg/l vom Del-3-O-rut, 6,2 mg/lvom Cy-3-O-glc und 12,4 mg/l vom Del-3-O-glc vor. Die Konzentration der vier Anthocyane nahmbeim Übergang ins Duodenum schlagartig ab und sank dann weiter innerhalb der 4 h in der Pas-sage von 67,8 mg/l auf 8,6 mg/l, bezogen auf die gesamte Anthocyankonzentration, ab. Zu Beginndes Ileums stieg die Gesamtkonzentration wieder auf 33,8 mg/l an und betrug am Ende des Ileumsnoch 18,9 mg/l für alle vier Anthocyane. Während der aufsteigenden Dickdarmpassage blieb die Ge-samtkonzentration konstant bei 15,2 mg/l, stieg beim Übergang wieder leicht an und sank dann imabsteigenden Dickdarm von 20,1 mg/l auf eine Endkonzentration von 16,5 mg/l. Aus Übersichtsgrün-den wurden die Abbauprodukte wieder in einem Graphen dargestellt. Auch bei der Kontrolle wird nurein Bruchteil der erwarteten Konzentration der Abbauprodukte gefunden. Zu Beginn des Duodenumsstieg die Konzentration der Abbauprodukte von 1,1 mg/l auf 1,7 mg/l an und stieg während der 8 him Duodenum und Ileum auf sein Maximum von 2,9 mg/l. Zu Beginn des aufsteigenden Dickdarmslagen noch 2,2 mg/l vor. Die Konzentration blieb während der gesamten Passage konstant und stiegim absteigenden Dickdarm auf einen Endwert von 2,8 mg/l an.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 45: HPLC-Chromatogramme des zeitabhängigen Konzentrationsverlaufes des Abbauproduk-tes AP 4 aus dem Johannisbeersaft im Darmsegment des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei320 nm. Ende Duodenum (schwarz, 4 h, pH 6,8), Beginn Ileum (rosa, 4 h, pH 6,5), Ende Ileum (blau), Beginn aufstei-gender Dickdarm (braun, pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h),Ende aufsteigender Dickdarm (grün). Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C.

Abbildung 46: HPLC-Chromatogramme des zeitabhängigen Konzentrationsverlaufes des Abbauproduk-tes AP 5 aus dem Johannisbeersaft im Duodenum des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 320 nm.Beginn Duodenum (schwarz, 4 h pH 6,8) und Ende Duodenum (rosa). Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungenbei 37 °C mit Pepsin, Trypsin und Pankreatin über 6 h.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 47: UV-Spektrum von AP 5 aus der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung von Johan-nisbeersaft im Duodenum des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 320 nm. Der Versuch verlief unteranaeroben Bedingungen bei 37 °C mit Pepsin, Trypsin und Pankreatin über 6 h.

Das Chromatogramm bei 320 nm (Abb. 45) zeigt das Abbauprodukt AP 4, welches bereits bei derUmsetzung des Cy-3-O-rut und des Heißwasserextraktes gefunden wurde. Aufgrund der Komplexi-tät der Matrix konnten während der Umsetzung des Saftes weitere Abbauprodukte, sowie deutlicheKonzentrationsveränderungen verschiedener Substanzen aus dem Saft beobachtet werden. Das Abbau-produkt AP 5 (Abb. 46) wurde nicht in den Kontrollen gefunden. Die Struktur konnte bisher jedochnicht aufgeklärt werden. Anhand des UV-Spektrums (Abb. 47) zeigte sich, dass die entstandene Sub-stanz Gallussäure enthält.

4.2.3.3.2 Analytik der präzipitierten Anthocyane aus dem Johannisbeersaft

Die Analyse der präzipitierten Anthocyane verlief analog zur Untersuchung in Abschnitt 4.2.3.1.2. und4.2.3.2.2. Präzipitierte Abbauprodukte wurden nicht gefunden.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 48: Präzipitierung der Anthocyane des Johannissbeersaftes und Verlauf der Anthocyankonzen-tration aus Überstand und Präzipitat während des Umsetzungsversuches im simulierten in vitro Verdau-ungsmodell.Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h),aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h), ab-steigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalken gebendie Mittelwertabweichung an. (n = 2)

Im Vergleich zu den vorherigen Untersuchungen (Abschnitt 4.2.3.1.2 und 4.2.3.2.2) wurde beim Saftnur ein geringer Anteil an Anthocyan (20,4 mg/l) im Magensegment gebunden. Der Anteil an gebun-denem Anthocyan blieb über die 2 h im Magensegment stabil (Abb. 48, Präzipitat vor dem Ansäuern).Beim Übergang ins Duodenum sank die Konzentration an präzipitiertem Anthocyan auf 6,8 mg/l abund lag am Ende bei 1,8 mg/l. Zu Beginn des aufsteigenden Dickdarms wurde erneut ein Teil desAnthocyans präzipitiert (7,1 mg/l). Der Anteil an präzipitiertem Anthocyan nahm innerhalb der 12 him aufsteigenden Dickdarm nochmals um 3 mg/l zu. Am Ende der Umsetzung im in vitro Verdau-ungsmodell konnte kein Anthocyan aus dem Präzipitat detektiert werden.Beim Präzipitat, welches sich nach dem Ansäuern der Probe gebildet hatte, wurde der gleiche Konzen-trationsverlauf wie beim Cy-3-O-rut und Heißwasserextrakt beobachtet. Zu Beginn des Duodenumswurde ein erheblicher Teil des Anthocyans präzipitiert (56,9 mg/l), welcher bis zum Ende des Duo-denums auf 69,5 mg/l anstieg. Beim Übergang ins Ileum fiel die Konzentration dann auf 3,1 mg/l abund lag nach 28 h bei 2,3 mg/l. Bezieht man die Konzentration der resolubilisierten Anthocyane beider Ermittlung der Gesamtkonzentration mit ein, zeigt sich für den Konzentrationsverlauf über 28 hein deutlich anderes Bild als zuvor (Abb. 48).

4.2.3.3.3 Analytik der polymeren Anthocyane und der antioxidativen Kapazität des Jo-hannisbeersaftes in den verschiedenen Verdauungsstufen

Der Johannisbeersaft wurde, wie zuvor das Cy-3-O-rut und der Heißwasserextrakt, auf die Anwesen-heit von polymeren Anthocyanen und seine antioxidative Kapazität hin untersucht. Dabei wurden fürden Monomer- und Polymerindex die gleichen Ergebnisse gefunden, wie zuvor für das Cy-3-O-rut undden Heißwasserextrakt (Abb. 49). Mit Abnahme der Anthocyankonzentration sank auch die Absorp-tionskurve für die Monomere. Zu Beginn lag der OD520nm Wert bei 1,5 und sank innerhalb der 28 hstetig auf 0,7 ab. Parallel dazu stieg der Anteil an Polymeren von 0,2 auf 0,8, wobei der Graph im

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Ergebnisse und Diskussion

absteigenden Dickdarm den Graphen für die Monomere schnitt.

Abbildung 49: Zeitabhängiger Konzentrationsverlauf der Anthocyane des Johannisbeetsaftes und Verlaufder optischen Dichte bei 520 nm für die Anthocyane und Polymere im simulierten in vitro Verdauungs-modell. Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h),aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h),absteigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalkengeben die Mittelwertabweichung an. (n = 2)

Bei der Untersuchung der antioxidativen Kapazität zeigte sich, dass die antioxidative Wirkung ge-nau gegenläufig zur Anthocyankonzentration verlief. Die antioxidative Kapazität blieb während derMagenpassage, dem Duodenum und Ileum annähernd konstant und stieg beim Übergang in den auf-steigenden Dickdarm schlagartig von 3,7 mmol/l Troloxequivalent auf 15,8 mmol/l Troloxequivalentan (Abb. 50). Bis auf einen leichten Anstieg am Ende des aufsteigenden Dickdarms auf 18,8 mmol/lTroloxequivalent blieb die Konzentration über den Zeitraum von 18 h in Dickdarm konstant. Die Kon-zentration der Kontrolle blieb, bis auf einen kleinen Ausreißer, über die gesamte Dauer der Umsetzungkonstant (3,2 mmol/l Troloxequivalent bis 3,5 mmol/l Troloxequivalent).

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 50: Verlauf der antioxidativen Kapazität im Überstand sowie der Anthocyankonzentrationdes Johannisbeersaftes aus Überstand und Präzipitat und Verlauf der Abbauproduktkonzentration imsimulierten in vitro Verdauungsmodell. Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsin undPankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h), aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacte-rien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h), absteigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unter anaerobenBedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalken geben die Mittelwertabweichung an. (n = 2), Kontrolle (n = 1)

4.2.3.4 Umsetzung des Gärgetränkes auf Basis von vergorener Bierwürze und Johan-nisbeersaft

Ein weiterer Schritt im Rahmen des BMBF-Projektes war die Analyse eines Gärgetränkes auf Basisvon vergorener Bierwürze und Johannisbeersaft. Dabei stellte gerade die Bierwürze analytisch einegroße Herausforderung dar. Ihre Matrix war nicht nur sehr komplex, sondern der Anteil an Zuckerund vor allem Proteinen in der Würze war zudem sehr hoch. Diese Faktoren machten die Analyseder Metabolite sehr aufwendig. Der Gesamtphenolgehalt des Getränkes belief sich auf 689,8 mg/lCatechinequivalent (SD +/- 0,2). Die Stickstoffbestimmung nach Dumas wurde vom ProjektpartnerMikrobiologie durch M. Hageböck durchgeführt und belief sich auf einen Proteingehalt von 613,0 mg/l.

4.2.3.4.1 Analytik der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung des Gärgetränkesauf Basis von vergorener Bierwürze und Johannisbeersaft im in vitro Verdauungsmo-dell

Die Gesamtkonzentration an Anthocyan im Gärgetränk zu Beginn der simulierten in vitro Umsetzungbetrug 43,8 mg/l im Überstand (Abb. 51). Den größten Anteil hatte das Cy-3-O-rut mit 21,4 mg/l,gefolgt vom Del-3-O-rut mit 16,0 mg/l. Die Glykoside hatten den kleinsten Anteil mit 1,3 mg/l fürsCy-3-O-glc und 4,2 mg/l fürs Del-3-O-glc. Die Anthocyankonzentration blieb während der Magen-passage für alle vier Anthocyane konstant und nahm erst beim Übergang ins Duodenum ab. Für dasCy-3-O-rut sank die Konzentration beispielsweise auf etwas weniger als die Hälfte der Konzentrati-on im Magen (9,2 mg/l) ab. Vom Duodenum bis zum Ende des Ileums sank die Konzentration allerAnthocyane stetig weiter bis zum Beginn des aufsteigenden Dickdarms. In den letzten 18 h der Umset-zung blieb die Konzentration annähernd konstant. Am Ende wurden für das Cy-3-O-rut noch 1,8 mg/lund für das Del-3-O-rut 6,4 mg/l gemessen. Cy-3-O-glc und Del-3-O-glc konnte zu Beginn der Dick-

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Ergebnisse und Diskussion

darmpassage nicht mehr detektiert werden. Die Summe der Abbauprodukte wurde wieder in einemGraph zusammengefasst. Zu Beginn der Magenpassage lag die Konzentration der Abbauprodukte bei2,3 mg/l und stieg in den ersten 4 h der Umsetzung auf 5,1 mg/l an. Danach sank die Konzentrationbis zum Ende des Ileums auf 3,2 mg/l. Zu Beginn des aufsteigenden Dickdarms erreichten die Ab-bauprodukte ihren Maximalwert von 8,8 mg/l und sanken innerhalb der 12 h in dieser Passage auf5,3 mg/l ab. Zu Beginn des absteigenden Dickdarms lagen noch 3,1 mg/l vor. Die Konzentration derAbbauprodukte änderte sich über die letzten 6 h nur geringfügig. Beim Gärgetränk war die Abnahmean Anthocyan nicht mit der Bildung der Abbauprodukte zu erklären.

Abbildung 51: Zeitabhängige Metabolisierung des Gärgetränks im simulierten in vitro Verdauungsmodell.Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h), aufsteigenderDickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h), absteigenderDickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalken geben dieMittelwertabweichung an. (n = 2), Kontrolle (n = 1)

In der Kontrolle lagen die Glykoside der Anthocyane wie in der Probe (Abb. 51) in der kleinsten Kon-zentration mit 2,0 mg/l fürs Cy-3-O-glc und 3,6 mg/l fürs Del-3-O-glc vor. Am Ende des Duodenumskonnten beide Glykoside nicht mehr detektiert werden. Das Cy-3-O-rut hat zu Beginn der Magenpas-sage eine Konzentration von 17,7 mg/l. Zu Beginn des Duodenums sank die Cy-3-O-rut-Konzentrationauf 11,3 mg/l und am Ende des Duodenums wurden nur noch 0,8 mg/l gefunden. Bis auf einen Ausrei-ßer blieb die Konzentration die folgenden 18 h konstant. Nach weiteren 4 h im absteigenden Dickdarmkonnte kein Cy-3-O-rut mehr detektiert werden. Mit 14,8 mg/l lag das Del-3-O-rut in der Magen-passage 2,9 mg/l unterhalb der Cy-3-O-rut-Konzentration. Die Konzentrationsabnahme verlief biszum Ende des Duodenums parallel zum Cy-3-O-rut. Im Ileum stieg die Del-3-O-rut-Konzentrationim Vergleich zum Cy-3-O-rut wieder an (von 2,2 mg/l auf 4,5 mg/l). Die Del-3-O-rut-Konzentrationblieb während der Passage des Ileums konstant, stieg im aufsteigenden Dickdarm auf 6,1 mg/l anund änderte sich nicht mehr signifikant. Im absteigenden Dickdarm wurde allerdings kein Del-3-O-rutmehr detektiert. Die Summe der Abbauprodukte wurde aus Übersichtsgründen in einem Graph zu-sammengefasst. Die Abbauprodukte der Kontrolle wiesen im Magensegment eine Konzentration von1,4 mg/l auf und nahmen stetig zu. Innerhalb jeder Passage stieg die Konzentration deutlich an undsank beim Übergang in die nächste Passage wieder leicht ab. Am Ende des aufsteigenden Dickdarms

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Ergebnisse und Diskussion

lag der Maximalwert mit 3,5 mg/l vor. In den darauffolgenden 6 h im absteigenden Dickdarm sankdie Konzentration auf 2,5 mg/l ab.

4.2.3.4.2 Analytik der präzipitierten Anthocyane aus dem Gärgetränk auf Basis vonvergorener Bierwürze und Johannisbeersaft

Beim Gärgetränk lag der prozentuale Anteil an präzipitiertem Anthocyan in der Magenpassage vordem Ansäuern der Proben bei 16 % bezogen auf die Konzentration an freiem Anthocyan in Lösung(Abb. 52). Im Vergleich zu den vorherigen Untersuchungen wurde im Gärgetränk kaum Anthocyanin der Magenpassage präzipitiert. Zu Beginn lag die Konzentration bei 7,3 mg/l und nahm über die2 h auf 4,2 mg/l ab. Zu Beginn des Duodenums lag die Konzentration bei 1,5 mg/l und nahm biszum Ende des Ileums auf 0,3 mg/l ab. Zu Anfang des absteigenden Dickdarms stieg die Konzentrationnochmals auf 1,1 mg/l an. Nach 28 h wurde kein Anthocyan mehr detektiert.

Abbildung 52: Präzipitierung der Anthocyane des Gärgetränkes und Konzentrationsverlauf der Antho-cyane aus Präzipitat und Verdauungssaft während des Umsetzungsversuches im simulierten in vitroVerdauungsmodell. Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum(pH 6,5, 4 h), aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme, ClostridienStämme, 12 h), absteigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C.Die Fehlerbalken geben die Mittelwertabweichung an. (n = 2)

Für die nach dem Ansäuern präzipitierten Anthocyane zeigte sich ein bekanntes Bild. Die Anthocy-ankonzentration stieg beim Übergang ins Duodenum von 0,4 mg/l auf 17,7 mg/l und lag nach 4 h bei21,1 mg/l. Im Ileum fiel die Konzentration dann auf 2,2 mg/l ab. Im aufsteigenden Dickdarm lagennur noch 1 mg/l an präzipitiertem Anthocyan vor und nach 28 h waren es nur noch 0,3 mg/l. Auchfür das Gärgetränk wurden keine präzipitierten Abbauprodukte gefunden.

4.2.3.4.3 Analytik der polymeren Anthocyane und der antioxidativen Kapazität desGärgetränkes auf Basis von vergorener Bierwürze und Johannisbeersaft in den verschie-denen Verdauungsstufen

93

Ergebnisse und Diskussion

In der Magenpassage wurde keine signifikante Änderung der monomeren und polymeren Anthocyanebeobachtet (Abb. 53). Erst im Duodenum nahm der Anteil an monomeren Anthocyanen stark ab. DieOD520nm sank von 0,6 zu Beginn des Duodenums auf 0,3 am Ende des Duodenums ab. Vom Ileumbis zum Ende des absteigenden Dickdarms belief sich die OD520nm auf 0,2. Der Anteil an polymerenAnthocyanen nahm stufenförmig von Passage zu Passage zu, blieb aber innerhalb jeder Passage kon-stant. Während im Magen der OD520nm Wert bei 0,1 lag, stieg er im Duodenum auf 0,2. Im Ileum lager bei 0,3 und blieb ab dem aufsteigenden Dickdarm bei 0,5. Zu Beginn des aufsteigenden Dickdarmskreuzten sich der Verlauf des Polymerindex und des Monomerindex.

Abbildung 53: Zeitabhängiger Konzentrationsverlauf der Anthocyane des Gärgetränkes auf Basis vergo-rener Bierwürze und Johannisbeersaft und Verlauf der optischen Dichte bei 520 nm für die Anthocyaneund Polymere im simulierten in vitro Verdauungsmodell.Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8,Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h), aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eu-bacterien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h), absteigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unter anaerobenBedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalken geben die Mittelwertabweichung an. (n = 2)

Die antioxidative Kapazität im Gärgetränk (Abb. 54) und dem Johannisbeersaft (Abb. 50) verlief überdie gesamte Versuchsdauer annähernd gleich. Bis zum aufsteigenden Dickdarm blieb die antioxidativeKapazität annähernd stabil und stieg dann deutlich von 4,2 mmol/l Troloxequivalent auf 19,2 mmol/lTroloxequivalent an. Zum Schluss lag die antioxidative Kapazität bei 14,9 mmol/l Troloxequivalent.Die antioxidative Kapzität in der Kontrolle verlief, wie schon beim Saft, über den gesamten Zeitraumder Umsetzung annähernd konstant (Beginn Magen: 4,5 mmol/l Troloxequivalent, Ende absteigenderDickdarm: 4,5 mmol/l Troloxequivalent).

94

Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 54: Verlauf der antioxidativen Kapazität im Überstand sowie der Anthocyankonzentrationdes Gärgetränkes auf Basis vergorener Bierwürze und Johannisbeersaft aus Überstand und Präzipitatund der Verlauf der Abbauproduktkonzentration im simulierten in vitro Verdauungsmodell.Magensegment(pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8, Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h), aufsteigender Dickdarm(pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h), absteigender Dickdarm(pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalken geben die Mittelwertabwei-chung an. (n = 2), Kontrolle (n = 1)

4.2.4 Umsetzung von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin)

Nachdem im Rahmen des BMBF-Projektes die Anthocyane der Johannisbeere umfassend in verschie-densten Matrices analysiert wurden, sollten im nächsten Schritt weitere Flavonoide auf ihre Umsetzungim simulierten Verdauungsmodell untersucht werden. Dazu wurde das Quercetin-3-O-rutinosid (Ru-tin) ausgesucht, da es den Anthocyanen ähnlich ist, in der Natur häufig vorkommt und der reineStandard sehr kostengünstig zu bekommen war. Für die Analyse wurden 1,5 mg/ml des schwer lösli-chen Rutins in 6 % Ethanol bezogen auf die Ausgangsmenge gelöst. Bei der Zugabe des Magensaftesund der damit verbundenen Absenkung des pH-Wertes fiel ein Großteil des Rutins aus und ließ sichauch durch Verdünnung der Konzentration auf 1 mg/ml nicht mehr in Lösung bringen. Lösung undNiederschlag wurden dennoch für den Umsetzungsversuch verwendet.

4.2.4.1 Analytik der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) im in vitro Verdauungsmodell

Der Konzentrationsverlauf des Rutins in Abbildung 55 verlief gegensätzlich zum Anthocyan aus denvorherigen Untersuchungen (Abschnitt 4.2.3.1.1 - 4.2.3.4.1).

95

Ergebnisse und Diskussion

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Ergebnisse und Diskussion

Während die Rutinkonzentration im Magen bei 36,3 mg/l lag, stieg sie zu Beginn des Duodenums auf356,0 mg/l an und blieb über 4 h konstant. Im Ileum nahm die Konzentration dann von 254,1 mg/lauf 308,1 mg/l zu und sank während der 18 h im Dickdarm nur geringfügig ab. Am Ende der Dick-darmpassage wurden 260,6 mg/l des Rutins gefunden. Bis zum Ende des Ileums verlief die Rutin-konzentration für die Ansätze und die Kontrolle ohne Enzyme und Mikroorganismen absolut gleich.Während die Konzentration in der Probe nach der Zugabe der Mikroorganismen im Ileum absank,blieb die Konzentration in der Kontrolle ohne Mikroorganismen erst einmal konstant. Im Dickdarmstieg die Rutinkonzentration in der Kontrolle auf 592,4 mg/l an und änderte sich bis zum Ende nichtmehr signifikant.Quercetin-3-O-glucosid (Isoquercetin), das Glykosid des Rutins, wurde in den Versuchsansätzen mitEnzymen und Mikroorganismen erst nach dem Übergang ins Duodenum detektiert. Während des Duo-denums änderte sich die Isoquercetinkonzentration von 10,9 mg/l kaum, sank am Anfang des Ileumsauf 7,5 mg/l ab und lag nach 22 h im Verdauungsmodell bei 5,7 mg/l. Auch für das Isoquercetinkonnte beobachtet werden, dass bis zum Ileum Probe und Kontrolle parallel verliefen. Im Ileum bliebdie Konzentration in der Kontrolle bis zum Ende konstant, stieg beim Übergang in den Dickdarm von10,0 mg/l auf 17,2 mg/l an und blieb danach bis zum Ende des Versuches stabil.

Nach 2 h im Ileum, 8 h insgesamt im Verdauungsmodell, konnte auch Quercetin, das Aglykon desRutins, zum ersten Mal in den Versuchsansätzen mit Enzymen und Mikroorganismen detektiert wer-den. Während die Konzentration nach dem Ileum bei 6,0 mg/l lag, stieg sie beim Übergang in denaufsteigenden Dickdarm schlagartig auf 46,3 mg/l an. Beim Wechsel in den absteigenden Dickdarmkonnte nochmals eine leichte Abnahme der Quercetinkonzentration beobachtet werden. Innerhalb der6 h im absteigenden Dickdarm stieg die Konzentrationskurve auf das Maximum von 44,9 mg/l an. Inder Kontrolle konnte kein Quercetin gefunden werden. 1,3,5-Trihydroxybenzen (Phloroglucinol) stelltneben der 3,4-Trihydroxybenzoesäure (Protocatechusäure), dem 1,2-Dihydroxybenzen ((+)-Catechol)und der 3-Hydroxyphenylessigsäure eines der Zerfallsprodukte des Quercetins dar. Im Gegensatz zurProtocatechusäure, 3-Hydroxyphenylessigsäure und dem (+)-Catechol wurde das Phloroglucinol zuBeginn des Ileums in den Versuchsansätzen mit Enzymen und Mikroorganismen detektiert. Die Kon-zentration des Phloroglucinols blieb während der gesamten Passage im Ileum konstant und stieg beimÜbergang in den Dickdarm von 2,1 mg/l auf 29,0 mg/l steil an. Ab diesem Punkt verlief die Phlo-roglucinolkonzentration parallel zum Quercetin. Während der 12 h im aufsteigenden Dickdarm bliebdie Konzentration an Phloroglucinol konstant, sank beim Übergang in den absteigenden Dickdarmleicht ab und stieg innerhalb der ersten 2 h auf 40,2 mg/l an. Die Endkonzentration nach 28 h betrug37,8 mg/l.

4.2.4.2 Analytik des präzipitierten Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) und dessen Abbau-produkte

Im Gegensatz zu den Anthocyanen wurden bei der Umsetzung des Rutins auch die Abbauproduktein präzipitierter Form gefunden. Innerhalb des Magensegmentes lagen nur Rutin und Isoquercetin inpräzipitierte Form vor (Abb. 56). Dieses Ergebnis war zu erwarten, da bereits vor dem Versuchsstarteine erhebliche Menge an Rutin ausgefallen war bzw. ein erheblicher Anteil an Isoquercetin gebildetwurde, der ebenfalls ausgefallen war bzw. präzipitiert wurde. Am Ende der Magenpassage konnten6,6 mg/l Isoquercetin und 73,9 mg/l Rutin aus dem Protein-Flavonol-Komplex resolubilisiert werden.Nach dem Übergang ins Duodenum nahm bei beiden Analyten die Konzentration im Niederschlagschlagartig ab. Danach stieg die Konzentration an resolubilisiertem Rutin auf maximal 11,4 mg/l biszum Ende des aufsteigenden Dickdarms an. Die Konzentration an präzipitiertem Isoquercetin blieb biszum Ende des Umsetzungsversuches konstant bei 0,6 mg/l. Beim Quercetin konnte erst im Dickdarmeine Präzipitierung beobachtet werden. Das Maximun an präzipitiertem Quercetin lag bei 3,8 mg/lam Ende des aufsteigenden Dickdarms. Die Phloroglucinolkonzentration stieg während der Passageim Duodenum und Ileum auf 14,9 mg/l an. Innerhalb der 12 h in der Dickdarmpassage stieg dieKonzentration an präzipitiertem Phloroglucinol nochmals auf 22,3 mg/l an und lag am Ende des Um-setzungsversuches bei 19,4 mg/l.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 56: Präzipitierung von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) und seinen Abbauprodukten währenddes Umsetzungsversuches im simulierten in vitro Verdauungsmodell. Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h),Duodenum (pH 6,8, Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h), aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, BacteroidesStämme, M. elsdenii, Eubacterien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h), absteigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuchverlief unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalken geben die Mittelwertabweichung an. (n = 2)

4.2.4.3 Analytik der antioxidativen Kapazität von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin)

Beim Vergleich der antioxidativen Kapazität der Ansätze mit Enzymen und Mikroorganismen und derKontrolle zeigte sich, dass der Anstieg der beiden Graphen bis zum aufsteigenden Dickdarm parallelzueinander verlief (Abb. 57). Die Kapazität für die Ansätze mit Enzymen und Mikroorganismen lagnach dem Übergang in den aufsteigenden Dickdarm bei 12,6 mmol/l Troloxequivalent und nahm nurnoch geringfügig auf 11,4 mmol/l ab. Die Kontrolle nahm vom Ileum zum aufsteigenden Dickdarmum 1,3 mmol/l Troloxequivalent zu, blieb über 12 h konstant und erreichte beim Übergang in denabsteigenden Dickdarm ihr Maximum von 7,9 mmol/l Troloxequivalent. Am Ende lag die antioxidativeKapazität der Kontrolle bei 5,3 mmol/l und damit 53 % unterhalb des Wertes für die Ansätze mitEnzymen und Mikroorganismen.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 57: Verlauf der antioxidativen Kapazität im Überstand sowie der Verlauf der Konzentrationdes Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) aus Überstand und Präzipitat und Verlauf der Abbauproduktkon-zentration im simulierten in vitro Verdauungsmodell. Magensegment (pH 3, Pepsin, 2 h), Duodenum (pH 6,8,Trypsin und Pankreatin, 4 h), Ileum (pH 6,5, 4 h), aufsteigender Dickdarm (pH 5,5, Bacteroides Stämme, M. elsde-nii, Eubacterien Stämme, Clostridien Stämme, 12 h), absteigender Dickdarm (pH 6,5, 6 h). Der Versuch verlief unteranaeroben Bedingungen bei 37 °C. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. (n = 3), Kontrolle (n = 1)

4.2.5 Diskussion der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung der Flavonoideunter anaeroben Bedingungen im in vitro Verdauungsmodell

4.2.5.1 Enzymatische und mikrobielle Umsetzung der Aglykone und Glykoside der An-thocyane

Aufgrund der verschiedenen, teilweise komplexen, eingesetzten Matrices (Johannisbeersaft und vergo-rene Bierwürze) wurde im ersten Schritt der Arbeit die enzymatische Umsetzung der Reinsubstanzenbetrachtet und anschließend die enzymatische und mikrobielle Umsetzung des Cyanidin-3-O-rutinosids(Cy-3-O-rut). Die separate Betrachtung der Aglykone und Glykoside sowie deren enzymatische undmikrobielle Umsetzung sollten die schwierige Analyse der komplexeren Matrices der Anthocyane er-leichtern und den Einfluss der verschiedenen Matrices beleuchten. Jaganath et al. [2009] zeigten inihrer Arbeit, dass die Lebensmittelmatrix Einfluss auf die Abbauprodukte ausüben kann, so dass be-stimmte Verbindungen verstärkt gebildet werden. Vor allem die Zucker, welche in fast allen Produktenvorhanden sind, nehmen deutlichen Einfluss auf die Verstoffwechslung und das Wachstum der Mikro-organismen. Im Laufe der Arbeit wurde die Komplexität der Matrices immer weiter erhöht. Bei deraufgefächerten Analyse lassen sich so die Wechselwirkungen von Matrices mit den Analyten und demVerdauungssystem viel leichter ermitteln und bessere Aussagen über die Umsetzung sowie möglicheNebenreaktionen treffen.

