ANKARA NVERSTES FEN BLMLER ENSTTS

YKSEK LSANS TEZ

FARKLI HDROLZ YNTEMLERYLE NOHUTTAN ELDE EDLEN FTOSTROJENLERN HPLC VE GC-MS LE BELRLENMES

Deryacan AYGNE

GIDA MHENDSL ANABLM DALI

ANKARA 2011

Her Hakk Sakldr

i

ZET

Yksek Lisans Tezi

FARKLI HDROLZ YNTEMLERYLE NOHUTTAN ELDE EDLEN FTOSTROJENLERN HPLC VE GC-MS LE BELRLENMES

Deryacan AYGNE

Ankara niversitesi

Fen Bilimleri Enstits Gda Mhendislii Anabilim Dal

Danman: Prof. Dr. Nevzat ARTIK

Bu almada nohut materyalinin iermekte olduu serbest isoflavon (biochanin A, formononetin, genistein, daidzein ve glycitein), konjuge isoflavon (sissotrin, ononin, genistin, daidzin ve glycitin), lignan (secoisolariciresinol ve matairesinol), coumestan (coumestrol) ve dier flavonoidler (apigenin, quercetine ve rutin) gibi fitostrojenik aktiviteye sahip bileik konsantrasyonlar farkl rnek hazrlama yntemleri uygulanmas sonrasnda eitli kromatografik teknikler kullanlarak belirlenmitir. alma kapsamnda uygulanan rnek hazrlama yntemleri metanol ve seyreltik HCl ile direkt ekstraksiyon, deriik HCl ve inkbasyon ile asit hidrolizi, sellaz, -glucosidase ve -glucuronidase enzimleri ve inkbasyon ile enzimatik hidroliz ve enzimatik ve asit hidrolizlerinin birlikte uyguland oklu hidroliz olmutur. Kromatografik tekniklerden ise HPLC (HPLC-DAD ve LC-MS/MS) ile GC-MS kullanlmtr. Tekrarlanabilirlik ve hassasiyet gibi faktrler (tayin limiti aral 0.9-3.0 ppb) nedeni ile en etkin yntem LC-MS/MS olarak belirlenmitir. Nohut rneklerine uygulanan oklu hidroliz sonucunda tespit edilen balca isoflavan bileiinin be secoisolariciresinol olduu belirlenmitir. oklu hidroliz uygulanan rnekler 967.9 ppb ile en yksek isoflavon konsantrasyonuna sahip olmulardr. Ayrca direkt hidroliz uygulanan rneklerdeki rutin en yksek dier flavonoid konsantrasyonuna (55.8 ppb). Nohut rneklerinde toplam fitostrojenik madde dzeyleri 484.3 3844.8 ppb aralnda deiiklik gstermektedir. rneklerin hi birinde coumestrol, daidzin ve quercetin tespit edilememitir. Aratrma verileri, toplam isoflavon ve toplam lignan tayinleri iin nohut enzimatik hidroliz, toplam dier flavonoid tayini iin ise direkt hidroliz yntemlerinin etkili olduunu ortaya koymu olmakla birlikte bileikler baznda bu kk deiiklikler gsterebilmektedir.

Aralk 2011, 123 sayfa Anahtar Kelimeler: Fitostrojen, nohut, LC-MS/MS, HPLC-DAD

ii

ABSTRACT

Master Tesis

HPLC AND GC-MS IDENTIFICATON OF CHICKPEAS PHYTOESTROGENS

OBTAINED BY USING DIFFERENT HYDRALIZATION METHODS

Deryacan AYGNE

Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Food Engineering

Supervisor: Prof.Dr. Nevzat ARTIK

This study identified concentrations of phytoestrogenic compounds such as free isoflavones (biochanin A, formononetin, genistein, daidzein and glycitein), conjugated isoflavones (sissotrin, ononin, genistin, daidzin and glycitin), lignan (secoisolariciresinol and matairesinol), coumestan (coumestrol) and other flavonoids (apigenin, quercetine and rutin) contained by chickpea, using different chromatographic methods after different sample preparation methods. Sample preparation methods used in the study included simple extraction with methanol and diluted HCl, acid hydrolysis with concentrated HCl and incubation, enzymatic hydrolysis with cellulose, -glucosidase and -glucuronidase enzymes and incubation and multiple hydrolysis with collective use of enzymatic hydrolysis and acid hydrolysis. Among chromatographic methods, HPLC (HPLC-DAD and LC-MS/MS) and GC-MS were used in the study. The most effective method was found to be LC-MS/MS due to factors of repeatability and sensitivity (range of identification limit 0.9-3.0 ppb). Major phytoestrogenic compound was found to be secoisolariciresinol in all chickpea samples with the highest concentration (2860.8 ppb) by multiple hydroyslis . The samples that treated by multiple hydrolysis have highest isoflavone concentration with 967.9 ppb. On the other hand, rutin treated by direct hydrolysis has the highest other flavonoid concentration with 55.8 ppb. Total phytoestrogenic substance amounts of chickpea samples varied between 484.3 3844.8 ppb according to the hydrolysis methods. Although study data revealed that multiple hydrolysis was effective for total isoflavone and total lignin identification and direct hydrolysis method was effective for identification of total other flavonoid, compounds can show small variations. December 2011, 123 pages Key Words: Phytoestrogen, chickpea, LC-MS/MS, HPLC-DAD

iii

TEEKKR

Tez almas ncesi ve sresince her trl destek ve bilgilerini benden esirgemeyen

danmanm Sayn Prof. Dr. Nevzat ARTIK (Ankara niversitesi Mhendislik Fakltesi

Gda Mhendislii Anabilim Dal), Sayn Prof. Dr. Ender Sinan POYRAZOLU

(Ankara niversitesi Mhendislik Fakltesi Gda Mhendislii Anabilim Dal ) ve

Uzman Nevzat KONARa (Ankara niversitesi Mhendislik Fakltesi Gda

Mhendislii Anabilim Dal);

HPLC almalar srasnda nerileri ve destekleri iin Sayn Prof. Dr. Sedat

VELOLUna (Ankara niversitesi Mhendislik Fakltesi Gda Mhendislii

Anabilim Dal);

Her zaman yanmda olan ve sahip olduum iin ne kadar ansl olduumu hissettiren

babam Deniz AYGNE, annem Zeynep AYGNE ve biricik kardeim Aylin

AYGNEe ayrca destekleri ve dostluklaryla yalnz brakmayan herkese ok

teekkr ederim.

Deryacan AYGNE

Ankara, Aralk 2011

iv

NDEKLER

ZET. i ABSTRACT.. ii TEEKKR..... iii SMGELER ve KISALTMALAR DZN vi EKLLER DZN. viiiZELGELER DZN... ix 1.GR. 1 2.KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ZETLER.... 4 2.1 Fitostrojenler 4 2.1.1 Fitostrojenlerin snflandrlmas. 6 2.1.2 Gda maddeleri ve fitostrojenik bileikler..... 13 2.1.5 Fitostrojenik bileiklerin salk zerine etkileri 17 2.2 Kaynak zetleri. 21 3. MATERYAL ve YNTEM. 32 3.1 Materyal.. 32 3.1.1 rnekler... 32 3.1.2 Reaktifler ve ekipmanlar 32 3.1.3 Standart maddeler.. 33 3.2 Yntem 36 3.2.1 rnek hazrlama yntemleri.. 36 3.2.1.1 Direkt ekstraksiyon yntemi... 36 3.2.1.2 Asit hidrolizasyon yntemi.. 36 3.2.1.3 Enzimatik hidroliz yntemi. 37 3.2.1.4 oklu (enzimatik+asit) hidrolizasyon yntemi. 39 3.2.2 Kat faz ekstraksiyon (SPE) yntemi 42 3.2.3 LC-MS/MS... 42 3.2.4 statistiksel analiz 48 4. BULGULAR. 49 4.1 Nohut rneine Ait Bulgular 49 4.2 Coumestrol Tayini.. 55

v

5. TARTIMA VE SONU 56 5.1 Deerlendirme 56 5.2 neriler... 61 KAYNAKLAR 63

EKLER 74

Ek 1 LC-MS/MS kalibrasyon erileri.. 75

Ek 2 LC-MS/MS teknii ile nohut rneklerinde Direkt Hidrolizasyon

uygulamas sonucundaki fitostrojenik bileiklere ait kromatogramlar..... 91

Ek 3 LC-MS/MS teknii ile nohut rneklerinde Asit Hidrolizasyon

uygulamas sonucundaki fitostrojenik bileiklere ait kromatogramlar 99

Ek 4 LC-MS/MS teknii ile nohut rneklerinde Enzim Hidrolizasyon

uygulamas sonucundaki fitostrojenik bileiklere ait kromatogramlar. 107

Ek 5 LC-MS/MS teknii ile nohut rneklerinde oklu Hidroliz uygulamas

sonucundaki fitostrojenik bileiklere ait kromatogramlar..... 115

vi

SMGELER VE KISALTMALAR DZN

4CL 4-Coumarate Ligaz ACCase AsetilCoA Karboksilaz AH Asit Hidrolizi BHT Butilendirilmi Hidroksi Toluen BSTFA N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide C4H Cinnamate 4-Hydroksilaz CAS Chemical Abstracts Service CoA Koenzim A Cy Siyanidin DDT Dikloro Difenol Trikloroethan DE Direkt Ekstraksiyon DMSO Dimetilslfoksit DNA Deoksiribo Nkleik Asit Dp Delfinidin DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EAH oklu (Enzimatik+Asit) Hidroliz EH Enzimatik Hidroliz ER strojen Reseptr ER strojen Reseptr FDA Amerikan Gda ve la Dairesi FOSHU Foods for Specified Health Use GC-MS Gaz Kromatografisi-Ktle Spektroskopisi GC-MS/MS Gaz Kromatografi- Sral Ktle Spektroskopisi GSH Glutathione HCl Hidroklorik Asit HDL Yksek Younluklu Lipoprotein HP Helix pomatia HPLC Yksek Performans Sv Kromatografi HPLC/DAD-MS Sv Kromatografi-Diode Array Dedector- Ktle

Spektroskopisi HPLC-CAD Sv Kromatografi-Coulometric Electrode Array Detection HPLC-DAD Sv Kromatografi-Diode Array Dedector HPLC-UV/VIS-DAD Sv Kromatografi-Ultra Viole-Visible- Diode Array Dedector IFIC The International Food Information Council ILSI International Life Science Institute LC-API-MS Sv Kromatografi-Atmosferik Basn Kimyasal yonizasyon-

Ktle Spektrometrisi LC-MS Likit Kromatografi- Ktle Spektroskopisi LC-MS/MS Likit Kromatografi- Sral Ktle Spektroskopisi LDL Dk Younluklu Lipoprotein LOD Limit of Dedection- Tehis Limiti LOQ Limit of Quantitation- Tayin Limiti NO Nitrit Oksit o-DMA o-Desmetil-Angolensin PAL L-Fenilalanin Amonyakliaz

vii

Pg Pelarginidin RP-LC Terz Faz-Sv Kromatografi SDG Sekoisolariciresinol Diglikozid SPE Kat-Faz Ekstraksiyon TMCS Trimethylchlorosilane

viii

EKLLER DZN

ekil 2.1 17--estradiol kimyasal yaps.. 4

ekil 2.2 Diyetsel strojenlerin snflandrmas ve kaynaklar 6

ekil 2.3 Baz fitostrojen altgruplar.. 8

ekil 2.4 Zearalenon kimyasal yaps... 8

ekil 2.5 eitli fitostrojenlerin kimyasal yaplar. 10

ekil 2.6 Baz isoflavonlarn kimyasal yaplar 11

ekil 2.7 Enterolakton kimyasal yaps 11

ekil 2.8 Enterodiol kimyasal yaps 12

ekil 3.1 Direkt ekstraksiyon yntemi ile rnek hazrlama. 37

ekil 3.2 Asit hidrolizasyon yntemi ile rnek hazrlama... 38

ekil 3.3 Enzimatik hidrolizasyon yntemi ile rnek hazrlama...... 39

ekil 3.4 oklu (enzimatik+asit) hidrolizasyon yntemi. 41

ekil 3.5 Aratrmada kullanlan likit kromatografi (1) tandem quadrupol ktle spektrometre(2)ye ait bir grnt.... 45 ekil 4.1 Nohut LC-MS/MS toplam iyon kromatogram rnekleri. 54

ekil 5.1 LC-MS/MS teknii ile nohut rneinde incelenen fitostrojenik bileiklere ait standart maddelerin toplam iyon kromatogram 56

ix

ZELGELER DZN

izelge 2.1 Baz gdalarn toplam izoflavon ierikleri (yenilebilir porsiyonda).. 16

izelge 2.2 Baz gdalarn lignan ierikleri.. 17

izelge 3.1 Aratrmada kullanlan standart maddeler.. 34

izelge 3.2 rnek kodlar.. 36

izelge 3.3 LC-MS/MS sistemi zellikleri 42

izelge 3.4 LC-MS/MS metodu koullar.. 44

izelge 3.5 LC-MS/MS yntemi, tayin ve tehis limitleri. 44

izelge 3.6 LC-MS/MS ynteminde incelenen standart maddelere ait baz zellikler.. 46

izelge 3.7 LC-MS/MS ynteminde incelenen standart maddelere ait iyonlara ait baz zellikler. 47

izelge 4.1 Farkl rnek hazrlama yntemleri uygulanm nohut rneklerinde LC-MS/MS ile belirlenen isoflavonlarn miktarlar... 51

izelge 4.2 Farkl rnek hazrlama yntemleri uygulanm nohut rneklerinde LC-MS/MS ile belirlenen lignanlarn miktarlar (ppb)... 52

izelge 4.3 Farkl rnek hazrlama yntemleri uygulanm nohut rneklerinde LC-MS/MS ile belirlenen dier flavonoidlerin miktarlar... 52

izelge 4.4 Nohut rneklerindeki fitostrojenik madde miktarlarnda rnek hazrlama yntemine gre bileik snf esasl deiim. 53

izelge 5.1 Aratrma kapsamndaki kromatografik teknikte (LC-MS/MS) belirlenen tayin (LOQ) ve tespit (LOD) limitleri 57

izelge 5.2 LC-MS/MS ynteminde uygulanan hidroliz yntemlerine gre toplam isoflavon, lignan ve dier flavonoiid bileiklerindeki konsantrasyon deiimi 59

1

1. GR Fitostrojenik bileiklerin genel olarak merkezi sinir sistemi zerinde strojenik etkiler

uygulayan, strusu tevik eden, dii hayvanlarda jenital sistemin geliimini stimule eden

maddeler grubu eklinde tanmlanr.

