ankara Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ yÜksek...

ANKARA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

ATMOSFERDE EN ÇOK RASTLANAN MİKROFUNGUS

CİNSLERİNE AİT BAZI TÜRLERİN PROTEİN

PROFİLLERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI

Burhanettin YALÇINKAYA

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ANKARA

2012

Her hakkı saklıdır

TEZ ONAYI

Burhanettin YALÇINKAYA tarafından hazırlanan “Atmosferde En Çok Rastlanan

Mikrofungus Cinslerine Ait Bazı Türlerin Protein Profillerinin Karşılaştırılması”

adlı tez çalışması 09/11/2012 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Ankara Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak

kabul edilmiştir.

Danışman: Prof. Dr. N. Münevver PINAR

Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü

Jüri üyeleri:

Başkan: Prof. Dr. Kadriye SORKUN Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü

Üye : Prof.Dr. Nur Münevver Pınar Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü

Üye : Yrd. Doç. Dr. Ahmet Emre YAPRAK

Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü

Yukarıdaki sonucu onaylarım

Prof. Dr. Özer KOLSARICI

Enstitü Müdürü

i

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

ATMOSFERDE EN ÇOK RASTLANAN MİKROFUNGUS

CİNSLERİNE AİT BAZI TÜRLERİN PROTEİN

PROFİLLERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI


Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. N. Münevver PINAR

Bu çalışmada Atmosferde en çok rastlanan mikrofungus cinslerine (Acremonium

kiliense, Alternaria alternata, Aspergillus flavipes, Aspergillus niger, Aspergillus

oryzae, Cladosporium herbarum, Cladosporium obtectum, Cylindrocladium

floridanum, Penicillium chrysogenum), ait taksonların protein profillerinin

karşılaştırılması, SDS-Page yöntemiyle yapılmıştır. Bu yönteme göre, Acremonium

kliense, örneğinden SDS-Page yöntemi ile 19, Aspergillus flavipes örneğinden 17,

Aspergillus niger’den 10, Aspergillus oryzae’den 13, Alternaria alternata’dan 31,

Cladosporium herbarum’dan 25, Cladosporium obtectum’dan 16, Cylindrocladium

floridanum’dan 14 ve Penicillium chrysogenum’dan 20 farklı protein bandı elde

edilmiştir.

Elde edilen verilere göre toplam 82 farklı protein bandı elde edilmiş, 24kDA

büyüklüğündeki protein bandının 7 taksonda (Acremonium kiliense, Aspergillus

flavipes, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Cladosporium obtectum,

Cylindrocladium floridanum, Penicillium chrysogenum) ortak olduğu gözlemlenmiştir.

Kasım 2012, 69 sayfa

Anahtar Kelimeler: Atmosfer, Mikrofungi, Protein, SDS-Page, Türkiye

ii

ABSTRACT

Master Thesis

COMPARİSON OF PROTEİN PROFİLES OF SOME

MİCROFUNGİ SPECİES BELONGİNG TO MOST

OBSERVED GENERA İN ATMOSPHERE


Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Biology

Supervisor: Prof.Dr. N. Münevver PINAR

In this study, the protein profile comparison of most commonly found microfungus

genera taxa in the atmosphere (Acremonium kiliense, Alternaria alternata, Aspergillus

flavipes, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Cladosporium herbarum, Cladosporium

obtectum, Cylindrocladium floridanum, Penicillium chrysogenum) was conducted using

SDS-Page. According to this method, different protein bands for Acremonium kliense

(19), Aspergillus flavipes (17), Aspergillus niger (10), Aspergillus oryzae (13),

Alternaria alternata (31), Cladosporium herbarum (25), Cladosporium obtectum (16),

Cylindrocladium floridanum (14) and Penicillium chrysogenum (20) were obtained.

Based on data, 82 different protein bands were obtained and 24kDA-sized protein band

was determined to be common for 7 taxa (Acremonium kiliense, Aspergillus flavipes,

Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Cladosporium obtectum, Cylindrocladium

floridanum, Penicillium chrysogenum).