Enzymatische Umsetzung der Aglykone innerhalb der Magenpassage im in vitro Verdauungsmodell

Die Ergebnisse der Inkubation von Delphinidin und Cyanidin im in vitro Verdauungsmodell unter-

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Ergebnisse und Diskussion

scheiden sich nur geringfügig voneinander. Im Gegensatz zum Spaltprodukt 3,4-Dihydroxybenzoesäure(Protocatechusäure) des Cyanidins wurde in den Reaktionsansätzen des Delphinidins erwartungs-gemäß die 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure (Gallussäure) identifiziert [Boto-Ordóñez et al., 2013]. Diegemessenen Anfangskonzentrationen des Delphinidins (167,2 mg/l = Präzipitat (Protein-Anthocyan-Komplex) + Verdauungssaft) und des Cyanidins (184,9 mg/l = Präzipitat + Verdauungssaft) warennahezu gleich. Die Aglykone wurden, im Gegensatz zu den Glykosiden (Abb. 32), bereits im Magenseg-ment abgebaut. Die Wiederfindung lag am Ende der Magenpassage bei 18 %. Die deutliche Abnahmewährend der Magenpassage spiegelt sich in den Ergebnissen von He et al. [2009] und Woodward et al.[2011] wider. Die Verweildauer von 4 Stunden scheint zwar relativ lang gewählt, man muss allerdingsbedenken, dass die Verweildauer der Nahrung im Menschen von den Eigenschaften der aufgenommenenNahrungsmittel (fettig, zuckerhaltig, faserig etc.) und dem individuellen Stoffwechsel des Organismusabhängig ist [Schmidt und Lang, 2005; Kahle et al., 2006].

Enzymatische Umsetzung der Aglykone innerhalb der Darmpassage im in vitro Verdauungsmodell

Nach dem Übergang der Aglykone vom Magen in die Dünndarmpassage liegen nur noch 25 - 28 %der Anthocyankonzentration vor, welche am Ende der Magenpassage quantifiziert wurde. Innerhalbeiner Transitzeit von 1 h sank die Aglykonkonzentration auf unter 2 % der Ausgangskonzentration(Abb. 32). Am Ende des Verdauungsmodells betrug die Konzentration des Cyanidins nach Komplet-tumsetzung noch 0,5 % der Ausgangskonzentration (Präzipitat + Verdauungssaft), vergleichbar demDelphinidin mit 0,4 % (Präzipitat + Verdauungssaft). Die Ergebnisse zeigen, dass die Abnahme beiderAnthocyanaglykone annähernd gleich verläuft, was Aufgrund ihrer ähnlichen chemischen Struktur zuerwarten war. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die kombinierte Analyse des Verdauungssaftes(Überstand) und des Präzipitats geeignet ist, den quantitativen Konzentrationsverlauf und Abbau derAnthocyane zu beschreiben. In Abschnitt 4.2.5.4 wird näher auf die Analyse der Protein-Polyphenol-Wechselwirkung eingegangen. Nach Abschluss der Inkubation sind weniger als 1 % der ursprünglicheingesetzten Aglykone nachweisbar. Der Verlauf der Gesamtkonzentration aus Präzipitat und Verdau-ungssaft für die Aglykone mit und ohne Enzym (Tab. 15 und 16) zeigte, dass die Enzyme auf dieInkubationssubstrate einen weit geringeren Einfluss als die Temperatur und der pH Wert des Medi-ums ausübten. Die Abnahme der Aglykone wurde demnach durch physikochemische Einflüsse bedingtund nicht durch enzymatischen Abbau. Dass der Abbau der Anthocyane im Magen durch physiko-chemische Einflüsse bedingt wurde, stimmt auch mit den Ergebnissen in anderen Arbeiten überein[Woodward et al., 2009; Liu et al., 2014]. Die Instabilität der Aglykone erschwert ihre Analyse währendder Umsetzung im in vitro Verdauungsmodell mit Enzymen und Mikroorganismen.

Enzymatische Umsetzung des Cyanidin-3-O-rutinosids im in vitro Verdauungsmodell

Die Abnahme der Konzentration des Cyanidin-3-O-rutinosids bei der rein enzymatischen Umsetzung(Präzipitat + Verdauungssaft) lag während der gesamten Versuchsreihe bei nur 29 %. Für die AglykoneCyanidin und Delphinidin war eine Abnahme von über 99 % zu beobachten (Abb. 32). Hier bestätigtsich experimentell die angesprochene pH-Stabilität des Cyanidin-3-O-rutinosids. Studien von Krauset al. [2010] und Kahle et al. [2006] zeigten, dass die Abbaurate von Anthocyanen mit verschiedenensubstituierten Zuckern unterschiedlich hoch ist. Während der rein enzymatischen Umsetzung war dasCyanidin-3-O-rutinosid stabiler im Vergleich zu den Anthocyaglykonen und wurde zudem wenigerstark an das Protein gebunden, als die Aglykone. Wie zuvor bei den Aglykonen, ist auch bei denGlykisoden die Abnahme der Konzentration auf physikochemische Einflüsse zurück zu führen.

Enzymatische und mikrobielle Umsetzung der Anthocyane in verschiedenen Matrices im in vitro Ver-dauungsmodell

Bei den vier in vitro Umsetzungen der Anthocyane in verschiedenen Matrices, in Gegenwart vonEnzymen und Mikroorganismen, blieben die Konzentrationen der Anthocyane in der Magenpassageweitestgehend konstant. Die Ergebnisse bestätigen die in anderen Arbeiten postulierte Stabilität der

100

Ergebnisse und Diskussion

Anthocyane bei niedrigen pH-Werten in synthetischen Verdauungssäften. Im sauren Milieu liegen dieAnthocyane in ihrer stabilsten Form, dem mesomeriestabilisierten Flavyliumkation [Lapidot et al.,1999], vor. In vivo muss dieses Ergebnis nicht zwangsläufig das gleiche sein, da die Anthocyane meistin Kombination mit anderen Lebensmitteln aufgenommen werden, was durch den puffernden Effektder Nahrung zu einer Erhöhung des pH-Wertes führen kann [Löffler und Petrides, 1998; Rehner undDaniel, 2002]. Ein höherer pH-Wert hat eine Umlagerung (Abb. 2) und damit eine Destabilisierung derAnthocyane zur Folge [Markakis und Jurd, 1974]. In der vorliegenden Arbeit verlassen die Anthocyanefast unbeschadet die Magenpassage.

Beim Übergang ins Duodenum nimmt die Konzentration an Anthocyanen im Überstand rapide ab.Stalmach et al. [2012] konnten in ihren Arbeiten die gleiche starke Abnahme der Anthocyankonzentra-tion beobachten. Wie schon zuvor Seeram und Nair [2002] begründeten Stalmach et al. [2012] die starkeKonzentrationsabnahme mit dem Wechsel des pH-Wertes vom sauren Milieu (pH 2) in den neutralenBereich von pH 6,8 [Liu et al., 2014]. Neben den im Dünndarm ablaufenden Spaltungsreaktionen derAnthocyane durch hydrolysierende Enzyme in ihre Aglykone und dem darauffolgenden Zerfall in denAldehyd und die phenolische Säure [Day et al., 1998], liegen die Anthocyane im pH-Bereich von 6 - 7in ihrer chinoiden Form als Anhydrobase vor (Abb. 2). In dieser sehr reaktiven Form können verschie-dene Reaktionen mit im Körper vorliegenden Kohlenhydraten, Proteinen oder Molekülen, die z.B.SH-Gruppen enthalten [Serafini et al., 1996; Fleschhut, 2004], ablaufen. Die Chinone können unter an-derem mit den Abbauprodukten Kondensationsprodukte bilden (Abschnitt 4.2.5.3). Beim Übergangvom Duodenum zum Ileum nahm die Konzentration der Anthocyane in Summe im Überstand um6,7 % (Experiment Heißwasserextrakt), 20 % (Experiment Gärgetränk) und 42 % (Experiment Saft),bezogen auf die Endkonzentration im Duodenum, ab. Beim Experiment mit Cyanidin-3-O-rutinosidnahm die Konzentration um 23 %, bezogen auf die Endkonzentration im Duodenum, zu. Am Endedes Ileums lagen die Anthocyankonzentrationen in den vier verschiedenen Umsetzungsversuchen inSumme zwischen 43 % (Experiment mit Cyanidin-3-O-rutinosid) und 11 % (Experiment im Saft) imÜberstand vor. Beim Übergang in den Dickdarm zeigten sich keine drastischen Konzentrationsabnah-men wie zu Beginn im Magensegment. Am Ende der Dickdarmpassage lag die Anthocyankonzentrationfür die Umsetzung mit Cyanidin-3-O-rutinosid bei 12 %, für den Heißwasserextrakt bei 16 %, für denJohannissbeersaft bei 8,5 % und für das Gärgetränk bei 20 % bezogen auf die Ausgangskonzentration.Auf die Ergebnisse wird weiter unten (Einfluss der verschiedenen komplexen Matrices auf die Umset-zung des Anthocyans im in vitro Verdauungsmodell) noch mal näher eingegangen.

In der Arbeit des Projektpartners M. Hageböck, aus dem Forschungsinstitut für Mikrobiologie der TUBerlin, wurde die mikrobielle Metabolisierung der Anthocyane während des Ileums und der Dickdarm-Passage im simulierten in vitro Verdauungsmodell untersucht. Hageböck konnte in Untersuchungenmit definierten Bakterienkulturen die unterschiedlich starke Umsetzung der Anthocyane aufzeigen[Hageböck, 2013]. Beobachtete Abbaureaktionen waren dabei die Abspaltung der Zucker und dieRingspaltung der Anthocyane [Hageböck, 2013], beides bekannte Abbaumechanismen der Darmbak-terien [Bokkenheuser et al., 1987; Schneider und Blaut, 2000; Braune et al., 2001; Herles et al., 2004].

Die gebildeten Abbauprodukte während der Umsetzung der Aglykone und Glykoside im in vitro Ver-dauungsmodell

Sowohl bei der enzymatischen Umsetzung der Aglykone, als auch für die enzymatisch-mikrobielle Um-setzung im in vitro Verdauungsmodell, wurden die postulierten Abbauprodukte Phloroglucinolaldehyd[Kern et al., 2007], Protocatechusäure [Jurd, 1972] und Gallussäure [Boto-Ordóñez et al., 2013] de-tektiert. Neben dem 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd (Phloroglucinolaldehyd) wird in der Literatur auchder 2,4,6-Trihydroxyphenylacetaldehyd (Phloroglucinacetaldehyd) als Abbauprodukt postuliert [Jurd,1972]. In der vorliegenden Arbeit wurde der Pholoroglucinolaldehyd als Hauptmetabolit identifiziert.Bei der enzymatischen Umsetzung nahmen die Abbauprodukte Gallussäure und der Phloroglucinolal-dehyd im Lauf der Verdauung wieder ab. Bei der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung konntedie Abnahme aller gefundenen Abbauprodukte nur in Gegenwart von Mikroorganismen, nicht jedoch

101

Ergebnisse und Diskussion

für die Kontrolle beobachtet werden. Über den mikrobiellen Abbau von Protocatechusäure ist bisherwenig bekannt, allerdings zeigten Hsu et al. [1990] in ihrer Arbeit, dass Clostridium thermeaceticumdurchaus in der Lage ist, die Protocatechusäure abzubauen. Es ist somit nicht gänzlich auszuschließen,dass auch die eingesetzten Mikroorganismen die Abbauprodukte metabolisieren können. Woodwardet al. [2011] beobachteten ebenfalls den Abbau von Protocatechusäure, allerdings durch Rattenleber.Hageböck untersuchte in seiner Arbeit die Umsetzung einiger in der Nahrung häufig vorkommenderphenolischer Säuren im Verdauungsmodell [Hageböck, 2013]. Die Analyse der Abbauprodukte wäreein weiterer Ansatzpunkt, um Aufschluss über die Stabilität der Verbindungen im Verdauungsmodellzu geben.

Stoffbilanz der Umsetzungen im in vitro Verdauungsmodell

Sowohl für die Aglykone, als auch für die Glykoside, stimmt die gefundene Stoffbilanz nicht mit denerwarteten stöchiometrischen Verhältnissen überein. Während in den in vitro Untersuchungen vonFleschhut et al. [2006] zumindest noch 62 % der Abbauprodukte gefunden wurden und auch in derArbeit von Ackermann [2010] weniger Abbauprodukte gefunden wurden als erwartet, postulierte dieArbeitsgruppe von Kay et al. [2009] sogar eine äquivalente Wiederfindung. Um diese unterschiedlichenErgebnisse zu bewerten, muss man sich die Rahmenbedingungen der einzelnen Versuche näher betrach-ten. Die Zusammensetzung der Mikroorganismen, die Versuchsdauer, die Probenvorbereitung und derVersuchsaufbau unterscheiden sich von Studie zu Studie. Die Summe dieser Abweichungen kann imFall der vorliegenden Arbeit dazu führen, dass die Ergebnisse von den publizierten Ergebnissen abwei-chen. Gerade bei den Anthocyanen, die zu den instabileren Analyten gehören, können solche Faktorendas Ergebnis entscheidend beeinflussen. Weitere Untersuchungen lassen zudem vermuten [Ichiyanagiet al., 2007], dass der allgemein anerkannte Abbaumechanismus (Abb. 2 und 3) [Markakis und Jurd,1974] nur einen Nebenweg darstellt. Im alkalischen Milieu sind die Anthocyane instabil und zerfallenoder polymerisieren. Dieser Abbau wird unter anderem durch Temperatur [Rechner, 2000] und dieAnwesenheit von Proteinen beeinflusst [Viljanen et al., 2005]. Ichiyanagi et al. [2007] formuliertendie These, dass die Polymerisation der Anthocyane den Hauptweg ihrer Abnahme darstellt. Hinweiseauf Polymerisationsreaktionen konnten auch während der Umsetzung im in vitro Modell beobachtetwerden. Bei der LC-MS Analyse der Delphinidinproben aus der enzymatischen Umsetzung wurdenOligomere sowie ein unbekannter Peak gefunden (Abb. 29), der bisher nicht identifiziert werden konn-te. Aus dem nominalen Massenverhältnis ließ sich kein geeigneter Strukturvorschlag angeben. Im Laufeder Umsetzung der Anthocyane in verschiedenen Medien wurden noch weitere Peaks gefunden, derenUV-Spektren Hinweise auf Kondensationsprodukte aus Anthocyanen oder deren Abbauprodukte mitweiteren Polyphenolen geben. Die Strukturaufklärung ist Bestandteil nachfolgender Arbeiten.

Obwohl die Anthocyane gut erforscht sind, gab es in den letzten Jahren nur wenige neue Erkenntnissezu den polymeren Anthocyanen, was unter anderem eine Folge aus einer erschwerten Analyse undeinem Mangel an käuflichen Referenzen ist. Dennoch rückten polymere Anthocyane in den letztenJahren immer mehr in den Fokus der Forschung [Jennings et al., 2014; Espley et al., 2014].

Es ist bislang nicht auszuschließen, dass weitere Mechanismen eine Rolle spielen, bei denen es durchAusbildung von kovalenten Bindungen sogar zu irreversiblen bisher unbekannten Metaboliten kommt,welche sich somit der Analyse entziehen. Neben dem Abbau der Anthocyane zum Aldehyd und derkorrespondierenden phenolischen Säure besteht noch eine Vielzahl von potentiellen anderen Abbau-wegen, was eine Erklärung für die schlechte Stoffbilanz wäre. Möglicherweise wurde der Aldehyd inseine korrespondierenden Säuren abgebaut, die allerdings nicht identifiziert werden konnten.

Einfluss der verschiedenen komplexen Matrices auf die Umsetzung des Anthocyans im in vitro Ver-dauungsmodell

Wie bereits weiter oben erwähnt (Enzymatische und mikrobielle Umsetzung der Anthocyane in ver-schiedenen Matrices im in vitro Verdauungsmodell), lag die Gesamtkonzentration der Anthocyane am

102

Ergebnisse und Diskussion

Ende der Umsetzungsversuche für Cyanidin-3-O-rutinosid bei 12 %, für den Heißwasserextrakt bei16 %, für den schwarzen Johannissbeersaft bei 8,5 % und für das Gärgetränk bei 20 %. Auffällig ist,dass entgegen der Erwartungen die Restkonzentration in den Proben mit der komplexesten Matrix amhöchsten war. Bei der hohen Proteinmenge sowie der Vielzahl an zusätzlichen Reaktionspartnern wurdehier mit der kleinsten Wiederfindungsrate zum Ende der Umsetzung gerechnet. Die Ergebnisse lassenvermuten, dass die Komplexität der Matrix einen deutlichen Einfluss auf den Abbau der Anthocyanehat. In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass neben den Proteinen auch Kohlenhydrateund Zucker Einfluss auf die Flavonoid bzw. Anthocyankonzentration und deren Umsetzung nehmen[Zhang et al., 2013; Ozdal et al., 2013]. Welche Mechanismen der Stabilisierung zugrunde liegen, istzu diesem Zeitpunkt noch nicht gänzlich aufgeklärt.

Fazit

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Anthocyane durch physikochemische und mikrobi-elle Einflüsse im in vitro Verdauungsmodell zu ihren bekannten Abbauprodukten (Protocatechusäure,Gallussäure und Phloroglucinolaldehyd) sowie zu bisher unbekannten Verbindungen abgebaut wurden.Die Ausbildung von Matrix-Protein-Anthocyan-Komplexen nimmt Einfluss auf die Konzentration desAnthocyans. Neben dem Abbau und der Komplexierung finden vorwiegend Reaktionen statt (z.B.Polymerisierung, Zusammenlagerung der Aglykone und Anthocyane), die deutlich mehr Einfluss aufdie Abnahme der Anthocyankonzentration und damit auch auf die Stoffbilanz nehmen.

4.2.5.2 Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin)

Bei der Umsetzung von Rutin im simulierten in vitro Verdauungsmodell fand erst im Ileum die mi-krobielle und enzymatische Umsetzung in seine bekannten Metabolite Quercetin-3-O-glucosid (Iso-quercetin), Quercetin und 1,3,5-Trihydroxybenzen (Phloroglucinol) statt [Aura et al., 2002; Jaganathet al., 2009; Lu et al., 2013]. Dabei ist vor allem die Bildung des Isoquercetins von Bedeutung, dadieses bisher nur in wenigen Publikationen als Abbauprodukt von Rutin durch Bakterien aus demmenschlichen Verdauungstrakt erwähnt wurde [Lu et al., 2013].

Während des Magensegmentes und dem ersten Teil des Dünndarms, dem Duodenum, blieb die Kon-zentration an Rutin in den Proben und der Kontrolle konstant. Dieses Ergebnis stimmt mit den Beob-achtungen von Manach et al. [2004] und Bouayed et al. [2011] überein, die innerhalb der Magenpassagekeine Bildung von Quercetin beobachtet haben. Eine geringe Menge des Isoquercetins wurde schonzu Beginn der Umsetzung in den Ansätzen mit Enzymen und Mikroorganismen sowie der Kontrolledetektiert. Rutin ist im Vergleich zu Quercetin relativ stabil, dennoch bildete sich schon im Verlauf derVersuchsvorbereitung durch thermische Einflüsse Isoquercetin, welches zu Beginn des Versuches in denProben und der Kontrolle in gleichen Konzentrationen detektiert wurde. 563,8 mg/l des Rutins und4,6 mg/l des Isoquercetins lagen zu Beginn der Magenpassage in präzipitierter Form vor und wurdenerst beim Übergang ins Duodenum und dem damit verbundenen Anstieg des pH-Wertes wieder gelöst(Abb. 56). In Abschnitt 4.2.5.4 wird auf die Protein-Polyphenol-Wechselwirkung näher eingegangen.Die physikochemische Umsetzung von Rutin zu Isoquercetin sowie die pH-Wert-bedingte Freisetzungdes Rutin spiegeln sich in Konzentrationsverläufen der Kontrolle ohne Enzyme und Mikroorganismenwieder.

Vom Ende des Duodenums bis zum Ende der Dickdarmpassage sank die Rutinkonzentration um 23 %ab, während sie innerhalb der Kontrollprobe um 40 % anstieg (Abb. 55). Anhand der Ergebnisse fürden Kontrollansatz ist es sehr wahrscheinlich, dass innerhalb dieser Passage weiteres präzipitiertesRutin gelöst wurde. Die reale Abbaurate lag demnach höher als 23 % in den Ansätzen mit Enzymenund Mikroorganismen. Dieses Ergebnis zeigt eindeutig, dass eine Metabolisierung des Rutins durchEnzyme und Bakterien stattgefunden hat. Im menschlichen Organismus wird ein Großteil des Rutinserst im Kolon abgebaut und absorbiert, da dort die Rhamnosidase vorliegt, welche den Zucker vomRutin abspaltet [Graefe et al., 2001]. Bis zum Kolon dienen das Rutin und seine Abbauprodukte alsAntioxidantien für den Magen-Darm-Trakt. Neben den antioxidativen Eigenschaften zeigten Tenore

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Ergebnisse und Diskussion

et al. [2013], dass die Abbauprodukte des Rutins die Mucosa und Mikroflora im Darm positiv beein-flussen.Setzt man für die Stoffbilanz bei der enzymatischen und mikrobiellen in vitro Umsetzung des Rutinsdie Kontrolle als Referenzpunkt, so stimmt auch für das Rutin die Stoffbilanz nicht mit den Ausgangs-werten überein. Im Vergleich zu den Anthocyanen lag die Stoffbilanz hier bei 36 %. Da theoretischgenauso viel 3-Hydroxyphenylessigsäure bzw. die daraus entstehende 3,4-Dihydroxybenzoesäure (Pro-tocatechussäure) gebildet werden müsste wie Phloroglucinol, würde demnach die Gesamtkonzentrationan Abbauprodukten bei 53 % liegen. Phloroglucinol, 3-Hydroxyphenylessigsäure, 1,2-Dihydroxybenzen((+)-Catechol) und Protocatechusäure sind die bekannten Abbauprodukte für den anaeroben Bakte-riellen Abbau von Quercetin [Heim et al., 2002; Selma et al., 2009; Tranchimand et al., 2010]. DasFehlen der 3-Hydroxyphenylessigsäure bzw. der Protocatechusäure und des (+)-Catechols kann zu die-sem Zeitpunkt, genauso wie die unzureichende Stoffbilanz, durch weitere ablaufende Reaktionsprozes-se wie Dimerisierung, Copigmentierung und Kondensationsreaktionen erklärt werden (siehe Abschnitt4.2.5.3). Ein weiterer Erklärungsansatz für die mangelnde Stoffbilanz ist, dass im Gegensatz zu denAnthocyanen alle gefundenen Abbauprodukte ebenfalls präzipitiert wurden (Abb. 56). Es ist durchausmöglich, dass die Resolubilisierung nicht so umfassend war wie bei den Anthocyanen.

Fazit

Die Ergebnisse der enzymatisch-mikrobiellen Umsetzung im simulierten in vitro Verdauungsmodellzeigen, dass Rutin in der Darmpassagen durch die Darmbakterien zu Isoquercetin, Quercetin undPhloroglucinol verstoffwechselt wird.

4.2.5.3 Weitere Reaktionen von Flavonoiden

Bei der Umsetzung der Flavonoide im simulierten in vitro Verdauungsmodell können neben der Me-tabolisierung der Substanzen weitere Prozesse ablaufen. Vor allem in Gegenwart von komplexen Ma-trices wie sie in den Versuchsansätzen dieser Arbeit vorliegen, sind Proteine und verschiedene andereSubstanzen (z.B. Polyphenole, Aminosäuren) enthalten, die Interaktionen mit den zu analysierendenSubstanzen eingehen können. Dabei entstehen unter anderem polymere Verbindungen und Protein-Polyphenol-Komplexe (z.B. Abb. 36, 37, 56), welche eine Erklärung für die unzureichende Stoffbilanzliefern können.

Copigmentierung

Im Laufe der Umsetzung im in vitro Verdauungsmodell nahm die Konzentration an Anthocyan ste-tig ab (Abschnitt 4.2.5.1). Parallel konnte eine Erhöhung des Anteils an polymeren Polyphenolendurch die Bestimmung der Monomerindeces beobachtet werden (z.B. Abb. 37 und 53). Der Anstiegan polymeren Polyphenolen deutete darauf hin, dass neben der Umsetzung der Anthocyane im Ver-dauungsmodel auch Polymerisationsreaktionen abliefen.Bei diesen Polymerisationsreaktionen wird in der Literatur meist von Copigmentierung gesprochen.Unter dem Begriff der Copigmentierung versteht man eine inter- und intramolekulare Reaktion oderauch Polymerisierung der Anthocyane mit anderen Polyphenolen, Aminosäuren, Alkaloiden und vorallem farblosen Polyphenolen, was einen farbverstärkenden Effekt zur Folge hat (hyperchromer Effekt)[Mazza und Miniati, 1993]. Copigmentierung wird vor allem in Weinen und Fruchtsäften häufig beob-achtet. Je komplexer die eingesetzte Matrix ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass es zu einerCopigmentierung kommt. Der Anteil an Polyphenolen, organischen Säuren und Aminosäuren nahmmit der Komplexität der in der Arbeit verwendeten Matrices zu. Besonders beim Johannisbeersaftund der vergorenen Bierwürze ist der Anteil an Polyphenolen, organischen Säuren und Aminosäurenbesonders hoch. Dazu kommen die gebildeten Metabolite, welche ebenfalls für Copigmentierungsreak-tionen zur Verfügung stehen können (z.B. Gallussäure und Protocatechusäure). Die Copigmentierungkönnte eine Erklärung für die unzureichende Stoffbilanz sein.Der Anstieg an Polymeren im Laufe der Simulation wurde in allen vier Ansätzen mit Anthocyanenbeobachtet, nicht nur für die Ansätze, in denen ein hoher Polyphenolanteil durch Matrices oder deren

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Ergebnisse und Diskussion

Metabolite vorlag. Die Anthocyane sind nicht nur in der Lage mit anderen Polyphenolen Bindungeneinzugehen, sondern auch mit sich selbst [Quast, 2008]. Die LC-MS-Ergebnisse in Abschnitt 4.2.2.2.1und des Projektpartners M. Hageböck bestätigen die Annahme [Hageböck, 2013], dass Polymerisati-onsreaktionen ablaufen. Für die Polymerisierung der Anthocyane ist bisher kaum Literatur publiziert.In zukünftigen Arbeiten sollten daher auch die Polymere und ihre Bildungsbedingungen untersuchtwerden.