Bitkilerde antioksidan ilevi gren bu maddeler, hayvanlarda ve insanlarda ise strojen

agonist ve antagonistleri olarak fonksiyonlar bulunmaktadr. Bu zellikleri nedeni ile

fitostrojenik bileikler, biyoaktif bileikler grubunda yer alabilir niteliktedirler.

Fitostrojenler, flavonoidler, isoflavonlar, lignanlar, komestanlar ve stilbenler olmak

zere farkl snflara mensup maddelerin iinde yer ald bir bileik grubudur. Bu

maddelere rnek olarak belirtilebilecek ve yaygn olarak aratrma kapsamlarna alnm

olan maddeler arasnda flavonoidlerden apigenin, rutin, quercetin; isoflavonlardan

biochanin A, formononetin, glycitein, daidzein ve genistein ile birlikte bu maddelerin

konjuge formlar, lignanlardan secoisolariciresinol, pinoresinol, lariciresinol ve

matairesinol, coumestanlardan coumestrol bulunmaktadr. zellikle son yllarda

gerekletirilen epidemiyolojik almalarn sonucunda elde edilen veriler bu maddeler

ile ilgili almalarn younlamas zerinde nemli etkiye sahiptir. Epidemiyolojik

almalar fitostrojence zengin diyetle beslenen toplumlarda kardiyovaskler

hastalklar, osteoporoz, gs, prostat ve barsak kanserleri ile ilgili ikayetlerin daha

az grldn ve postmenapozal kadnlarda strojen yetersizliine bal semptomlarn

hafif yaven gstermektedir (Byktuncer ve Baaran 2005).

Diyette fitostrojen bileikler iin balca kaynan Asya diyetinin ok nemli bir esi

olan soya ve soya trevi gdalar ve baz Leguminase familyasndan gda maddeleri

olduu pek ok aratrma tarafndan vurgulanmtr. Ancak gerek bat Avrupa ve

Amerikan diyetinde gerekse de geleneksel Trk diyetinde, fitostrojen bileiklerin

balca kaynaklar olduklar nitelendirilen gda maddelerinden yalnzca baz legumlar

yer almaktadr. Bu nedenle de Asya tipi diyet dndaki dier diyetlerde yer alan belirli

gda maddelerinin fitostojen bileikler asndan bileimlerinin incelenmesi gereklilii

sz konusu olup, bu almann yrtlmesi srasnda gerekletirilen kaynak taramalar

srasnda yukarda belirtilen trde bir aratrmaya rastlanlmamtr.

2

Fitostrojenik bileik ile ilgili yrtlen aratrmalar snflvermak iin birka farkl

faktr kullanabiliriz. Bu faktrler; rnek tr, rnek hazrlama metodu, tayin ve tespit

metodu olarak sralanabilir.

Analiz uygulamalar iin kullanlan rnek hazrlama yntemlerinin elde edilen bileik

bileim ve konsantrasyonu zerinde, gda maddesi ve bileik tr, gda maddesi

matriksi gibi faktrlerin etkisi nedeni ile deiik sonular elde edilmesine neden

olabilmektedir. Drt farkl yntem ile uygulanan rnek hazrlama almalar, temel

ekstraksiyonun gerekletirilmesi, asit hidrolizasyonu uygulamas, enzimatik

hidrolizasyon uygulamas veya asit ve enzim etkisi ile hidrolizin ayn rnek hazrlama

prosedrnde kullanlmas sonucu gerekletirilmektedir. Enzimatik hidroliz

uygulamalarnda, tayin ve tespiti hedeflenen bileiklerin aglikon formunun matriksten

ayrlmasn salanmas amac ile sahip olduu bilinen ba yapsn paralama

potansiyeline sahip olan enzim tr seilmesi ile gerekletirilebilmektedir.

Kromatografik yntemler fitostrojenik bileiklerin analizlerinde kullanlan balca

analiz yntemleridir. Bu tekniklerden HPLC, GC-MS, LC-MS ve LC-MS/MS ne

kanlardr. Yntem belirlenmesinde dikkat edilmesi gereken ynlerden birisi aratrma

kapsamnda yer alan bileiklerin tayinine olanak verebilecek teknie sahip yntemin

seilmesi gerekliliidir.

Bu almada, lkemizde yaygn olarak tketilen bir baklagil eidi olan nohutdan farkl

hidroliz yntemleri ile elde edilen rneklerin eitli kromatografik yntemler ile

incelenerek eitl fitostrojenik bileiklerin tayin ve tespiti gerekletirilmitir.

Aratrma kapsamnda konjuge (daidzin, genistin, glycitin, ononin, sissotrin) ve serbest

(daidzein, genistein, glycitein, formononetin ve biochanin A) isoflavonlara, lignanlara

(matairesinol ve secosolariciriesinol), komestanlara (coumestrol) ve flavonoidlere

(apigenin, rutin, quercetin) yer verilmitir. Tayin ve tespit almalarnda ise, HPLC

(LC-MS/MS ve HPLC-DAD) ve GC-MS teknikleri kullanlmtr. Ayrca

gerekletirilen eitli aratrmalar ve uygulamalar sonras belirlenmi 4 farkl rnek

hazrlama teknii nohut rneine kromatografik analizler ncesi uygularak,

fitostrojenik bileiklerin ayrm ve saflatrlmas gerekletirilmeye allmtr.

3

almann balca amalar;

a. Kapsam dahilindeki kromatografik tekniklerin, dk konsantrasyonlarda

fitostrojenleri ieren rnekte kullanm sonular,

b. Kromatografik yntemlerin tayin ve tespit hassasiyetleri ile ilgili veriler elde

etmek,

c. Gerek fitostrojenik bileik baznda gerekse de kimyasal snf baznda rnek

hazrlama ilemleri sonucu tayin edilen bileik miktarlarnda meydana gelen

deiim,

d. Aratrma kapsamndaki nohutun fitostrojenik bileik dzey ve kompozisyonun

ortaya konmasdr.

4

2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ZETLER

2.1 Fitostrojenler

Fitostrojenler, strojenik aktiviteye sahip bitkisel kkenli bileiklerdir. Bu aktivitelerin

nedeni insan hormunu stradiole yapsal benzerlikleridir.Pek ok yenilebilir ve genel

olarak diyette yer alan bitki, fitostrojenik bileiklerce zengindirler (Liu vd. 2010). Bu

fitokimyasal bileik grubunun genel tanmlamas, merkezi sinir sistemi zerinde

strojenik etkiler uygulayan, strusu tevik eden, dii hayvanlarda jenital sistemin

geliimini stimule eden maddeler grubu eklindedir (Kurzer ve Xu Xia 1997).

Fitostrojenik bileikler, memelilerde strojenik aktiviteyi tevik eden ve yapsal olarak

memeli strojeni 17--estradiole benzeyen, steroidal olmayan bitkisel kaynakl

kimyasallar olarak da tanmlanabilirler (Ososki ve Kennelly 2003). Fitostrojenler,

yapsal ve/veya fonksiyonel olarak ovaryen ve plasental strojenlere ve bunlarn aktif

metabolitlerine benzerlik gsteren bitkisel bileiklerdir (Whitten ve Patisaul 2001).

ekil 2.1 17--estradiol kimyasal yaps

strojenler, yumurtalk ve testislerde retilmekte olup, vcutta reme sisteminin yan

sra pek ok biyolojik etkiye sahiptirler. strojen reseptrleri (ER) ekirdekte yerleik

olup, bir strojene balveklarnda dimerler olutururlar. Dimerler daha sonra strojen

duyarl genlerin transkripsiyonunu dzenleyen strojen reseptr ile etkileime geerler.

Dk orvea strojen reseptr (%2-3) hcre membrannda yerleik olup, strojenin

genetikle ilgili olmayan etkilerine katkda bulunurlar. ER ve ER olmak zere iki tip

strojen reseptr bilinmektedir. ki strojen reseptr de ayn hcre ierisinde

5

bulunabildii gibi, doku yaplarnda farkllklar gsterebilmektedirler. Hem ER, hem

de ER normal ovaryen folikller geliiminde, vaskler endotelya hcrelerinde,

mitokardiyal hcrelerde ve meme dokusunda fonksiyon sahibidirler. ER hem erkek

hem de kadnlarda kemik maturasyonunda gerekirken, sadece ER kadnlarda

kemiklerin korunmasnda rol oynar. ER folikl uyarlmasnn srdrlmesinde ve kvea

luteojenik hormon konsantrasyonun olduka nemli olup, ERnin, n lobun renme

ve hafza fonksiyonlar ile ilgisi bulunmaktadr. strojenin vcuttaki dominant formu

17--estradioldr (Cornwell vd. 2004).

Baz bitkilerin geleneksel tpta kullanm, gnmze kadar olan srete bu bitkilerin

sahip olduklar strojenik zelliklerle ilikilendirilmi, Tai asmasnn (Pueraria mirifica)

genletirici ve afrodizyak, erbeti otunun ise Orta ada Alman Ruhban Snfnca

libido drc etkiye sahip olduuna inanlmtr. Baz bitkilerin ve ekstraktlarnn

strojenik aktivite gsterdiklerine dair ilk alma 1927 ylnda yaynlanmtr (Loewe

vd. 1927). 1940l yllarn ortalarnda, bir yonca trnde bulunan baz bitkisel kaynakl

bileiklerin ve trevlerinin sindiriminden kaynaklanan infertilite sendromu Bat

Avustralyadaki koyunlarda tespit edilmitir. (Bennetts vd. 1946). Bu strojenik

yoncann, formononetin, genistein ve Biochanin A ieriince zengin olduu

belirlenmitir (Rossiter ve Beck 1966, Morley ve Francis 1968). Ayrca bu strojenik

yonca ile otlanan koyunlarn plasmasnn yksek seviyelerde daidzein, formononetin,

genistein ve biochanin Ann suda znr konjugatlarn ierdii tespit edilmitir

(Shutt vd. 1967). Koyunlarn infertilite problemi, bu sterodial olmayan zayf strojenler

ile ilikilendirilmitir (Shutt 1976). Fitostrojenler, primat idrarlarnda 1979da

tanmlanm (Setchell ve Adlercreutz 1979), 1982 ylnda da insan idrarnda bu

tanmlama gerekletirilmitir (Murkies vd. 1998, Setchell vd. 1984, Axelson vd. 1982).

Bitkilerde fitostrojenler ncelikli olarak antioksidan ilev gstermektedirler.

Hayvanlarda ve insanlarda ise bu maddelerin strojen agonist ve antagonistleri olarak

fonksiyonlar bulunduu dnlmektedir (Albertazzi ve Purdie 2002). Fitostrojenlerin

farkl/eitli biyolojik aktiviteleri, ksmen bu maddelerin hem strojen agonistleri hem

de antagonistleri gibi davranma yeteneklerine baldr (Safe vd. 2001). strojen

agonistleri olarak fitostrojenler endojen strojenleri taklit ederler ve strojenik etkilere

6

neden olurlar. strojen antagonistleri olarak, strojen reseptrlerini bloke veya tahrif

edebilirler ve strojenik aktiviteyi nleyerek antistrojenik aktiviteye neden olabilirler.

Fitostrojenler sadece biyolojik aktivite/fonksiyonel zellikleri asndan deil, yapsal

olarak da farkllklar gstermektedirler. nk farkl kimyasal gruplara ye olan

maddeler fitostrojen olarak nitelendirilmektedirler. Genel olarak fitostrojenler

difenolik gruplara sahip olup, yapsal olarak memeli strojenlerine benzerlikleri

bulunmaktadr. Bir aromatik halka ve bir hidroksil grubunun balanma etkinlii iin

nemli olduklar bilinmektedir. Hidrofobik ve hidrojen ba aras boluk interaksiyonlar

gibi iki karbon atomunun arasndaki mesafe ile ayrlan iki halkal yaplar da strojen

reseptrlerine balanma affinitesi iin nemlidir (Hu ve Aizawa 2003).

2.1.1 Fitostrojenlerin snflverlmas

Fitostrojenler, flavonoidler ve lignanlardan oluan iki ana snf ile birlikte byk bir

kimyasal bileik grubudurlar. Flavonoidlerin says lignanlarn saysndan daha fazladr.

Flavonoidler ayrca lignanlardan greceli olarak daha yksek strojenik aktiviteye

sahiptirler (Whitten ve Patisaul 2001).

