animales modificados genÉticamente en investigaciÓn

Rev. Farmacol. Chile (2012) 5(1): 9

ANIMALES MODIFICADOS GENÉTICAMENTE EN INVESTIGACIÓN FARMACOLÓGICA (Genetically Modified Animals in Pharmacological Research)

Mauricio D. Dorfman, Ph.D.

Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center/Oregon Health and Science University, Beaverton, Oregon, USA.

RESUMEN ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐

Los animales modificados genéticamente (AMG) son una herramienta ampliamente utilizada en la investigación biomédica, ya que permiten modelar enfermedades, estudiar las bases moleculares de las condiciones patológicas, identificar y validar nuevos blancos farmacológicos, y estudiar la farmacocinética y toxicidad de los fármacos. Los AMG pueden sobreexpresar un gen foráneo (animal transgénico), tener interrumpida la expresión de un gen (knock‐out), o tener reemplazado un gen en particular (knock‐in). El ratón es el animal de laboratorio de elección para la generación de AMG, principalmente por la facilidad con que es posible modificarlo genéticamente y su bajo costo económico de mantención. Entre los avances más destacados del último tiempo en las técnicas de ingeniería genética, esta la introducción de mutaciones célula o tejido‐específico, los cambios en el genoma del ratón que pueden inducirse o reprimirse en un momento puntual de la vida del animal, y la sustitución de genes del ratón por su ortólogo humano. Las limitaciones tecnológicas para producir modelos de ratones manipulados genéticamente son cada vez menores, mientras que las aplicaciones y ejemplos de usos de estos animales en farmacología, que podemos encontrar en la literatura, son cada vez mayores. Por lo tanto, entender lo que se requiere experimentalmente para responder una pregunta científica es tan importante, como conocer las herramientas biotecnológicas disponibles en el mercado. Esta revisión no tiene otro fin que informar de manera general los tipos de AMG que existen y ejemplificar los usos de estos en la investigación farmacológica. Palabras claves: Animales Modificados Genéticamente, Transgénicos, Knock‐Out, Knock‐In, Ratones Humanizados.

Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile

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INTRODUCCIÓN

La investigación biomédica tiene por objetivo, no sólo entender los mecanismos moleculares involucrados en el inicio y progresión de las enfermedades, sino también desarrollar nuevas estrategias para el tratamiento y prevención de dichas anomalías. Para este propósito, la validación experimental y los ensayos preclínicos utilizando modelos animales son indispensables. Los modelos animales de enfermedades pueden ser:

1) Naturales, es decir, que suceden espontáneamente,

como por ejemplo la ateroesclerosis en el mono ardilla. 2) Inducidos de forma física, como en el caso de las ratas

ovariectomizadas para el estudio de la osteoporosis. 3) Generados con el uso de agentes químicos, como es el

modelo de diabetes mellitus tipo 1 inducido con estreptozotocina.

4) Originado con un agente biológico, como en el caso del modelo animal de septicemia inducido con LPS.

5) Producido mediante manipulación genética.

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ARTÍCULO DE REVISIÓN


Estos últimos se definen como aquellos animales a los cuales, mediante técnicas de ingeniería genética, se les ha introducido, removido o reemplazado una región específica de su genoma. Dentro de los animales modificados genéticamente (AMG) están: 1) los animales transgénicos, que se definen como aquellos en los cuales se ha introducido un gen foráneo en su genoma y por lo tanto han ganado una función que anteriormente no tenían; y 2) los animales knock‐out (KO), que se definen como animales a los cuales se les ha eliminado de manera específica la expresión de un gen y como consecuencia han perdido una función que inicialmente poseían. En este último grupo se incluyen también a los animales knock‐in (KI), en los cuales se reemplaza una secuencia específica del genoma del animal, que puede ir desde un simple par de bases hasta el reemplazo de un gen completo. Recientemente, gracias a los avances en la tecnología que involucra a la ingeniería genética, los modelos animales transgénicos, KO y KI se han convertido en una herramienta de uso masivo. El mamífero de elección para la generación de modelos AMG es el ratón. Las ventajas del ratón por sobre otros mamíferos como la rata o el conejo, radican en la posibilidad de disponer de cientos de organismos genéticamente homogéneos en el corto plazo, la facilidad con que es posible modificar genéticamente su línea germinal y la gran disponibilidad de células embrionarias indiferenciadas. Estas ventajas se deben en parte a la facilidad para cruzarlos y el poco tiempo que demora obtener nuevas camadas. El costo económico de mantención de estos animales es otra ventaja a considerar, ya que por su tamaño, el espacio requerido para albergar un gran número de ellos es pequeño y la cantidad de alimento necesario es bajo, lo cual mantiene el costo en un rango asequible. El número de ratones modificados genéticamente que son utilizados en instituciones de investigación científica ha crecido rápidamente en las últimas décadas. Un dato que apoya el uso masivo de AMG proviene de un estudio retrospectivo, en el que se correlacionó positivamente el efecto conocido de las 100 drogas más vendidas, con el fenotipo observado en los ratones KO para los blancos moleculares de cada droga (1). Pero no sólo la industria farmacéutica se ha beneficiado con el uso de la tecnología genética en modelos animales, sino que básicamente todas las ramas de la farmacología han logrado resultados positivos con el uso de modelos de AMG. En esta revisión bibliográfica se abordará de manera general la forma de generar los distintos tipos de ratones manipulados genéticamente, se discutirán las diversas aplicaciones que tiene el uso de dichos modelos en los estudios farmacológicos y finalmente se analizará desde un punto de vista prospectivo los enfoques que tendrá el uso de los AMG en la investigación farmacológica en el futuro.