Kondensationsreaktionen

Neben der Copigmentierung können auch Kondensationsreaktionen im Laufe der Umsetzung im si-mulierten in vitro Verdauungsmodell ablaufen [Fossen et al., 2004]. Natürliche Säfte und Gärgetränkeenthalten zahlreiche Verbindungen wie z.B. Acetaldehyd, welche gerade mit den Flavonoiden aus demschwarzen Johannisbeersaft und dem Gärgetränk Bindungen eingehen können. So finden in Gegenwartvon Acetaldehyd Kondensationsreaktionen zwischen den Anthocyanen und Flavan-3-olen statt [Remyet al., 2000]. Dieses anthocyanhaltige polymere Pigment wurde bereits in verschiedensten Arbeitenbei der Untersuchung von Buntsäften gefunden [Es-Safi et al., 2002; Salas et al., 2003; Pissarra et al.,2004]. Der Acetaldehyd liefert die Ethylenbrücke für die Bildung des Anthocyan-Tannin bzw. derTannin-Anthocyan-Pigmente [Pissarra et al., 2004]. Neben den Tannin-Anthocyan-Pigmenten kannin Gegenwart von Phenolcarbonsäuren, Flavanolen und Procyanidinen mit Hilfe von Acetaldehyd dasPyranoanthocyan entstehen. In den meisten bisher bekannten Pyranoanthocyanen ist Malvidin alsAnthocyan vertreten, aber in den letzten Jahren wurden auch Pyranoanthocyane von Delphinidinund Cyanidin gefunden [Hayasaka und Asenstorfer, 2002; Alcalde-Eon et al., 2004; Pozo-Bayon et al.,2004]. Lu et al. [2000, 2002] fanden die Pyranoanthocyane auch in der schwarzen Johannisbeere. Bis-her liegen allerdings noch keine Arbeiten zu Pyranoanthocyanen im Saft der Johannisbeere vor. Esgibt bisher zwei Bildungswege für die Pyranoanthocyane: den enzymatischen Bildungsweg über He-fen [Bakker und Timberlake, 1997; He et al., 2006] oder nicht-enzymatischen über das Vinylphenol[Fulcrand et al., 1996; Mateus et al., 2003]. Fulcrand et al. [1996] gingen beim Vinylphenol von zweimöglichen Reaktionswegen aus: der Cycloaddition oder der elektrophilen Addition einer Vinylphenol-Doppelbindung an ein Anthocyan-Nukleus gefolgt von einer Oxidation, wobei letzterer Aufgrund derstrukturellen Gegebenheiten als der wahrscheinlichere Weg angenommen wird.

4.2.5.4 Protein-Polyphenol-Interaktionen

In den letzten Jahren rückte die Untersuchung von Protein-Polyphenol-Wechselwirkungen vor allemim Zusammenhang mit der Metabolisierung von Polyphenolen im Humanstoffwechsel immer weiterin den Fokus der Untersuchungen. Über Wasserstoffbrückenbindungen, kovalente Bindungen oder hy-drophobe Wechselwirkungen binden die Proteine dabei an die Polyphenole [D’agostino et al., 2012;Tenore et al., 2013]. Um die Bioverfügbarkeit und Verstoffwechslung der Polyphenole umfassend be-urteilen zu können, ist es zwingend notwendig auch die Komplexierung der Analyten zu betrachten.Kaldas et al. [2005] und Rawel et al. [2005] fanden unabhängig voneinander Hinweise auf eine ko-valente Bindung zwischen Quercetin und menschlichem Serumalbumin. Ackermann [2010] konnte inseiner Arbeit bereits die Bindungsstellen und Bindungspartner der Anthocyane an das Human Seru-malbumin identifizieren. Die Untersuchung der Protein-Flavonoid-Komplexe, welche sich im in vitroVerdauungsmodell in Laufe der Umsetzung gebildet haben, war ebenfalls Teil dieser Arbeit. Es konntegezeigt werden, dass sowohl bei der Probenvorbereitung, als auch innerhalb der Magenpassage unddem Transit durch den Dünndarm, ein Teil des zu analysierenden Anthocyans und Rutins durch dieBildung eines Protein-Flavonoid-Komplexes für die Analytik verloren geht. Die Analyten werden fürdie Analyse maskiert und so der beobachtete Konzentrationsverlauf innerhalb der Verdauung ver-fälscht.

Protein-Anthocyan-Interaktionen im Magen

In der Magenpassage bei der enzymatisch-mikrobiellen Umsetzung ist der Anteil an gebundenemAnthocyan am höchsten. Beim Keracyanin liegen 19 % des Cy-3-O-rut (bezogen auf die Gesamtkon-

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Ergebnisse und Diskussion

zentration aus Verdauungssaft + Präzipitat) zu Beginn der Magenpassage in gebundener Form vor(Abb. 36). Für den Heißwasserextrakt sind es 24 % im Magen (Abb. 41), beim Saft und dem Gärge-tränk liegen 16 % bzw. 15 % (Abb. 48 und 52) zu Beginn der Magenpassage in komplexierter Formvor. In der Kontrolle (nicht abgebildet) ist die Menge an gebundenem Anthocyan deutlich geringer.

Liegt der pH-Wert des Mediums in der Nähe des isoelektrischen Punktes des jeweiligen Proteins,wird die hydrophobe Bindung zu den Anthocyanen noch verstärkt [Viljanen et al., 2005; Wiese et al.,2008]. Im Magensaft ist das Enzym Pepsin, außer bei den Kontrollansätzen, enthalten. Dessen iso-elektrischer Punkt liegt bei pH 1. Ein Teil des Anthocyans bindet an das Pepsin und fällt aus. Einweiterer Bindungspartner könnte das prolinhaltige Mucin sein, was auch eine Erklärung für das Präzi-pitat im Kontrollansatz wäre. In der Arbeit von Hageböck wurde die Wechselwirkung von Mucin mitder Hydroxyzimtsäure gezeigt. Dabei führte deren Einfluss zu einer deutlich geringeren Konzentrationder Säure zu Beginn der Umsetzung im simulierten in vitro Verdauungsmodell [Hageböck, 2013]. Wiebeim Pepsin lag auch das Mucin hier an seinem isoelektrischen Punkt vor. Eine naheliegende Erklä-rung hierfür könnte der Umstand sein, dass die Anthocyane, wie auch die Hydroxyzimtsäure, an dasMucin über Wasserstoffbrückenbindungen oder hydrophobe Wechselwirkungen binden.

Protein-Anthocyan-Interaktionen im Darm

Nach dem Übergang in die Dünndarmpassage nahm der Anteil an präzipitiertem Anthocyan stetigab. Der Protein-Polyphenol-Komplex schien im Dünndarm bereits wieder in die gelöste Form über-zugehen. Innerhalb der Dickdarmpassage nahm die Konzentration an gebundenem Anthocyan in denVersuchsansätzen mit Heißwasserextrakt, Johannisbeersaft und Gärgetränk nochmals zu. In den Ar-beiten von Ribnicky et al. [2014] wurde gezeigt, dass Proteine durchaus in der Lage sind, Anthocyanedurch ihre Bindung bis in den Dickdarm zu transportieren, wo sie dann resorbiert werden. Die bekann-ten Abbauprodukte der Anthocyane konnten in den resolubilisierten Proben nicht gefunden werden.

Für die HPLC-Analyse wurden alle Proben auf einen pH von 2 eingestellt. Dabei bildete sich in denProben des Duodenums eine große Niederschlagsmenge, welche nur schwer wieder resolubilisiert werdenkonnte. Der Anteil an Anthocyanen im Niederschlag war dabei deutlich höher als in der Magenpassa-ge. Für das Cy-3-O-rut lagen zu Beginn des Duodenums 61 % (bezogen auf die Gesamtkonzentrationaus Üs + Präzipitat) in gebundener Form vor, für den Heißwasserextrakt waren es 46 %, beim Saftwurden noch 39 % gefunden und beim Getränk auf Bierwürze Basis waren es noch 44 %.Entgegen der Ergebnisse von Siebert [2006] und Poncet-Legrand et al. [2007] wurde die höchste Mengean gebundenem Anthocyan vor und nach der Probenvorbereitung nicht in den Proben des Gärgeträn-kes auf Basis von vergorener Bierwürze und schwarzem Johannisbeersaft gefunden, sondern im Ansatzmit Cy-3-O-rut als Reinsubstanz. Dabei enthält die Bierwürze, bei deren Herstellung auch Gersteverwendet wurde, einen hohen Anteil an prolinreichen Proteinen (z.B. Hordeinproteine) [Gorinsteinet al., 1999; Lopez und Edens, 2005]. Baxter et al. [1997] zeigten, dass gerade prolinreiche Proteineverstärkt Wechselwirkungen mit Polyphenolen eingehen. In der Dickdarmpassage liegen diese Prote-ine an ihrem isoelektrischen Punkt vor [Strelec et al., 2011], was zu einer Entfaltung der Strukturführen könnte und die hydrophoben Wechselwirkungen erleichtern würde. Trotz allem wurde für dasGärgetränk die kleinste Konzentration an gebundenem Anthocyan von allen Experimenten gefunden.Fraglich ist hier, inwieweit sich die verschiedenen Proteine bei der Bindung an die Anthocyane ge-genseitig beeinflussen bzw. ob andere Polyphenole, die in den verschieden Matrices im Vergleich zurReinsubstanz enthalten sind, leichter gebunden werden, als es für die Anthocyane der Fall ist. DieWechselwirkungen mit den Proteinen scheinen von der Struktur der Polyphenole sowie der Proteineabhängig zu sein [Baxter et al., 1997]. Diese These wird von den Ergebnissen der enzymatischen Um-setzung der Aglykone und Cy-3-O-rut gestützt, bei denen der Anteil an präzipitiertem Aglykon höherwar als für das Cy-3-O-rut. Es ist zudem möglich, dass ein großer Teil der Anthocyane bereits bei derHerstellung des Gärgetränkes an die Proteine der Bierwürze gebunden wurden und das Präzipitat imZuge weiterer Verarbeitungsschritte abgetrennt wurde.

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Ergebnisse und Diskussion

Protein-Flavonol-Interaktion in Magen und Darm

Bei der Umsetzung von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) im simulierten in vitro Verdauungsmodellwurde, wie zuvor bei den Anthocyanen, ein Großteil des Rutins (93 % bezogen auf die Gesamtkon-zentration aus Verdauungssaft + Präzipitat) schon in der Magenpassage an das Pepsin oder Mucingebunden (Abb. 56). Die Ergebnisse stimmen mit den Beobachtungen von Rawel et al. [2005] überein,die für diesen Analyten eine hohe Bereitschaft zur Proteinbindung zeigten. Die erhebliche Menge angebundenem Analyten erklärt die geringe Menge an Rutin zu Beginn des Versuchs. Mit Hilfe der Re-solubilisierungsmethode konnte nur ein Teil des an das Protein gebundene Rutin wieder gelöst werden.Im Vergleich zu den Anthocyanen (siehe Protein-Anthocyan-Interaktionen im Magen) ist die Bindun-gen zwischen Rutin und den Proteinen deutlich stärker und schwerer zu lösen. Im Vergleich zu denAnthocyanen besitzt Rutin im C-Ring an Position 4 eine Carbonylgruppe sowie eine Doppelbindungzwischen Position 2 und 3, welche die Bindung an das Protein noch unterstützen [Xiao und Kai, 2012].Aufgrund dieser strukturellen Gegebenheiten bildet das Rutin z.B. über Wasserstoffbrückenbindungenoder hydrophobe Effekte einen stabilen Komplex mit dem Mucin aus [?]. Nach dem Übergang insDuodenum lagen die Konzentrationen für das präzipitierte Rutin bei 41 % (bezogen auf die Gesamt-konzentration aus Verdauungssaft + Präzipitat)und für die präzipitierten Abbauprodukte Isoquercetinund Quercetin bei maximal 9 % (bezogen auf die Gesamtkonzentration aus Verdauungssaft + Präzipi-tat). Der Verlust der Protein-Polyphenol-Bindung wurde durch die Änderung des pH-Wertes bedingt.

Protein-Flavonoid-Komplex als Drug Delivery System

Beim Drug Delivery System handelt es sich um einen Lösungsansatz für ein Transportsystem, das z.B.Pharmazeutika im Körper gezielt an seinen Wirkungsort transportiert [Ravi Kumar, 2008]. Die Phar-mazeutika sollen dabei aufgrund des Systems unbeschadet durch den Körper transportiert werden.Der vorliegende Protein-Flavonoid-Komplex könnte auf zwei verschiedene Weisen als Drug DeliverySystem eingesetzt werden. Zum einen könnte der Komplex dazu verwendet werden, die Flavonoideunbeschadet an ihren Wirkungsort zu transportieren. Zum anderen könnten neben den Flavonoidenweitere Wirkstoff in den Komplex eingebracht werden. Diese Wirkstoffe könnten bei der Ausbildungdes Komplexes mit gefällt werden und somit in den Protein-Flavonoid-Komplex eingebracht werden.

Fazit

Aus den Ergebnissen für die Protein-Polyphenol–Komplexe lassen sich zwei wichtige Schlussfolgerun-gen ziehen. Erstens, um genaue Aussagen über die Umsetzung der Polyphenole im in vitro Verdau-ungsmodell sowie im Humanstoffwechsel treffen zu können, vor allem bei den Anthocyanen, ist dieAnalyse der komplexierten Polyphenole unumgänglich. Betrachtet man die in der Arbeit vorliegendenKonzentrationsverläufe aus dem Überstand (z.B. Abb. 33 und 55) und die Summe aus Überstandund Präzipitat (z.B. Abb. 36 und 56) zeigt sich in allen Ansätzen für die Magen-Dünndarm-Passageeine deutlich langsamere Abnahme der Anthocyane und im Fall des Rutin sogar eine deutlich höhereAusgangskonzentration. Zweitens ermöglicht die Komplexierung der Polyphenole durch Bindung andie Proteine eine Stabilisierung der Verbindungen. Während des Transits in den Dickdarm werdenvor allem instabile Polyphenole wie die Anthocyane vor dem Abbau geschützt. Eine Stabilisierung derAnthocyane durch Wechselwirkungen mit Proteinen des Humanen Serumalbumins und Lactalbuminskonnte bereits Ackermann [2010] in seiner Arbeit aufzeigen. Dabei werden die Anthocyane in Formihrer chinoiden bzw. ionischen Base an das Serumalbumin gebunden, was das Gleichgewicht auf dieSeite der chinoiden Base verschiebt und somit eine Stabilisierung der Anthocyane im neutralen undalkalischen Milieu zur Folge hat. Für die Anthocyane der Heidelbeere konnte Ackermann [2010] eben-falls eine Stabilisierung in Gegenwart von Lebensmittelmatrices mit hohem Protein- und Fettgehaltaufzeigen. Bei dieser Beobachtung liegt die Vermutung nahe, dass die gebundenen Anthocyane undFlavonole in der Magen-Dünndarm-Passage nicht resorbiert werden können. Der Protein-Polyphenol-Komplex stellt demnach ein Drug Delivery System dar, welches die Antioxidantien gezielt in denDickdarm transportieren könnte. In weiterführenden Arbeiten am Forschungsinstitut für Mikrobiolo-

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Ergebnisse und Diskussion

gie der Versuchs- und Lehranstalt für Brauerei der TU Berlin wird an der gezielten Auflösung desKomplexes im Dickdarm aktuell weiter geforscht.

4.2.5.5 Antioxidative Wirkung der Analyten während der Umsetzung im simulierten invitro Verdauungsmodell

Für die Bestimmung der antioxidativen Wirkung von Naturstoffen gibt es verschiedene Testsysteme,die auf unterschiedlichen Reaktionsmechanismen beruhen (TEAC, FRAP, ORAC usw.), was ihre Ver-gleichbarkeit untereinander deutlich erschwert. Fleschhut et al. [2006] waren in ihrer Arbeit eine derersten, die sich unter anderem mit der Gegenüberstellung der verschiedenen Testsysteme beschäftigthaben. Bewertet man Ergebnisse aus verschiedenen Literaturstellen, sollte bedacht werden, dass dieVergleichbarkeit durch die verschiedenen Messmethoden nicht immer gegeben ist. Die antioxidativeWirkung ist ein durchaus sehr häufig eingesetztes Mittel für Untersuchungen von Lebensmitteln, vorallem im Getränkebereich [Shahbaz et al., 2014] oder auch bei der Untersuchung von physiologischenEinflüssen der sekundären Pflanzenstoffe [Lin et al., 2013; Choudhari et al., 2014] auf den Menschen.Bei der Eruierung der Umsetzung der Anthocyane in verschiedenen Matrices sowie dem Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) als Reinsubstanz wurde in der vorliegenden Arbeit auch der Verlauf der antioxida-tiven Wirkung in den vier Verdauungsstufen (Magen, Duodenum, Ileum und Dickdarm) ermittelt. Auszahlreichen Studien ist bekannt, dass die Anthocyane ein sehr hohe antioxidative Kapazität vorweisen[Kelebek et al., 2013; Xu und Mojsoska, 2013]. Bisher lässt sich über die Rangfolge der Wirksam-keit der einzelnen Anthocyane nur schwer eine Aussage treffen. Gründe hierfür können zum einen aufden unterschiedlichen Ergebnissen für verschiedene Messmethoden beruhen, zum anderen auch durchverschiedene strukturelle Faktoren zustande kommen, die auf die Wirkung der einzelnen AnthocyaneEinfluss nehmen. So ist z.B. bekannt, dass ein Zusammenhang zwischen der Anzahl der Hydroxyl-gruppen am B-Ring und der Zunahme der antioxidativen Kapazität besteht [Rice-Evans et al., 1996].Die O-Methylierungen der Hydroxylsubstitutenten beeinflussen die antioxidative Kapazität hingegennegativ [Fleschhut et al., 2006]. Bei den phenolischen Säuren mindern die Carboxylgruppen, welcheeinen elektronenziehenden Effekt aufweisen, die Übertragung der Wasserstoffatome [Rice-Evans et al.,1996] und damit die antioxidative Kapazität der Substanzen.

Verlauf der antioxidativen Kapazität während der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung der An-thocyane in verschiedenen Matrices im in vitro Verdauungsmodell

In der vorliegenden Arbeit verläuft die antioxidative Kapazität in allen Proben ähnlich. Vom Beginnder Magenpassage bis zum Ende des Ileums ändert sich der Verlauf der antioxidativen Kapazität inallen Ansätzen nur geringfügig. Einzig im Heißwasserextrakt nimmt die Kapazität beim Übergangins Ileum geringfügig ab. Beim Übergang in die Dickdarmpassage nimmt die antioxidative Kapazitätschlagartig zu. Innerhalb der Dickdarmpassage liegen alle Anthocyane in ihrer kleinsten Konzentrationvor, dennoch wird die höchste antioxidative Kapazität in allen Ansätzen innerhalb der Dickdarmpassa-ge verzeichnet. Der Anstieg der antioxidativen Kapazität lässt sich nur geringfügig mit der Bildung vonAbbauprodukten erklären. 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure (Gallussäure) und 3,4-Dihydroxybenzoesäure(Protocatechussäure) zeigen zwar antioxidative Wirkung [Seeram et al., 2001; Vitaglione et al., 2007],jedoch nicht in dem Ausmaß wie die Anthocyane, was nicht zuletzt durch die oben erwähnten struk-turellen Einflüsse bedingt ist. Gao et al. [1999] zeigten in ihren Arbeiten, dass die Aglykone bessereAntioxidantien sind, als die Glykoside. Tsuda et al. [1994] machten in ihren Arbeiten die gleichenBeobachtungen, dass die Glykosylierung einen schwächenden Effekt auf die antioxidative Kapazitätausübt. Die O-Glykosylierung vermindert die Koplanarität des B-Ringes mit dem Rest des Flavonoids,was die Delokalisierung des Elektrons einschränkt [van Acker et al., 1996; Heim et al., 2002]. Dabei istnicht nur die Glykosylierung an sich, sondern auch die Art des Zuckers für die antioxidative Wirkungvon entscheidender Bedeutung [Wang et al., 1997]. Die Ergebnisse waren auch hier wieder abhängigvom verwendeten System, allgemeingültige Trends wurden bisher allerdings nicht gefunden.

Bei der Bestimmung der antioxidativen Wirkung handelt es sich um eine qualitative Methode, die eineUnterscheidung der einzelnen Antioxidantien ausschließt. Gerade in den Matrices Saft und vergorene

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Ergebnisse und Diskussion

Bierwürze ist eine Vielzahl von Substanzen bzw. deren Abbauprodukte enthalten, welche ebenfalls alsAntioxidantien wirksam sind [Vitaglione et al., 2007] und somit die Ergebnisse beeinflussen können.Diese Substanzen werden wiederum von den verwendeten Mikroorganismen weiter verstoffwechselt.Die entstehenden Abbauprodukte könnten ebenfalls Einfluss auf die antioxidative Kapazität nehmen.Bei der Analyse der Kontrollproben ohne Anthocyane oder Rutin konnten verschiedene Abbauproduk-te detektiert werden, die nicht identifiziert werden konnten. Diese Abbauprodukte könnten ebenfallseine Auswirkung auf die antioxidative Kapazität haben. Für Ascorbinsäure in Kombination mit Kaf-feesäure oder Ferulasäure wurden im Hinblick auf die antioxidative Kapazität synergistische Effektebeobachtet [Laranjinha und Cadenas, 1999; Trombino et al., 2004]. Für die Anthocyane wurden bisherkaum Synergismen gefunden. Fleschhut et al. [2006] zeigten in ihrer Arbeit vielmehr, dass Cy-3-O-glc und die Protocatechusäure keinen Synergismus aufweisen. Neben der Umsetzung der Anthocyanelaufen weitere Reaktionsmechanismen wie Kondensationsreaktionen oder Copigmentierung ab (sieheauch Abschnitt 4.2.5.3), deren Produkte ebenfalls Einfluss auf die antioxidative Kapazität nehmen.

Die antioxidative Kapazität in Gegenwart von polymeren und komplexierten Anthocyanen

Die komplexierten Anthocyane hingegen weisen nur schwache antioxidative Eigenschaften auf. Damitträgt der im Protein-Anthocyan-Komplex gebundene Anthocyananteil kaum bis gar nicht zur anti-oxidativen Kapazität bei [Arts et al., 2002; Bandyopadhyay et al., 2012]. Vielmehr maskieren diegebundenen Anthocyane die eigentliche antioxidative Kapazität, was sich aus den Ergebnissen für diepräzipitierten Anthocyane schließen lässt. In verschiedenen Studien wurde der Einfluss von polymerenPolyphenolen auf die antioxidative Kapazität untersucht [Vennat et al., 1994; Arteel und Sies, 1999;Rao et al., 2004; Rösch et al., 2004]. Gu et al. [2006] untersuchten Procyanidin in Kakao und zeigten,dass für die Polymere hohe antioxidative Kapazitäten vorliegen. Morel et al. [2014] zeigten in ihrerArbeit mit Medemia Argun Nüssen für die Proanthocyane höhere antioxidative Kapazitäten, als esfür starke Antioxidantien wie Catechin und Epicatechin der Fall ist. Die Bestimmung des polymerenAnteils in den hier analysierten Proben über den Monomerindex zeigte eine Zunahme der polymerenVerbindungen innerhalb der Dickdarmpassage (Abb. 37, 42, 49 und 53). Ob es sich hier um einenvergleichbaren Effekt handelt, muss noch untersucht werden. Obwohl die Anthocyankonzentrationenfür die Kontrolle ähnlich verlaufen wie bei den Ansätzen mit Enzymen und Mikroorganismen, nimmtdie antioxidative Kapazität für alle Kontrollen stetig ab. Aus dieser Beobachtung lässt sich schließen,dass die deutliche Zunahme der antioxidativen Wirkung während der Passage des Dickdarms im Zu-sammenhang mit den Enzymen und Mikroorganismen bzw. deren Reaktionsprodukten steht.

Verlauf der antioxidativen Kapazität während der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung vonQuercetin-3-O-rutinosid (Rutin) im in vitro Verdauungsmodell

Für die Umsetzung mit Rutin unterscheidet sich der Verlauf der antioxidativen Kapazität für Probeund Kontrolle ohne Mikroorganismen und Enzyme während der Magenpassage nicht von dem Ver-lauf der Kurve für die antioxidative Kapazität der Anthocyane. Da das Rutin im Magensegment zumGroßteil präzipitiert vorliegt, ist die antioxidative Wirkung hier für Probe und Kontrolle am nied-rigsten. Beim Übergang in den Dünndarm nimmt mit der Rutinkonzentration auch die antioxidativeWirkung zu. Bis zum Dickdarm verlaufen die Kapazitäten für Probe und Kontrolle ähnlich. Im Dick-darm konnte für die Probe die gleiche Zunahme der antioxidativen Kapazität beobachtet werden, wiees bei den Anthocyanen der Fall war. Bei einem Großteil der Abbauprodukte des Rutins handelt essich um starke Antioxidantien. Der Verlauf der antioxidativen Kapazität für Kontrolle und Ansätzezeigte, dass die Abbauprodukte des Rutins bessere Antioxidantien sind als Rutin selbst (Abb. 57).Diese Eigenschaft beruht vor allem auf den strukturellen Eigenschaften der Abbauprodukte (z.B. desQuercetins) [Rice-Evans et al., 1997; Heim et al., 2002]. In einigen Studien konnte bereits gezeigtwerden, dass die freie Hydroxylgruppe in der 3-Position des C-Ringes einen großen Einfluss auf dieantioxidative Kapazität hat [Rice-Evans et al., 1996; Lien et al., 1999]. Wie schon beim Anthocyanevermindern auch beim Rutin die gebundenen Zucker die Delokalisierung der Elektronen und damitdie antioxidative Kapazität [Tsuda et al., 1994; Gao et al., 1999; Heim et al., 2002]. Noch unklar ist

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Ergebnisse und Diskussion

auch hier, in wieweit Abbauprodukte aus dem Verdauungssaft auf die antioxidative Kapazität Einflussnehmen.

Fazit

Zusammenfassend ergab die Messung der antioxidativen Kapazität trotz Abnahme der Anthocyan-und Rutinkonzentration eine Zunahme der gemessenen Kapazitäten in allen Ansätzen. Bei den An-sätzen mit Anthocyanen scheinen vor allem die polymeren Anthocyane Einfluss auf die Kapazität zunehmen, während beim Rutin die Abbauprodukte die antioxidative Kapazität erhöhen.Ebenfalls zu erwähnen ist, dass in dem vorliegenden Verdauungsmodell zwar die Betrachtung der anti-oxidativen Kapazität in den einzelnen Verdauungsstufen möglich ist, die Bioverfügbarkeit der Analytenjedoch nicht ermittelt werden kann. Rechner et al. [2002] zeigten, dass nach der oralen Aufnahme vonJohannisbeersaft der Anteil an Anthocyanen im Plasma deutlich geringer war, als z.B. Quercetin. Da-bei liegt der Gesamtphenolanteil an Anthocyan im Saft bei 86 %. Die Bioverfügbarkeit der Anthocyaneim Menschen ist schlechter als die für andere Polyphenole. Ackermann [2010] beschäftigte sich in sei-ner Arbeit mit der Bindung von Anthocyanen an das Albumin im Blut, was zu einer Maskierung derAnthocyane für die Analytik führte und somit bei Aussagen über die Bioverfügbarkeit berücksichtigtwerden muss. Zu berücksichtigen bleibt auch, dass die beschriebenen Einzelbeobachtungen aus dem invitro Modell dennoch keine verlässlichen Aussagen über den in vivo Zustand zulassen. Die Zunahmeder antioxidativen Kapazität im Verlauf des Verdauungsmodells ist daher nicht zwangsläufig auf denHumanstoffwechsel übertragbar.

4.3 Umsetzung von Flavonoiden unter aeroben BedingungenNachdem im Darmmodell die Umsetzung von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) unter anaeroben Be-dingungen im simulierten in vitro Verdauungsmodell untersucht wurde, sollte im nächsten Schritt dieUmsetzung unter aeroben Bedingungen untersucht werden. Der Bakterienstamm Rhodococcus erythro-polis DSM 44534 wurde ausgewählt, da dieser Stamm eine Vielzahl von Substanzen metabolisierenkann [Kolouchová et al., 2012].