Fitostrojen bileikleri zellikle izoflavonlar (Genistein, daidzein, glycetin,

formomonetin, biochanin A), lignanlar (Enterodiol, enterolakton, sekoizolariresinol,

matairesinol) ve komestranlar (komestrol) gruplar altnda toplamak mmkndr (ekil

1).

ekil 2.2 Diyetsel strojenlerin snflvermas ve kaynaklar (Murkies vd. 1998)

7

Gnmzde bitkilerce retilen balca drt farkl fenolik bileik grubu fitostrojen

olarak adlverlmaktadr. Bunlar;

Izoflavonoidler,

Stilbenler,

Lignanlar,

Komestanlar

Farkl fitostrojen gruplar ve eitli bileikler, kendi iinde deiik yollar ile endojen

strojene benzer etki gstermektedirler (Cornwell 2004).

Fitostrojenler, strojen reseptrlerine balanrlar. Ancak reseptrn ligve balama etki

alan (LBD), morfolojisi (zellikle helix 12 pozisyonu) reseptr balayan ligve tipine

gre deiiklik gsterir. Fitostrojenler bitkilerde zellikle antioksidan olarak fonksiyon

gstermekte olup, insanlarda ve hayvanlarda ise strojen antagonist ve agonisti olarak

etki gsterdikleri dnlmektedir. zellikle baklagil familyasndan bitkiler, tohumlar,

sert kabuklu yemiler ve zms meyveler olmak zere pek ok gdann bileiminde yer

almaktadrlar (ekil 2). Tek bitki, birden fazla tipte strojen ierdii gibi, farkl bitkiler

farkl trde fitostrojenleri deiik konsantrasyonlarda ierebilmektedir (Albertazzi ve

Purdie 2002).

8

ekil 2.3 Baz fitostrojen altgruplar

Bitkiler, hayvanlar ve insanlar yan sra mikroorganizmalar tarafndan retilen

strojenik bileikler de bulunmaktadr. Mikrobiyel kkenli strojenik bileikler,

zellikle uygun olmayan koullarda depolanan tahllar, yal tohumlar ve tbbi ve

aromatik bitkilerde hzla oalan bir organizma olan Fusarium gibi kf mantarlarnn

ikincil metabolitleridirler. Mikostrojenler olarak adlverlan bu grubun yelerine rnek

olarak Zearalenon, - ve -zeralenol verilebilir. ounlukla tohumun kabuk ksmnda

youn olarak bulunurlar (Byktuncer ve Baaran 2005).

ekil 2.4 Zearalenon kimyasal yaps

9

Endstriyel olarak retilen kimyasallar ve bunlarn ykmlar ile aa kan baz

bileiklerden strojenik aktivite gsterenler ise ksenostrojenler olarak adlverlrlar.

DDTyi de ieren baz peptisitler ve insektisitler bu grubun yesi olan bileiklerdir

(Murkies vd. 1998).

Isoflavonlar, zerlerinde en ok aratrma yaplan fitostrojenik bileik grubudurlar

(Coward vd. 1993, Cassidy 2004). Isoflavonlarn aksine lignanlar daha ok kaynakta

bulunabiliyor olmalarna ramen, bu bileiklerin izolasyon ve analizindeki glkler

nedeni ile daha az allm fitostrojen grubu maddelerdir (Oomah ve Hosseinian

2008). Secoisolariciresionol n maddesini en yksek dzeyde ieren keten tohumu gibi

pek ok gda maddesi daha yksek konsantrasyonlarda lignanlar iermektedir (Setchell

vd. 1981). Lignanlar ou lifce zengin gdalarda bulunmalar nedeni ile batl diyetler

iin isoflavonlara oranla daha elverili fitostrojenik bileik kayna durumundadrlar

(Cassidy 2004).

Fitostrojenler, kimyasal yaplar esas alnarak snflverlmalar halinde zellikle

isoflavonlar, lignanlar ve komestanlar balklar altnda toplanabilirler (Kurzer ve Xu

1997). Bir stilben olan resveratrol ve zearalenon gibi resorsiklik asit lakton bileikleri de

fitostrojenler kapsamnda deerlendirilen kimyasal bileiklerdir (Cornwell vd. 2004,

Knight ve Eden 1995).

10

ekil 2.5 eitli fitostrojenlerin kimyasal yaplar (Antignac vd. article in pres)

Isolavonlar zellikle Leguminosae familyasnda bulunan ve bitki aleminde olduka

yaygn olan kimyasal bileik snfdr (Albertazzi ve Purdie 2002, Mazur 1998). Bu grup

maddelerin bilinen en iyi kaynaklar soya ve soya trevi maddelerdir. Genistein,

daidzein ile daha dk dzeyde olmakla birlikte glyctein soya isoflavonlarnn majr

bileikleridirler (Reinli ve Block 1996). Soyaya ek olarak yonca bitkisi zellikle

formononetin, genistein ve biochanin A bata olmak zere isoflavon fitostrojenler iin

nemli bir kaynaktr.

11

Isoflavon R1 R2 R3 R4 R5 Daidzein H H OH OH H Genistein OH H OH OH H Glisitein H OCH3 OH OH H Daidzin H H O-glukozit OH H Genistin OH H O-glukozit OH H Glisitin H OCH3 O-glukozit OH H Formononetin H H OH OCH3 H Biochanin A OH H OH OCH3 H

ekil 2.6 Baz isoflavonlarn kimyasal yaplar

Isoflavonlar, biyolojik etkileri ve hayvan ve insan sal zerindeki potansiyel

nemleri nedeni ile en ok bilinen fitostrojenlerdir. Isoflavonlarn strojenik

aktivitelerini ortaya koyan ok sayda aratrma bulunmaktadr (Cassidy vd. 2000).

Epidemiyolojik veriler, Asyal insanlarda kardiyovaskler hastalklar, postmenaposal

semptomlar ve baz kanser trlerine rastlanma sklnn batl populasyonlara oranla

daha dk olduuna iaret etmektedir. Bu durumun geleneksel Asya diyetinde yer alan

ve genistein ve daidzein gibi isoflavonlarca zengin olan soya ve soya rnleri ile

ilikilendirilmesi sz konusudur (Adlercreutz 1990, Mazur ve Adlercreutz 2000).

ekil 2.7 Enterolakton kimyasal yaps

12

Bitkilerde isoflavonlar eker fonksiyonel gruplar ile konjuge halde ve primer olarak

glikozit ve glikozit malonat konjugatlar formunda bulunmaktadrlar (Setchell 1998).

rnek olarak genisteinin soyadaki 7-o--D-glikozit ve 6-o-malonilglikozit formlar

verilebilir. Isoflavon glikozitler aktif strojenik bileikler deildirler (Miksijek 1995).

lem veya metabolizma srasnda bu glikozit formlar enzimatik veya kimyasal yol ile

aglikonlara dnrler. Isoflavon glikozitlerin bu dnm sindirim sonras mide

asitleri veya intestinal mikroflora tarafndan gerekletirilebilir. Intestinal bakteriler

isoflavonlar ileri metabolitlere dntrebilmektedirler (Hendrich 2002, Heinonen

2003).

Lignanlar, pek ok bitkisel kaynakta tanmlanm olan fitostrojenik bileiklerin dier

bir nemli kimyasal grubudurlar. Lignanlar baz tahl, sebze ve meyvelerde tespit

edilebilir dzeyde yer almaktadrlar (Milder vd. 2005, Smeds vd. 2007, Blitz vd. 2007).

Gda maddeleri baznda lignan dzeyleri dk olsa da, bitkilerde yaygn olarak

bulunabilmeleri nedeni ile, yksek bitkisel gda esasl diyetlerde fitostrojen alm

dzeyleri asndan nem tamaktadrlar. Tam tahll rnler ve zms gdalarda ve

bunlardan elde edilen rnlerde yaygn olmalar nedeni ile batl diyetler asndan

dikkat ekicidirler. Aratrmalar ortaya koymutur ki batl toplumlarn dk dzeyde

isoflavonoid almlar dolaysyla, lignanlar bu populasyonlarn diyetlerinde daha nemli

fitostrjen kaynaklar haline gelebilmektedir (Peeters vd. 2002, Fletcher 2003, Clavel

vd. 2006).

ekil 2.8 Enterodiol kimyasal yaps

Tanmlanm en nemli lignanlar olan lignanlar enterodiol (ekil 2.4) ve enterolakton

(ekil 2.5) olup (Axelson vd. 1982), bu maddeler iin enterolignanlar terimi

kullanlmaktadr. Bu iki bileik, insan ve hayvanlarn serum, idrar, safra ve seminal

13

svlarnda bulunmalar nedeni ile memeli lignanlar olarak da adlverlrlar (Thompson

vd. 1992, Raffaelli vd. 2002). Enterolignanlar fenolik gruplarla bir dibenzil btan

iskeletine sahip olup, endojen strojenlere yapsal benzerlik gstermektedirler.

Antioksidan, antitmorojianik etkiler ve zayf strojenik ve antistrojenik etkiler

gsterme kabiliyetine sahiptirler (Kitts vd. 1999, Wang 2002, Saarinen 2002).

Enterordiol ve enterolakton, bitki lignan nmaddelerin metabolik rnleridirler. Majr

enterolignan n maddeleri olarak sekoisolarisiresinol, matairesinol, pinoresinol ve

lariciresinol belirlenmitir (Raffaelli 2002). Bunlar arasnda secoisolariciresinol ve

matairesinol en bilinen ve en ok aratrlanlardr. Bitkisel lignanlar, bitkilerde

bulunduklar halleri ile aktif strojenler deildirler. Yalnzca barsak floras tarafndan

metabolize edilmeleri ile strojenik aktivite salanr. Enterodiol ve enterolakton bitkisel

n maddeleri tarafndan intestinal sistemde olutulurlar (Begum vd. 2004, Duncan

2003). Plasma ve idrardaki enterolignan konsantrasyonu, lignanlarca zengin diyetin

tketimesinin ardndan belirgin dzeyde ykselmektedir (Clavel vd. 2006, Kuijsten vd.

2005).

Coumestan, bitkisel fenollerden strojenik aktivite gsterebilen bir baka bileik

grubudur. ok sayda coumestan bulunmasna ramen az saydaki coumestan bu tr bir

aktivite gsterebilmekte ve fitostrojenik bir bileik olarak snflverlmaktadr. Bu

snfn en nde gelen temsilcisi coumestroldr (Bingham vd. 1998). lk olarak 1957

ylnda Bickoff ve arkadalar tarafndan gerekletirilen aratrma sonras yeni bir

fitostrojenik bileik olarak bildirilmitir (Bickoff vd. 1957). Coumestrol tm

fitostrojenler arasnda en yksek strojenik aktiviteye sahip olandr. Isoflavonlardan

30-100 kat fazla fazla strojenik aktiviteye sahip olup, endojen strojen estradiolden 10-

20 kat daha dk dzeyde aktivite gsterebilmektedir.

2.1.2 Gda maddeleri ve fitostrojenik bileikler

Fitostrojenler, farkl konsantrasyonlarda olmakla birlikte rnein soya fasulyesi,

meyveler ve lahanagiller gibi, pek ok bitkisel kaynakta, yaygn olarak

bulunmaktadrlar (Liggin vd. 2000). Bu bitkisel kaynaklardan bazlar zellikle Asyada

14

olmak zere yksek dzeylerde tketilen gda maddeleri konumundadrlar (Nagata vd.

2007).

Farkl gruplarda ele alnan fitostrojenlerin, her birinin youn olarak bulunduklar gda

kaynaklar farkllk gstermektedir. soflavonlarn bilinen en iyi kayna Leguminosae

ailesine ait bitkilerden kurubaklagiller (bezelye, kuru fasulye, mercimek vb.), zellikle

de soya fasulyesidir. Ancak Graminae, Rosaceae (Prunus sp.), Iridaceae (Iris sp.) ve

Solanaceae (Nicotiniana tabacum) trlerinde de grlmektedir. Bugn en ok

kullanlan isoflavon kaynaklar soya fasulyesinin ilenmesi ile elde edilen eitli rnler

olup, bunlarn banda soya unu, soya protein izolatlar, tofu, soya st, soya yourdu

ve soya ehriyesi gelir. Soya rnleri dndaki kaynaklar dier kurubaklagiller, tam-

tahl rnleri, simisifuga ve krmz yonca otlardr (Cassidy vd. 2000, Bingham vd.

1998, Umlve vd. 2000, Rowlve 1999). almalar ku zm ve kuru zm gibi kk

taneli meyvelerin ve soya unu ieren tahl rnlerinin de iyi fitostrojen kaynaklar

olduunu gstermektedir. Uzakdouda sklkla tketilen fermente soya rnlerinin

(miso, tempeh) isoflavon ierii zengindir. nk fermentasyon sresince

mikroorganizmalar isoflavonlarn -glikozit ban kopararak glikozit yaplarnn

aglikonlara dnmesini salar. Bu durum serbest formdaki bileiklerin

konsantrasyonunu ve biyoyararlln artrabilmektedir (Liggins vd. 1998, Reinli ve

Block, 1996). Soya fasulyesinden elde edilen soya ya ve sosu eser miktarda isoflavon

ierirken, soya ve rnlerinin isoflavon ieriinin genel olarak 1-3 mg/g arasnda

deitii bilinmektedir (Cassidy vd. 2000, Liggins vd. 1998, Song vd. 1999, Rowlve

1999, Fukutake vd. 1996, Byktuncer ve Baaran 2005).

Bitkisel gdalarda en sk rastlanlan soflavonoidler unlardr;

genistein,

daidzein,

glicitein,

biochanin A (genisteinin metillendirilmi trevi),

formononetin (daidzeinin metillendirilmi trevi).