ANIMALES TRANSGÉNICOS El primer animal transgénico se generó hace más de dos décadas, mediante la microinyección de una secuencia lineal y purificada de ácido desoxirribonucleico (DNA) en ovocitos fertilizados (2) (Figura 1A). Desde entonces, la tecnología para generar animales transgénicos convencionales, por medio de la microinyección de embriones, no ha variado sustancialmente. Sin embargo, varias de las limitaciones iniciales, como por ejemplo la baja eficiencia del método y la integración azarosa del DNA exógeno, que muchas veces causaba mutaciones dañinas en el genoma del animal, han sido resueltas a lo largo de los últimos años. Los sistemas de transferencia de DNA que hoy están disponibles, como por ejemplo el uso de vectores virales, transferencia de DNA por medio de espermatozoides y clonamiento de células somáticas, permiten mejorar enormemente la eficiencia, disminuyendo los costos asociados con la generación de los ratones transgénicos (3). Por otra parte, se han desarrollado métodos para lograr la inserción del DNA exógeno en sitios específicos del genoma, evitando la producción de mutaciones indeseadas y toxicas para el animal. Además, la utilización de promotores específicos permite que el transgén (DNA exógeno) se exprese de forma tejido‐específico en el animal transgénico. Otro avance obtenido en la tecnología de los animales transgénicos es la inducción temporal o condicional de la expresión del transgén (4). La expresión inducida con tetraciclina es un sistema ampliamente utilizado en aquellos estudios donde la expresión del transgen durante el desarrollo causa la muerte del animal. De esta manera se puede “encender” o “apagar” al transgén mediante la inyección de análogos de la tetraciclina (Figura 1B). Un ejemplo de la utilidad de los transgénicos en la validación de una vía de transducción de señal terapéuticamente relevante, fue la expresión del gen humano que codifica para el transportador de glucosa 4 (GLUT4) en una cepa de ratón diabético (db/db). Los resultados obtenidos demostraron que la expresión del transgén GLUT4 mejoró la resistencia a la insulina y recuperó el control de la glicemia en los animales diabéticos (5). El descubrimiento de modelos animales que remeden las enfermedades humanas es fundamental para la identificación de nuevas terapias. En el caso de la enfermedad de Alzheimer (EA), no existen modelos animales que desarrollen espontáneamente las características de esta enfermedad (depósitos de ovillos neurofibrilares y placas amiloides en el cerebro). Por este motivo, se han invertido muchos recursos para generar modelos transgénicos de la EA. Un ejemplo de ellos es el ratón transgénico Tg2576 (6), uno de los modelos de EA más ampliamente utilizados en el mundo.


Figura 1.

A) Producción de un ratón transgénico mediante la microinyección de un pronúcleo. El material genético es inyectado directamente en un ovocito fertilizado y posteriormente este último es implantado en una hembra pseudopreñada. B) Sistema de regulación de la expresión del transgen mediante el sistema de la tetraciclina. Esta estrategia involucra dos transgenes. El transgén 1utiliza un promotor tejido‐específico para conducir la expresión de un represor o activador reverso de la transcripción del operón de tetraciclina (representado en este esquema por el sitio de respuesta a tetraciclina: ERT). El transgén 2 lleva en su construcción el cDNA de interés, cuya expresión está controlada por el elemento de respuesta a tetraciclina. En presencia del antibiótico tetraciclina se bloquea el efecto del represor (rtTA) y se induce la transcripción del cDNA (encendido del transgén 2). Por el contrario, en ausencia de tetraciclina, el represor rtTA mantiene apagada la expresión del cDNA de interés.