4.3.1 Metabolisierung von Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) innerhalb der ver-schiedenen Stufen der Enzymaufreinigung aus Rhodococcus erythropolisDSM 44534

4.3.1.1 Metabolisierung von Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) mit ganzen und aufge-schlossenen Zellen von Rhodococcus erythropolis DSM 44534

Rhodococcus erythropolis wurde als Schüttelkultur im 1 l Maßstab mit modifiziertem Minimal-Salz-Medium über 5 Tage bei 37 °C mit 100 µM Rutin (Endkonzentration) als Kohlenstoffquelle (C-Quelle)kultiviert. Die Wachstumskurven für die Rhodococcus erythropolis Zellen mit 100 µMRutin als C-Quelle(Abb. 77) und die Tabelle für den Verlauf der Rutinkonzentration (Tab. 30) befinden sich im Anhang.Die Zellen wurden geerntet, bei 5000 x g abzentrifugiert und mit 0,9 % NaCl gewaschen. Anschließenderfolgte die Umsetzung von 100 µM Rutin (Endkonzentration) durch je 25 mg Zellenmasse pro Ansatz.Nach 4 h Inkubation der Zellen mit 100 µM Rutin in 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 bei 37 °Cwurde Quercetin, ein Abbauprodukt des Rutins, (siehe Abb. 8, Abschnitt 1.7.2), mittels HPLC de-tektiert. Abbildung 58 zeigt die Abnahme des Rutins für die drei Ansätze mit aktiven Zellen und denbeiden Kontrollen sowie die gleichzeitige Zunahme des Quercetins über die 6 h der Biotransformation.Die Abnahme der Rutinkonzentration verlief in allen drei Ansätzen parallel. Nur in den Ansätzen mitaktiven Zellen wurde Quercetin detektiert. Die Abbauprodukte Quercetin-3-O-glucosid (Isoquercetin)und 1,3,5-Trihydroxybenzen (Phloroglucinol) wurden nicht detektiert. Die Daten der Metabolisierungbefinden sich in Tabelle 18.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 58: Konzentrationsverlauf des Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) und des Quercetins währendder Umsetzung von 100 µM Rutin durch Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Zellen in 40 mM Na-triumphosphatpuffer pH 7 über 6 h bei 37 °C im Inkubationsschüttler. Als Referenz wurde ein Ansatz mitautoklavierten Rhodococcus erythropolis Zellen (120 °C, 20 min) und Rutin ohne Zellen in 40 mM NatriumphosphatpufferpH 7 angesetzt und über 6 h bei 37 °C im Inkubationsschüttler inkubiert. Aktiver Ansatz (n = 3), Kontrollen (n = 1)

Tabelle 18: Konzentrationsverlauf von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) und Quercetin während der Um-setzung von 100 µM Rutin durch Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Zellen bei 37 °C im Inkubations-schüttler in 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 über 6 h. Als Referenz wurde ein Ansatz mit autoklaviertenRhodococcus erythropolis Zellen (120 °C, 20 min) und Rutin ohne Zellen in 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 an-gesetzt und über 6 h bei 37 °C im Inkubationsschüttler inkubiert. Aktiver Ansatz (n = 3), Kontrollen (n = 1), SD =Standardabweichung

Zeit [h] Ansatz Rutin [mg/l] SD Rutin Quercetin [µg/l] SD Quercetin

0 h Aktiver Ansatz 55,5 3,6 0,0 0,0Rutin ohne Zellen 53,9Autoklavierte Zellen 56,7

4 h Aktiver Ansatz 54,9 2,3 204,1 38,1Rutin ohne Zellen 53,6Autoklavierte Zellen 57,1

6 h Rutin ohne Zellen 51,0 3,7 361,1 28,6Autoklavierte Zellen 49,7Aktiver Ansatz 53,4

Innerhalb der Versuchsdauer von 6 h nahm die Rutinkonzentration um 4,5 mg/l ab, während in denbeiden Kontrollen (Puffer ohne Zellen mit Rutin und Puffer mit autoklavierten Zellen und Rutin) dieKonzentration erst innerhalb der letzten 2 h des Versuches abnahm. In den Kontrollen (Abb. 58 und59) wurde, wie zuvor bei der physikochemischen Umsetzung im Verdauungsmodell (Abschnitt 4.2.4.1),kein Quercetin gebildet. Innerhalb von 6 h wurden in den Ansätzen mit aktiven Zellen nur 361,1 µg/lQuercetin gebildet. Wie bereits bei der anaeroben Umsetzung, stimmt auch hier die Bilanzierung nichtmit den erwarteten Werten überein.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 59: HPLC-Chromatogramm für die aerobe Umsetzung von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin)zu Quercetin durch ganze Zellen von Rhodococcus erythropolis DSM 44534, gemessen bei 280 nm. DieRhodococcus erythropolis DSM 44534 Zellen wurden in 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 für 6 h bei 37 °C mit100 µM Rutin inkubiert. Das kleinere Bild zeigt den Peak für das Abbauprodukt Quercetin bei 0 h (schwarz) und 6 h(rosa), sowie den Quercetinpeak für die Kontrolle mit autoklavierten Zellen (120 °C, 20 min, blau) und Rutin ohne Zellen(braun) nach 6 h Inkubation.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 60: Konzentrationsverlauf von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) und Quercetin bei der Umset-zung von Rutin im Extrakt der aufgeschlossenen Zellen. 25 mg dialysiertes Protein der Rhodococcus erythropolisDSM 44534 Zellen wurden in 5 ml 40 mM Natriumphhosphatpuffer pH 7 gelöst und mit 100 µM Rutin bei 37 °C über2 h im Inkubationsschüttler inkubiert. (n = 3)

Für die nachfolgenden Untersuchungen wurden weitere Zellen mittels einer Kugelmühle aufgeschlos-sen. Aus dem Extrakt der aufgeschlossenen Zellen wurde das Protein mit 60 % Ammoniumsulfat bei4 - 6 °C gefällt, dialysiert und anschliessend die Umsetzung von 100 µM Rutin mit 5 mg/ml Proteinin 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 untersucht. Im Vergleich zu den ganzen Zellen wurde bereitsnach 45 min Quercetin in den Proben mittels HPLC detektiert (Abb. 60). Innerhalb von 2 h stieg dieKonzentration des Quercetin um 167,4 µg/l an, während die Rutinkonzentration nach 1 h um 9,4 mg/labgenommen hatte und dann konstant blieb (Tab. 19). Weitere Abbauprodukte wurden nicht gefun-den. Auch hier ist die Stoffbilanz nicht ausgeglichen. Die Menge an gebildetem Quercetin stimmt nichtmit der Abnahme der Rutinkonzentration überein.

Tabelle 19: Konzentrationsverlauf von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) und Quercetin während der Um-setzung von 100 µM Rutin durch Extrakt aus aufgeschlossenen Rhodococcus erythropolis DSM 44534Zellen bei 37 °C im Inkubationsschüttler in 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 über 2 h. Als Referenzwurde ein Ansatz mit autoklaviertem Extrakt der aufgeschlossenen Zellen (120 °C, 20 Min) und Rutin ohne Extrakt in40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 angesetzt und über 6 h bei 37 °C im Inkubationsschüttler inkubiert. (n = 3), SD= Standardabweichung, MW = Mittelwert

Zeit [min] Rutin MW [mg/l] SD Quercetin MW [µg/l] SD0 57,4 3,2 85,1 4,415 57,5 1,5 86,9 4,245 56,4 1,0 135,3 6,260 47,3 0,8 154,2 3,8120 48,0 1,5 252,5 4,3

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Ergebnisse und Diskussion

4.3.1.2 Umsetzung des Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) nach der isoelektrischen Fo-kussierung (IEF) des Rhodococcus erythropolis DSM 44534

Die Zellen wurden in modifiziertemMinimal-Salz-Medium (mod. MSM) mit 100 µMRutin als C-Quelle(Endkonzentration) kultiviert, um die Bildung der Rutinase zu induzieren. Nach 10 Tagen wurden 3,6 gZellen (Feuchtgewicht) geerntet (OD620nm 1,7), durch Zentrifugation bei 5000 x g vom Medium ge-trennt und mittels Kugelmühle aufgeschlossen (Bedingungen des Aufschluss siehe Abschnitt 3.7.4). DieProteinfällung aus 186 ml Rohextrakt erfolgte mit 60 % Ammoniumsulfat. Das resolubilisierte Protein(8,6 mg/l) wurde für 12 h gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 6 bei 4 - 6 °C dialysiert. Mit demdialysierten Rohprotein (144,8 mg) wurde eine isoelektrische Fokussierung (IEF) durchgeführt. LautLiteratur liegt der IEP des Rutinase Enzyms aus Penicillium rugulosum bei pH 5 [Narikawa et al.,2000]. Die IEF wurde mit einem Ampholyten von 3 - 10 durchgeführt. Die fünf Fraktionen von pH 5,22bis 6,72 wurden für die Biotransformation von Rutin mittels 10 kDa Vivaspin vollständig aufkonzen-triert, in 400 µl 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 wieder gelöst und mit 100 µl Rutinlösung (1 mM)versetzt. Die Proben wurden 2 h bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Rutin bzw. Quercetin wurdenmittels HPLC-UV analysiert.

Abbildung 61: HPLC-Chromatogramme des Konzentrationsverlaufs des Abbauproduktes Quercetin wäh-rend der Biotransformation über 2 h bei 37 °C mit Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) als Substrat. Für dieBiotransformation wurden die Fraktionen 7 – 11 nach der IEF (Ampholyt 3 - 10) mittels 10 kDa Vivaspin aufkonzentriert,mit 40 mM Natrimphosphatpuffer pH 7 umgepuffert und je 400 µl Probe mit 100 µl Rutin (1 mM Endkonzentration)versetzt. Die Proben wurden im Wasserbad für 2 h bei 37 °C inkubiert. Für die Referenz wurde Puffer mit 14 µl Ampho-lyt versetzt, was der Menge an Ampholyt im Proteinextrakt zu Beginn der IEF entspricht, und nach Zugabe von Rutinebenfalls für 2 h bei 37 °C im Wasserbad inkubiert.

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Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 20: Konzentrationen von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) und Quercetin zu Beginn und Endeder Biotransformation. Für die Biotransformation wurden die Fraktionen 7 – 11 nach der IEF (Ampholyt von 3 - 10)mittels 10 kDa Vivaspin aufkonzentriert, mit 40 mM Natrimphosphatpuffer pH 7 umgepuffert und je 400 µl Probe mit100 µl Rutin (1 mM Endkonzentration) versetzt. Die Proben wurden im Wasserbad für 2 h bei 37 °C inkubiert. DieKonzentrationen wurden mittels HPLC-UV ermittelt.

Rutin Fraktion 7 Fraktion 8 Fraktion 9 Fraktion 10 Fraktion 11 Referenz[mmol/l] [mmol/l] [mmol/l] [mmol/l] [mmol/l] [mmol/l]

0 h 0,940 1,021 1,029 0,995 0,973 1,0602 h 0,935 0,991 0,966 0,848 0,916 1,000AbnahmeRutin

0,005 0,030 0,062 0,147 0,057 0,060

Quercetin0 h 0,003 0,004 0,016 0,017 0,009 0,0022 h 0,012 0,056 0,092 0,148 0,044 0,003ZunahmeQuercetin

0,009 0,052 0,077 0,131 0,036 0,000

Der höchste Umsatz an Rutin fand sich in der Fraktion 10 (pH 6,4, siehe Abb. 61). Die Quercetinkon-zentration nach 2 h Biotransformation lag in dieser Fraktion bei 131 µmol/l (Tabelle 20). Die Bildungvon Quercetin mit aufgeschlossenen Zellen (Abschnitt 4.3.1.1) ergab nach 2 h Inkubation eine maxi-male Zunahme von nur 0,1 µmol/l. In den Fraktionen 9 -11 verlief die Umsetzung in einem annäherndstöchiometrischen Verhältnis. Der Ampholyt aus der IEF nahm keinen Einfluss auf die Umsetzung desRutins zu Quercetin.

Mit der SDS-PAGE wurde die Proteinzusammensetzung der IEF-Fraktionen detailliert untersucht.Von den Fraktionen 3 - 10 wurden je 500 µl mittels Vivaspin 10 kDa auf 20 µl aufkonzentriert und aufein 10 %iges Gel gegeben. Von besonderem Interesse waren hier die Fraktionen 7 - 11 (Abb. 62 und 63),bei denen die Umsetzung von Rutin beobachtet wurde. Im Vergleich zu den Fraktionen 3 - 5 waren indiesen Fraktionen Proteinbanden im Bereich von 74 kDa und niedriger zu finden (Abb. 62). Die Bandebei ca. 48 kDa war in unterschiedlicher Konzentration in allen IEF-Fraktionen mit Rutinaseaktivitätwiederzufinden.

Abbildung 62: SDS-PAGE von Fraktion 3 - 10 der IEF des Proteinextraktes aus Rhodococcus erythropolis.Je 500 µl jeder Fraktion wurden mittels 10 kDa Vivaspin auf 20 µl aufkonzentriert und auf ein 10 %iges Gel gegeben.Das Gel wurde mit Silberfärbung entwickelt.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 63: SDS-PAGE von Fraktion 11 - 18 der IEF des Proteinextraktes aus Rhodococcus erythropolis.Je 500 µl jeder Fraktion wurden mittels 10 kDa Vivaspin auf 20 µl aufkonzentriert und auf ein 10 %iges Gel gegeben.Das Gel wurde mit Silberfärbung entwickelt.

4.3.2 Mykolsäure

4.3.2.1 Einfluss verschiedener C-Quellen auf das Wachstum von Rhodococcus erythro-polis

Bei der Kultivierung von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 wurden verschiedene Verbindungen alsC-Quelle eingesetzt. In den drei Ansätzen wurden Zitronensäure (4 mM), Quercetin-3-O-rutinosid (Ru-tin, 1 mM) und eine Kombination aus beiden Verbindungen als einzige C-Quellen in der Hauptkulturverwendet und die Zelldichte über 7 Tage mittels Photometer bestimmt (Abb. 64). Dem Kontrollan-satz wurde nach der Kultivierung der Vorkultur keine neue C-Quelle hinzugefügt.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 64: Wachstumskurven für Rhodococcus erythropolis DSM 44534 in Minimal-Salz-Medium(MSM) auf verschiedenen C-Quellen. Die Vorkultur wuchs über 4 Tage bei 37 °C im Inkubationsschüttler inmodifiziertem Minimal-Salz-Medium mit 50 mM Ethanol als C-Quelle. Für die Ansätze mit verschiedenen C-Quellenwurden je 100 ml Minimal-Salz-Medium eingesetzt. Die Zelldichte betrug zu Beginn des Versuchs 0,2 OD620nm. AlsC-Quellen wurden Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin, 1 mM) und Zitronensäure (4 mM) einzeln und in Kombination ein-gesetzt. Im Kontrollansatz wurde nach der Vorkultur keine zusätzliche C-Quelle eingesetzt. Die vier Ansätze wurdenüber 7 Tage bei 37 °C im Inkubationsschüttler inkubiert und das Wachstum über die 7 Tage mittels OD620nm verfolgt.(n = 3)

In allen drei Ansätzen erreichten die Zellen nach 3 Tagen ihre stationäre Phase. Im Kontrollansatznahm die Zelldichte innerhalb der ersten zwei Tage geringfügig zu. Im Ansatz mit Rutin als einzi-ger C-Quelle wuchs die Kultur am langsamsten und die Zelldichte lag unterhalb der beiden anderenWachstumskurven. Die höchste Zelldichte wurde in der Kultur die nur auf Zitronensäure wuchs ge-funden, obwohl die Konzentration der Zitronensäure äußerst gering war. Die Wachstumskurve für dieKombination aus Rutin und Zitronensäure verlief nahe der Wachstumskurve mit Rutin als einzigerC-Quelle. Zu Beginn der Kultivierung lag der Mittelwert der pH-Werte für den Ansatz mit Zitronen-säure als einziger C-Quelle bei 6,8 ± 0,02 und am Ende des Wachstums bei 7,1 ± 0,03. Für den Ansatzmit Rutin als einziger C-Quelle lag der pH-Wert zu Beginn bei 7,1 ± 0,03 und am Ende bei 7,1 ± 0,04.Für die Kombination beider C-Quellen wurde ein pH-Wert von 6,7 ± 0,03 zu Beginn des Wachstumsgemessen und am Ende lag der pH-Wert bei 7,0 ± 0,02.

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Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 21: Konzentrationsverlauf des Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) während des Wachstums vonRhodococcus erythropolis DSM 44534 in Minimal-Salz-Medium (MSM) auf verschiedenen C-Quellen. DieVorkultur wuchs über 4 Tage bei 37 °C im Inkubationsschüttler in modifiziertem MSM mit 50 mM Ethanol als C-Quelle.Für die Ansätze mit verschiedenen C-Quellen wurden je 100 ml Minimal-Salz-Medium eingesetzt. Die Zelldichte betrugzu Beginn des Versuchs 0,2 OD620nm. Als C-Quellen wurden Rutin (1 mM) und Zitronensäure (4 mM) einzeln und inKombination eingesetzt. Im Kontrollansatz wurde nach der Vorkultur keine zusätzliche C-Quelle eingesetzt. Die vierAnsätze wurden über 7 Tage mit 37 °C im Inkubationsschüttler inkubiert und der Abbau von Rutin über die 7 Tagemittels HPLC verfolgt. Der Mittelwert (MW) zeigt die Summe der Rutinkonzentration aus Überstand und Präzipitat.(n = 3) SD = Standardabweichung

Proben Zeit [h]Rutin 1 mM 0 24 48 72 96 144 168MW [µg/ml] 443,2 432,9 384,7 383,4 203,6 206,1 207,3SD 11,4 1,1 4,9 3,4 8,0 8,8 5,4

Proben Zeit [h]Rutin + Zitronensäure 0 24 48 72 96 144 168MW [µg/ml] 450,3 406,7 391,2 396,1 335,9 324,9 306,4SD 17,9 68,4 12,3 7,6 57,5 28,8 19,6

Betrachtet man die Rutinkonzentration während der Wachstumsphase zeigt sich, dass die Abnahme inden Kulturen mit Rutin (235,9 µg/ml) als einziger C-Quelle deutlich höher ist, als für die Kombinationaus Rutin und Zitronensäure (143,9 µg/ml, siehe Tab. 21).

4.3.2.2 Ziehl-Neelsen-Färbung

Eine Ursache für das unterschiedliche Wachstumsverhalten der Rhodococcus erythropolis Zellen ist dieVeränderung der Zellhülle, genauer gesagt der Mykolsäuren, welche in der äußeren Zellhülle von gram-positiven Mikroorganismen enthalten sind. Die komplexe Zellhülle besteht aus einem Peptidoglykan-Arabinogalaktan-Polymer und ist kovalent mit langkettigen Fettsäuren, den Mykolsäuren, verknüpft[Hoffmann und Engelhardt, 2009]. Die Ziehl-Neelsen-Färbung eignet sich um die Veränderung derPermeabilität der Zellhülle wiederzugeben. Die Färbung wurde ursprünglich entwickelt, um säurefesteMykobakterien anzufärben. Diese Bakterien besitzen eine extreme Undurchlässigkeit für hydrophileund hydrophobe Stoffe, was durch ihre langsame Nahrungsaufnahme zu einer langen Wachstumsphaseführt. Für den Farbtest wurden die Zellen zuerst mit Karbolfuchsin orange angefärbt und im nächstenSchritt durch ethanolische Salzsäurelösung wieder entfärbt. Alle nicht säurefesten Bakterien werdenaufgrund ihrer durchlässigen Zellhülle wieder durch den Alkohol entfärbt und anschließend durch dieFärbung mit Methylenblau blau eingefärbt. Daher leuchten die säurefesten Bakterien nach der Färbungorange, während die Zellen mit einer durchlässigeren Zellhülle sich blau darstellen. Die Abbildungen65 - 68 zeigen mikroskopische Aufnahmen der angefärbten Zellen aus den drei unterschiedlichen Kulti-vierungsansätzen und der Kontrolle aus Abb. 66. Es ließ sich ein deutlicher Unterschied zwischen denZellen erkennen. Die Zellen der beiden Kulturen, in denen Zitronensäure als C-Quelle enthalten war,zeigten eine deutliche Blaufärbung, welche auf eine Veränderung der Zellhülle hindeutet. Der Aufbauder Zellhülle entspricht hier nicht mehr dem charakteristischen Aufbau der grampositiven Rhodococ-cus erythropolis Zellen, da diese sonst rot gefärbt vorliegen müssten. Im Ansatz mit Rutin als einzigerC-Quelle (Abb. 67) sind die Zellen nach der Färbung rot angefärbt, wie es für Rhodococcus erythropolisund grampositive Bakterien typisch ist. Unter diesen Kultivierungsbedingungen entspricht die Zellhül-lenzusammensetzung von Rhodococcus erythropolis dem charakteristischen Aufbau. Für den Ansatz,der ohne C-Quelle kultiviert wurde, ließen sich kaum Zellen finden, da die optische Dichte sehr geringwar. Die Färbung ergab daher kein eindeutiges Ergebnis (Abb. 68).

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 65: Ziehl-Neelsen-Färbung von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Zellen, die auf Zitro-nensäure kultiviert wurden. Die Zellen wuchsen über 7 Tage in Minimal-Salz-Medium mit 4 mM Zitronensäureals C-Quelle bei 37 °C im Inkubationsschüttler unter aeroben Bedingungen und wurden mittels Ziehl-Neelsen-Färbungeingefärbt. Blaue Färbung = Veränderung der Zellwand

Abbildung 66: Ziehl-Neelsen-Färbung von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Zellen, die auf beidenC-Quellen kultiviert wurden. Die Zellen wuchsen über 7 Tage in Minimal-Salz-Medium mit 4 mM Zitronensäureund 1 mM Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) als C-Quelle bei 37 °C im Inkubationsschüttler unter aeroben Bedingungenund wurden mittels Ziehl-Neelsen-Färbung eingefärbt. Blaue Färbung = Veränderung der Zellwand

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 67: Ziehl-Neelsen-Färbung von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Zellen, die auf Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) kultiviert wurden. Die Zellen wuchsen über 7 Tage in Minimal-Salz-Medium mit 1 mM Rutinals C-Quelle bei 37 °C im Inkubationsschüttler unter aeroben Bedingungen und wurden mittels Ziehl-Neelsen-Färbungeingefärbt. Rote Färbung = säurefeste Zellen, Zellwand nicht verändert

Abbildung 68: iehl-Neelsen-Färbung von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Zellen, die ohne weitere C-Quelle kultiviert wurden. Die Zellen wuchsen über 7 Tage in Minimal-Salz-Medium bei 37 °C im Inkubationsschüttlerunter aeroben Bedingungen ohne zusätzliche C-Quelle (nach der Vorkultur) und wurden mittels Ziehl-Neelsen-Färbungeingefärbt. Blaue Färbung = Veränderung der Zellwand, Rote Färbung = säurefeste Zellen, Zellwand nicht verändert

4.3.2.3 Bestimmung der Mykolsäuren in den Zellhüllen von Rhodococcus erythropolisDSM 44534 Zellen mittels ESI-MS/MS

Um Genaueres über die Zusammensetzung der gesättigten und mehrfach ungesättigten Mykolsäurenin der Zellhülle von Rhodococcus erythropolis zu erfahren, wurden die Zellen, wie im Methodenteilbeschrieben, präpariert und mittels ESI-MS/MS analysiert (Abb. 69). In den Abbildungen 70 - 73wurde der prozentuale Anteil an gesättigten und mehrfach ungesättigten Mykolsäuren dargestellt.Dabei wurden die Meromykolatkette (Hauptkette) und der α-Alkylzweig (Abb. 9, Abschnit 1.8.1) ge-

120

Ergebnisse und Diskussion

trennt voneinander betrachtet. Da es sich bei den Fragmenten um Fettsäuren handelt, wird der BegriffFettsäuren im nachfolgenden Text für die Fragmente verwendet. Die Übergänge einiger ausgewählterMykolsäuren und die dazugehörigen Strukturen befinden sich im Anhang (Abb. 79 - 81).

Abbildung 69: ESI-MS/MS Chromatogramm (Totalionenstrom) der Mykolsäuren in Rhodococcus ertyhro-polis DSM 44534, die auf Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) als einziger C-Quelle kultiviert wurden. DieVorkultur wuchs über 4 Tage bei 37 °C im Inkubationsschüttler in modifiziertem Minimal-Salz-Medium mit 50 mMEthanol als C-Quelle. Die Zellen wurden danach 7 Tage in Minimal-Salz-Medium bei 37 °C im Inkubationsschüttlerinkubiert. Die Proben wurden mittels Festphasenextraktion aufgereinigt.

121

Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 70: Prozentualer Anteil an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren der Meromykolatkettebezogen auf die Gesamtmenge der gefundenen Spezies. Die Vorkultur wuchs über 4 Tage bei 37 °C im Inkubati-onsschüttler in modifizierten Minimal-Salz-Medium mit 50 mM Ethanol als C-Quelle. Die Zellen wurden danach 7 Tagebei 37 °C in Minimal-Salz-Medium im Inkubationsschüttler inkubiert. Das linke Tortendiagramm zeigt die Ergebnissefür die Zellen, welche auf 1 mM Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) wuchsen. Das rechte Diagramm zeigt die Ergebnisse fürdie Zellen, welche auf 4 mM Zitronensäure wuchsen. Die Zusammensetzung der Mykolsäuren wurde mittels ESI-MS/MSuntersucht. (n = 3)

Abbildung 71: Prozentualer Anteil an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren der Meromykolatkettebezogen auf die Gesamtmenge der gefundenen Spezies. Die Vorkultur wuchs über 4 Tage bei 37 °C im Inkubati-onsschüttler in modifizierten Minimal-Salz-Medium mit 50 mM Ethanol als C-Quelle. Die Zellen wurden danach 7 Tagebei 37 °C in Minimal-Salz-Medium im Inkubationsschüttler inkubiert. Das linke Tortendiagramm zeigt die Ergebnisse fürdie Zellen, welche auf 1 mM Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) und 4 mM Zitronensäure wuchsen. Das rechte Diagrammzeigt die Ergebnisse für die Kontrolle. Die Zusammensetzung der Mykolsäuren wurde mittels ESI-MS/MS untersucht.(n = 3)

Bei der Analyse der Mykolsäuren in der Kontrolle (Abb. 71 rechts) wurden in den Zellen von Rho-dococcus erythropolis gesättigte Fettsäuren und ungesättigte Fettsäuren mit 1 - 4 Doppelbindungen

122

Ergebnisse und Diskussion

gefunden. Der Anteil an gesättigten und einfach ungesättigten Fettsäuren lag in der Kontrolle (ohneC-Quelle nach der Vorkultur) bei 41 % bzw 26 %. Mit 15 % war der Anteil an dreifach ungesät-tigten Fettsäuren in der Kontrolle am größten, gefolgt von den zweifach ungesättigten (11 %) undvierfach (7 %) ungesättigten Fettsäuren. Bei der Kontrolle enthielt nur das Medium der Vorkultur alsC-Quellen Zitronensäure und Ethanol. Der Hauptkultur wurden keine weiteren C-Quellen zugesetzt.

Im Vergleich zur Kontrolle, zeigt die Rhodococcus-Kultur auf Zitronensäure als einziger C-Quelle einedeutliche Zunahme der vierfach (15 %) ungesättigten Fettsäuren (Abb. 70 rechts), während der Anteilan zweifach ungesättigten Fettsäuren (12 %) keinen signifikanten Unterschied zeigte. Der Anteil aneinfach (19 %) und dreifach (8 %) ungesättigten Fettsäuren nahm deutlich ab. Bei der Kultivierung mitRutin als einziger C-Quelle lag der Anteil an zweifach ungesättigten Fettsäuren bei 9 % und dreifachungesättigten Fettsäuren bei 8 %, während keine vierfach gesättigten Fettsäuren gefunden wurden.Der Anteil an einfach ungesättigten Fettsäuren war mit 40 % der höchste. Der Anteil an gesättigtenFettsäuren lag mit 43 % nahe an der Kontrolle. Beim Ansatz mit Rutin und Zitronensäure ähnelten dieZusammensetzungen der Fettsäuren denen des Kontrollansatzes. Der Anteil an ungesättigten Fettsäu-ren nahm für einfach und zweifach ungesättigte Säuren zu und für dreifach und vierfach ungesättigteSäuren im Vergleich zu Kontrolle ab, während der Anteil an gesättigten Fettsäuren annähernd gleichblieb. Die deutlichsten Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung wurde für Zitronensäure undRutin als separate C-Quellen gefunden.

Beim Vergleich der Fettsäurezusammensetzung der Zellen nach Kultivierung auf Zitronensäure mitund ohne Rutin (Abb. 70 rechts und 71 links), zeigte sich, dass der prozentuale Anteil an ungesättig-ten Säuren in den Zellen mit Rutin und Zitronensäure (62 %) höher war, als für Zitronensäure alleine(54 %). Die Zellen, denen Zitronensäure und Rutin als C-Quelle zur Verfügung standen, wiesen denzweithöchsten Anteil an einfach (32 %) und dreifach (11 %) ungesättigten Fettsäuren auf. Die Zellenmit Zitronensäure als einziger C-Quelle wiesen den höchsten Anteil an vierfach ungesättigten Säuren(15 %) auf. Der Anteil an einfach (19 %) und dreifach (8 %) ungesättigten Fettsäuren war hier amkleinsten. Für die Zellen mit Rutin als einziger C-Quelle wurden, im Vergleich zur Kombination ausZitronensäure und Rutin, keine vierfach ungesättigten Fettsäuren gefunden. Der prozentuale Anteilan gesättigten Säuren war hier am zweithöchsten (43 %) und an einfach ungesättigten (40 %) Säurenam höchsten.