Fitostrojenlerce zengin olduu bilinen eitli gdalarn fitostrojen ierikleri kendi

ilerinde de byk deiiklik gsterebilmektedir. Hatta farkl blgelerde yetien soya

15

fasulyelerinin fitostrojen ierikleri birbirinden farkllklar gstermektedir (Byktuncer

ve Baaran 2005). Bu farkllk ileme srecine bal olarak artabilecei gibi, bu rnleri

zellikle gda takviyeleri retiminde hammadde olarak kullananlar iin stveardize rn

eldesi asndan nemli bir sorun ortaya kabilmektedir.

soflavonoidler, dk molekl arlkl hidrofobik bileiklerdir. soflavonoid aglikonun

suda znrl dktr ve ortam asitliiyle ilgilidir. Genistein ve daidzeinin

metillendirilmi trevleri (biochanin A ve formononetin) kendilerinden daha dk

znrlktedirler. Glukoz, glukoronoid ve slfat gruplar ile konjugasyon znrl

arttrr. soflavonoid aglikonlar, fizyolojik koullar altnda kararldrlar. Asidik

koullarda glikozidler aglikonlar vererek dekonjuge olabilirler. Vcutta, karacier ve

sindirim sistemindeki enzimler bu reaksiyonlar metabolizma srasnda yerine getirirler.

soflavonoidler bitkilerde glikozidler olarak bulunurlar (Gultekin 2004).

Diyetin temel fitostrojen bileikleri olan lignanlar, bitki hcre duvar ligninlerin nemli

bir ksmn oluturduu iin pek ok bitkide, dk konsantrasyonlarda bulunmaktadr.

Lignanlar tahl, sebze ve meyvelerde yaygn olarak bulunurlar, en iyi kaynaklar ise

keten tohumudur. Lignanlarn temel kayna posal gdalar olduu iin, batllarn

diyetlerinde isoflavonlardan daha fazla bulunurlar. Spesifik bir gdann fitostrojen

ieriinin, dier fitokimyasallar gibi, bitkinin genetik yaps, yetitii blge ve mevsim

zellikleri, mantarlar ile enfekte olma durumu ve gda ileme yntemleri gibi birok

faktrden etkilendii bilinmektedir (Byktuncer ve Baaran 2005, Davis vd. 1999).

Spesifik bir kaynan fitostrojen ierii, dier fitokimyasallarda olduu gibi;

a. Bitkinin genetik yaps,

b. Yetitii blge,

c. Yetitii blgenin mevsim zellikleri,

d. Mantarlar ile enfekte olma durumu,

e. lenmesi srasnda uygulanan proses yntem ve parametrelerine baldr.

16

izelge 2.1 Baz gdalarn toplam izoflavon ierikleri (yenilebilir porsiyonda) (Byktuncer ve Baaran 2005) Gda Maddesi zolavon (g/g)

Soya fasulyesi, Kore (Glycine max) 144,99

Soya fasulyesi, Japonya (Glycine max) 118,51

Soya fasulyesi, Brezilya (Glycine max) 87,63

Soya unu, tam yal 177,89

Soya unu, yasz 131,19

Soya protein konsantresi (su ile ekstrakte edilmi) 102,07

Soya protein konsantresi (alkol ile ekstrakte edilmi) 12,47

Soya protein izolat 97,43

Soya fasulyesi filizi 40,71

Soya st 9,65

Soya sosu 1,64

Soya peyniri 31,32

Tofu 29,50

Tempeh 43,52

Miso 42,55

Natto 58,93

Dier fasulye eitleri 0,06

Nohut (Cicer arientium) 0,10

Bakla (Vicia faba major) 0,03

Mercimek (Lens culinaris) 0,01

17

izelge 2.2 Baz gdalarn lignan ierikleri (Byktuncer ve Baaran 2005)

Gda Maddesi Lignan (g/g)

Keten tohumu 675,0

Keten tohumu unu 527,0

Mercimek 17,9

Soya fasulyesi 8,6

Buday kepei 5,7

Yulaf kepei 6,5

Kuru fasulye 5,6

Sarmsak 4,1

Yulaf 3,4

Kukonmaz 3,7

Havu 3,5

Patates 3,0

Prasa 2,0

Brokoli 2,3

Armut 1,8

Erik 1,5

2.1.5 Fitostrojenik bileiklerin salk zerine etkileri

Son yllarda gerekletirilen epidemiyolojik almalarn sonucunda elde edilen veriler,

fitostrojenler ile ilgili almalarn younlamas zerinde nemli etkiye sahiptir.

Klinik ve epidemiyolojik almalar, fitostrojenlerin kardiyovaskler problemler,

osteoporos, menaposal semptomlar ile hormonal gs, prostat, basak kanserleri gibi

kanser trleri zerinde nleyici veya geciktirici koruma etkisi gsterbilme potansiyeline

sahip olabildiklerine dair veriler ortaya koymaktadrlar (Bagder vd. 2002, Lof ve

Weiderpass 2006). Ayrca yine baz aratrmalar sonucunda fitostrojenlerin arzu

edilmeyen etkiler gsterdiklerini de baz aratrmaclar belirtmektedir (Ryokkynen vd.

2005).

18

Epidemiyolojik almalar fitostrojence zengin diyetle beslenen toplumlarda

kardiyovaskler hastalklar, osteoporoz, gs, prostat ve barsak kanserleri ile ilgili

ikayetlerin daha az grldn ve postmenapozal kadnlarda strojen yetersizliine

bal semptomlarn hafif yaven gstermektedir (Byktuncer ve Baaran 2005).

Amerikan Kanser Aratrma Enstitsnde yrtlen epidemiyolojik almalarda

beslenmelerinde isoflavonoidlere yksek orvea yer veren insanlarda meme, prostat,

kolon kanseri gibi eitli kanserlere yakalanma riskinin daha az olduu belirtilmektedir.

Fitostrojen tketiminin yksek olduu Asya lkelerinde bu kanser eitlerinin daha

dk orvea olduu saptanmtr. Asyadan Amerikaya g etmi insanlarda Asyada

yaayan insanlara kyasla kanser riskinde art olduu gzlenmitir. Kanser riskindeki

art Amerikada kalma sresinin uzunluuyla ve Kuzey Amerika tarznda beslenmeyle

ilikili olduu eitli almalarla ortaya konmaktadr (Anonymous 1997).

Batl populasyonlarda meme kanseri kadnlar arasnda en yaygn olan kanser

trlerindendir. Asyal populasyonlarda ise aksine bu rahatszln insidans belirgin

dzeyde dktr. Baz aratrmaclar tarafndan bu durum fitostrojenlerin yksek

dzeyde tketimi ile ilikilendirilmektedir (Kang 2007, Magee ve Rowlve 2004).

Epidemiyolojik almalar ve vaka-kontrol almalar, yksek orvea izoflavon ieren

diyetleri tketen lkelerde, az tketen lkelere gre meme ve prostat kanserinin daha

dk orvea grldn belirtmektedir ( (Temper vd. 2007).

zoflavonlarn nonrenal hcre tiplerinde D vitamini sentezini arttrd ortaya

konmutur. Bu mekanizma nedeniyle izoflavonlarn kemiklerdeki mineral younluuna

katkda bulunduu dnlmektedir (Temper vd. 2007). 66 kadn zerinde yaplan

prospektif- rveomize bir almada gnlk 88 mg izoflavonun iskelet sistemi zerine

koruyucu etkisi olduu ve bel kemiinde mineral younluunu artrd belirtilmektedir

(Potter vd. 1998). Dier yvean, 202 postmenoposal kadn zerinde yaplan geni apl

bir aratrmada 12 gn boyunca gnde 99 mg izoflavon takviyesi (52 mg genistein, 41

mg daidzein ve 6 mg glyctein) yaplm ancak olumlu bir etki gzlenmemitir

(Kreijkamp-Kaspers vd. 2004). Bu ift kr rveomize deneme, izoflavon ieren soya

proteininin 60 ya ve st salkl postmenopozal kadnlarda kavrama fonksiyonlar ve

19

kemik mineral younluunu gelitirdiini belirten hipotezi desteklememektedir. Bu

veriler baz alndnda kliniksel olarak izoflavonlarn kemik saln arttrdn

sylemek mmkn deildir. Deneylerden elde edilen veriler izoflavonlarn kadnlardaki

osteoperosis tedavisindeki yararn deerlendirmek iin yeterli deildir. Rveomize

kontroll denemeler fitosstrojenlerin osteoperosis veya kemik krlmalarna kar

koruyucu etkisini ortaya koymak iin kullanlabilir nitelikte bulunmamtr (Temper vd.

2007).

Postmenopozal kadnlarn lignan ve izoflavonid ieren gdalarla beslenmesini inceleyen

iki almada, en yksek dozun drtte birini alan kadnlarda optimum dozu olan

kadnlara gre bel-kala arasnda, trigliserid seviyesinde ve metabolik dengede ve aort

zerinde daha olumlu sonular elde edilmitir. Ancak fitostrojenler ile kan basnc,

toplam LDL ve HDL kolesterol arasnda bir iliki bulunamamtr. Her iki almada da

toplam fitostrojen tketimini oluturan izoflavonid, daidzein, genistein, formonotein,

biochain A, coumetrol, lignan, matairesino ve sekoizolarisiresinoln alm nerilmitir

(De Kleijn vd. 2002, Van der Schouw vd. 2002). Yaplan baka bir almaya gre de

orta yal erkeklerde serumdaki enterolakton konsantrasyonu kardiyovaskler hastalk

riskini ve lm orann azaltmaktadr (Vanharanto vd. 2003).

strojen yetersizlii, postmenaposal kemik kaybnda etkili olan enmli faktrlerden

birisidir (Kang 2007). Fitostrojenlerin kemik mineral younluu zerindeki etkisi

eitli aratrmalarda incelenmi vve baz aratrmalar, isofalvonlar ve komestrolca

zengin diyetin kemik sal zerinde koruyucu etkisi olduunu bildirimilerdir (Panet

vd. 2005, Kanno vd. 2004, Potter vd. 1998, Veerson ve Garner 1997). Soya proteini ve

soya fitostrojenleri almnn postmenaposal kadnlarda kemik ktlesinin korunmasnda

veya dk dzeyde geliiminde etkili olduu ne srlmtr (Setchell ve Lydeking-

Olsen 2003, Ususi 2006). Bu etkinin riner kalsiyum kaybnn nlenmesi, osteoblastlar

zerindeki faydal etkiler, kalsitonin hormonu salglanmas stndeki tesir gibi

mekanizmalar yoluyla gerekletii dnlmektedir (Kang 2007).

Lignan ve enterlaktonun yksek plasma konsantrasyonunun meme kanseri riskini

azaltt belirtilmektedir. Enterolakton konsantrasyonunun en yksek dozunun drtte

birine sahip olan kadnlarda kanser riskinin, minimum dozda alanlara gre yar yarya

20

olduu saptanmtr (Cornwell vd. 2004). Benzer korelasyonlar pre- ve postmenopozal

kadnlarda isoflavonoid ve lignan alm ile yumurtalk ve meme kanseri arasnda da

bulunmaktadr. Tersi olarak Kaliforniyada 111,526 kadnla yaplan geni apl bir

almada fitostrojenler ile meme kanseri arasnda bir ilikinin olmad saptanmtr.

Finlveiyada 2004 ylnda yaplan bir aratrmaya gre de pre- veya post-menoposal

kadnlarda serum entorolakton konsatrasyonu ile meme kanseri riski arasnda bir

korelasyon bulunmaktadr.

Fitostrojen metabolitlerin idrar ile boaltm biyomarker olarak kullanlabilmekte ve

fitostrojenlerin biyolojik adan kullanlabilirlii hakknda bilgi vermektedir.

Fitostrojen boaltm ve meme kanseri riskini inceleyen nceki yllara ait iki alma

fitostroojen boaltmnn fazla olduu kadnlarda meme kanseri riskinin daha az

olduunu ortaya koymaktadr. Baka bir almada da meme kanseri hastalarnda idrarla

fitostrojen atmnn salkl kiilere oranla nemli lde daha dk olduu tespit

edilmitir. ok yllk geni kapsaml bir almada 1 yldan 9 yla kadar meme kanseri

hastalna sahip kiilerden idrarla atlan metabolitler incelenmi ve bu metabolitlerin

miktarlar meme kanseri olmayan insanlarnki ile karlatrlmtr. Elde edilen veriler

dorultusunda isoflavonoid ve lignan salgsnn artmasyla meme kanseri riskinin

azald dnlmr (Cornwell vd. 2004).

strojen temel olarak globulin veya albumini balayan cinsiyet hormonlarnn inaktif

bileimleri gibi sirkle olmaktadr. Soya isoflavonoidleri veya lignanlar ile

desteklenmi bir beslenmenin, serumdaki serbest estradiol seviyesinin dk olduu

postmenoposal kadnlarda globulin seviyesini arttrd belirtilmektedir. Birok

almada soya takviyesiyle menstural dngnn uzunluunda ya da hormon

seviyesinde herhangi bir farklln gelimedii belirtilmekle birlikte menstural

dngdeki kadnlarda fitostrojenlerin strojen seviyesi zerine etkisi yeterince

aklanamamtr. zoflavonoid ve keten tohumunun yksek orvea tketilmesi

genotoksik strojen metabolitlerinin idrarla atmn nemli lde azaltmaktadr.

Estradiol ve estronlarn metabolize olmasnda farkl metabolitlerin olumasna yol aan

temel yol bulunmaktadr. Bu yollarn iki tanesinin sonunda genotoksik olarak bilinen

16 -hidroksiestrojen metabolitlerinin meme kanserine kar koruyucu olarak

kullanlmas nerilmektedir ve 2 hidroksiestrojenlerin, 16 -hidroksiestrojenlere oran

21

meme kanserinde nemli bir iaret olarak kabul edilmektedir. Serumdaki globulin

seviyesi idrarla atlan 16 -hidroksiestrojen miktaryla ters orantya sahiptir (Cornwell

vd. 2004).