Otro ejemplo de un modelo transgénico que desarrolla una condición patológica, es el ratón transgénico de la 11β‐hidroxiesteroide deshidrogenasa, cuya secuencia génica se ha colocado bajo el control del promotor de la cadena pesada de la α‐miosina, permitiendo así la sobreexpresión de este transgén específicamente en células de la musculatura cardiaca. Este animal transgénico tejido‐específico presenta una condición de hipertrofia, fibrosis y falla cardiaca (7). La administración de eplerenona, un bloqueador selectivo de la aldosterona, mejoró significativamente la condición patológica del animal. Gracias a este transgénico se descubrió que la activación inapropiada del receptor de mineralocorticoide provoca daños a nivel cardiaco y que el bloqueo de la aldosterona tiene beneficios terapéuticos en la falla cardiaca.

Los AMG además se han utilizados ampliamente en estudios farmacocinéticos, permitiendo mejorar el conocimiento de la función in‐vivo de enzimas, proteínas transportadoras y receptores de xenobióticos involucrados en el metabolismo y transporte de drogas. Un ejemplo de animal transgénico utilizado para el estudio del metabolismo de drogas, corresponde al ratón transgénico de la citocromo P450 3A4 (CYP3A4), cuyo estudio mejoró el conocimiento del metabolismo de primer paso del midazolam (8). La toxicología es otra rama de la farmacología que ha obtenido beneficios de la investigación con animales transgénicos. En esta área, sin embargo, hay que tener especial cuidado con las diferencias entre especies a la hora de interpretar los resultados. Esto debido a que muchas veces la interacción de una droga con una enzima, transportador o receptor no será igual en el animal que en el humano, debido a las diferencias en la composición y/o expresión génica de las diferentes especies. En este sentido, un avance importante ha sido la posibilidad de generar animales “humanizados”, es decir, animales en los cuales se reemplaza un gen del ratón por su ortólogo humano, mejorando de esta forma la predicción del riesgo del xenobiótico en humanos (revisar en la sección de animales KI). ANIMALES KNOCK‐OUT La generación de animales KO fue precedida principalmente por dos descubrimientos en la década de 1980, el aislamiento de células madre de embriones de ratón (mES) y la posterior demostración de la posibilidad de interrumpir un gen particular con un gen de neomicina en células mES. Estos eventos permitieron posteriormente la producción de ratones KO, mediante la interrupción de un gen específico a través de la tecnología de recombinación homóloga en células mES. La razón por la cual se utilizan las células mES en la producción de ratones KO, es que estas células son pluripotentes y por lo tanto, darán origen a los distintos tipos celulares del animal adulto. Además, estas células pueden mantenerse en cultivo de manera indiferenciadas y escoger, mediante la selección con antibióticos, aquellos clones que tienen el constructo en la región correcta del genoma antes de inyectarlas en el embrión (Figura 2A). El proceso para generar un ratón KO tiene dos etapas: la construcción del vector (Figura 2A) y la inyección de las células mES, que han incorporado correctamente el constructo en su genoma, en la etapa de blastocisto del embrión (Figura 2B). Uno de los principales inconvenientes de esta tecnología es que la mutación (interrupción del gen) es transmitida a través de la línea germinal, por lo que todas las células del organismo llevan la mutación inducida (animal KO convencional). Sin embargo, el desarrollo de la


tecnología Cre‐LoxP ha permitido eliminar la expresión de un gen de forma célula‐específica (animal KO condicional) (9). Para la utilización de esta tecnología se requiere dos tipos de animales: 1) Uno que exprese el gen Cre (nombre proveniente del

inglés: Causes Recombination) que codifica para la enzima recombinasa, la cual producirá la recombinación homologa al reconocer los sitios LoxP.

2) Un animal que tenga el gen de interés, flanqueado por

dos sitios LoxP, que corresponden a secuencias génicas que serán reconocidas por la enzima recombinasa CRE.