Der Vergleich der Kultivierung mit 3 verschiedenen C-Quellen zeigte, dass die Zellen mit Rutin alsreiner C-Quelle den höchsten Anteil an einfach ungesättigten Mykolsäuren (40 %) aufwiesen. Für dieKultivierung mit Zitronensäure als C-Quelle lag der Anteil an einfach ungesättigten Mykolsäuren bei19 % und in der Kombination beider C-Quellen bei 32 %. Der höchste Anteil an zweifach (16 %)und dreifach (11 %) ungesättigten Mykolsäuren konnte für die Zellen mit Zitronensäure und Rutin alsC-Quelle festgestellt werden. Vierfach ungesättigte Mykolsäuren waren nur in den Zellen vorhanden,denen Zitronensäure während der Kultivierung zur Verfügung stand. Bei allen Kultivierungen lag dieAnzahl an C-Atomen in der Mykolsäure der Zellen im Bereich von C30 bis C48 (Tab. 32, siehe Anhang).In allen vier Ansätzen war das Verhältnis von geraden zu ungeraden Alkanketten der Fettsäuren an-nähernd gleich (Tab. 32, siehe Anhang).

Die Ergebnisse zeigten, dass in Anwesenheit von Zitronensäure vierfach ungesättigte Säuren gebildetwurden. In Gegenwart von Rutin wurden hauptsächlich einfach ungesättigte und gesättigte Säurengefunden. Bei der Kombination aus Rutin und Zitronensäure wurde auch hier keine Synergie beobach-tet. Bis auf die dreifach ungesättigten Säuren wurden hauptsächlich einfach und zweifach ungesättigteSäuren gefunden.

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Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 72: Prozentualer Anteil an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren in der Nebenkette be-zogen auf die Gesamtmenge der gefundenen Spezies. Die Vorkultur wuchs über 4 Tage bei 37 °C im Inkubati-onsschüttler in modifiziertem Minimal-Salz-Medium mit 50 mM Ethanol als C-Quelle. Die Zellen wurden danach 7 Tagein Minimal-Salz-Medium bei 37 °C im Inkubationsschüttler inkubiert. Das linke Diagramm zeigt die Ergebnisse für dieKontrolle. Das rechte Tortendiagramm zeigt die Ergebnisse für die Zellen, welche auf 1 mM Quercetin-3-O-rutinosid(Rutin) wuchsen. Die Zusammensetzung der Mykolsäuren wurde mittels ESI-MS/MS untersucht. (n = 3)

Abbildung 73: Prozentualer Anteil an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren in der Nebenkette be-zogen auf die Gesamtmenge der gefundenen Spezies. Die Vorkultur wuchs über 4 Tage bei 37 °C im Inkubati-onsschüttler in modifiziertem Minimal-Salz-Medium mit 50 mM Ethanol als C-Quelle. Die Zellen wurden danach 7 Tagebei 37 °C in Minimal-Salz-Medium im Inkubationsschüttler inkubiert. Das linke Diagramm zeigt die Ergebnisse für dieZellen, welche auf 4 mM Zitronensäure wuchsen. Das rechte Tortendiagramm zeigt die Ergebnisse für die Zellen, welcheauf 1 mM Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) und 4 mM Zitronensäure wuchsen. Die Zusammensetzung der Mykolsäurenwurde mittels ESI-MS/MS untersucht. (n = 3)

Bei der Betrachtung der Säuren im α-Alkylzweig zeigte sich ein eindeutigeres Bild als für die Meromy-kolatkette. Für die Rhodococcus-Zellen in der Kontrolle wurden nur gesättigte Säuren gefunden (Abb.72 links). Wuchsen die Kulturen auf Rutin als einziger C-Quelle, fand sich dort ein geringer Anteil

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Ergebnisse und Diskussion

an einfach ungesättigten Fettsäuren (3 %) (Abb. 72 rechts). Wuchsen die Zellen auf Zitronensäuremit Rutin stieg der Anteil an einfach ungesättigten Säuren auf 12 % an (Abb. 73 rechts). Neben deneinfach ungesättigten Säuren wurden auch zweifach (3 %) und dreifach ungesättigte Fettsäuren (6 %)detektiert. In den Zellen der Kultivierung mit Zitronensäure als einziger C-Quelle lag der Anteil aneinfach ungesättigten Säuren bei 19 % und der Anteil an zweifach und dreifach ungesättigten Säurenbei je 3 %. Wie zuvor bei der Meromykolatkette nahm der Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäu-ren in Gegenwart von Zitronensäure deutlich zu. Im Vergleich zur Meromykolatkette konnte auch hierkeine gegenseitige Beeinflussung von Rutin und Zitronensäure beobachtet werden.

Da es keinen geeigneten Standard der Mykolsäure käuflich zu erwerben gab, bezieht sich die berech-nete Menge an Mykolsäure pro mg Zellen auf den internen Standard (Nonansäure) und ist nicht alsabsoluter Wert zu verstehen. Die berechneten Werte ermöglichten allerdings einen guten Überblicküber die gebildete Menge an Mykolsäure in den verschiedenen Ansätzen.

Die Gesamtmenge an Mykolsäuren lag in den Zellen für den Ansatz ohne C-Quelle bei 0,89 ± 0,11 ng/mg,für die Zellen mit Zitronensäure bei 7,43 ± 1,93 ng/mg, für die Zellen mit Rutin bei 38,60 ± 4,28 ng/mgund für die Zellen mit Rutin und Zitronensäure bei 5,08 ± 0,36 ng/mg. Die höchste Konzentrationlag in den Zellen mit Rutin als C-Quelle vor. Die zweithöchste Konzentration konnte bei den Zellenmit Zitronensäure nachgewiesen werden. Bei der Kombination aus den beiden C-Quellen ist die Kon-zentration deutlich geringer als für Rutin alleine und auch unterhalb der gefundenen Konzentrationfür Zitronensäure. Obwohl bei allen Ansätzen die gleiche Menge an Zellen aufgearbeitet wurde, ist derAnteil an Mykolsäure in den Zellen der Kontrolle am geringsten.

4.3.3 Diskussion der mikrobiellen Umsetzungen der Flavonoide am Beispiel vonQuercetin-3-O-rutinosid (Rutin) unter aeroben Bedingungen durch Rhodo-coccus erythropolis DSM 44534 und die Auswirkung des Quercetin-3-O-rutinosids auf die Zellhülle

4.3.3.1 Enzymatische Umsetzung von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) durch die Ru-tinase

Die anaerobe bakterielle Umsetzung der Flavonoide, speziell des Rutins, wurde im zweiten Teil der Ar-beit im Zusammenhang mit den Metabolisierungsversuchen im simulierten in vitro Verdauungsmodellbetrachtet. Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit geht es um den aeroben mikrobiellen Katabolismusder Flavonoide. Für die Untersuchungen wurde Rhodococcus erythropolis DSM 44534 ausgewählt. DerRhodococcus erythropolis DSM 44534 gehört zu den sehr langsam wachsenden Bakterien. Seine säu-refeste Zellwand besteht aus einer Mykolsäureschicht, die eine extreme Undurchlässigkeit gegenüberhydrophilen und hydrophoben Stoffen bewirkt, so dass es bei diesen Bakterien zu einer langsamenNahrungsaufnahme und einem langsamen Wachstum kommt. Die Generationszeiten sind besonderslang, bis über 24 Stunden [Aktories et al., 2004]. Um eine ausreichende Menge an Zellen zu gewinnen,wurde deshalb eine Kultivierungszeit bis zu 10 Tagen gewählt. Durch das Wachstum des Rhodococcuserythropolis DSM 44534 auf Rutin als C-Quelle wurde die Bildung einer Rutinase induziert, die Rutindurch intrazelluläre Prozesse in Quercetin metabolisieren kann. Die Umsetzung des Rutins erfolgtezum einen mit ganzen Zellen zum anderen mit Zellextrakt der aufgeschlossenen Zellen in zwei verschie-denen Stufen der Proteinaufreinigung (1. gefällter und dialysierter Extrakt; 2. gefällter, dialysierterExtrakt nach der IEF). In allen drei Versuchsansätzen konnte die Umsetzung von Rutin zu Quercetinbeobachtet werden. Die Kontrollen wiesen kein Quercetin auf, was nicht auf einen Abbau durch phy-sikochemische Einflüsse, sondern durch Stoffwechselprozesse in der Zelle hindeutet. Bis dato wurdeder Katabolismus von Flavonolen in Bakterien nur von Merkens et al. [2007] mit Streptomyces sp.untersucht. Merkens et al. [2007] beschränkten sich dabei allerdings auf die Umsetzung des Quercetinsund nicht des Rutins. In den Arbeiten von Hay et al. [1961] sowie Westlake et al. [1959] wurde dieRutinase aus Aspergillus flavus erstmals erwähnt. Der Abbauweg des Rutins mit allen Abbauproduk-ten wurde in den 50er Jahren in Schimmelpilzen ausführlich untersucht [Hattori und Noguchi, 1959;Westlake et al., 1959; Simpson et al., 1960]. In den Arbeiten von Westlake et al. [1959] und Narikawa

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Ergebnisse und Diskussion

et al. [2000] wurde das Enzym beschrieben, welches das Rutin zu Quercetin und Rutinose abbaut. Esgelang das Enzym vollständig aufzureinigen. Neben den Untersuchungen in Schimmelpilzen wurdenrutinabbauende Enzyme vor allem in Pflanzen eingehender betrachtet. Yasuda und Nakagawa [1994]gelang die Isolierung des Enzyms aus Buchweizen. Die Umsetzung von Flavonolen mit Enzymen ausBuchweizen ist Bestandteil einiger aktueller Arbeiten [Quettier-Deleu et al., 2000; Suzuki et al., 2005;Li et al., 2012].

Aktivitätstest mit ganzen Zellen und im dialysiertem Zellextrakt der aufgeschlossenen Zellen

Hay et al. [1961] und Narikawa et al. [2000] diskutieren in ihren Arbeiten über die Klassifizierung derRutinase als extrazelluläres Enzym. Eigene Aktivitätstests mit dem Überstand des Kultivierungsmedi-ums nach 5 Tagen (Ergebnisse nicht gezeigt) haben keine Hinweise auf eine extrazelluläre Umsetzungvon Rutin ergeben. Vielmehr deuteten die Ergebnisse des Aktivitätstests mit ganzen Zellen darauf hin(Abb. 58, Tab. 18), dass es sich um ein intrazelluläres Enzym handelt. Erst nach 4 h wurde bei derUmsetzung mit ganzen Zellen Quercetin mittels HPLC detektiert. Die Inkubationszeit von 4 h deutetdarauf hin, dass das Rutin für die Umsetzung erst ins Innere der Zelle gelangen musste, um dann me-tabolisiert zu werden. Wie schon weiter oben in Abschnitt 4.3.3.1 und in Abschnitt 1.8 beschrieben,besitzt die Zellhülle des Rhodococcus erythropolis DSM 44534 einen besonderen Aufbau. Durch diedicht gepackte Mykolsäureschicht entsteht eine Permeabilitätsbarriere, die den langsamen Transportder Substanzen bedingt. Auf die Mykolsäureschicht wird in Abschnitt 4.3.3.2 und 4.3.3.3 noch nähereingegangen. Beim Vergleich der Ansätze mit intakten Zellen zur Kontrolle in Bezug auf die Abnahmedes Rutins über 6 h zeigte sich ein paralleler Verlauf der Rutinkonzentrationen (Abb. 58). Es konntenur in den Ansätzen mit intakten Zellen Quercetin detektiert werden.Der Aktivitätstest mit aufgeschlossenen Zellen ergab bereits nach 45 min einen Anstieg der Querce-tinkonzentration (Abb. 60, Tab. 19). Bei der Variation der Proteinmenge im Aktivitätstest zeigte sich,dass eine Konzentration von 5 mg/ml nötig war, um eine Umsetzung des Rutins zu bewirken. In denKontrollen (Rutin in Puffer und autoklavierte Zellen sowie autoklavierter Extrakt der aufgeschlosse-nen Zellen) konnte eine physikochemisch bedingte Abnahme des Rutins beobachtet werden (siehe auchAbschnitt 4.2.5.2). In den Kontrollen wurde kein Quercetin detektiert.Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die Bildung des Quercetins enzymatisch durch Rhodococcus ery-thropolis DSM 4453 bedingt ist. Wie schon bei der anaeroben Umsetzung in Abschnitt 4.2.5.2 istauch hier die stöchiometrische Stoffbilanz nicht ausgeglichen. Das kann zum einen an der längerenTransferzeit der Abbauprodukte aus den ganzen Zellen liegen, zum anderen könnte das Quercetin, wiein Abschnitt 4.2.5.4 bereits diskutiert, Protein-Polyphenol-Wechselwirkungen eingehen. Dabei werdendie Flavonole durch kovalente Bindungen oder Wasserstoffbrückenbindungen an die Proteine gebun-den, wobei ein schwer löslicher Protein-Flavonol-Komplex entsteht. Die gebundenen Flavonole sindfür die Analytik maskiert und werden während der HPLC-Messungen nicht erfasst. Die Ergebnissekönnten möglicherweise durch unentdeckte Störeffekte der Proteine in der Matrix beeinflusst sein. Esist nicht auszuschließen, dass bisher unbekannte Reaktionen ablaufen, deren Reaktionsprodukte nichterfasst wurden. Es ist zudem denkbar, dass der Rhodococcus neben der Rutinase auch das EnzymQuercetinase bildet, welches das Quercetin zu einem Depsid der Protocatechusäure und der Phloro-glucincarbonsäure (Abb. 8) metabolisiert. Die Ergebnisse der Aktivitätstests mit den ganzen Zellenund dem dialysierten Zellextrakt unterstützen diese Annahme. Die Quercetinase ist bisher bekanntaus 5 verschiedenen Schimmelpilzen: Aspergillus flavus [Simpson et al., 1963; Oka et al., 1971; Oka undSimpson, 1972], A. niger [Hund et al., 1999], A. jasponicus [Fusetti et al., 2002; Kooter et al., 2002],Penicillium decumbens [Mamma et al., 2005] und P. olsonii [Tranchimand et al., 2008]. Der IEP derQuercetinase lag für Aspergillus flavus bei 4,12, für A. niger bei 4,04 und für P. olsonii bei 5,55 - 6,07.Das Molekulargewicht der Quercetinase lag bei den 5 Bakterienstämmen zwischen 45 und 140 kDa. Indiesem Molekularbereich konnten Proteinbanden in den SDS-PAGES für die Proteinfraktionen nachder IEF gefunden werden (siehe Abb. 62 und 63 sowie Aktivitätstest in den aufkonzentrierten IEF-Fraktionen).

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Ergebnisse und Diskussion

Aktivitätstest in den aufkonzentrierten IEF-Fraktionen

Für die teilweise Enzymreinigung durch isoelektrische Fokussierung (IEF) wurde der Ampholyt pH 3/10ausgewählt. Die IEF-Fraktionen wurden aufkonzentriert und umgepuffert, um eine Beeinflussung derunterschiedlichen pH-Werte während des Aktivitätstests zu vermeiden. Es zeigte sich, dass in derFraktion mit einem pH-Wert von 6,4 die höchste Rutinaseaktivität gefunden werden konnte (Abb. 61,Tab. 20). Nach Zugabe des Rutins wurden die Proben für die HPLC-Messung zentrifugiert und einge-froren. In dieser kurzen Zeit hat sich bereits Quercetin gebildet, was die hohe Quercetinkonzentrationin den Ausgangsproben aller Fraktionen erklärt (Tab. 20). Durch die schnelle Umsetzung konnte dieexakte Ausgangskonzentration des Rutins nicht ermittelt werden. Die Biotransformation des Rutinszu Quercetin zeigte in den IEF-Fraktionen 9 - 11 einen annähernd stöchiometrischen Verlauf. In denFraktion 7 - 8 wurde hingegen weniger Rutin abgebaut als Quercetin gebildet. Zum einen lässt sich diesmit der nicht exakten Ausgangskonzentration für das Rutin in der 0 h Probe erklären. Zum anderenliegen die Messwerte in den Fraktionen 7 und 8 in einem sehr kleinen Konzentrationsbereich. Da essich hier aufgrund der geringen Probenmenge um Einzelmessungen handelt, lässt sich keine Aussageüber die Messfehler und die damit verbundene Standardabweichung treffen. Der Proteingehalt in deneinzelnen Fraktionen konnte nicht bestimmt werden, da immer die vollständige IEF-Fraktion für dieUntersuchung der Rutinaseaktivität benötigt wurde.Beim Vergleich der Ergebnisse für die Rutinaseaktivität der IEF-Fraktionen mit denen aus Publikatio-nen konnten sowohl Unterschiede als auch Gemeinsamkeiten aufgezeigt werden. Für die Rutinase ausPenicillium rugulosum IFO 7242 [Narikawa et al., 2000] wird der IEP bei pH 5 beschrieben, währendbei Rhodococcus erythropolis DSM 44534 unter Verwendung des Ampholyten 3/10 der IEP bei 6,4 lag.Die anschließenden Untersuchungen der IEF-Fraktionen (pH 5,2 bis 6,7) zeigten in der SDS-PAGEProteinbanden (Abb. 62 und 63) von 48 kDa bis 74 kDa in den IEF-Fraktionen 9 - 10. Yasuda undNakagawa [1994] sowie Hay et al. [1961] und Narikawa et al. [2000] beschrieben in ihren Arbeiten dasRutin abbauende Enzym mit einem Molekulargewicht von 69 kDa bis 85 kDa. Da die Rutinase ausRhodococcus erythropolis durch IEF nur teilweise aufgereinigt werden konnte, ist die exakte Zuordnungder Molekulargewichtsbanden zur Aktivität nicht möglich. Einige der gefundenen Proteinbanden lagenim Literatur beschriebenen Bereich. Es kann zudem nicht ausgeschlossen werden, dass der Aufbau derRutinase abweicht vom Aufbau des Enzyms im Schimmelpilz Penicillium rugulosum. Für die Rutinaseaus Penicillium rugulosum IFO 7242 fand Narikawa et al. [2000] ein pH-Optimum von pH 2,2. Leiderkonnte die Rutinase aus Rhodococcus nicht vollständig aufgereinigt und biochemisch charakterisiertwerden.Narikawa et al. [2000] zeigten in ihrer Arbeit, dass ihr aufgereinigtes Enzym ein Homotetramer miteiner molaren Masse von über 245 kDa ist. Es ist daher möglich, dass auch die Rutinase aus Rho-dococcus erythropolis DSM 44534 ein Tetramer ist, das während der isoelektrischen Fokussierung inUntereinheiten zerfällt, was zum Verlust der Aktivität führen kann. Die Quartärstruktur (räumlicheStruktur) und Sequenz der Rutinase aus Rhodococcus erythropolis müssen in nachfolgenden Untersu-chungen analysiert werden.Überdies handelt es sich hier um ein Substrat induziertes Enzym. Sowohl das Substrat, als auch leichteAbweichungen in den Wachstumsparametern, können sich auf die Bildung des Enzyms auswirken.

Fazit

Zusammenfassend wird festgestellt, dass durch das Wachstum des Rhodococcus erythropolis DSM 44534auf Rutin als C-Quelle die Bildung einer Rutinase induziert wird, die Rutin intrazellulär in Querce-tin metabolisieren kann. Die durch isoelektrische Fokussierung gewonnene Rutinase weist einen IEPvon 6,4 auf und hat ein Molekulargewicht zwischen 48 und 74 kDa. Im Zusammenhang mit weiterenArbeiten am Rhodococcus erythropolis DSM 44534 konnte gezeigt werden, dass bei vorhandener Ru-tinaseaktivität andere Enzyme des Rhodococcus erythropolis [Martinez-Roja, 2007] inaktiviert werden.Weitere Untersuchungen dazu werden derzeit von Martinez-Rojas durchgeführt (persönliche Mittei-lung, 2013).

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Ergebnisse und Diskussion

4.3.3.2 Einfluss unterschiedlicher C-Quellen auf das Wachstum und die Permeabilitätder Zellhülle von Rhodococcus erythropolis DSM 44534

Die Struktur von mykobakteriellen Zellhüllen ist seit einigen Jahren, besonders im Hinblick auf dasMycobacterium tuberculosis [Hoffmann und Engelhardt, 2009; Langford et al., 2011], Gegenstand zahl-reicher Untersuchungen. Rhodococcus erythropolis DSM 44534 gehört zur Familie der Mykobakterienund ist ein grampositives Bakterium, dessen Säure resistente und hydrophobe Zellwand aus einemPeptidoglykan-Arabinogalaktan-Skelett besteht, in das die Mykolsäure kovalent gebunden ist [Sutclif-fe, 1998; Sokolovská et al., 2003]. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich unter anderem mit demEinfluss der C-Quellen auf die Permeabilität der Zellen und die damit verbundene Veränderung derZusammensetzung der Mykolsäuren. Die Gattung Rhodococcus ist bekannt für ihre Fähigkeit, auchungewöhnliche C-Quellen, z.B. Dieselöl [Lee et al., 2005] oder Petroleum [Cheung und Kinkle, 2001],zu verstoffwechseln. Die Wachstumskurven von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 auf unterschied-lichen C-Quellen (Abb. 64) zeigten, dass der Mikroorganismus sowohl auf geringen Mengen Zitro-nensäure als auch Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) als einziger C-Quelle wachsen kann, wobei dieAnwesenheit von Zitronensäure zu einer höheren Zelldichte führte. Bisher wurden Zitronensäure undRutin nicht als alleinige C-Quellen eingesetzt. Normalerweise wurde Ethanol als C-Quelle verwendet.

Wachstumsverhalten des Rhodococcus erythropolis DSM 44534 auf verschiedenen C-Quellen

Das Genom des Rhodococcus ist eines der größten für die grampositiven Bakterien, das ein hohesPotential an genetischen Modifikationen bietet und somit erhebliche Variationen des Metabolismuserlaubt, meist phänotypisch bedingt [Kolouchová et al., 2012]. Bei den hier eingesetzten C-Quellenhandelte es sich um das wasserunlösliche Rutin und die wasserlösliche Zitronensäure. Sokolovská et al.[2003] stellten in ihrer Arbeit dar, dass die Zellwand für hydrophobe Moleküle durchlässiger wird, wenndie Bakterien auf hydrophoben Molekülen kultiviert werden. Daraus resultiert, dass der Transport vonhydrophilen Molekülen erschwert wird. Über die Struktur der Mykolsäuren wurden allerdings keineAussagen getroffen. Dieses Ergebnis konnte nur teilweise bestätigt werden. Die Wachstumskurve für dieKultivierung mit Rutin als einziger C-Quelle und die Kombination aus Rutin und Zitronensäure verlie-fen annähernd gleich. Durch Kombination der beiden C-Quellen konnte kein synergistischer Effekt aufdas Wachstumsverhalten (Abb. 64) beobachtet werden. Beim Vergleich des Konzentrationsverlaufesvon Rutin in den Kultivierungsansätzen mit und ohne Zitronensäure (Tab. 21) wurde ersichtlich, dassdie Konzentration an Rutin ohne Zitronensäure deutlich stärker abnahm als im Kultivierungsansatzmit beiden C-Quellen. Der Anteil an Zitronensäure im Medium vermindert die Verstoffwechselung desRutins um fast die Hälfte (32 % statt 53 %). Das bedeutet, dass sich die hydrophobe und die hy-drophile Komponente des Mediums gegenseitig beim Transport in die Zelle behindern. Die deutlicheAbnahme der Rutinkonzentration (Tab. 21) in beiden Kultivierungsansätzen (Rutin allein und Rutin+ Zitronensäure) zwischen 24 h und 48 h deutet darauf hin, dass nach einem Zeitraum von 24 h dieRutinase induziert wurde und die Verstoffwechselung des Rutins durch die Zellen begonnen hat. DieInduzierung des Enzyms wurde durch Zitronensäure weder unterbunden noch verzögert. Der geringeAnstieg der Wachstumskurve bei der Kontrolle kann auf die C-Quelle aus der Vorkultur zurückgeführtwerden, die noch nicht vollständig verbraucht wurde. Nach erfolgter Induzierung der Rutinase setztauch das Wachstum verstärkt ein (siehe Abb. 64).

Ziehl-Neelsen-Färbung

Die Ziehl-Neelsen-Färbung der Zellen, welche auf verschiedenen C-Quellen gewachsen sind, zeigte eineVeränderung der Zellhülle in Gegenwart von Zitronensäure. Alle Zellen, die in Gegenwart von Zitro-nensäure gewachsen sind, ließen sich bei der Ziehl-Neelsen-Färbung blau anfärben (Abb. 65 und 66),was für säure resistente Bakterien nicht der Fall sein dürfte. Da die Zelldichte im Kontrollansatz sehrgering war, sind in der Abbildung 68 nur vereinzelt Zellen zu sehen. Eine eindeutige Aussage über dieFärbung der Zellen ist daher in der Kontrolle schwierig. Zellen, die auf Rutin wuchsen, waren nachder Färbung rot eingefärbt, wie es für den Rhodococcus erythropolis DSM 44534 typisch ist. Die roteFärbung stammt von Karbolfuchsin, mit dem die Zellen im ersten Schritt der Ziehl-Neelsen-Färbung

128

Ergebnisse und Diskussion

behandelt wurden. Das Karbolfuchsin wurde bei der anschließenden Spülung der Zellen mit ethano-lischer Salzsäurelösung nicht wieder entfärbt und daher anschließend auch nicht mit Methylenblauangefärbt. Die Permeabilität der Zellen hat sich durch Rutin als C-Quelle nicht verändert. Wuchsendie Zellen auf einer Kombination aus beiden C-Quellen, sind keine roten Zellen nachweisbar. Das glei-che Ergebnis wurde mit Zitronensäure als einziger C-Quelle beobachtet. Zitronensäure hat vermutlicheinen größeren Einfluss auf die Zellhüllenzusammensetzung bzw. Synthese der Mykolsäuren und damitauch auf die Permeabilität der Zellhülle. Die blaue Färbung der Zellen wird beim Ziehl-Neelsen-Testals ein Hinweis auf das Fehlen von Mykolsäure deklariet. In Gegenwart der Mykolsäuren bildet sichein wachsartige Schicht, welche die Färbung mit Methylenblau eigentlich verhindert. Für die Ansätzemit Zitronensäure ließen sich die Zellen trotz Mykolsäure blau anfärben. Während die Färbemethodeauf eine mögliche Veränderung der Zellhüllenzusammensetzung hindeutet, belegen die Ergebnisse derLC-MS Messungen diese Annahme (Abschnitt 4.3.2.3 und 4.3.3.3).Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen von Sokolovská et al. [2003] für Rhodococcus erythro-polis E1 überein. Sie verwendeten in ihren Arbeiten Acetat als einzige C-Quelle und ermittelten inden Zellen aus der stationären Wachstumsphase sowohl die oben beobachtete Blaufärbung als auchdie Anwesenheit von Mykolsäure mittels GC-MS Analyse.

Fazit

Die Ergebnisse für den Farbtest zeigten, dass sich die Permeabilität der Zellhülle durch das Wachstumauf unterschiedlichen C-Quellen beeinflussen lässt. Während das hydrophobe Rutin keine Veränderun-gen an der Permeabilität der Rhodococcus erythropolis Zellen zeigte, nahm die Zitronensäure deutlichenEinfluss auf die Zusammensetzung der Zellhülle. Die Zellen mit Zitronensäure als C-Quelle ließen sichblau anfärben, was für säureresistente Zellen bei der Ziehl-Neelsen-Färbung nicht eintreten sollte. DieVeränderung der Permeabilität hängt mit den Mykolsäuren in der Zellhülle zusammen, die die äußerePermeabilitätsschicht bilden. Durch die Veränderung der Zellhülle wird der Transfer der C-Quellenin die Zelle erleichtert. Der Effekt von Rutin und Zitronensäure auf die Zellhülle verläuft gegensätz-lich. Dabei nimmt die Zitronensäure größeren Einfluss auf den Aufbau der Zellhülle, denn die Zellensind für Rutin und Zitronensäure in Kombination als C-Quelle blau gefärbt (Abb. 66). Die gerin-ge Permeabilität der Zellen mit Rutin als einziger C-Quelle könnte die deutlich flacher verlaufendeExponential-Phase des Zellwachstums (Abb. 65) erklären.Weitere Arbeiten beschäftigen sich mit dem Einfluss unterschiedlicher C-Quellen auf die Permeabi-lität der Zellen, insbesondere wird der Zusammenhang Permeabilität und Struktur sowie Gehalt anMykolsäure betrachtet [Stratton et al., 2002, 2003; Hsu et al., 2011; Kolouchová et al., 2012]. Eswurde ebenfalls ein Einfluss der C-Quellen auf den Aufbau der Zellhülle bzw. der Variationen derMykolsäuren und die erhöhte Permeabilität der Zellhülle gefunden.