Fitostrojenlerin kolektral, endometriyal ve mide kanseri zerindeki etkileri de

aratrma konusu edilen fonksiyonel nitelikler arasndadr. rnein hem diyetsel

isoflavonlarn hem de lignanlarn kolerektal kanser riskini azaltt, bu etkinin lignanlar

iin daha fazla olduu bildirilmitir (Cotterchio vd. 2006).

Fazla sayda olmamakla birlikte, fitostrojen almnn endometriyal kanser insidans

zerindeki etkileri ile ilgili aratrmalar bulunmaktadr. Hawaiide yaayan ve yksek

dzeyde soya rnleri tketen kiilerin, dierlerine oranlar %50 orannda dk

endometriyal kanser riski tadklar bildirilmitir. Bu dk endometriyal kanser

riskinin, hi doum yapmam ve strojen replasmant terapisi almayan kadnlar iin

daha kuvvetli olduu belirtilmitir (Goodman vd. 1999). San Fransisco krfezi

blgesinde yaayan ve Asyal olmayan kadnlar arasnda gerekletirilen bir aratrmada

ise, tipik Amerikan tarz diyette tketilen isoflavonlar ve lignanlar, indirgenmi

endomeriyal kanser riski ile ilikilendirilmitir (Horn-Ross vd. 2003).

Soya rnlerinin tketimi ve mide kanseri riski arasndaki ilikisinin ise, soya

rnlerinin fermente olup olmad ile ilgisinin bulunduuna dair veriler sz konusudur.

Gerekletirilen bir meta-analiz almasnda soya tketiminin mide kanserine kar

koruyucu etkisi olduu bildirilmi, fermente soya rnlerinin ise bu riski ykselttii

iddaa edilmi (Wu vd. 2000) olmakla birlikte, bu ilikinin tam olarak tanmlanabilmesi

iin bitkisel gdalar, tuz alm ve N-nitrozo bileikler gibi potansiyel kirleticiler ve dier

diyetsel faktrlerin gz nnde tutulmas gereklilii sz konusudur.

2.2 Kaynak zetleri

Fitostrojenik bileik ile ilgili yrtlen aratrmalar snflvermak iin birka farkl

faktr kullanabiliriz. Bu faktrler; rnek tr, rnek hazrlama metodu, tayin ve tespit

metodu olarak sralanabilir.

22

Fitostrojen bileiklerin aratrld rnekler genel olarak gda maddeleri, biyolojik

rnekler (metabolizma rnleri, kan, serum, idrar vb.) gda takviyeleri ve atk ve kaynak

sulardr.

Analiz uygulamalar iin kullanlan rnek hazrlama yntemleri, elde edilen bileik

kompozisyon ve konsantrasyonu zerinde, gda maddesi ve bileik tr, gda maddesi

matriksi gibi faktrlerin etkisi nedeni ile, deiik sonular elde edilmesine neden

olabilmektedir. Genel olarak, drt farkl yntem ile yrtlen rnek hazrlama

almalar, temel ekstraksiyonun gerekletirilmesi, asit hidrolizasyonu uygulamas,

enzimatik hidrolizasyon uygulamas veya asit ve enzim etkisi ile hidrolizin ayn rnek

hazrlama prosedrnde kullanlmas sonucu gerekletirilmektedir. Enzimatik hidroliz

uygulamalarnda, tayin ve tespiti hedeflenen bileiklerin aglikon formunun matriksten

ayrlmasn salanmas amac ile sahip olduu bilinen ba yapsn paralama

potansiyeline sahip olan enzim tr seilmesi ile gerekletirilir.

Kromatografik yntemler fitostrojenik bileiklerin analizlerinde kullanlan balca

analiz yntemleridir. Bu tekniklerden HPLC, GC-MS, LC-MS ve LC-MS/MS ne

kanlardr. Yntem belirlenmesinde dikkat edilmesi gereken ynlerden birisi aratrma

kapsamnda yer alan bileiklerin tayinine olanak verebilecek teknie sahip yntemin

seilmesi gerekliliidir.

Fonksiyonel gdalara ve biyoaktif bileiklere ilginin artmas ile ayn dneme denk

gelecek ekilde 1990l yllarn sonrasnda farkl gda maddelerinde ve biyolojik

rneklerde fitostrojenik bileiklerin tayinini ve tespitini amalayan aratrmalar art

gstermilerdir.

Zafra-Gomez vd. (2010), isoflavon ierikleri zenginletirilmi st ve meyve sularn

kullanarak, takviye amal gdalarda isoflavon tayininde kullanlmak zere rnek

hazrlama ve kromatografik yntem gelitirme amal bir aratrma yrtmlerdir. Bu

almada isoflavonlardan daidzein, daidzin, genistein ve genistin kapsama alnmtr.

Isoflavon izolasyonu amac ile inko asetat, fosfotungstik asit polihidrat ve glasiyel

asetik asitin suda hazrlanan karm ve asetontiril kullanlan bir zelti kullanlm

olup, RP-LC ve C18 kolon ile kromatografik almalar yrtlmtr. Aratrma

23

sonucunda tespit ve tayin limitleri sras ile 0.7-1.0 mg/L ve 0.2-0.3 mg/L olarak

belirtilmi, aratrma kapsamndaki isoflavonlardan %90-110 aralnda geri kazanmn

salve sonucuna ulalmtr.

Fernveez vd. (2008), GC-MS yntemini kullanarak Kbada yetien 7 farkl krmz

propolis rneini lkenin farkl blgelerinden temin ederek isoflavonoidlerin tespitine

ynelik bir aratrma yapm olup, kullanlan GC-MS tekniinin, propolis rneklerinde

isoflavonoid tayini iin uygun nitelikte olduunu belirtmilerdir. Bu aratrmaclar

rnek hazrlama amacyla metanol kullanarak ekstraksiyon gerekletirmilerdir.

Schwartz ve Sontag (2006) ise HPLC-CAD (Coulometric Electrode Array Detection)

tekniini kullanarak sebze (brokoli, havu, salatalk, kukonmaz, kereviz), meyve

(ilek), fasulye (mung bean) ve susam tohumu rneklerinde lignan snf bileiklerden

secoisolariciresinol, lariciresinol ve isolariciresinol tayini amal bir aratrma

yrtmlerdir. Sellaz kullanlarak gerekletirilen enzimatik hidroliz ve ncesinde

gerekletiren ekstraksiyon yan sra sodyum methoksit ve HCL kullanlan alternatif

rnek hazrlama metodu daha uygulanmtr. Lignanlarn geri kazanm oran

%44.7-97.0 arasnda hesaplanmtr.

Bonzanini vd. (2009) ise eitli nar rn ve yan rnlerinde isolariciresinol,

medioresinol, matairesinol, pinoresinol, secoisolariciresinol ve syringaresinol gibi

lignanlarn konsantrasyonlarn incelenmitir. GC-MS teknii kullanlan bu aratrmada,

rnek hazrlama ynteminde ise asit hidrolizi kullanlmtr. En yksek toplam lignan

konsntrasyonu nar ekirdeinde (36.1 g/g), en dk ise nar endokarpnda (3.3 g/g)

tespit edilmitir.

Liggins vd. gerekletirdikleri bir seri almann bir blmnde meyve ve yemilerin

(2000a), dier blmnde ise (200b) sebzelerin daidzein ve genistein

konsantrasyonlarn her iki aratrmada da GC-MS tekniini ve enzimatik hidrolizi

kullanarak incelemilerdir. Bu aratrmalarda 37Cde gece boyu sren hidroliz iin

sellaz enzimi (Aspergillus niger) kullanlmtr. Enzimatik hidroliz uygulamas,

metanol ile gerekletirilen bir n-ekstraksiyon sonras elde edilen rnekler kullanlarak

gerekletirilmitir. zm ve zms meyvelerin, aratrma kapsamndaki dier

24

meyvelere gre daidzein ve genistein toplam konsatrasyonu daha yksek olduu

(srasyla 2850 ve 1840 g7kg) belirtilmitir. Sebzelerde ise bu gda maddesi trnde

incelenen soya fasulyesi (kurutulmu, ilenmemi) en zengin genistein ve daidzein

(toplam ortalama 960 mg/kg) kayna olarak vurgulanmtr.

Meagher vd. (1999) tarafndan tlm keten tohumundan isolariciresinol,

pinoresinol, secoisolariciresinol ve matairesinoln izolasyonu ve karakterizasyonu

amacyla bir aratrma yrtlmtr. Bu aratrmada tlm keten tohumu

rneklerinde metanol kullanlarak gerekletirilen ekstraksiyon sonras, hidroklorik asit

ile asit hidrolizasyonu gerekletirilmi, elde edilen rnekler HPLC-DAD (280 nm) ve

GC-MS teknikleri ile incelenmitir. Kromatografik analizler ile elde edilen veriler

nda secoisolariciresinoln keten tohumundaki majr lignan bileii olduu,

isolariciresinol, pinoresinol ve matairesinoln ise minr lignan bileikleri olduklar

bildirilmitir.

RP-HPLC tekniini kullanan Klejdus vd. (1999), krmz yonca rneklerinde

isoflavonlar incelemilerdir. Bu aratrma kapsamna alnan isoflavonlar, daidzein,

genistein, formononetin ve biochanin A olmutur. Krmz yonca rneklerinde

isoflavonlarn kalitatif ve kantitatif tayini iin ncelikle 37C/30 dakikalk inkbasyon

ile HCl esasl asit hidrolizi gerekletirilmi, hedef bileiklerin izolasyonu amac ile

SPE (Kat-faz ekstraksiyon) kartular kullanlmtr. RP-HPLC tekniinde ise C18

kolon kullanlm olup 280 nm dalga boyunda tespit ve tayin gerekletirilmitir.

Aratrma sonucunda Spe-ed ABN SPE kartu kullanm ile ekstraksiyon etkinliinin

%90nn zerinde olduu belirtilmitir.

Ferrer vd. (2009), biochanin A, coumestrol, daidzein, equol, formononetin, glycitein,

genistein ve prunetin gibi sekiz farkl fitostrojenik bileiin konsantrasyonu GC-

MS/MS teknii ve etil asetat solventi kullanlarak sv-sv ekstraksiyonu ile elde edilen

rneklerde belirlenmitir. Soya st ve atk sular kullanlarak yrtlen aratrmada,

rneklerin trevlendirilmesi amac ile trimethylchlorosilane (TMCS) ve N,O-bis

(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) kullanlmtr. Her bir analiz iin iki

fragment iyon tanmlama ve konfirmasyon iin kullanlmtr. Atk sular bir soya ileme

tesisinin artma sisteminin giri ve kndan temin edilmitir. Soya st iin genistein

25

dzeyi 2000 g/L- 50000 g/L aralnda iken atk sularda bu konsantrasyon

26

glycitein, formononetin, biochanin A, secoisolariciresinol, matairesinol ve coumestrol

konsantrasyonlarn incelemilerdir. Bu aratrmada difenil kolon ieren LC-MS/MS

teknii kullanlm olup, rnekler metanol ekstraksiyonu sonras -glucuronidase,

sellaz ve -glucosidase enzimleri kullanlarak hidroliz gerekletirilmi, daha sonra

Starat C18E kartular kullanlarak SPE uygulamas gerekletirilmitir. Aratrma

sonucu elde edilen veriler daha nce pek ok aratrmada vurgulve gibi gda

maddelerinin isoflavon, lignan ve coumestan ierikleri zerinde elde edildikleri ve/veya

yetitirildikleri blgelerin nemli dzeyde etki gstermekte olduu [varyasyon sabiti

(C) ; deeri lignanlar iin %33, isoflavonlar iin %39] belirtilmitir.

Kuhnle vd. (2009b), ngilterede yaygn olarak tketilen meyve ve sebzelerin

fitostrojenik bileik ieriklerini aratrdklar almada LC-MS/MS tekniini

kullanmlardr. Bu aratrma kapsamna daidzein, genistein, glycitein, biochanin A,

formononetin, secoisolariciresinol, matariresinol ve coumestrol dahil edilmi olup, 240

farkl gda maddesi incelenmitir. Bu gda maddelerinden bazlar taze formda iken

bazlar da ilenmi gda maddeleridir. rneklere dekonjugasyon enzimatik hidroliz ile

gerekletirilmi olup, bu amala -glucuronidase, -glucosidase ve sellaz enzimleri

kullanlmtr. Dekonjugasyon sonras Strata C18 kartular kullanlarak SFE uygulamas

gerekletirilmi olup, ardndan difenil kolon kullanlarak LC-MS/MS ile inceleme

gerekletirilmitir. Dekonjugasyon ncesi ise metanol kullanlarak ekstraksiyon

yrtlmtr. Aratrma kapsamndaki ou gda maddesinin toplam fitostrojen

ieriinin 100 g/100 g (ya bazda) altnda olduu belirtilmi olup, bu gda

maddelerinin sadece %5inin 400g/100 gn zerinde toplam fitostrojenik madde

konsantrasyonuna sahip olduu bildirilmitir.

Alves vd. (2010) tarafndan ise kahve ve kahve rnlerinde isoflavonlarn tayin ve tespit

edilmesine ynelik metod gelitirilmesi ve bu metodun dorulanmas (validasyonu)

amacyla bir alma yrtlmtr. Oluturulan yntemde kromatografik analiz

HPLC-DAD ile gerekletirilmi olup, Mediterranea Sea18 kolon kullanlm, %0.1lik

formik asit ve asetonitrilin mobil faz olarak kullanld gradient yntemde daidzein,

genistein ve formononetin stveart maddeleri kullanlarak metod gelitirme almalar

yrtlmtr. rnek hazrlama aamasnda HCl kullanlarak asit hidrolizi

27

uygulanmtr. Stveart maddeler iin yksek korelasyon sabitinin (r> 0.999) elde

edildii, tayin limitinin ise 5-25 ng/mL aralnda olduu bildirilmitir.