Si la expresión del gen Cre está bajo el control de un promotor de un gen que se expresa en un tipo celular determinado, se obtendrá como resultado un animal KO condicional o tejido‐específico. La figura 3 ilustra la producción de un ratón KO para un gen X, específicamente en hepatocitos, mediante el sistema Cre‐LoxP. Además, es posible inducir la expresión de la recombinasa en un momento determinado de la vida del animal mediante, por ejemplo, el uso de un sistema inductor como el de la tetraciclina (animal KO condicional, inducible) (10). Una alternativa al uso de vectores de expresión transgénicos inducibles, es la infección de ratones con vectores de expresión viral que expresen la proteína CRE. Estos virus pueden ser administrados en el animal adulto localmente, con lo cual se logra la infección en las células que rodean el sitio de de inyección, o mediante inyección intravenosa, con lo cual se pierde especificidad en la infección. Durante los últimos 20 años se han generado miles de ratones KO en todo el mundo, lo cual ha permitido a los científicos usar esta herramienta experimental en todas las aéreas de la biología, fisiología y farmacología. Los animales KO son utilizados ampliamente como modelos de ciertas condiciones clínicas relevantes. Ejemplo de ello son: el ratón KO para Apoliproproteina E, utilizado como modelo de ateroesclerosis (11); y los ratones KO para el receptor de insulina, GLUT4, el receptor del factor de crecimiento tipo insulina 1, el sustrato del receptor de insulina 1 y 2, cuya finalidad es estudiar los mecanismos moleculares asociados con la fisiopatología de la resistencia a la insulina y diabetes mellitus tipo 2 (12). Como ejemplos del uso de animales KO en estudios farmacológicos podemos mencionar al ratón KO para glutatión S transferasa pi (GstP‐KO). Este gen codifica para una de las enzimas glutatión S‐transferasas más importantes, la cual es responsable de la defensa celular del organismo contra toxinas endobióticas y xenobióticas. Los estudios con el modelo de ratón GstP‐KO permitió determinar el efecto carcinogénico del 7,12‐dimetilbenceno antraceno (DMBA) (13), el efecto

hepatotóxico del paracetamol (14) y la disfunción endotelial producida por el tabaco (15).

Figura 2.

Proceso para generar un ratón KO mediante recombinación homóloga en células mES. A) El vector contiene el gen de interés (Gen A), interrumpido por el gen de resistencia a la neomicina (neor) y todo esto flanqueado por dos regiones de homología, que permiten la inserción del constructo en el lugar donde está ubicado el gen original en el genoma del ratón. Una vez que el vector es introducido en las células mES, se seleccionan aquellos clones que tienen el inserto, cultivando las células en presencia de neomicina. B) Las células mES con el inserto en la ubicación deseada, son inyectadas en el blastocisto de un ratón de aproximadamente 4 días de gestación y posteriormente el blastocisto se transplanta en el útero de una hembra pseudopreñada. Los ratones de la primera camada son quimeras, ya que tienen una mezcla de las células propias del blastocisto y las células mES inyectadas. Los animales KO homocigotos se obtienen haciendo una selección mediante nuevos cruzamientos y la genotipificación del constructo.

Otro ejemplo son los ratones KO para las diferentes isoformas de la Glicoproteína‐P MDR1. Esta glicoproteína, que tiene un alto nivel de expresión en la membrana apical


de los enterocitos, en la superficie biliar de los hepatocitos y en el lado luminal de las células del tubo proximal del riñón, participa en la absorción, distribución y excreción de drogas. Estudios realizados con estos animales KO demostraron la importancia de las diferentes isoformas de esta glicoproteína en la farmacocinética y toxicidad de varios fármacos como la invermectina, vinblastina, dexametasona, digoxina, ciclosporina A, loperamida y rodamina (16). ANIMALES KNOCK‐IN Esta tecnología se basa en la inserción o reemplazo de una secuencia de DNA en un sitio definido del genoma del animal, utilizando, al igual que en la tecnología para generar KO, la recombinación homologa en células mES. La humanización de ratones mediante la tecnología KI (reemplazo de un gen del ratón por su ortólogo humano), se ha convertido en una herramienta muy importante para evaluar in vivo la eficacia, perfiles farmacocinéticos y toxicológicos de innumerables drogas. Por ejemplo, el ratón KI humanizado para el receptor de quimioquina 1 (CCR1) se usó para estudiar el efecto de antagonistas de CCR1 específicos de humano sobre la modulación de la respuesta inflamatoria (17). En este modelo animal, el gen Ccr1 del ratón fue reemplazado completamente por el gen CCR1 humano, sin embargo no siempre es necesario el reemplazo completo del gen para lograr la “humanización”. Un ejemplo de esto último, es el estudio realizado en un ratón KI para el receptor de trombopoyetina (TPOr). En este KI humanizado se reemplazó solamente los exones 8, 9 y 10, ya que esta región era la responsable de la especificidad de los agonistas que se quería investigar. Los agonistas, con especificidad por el TPOr humano, fueron inyectados en los ratones KI humanizados para TPOr y demostraron un efecto dosis‐respuesta respecto al número de plaquetas. La tecnología KI también se utiliza para introducir mutaciones puntuales y modelar enfermedades humanas en el ratón, inactivar regiones esenciales de una proteína, como el dominio catalítico de una quinasa, o el sitio de unión a drogas de la proteína blanco. Un estudio que demuestra esto último es el ratón KI α2δ1 R217A, en el cual se modificó una arginina por una alanina en la ubicación 217 de la subunidad α2δ1 del canal de calcio dependiente de voltaje. Con este KI se demostró que el mecanismo de acción del efecto analgésico de gabapentina y pregabalina es mediado por una interacción específica con el aminoácido arginina 217 de la subunidad α2δ1 del canal de calcio (18). Con respecto a la utilización de la tecnología KI para modelar una enfermedad humana en el ratón, en teoría cualquier enfermedad humana causada por una mutación es posible estudiarla en un ratón KI en el que se ha mutado su ortólogo humano. Es el caso por ejemplo, del ratón KI con repeticiones CAG en el gen de