4.3.3.3 Aufbau der Mykolsäuren in der Zellhülle von Rhodococcus erythropolis DSM44534 durch Variation der C-Quellen

Die ESI-MS/MS-Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein Zusammenhang zwischen den ungesättigtenMykolsäuren und der Permeabilität der Rhodococcus erythropolis Zellen besteht. In den Zellen, de-nen nur Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) als C-Quelle zur Verfügung stand, wurden hauptsächlichgesättigte und einfach ungesättigte Säuren in der Meromykolatkette gefunden (83 %, Abb. 70, links).In Gegenwart von Zitronensäure als einziger C-Quelle oder in Kombination mit Rutin nahm derprozentuale Anteil an mehrfach ungesättigten Säuren in der Meromykolatkette deutlich zu (Abb. 71).Auffällig waren hier vor allem die vierfach ungesättigten Mykolsäuren, die nur in Gegenwart von Zitro-nensäure in den Zellhüllen gefunden wurden. Bei der Betrachtung der Ergebnisse für den α-Alkylzweigzeigte sich ein ähnliches Bild. Während in Gegenwart von Rutin neben den gesättigten Säuren nur 3 %ungesättigte Säuren (einfach ungesättigte) gebildet wurden (Abb. 72, rechts), nahm das Spektrum anmehrfach ungesättigten Säuren im α-Alkylzweig in Gegenwart von Zitronensäure deutlich zu (21 % mitRutin + Zitronensäure, 23 % mit Zitronensäure, Abb. 73). In der Literatur wurde bisher kaum auf dieungesättigten Säuren des α-Alkylzweiges eingegangen. Inwieweit die gesättigten bzw. ungesättigtenMykolsäuren die Permeabilität beeinflussen, ist zu diesem Zeitpunkt noch nicht bekannt. Nach dem

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Ergebnisse und Diskussion

Modell von Minnikin [Minnikin, 1982, 1991] (Abb. 10) sind für die Zellhüllen sowohl der α-Alkylzweigund der proximale Teil der Meromykolatkette der einzelnen Mykolsäure als auch die verschiedenenMykolsäuren in der äußeren Schicht dicht aneinander gepackt. Je mehr Doppelbindungen in der Mero-mykolatkette oder dem α-Alkylzweig enthalten sind, umso stärker beeinflussen sich die Mykolsäurensterisch gegenseitig. Diese Beeinflussung kann dazu führen, dass die kompakte Struktur aufgebrochenund somit die Permeabilitätsbarriere aufgelockert wird. Die Zellhüllen wirken nun nicht mehr so effek-tiv als Barriere gegen hydrophile Substanzen. Eine Auflockerung der Permeabilitätsschicht könnte aucheine Freilegung von Proteinen zur Folge haben, was den Transfer in die Zelle deutlich erleichtern würde.

Einfluss der ungesättigten Fettsäuren auf die Permeabilität der Zellhülle

Wie bereits in Abschnitt 1.8.3.3 erwähnt, wird angenommen, dass die längere Meromykolatkette ausder gepackten Schicht der Permeabilitätsbarriere herausragt. Die Leerräume, welche durch die ver-schieden langen Fettsäuren der Mykolsäure entstehen (Abb. 10), werden durch verschiedene Lipideund verkapselte Polysaccharide aufgefüllt [Puech et al., 2001]. Bisher konnte noch nicht geklärt wer-den, welchen weiteren Einfluss die Lipide und Polysaccharide in den Leerräumen auf die Barrierehaben [Sutcliffe et al., 2010]. Weist die längere Meromykolatkette eine Vielzahl an Doppelbindungenauf, kann sich der Leerraum durch die sterische Veränderung der Meromykolatkette soweit verändern,dass die Lipide und Polysaccharide nicht mehr in die Leerräume gelangen können. Dadurch werdendie bestehenden Leerräume in der Permeabilitätsbarriere nicht mehr aufgefüllt und bleiben bestehen.Die äußere Permeabilitätsschicht ist nicht mehr vollständig geschlossen, was zu einer Schwächung derBarrierefunktion der Zellhülle führt und den Substanzen das Eindringen in die Zelle erleichtern könn-te. Weitere Studien sollten sich mit der Zusammensetzung der Mykolsäuren, welche auf untypischeC-Quellen gewachsen sind, beschäftigen. Denn trotz zahlreicher Untersuchungen der letzten Jahre, be-steht zum Einfluss verschiedenster C-Quellen auf die Permeabilität und Stabilität der Zellhüllen vonMykobakterien weiterer Forschungsbedarf. In diesem Zusammenhang sollten vor allem die Mykolsäu-ren und deren Beitrag zur Stabilität und Permeabilität der Zellhülle von Mikroorganismen untersuchtwerden.

Gesamtmenge an gebildeten Mykolsäuren auf verschiedenen C-Quellen

Die Gesamtmenge an Mykolsäure pro mg Zellen (bezogen auf den internen Standard) war bei einerKultivierung mit Rutin als einziger C-Quelle 5- fach höher (38,55 ± 4,28 ng/mg) als mit Zitronen-säure (7,43 ± 1,93 ng/mg) als einziger C-Quelle. Dabei war die Wachstumsrate für die Zellen mitZitronensäure als C-Quelle von allen drei Kultivierungsansätzen die höchste (Abb. 64). Der geringereAnteil an Mykolsäuren scheint, ähnlich wie die Struktur (siehe oben), die Aufnahme der Zitronensäu-re zu erleichtern, was wiederum zu einer erhöhten Zelldichte führt. Für die Kombination aus beidenC-Quellen war die berechnete Menge an Mykolsäure am kleinsten (5,08 ± 0,36 ng/mg). Bereits dieWachstumskurve (Abb. 64) zeigte eine gegenseitige Beeinflussung der beiden C-Quellen. Derzeit lässtsich noch nicht mit Sicherheit sagen, ob die Struktur oder die Konzentration der Mykolsäuren dengrößeren Einfluss ausübt.

Geradzahlige und ungeradzahlige Mykolsäuren

Zusätzlich zu den gesättigten und ungesättigten Mykolsäuren stellten Sokolovská et al. [2003] Zu-sammenhänge zwischen der Anzahl an geraden (z.B. C6, Zitronensäure) bzw. ungeraden (z.B. C7)C-Ketten der C-Quelle und der entstehenden Mykolsäure her. In seinen Arbeiten untersuchte er dieMykolsäurezusammensetzung der Zellhülle von Rhodococcus erythropolis E1 nach der Kultivierungauf verschiedenen C-Quellen. Dazu wurde das Bakterium auf verschiedenen Carbonsäuren (C2 bis C7)und gesättigten n-Alkanen (C9 bis C15) als C-Quellen kultiviert. Die gebildeten Mykolsäuren in deneinzelnen Ansätzen wurden mittels HPLC-MS analysiert. Dabei fanden Sokolovská et al. [2003] keineungeradzahligen Mykolsäure-Einheiten, wenn die Zellen von Rhodococcus erythropolis E1 auf linea-ren hydrophoben und hydrophilen Substraten mit einer geraden Anzahl an C-Atomen gewachsen sind.

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Ergebnisse und Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde Rhodococcus erythropolis DSM 44534 auf Zitronensäure und Rutin(einzeln und in Kombination) als C-Quelle kultiviert und anschließend mittels ESI-MS/MS analysiert.Die Ergebnisse zeigten (Tab 30), dass das Verhältnis von ungeradzahligen zu geradzahligen Mykol-säuren für alle drei Kultivierungsansätze und die Kontrolle (ohne C-Quelle nach Vorkultur) immerannähernd gleich blieb. Die Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass die Anzahl an geraden undungeraden C-Ketten der C-Quellen keinen Einfluss auf die Struktur der Mykolsäuren hat, da für ge-radzahlige Zitronensäure (C6) ein größeres Verhältnis an ungeradzahligen C-Atomen gefunden wurde.

Einfluss der Kettenlänge der C-Quellen auf die Kettenlänge der gebildeten Mykolsäuren

Wick et al. [2002b] untersuchte ebenfalls den Einfluss verschiedener Wachstumssubstrate auf die Zu-sammensetzung der Mykolsäuren von Mykobakterien. In seinen Untersuchungen kultivierte Wick My-cobacterium spp. LB501T, LB307T und VM552 auf Glukose, Alkanen, polycyclischen aromatischenKohlenwasserstoffen und Luria-Bertani-Medium. Anhand seiner Ergebnisse stellte Wick die These auf,dass ein Zusammenhang zwischen der Kettenlänge der C-Quelle und der Kettenlänge der gebildetenMykolsäure besteht. Die vorliegenden Ergebnisse der ESI-MS/MS-Analyse geben dieses Ergebnis nichtwider. In allen drei Versuchsansätzen sowie der Kontrolle lag die Kettenlänge der Mykolsäuren zwi-schen C30 und C50 (Tab. 31).

Fazit

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass in der Literatur verschiedenste Parameter für dieVariation der Mykolsäurezusammensetzung verantwortlich gemacht werden: die C-Quelle [Wick et al.,2002b], die Anzahl an C-Atomen [Nishiuchi et al., 2000], die Temperatur [Beney und Gervais, 2001],die Wachstumsdauer [Stratton et al., 2003] sowie die Anzahl an geraden und ungeraden C-Ketten derSubstrate [Sokolovská et al., 2003].Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass je nach C-Quelle unterschiedliche Anteile an un-gesättigten und gesättigten Mykolsäuren in der Meromykolatkette und dem α-Alkylzweig gefundenwurden, die anscheinend die Permeabilität der Zellen beeinflussen. Um den Zusammenhang zwischenden ungesättigten Mykolsäuren und der Permeabilität zu erklären, muss der Beitrag der am Zellhüllen-aufbau beteiligten Membranproteine und Phospholipide weiter aufgeklärt werden. Es ist anzunehmen,dass sie neben den Mykolsäuren einen Einfluss auf den Transport der Substanzen ausüben, da sie denAufbau der Zellhüllen und damit auch die Permeabilität beeinflussen.

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5

Zusammenfassung

Ziel der Arbeit war

(I) die Etablierung, Validierung und Durchführung einer geeigneten Analysemethode zur Untersu-chung ausgewählter Flavonoide auf deren physikochemisches Verhalten

(II) sowie deren enzymatische und mikrobielle in vitro Umsetzung unter anaeroben Bedingungen (invitro Verdauungsmodell) sowie

(III) unter aeroben Bedingungen (R. erythropolis Fermentation).

Ein Teil der vorliegenden Arbeit war Bestandteil eines Projektes des Bundesministeriums für Bildungund Forschung im Rahmen der „Ernährungsforschung – für ein gesundes Leben“. Die Untersuchun-gen gehören dem Modul „Biomedizinische Ernährungsforschung im Rahmen der Hightech-Strategiefür Deutschland und im Rahmenprogramm „Biotechnologie-Chancen nutzen und gestalten“ an, mitdem Titel „Nachweis der Funktionalität von pflanzlichen und mikrobiellen Nahrungsinhaltsstoffen imsimulierten Darmmodell“.

Für die anaerobe Umsetzung im simulierten in vitro Verdauungsmodell wurden die natürlich vorkom-menden Anthocyane Cyanidin-3-O-glucosid, Cyanidin-3-O-rutinosid, Delphinidin-3-O-glucosid undDelphinidin-3-O-rutinosid aus der schwarzen Johannisbeere sowie das Flavonol Quercetin-3-O-rutinosidausgewählt. Um die Flavonoide sowie deren Abbauprodukte in komplexen Matrices zu analysieren,wurde eine geeignete Reversed phase – High-performance liquid chromatography - Methode (RP-HPLC) etabliert und validiert. Das in vitro Verdauungsmodell wurde am Forschungsinstitut für Mi-krobiologie der Technischen Universität Berlin durch Dr. M. Hageböck etabliert und besteht ausvier hintereinander geschalteten, Temperatur- und pH-kontrollierten Bioreaktoren. Dabei bestehen dieMatrices des Verdauungsmodells aus künstlichem Magen- und Duodenalsaft, der mit den EnzymenTrypsin, Pankreatin und Pepsin sowie 23 verschiedenen Mikroorganismen aus dem humanen Verdau-ungstrakt versetzt wurde. Die Anthocyane wurden erst als Reinsubstanz und anschließend in verschie-denen komplexen Matrices, bestehend aus einem Heißwasserextrakt des Johannisbeersaftes, einemschwarzen Johannisbeersaft des Industriepartners Liven GmbH c/o Lienig Wildfrucht-Verarbeitungsowie einem Gärprodukt aus Würze und Johannisbeersaft (Gärgetränk) eingesetzt. Im ersten Schrittder Umsetzungsuntersuchungen wurde der enzymatische in vitro Abbau der Anthocyane unter an-aeroben Bedingungen in künstlichen Verdauungssäften anhand von Delphinidin und Cyanidin sowieCyanidin-3-O-rutinosid betrachtet. Anschließend wurde die sequentielle enzymatische und mikrobielleMetabolisierung von Cyanidin-3-O-rutinosid bzw. den oben genannten anthocyanhaltigen Nahrungs-mittelmatrices durchgeführt. Im Verlauf der enzymatischen und mikrobiellen Metabolisierung wurdenzusätzlich die antioxidative Kapazität und der Anteil an polymeren Anthocyanen in den verschiedenenStufen des Verdauungsmodells betrachtet.Quercetin-3-O-rutinosid wurde unter anaeroben Bedingungen im in vitro Verdauungsmodell metabo-lisiert bzw. unter aeroben Bedingungen in Schüttelkulturen von Rhodococcus erythropolis DSM 44543inkubiert und Metabolite mittels RP-HPLC-Methode analysiert. Weiterhin wurde der Einfluss der

Zusammenfassung

C-Quellen Quercetin-3-O-rutinosid und Zitronensäure, einzeln und in Kombination miteinander, aufdas Wachstum von R. erythropolis sowie den Aufbau und die Permeabilität der Zellhülle betrachtet.

I Etablierung und Validierung einer geeigneten RP-HPLC-Methode mit DiodenarrayDetektorFür die Analyse der Anthocyane und ihrer Abbauprodukte wurde eine reproduzierbare RP-HPLC-Methode etabliert und validiert. Im Zuge der Validierung wurden die Parameter Linearität, Selekti-vität, Wiederfindung, Präzision, Nachweisgrenze, Bestimmungsgrenze, Arbeitsbereich und Robustheituntersucht. Neben der Analyse der Substrate wurde eine umfassende und reproduzierbare Methodezur Resolubilisierung der an das Protein gebundenen Analyten etabliert und ebenfalls validiert. DieseMethode ermöglicht es, eine umfassende Aussage über die Umsetzung der Anthocyane im in vitroVerdauungsmodell zu treffen, da die Analyten durch den Protein-Komplex für die Analytik ansonstenmaskiert werden. So lagen z.B. 63 % der Anthocyane in den Proben des Gärgetränkes (Ende Duode-num) nach der Probenvorbereitung in präzipitierter Form vor.

II Enzymatische und mikrobielle Umsetzung der Flavonoide im in vitro Verdauungsmo-dell unter anaeroben BedingungenDie Aglykone Delphinidin und Cyanidin wurden bei der enzymatischen Umsetzung mit Pepsin, Tryp-sin und Pankreatin im in vitro Verdauungsmodell über eine Ringspaltung im B-Ring zu ihren analogenphenolischen Säuren 3,4-Dihydroxybenzoesäure (Protocatechusäure) beim Cyanidin und3,4,5-Trihydroxybenzoesäure (Gallussäure) beim Delphinidin sowie dem 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd(Phloroglucinolaldehyd) abgebaut. Am Ende der Magenpassage lagen nur noch 18 % der Aglykone,bezogen auf die Anfangskonzentration, vor. Nach 9 h im künstlichen Verdauungsmodel konnten nurnoch 0,5 % der Konzentration zu Anfang des Versuches detektiert werden. Bei der enzymatischenUmsetzung des Cyanidin-3-O-rutinosids wurden am Ende des Versuchs noch 71 % der Anfangskon-zentration gefunden. Das Glukosid der Anthocyane ist aufgrund des gebundenen Zuckers deutlichstabiler als das Aglykon.

Bei der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung von Cyanidin-3-O-glucosid, Cyanidin-3-O-rutinosid,Delphinidin-3-O-glucosid und Delphinidin-3-O-rutinosid verließen diese Glykoside fast unverändert dieMagenpassage. Bei dem niedrigern pH-Wert des Magensegmentes liegen die Anthocyane in ihrer stabil-sten Form, dem Flavyliumkation, vor. Bis zum Ende des Ileums lag die Gesamtkonzentration der An-thocyane in den einzelnen Versuchsansätzen zwischen 43 % (Experiment mit Cyanidin-3-O-rutinosids)und 11 % (Experiment mit schwarzem Johannisbeersaft (Saft)). Am Ende der Metabolisierungsversu-che lag die Restmenge an Anthocyan im Überstand in den verschiedenen Ansätzen zwischen 11 % fürden Saft und 20 % für das Gärgetränk. Die Anthocyane wurden bei der enzymatischen und mikrobiel-len Umsetzung erst zu ihren Aglykonen hydrolysiert und anschließend durch Ringspaltung am B-Ringzu den oben genannten Abbauprodukten metabolisiert. Wie zuvor bei der enzymatischen Umsetzung,wurde auch hier der Abbau der Anthocyane von den Zuckerresten beeinflusst bzw. vermindert. Nebenden Zuckern nimmt auch die Matrix einen wesentlichen Einfluss auf die Stabilität der Anthocyane.Für die komplexeste Matrix, dem Gärgetränk, wurde am Ende der Umsetzung die höchste Restkon-zentration an Anthocyan gefunden. Gleichzeitig war der Anteil an Protein für das Gärgetränk amhöchsten. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die Komplexität der Matrix ebenfalls einen Einflussauf den Abbau der Anthocyane hat. Wie genau sich diese Beeinflussung sich auswirkt, ist zu diesemZeitpunkt noch nicht aufgeklärt.

Bei den gefundenen Abbauprodukten des Cyanidin-3-O-glucosid, Cyanidin-3-O-rutinosid, Delphinidin-3-O-glucosid und Delphinidin-3-O-rutinosid handelt es sich um Protocatechusäure, Gallussäure undden Phloroglucinolaldehyd. In der Literatur wurden bisher zwei mögliche Aldehyde als Reaktionspro-dukte der Anthocyane diskutiert, der Phloroglucinolaldehyd und der 2,4,6-Trihydroxyphenylacetaldehyd(Phloroglucinacetaldehyd). In der vorliegenden Arbeit wurde der weniger bekannte Phloroglucinolalde-hyd als Hauptmetabolit ermittelt. Neben diesen Metaboliten wurden Hinweise auf Copigmentierungen(UV-Spektren) und Polymerisierungen (Polymerindex) gefunden.

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Zusammenfassung

Bei der Umsetzung von Quercetin-3-O-rutinosid wurde ebenfalls dessen Metabolisierung durch Mikro-organismen im Darm beobachtet. Bei den gefundenen Abbauprodukten handelt es sich um Quercetin-3-O-glucosid (Isoquercetin), Quercetin und 1,3,5-Trihydroxybenzen (Phloroglucinol).

Im Verlauf der Umsetzung der Anthocyane und des Quercetin-3-O-rutinosid bildete sich neben denmöglichen Abbauprodukten und polymeren Anthocyanen ein schwer löslicher flavonoidhaltiger Kom-plex (Präzipitat) aus. Um den Anteil an präzipitierten Flavonoiden im in vitro Verdauungsmodellbestimmen zu können, wurde eine Methode zur Resolubilisierung dieser Flavonoid-Protein-Komplexe(Präzipitate) etabliert und validiert. Durch diese Resolubilisierung konnten die gebundenen Flavonoi-de ebenfalls in die Stoffbilanz des Abbaus mit einbezogen werden. Gerade in der Magenpassage undim Zuge der Probenvorbereitung lag ein Großteil der Analyten als Präzipitat vor. Beim Heißwasser-extrakt lag der Anteil an präzipitiertem Substrat zu Beginn des Magensegmentes bei 24 % bezogenauf die Ausgangskonzentration. Dies ist nur ein Beispiel für die Notwendigkeit einer reproduzierbarenMethode zur Resolubilisierung, um quantitative Aussagen über die Metabolisierung der Flavonoideim ausgewählten Modellsystem zu treffen.

Sowohl für die Aglykone als auch für die Glykoside der Anthocyane und des Flavonols stimmt diegefundene Stoffbilanz nicht mit den erwarteten stöchiometrischen Verhältnissen überein. Für alle Um-setzungsversuche mit Anthocyanen lag die Stoffbilanz zwischen 1,5 % für den Heißwasserextrakt und6,1 % für das Gärgetränk. Bei der Metabolisierung des Quercetin-3-O-rutinosids lag die Stoffbilanzhingegen bei 36 %. Neben dem Abbau der Flavonoide wurden bei der Analyse Hinweise auf weitereReaktionen gefunden (z.B. Polymerisierung, Zusammenlagerung der Aglykone und Anthocyane), wel-che ebenfalls Einfluss auf die Stoffbilanz nehmen. So konnte eine deutliche Zunahme an polymerenAnthocyanen über die gesamte Dauer des in vitro Modells beobachtet werden. Dabei war der Anteilan polymeren Anthocyanen beim Heißwasserextrakt und dem Gärgetränk nach der Umsetzung mit0,35 OD520nm am geringsten und beim schwarzen Johannissbeersaft, mit dem höchsten Anthocyange-halt aller Versuchsansätze, mit 0,65 OD520nm am höchsten. Die Ergebnisse und die Stoffbilanz weisendarauf hin, dass die Ringspaltung des B-Rings nur einen möglichen Abbauweg der Anthocyane dar-stellt, wobei es sich nicht um den Hauptabbauweg handeln muss.

Analog zur Analyse der Abbauprodukte und des polymeren Anthocyananteils wurde die antioxida-tive Kapazität in den einzelnen Verdauungsstufen mittels Trolox Equivalent Antioxidative Capacity(TEAC-Methode) ermittelt, wobei die antioxidative Wirkung den Summenparameter aller vorhande-nen Antioxidantien in den Proben darstellt. Während des gesamten Verlaufs des Modells konnte einestetige Zunahme der antioxidativen Wirkung nachgewiesen werden. Am Ende des Verdauungsmodellslag die antioxidative Kapazität für die Anthocyane der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzungzwischen 9,9 mmol/l Troloxequivalten für das Gärgetränk und 19,3 mmol/l Troloxequivalten für denHeißwasserextrakt. Beim Quercetin-3-O-rutinosid beruht die erhöhte antioxidative Kapazität vor al-lem auf den besseren antioxidativen Eigenschaften der Abbauprodukte. Die antioxidative Kapazitätlag für das Quercetin-3-O-rutinosid am Ende bei 10,7 mmol/l Troloxequivalten. Eine genaue Aussa-ge über die Wirksamkeit einzelner Substanzen oder deren Relevanz lässt sich auf diesem Wege nichttreffen.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Anthocyane hauptsächlich durch physikochemi-sche und mikrobielle Einflüsse im in vitro Verdauungsmodell zu ihren bekannten Abbauproduktensowie zu bisher unbekannten Verbindungen abgebaut wurden. Dabei nimmt die Matrix Einfluss aufdie Konzentration des abgebauten Anthocyans durch Ausbildung von Protein-Anthocyan-Bindungenund stabilisierende Effekte. Neben dem Abbau und der Komplexierung finden weitere Reaktionenstatt (z.B. Polymerisierung, Copigmentierung, Zusammenlagerung der Aglykone und Anthocyane),die Einfluss auf die Stoffbilanz nehmen. Beim Quercetin-3-O-rutinosid wurde neben der mikrobiellenUmsetzung in seine bekannten Abbauprodukte die Komplexierung der Flavonole durch Matrixprote-ine (analog zu den Anthocyanen) beobachtet.Als Ausblick der Untersuchungen könnte eine industrielle und pharmazeutische Anwendung von Fla-

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Zusammenfassung

vonoidekomplexen als Grundlage für eine natürliche Verkapselung oder auch Drug Delivery Systemangedacht werden. Ein Beispiel hierfür wäre der Schutz der Flavonoide vor Metabolisierung auf ihremWeg in den Dickdarm, wo sie den Anteil an natürlichen Antioxidantien erhöhen. Eine andere Mög-lichkeit wäre, den Protein-Flavonoid-Komplex zum verkapseln anderer Substanzen zu verwenden unddiese somit gezielt in den Darm zu bringen.

III Aerobe Umsetzung von Quercetin-3-O-rutinosid durch Rhodococcus erythropolis DSM44534Ein weiterer Teil der Arbeit beschäftigte sich mit dem aeroben mikrobiellen Abbau der Flavonole.Hierzu wurde die Metabolisierung von Quercetin-3-O-rutinosid durch den Modellorganismus Rho-dococcus erythropolis DSM 44543 untersucht. Durch die Zugabe von Quercetin-3-O-rutinosid wäh-rend der Wachstumsphase der Kulturen wurde die Bildung einer Rutinase induziert. Dieses En-zym spaltet das Quercetin-3-O-rutinosid in Quercetin und Rutinosid. Quercetin-3-O-glucosid (Iso-quercetin) und 1,3,5-Trihydroxybenzen (Phloroglucinol) wurden nicht detektiert. Das Enzym wur-de im Rahmen der Arbeit teilweise mittels isoelektrischer Fokussierung (IEF) aufgereinigt und mitNatriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) sowie der Biotransformation vonQuercetin-3-O-rutinosid charakterisiert. Es wurde für das Enzym ein isoelektronischer Punkt (IEP)von 6,4 gefunden. Die markanten Proteinbanden lagen zwischen 48 kDa und 74 kDa. Neben der Ru-tinase wurde ein weiteres Enzym gebildet, welches Quercetin weiter metabolisiert. Diese Vermutungwird durch die Ergebnisse der Aktivitätstests gestützt.