Franke vd. (1994) ise RP-HPLC-DAD teknii kullanarak eitli legume rneklerinde

(40n zerinde) coumestrol, daidzein, genistein, formononetin ve biochanin A tayini

gerekletirmilerdir. Sonu olarak soya rnlerinin dier gda maddelerine oranla ok

daha yksek dzeyde daidzein ve genistein bata olmak zere fitostrojenik bileikleri

ierdii bildirilmitir.

Kuhnle vd. (2007) otomasyon ile uygulanan SFE ve LC-MS ile fitostrojenlerin

ekstraksiyonu ve tayinine ynelik bir yntem gelitirme almas yrtmlerdir. Bu

yntemde SPE ncesi rneklere 30 dakikalk metanol ekstraksiyonu sonras 37C/16

saatlik bir inkbasyon kullanlarak ile enzimatik hidroliz uygulanmasnn ardndan robot

araclyla otomasyonu gerekletirilen ve Strata C18E kartu kullanlan SPE

uygulamas sonras LC-MS teknii kullanlmtr. Yntem gelitirme almalarnda

biochanin A, daidzein, formononetin, genistein, glycitein, matairesinol,

secoisolariciresinol ve coumestrol ile aratrmalar yrtlmtr. zellikle sebze ve

meyve rnekleri ile yrtlen yntem gelitirme almalar sonrasnda, doruluk,

kesinlik ve tekrarlanabilirlik kriterleri alarndan uygun bir yntemin ortaya koyulduu

aratrmaclar tarafndan belirtilmitir.

Bonglia vd. (2009), talyada tketilmekte olan soya esasl 14 farkl gda takviyesinde

aglikon formdaki isoflavonlarn HPLC teknii ile belirlenmesine ynelik bir aratrma

gerekletirmilerdir. Aratrma kapsamna isoflavonlardan genistein, daidzein ve

glycitein alnm olup, HCl ve etanoln birlikte kullanlmas ile ekstraksiyon

aamasnda asit hidrolizasyonu da gerekletirilmitir. HPLC tekniinde ise UV

dedektr yan sra C18 kolon kullanlmtr. alma sonucunda kapsam dahilindeki

gda takviyelerinin tmnde etikette belirtilmi olan isoflavon ieriinin doru beyan

edilmediinin tespit edildii bildirilmitir.

Lopez vd. (2008) tarafndan talyan ve spanyol zeytinlerinin farkl ksm ve

rnlerindeki lignan dzeyleri HPLC/DAD-MS teknii kullanlarak incelenmitir.

rnek hazrlama srasnda metanol ekstraksiyonu yan sra alkali ve su ile ekstraksiyon

28

uygulanm, HPLC/DAD-MSde RP18 kolon kullanlmtr. Aratrma sonucunda

zeytin ekirdeinin lignanlarca bu meyvedeki en zengin ksm olduu ve 0.1-2.9 mg/g

toplam lignan konsantrasyonuna sahip olduu belirtilmitir.

Keljdus vd. (2007), soya rnleri ve Trifolium pratense, Irensine herbstii ve Ononis

spinosa bitkilerinde genistin, genistein, daidzin, daidzein, glycitin, glycitein, ononin,

formononetin, sissotrin ve biochanin A gibi isoflavonlarn tayin ve tespit edilmesi amac

ile HPLC-UV/VIS-DAD teknii ile bir aratrma yapmlardr. Kromatografik sistemde

C18 kolon, lineer gradient elsyon (%0.2 asetik asitli su ve metanol mobil fazlar ile)

kullanlmtr. rnek hazrlama srasnda ise metanol kullanlarak ekstraksiyon

gerekletirilmitir. Tanmlama iin 254 nm dalga boyu kullanlm olup, aratrma

sonucunda farkl gda matriksleri iin uygulanan yntemin isoflavonlarn tespitinde

zellikle hz asndan iyi bir alternatif nitelii tad belirtilmitir.

Erbs vd. (2007) yzey sularnda biochanin A, daidzein, equol, formononetin, genistein

ve coumestrol tayin ve tespiti ama aratrmada, HPLC-MS/MS tekniini kullanm

olup, yntemde 13C3-iaretli internal stveartlar da kullanlmtr. Bal geri kazanm

oranlar %89-132 arasnda deiim gstermekte olup, tespit limiti ise, 0.4-11.0 ng/L

olarak belirlenmitir. rnek hazrlama aamasnda Oasis HLB kartular ile SPE

uygulamas gerekletirilmi, kromatografik yntemde ise C18 kolon kullanlmtr.

Aratrma kapsamndaki rneklerin fitostrojenik bileik konsantrasyonlar toplam ise

4-157 ng/L aralnda tespit edilmitir.

Lee vd. (2004) gerekletirdikleri aratrmada, 22 farkl geleneksel in tbbnda

kullanlan bitkide 17 farkl fitostrojenik bileiin (isoflavonoid, lignan ve

mikostrojen) GC-MS tenii kullanlarak konsantrasyonlarn belirlemilerdir. rnek

hazrlama aamasnda metanol ekstraksiyonu sonrasnda -glucuronidase/aryl sulfatase

kullanlarak enzimatik hidroliz (inkbasyon koulu; 55C/3 saat) ve HCl kullanlarak

asit hidrolizi (inkbasyon koulu; 100C/2.5 saat) gerekletirilmi olup, elde edilen

rneklerde Oasis HLB kartular ile SPE uygulamas yrtlmtr. GC-MS ynteminde

trevlendirme ajan olarak MSTFA/NH4I/DTE kullanlmtr. Genel geri kazanm oran

%84n zerinde belirlenmi, kullanlan yntemin tayin limiti ise 0.2 g/g olarak tespit

edilmitir.

29

Panalvo vd. (2005) tarafndan yrtlen aratrmada ID-GC/MS teknii ile lignanlarn

tayinine ynelik bir yntem gelitirilmesi hedeflenmitir. Yntemin kesinlik ve

hassasiyeti daha nce gerekletirilen aratrmada elde edilen verilerin karlatrlmas

ile yorumlanm, gelitirilen yntem uygun ve yeterli bulunmutur. Aratrma

kapsamna alnan lignanlar secoisolariciresinol, matairesinol, lariciresinol, pinoresinol,

mediaresinol ve syringaresinoldr. rnek hazrlamada 60Cde bir saatlik inkbasyon

ieren metanol ekstraksiyonu sonras -glucuronidase ile enzimatik hidroliz ve C18

kartular kullanlarak SPE uygulamas gerekletirilmitir.

Gda takviyeleri ie ilgili bir aratrma da Chen vd. (2005) tarafndan yrtlmtr.

Soya esasl gda takviyelerinde daidzein, genistein, glycitein, daidzin, glycitin, 6-O-

acetylglycitin ve 6-O-acetylgenistin dzeyleri incelenmesi iin su ve asetonitril ile

ekstraksiyon gerekletirilmi olup, ardndan LC-API-MS (likit kromatografi-

atmosferik basn kimyasal iyonizasyon- ktle spektrometrisi) teknii ile kantitatif

inceleme yaplmtr. Aratrmada kullanlan isoflavonlarn geri kazanm dzeyleri

%92.36-111.0 aralnda gereklemitir.

LC/APCI-MS teknii, Wyns vd. (2010) tarafndan insan idrar ve serumunda bulunan

gut mikrobiyal metabolitlerinin ierdii fitostrojenik bileiklerinin tespitinde

kullanmak zere bir yntem gelitirmilerdir. Bu fitostrojenik bileikler genistein,

daidzein, equol, dihydrodaidzein, O-desmethylangensin, coumestrol,

secoisolariciresinol, matairesinol,, enterodiol, enterolactone, isoxanthohumol,

xanthohumol ve 8-prenylnaringenin olup, rnek hazrlamada sv-sv ekstraksiyon,

enzimatik hidroliz ve SPE uygulamalar gerekletirilmitir. Enzimatik hidroliz iin

sodyum asetat tamponundaki Helix pomatia juice (-glucuronidase), SPE iin ise Bond

Elut C18 kartular kullanlmtr. Kromatografik sistemde C18 kolon yer almtr.

Yntemin tespit limitleri (LOD), bileik ve rnek tipine gre deimekle birlikte idrar

iin 0.2-65.1 ng/mL, serum iin ise 1.4-132.6 ng/mL olarak bildirilmitir.

Key vd. (2006), ngiltere Gda Stveartlar Ajans (FSA; Food Stveards Agency)

tarafndan gda maddeleri, idrar ve plasma rneklerinde daidzein ve genistein

miktarlarnn belirlenmesi iin bir uluslararas kalite salama metodu gelitirilmesi

amac ile alma yrtmlerdir. Yntemde HPLC-UV, GC-MS, LC-MS/MS

30

tekniklerinin kullanlmas sz konusu olup, ayrca rnek hazrlama aamalarnda

ekstraksiyon, SPE uygulamas ve enzimatik hidroliz gerekletirilmektedir.

Milder vd. (2004) drt majr enterolignan n maddesinin (secoisolariciresinol,

matariresinol, lariciresinol ve pinoresinol) gda maddelerinde LC-MS/MS teknii ile

tespiti iin bir yntem gelitirmilerdir. Yntemin rnek hazrlama aamasnda metanol

ile 60Cde bir saatlik ekstraksiyon ve sonrasnda 37Cde bir gece sren inkbasyonda

H. pomatia -glucuronidase/slfataz kullanlarak enzimatik hidroliz gerekletirilmitir.

Kromatografik sistemde ise C18 kolon yer almtr. Keten tohumu, brokoli, ekmek ve

ay gibi farkl matrikslere sahip gda maddelerinin kullanld bu aratrmada LOD

deerinin lignan ve gda maddesi baznda deiiklikler gstererek 0.2-10.0 g/100 g

veya mL aralnda olduu bildirilmitir.

Antignac vd. (2009) tarafndan yrtlen aratrmada LC-MS/MS teknii kullanlarak

zellikle bebek beslenmesine ynelik st rnleri ve tahl rnleri bata olmak zere

gda maddelerindeki fitostrojenik bileiklerin konsantrasyonlarnn belirlenmesi amal

bir yntem gelitirilmesi gerekletirilmi olup, bu yntemin en dikkat ekici yn

rnek hazrlama aamasnda ok sayda ilem yrtlmesi olmutur. rnek hazrlama

aamasnda srasyla ekstraksiyon, enzimatik hidroliz, asit hidrolizi C18 kartu ile SPE

uygulamas ve son olarak SiOH kullanlarak SPE uygulamas sz konsudur.

Ekstraksiyon ilemi iin ok sayda solvent denemi, etkinlik nedeni ile bunlar

arasndan asetat buffer (2M, pH5.2) tercih edilmitir. Enzimatik hidrolizde ise -

glucosidase ve -glucuronidase enzimleri kullanlm, 52Cdeki inkbasyon iin 4-16

saat aras sreler denemi, optimum sre olarak 16 saat tespit edilmitir. Asit hidrolizi

iin ise 80Cde 2 saatlik hidrolizasyonun optimum uygulama olduu bildirilmitir. C18

kolona sahip kromatografik sistemin kullanld aratrma kapsamna apigenin,

biochanin A, glycitein, coumestrol, daidzein, enterodiol, enterolactone, equol,

formononetin, fluorometholone, genistein, matairesinol, resveratrol ve

secoisolariciresinol gibi fitostrojenik bileikler alnm olup, 1 ppbnin altnda

dzeylerde dahi tanmlama gerekletirilebildii belirtilmitir.

nsanlardan elde edilen farkl biyolojik rneklerde fitostrojenlerin veya bunlarn

metabolitlerinin incelenmesi amacyla yrtlen eitli aratrmalar bulunmakta olup,

31

bu aratrmalarda farkl analiz teknikleri kullanlmtr. Bu teknikler arasnda

LC-MS/MS (Key vd. 2006, Taylor vd. 2005, Prasain vd. 2010, Grace vd. 2007, Plamley

vd. 2011), LC-MS (Mustafa vd. 2007, Yu vd. 2009), HPLC (Melby vd. 2005, Kuijsten

vd. 2005) son yllarda sklkla kullanlanlardr. Aratrmalarda idrar ve plasma (Key vd.

2006, Taylor vd. 2005, farkl kan rnekleri (Mustafa vd. 2007, Melby vd. 2005), serum

(Prasain vd. 2010), idrar ve serum (Gracevet vd. 2007, Plamley vd. 2011) ve yalnzca

idrar (Yu vd. 2009) rnekleri aratrma kapsamna alnmtr.

32

3. MATERYAL ve YNTEM

3.1 Materyal

3.1.1 rnekler

Aratrmalarda kullanlan nohut (Cicer arientinum) rnei Ankara piyasasnda farkl

sat noktalarndan temin edilmitir. Nohut rnei, ncelikle laboratuar tip deirmende

(Blabender, Germany) ince tmeye tabi tutularak toz haline gelinceye kadar

tldkten sonra yine polietilen malzemeden imal kilitli torbalara yerletirilerek

rnek hazrlama ilemine dein -18Cde muhafaza edilmilerdir.

Muhafaza ilemleri Ankara niversitesi Mhendislik Fakltesi Gda Mhendislii

Blmnde gerekletirilmitir.

3.1.2 Reaktifler ve ekipmanlar

Aratrmada kullanlan reaktiflerden asetonitril (HPLC grade, %99,8), metanol (HPLC

grade, %99,9), hidroklorik asit, glasiyel asetik asit (%100), sodyum hidroksit, sodyum

asetat trihidrat, su (HPLC grade) Merck (Darmsadt, Germany)den ve yine dimetil

slfoksit Merck (Hohenbrunn, Germany)den temin edilmitir. BSTFA (N,O-

bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide) trevlendirme ajan ve DPPH (2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl) serbest radikali Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)den temin

edilmitir.