November 2012, 69 pages

Key Words: Atmosphere, Microfungi, Protein, Morphology, SDS-Page, Turkey

iii

TEŞEKKÜR

Bu çalışmanın gerçekleşmesindeki her aşamada bilgi, öneri ve yardımlarını esirgemeyen

her şeyden öte hem akademik hemde insani olarak yetişmemde çok değerli katkıları

olan danışman hocam Sayın Prof. Dr. Nur Münevver PINAR’a (Ankara Üniversitesi

Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü), bilgi ve deneyimlerinden her zaman yararlandığım

Sayın Prof. Dr. Özlem YILDIRIM’a (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji

Bölümü), çalışmalarım boyunca hep yanımda olan ve yardımlarını esirgemeyen Sayın

Yrd. Doç. Dr. Şenol ALAN’a (Bülen Ecevit Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi

Biyoloji Bölümü), Sayın Yrd. Doç. Dr. Talip ÇETER’e (Kastamonu Üniversitesi Fen

Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü), fungusları hayatıma sokan ve örneklerimin

temininde yardımcı olan Sayın Yrd. Doç. Dr. Adem İmalı’ya (Kilis 7 Aralık

Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü), çalışmalarım sırasında hertürlü

desteği aldığım dostum Ferudun KOÇER’e,

Çalışmalarım süresince maddi ve manevi fedakârlıklar gösteren aileme ve hep yanımda

olan eşim Saliha YALÇINKAYA’ya, en derin duygularla teşekkür ederim.

Bu tez çalışması, ‘TUBİTAK SBAG-COST ES0603-30 (109S265) Orta ve Doğu

Karadeniz Bölgesi Atmosferik Polen ve Mantar Sporlarının İncelenmesi’’ konulu proje

tarafından desteklenmiştir.


Ankara, Kasım 2012

iv

İÇİNDEKİLER

ÖZET ………………...………………………………………………………………….i

ABSTRACT ..................................................................................................................... ii

TEŞEKKÜR ................................................................................................................... iii

KISALTMALAR DİZİNİ .............................................................................................. v

ŞEKİLLER DİZİNİ ....................................................................................................... vi

ÇİZELGELER DİZİNİ ............................................................................................... viii

1. GİRİŞ ............................................................................................................................ 1

2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ARAŞTIRMALARI ........................... 4

2.1 Kaynak Araştırmaları ............................................................................................... 4

2.1.1 Türkiyede yapılan atmosferik fungus çalışmaları .............................................. 4

2.1.2 Fungal protein çalışmaları ................................................................................. 8

2.2 Kuramsal Temeller ................................................................................................. 9

2.2.1 Araştırmada kullanılan örneklerin genel özellikleri ..................................... 9

3. MATERYAL VE YÖNTEM .................................................................................... 22

3.1 Örneklerin Temini ................................................................................................... 22

3.2 Örneklerin Çoğaltılması ......................................................................................... 23

3.2.1 Besiyerlerinin hazırlanması ................................................................................. 23

3.2.2 Örneklerin üretilmesi .......................................................................................... 25

3.2.3 Örneklerin özütlenmesi ....................................................................................... 25

3.3 Protein Profil Çıkarılmasında Kullanılan Yöntemler ......................................... 25

3.3.1 Özütlenen örneklerin total miktarlarının belirlenmesi .................................... 26

3.3.2 Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) .............. 26

3.4 MVSP (MultiVariate Statistical Package) ............................................................ 32

4. BULGULAR .............................................................................................................. 33

5. TARTIŞMA VE SONUÇ .......................................................................................... 53

KAYNAKLAR .............................................................................................................. 64

ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................... 69

v

KISALTMALAR DİZİNİ

APS Amonyum Persülfat

EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit

N-PAGE Native-Poliakrilamid Jel Elektroforez

ME Merkaptoetanol

PAGE Poliakrilamid Jel Elektroforez

SDS Sodyum Dodesil Sülfat

SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforez

TAE Tris Asetikasit EDTA

TEMED Tetra Etil Metilen Diamin

MVSP MultiVariate Statistical Package

kDa Kilodalton

MEA Malt Ekstrakt Agar

SDA Sabouraud Dekstroz Agar

vi

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 2.1 Aerofungus çalışmalarında kullanılan tuzaklar ................................................. 4

Şekil 2.2 Türkiye'de yapılan aerofungus çalışmalarında kullanılan yöntemlerin illere

göre dağılımı ....................................................................................................... 5

Şekil 4.1 a. Çalışmada kullanılan örneklerin protein bant verilerine göre elde edilen

dendrogram b. Çalışmada kullanılan örneklerin sistematik verilerine göre

elde edilen dendrogram ..................................................................................... 34