Weiterhin sollte die Frage geklärt werden, welchen Einfluss Quercetin-3-O-rutinosid als C-Quelle aufdie Bildung von Mykolsäuren und die Permeabilität der Zellhülle während der Kultivierung vonR. erythropolis hat. Es wird angenommen, dass die Zusammensetzung der Mykolsäuren, als ein Haupt-bestandteil der Zellwand, direkten Einfluss auf die Permeabilität der Zelle nimmt. Für die Untersu-chung der Mykolsäuren wurde R. erythropolis auf den C-Quellen Quercetin-3-O-rutinosid und Zitro-nensäure kultiviert. Für den Kultivierungsansatz des R. erythropolis auf Zitronensäure wurde nach10 Tagen mit einer OD620nm von 0,8 die höchste Zelldichte gefunden. Für das Quercetin-3-O-rutinosidund die Kombination beider C-Quellen verlief der Graph der Wachstumskurven entgegen den Erwar-tungen annähernd gleich. Für den Ansatz der beiden C-Quellen in Kombination wurde eine deutlichhöhere Zelldichte als für Zitronensäure alleine erwartet, der Synergismus blieb jedoch aus. Währendbeim Ansatz mit Quercetin-3-O-rutinosid 53 % des Substrates verstoffwechselt wurden, waren es fürden Ansatz mit beiden C-Quellen nur noch 32 %. Das könnte bedeuteten, dass sich die hydrophobeund die hydrophile Komponente des Mediums gegenseitig beim Transport in die Zelle behindern. Es istzudem ein Hinweis darauf, dass die Zitronensäure parallel zum Quercetin-3-O-rutinosid von den Zellenverstoffwechselt wird. Die deutliche Abnahme der Konzentration des Quercetin-3-O-rutinosids (Tab.21) in beiden Kultivierungsansätzen (Quercetin-3-O-rutinosid allein und Quercetin-3-O-rutinosid +Zitronensäure) zwischen 24 h und 48 h deutet darauf hin, dass nach einem Zeitraum von 24 h dieRutinase induziert wurde und die Verstoffwechslung des Quercetin-3-O-rutinosids durch die Zellenbegonnen hat.Die in den verschiedenen Kultivierungsansätzen gebildeten Mykolsäuren wurden mittels ESI-MS/MSanalysiert und die Permeabilität der Zellen mittels Ziehl-Neelsen Färbung untersucht. An den Er-gebnissen der Färbung ist deutlich zu erkennen, dass ein Zusammenhang zwischen der Anwesenheitvon Zitronensäure und der Änderung der Permeabilität der Rhodococcus erythropolis Zellen besteht.Die Zellen, welche unter Standardbedingungen kultiviert wurden, waren am Ende der Färbung roteingefärbt. Die Zellen, welche auf Zitronensäure kultiviert wurden, waren am Ende der Färbung blaugefärbt. Bei der ESI-MS/MS Analyse der Mykolsäuren zeigte sich, dass in Anwesenheit von Zitronen-säure die Synthese von Mykolsäuren mit einer hohen Anzahl an mehrfach ungesättigten (zwei-, drei-und vierfach ungesättigt) Säuren in der Meromykolatkette (35 %) und dem α-Alkylzweig (23 %) initi-iert wird. Für Quercetin-3-O-rutinosid lag der Anteil an mehrfach ungesättigten Säuren bei 17 % fürdie Meromykolatkette und 3 % für den α-Alkylzweig. Die vierfach ungesättigten Mykolsäuren wurdennur in Gegenwart von Zitronensäure detektiert. Die Ergebnisse für die ESI-MS/MS zeigen, dass derhöhere Anteil an ungesättigten Mykolsäuren anscheinend die Schwächung der Permeabilitätsbarriere

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Zusammenfassung

hervorruft.

Beim Vergleich des Metabolismus von Quercetin-3-O-rutinosid unter aeroben und anaeroben Bedin-gungen zeigte sich, dass bei der anaeroben Umsetzung das Quercetin über das Zwischenprodukt Iso-quercetin gebildet werden kann. Das gebildete Quercetin wird dann anschließend von den Bakterien imDickdarm weiter zu Phloroglucinol, 3-Hydroxyphenylessigsäure und Protocatechusäure metabolisiert.Wobei die beiden letzten Abbauprodukte im simulierten Verdauungsmodell nicht detektiert wurden.Für den Abbau mit aeroben Bakterien sollte zunächst die Induktion des nötigen Enzyms erfolgen,welches Quercetin-3-O-rutinosid dann direkt in Quercetin und Rutinose spaltet. Der Abbau von Fla-vonoiden bzw. Flavonolen unter aeroben und anaeroben Bedingungen führte in dieser Arbeit zu demgleichen Hauptabbauprodukt Quercetin, allerdings mit unterschiedlichen Nebenprodukten. Bei der an-aeroben Umsetzung wurden neben Quercetin noch Isoquercetin und Phloroglucinol gebildet. Bei deraeroben Metabolisierung musste erst das Enzym induziert werden, welches Quercetin-3-O-rutinosidzu Quercetin und Rutinosid spaltet. Weitere Metabolite wurden nicht detektiert.

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Abbildungsverzeichnis

1 Einteilung der Polyphenole nach ihrer Struktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 Strukturelle Veränderung der Anthocyane in Abhängigkeit vom pH-Wert . . . . . . . . 113 pH-abhängiger Zerfallsmechanismus der Anthocyanidine [nach Markakis und Jurd, 1974 124 Struktur-Wirkbeziehung der antioxidativen Kapazität von Flavonoiden am Beispiel von

Quercetin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145 Menschlicher Verdauungstrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176 Aufbau des Kolon. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 Abbauweg des Rutins in Schimmelpilzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238 Zusammenfassung der verschiedenen Abbauwege des Rutins . . . . . . . . . . . . . . . 249 Fragmentierung der Mykolsäure in den Meroaldehyd (Meromykolatkette) und den α-

Alkylzweig durch thermisch induzierte Spaltung der β-Hydroxycarbonsäure. . . . . . . 2510 Modell des Aufbaus der Zellhülle des Rhodococcus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

11 Anthocyankonzentration im Johannisbeersaft bei verschiedenen pH-Werten mittels HPLC. 5412 HPLC-Chromatogramme des Magensaftes (schwarz), Darmsaftes (rosa) ohne Analy-

ten und einer Probe mit Delphinidin-3-O-glucosid (Del-3-O-glc), Cyanidin-3-O-glucosid(Cy-3-O-glc) und Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut) (blau) bei 520 nm. . . . . . . . 55

13 HPLC-Chromatogramme des Magensaftes (schwarz), Darmsaftes (rosa) ohne Analytenund einer Probe mit 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure (Gallussäure) und 3,4-Dihydroxybenzoesäure(Protocatechusäure) (blau) bei 280 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

14 HPLC-Chromatogramme des Magensaftes (schwarz), Darmsaftes (rosa) ohne Analytenund einer Probe mit 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd (Phloroglucinolaldehyd) (blau) bei280 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

15 Vergleich der Steigung der Kalibrierkurven für den Standard Cyanidin-3-O-glucosid(Cy-3-O-glc), der im HPLC-Laufmittel (LM) bzw. der Magensaftmatrix angesetzt wurde. 57

16 Vergleich der Steigung der Kalibrierkurven für den Standard Delphinidin-3-O-glucosid(Del-3-O-glc), der im HPLC-Laufmittel (LM) und der Magensaftmatrix angesetzt wurde. 58

17 Vergleich der Steigung der Kalibrierkurven für den Standard Cyanidin-3-O-rutinosid(Cy-3-O-rut), der im HPLC-Laufmittel (LM) und der Magensaftmatrix angesetzt wurde. 59

18 HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin im Magensegment(pH 1,5, Pepsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 520 nm. . . . . . . . . 63

19 UV-Spektrum von AP 1 aus der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin im Magen-segment (pH 1,5, Pepsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 280 nm. . . . 64

20 HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin im Magensegment(pH 1,5, Pepsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 280 nm. . . . . . . . . 64

21 Konzentrationsverlauf von Cyanidin und dessen Abbauprodukte Protocatechusäure undPhloroglucinolaldehyd bei der sequentiellen enzymatische Umsetzung im simulierten invitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

22 HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Delphinidin im Magenseg-ment (pH 1,5, Pepsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 280 nm. . . . . 66

23 HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Delphinidin im Magenseg-ment (pH 1,5, Pepsin) und Duodenum (pH7, Pankreatin und Trypsin) des simuliertenin vitro Verdauungsmodells bei 520 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

24 UV-Spektrum von AP 2 aus der enzymatischen Umsetzung von Delphinidin im Magen-segment (pH 1,5, Pepsin) und Duodenum (pH 7, Pankreatin und Trypsin) des simulier-ten in vitro Verdauungsmodell bei 520 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

25 HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Delphinidin im Duodenum(pH 7, Pankreatin und Trypsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 320 nm. 68

26 HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Delphinidin im Duodenum(pH 7, Pankreatin und Trypsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 280 nm. 69

27 Konzentrationsverlauf von Delphinidin und dessen Abbauprodukte (Gallussäure undPhloroglucinolaldehyd) bei der sequentiellen enzymatischen Umsetzung im simuliertenin vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

28 LC-MS Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung des Delphinidins im Magen-segment (pH 1,5, Pepsin) unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C bei 0 h (MIC m/z435 - 440). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

29 LC-MS Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung des Delphinidins im Magen-segment (pH 1,5, Pepsin) unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C nach 4 h (MIC m/z435 - 440). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

30 HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin-3-O-rutinosid imMagensegment (pH 1,5, Pepsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 320 nm. 71

31 HPLC-Chromatogramm der enzymatischen Umsetzung von Cyanidin-3-O-rutinosid imDuodenum (pH 7, Pankreatin und Trypsin) des simulierten in vitro Verdauungsmodellsbei 320 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

32 Konzentrationsverlauf der Anthocyane Cyanidin, Delphinidin und Cyanidin-3-O-rutinosid(Cy-3-O-rut) bei der sequentiellen enzymatischen Umsetzung im simulierten in vitroVerdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

33 Zeitabhängige Metabolisierung von Cy-3-O-rut im simulierten in vitro Verdauungsmodell. 7534 HPLC-Chromatogramme des zeitabhängigen Konzentrationsverlaufes des Abbaupro-

duktes AP 4 im Darmsegment der Umsetzung des Cy-3-O-rut im simulierten in vitroVerdauungsmodells bei 320 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

35 UV-Spektrum von AP 4 aus der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung des Cyanidin-3-O-rutinosid im Darmsegment des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 320 nm. 76

36 Präzipitierung der Anthocyane von Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut) während desUmsetzungsversuches im simulierten in vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . 78

37 Zeitabhängiger Konzentrationsverlauf von Cy-3-O-rut und Verlauf der optischen Dichtebei 520 nm für Cy-3-O-rut und die Polymere im simulierten in vitro Verdauungsmodell. 79

38 Verlauf der antioxidativen Kapazität von Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut) im Über-stand der Versuchsansätze der enzymatisch-mikrobiellen Umsetzung sowie der Kontrolleund der Verlauf der Cyanidin-3-O-rutinosid- /Protocatechusäurekonzentration im simu-lierten in vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

39 Zeitabhängige Metabolisierung des Heißwasserextrakts aus Johannisbeertrester im si-mulierten in vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

40 HPLC-Chromatogramme des zeitabhängigen Konzentrationsverlaufes des Abbaupro-duktes AP 4 aus dem Heißwasserextrakt des Johannisbeetresters im Darmsegment dessimulierten in vitro Verdauungsmodells bei 320 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

41 Präzipitierung der Anthocyane des Heißwasserextraktes und der Konzentrationsverlaufder Anthocyane aus Überstand und Präzipitat während des Umsetzungsversuches imsimulierten in vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

42 Zeitabhängiger Konzentrationsverlauf der Anthocyane aus dem Heißwasserextrakt desJohannisbeetresters und Verlauf der optischen Dichte bei 520 nm für die Anthocyaneund die Polymere im simulierten in vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . 84

43 Verlauf der antioxidativen Kapazität im Überstand sowie der Anthocyankonzentrationdes Heißwasserextraktes aus Überstand und Präzipitat und Verlauf der Konzentrationder Abbauprodukte im simulierten in vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . 85

158

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

44 Zeitabhängige Metabolisierung des Johannisbeersaftes im simulierten in vitro Verdau-ungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

45 HPLC-Chromatogramme des zeitabhängigen Konzentrationsverlaufes des Abbaupro-duktes AP 4 aus dem Johannisbeersaft im Darmsegment des simulierten in vitro Ver-dauungsmodells bei 320 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

46 HPLC-Chromatogramme des zeitabhängigen Konzentrationsverlaufes des Abbaupro-duktes AP 5 aus dem Johannisbeersaft im Duodenum des simulierten in vitro Verdau-ungsmodells bei 320 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

47 UV-Spektrum von AP 5 aus der enzymatischen und mikrobiellen Umsetzung von Jo-hannisbeersaft im Duodenum des simulierten in vitro Verdauungsmodells bei 320 nm. 88

48 Präzipitierung der Anthocyane des Johannissbeersaftes und Verlauf der Anthocyankon-zentration aus Überstand und Präzipitat während des Umsetzungsversuches im simu-lierten in vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

49 Zeitabhängiger Konzentrationsverlauf der Anthocyane des Johannisbeetsaftes und Ver-lauf der optischen Dichte bei 520 nm für die Anthocyane und Polymere im simuliertenin vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

50 Verlauf der antioxidativen Kapazität im Überstand sowie der Anthocyankonzentrationdes Johannisbeersaftes aus Überstand und Präzipitat und Verlauf der Abbauprodukt-konzentration im simulierten in vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

51 Zeitabhängige Metabolisierung des Gärgetränks im simulierten in vitro Verdauungsmodell. 9252 Präzipitierung der Anthocyane des Gärgetränkes und Konzentrationsverlauf der An-

thocyane aus Präzipitat und Verdauungssaft während des Umsetzungsversuches im si-mulierten in vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

53 Zeitabhängiger Konzentrationsverlauf der Anthocyane des Gärgetränkes auf Basis ver-gorener Bierwürze und Johannisbeersaft und Verlauf der optischen Dichte bei 520 nmfür die Anthocyane und Polymere im simulierten in vitro Verdauungsmodell. . . . . . 94

54 Verlauf der antioxidativen Kapazität im Überstand sowie der Anthocyankonzentrationdes Gärgetränkes auf Basis vergorener Bierwürze und Johannisbeersaft aus Überstandund Präzipitat und Verlauf der Abbauproduktkonzentration im simulierten in vitroVerdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

55 Zeitabhängige Metabolisierung des Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) im simulierten invitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

56 Präzipitierung von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) und seinen Abbauprodukten wäh-rend des Umsetzungsversuches im simulierten in vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . 98

57 Verlauf der antioxidativen Kapazität im Überstand sowie der Verlauf der Konzentrationdes Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) aus Überstand und Präzipitat und Verlauf derAbbauproduktkonzentration im simulierten in vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . 99

58 Konzentrationsverlauf des Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) und des Quercetins wäh-rend der Umsetzung von 100 µM Rutin durch Rhodococcus erythropolis DSM 44534Zellen in 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 über 6 h bei 37 °C im Inkubationsschüttler.111

59 HPLC-Chromatogramm für die aerobe Umsetzung von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin)zu Quercetin durch ganze Zellen von Rhodococcus erythropolis DSM 44534, gemessenbei 280 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

60 Konzentrationsverlauf von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) und Quercetin bei der Um-setzung von Rutin im Extrakt der aufgeschlossenen Zellen. . . . . . . . . . . . . . . . . 113

61 HPLC-Chromatogramme des Konzentrationsverlaufs des Abbauproduktes Quercetinwährend der Biotransformation über 2 h bei 37 °C mit Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin)als Substrat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

62 SDS-PAGE von Fraktion 3 - 10 der IEF des Proteinextraktes aus Rhodococcus erythropolis.11563 SDS-PAGE von Fraktion 11 - 18 der IEF des Proteinextraktes aus Rhodococcus ery-

thropolis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11664 Wachstumskurven für Rhodococcus erythropolis DSM 44534 in Minimal-Salz-Medium

(MSM) auf verschiedenen C-Quellen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

159

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

65 Ziehl-Neelsen-Färbung von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Zellen, die auf Zitro-nensäure kultiviert wurden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

66 Ziehl-Neelsen-Färbung von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Zellen, die auf beidenC-Quellen kultiviert wurden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

67 Ziehl-Neelsen-Färbung von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Zellen, die auf Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) kultiviert wurden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

68 Ziehl-Neelsen-Färbung von Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Zellen, die ohne wei-tere C-Quelle kultiviert wurden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

69 ESI-MS/MS-Chromatogramm (Totalionenstrom) der Mykolsäuren in Rhodococcus er-tyhropolis DSM 44534, die auf Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) als einziger C-Quellekultiviert wurden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

70 Prozentualer Anteil an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren der Meromykolatkettebezogen auf die Gesamtmenge der gefundenen Spezies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

71 Prozentualer Anteil an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren der Meromykolatkettebezogen auf die Gesamtmenge der gefundenen Spezies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

72 Prozentualer Anteil an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren in der Nebenkettebezogen auf die Gesamtmenge der gefundenen Spezies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

73 Prozentualer Anteil an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren in der Nebenkettebezogen auf die Gesamtmenge der gefundenen Spezies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

74 Vergleich der Steigung der Kalibrierkurven für den Standard 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure(Gallussäure), der im HPLC-Laufmittel (LM), Magensaftmatrix und Darmsaftmatrixangesetzt wurde. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165

75 Vergleich der Steigung der Kalibrierkurven für den Standard 3,4-Dihydroxybenzoesäure(Protocatechusäure), der im HPLC-Laufmittel (LM), Magensaftmatrix und Darmsaft-matrix angesetzt wurde. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166

76 Vergleich der Steigung der Kalibrierkurven für den Standard 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd(Phloroglucinolaldehyd), der im HPLC-Laufmittel (LM), Magensaftmatrix und Darm-saftmatrix angesetzt wurde. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

77 Wachstumskurven für Rhodococcus erythropolis DSM 44534 in modifiziertem Minimal-Salz-Medium (mod. MSM) auf 100 µM Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) als C-Quelle. 168

78 ESI-Massenspektrum der Mykolsäure aus dem Kontrollansatz mit der Masse 605 m/z[M −H]−, sowie die Strukturformel für die Mykolsäure mit dem Fragment 277 m/z. . 168

79 ESI-Massenspektrum der Mykolsäure aus dem Ansatz mit Zitronensäure (4 mM) mitder Masse 585 m/z [M − H]−, sowie die Strukturformel für die Mykolsäure mit demFragment 199 m/z. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169

80 ESI-Massenspektrum der Mykolsäure aus dem Ansatz mit Quercetin-3-O-rutinosid (Ru-tin, 1 mM) mit der Masse 549 m/z [M −H]−, sowie die Strukturformel für die Mykol-säure mit dem Fragment 199 m/z. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169

81 ESI-Massenspektrum der Mykolsäure aus dem Ansatz mit Zitronensäure (4 mM) undQuercetin-3-O-rutinosid (Rutin, 1 mM) mit der Masse 603 m/z [M − H]−, sowie dieStrukturformel für die Mykolsäure mit dem Fragment 225 m/z. . . . . . . . . . . . . . 170

160

Tabellenverzeichnis

1 Überprüfung der Richtigkeit aus Wiederfindungsexperimenten und Reproduzierbarkeitder Resolubilisierung des Protein-Anthocyan-Komplexes. . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

2 Übersicht der eingesetzten Mikroorganismen mit DSM-Nummer, dem jeweiligen Vor-kulturmedium und dem Einsatzort der Kultur im in vitro Verdauungsmodell. . . . . . 39

3 Zusammensetzung der Vorkulturmedien und der dazugehörigen Salzlösungen bzw. Spu-renelementlösung in g/l. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

4 Zusammensetzung des synthetischen Magen- bzw. Duodenalsaft in g/l. . . . . . . . . . 415 Gradientenprogramm für die Analyse der Anthocyane aus dem simulierten in vitro

Verdauungsmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 436 Gradientenprogramm der LC-MS-Methode für die enzymatische Umsetzung im simu-

lierten in vitro Verdauungsmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 437 Gradientenprogramm für die Analyse von Rutin aus dem simulierten in vitro Verdau-

ungsmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 448 Gradientenprogramm für die Analyse von Rutin und Quercetin aus dem Aktivitätstest 509 Zusammensetzung der Medien für die vier Kultivierungsansätze und die eingesetzten

Konzentrationen der unterschiedlichen C-Quellen in den verschiedenen Ansätzen. . . . 50

10 Mittelwert der Peakflächen für die Kalibrierkurven von Cyanidin-3-O-glucosid (Cy-3-O-glc) in Laufmittel und Matrix. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

11 Analyse der Richtigkeit für Resolubilisierung und Wiederfindung der Anthocyane ausdem Präzipitat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

12 Nachweis-, Bestimmungs- und Erfassungsgrenze der Anthocyanstandards im Magensaft. 6013 Analyseergebnisse der Methodenpräzisionsmessung für Delphinidin-3-O-glucosid (Del-

3-O-glc), Cyanidin-3-O-glucosid (Cy-3-O-glc) und Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut).. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

14 Ergebnisse des Stabilitätstest von Delphinidin-3-O-glucosid (Del-3-O-glc), Cyanidin-3-O-glucosid (Cy-3-O-glc) und Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut) über 5 Tage undnach 20 Tagen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

15 Konzentrationsverlauf des Cyanidins bei der enzymatischen Umsetzung im in vitro Ver-dauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

16 Konzentrationsverlauf des Delphinidins bei der enzymatischen Umsetzung im in vitroVerdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

17 Konzentrationsverlauf des Cyanidin-3-O-rutinosids bei der enzymatischen Umsetzungim in vitro Verdauungsmodell. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

18 Konzentrationsverlauf von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin)und Quercetin während derUmsetzung von 100 µM Rutin durch Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Zellen bei37 °C im Inkubationsschüttler in 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 über 6 h. . . . 111

19 Konzentrationsverlauf von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) und Quercetin während derUmsetzung von 100 µM Rutin durch Extrakt aus aufgeschlossenen Rhodococcus erythro-polis DSM 44534 Zellen bei 37 °C im Inkubationsschüttler in 40 mM Natriumphosphat-puffer pH 7 über 2 h. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

20 Konzentrationen von Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) und Quercetin zu Beginn undEnde der Biotransformation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

TABELLENVERZEICHNIS

21 Konzentrationsverlauf des Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) während des Wachstumsvon Rhodococcus erythropolis DSM 44534 in Minimal-Salz-Medium (MSM) auf ver-schiedenen C-Quellen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

23 Mittelwert der Peakflächen für die Kalibrierkurven von Delphinidin-3-O-glucosid (Del-3-O-glc) in Laufmittel und Matrix. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170

24 Mittelwert der Peakflächen für die Kalibrierkurven von Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut) in Laufmittel und Matrix. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170

25 Mittelwert der Peakflächen für die Kalibrierkurven von 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure(Gallussäure) in Laufmittel und Matrix. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

26 Mittelwert der Peakflächen für die Kalibrierkurven von 3,4-Dihydroxybenzoesäure (Pro-tocatechusäure)in Laufmittel und Matrix. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

27 Mittelwert der Peakflächen für die Kalibrierkurven von 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd(Phloroglucinolaldehyd) in Laufmittel und Matrix. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

28 Quotient der Steigung und der Prüfgrösse (PW) des Anpassungstests nach Mandel fürdie Kalibrierkurven der Anthocyane und ihrer Abbauprodukte. . . . . . . . . . . . . . 172

29 Die Tabelle zeigt die Werte des Standards in Laufmittel und die tatsächlich gefundenenKonzentration der Standards nach der Resolubilisierung aus dem Präzipitat. . . . . . . 172

30 Konzentrationsverlauf des Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) während des Wachstumsvon Rhodococcus erythropolis DSM 44534 in modifiziertem Minimal-Salz-Medium (mod.MSM) auf 100 µM Rutin als C-Quelle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172

31 Relativer Anteil (Prozent) der identifizierten Mykolsäuren in Rhodococcus erythropolisDSM 44534 Kulturen, die auf verschiedenen C-Quellen kultiviert wurden. . . . . . . . 173

32 Ermitteltes Verhältnis von geraden zu ungeraden Alkanketten der identifizierten My-kolsäuren in Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Kulturen, die auf verschiedenen C-Quellen kultiviert wurden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176

162

6

Abkürzungsverzeichnis

Amono Extinktion der monomeren AnthocyaneApoly Extinktion der polymeren AnthocyaneAgesamt Extinktion der gesamten AnthocyaneABTS 2,2’-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)ACN AcetonitrilACP Acyl carrier ProteinAPC Adenomatöses Polyposis ColiAPS AmmoniumpersulfatBidest. Doppelt destiliertes WasserBG BestimmungsgrenzeC-Quelle KohlenstoffquelleCatechol 1,2-DihydroxybenzenCy-3-O-gly Cyanidin-3-O-glycosidCy-3-O-rut Cyanidin-3-O-rutinosidDAD Diodenarray DetektorDel-3-O-gly Delphinidin-3-O-glycosidDel-3-O-rut Delphinidin-3-O-rutinosidDes DesaturaseDMSO DimethylsulfoxidDNA DesoxyribonukleinsäureDSM oder DSMZ Deutsche Sammlung von MikroorganismenDTT DithiothreitolESI-MS/MS Elektronensprayionisation-Massenspektrometrie/MassenspektrometrieEGFR Epidermal Growthfactor Receptors (EGF-Rezeptor)FAS Fettsäure-SynthaseHCl SalzsäureGallussäure 3,4,5-TrihydroxybenzoesäureHDL High density Lipoprotein (Lipoprotein hoher Dichte)HKL HerzkreislauferkrankungH2O2 WasserstoffperoxidIEF isoelektronische FokussierungIEP isoelektrische PunktkDa KilodaltonKOH KaliumhydroxidLAM LipoarabinomannaneLC-MS Liquid chromatography–mass spectrometry

(Flüssigkeitschromatograpie mit Massenspektrometrie-Kopplung)LDL Low density Lipoprotein (Lipoprotein niederer Dichte)LM LaufmittelM molare Masse

Abkürzungsverzeichnis

m/z Verhältnis von Masse zu Ladung in der MassenspektrometrieMeOH MethanolMSM Minimal Salz MediumN normalNO. StickstoffmonoxidOD optische Dichte1O2 SingulettsauerstoffOH . HydroxylradikalO−.

2 SuperoxidradikalionPBS Phosphat Buffer Solution (Phosphatpuffer)Phloroglucinol 1,3,5-TrihydroxybenzenPhloroglucinolaldehyd 2,4,6-TrihydroxybenzaldehydPMSF PhenylmethylsulfonylfluoridProtocatechusäure 3,4-DihydroxybenzoesäurePYGm modifiziertes Pepton-Hefeextrakt-Glucose-MediumPW PrüfwertPräzipitat Protein-Flavonoid-Komplex der vom Überstand abgetrennt wurdeROS reaktive SauerstoffspeziesROO. PeroxylradikalRO. AlkoxylradikalRP-HPLC Reversed phase high pressure liquid chromatography

(Umkehrphase Hochleistungsflüssigkeitchromatographie)RT RetentionszeitSDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

(Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese)SDS Sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat)SLGT-1 Soudium-glucose transport proteins, Natrium/Glucose Cotransporter 1TEAC Trolox equivalent antioxidative capacityTEMED N,N,N’,N’-TetramethylethylendiaminTRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethanUV UltraviolettVerdauungssaft Überstand des künstlichen Magen- und DarmsaftesVK Variationskoeffizient

164

7

Anhang

Abbildung 74: Vergleich der Steigung der Kalibrierkurven für den Standard 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure(Gallussäure), der im HPLC-Laufmittel (LM), Magensaftmatrix und Darmsaftmatrix angesetzt wurde.Um den Einfluss des Magensaftes, dessen Enzym Pepsin, dem Darmsaft und dessen Enzyme Trypsin und Pankreatin,im Vergleich zum Laufmittel (LM) der HPLC-Methode, auf Gallussäure zu untersuchen, wurden je fünf Kalibrierkurvenmit fünf verschiedenen Gallussäurekonzentrationen an drei unterschiedlichen Tagen gemessen. (n = 5)

Anhang

Abbildung 75: Vergleich der Steigung der Kalibrierkurven für den Standard 3,4-Dihydroxybenzoesäure(Protocatechusäure), der im HPLC-Laufmittel (LM), Magensaftmatrix und Darmsaftmatrix angesetztwurde. Um den Einfluss des Magensaftes, dessen Enzym Pepsin, dem Darmsaft und dessen Enzyme Trypsin undPankreatin, im Vergleich zum Laufmittel (LM) der HPLC-Methode, auf Protocatechusäure zu untersuchen, wurden jefünf Kalibrierkurven mit fünf verschiedenen Protocatechusäurekonzentrationen an drei unterschiedlichen Tagen gemessen.(n = 5)

166

Anhang

Abbildung 76: Vergleich der Steigung der Kalibrierkurven für den Standard 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd(Phloroglucinolaldehyd), der im HPLC-Laufmittel (LM), Magensaftmatrix und Darmsaftmatrix ange-setzt wurde. Um den Einfluss des Magensaftes, dessen Enzym Pepsin, dem Darmsaft und dessen Enzyme Trypsin undPankreatin, im Vergleich zum Laufmittel (LM) der HPLC-Methode, auf Phloroglucinolaldehyd zu untersuchen, wurdenje fünf Kalibrierkurven mit fünf verschiedenen Phloroglucinolaldehydkonzentrationen an drei unterschiedlichen Tagengemessen. (n = 5)

167

Anhang

Abbildung 77: Wachstumskurven für Rhodococcus erythropolis DSM 44534 in modifiziertem Minimal-Salz-Medium (mod. MSM) auf 100 µM Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) C-Quelle. Die Vorkultur wuchsüber 4 Tage bei 37 °C im Inkubationsschüttler in modifiziertem Minimal-Salz-Medium mit 50 mM Ethanol als C-Quelle.Die Zelldichte betrug zu Beginn des Versuchs 0,2 OD620nm. Als C-Quelle wurde Rutin (100 µM) eingesetzt. Die Kulturenwurden über 5 Tage mit 37 °C im Inkubationsschüttler inkubiert und das Wachstum über die 5 Tage mittels OD620nm

verfolgt. (n = 3)

Abbildung 78: ESI-Massenspektrum der Mykolsäure aus dem Kontrollansatz mit der Masse 605 m/z[M −H]−, sowie die Strukturformel für die Mykolsäure mit dem Fragment 277 m/z. Die Proben wurden fürdie ESI-MS/MS-Messung mittels Festphasenextraktion aufgereinigt.