Ayrca rnek hazrlama yntemlerinin uygulanmasnda, su banyosu (BM 302, Nve,

Ankara, Trkiye), santrifj (Universal 320R, Hettich, Tufflingen, Germany), el blenderi

(Harmony20, Fakir, Germany), UV-visible spektrofotometre (UV-1601, Shimadzu,

Australia), manyetik kartrc (Are2, Velp, Italia), pHmetre (pH890, Nel, Ankara,

Trkiye), analitik terazi (0,1 mg hassasiyet, XS204, Mettler Toledo, Swizerlve), filtre

kad (Whatman, Englve), ultrasonik su banyosu (LBS2, Falc Instrument, Treviglio,

Italy), vortex kartrc, azot altnda younlatrma ekipman ((EVA-EC1-L 24-16,

VLM, Germany) kullanlmtr.

33

Enzimatik ve oklu (enzimatik + asit) hidrolizasyon ile rnek hazrlama yntemlerinin

uygulanmasnda ise aspergillus trlerinden elde edilmi sellaz (1000 u/g), bademden

elde edilmi -glucosidase (7,8 u/mg) ve Helix pomatiadan elde edilmi olan -

glucuronidase, Type HP2 enzimleri kullanlmtr. Bu enzimler Sigma-Aldrich (St

Louis, MO, USA)den temin edilmitir. Enzim zeltileri gnlk olarak hazrlanm ve

kullanlmtr.

3.1.3 Stveart maddeler

Aratrmada kullanlan rutin dnda tm stveart maddeler Sigma-Aldrich (St Louis,

MO, USA)den temin edilmi ve retici tarafndan tanmlanm olan koullara uygun

olarak muhafaza edilmilerdir. Rutin ise Wako (Osaka, Japan)dan temin edilmitir. Bu

stveart maddelerin isimleri, molekl arlklar, saflk dzeyleri, CAS numaralar,

kimyasal forml ve yaplar izelge 3.1de yer almaktadr.

34

izelge 3.1 Aratrmada kullanlan stveart maddeler Stveart Madde Molekl

Arl Saflk Dzeyi

(%)

CAS No

Marka Katalog No

Kimyasal Forml

Sinonim

Biochanin A 284,26 - 491-80-5

Sigma D2016 C16H12O5 5,7-Dihydroxy-4-methoxyisoflavone, Genistein 4-methyl ether

Daidzein 254,24 98,0 486-66-8

Sigma D7802 C15H10O4 4,7-Dihydroxyisoflavone, 7-Hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one, 7-Hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)chromone

Glycitein 284,26 97,0 40957-83-3

Sigma G2785 C16H12O5 4,7-Dihydroxy-6-methoxyisoflavone, Glycetein

Genistein 270,24 98,0 446-72-0

Sigma G6649 C15H10O5 4,5,7-Trihydroxyisoflavone, 5,7-Dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one

Formononetin 268,26 99,0 485-72-3

Fluka 47752 C16H12O4 7-Hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)chromone, 7-Hydroxy-4-methoxyisoflavone

Ononin 430,40 99,0 486-62-4

Fluka 75275 C22H22O9 Formononetin 7-O--D-glucopyranoside

Secoisolariciresinol 362,42 95,0 29388-59-8

Biochemika 60372 C20H26O6 (2R*,3R*)-2,3-Bis(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)-1,4-butanediol

Matairesinol 358,39 85,0 580-72-3

Fluka 40043 C20H22O6 (R,R)-,-Bis(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)butyrolactone

34

35

izelge 3.1 Aratrmada kullanlan stveart maddeler (devam)

Stveart Madde

Molekl Arl

Saflk Dzeyi

(%)

CAS No Marka Katalog No

Kimyasal Forml

Sinonim

Coumestrol 268,22 95,0 479-13-0 Sigma 27885 C15H18O5 7,12-Dihydroxycoumestan Sissotrin 446,40 95,0 5928-26-

7 Sigma 85447 C22H22O10 Biochanin A 7-O--D-glucopyranoside,

Sissostrin Gylcitin 446,40 - 40246-

10-4 Sigma G1296 C22H22O10 4H-1-Benzopyran-4-one, 7-(-D-

glucopyranosyloxy)-3-(4-hydroxyphenyl)-6-methoxy-, Glycitein 7-O--glucoside

Daidzin 416,38 95,0 552-66-9 Sigma 30408 C21H20O9 Daidzein-7-O--D-glucopyranoside Genistin 432,38 95,0 529-59-9 Sigma G0897 C21H20O10 ,5,7-Trihydroxyisoflavone 7-glucoside,

Genistein 7-glucoside, Genistein-7-O--D-glucopyranoside

Quercetin 302,24 98,0 117-39-5 Sigma Q4951 C15H10O7 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-one, 3,3,4,5,6-Pentahydroxyflavone

Rutin 610.52 90,0 207671-50-9

Wako 189-00342

C27H30O16 xH2O

Quercetin-3-rutinoside hydrate, Vitamin P hydrate

Apigenin 270,24 95,0 520-36-5 Sigma 10798 C15H20O9 4,5,7-Trihydroxyflavone

35

36

3.2. Yntem

3.2.1 rnek hazrlama yntemleri

Aratrma kapsamnda bulunan tm gda maddeleri, drt farkl rnek hazrlama yntemi

kullanlarak, kromatografik rnekler iin hazrlanmtr. Hazrlanan nohut rneine

verilen kodlar izelge 2de yer almaktadr.

izelge 3.2 rnek kodlar

rnek Direkt

Ekstraksiyon Asit Hidrolizi Enzimatik Hidroliz oklu (Enzimatik

+ Asit) Hidroliz

Nohut 6DE 6AH 6EH 6EAH 3.2.1.1 Direkt ekstraksiyon yntemi

Direkt ekstraksiyon ile rnek hazrlama yntemi Kim vd. (2007) tarafndan uygulanan

yntemden uyarlanm olup, daha nce belirtilmi olduu ekilde hazrlanm

rneklerden 2 g tartlmtr. Bu rneklere 20 mL %80lik metanol ve 0,1 N HCLden 2

mL ilave edilerek 2 saat ultrasonik banyoda kartrlmtr. Sre sonunda filtrasyonu

gerekletirilen (Whatman No42) rnekler azot gaz altnda younlatrma ilemine tabi

tutulmutur. rneklerde ayn gn kromatografik analizler gerekletirilmi veya 4Cde

ktan da korunacak ekil ve ambalajda muhafaza edilmilerdir. Direkt ekstraksiyon

ynteminde uygulanan i ak ekil 3.1de verilmitir.

3.2.1.2 Asit hidrolizasyon yntemi

Asit hidrolizasyonu gerekletirilerek rnek hazrlama yntemi Alves vd. (2010)

tarafndan uygulanan yntemden uyarlanm olup, daha nce belirtilmi olduu ekilde

hazrlanm rneklerden 2 g tartlmtr. Bu rneklere 20 mL %80lik metanol ve 3,4 N

HCLden 20 mL, %1lik BHT zeltisinden (Metanol:BHT, 99:1) 500L ilave edilerek

75C scaklkta 150 dakika sre ile kartrlarak hidrolizasyon gerekletirilmitir. Sre

37

sonunda hidrolizattan 10 mL alnarak 10 M NaOH zeltisinden 1,2 mL ilave edilerek

vortexde kartrlmtr. Ardndan 9000grda 5 dakika santrifj sonras elde edilen

supernatant azot gaz altnda younlatrma ilemine tabi tutulmutur. rneklerde ayn

gn kromatografik analizler gerekletirilmi veya 4Cde ktan da korunacak ekil ve

ambalajda muhafaza edilmilerdir. Asit hidrolizasyonu ile rnek hazrlama ynteminde

uygulanan i ak ekil 3.2de verilmitir.

Metanol %80, 20 mL

0,1 N HCL, 2 mL

HPLC, GC-MS ve LC-MS/MS

Kartma Ultrasonik Banyo, 2

saat

rnek (2 g) (Whatman No42 Filtre)

Younlatrma (Azot Gaz Altnda)

Muhafaza (4 C)

ekil 3.1 Direkt ekstraksiyon yntemi ile rnek hazrlama

3.2.1.3 Enzimatik hidrolizasyon yntemi

Enzimatik hidrolizasyon ile rnek hazrlama yntemi Kuhnle vd. (2009a) tarafndan

uygulanan yntemden uyarlanm olup daha nce belirtilmi olduu ekilde hazrlanm

rneklerden 2 g analitik terazi tartlmtr. Bu rneklere 20 mL %80lik metanol ve 0,1

N HCLden 2 mL, %1lik BHT zeltisinden (Metanol:BHT, 99:1) 500L ilave

edilerek 2 saat ultrasonik banyoda kartrlmtr. Ardndan 5000grde 15 dakika

santrifj sonras elde edilen supernatantdan 4 mL alnm ve toplam 6 mL hacimli

sodyum asetat (%0,1, pH 5,0) zeltisi ierinde yer alan 480 L sellaz (1000 u/g),

bademden elde edilmi 2 mg -glucosidase (7,8 u/mg) ve Helix pomatiadan elde

edilmi olan 300 L -glucuronidase, Type HP2 enzimleri kullanlarak, 37Cde 16 saat

sren enzimatik hidroliz uygulanmtr. Sre sonunda rnekler oda scaklna

soutulmu ve hidrolizattan 4 mL alnmtr. Alnan ksm vortex kartrc kullanlarak

38

kartrldktan sonra 9000grde 5 dakika santrifj uygulanmtr. Supernatant azot gaz

altnda younlatrma ilemine tabi tutulmutur. rneklerde ayn gn kromatografik

analizler gerekletirilmi veya 4Cde ktan da korunacak ekil ve ambalajda

muhafaza edilmilerdir. Enzimatik hidrolizasyonu ile rnek hazrlama ynteminde

uygulanan i ak ekil 3.3de verilmitir.

rnek (2 g)

Kartma Ultrasonik Banyo, 2

saat

Hidroliz (75 C/150

dk, refluxing)

Hidrolizat (10 mL) Vortex

(Azot Gaz

C)

HPLC, GC-MS ve LC-MS/MS

Metanol (%80), 20 mL 10 M NaOH, 1.2 mL

.4 N HCL, 20 mL Metanol:BHT, 99:1 /5dk)

Supernatant

ekil 3.2 Asit hidrolizasyon yntemi ile rnek hazrlama

39

rnek (2 g)

Kartma Ultrasonik Banyo, 2

saat

Santrifj, 5000g/15

dk

Spernatant

rnek Alma 4.0 mL

Vortex

Muhafaza (4 C)

Spernatant

Younlatrma (Azot Gaz Altnda)

HPLC, GC-MS ve LC-MS/MS

Metanol (%80), 20 mL

Oda Scaklnda Soutma

Hidrolizat (4 mL)

0.1 N HCL, 2 mLBHT (%1), 500 L Metanol:BHT, 99:1

( g), Glucuronidase (300L) ve

Cellulase, (480L), Sodyum Enzimatik

Hidroliz 37

Santrifj, 9000g/5 dk

ekil 3.3 Enzimatik hidrolizasyon yntemi ile rnek hazrlama

3.2.1.4 oklu (enzimatik + asit) hidrolizasyon yntemi

oklu (enzimatik ve asit) hidrolizasyon yntemi Kuhnle vd. (2009a) ve Alves vd.

(2010) tarafndan uygulanan yntemlerden uyarlanm olup, her iki hidroliz yntemi de

sras ile yrtlmtr. Bu amala daha nce belirtilmi olduu ekilde hazrlanm

rneklerden 2 g tartlmtr. Bu rneklere 20 mL %80lik metanol ve 0,1 N HCLden 2

mL, %1lik BHT zeltisinden (Metanol:BHT, 99:1) 500L ilave edilerek 2 saat

ultrasonik banyoda kartrlmtr. Ardndan 3000grde 3 dakika santrifj sonras elde

edilen supernatantdan 4 mL alnm ve toplam 6 mL hacimli sodyum asetat (%0,1, pH

5,0) zeltisi ierinde yer alan 480 L sellaz (1000 u/g), bademden elde edilmi 2 mg

-glucosidase (7,8 u/mg) ve Helix pomatiadan elde edilmi olan 300 L -

40

glucuronidase, Type HP2 (Sigma, St Louis, MO, USA ) enzimleri kullanlarak, 37Cde

16 saat sren enzimatik hidroliz uygulanmtr. Sre sonunda rnekler oda scaklna

soutulmu ve hidrolizattan 5,1 mL alnm ve 10,2 N HCLden 2,01 mL ilave edilerek

75C scaklkta 150 dakika sre ile kartrlarak hidrolizasyon gerekletirilmitir. Sre

sonunda hidrolizattan 5 mL alnarak 10 M NaOH zeltisinden 0,6 mL ilave edilerek

vortexde kartrlmtr. Ardndan 9000grde 5 dakika santrifj sonras elde edilen

supernatant azot gaz altnda younlatrma ilemine tabi tutulmutur. rneklerde ayn

gn kromatografik analizler gerekletirilmi veya 4Cde ktan da korunacak ekil ve

ambalajda muhafaza edilmilerdir. oklu hidrolizasyon ile rnek hazrlama ynteminde

uygulanan i ak ekil 3.4de verilmitir.