Huntingtina, el cual remeda la enfermedad de Huntington (19).

Figura 3.

Obtención de ratones KO hepatocito‐específico utilizando el sistema Cre‐LoxP. Esta estrategia experimental requiere de dos tipos de ratones. El primero (izquierda) es un ratón transgénico que expresa el gen de la enzima recombinasa CRE bajo el control del promotor de la Albumina (Alb), cuya expresión se produce exclusivamente en los hepatocitos del ratón. El ratón de la derecha tiene el gen que se desea eliminar (gen X) flanqueado por dos stios LoxP. El cruce de estos dos animales da origen a ratones KO para el gen de interés específicamente en las células que expresan la enzima recombinasa CRE. En este ejemplo, los hepatocitos sufren la eliminación del gen X mediante recombinación de los sitios LoxP (ilustrado en el esquema con una tijera). El resto de las células del ratón, que no expresan CRE, tienen el gen de interés flanqueado por los sitios LoxP, lo cual no afecta la transcripción del gen o traducción ribosomal de su mRNA.

En esta revisión bibliográfica se ha descrito de forma general los diferentes tipos de modelos de animales modificados genéticamente, ejemplificando de entre miles de ejemplos existentes, algunas aplicaciones específicas de estos animales en investigaciones farmacológicas. El gran avance del último tiempo en las tecnologías para manipular el genoma de ratón, permiten al científico innovar en las modificaciones genómicas casi sin limitaciones. Por lo tanto, para determinar el tipo de modelo AMG que sería útil generar, es relevante entender cuáles son las necesidades del proyecto científico del que se participa. Por otra parte, aquellos científicos interesados en adquirir modelos AMG pueden dirigirse a diferentes empresas biotecnológicas u organizaciones sin fines de lucro que ofrecen sus servicios y productos a través de páginas web. The Jackson Laboratory (http://www.jax.org) es una organización independiente y sin fines de lucro, la cual está enfocada principalmente en la investigación genética de mamíferos con la finalidad de ayudar a mejorar la salud humana. Por otro lado, el Consorcio Internacional de Ratón Knock‐Out (IKMC), creado el año 2007, y que asocia tres de los consorcios más importantes del mundo en el ámbito de los ratones KO, tiene como principal aspiración mutar todos los genes codificantes en el ratón (alrededor de 30.000) mediante ingeniería genética de una línea celular estandarizada de mES proveniente de ratones


C57BL/6. El sitio web del IKMC (http://www.knockoutmouse.org) permite, no sólo buscar y comprar un determinado ratón KO, sino que también conocer el estado en que se encuentra la generación de un ratón KO para un gen particular. Finalmente es importante considerar que los modelos de AMG, si bien son herramientas únicas y valiosas para las investigaciones farmacológicas básicas y preclínicas, tienen limitaciones que no debieran subestimarse una vez que se obtienen los resultados de la investigación. La inserción o eliminación de genes mediante las técnicas de ingeniería genética, podría conducir a cambios no deseados en la expresión de otros genes en el AMG y de esta forma enmascarar o exagerar el fenotipo del animal. Además, no debemos olvidar que se trata de modelos animales que, aunque comparten una muy alta homología genética con el ser humano, fenotípica y médicamente hablando son completamente diferentes. Por lo tanto, no debemos esperar que un modelo animal simule de manera perfecta una enfermedad, un proceso fisiológico o el comportamiento de un fármaco en el humano. En el futuro se espera que la tecnología avance hacia la mejora en la humanización de los AMG, de tal forma que los modelos experimentales sean cada vez más similares a los humanos. Con el mismo rumbo, las técnicas de ingeniería genética en animales pretenden hacer viable económica y técnicamente eficiente la generación de modelos fenotípicamente más parecidos al humano, como es la manipulación genética en primates no humanos.

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