168

Anhang

Abbildung 79: ESI-Massenspektrum der Mykolsäure aus dem Ansatz mit Zitronensäure (4 mM) mit derMasse 585 m/z [M −H]−, sowie die Strukturformel für die Mykolsäure mit dem Fragment 199 m/z. DieProben wurden für die ESI-MS/MS-Messung mittels Festphasenextraktion aufgereinigt.

Abbildung 80: ESI-Massenspektrum der Mykolsäure aus dem Ansatz mit Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin,1 mM) mit der Masse 549 m/z [M −H]−, sowie die Strukturformel für die Mykolsäure mit dem Fragment199 m/z. Die Proben wurden für die ESI-MS/MS-Messung mittels Festphasenextraktion aufgereinigt.

169

Anhang

Abbildung 81: ESI-Massenspektrum der Mykolsäure aus dem Ansatz mit Zitronensäure (4 mM) undQuercetin-3-O-rutinosids (Rutin, 1 mM) mit der Masse 603 m/z [M −H]−, sowie die Strukturformel fürdie Mykolsäure mit dem Fragment 225 m/z. Die Proben wurden für die ESI-MS/MS-Messung mittels Festpha-senextraktion aufgereinigt.

Tabelle 23: Mittelwert der Peakflächen für die Kalibrierkurven von Delphinidin-3-O-glucosid (Del-3-O-glc) in Laufmittel und Matrix. Die Tabelle zeigt den Mittelwert der Peakflächen (n = 5) für die Kalibrierkurvedes Delphinidin-3-O-glucosids. Das Delphinidin-3-O-glucosid wurde für die Messungen in Laufmittel bzw. Magensaftverdünnt. Aus den beiden Mittelwerten der Peakflächen wurden die Peakflächenverhältnisse berechnet.

Konzentration Peakfläche Del-3-O-glc Peakfläche Del-3-O-glc Peakflächen-[µg/ml] in LM in Matrix verhältnis100 5720171,0 5485179,0 0,9650 2838730,2 2456168,0 0,8710 555701,8 528467,6 0,955 238994,6 291629,5 1,221 51196,8 46532,0 0,91

Tabelle 24: Mittelwert der Peakflächen für die Kalibrierkurven von Cyanidin-3-O-rutinosid (Cy-3-O-rut)in Laufmittel und Matrix. Die Tabelle zeigt den Mittelwert der Peakflächen (n = 5) für die Kalibrierkurve desCyanidin-3-O-rutinosids. Das Cyanidin-3-O-rutinosid wurde für die Messungen in Laufmittel bzw. Magensaft verdünnt.Aus den beiden Mittelwerten der Peakflächen wurden die Peakflächenverhältnisse berechnet.

Konzentration Peakfläche Cy-3-O-rut Peakfläche Cy-3-O-rut Peakflächen-[µg/ml] in LM in Matrix verhältnis100 4559859,0 4582768,2 1,0150 2273462,8 2367230,4 1,0410 451029,8 462787,0 1,035 194168,0 261646,3 1,351 41997,8 43916,0 1,05

170

Anhang

Tabelle 25: Mittelwert der Peakflächen für die Kalibrierkurven von 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure (Gal-lussäure) in Laufmittel und Matrix. Die Tabelle zeigt den Mittelwert der Peakflächen (n = 5) für die Kalibrierkurveder Gallussäure. Die Gallussäure wurde für die Messungen in Laufmittel bzw. Magensaft und Darmsaft verdünnt. Ausden Mittelwerten der Peakflächen wurden die Peakflächenverhältnisse berechnet.

Konzentration Peakfläche Peakfläche Peakfläche Peakflächen- Peakflächen-[µg/ml] Gallussäure Gallussäure Gallussäure verhältnis verhältnis

in LM in Magensaft in Darmsaft Magensaft Darmsaft100 6044167,4 6022213,0 5868521,6 1,00 0,9750 2812413,4 2963035,0 2558665,6 1,05 0,9110 618705,6 613889,6 592551,2 0,99 0,965 349520,6 341180,6 307614,2 0,98 0,881 63459,0 69537,2 59728,6 1,10 0,94

Tabelle 26: Mittelwert der Peakflächen für die Kalibrierkurven von 3,4-Dihydroxybenzoesäure (Pro-tocatechusäure) in Laufmittel und Matrix. Die Tabelle zeigt den Mittelwert der Peakflächen (n = 5) für dieKalibrierkurve der Protocatechusäure. Die Protocatechusäure wurde für die Messungen in Laufmittel bzw. Magensaftund Darmsaft verdünnt. Aus den Mittelwerten der Peakflächen wurden die Peakflächenverhältnisse berechnet.

Konzentration Peakfläche Peakfläche Peakfläche Peakflächen- Peakflächen-[µg/ml] Protocatechusäure Protocatechusäure Protocatechusäure verhältnis verhältnis

in LM in Magensaft in Darmsaft Magensaft Darmsaft

100 3966115,8 3769704,8 3614943,4 0,95 0,9150 1977021,2 1959299,6 1775963,4 0,99 0,9010 378942,8 382056,0 352027,8 1,01 0,935 209244,6 209681,0 181231,6 1,00 0,871 42497,0 41581,0 39311,6 0,98 0,93

Tabelle 27: Mittelwert der Peakflächen für die Kalibrierkurven von 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyd (Phlo-roglucinolaldehyd)in Laufmittel und Matrix. Die Tabelle zeigt den Mittelwert der Peakflächen (n = 5) für dieKalibrierkurve der Phloroglucinolaldehyd. Die Phloroglucinolaldehyd wurde für die Messungen in Laufmittel bzw. Ma-gensaft und Darmsaft verdünnt. Aus den Mittelwerten der Peakflächen wurden die Peakflächenverhältnisse berechnet.

Konzentration Peakfläche Peakfläche Peakfläche Peakflächen- Peakflächen-[µg/ml] Aldehyd in Aldehyd in Aldehyd in verhältnis verhältnis

LM Magensaft Darmsaft Magensaft Darmsaft100 4615009,6 4588144,8 4336180,8 0,99 0,9450 2615833,2 2579166,0 2388546,2 0,99 0,9110 469930,6 459722,8 442890,8 0,98 0,945 311555,0 312932,8 280152,2 1,00 0,901 45796,6 45948,2 43766,0 1,00 0,96

171

Anhang

Tabelle 28: Quotient der Steigung und der Prüfgrösse (PW) des Anpassungstests nach Mandel für dieKalibrierkurven der Anthocyane und ihrer Abbauprodukte. Die Tabelle zeigt die Quotienten für die Steigungdie Prüfgrösse des Anpassungtests nach Mandel berechnet aus den Kalibriekurven mit Laufmittel und Magensaft bzw.Darmsaft (n = 5). Für die Bestimmung der Prüfgröße des Anpassungtests nach Mandel wurden die Kalibrierkurvenmit Laufmittel und Magensaft bzw. Darmsaft verwendet. Drei der jeweils 5 Kalibrierkurven wurden dazu um 5 weitereKonzentrationen im Bereich von 1 – 100 µg/ml erweitert und gemessen. Für eine lineare Kalibriergerade muss derPW-Wert ≤ als der Tabellenwert für F sein. (n = 3)

Quotient Steigung PW-Wert F-WertCy-3-O-glc in Matrix 0,94 4,01 12,30Del-3-O-glc in Matrix 0,98 10,9 12,30Cy-3-O-rut in Matrix 1,00 1,99 12,30Gallussäure in Magensaft 1,00 0,66 12,30Gallussäure in Darmsaft 0,96 0,45 12,30Protocatechusäure in Magensaft 0,95 0,43 12,30Protocatechusäure in Darmsaft 0,96 0,17 12,30Aldehyd in Magensaft 0,99 0,02 12,30Aldehyd in Darmsaft 0,94 2,12 12,30

Tabelle 29: Die Tabelle zeigt die Werte des Standards in Laufmittel und die tatsächlich gefundenenKonzentration der Standards nach der Resolubilisierung aus dem Präzipitat. Die Darmsaftmatrix wurde mitder gleichen Menge an Standard versetzt wie für den Sollwert. Die Proben wurden anschließend mit 85 % Phosphorsäureauf pH 2 - 3 eingestellt. Das Präzipitat wurde mittels Zentrifuge abgetrennt und wie im Methodenteil beschrieben(Abschnitt 3.5.3) aufgearbeitet. Für die Quantifizierung wurde die Laufmittelkalibrierung (Abschnitt 4.1.3) verwendet.(n = 5); SD = Standardabweichung, VK = Variationskoeffizient

Konzentration theoretisch [µg/ml] LevelDel-3-O-glc 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 MW VK15,1 14,5 14,8 15,1 15,1 15,0 14,9 1,712,6 12,7 11,9 10,5 12,0 12,6 11,9 7,110,1 9,8 10,1 10,1 9,8 10,2 10,0 1,7Cy-3-O-glc11,8 12,4 12,3 12,0 12,0 11,8 12,1 2,09,8 10,5 10,1 9,6 10,2 10,9 10,3 4,237,8 7,7 7,4 8,1 8,1 7,5 7,8 4,6Cy-3-O-rut17,9 16,9 18,2 17,6 18,1 17,4 17,7 3,014,9 15,8 15,3 14,5 15,9 17,3 15,7 5,811,9 12,7 11,5 12,0 12,6 11,0 12,0 6,7

Tabelle 30: Konzentrationsverlauf des Quercetin-3-O-rutinosids (Rutin) während des Wachstums vonRhodococcus erythropolis DSM 44534 in modifiziertem Minimal-Salz-Medium (mod. MSM) auf 100 µMRutin als C-Quelle. Die Vorkultur wuchs über 4 Tage bei 37 °C im Inkubationsschüttler in modifiziertem Minimal-Salz-Medium mit 50 mM Ethanol als C-Quelle. Für die Ansätze mit verschiedenen C-Quellen wurden je 100 ml Mediumeingesetzt. Die Zelldichte betrug zu Beginn des Versuchs 0,2 OD620nm. Als C-Quelle wurden Rutin (100 µM) eingesetzt.Die Kulturen wurden über 5 Tage mit 37 °C im Inkubationsschüttler inkubiert und der Abbau von Rutin über die 5 Tagemittels HPLC verfolgt. Der Mittelwert (MW) zeigt die Summe der Rutinkonzentration aus Überstand und Präzipitat.(n = 3); SD = Standardabweichung.

Zeit [h] 0 24 48 72 96 120MW 59,6 50,5 41,6 40,4 34,7 30,3SD 5,5 10,1 6,1 4,3 1,9 4,0

172

Anhang

Tabelle 31: Relativer Anteil (Prozent) der identifizierten Mykolsäuren in Rhodococcus erythropolis DSM44534 Kulturen, die auf verschiedenen C-Quellen kultiviert wurden. Die Vorkultur wuchs über 4 Tage bei37 °C im Inkubationsschüttler in modifiziertem Minimal-Salz-Medium mit 50 mM Ethanol als C-Quelle. Für die Ansätzemit verschiedenen C-Quellen wurden je 100 ml Minimal-Salz-Medium eingesetzt. Die Zelldichte betrug zu Beginn desVersuchs 0,2 OD620nm. Als C-Quellen wurden Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin, 1 mM) und Zitronensäure (4 mM) einzelnund in Kombination eingesetzt. Im Kontrollansatz wurde nach der Vorkultur keine zusätzliche C-Quelle eingesetzt. Dievier Ansätze wurden über 7 Tage mit 37 °C im Inkubationsschüttler inkubiert und das Wachstum über die 7 Tage mittelsOD620nm verfolgt. Die Proben wurden für die ESI-MS/MS-Messung mittels Festphasenextraktion aufgereinigt. (n = 3);[M − H]− = deprotonierte Moleküle, KL:DB = äquivalente Kettenlänge und Anzahl der Doppelbindungen, RαCOO−

= Charakteristisches Fragment des α-Alkyl-Zweiges, * = spekulativ, es könnte sich auch um andere Fettsäuren handeln

[M-H]− KL:DB Mykolsäuren RαCOO− Kontrolle Zitronensäure Rutin Zitronensäure(Meromkolatkette/ und Rutinα-Alkyl-Zweig)

461 30:03:00 20:0/10:3 165 0,02119:0/11:3 179 0,01716:0/14:3* 221 0,01219:0/11:3 297 0,017

465 30:01:00 18:0/12:1 197 0,12917:0/13:1 211 0,02319:0/11:1 297 0,059 0,014

467 30:00:00 20:0/10:0 171 0,167 5,62 4,6719:0/11:0 185 0,006 0,144 0,0118:0/12:0 199 0,007 1,17 0,867

477 31:02:00 16:2/15:0* 241 0,069481 31:00:00 21:0/10:0 171 0,097

17:0/14:0 227 0,014 0,021 0,02616:0/15:0* 241 0,008 0,069 0,009 0,017

493 32:01:00 22:1/10:0 171 2,4620:1/12:0 199 1,0517:1/15:0* 241 0,007

495 32:00:00 22:0/10:0 171 13,5 15,0 45,420:0/12:0 199 57,9 51,9 12,118:0/14:0 227 1,2517:0/15:0* 241 0,006 0,002

501 33:04:00 24:3/9:1 155 0,65517:2/16:2* 265 0,392

509 33:00:00 22:0/11:0 185 4,77 7,3321:0/12:0 199 8,76 14,1 15,320:0/13:0 213 0,343 5,8019:0/14:0 227 0,24118:0/15:0 241 0,006 0,01517:0/16:0* 255 0,009 0,01 0,011

515 34:04:00 23:2/11:2 181 0,11823:3/11:1 183 0,121

517 34:03:00 19:0/15:3 235 0,03318:3/16:0* 255 0,01220:0/14:3 311 0,011

521 34:01:00 24:1/10:0 171 8,68 8,73 9,2222:0/12:1 197 24,9 18,422:0/12:0 199 8,68 37,3 36,920:0/14:1 225 6,9020:1/14:0 227 1,87 57,917:0/17:1* 267 1,0017:1/17:0* 269 0,004 0,01518:0/16:1* 253 0,067

173

Anhang

[M-H]− KL:DB Mykolsäuren RαCOO− Kontrolle Zitronensäure Rutin Zitronensäure(Meromkolatkette/ und Rutinα-Alkyl-Zweig)

523 34:00:00 24:0/10:0 171 5,75 88,8 7,5222:0/12:0 199 100 100 10020:0/14:0 227 41,9 0,511 57,8 57,918:0/16:0* 255 0,154 0,074 0,388 0,00917:0/17:0* 269 0,008 0,011

529 35:04:00 24:2/11:2 181 0,06424:3/11:1 183 0,31821:4/14:0 227 0,00319:4/16:0 255 0,00318:0/17:1* 267 0,014

531 35:03:00 24:3/11:0 185 0,10923:3/12:0 199 3,3919:2/16:1 253 0,00219:3/16:0 255 0,00818:0/17:3* 263 0,003

533 35:02:00 19:0/16:2 251 0,00219:2/16:0 255 0,00518:0/17:2* 265 0,00218:1/17:1* 267 0,00218:2/17:0* 269 0,005

535 35:01:00 23:1/12:0 199 0,00219:1/16:0 255 0,613 0,00218:0/17:1* 267 0,046 0,00218:1/17:0* 269 3,15

537 35:00:00 23:0/12:0 199 6,45 18,3 0,12119:0/16:0 255 0,101 0,58 0,00818:0/17:0* 269 0,006 0,02 0,003

547 36:02:00 24:2/12:0 199 4,1421:2/15:0 241 0,05720:2/16:0 255 5,1019:0/17:2* 265 0,18619:1/17:1* 267 0,07519:2/17:0* 269 0,077 0,01518:2/18:0* 283 0,161

549 36:01:00 26:1/10:0 171 10,424:1/12:0 199 74,4 79,322:1/14:0 227 32,4 47,7 37,820:1/16:0 255 0,46 0,912 0,02

551 36:00:00 24:0/12:0 199 42,6 100 52,2 56,122:2/14:0 227 78,9 86,4 97,720:0/16:0 255 6,71 0,06 17,4 21,119:0/17:0* 269 0,007 0,06 0,014 0,01118:0/18:0* 283 0,11

559 37:03:00 27:3/10:0 171 1,7325:3/12:0 199 28,3 10,523:3/14:0 227 8,73 4,6421:3/16:0 255 0,04819:3/18:0* 283 0,01

563 37:01:00 25:1/12:0 199 21,924:1/13:0 213 13,123:1/14:0 227 18,0

174

Anhang

[M-H]− KL:DB Mykolsäuren RαCOO− Kontrolle Zitronensäure Rutin Zitronensäure(Meromkolatkette/ und Rutinα-Alkyl-Zweig)19:1/18:0* 283 0,012

565 37:00:00 23:0/14:0 227 4,80 0,231 21,519:0/18:0* 283 0,016 0,143 0,034

575 38:02:00 26:2/12:0 199 3,98 5,03 18,424:2/14:0 227 1,21 57,222:2/16:0 255 0,048 0,081 49,120:2/18:0 283 0,03319:2/19:0* 297 0,008

577 38:01:00 26:1/12:0 199 66,8 60,8 42,2 79,924:1/14:0 227 68,2 85,3 83,623:1/15:0 241 0,00622:0/16:1 253 34,022:1/16:0 255 7,46 14,0 13,1

579 38:00:00 26:0/12:0 199 30,824:0/14:0 227 17,722:0/16:0 255 0,3420:0/18:0* 283 54,5

585 39:04:00 27:4/12:0 199 3,6721:4/18:0 283 0,475

587 39:03:00 27:3/12:0 199 18,3 6,36 7,4325:3/14:0 227 22,2 9,81 13,323:3/16:0 255 2,07 0,27920:3/19:0* 297 0,017

603 40:02:00 26:1/14:1 225 13,126:2/14:0 227 47,222:2/18:0 283 0,027

605 40:01:00 30:1/10:0 171 4,39 23,0 1,2128:1/12:0 199 43,1 40,3 12,0 46,626:1/14:0 227 67,3 0,545 18,7 72,624:0/16:1 253 10,024:1/16:0 255 13,4 5,62 4,99 31,322:1/18:0 283 0,012

607 40:00:00 28:0/12:0 199 2,1726:0/14:0 227 4,8824:0/16:0 255 4,88

613 41:04:00 27:4/14:0 227 0,96425:3/16:1 253 0,31525:4/16:0 255 0,1523:4/18:0 283 0,022

615 41:03:00 29:3/12:0 199 7,84 0,64327:3/14:0 227 14,1 1,3525:3/16:0 255 5,58 0,594

617 41:02:00 31:2/10:0 171 6,4229:2/12:0 199 6,4027:2/14:0 227 5,38

619 41:01:00 30:1/11:0 185 1,3429:1/12:0 199 3,67 12,628:1/13:0 213 0,999 4,4327:1/14:0 227 5,00 18,726:1/15:0 241 1,1425:1/16:0 255 1,15

175

Anhang

[M-H]− KL:DB Mykolsäuren RαCOO− Kontrolle Zitronensäure Rutin Zitronensäure(Meromkolatkette/ und Rutinα-Alkyl-Zweig)

631 42:02:00 30:2/12:0 199 7,1028:2/14:0 227 4,5426:2/16:1 253 2,93

633 42:01:00 30:1/12:0 199 26,9 20,6 44,528:1/14:0 227 30,9 25,426:1/16:0 255 10,0 9,80 4,40

635 42:00:00 30:0/12:0 199 8,29645 43:00:00 31:0/12:0 199 3,82

29:0/14:0 227 3,9328:0/15:0 241 0,29927:0/16:0 255 0,982

659 44:02:00 32:2/12:0 199 0,67130:2/14:0 227 0,88128:1/16:1 253 0,484

661 44:01:00 32:1/12:0 199 5,20 3,83 13,730:0/14:1 225 4,42 19,8 27,730:1/14:0 227 14,7 0,671 6,68 46,0

669 45:04:00 31:4/14:0 227 0,50627:4/18:0 283 0,041

687 46:02:00 34:2/12:0 199 2,4432:2/14:0 227 5,5730:2/16:0 255 1,32

689 46:01:00 34:1/12:0 199 9,9933:1/13:0 213 0,15232:1/14:0 227 4,02 7,4531:1/15:0 241 0,388 0,83330:1/16:0 255 6,91 13,7

697 47:04:00 35:4/12:0 199 0,04833:4/14:0 227 0,14631:4/16:0 255 0,0927:4/20:0 311 0,15 0,167

Tabelle 32: Ermitteltes Verhältnis von geraden zu ungeraden Alkanketten der identifizierten Mykolsäurenin Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Kulturen, die auf verschiedenen C-Quellen kultiviert wurden. DieVorkultur wuchs über 4 Tage bei 37 °C im Inkubationsschüttler in modifiziertem Minimal-Salz-Medium mit 50 mMEthanol als C-Quelle. Für die Ansätze mit verschiedenen C-Quellen wurden je 100 ml Minimal-Salz-Medium eingesetzt.Die Zelldichte betrug zu Beginn des Versuchs 0,2 OD620nm. Als C-Quellen wurden Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin, 1mM) und Zitronensäure (4 mM) einzeln und in Kombination eingesetzt. Im Kontrollansatz wurde nach der Vorkulturkeine zusätzliche C-Quelle eingesetzt. Die vier Ansätze wurden über 7 Tage mit 37 °C im Inkubationsschüttler inkubiertund das Wachstum über die 7 Tage mittels OD620nm verfolgt. Die Proben wurden für die ESI-MS/MS-Messung mittelsFestphasenextraktion aufgereinigt. (n = 3)

Ansatz Gerade : ungerade Anzahl an C-KettenKontrolle 62:38Rutin (1 mM) 61:39Zitronensäure (4 mM) 69:31Rutin (1 mM) + Zitronensäure (4 mM) 62:38

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Anhang

Publikationsliste:

Publikationen in Fachzeitschriften:

Schütt D.; Hageböck M.; Bader J.; Stahl U.; Garbe L.-A. (2013).Verhalten und Analytik von Anthocyanen im simulierten in-vitro Verdauungsmodell. Deutsche Le-bensmittelrundschau, Sonderthema: Analytik pflanzlicher Lebensmittel, 109:40-47

Tagungsbände:

Hageböck, M.;Baki, S.; Schütt, D.; Mast-Gerlach, E.; Bader, J.; Garbe, L.A.; Stahl, U. (2012).Nachweis der Funktionalität von pflanzlichen und mikrobiellen Lebensmittelinhaltsstoffen im simulier-ten Verdauungsmodell 3. Statusseminar Ernährung des BMBF

Schütt D., Martinez-Rojas E., Garbe L.-A. (2012).Aerobic degradation of polyphenols by whole cell or crude extract from Rhodococcus erythropolisDSM 44534. New Biotechnology, Supplement 1, 29:96

Schütt D., Hageböck M., Bader J., Stahl U., Garbe L.-A. (2012).Following the metabolism of polyphenols and proanthocyanins in an in-vitro digestion model. NewBiotechnology, Supplement 1, 29:125

Hageböck M., Schütt D., Popovic´ M.K., Stahl U., Garbe L.-A., Bader J.(2012)Identification of metabolizationof orally consumed products in a simulated digestion model. New Bio-technology, Supplement 1, 29:184

Schütt D., Hageböck M., Bader J., Mast Gerlach E., Stahl U., Garbe L.-A.(2011)Microbial metabolismof secondary plant metabolites by a simulated digestion model. Current Opinionin Biotechnology, Supplement 1, 22:97

Baki I., Schütt D., Bader J., Mast Gerlach E., Garbe L.-A., Stahl U. (2011)Functional, fermented beverages based on malted cereals and fruit components. Current Opinion inBiotechnology, Supplement 1, 22:98

Hageböck, M.;Baki, S.; Schütt, D.; Mast-Gerlach, E.; Bader, J.; Garbe, L.A.; Stahl, U. (2011)Nachweis der Funktionalität von pflanzlichen und mikrobiellen Lebensmittelinhaltsstoffen im simulier-ten Verdauungsmodell. 2. Statusseminar Ernährung der BMBF

Hageböck, M.;Baki, S.; Schütt, D.; Mast-Gerlach, E.; Bader, J.; Garbe, L.A.; Stahl, U. (2010)Nachweis der Funktionalität von pflanzlichen und mikrobiellen Lebensmittelinhaltsstoffen im simulier-ten Verdauungsmodell. 1. Statusseminar Ernährung der BMBF

Posterbeiträge auf Fachtagungen:

Schütt, D.; Martinez-Rojas, E.; Burkhardt, R.; Garbe, L.A.Partial purification of a ß-rutinosidase from Rhodococcus erythropolis DSM 44534 and degradationexperiment with different flavonoids as substrate. SMBB2013 – 12th Symposium on the Genetics ofIndustrial Microorganisms, 22.-26.06.2013 Cancun, Mexico

Schütt, D. Hageböck, M.; Bader, J.; Stahl, U.; Garbe, L.A.Analytik der Protein-Anthocyan-Komplexe 3. Statusseminar Ernährung des BMBF, 19.11.-21.11.2012Berlin, Germany

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Anhang

Schütt, D.; Martinez-Rojas, E.; Garbe, L.A.Degradation of polyphenols by using whole cells and crude extracts from Rhodococcus erythropo-lis DSM 44534 under aerobic conditions. ECB - 15. European Congress on Biotechnology, 23.09.-26.09.2012 Istanbul, Turkey

Schütt, D.; Hageböck, M.; Bader, J.; Stahl, U.; Garbe, L.A.Following the metabolism of polyphenols and proanthocyanins in an in vitro distention model. ECB- 15. European Congress on Biotechnology, 23.09.-26.09.2012 Istanbul, Turkey

Hageböck, M.; Schütt, D.; Popovic´, M.K.; Stahl, U.; Garbe, L.A.; Bader, J.Identification of metabolization of orally consumed products in a simulated digestion model. ECB -15. European Congress on Biotechnology, 23.09.-26.09.2012 Istanbul, Turkey

Schütt, D.; Hageböck, M.; Bader, J.; Mast-Gerlach, E.; Garbe, L.-A.; Stahl, U.Microbial metabolism of secondary plant metabolites by a simulated digestion model. 1st EuropeanCongress of Applied Biotechnology, 25. -.29.09.2011 Berlin ICC, Germany

Baki, I.; Schütt, D.; Bader, J.; Mast-Gerlach, E. Garbe, L.-A.; Rath, F.; Stahl, U.Controlled coculture fermentation for the production of a functional fermented beverage based onrenewable resources. 1st European Congress of Applied Biotechnology, 25. -.29.09.2011 Berlin ICC,Germany

Schütt D., Hageböck M., Bader J., Mast Gerlach E., Stahl U., Garbe L.-A.Microbial metabolismof secondary plant metabolites by a simulated digestion model. 1hth EuropeanBiotechnology Congress, 28.09. -01.10.09.2011 Istanbul, Turkey

Baki I., Schütt D., Bader J., Mast Gerlach E., Garbe L.-A., Stahl U.Functional, fermented beverages based on malted cereals and fruit components. 1hth European Bio-technology Congress, 28.09. -01.10.09.2011 Istanbul, Turkey

Hageböck, M.; Schütt, D.; Bader, J.; Mast-Gerlach, E. Garbe, L.-A.; Stahl, U.A Simulated Digestion Model for Metabolization of Fungic Food Ingredients. International ScientificConference on Probiotics and Prebiotics - IPC2011, 14. – 16.06.2011 Kosice, Slovakia

Schütt, D. Hageböck, M.; Bader, J.; Stahl, U.; Garbe, L.A.Analytik der Protein-Anthocyan-Komplexe. 2. Statusseminar Ernährung des BMBF, 16. -18.05.2011Berlin-Potsdam, Germany

Schütt, D. Hageböck, M.; Bader, J.; Stahl, U.; Garbe, L.A.Analytische Charakterisierung von Metaboliten im Projekt Darmmodell. 1. Statusseminar Ernährungdes BMBF, 23. -24.02.2010 Bonn, Germany

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