41

rnek (2 g)

Kartma Ultrasonik Banyo, 2

saat

Santrifj, 3000g/30

dk

Spernatant

rnek Alma 4.0 mL

Hidrolizat (5.1 mL)

Asit Hidrolizi(75 C/150 dk, refluxing

Hidrolizat (5 mL)

Vortex

Santrifj (9000g/5 dk)

HPLC, GC-MS ve LC-MS/MS

10.2 N HCL, 2.01 mL

10 m NaOH, 0.6 mL

Spernatant

Muhafaza Younlatma(4 C) (Azot Gaz Altnada)

Metanol (%80), 20 mL

0.1 N HCL, 2 mLBHT (%1), 500 L Metanol:BHT, 99:1

-Glucosidase (2 mg), -Glucuronidase (300L) ve

Cellulase, (480L), Sodyum acetate zeltisindeki (%0,1, pH

5,0) (Toplam Hacim : 6 mL)

Enzimatik Hidroliz 37 C/16 saat

Oda Scaklnda Soutma

ekil 3.4 oklu (enzimatik+asit) hidrolizasyon yntemi

42

3.2.2 Kat-faz ekstraksiyon (spe) yntemi

rneklerde sahip olunan kompleks matriksin kromatografik yntem uygulamasnda

seicilii ve hassasiyeti zerinde etkisini gzlemek amacyla kat-faz ekstraksiyon

yntemi ile almalar gerekletirilmitir.

Bu yntemin uygulanmas, dier rnek hazrlama yntemlerinde belirtilen azot gaz

altnda younlatrma ilemi ncesi gerekletirilmitir. Oasis HLB SPE kartu (1cc/30

mg) srasyla 1 mL metanol ve 1 mL su kullanlarak artlverlmtr. Ardndan rnekten

1 mL alnarak SPE kartutan geirilmitir. Daha sonra kartu su:metanol karm (95:5)

ile ykanmtr. Ykama ilemini takiben, 1mL metanol kullanlarak bileikler ekstrakte

edilmeye allmtr.

Kat-faz ekstraksiyon uygulamas iin rnek alma aamas, hidrolizasyon (asidik,

enzimatik veya asidik ve enzimatik) veya metanolizasyon (direkt ekstraksiyon) ilemleri

sonras, azot gaz altnda younlatrma ncesi olarak gerekletirilmitir.

3.2.3 LC-MS/MS

almada, LC-MS/MS (Yksek Performansl Sv Kromatografisi/Sral Ktle

Spektrometresi) olarak likit kromatografi (LC 1200, Agilent Technologies, Santa Clara,

CA, USA) ile sral haldeki l (triple), drt ulu (quadrupole) ktle spektrometresi

(MS, G6460A Triple quadrupole mass spectrometer) kullanlmtr. Sistemde G1367C

Hip-ALS SL otomatik rnekleyici, G1312B Binpump ikili binary pompa ve G1316B

Column-SL thermostated kolon (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) yer

almakta olup, LC-MS/MS sistemi zellikler izelge 3.3de yer almaktadr.

izelge 3.3 LC-MS/MS sistemi zellikleri Sistem Bileeni Marka Model HPLC Agilent 1200 LC MS (Ktle Spektrometresi) Agilent G6460A Triple quadrupole mass spectrometer Otomatik rnekleyici Agilent G1367C Hip-ALS SL Pompa Agilent Binary, G1312B Binpump Thermostated Kolon Agilent G1316B Column-SL

43

Kuhnle vd. (2009a ve 2009b) tarafndan uygulanan yntemde baz deiiklikler

gerekletirilerek kullanlan LC-MS/MS sisteminde kolon olarak Zorbax Eclipse XDB

C18 (50 mm L 2.1 mm ID, 1.8 m dp) kolon (Waters Corporation, Milford, MA,

USA) kullanlmtr. Kolon frn scakl 35 Cye ayarlanmtr. Ak hz 0.3

mL/dakikaya ayarlanm olup, toplam ak sresi 12 dakika olarak gerekletirilmitir.

Gradiyent ilke ile, mobil faz A olarak 0.01% (w/v) formik asit 5 mM amonyum format

ieren su ve mobil faz B olarak asetonitril kullanlmtr. Elsyon profili 0.00 - 3.00.

dakika aras %5 Mobil Faz B, 3.01 - 4.50 dakika aras %95 Mobil Faz B, 4.51 - 12.00

dakika aras % 5 Mobil Faz B eklindedir. MRM (Multiple Reaction Monitoring)

tarama tipi kullanlm, toplam iyon kromatogramlar (TIC) elde edilmitir. LC-MS/MS

metod koullar izelge 3.4te sunulmutur.

LC-MS/MS sisteminde kalibrasyon iin, alma kapsamndaki tm fitostrojenik

bileiklerin metanol kullanlarak 10, 25, 50, 100, 250 ve 500 ppblik zeltileri sisteme

verilmitir. Elde edilen veriler kulanlarak tayin (LOQ) ve tehis limitleri (LOD)

(izelge 3.5) ve alkonma sreleri yan sra bunlara ait iyonlar ile ilgili tanmlama ve

hesaplamada kullanlan veriler elde edilmitir (izelge 3.6).

44

izelge 3.4 LC-MS/MS metodu koullar Metod Koulu Aklama Kolon Zorbax Eclipse XDB C18 (50 mm L 2.1 mm i.d., 1.8 m dp) Mobil faz Mobil faz: 0.01% (w/v) formik asit 5 mM amonyum format, suda

Mobil Faz B: Asetonitril Elsyon profili 0.00 - 3.00 dakika, %5 Mobil Faz B

3.01 - 4.50 dakika, %95Mobil Faz B 4.51 - 12.00 dakika, % 5 Mobil Faz B

Ak hz 0.3 mL/dakika Ak sresi 12 dakika Kolon scakl 35 C Tarama tipi Dinamik Multiple Reaction Monitoring (MRM) Enjeksiyon 5 L, needle wash ile (flush port, 3 saniye; su/metanol, 1/1) yonizasyon Electrospray Ionization (ESI), pozitif ve negatif iyonizasyon Delta EMV (electron multiplier voltage)

300 V

Kromatogram tipi Toplam yon Kromatogram (TIC) Jet stream parametreleri

Kurutma gaz scakl 275C Kurutma gaz ak hz 10mL/dakika Nebulizer basnc 45 psi Sheath gaz scakl 350C Sheath gaz ak hz 10 mL/dakika Kapiler voltaj 3500 V Nozzle voltaj 0 V izelge 3.5 LC-MS/MS yntemi, tayin ve tehis limitleri Stveart Madde Tayin Limiti. LOQ (ppb) Tehis Limiti. LOD (ppb) Apigenin 0.9 0.3 Biochanin A 0.9 0.3 Coumestrol 1.5 0.5 Daidzein 0.9 0.3 Daidzin 3.0 1.0 Formononetin 0.9 0.3 Genistein 0.9 0.3 Genistin 0.9 0.3 Glycitein 0.9 0.3 Glycitin 0.9 0.3 Matairesinol 3.0 1.0 Ononin 3.0 1.0 Quercetin 3.0 1.0 Rutin 0.9 0.3 Secoisolariciresinol 3.0 1.0 Sissotrin 0.9 0.3 LOQ: Limit of quantitation, LOD: Limit of detection

45

ekil 3.5 Aratrmada kullanlan likit kromatografi (1) tveem quadrupol ktle spektrometre(2)ye ait bir grnt

45

46

izelge 3.6 LC-MS/MS ynteminde incelenen stveart maddelere ait baz zellikler

MRM geileri (m/z)

Stveart madde Alkonma sresi (dk) Kalibrasyon aral (ng/mL)

Molekler iyon rn iyonu

Kalma sresi (ms)

Formononetin 5.25 10-500 266.6 251.6 10 Genistein 5.10 10-500 268.6 132.8 10 Glycitein 4.96 10-500 282.6 267.6 10 Daidzein 4.94 10-500 252.6 223.1 10 Biochanin A 5.46 10-500 282.6 267.5 10 Matairesinol 5.13 10-500 356.4 82.8 10 Secoisolariciresinol 4.86 50-500 360.4 164.2 10 Coumestrol 5.11 10-500 266.6 210.6 10 Ononin 4.84 10-500 431.3 269.1 10 Genistin 4.72 10-500 433.3 271.1 10 Daidzin 4.60 10-500 417.3 255.1 10 Glycitin 4.62 10-500 447.3 284.9 10 Rutin 4.65 10-500 608.2 299.7 10 Apigenin 5.09 10-500 268.6 116.9 10 Quercetin 4.98 10-500 300.5 150.8 10 Sissotrin 4.97 10-500 447.3 285.1 10

MRM: multiple reaction monitoring

46

47

izelge 3.7 LC-MS/MS ynteminde incelenen stveart maddelere ait iyonlarn baz zellikleri

Bileik Ad Precursor iyon Product iyon Fragmentor Collision energy Polarite Daidzein 252.6 223.1, 207.7 130 26 Negatif Coumestrol 266.6 238.6, 210.6 130 18, 22 Negatif Formononetin 266.6 251.6, 222.7 112 10, 26 Negatif Apigenin 268.6 150.7, 116.9 130 18, 34 Negatif Genistein 268.6 158.6, 132.8 130 26 Negatif Biochanin A 282.6 267.5, 238.6 112 14, 26 Negatif Glycitein 282.6 267.6, 239.6 112 10, 18 Negatif Quercetin 300.5 178.7, 150.8 130 6, 10 Negatif Matairesinol 356.5 203.0, 82.9 112 22, 18 Negatif Secoisolariciresinol 360.4 164.2 90 20 Negatif Daidzin 417.3 255.1, 199.0 90 10, 30 Pozitif Ononin 431.3 270.3, 269.1 90 10 Pozitif Genistin 433.3 271.1 90 10 Pozitif Glycitin 447.3 284.9, 269.8 90 18, 30 Pozitif Sissotrin 447.3 285.1 90 10 Pozitif Rutin 608.2 299.7 130 34 Negatif

47

48

3.2.4 statistiksel analiz

Elde edilen veriler, farkl noktalardan temin edilen sebze rnekleri iin gerekletirilen

rnek hazrlama yntemleri bazndaki tekerrre ait sonularn, ortalama ve stveart

sapma deerlerinin ANOVA SPSS 15.0 program ile hesaplanmas ile betimsel istatistik

deerlendirmeye tabii tutulmutur.

49

4. BULGULAR

4.1 Nohut rneine Ait Bulgular

LC-MS/MS kromatografi teknii ile, drt farkl rnek hazrlama metodunun nohut

(Cicer arietinum) rneklerine uygulanmas sonucunda, kromatografik teknik ve rnek

hazrlama metodu baznda deiiklikler gsterecek nitelikte kalitatif ve kantitatif veriler

elde edilmitir.

LC-MS/MS yntemi ile nohut rneklerinde belirlenen fitostrojenik bileiklerden

isoflavon grubuna ait olanlarn izelge 4.1de, lignan grubuna ait olanlarn izelge

4.2de ve dier flavonoid olanlarn izelge 4.3te alkonma sreleri, response deerleri

ve miktarlar verilmitir.

izelge 4.1- 4.3de grld gibi nohut rneklerinde uygulanan LC-MS/MS yntemi

sonras direkt ekstraksiyon ile hazrlanm olan rneklerde, isoflavonlardan daidzein 2.4

ppb (0,84 3.96 ppb), genistein 11.3 ppb (11.18 11.47 ppb) ve genistin 2.8 ppb (2.67

- 2.84 ppb) dzeylerinde belirlenmi olup, lignanlardan matairesinoln

50

formononetin 6.97 ppb (6.96 6.99 ppb), genistein 6.5 ppb (4.04 8.87 ppb) ve

genistin 3.1 ppb (2.96 3.15 ppb) konsantrasyonlarnda belirlenmitir. Lignanlardan ve

dier flavonoid olarak srasyla secoisolariciresinol 373.02 ppb (325.23 422.24 ppb)

ve apigenin ise 37.4 ppb (35.30 39.54 ppb) olarak tespit edilmitir.

Enzimatik hidroliz yan sra asit hidrolizinin uygulve rnek hazrlama ynteminde ise

isoflavon grubu fitostrojenik bileiklerden biochanin A 27.5 ppb (25.7 29.18 ppb),

formononetin 5.8 ppb (5.76 5.80 ppb), genistein

51

izelge 4.1 Farkl rnek hazrlama yntemleri uygulanm nohut rneklerinde LC-MS/MS ile belirlenen isoflavonlarn miktarlar

DE EH AH EAH

Miktar Miktar Miktar Miktar

soflavon

RT Response

(ppb)

RT Response

(ppb)

RT Response

(ppb)

RT Response

(ppb)

BiochaninA 5.443 5955.5 4.2 5.430 48471 59.5 5.424 4935.5 2.9 5.433 23839 27.5

Daidzein 4.931 128.5 2.4 4.840 23 n.d. 5.210 17 n.d. 5.140 14 n.d.

Daidzin 4.764 167.5 n.d. 4.571 72 n.d. 4.619 151.5 n.d. 4.591 146.5 n.d.

Formononetin 5.230 1676 1.5 5.214 4286 6.9 5.208 515.5 n.d. 5.220 3714.5 5.8

Genistein 5.089 363 11.3 5.066 224 6.5 5.058 50.5 0.5 5.078 52.5 0.5

Genistin 4.831 418 2.8 4.432 713.5 3.1 4.700 1501.5 3.9 4.588 67.5 2.4

Glycitein 4.955 817.5 27.0 5.064 72 n.d. 4.921 2498.5 105.2 5.433 23827 931.7

Glycitin 4.855 145 n.d. 4.928 402 n.d. 4.924 307628 55.5 4.533 1109 n.d.

Ononin 4.791 370 n.d. 4.659 34.5 n.d. 4.803 18635 7.95 4.558 726 n.d.

Sissotrin 4.959 91 n.d. 4.928 402 n.d. 4.924 304251.5 446.8 4.533 1136