Şekil 4.2 a. Acremonium kliense’nin katı besiyerinde görüntüsü b. Acremonium

kliense’nin sıvı besiyerinde görüntüsü c. Acremonium kliense’den SDS-Page

yöntemiyle elde edilen protein bantları. d. Standart proteinlerin log MW

değerlerine karşı, Rf değerleri........................................................................... 35

Şekil 4.3 Acremonium kliense total protein miktarı ........................................................ 36

Şekil 4.4 a. Alternaria alternata’nın katı besiyerinde görüntüsü b. Alternaria

alternata’nın sıvı besiyerinde görüntüsü c. Alternaria alternata’dan SDS-

Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log

MW değerlerine karşı, Rf değerleri .................................................................. 37

Şekil 4.5 Alternaria alternata total protein miktarı ........................................................ 38

Şekil 4.6 a. Aspergillus flavipes’in katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus flavipes’

in sıvı besiyerinde görüntüsü c.Aspergillus flavipes’den SDS-Page

yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW


Şekil 4.7 Aspergillus flavipes total protein miktarı ......................................................... 40

Şekil 4.8 a. Aspergillus niger’in katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus niger’in

sıvı besiyerinde görüntüsü c. Aspergillus niger’den SDS-Page yöntemiyle

elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine

karşı, Rf değerleri.............................................................................................. 41

Şekil 4.9 Aspergillus niger total protein miktarı ............................................................. 42

Şekil 4.10 a. Aspergillus oryzae’nin katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus oryzae

’nin sıvı besiyerinde görüntüsü c. Aspergillus oryzae ’den SDS-Page

yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW


Şekil 4.11 Aspergillus oryzae total protein miktarı ......................................................... 44

Şekil 4.12 a. Cladosporium herbarum’un katı besiyerinde görüntüsü b. Cladosporium

herbarum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cladosporium herbarum’dan

SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin

log MW değerlerine karşı, Rf değerleri ............................................................ 45

Şekil 4.13 Cladosporium herbarum total protein miktarı ............................................... 46

Şekil 4.14 a. Cladosporium obtectum’un katı besiyerinde görüntüsü b. Cladosporium

obtectum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cladosporium obtectum’un SDS-

vii

Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW


Şekil 4.15 Cladosporium obtectum total protein miktarı ................................................ 48

Şekil 4.16 a. Cylindrocladium floridanum’un katı besiyerinde görüntüsü b.

Cylindrocladium floridanum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c.

Cylindrocladium floridanum’un SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein

bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri ......... 49

Şekil 4.17 Cylindrocladium floridanum total protein miktarı ......................................... 50

Şekil 4.18 a. Penicillium chrysogenum’un katı besiyerinde görüntüsü b. Penicillium

chrysogenum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Penicillium chrysogenum’dan

SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log

MW değerlerine karşı, Rf değeri ...................................................................... 51

Şekil 4.19 Penicillium chrysogenum total protein miktarı .............................................. 52

Şekil 5.1 Çalışmada kullanılan örneklerin özütleme işlemi sonucu total protein

miktarları ........................................................................................................... 62

viii

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 2.1 Türkiye’de Durham aleti ile yapılan aerofungus araştırmaları ...................... 5

Çizelge 2.2 Türkiye’de kültür besi yeri açma yöntemi ile yapılan çalışmalar .................. 6

Çizelge 2.3 Türkiye’de volümetrik (Burkard, Lanzoni aleti) yöntemle yapılan

aerofungus çalışmaları.................................................................................... 7

Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan örnekler ..................................................................... 23

Çizelge 3.2 Jel hazırlamak için gerekli çözelti miktarları ............................................... 30

1

1. GİRİŞ

Bitkiler aleminin ‘Mycota’ bölümünde iki alt bölüm (Myxomycotina ve Eumycotina)

halinde incelenen mantarlar, daha sonraları ‘Protista’ aleminin bir bölümü (divisio)

olarak kabul edilmiştir. Günümüzde ise ayrı bir alem ‘Fungi’ olarak ele alınmaktadır.

(Alexopoulos ve Mims 1979).

Funguslar özellikle nemli yerleri sevmelerine rağmen, değişik habitat ve substratlarda

gelişebilme özelliklerinden dolayı dünyanın birçok yerinde havada, karada, suda,

bitkide, hayvanların ve insanların üzerinde rastlayabiliriz. Fungusların bazıları

mikroskobik bazıları ise makroskobik canlılardır (Ökten ve Asan 2009).

Yaklaşık 1,5 milyon fungus türü olduğu tahmin edilse de 80 bin kadar türü

tanımlanmıştır. Bunlardan 15.000 – 20.000 makrofungus, 60.000 – 65.000 ise

mikrofungus’dur. Yeryüzündeki 80 bin fungusdan 112 fungusun alerjik reaksiyona

neden olduğu saptanmış olup, bunlardan da 50 fungusa atmosfer çalışmalarda daha fazla

rastlanmıştır (Acremonium, Agrocybe, Alternaria, Ascobolus, Aspergillus, Boletus,

Botrytis, Cercospora, Chaetomium, Cladosporium, Coprinus, Curvularia,

Cylindrocladium, Dictyosporium, Didymella, Drechslera, Epicoccum, Exosporium,

Fusarium, Ganoderma, Helminthosporium, Leptosphaeria, Melanomma, Melanospora,

Monilia, Mucor, Mycelia, Myrothecium, Nigrospora, Oidium, Paraphaeosphaeria,

Penicillium, Periconia, Peronospora, Pithomyces, Pleospora, Puccinia, Rhizopus,

Rhodotorula, Scopulariopsis, Sporormiella, Stemphylium, Tetracoccosporium, Torula,

Trichoderma, Ulocladium, Ustilago, Venturia ve Xylaria).

Bu funguslardan Türkiye’de Adana atmosferinde 34, Samsun 29, Kastamonu ve Ankara

atmosferinde 35’i saptanmıştır (Agrocybe, Alternaria, Ascobolus, Boletus, Botrytis,

Chaetomium, Cladosporium, Coprinus, Curvularia, Dictyosporium, Didymella,

Drechslera, Epicoccum, Exosporium, Fusarium, Ganoderma, Leptosphaeria,

Melanomma, Melanospora, Nigrospora, Oidium, Paraphaeosphaeria, Periconia,

Peronospora, Pithomyces, Pleospora, Puccinia, Sporormiella, Stemphylium,

2

Tetracoccosporium, Torula, Ustilago, Venturia, Xylaria, 1-septalı askospor) (Çeter vd.

2004, Çeter vd. 2006, Erkan vd. 2006, Çeter vd. 2008,).

Genellikle toprakta yaşayan funguslar çeşitli çevresel faktörlerin etkisiyle atmosfere

dağılabilir ve havayla taşınabilirler ve üremeyi garanti altına almak için çok miktarda

sporu atmosfere verirler. Örneğin Ganoderma applanatum (Persoon) Patouillard, bir

günde 30 milyar, Daldinia concentrica(Balt. ex Fr.) Ces. et De Not. günde 100 milyon,

Tilletia caries (De Candolle) Tulasne 12 milyon, Penicillium Link ise 400 milyon spor

üretebilmektedir (Smith 2000). Bu sporların solunması kronik bronşit, astım, fungal

alerjiler, aşırı duyarlı pnömoni ve Aspergillosis gibi çeşitli hastalıklara neden olabilir

(Sen 2001, Sakiyan 2003, Bavbek 2006, İnal vd. 2008, Başbülbül 2011).

Fungusların atmosferdeki yoğunlukları meteorolojik şartlara bağlı olarak da

değişmektedir. Sayıları yaklaşık m3’de 20.000- 2 milyon arasında bulunan mikroskobik

mantar sporları, birçok bireydeki astım ve alerjik rahatsızlıkların başta gelen

nedenlerindendir. Atmosferdeki spor miktarı, semptom şiddeti ile ilişkilidir. Funguslara

bağlı alerjik solunum hastalıkların prevalansı, genel populasyonlarda %6, atopik

kişilerde ise %20-30 olduğu düşünülmektedir (Wuethrich 1989).

Adana ilinde ise solunum alerjisi gösteren çocukların %11,6’da funguslara duyarlılık

saptanmıştır (İnal 2008). Avrupa ülkelerinde Cladosporium ve Alternaria duyarlılığının

%3-30 olduğu saptanmıştır. Ankara ilinde Cladosporium ve Alternaria’ya duyarlılık

erişkinlerde %14,8’dır (Bavbek 2006).

Ülkemizde henüz mikrofungusların protein profilleri ile ilgili bir çalışma

bulunmamaktadır. Buna karşın yurt dışında birçok mikrofungusun protein profilleri

çıkartılmış ve duyarlı kişilerde alerjik reaksiyonlara neden olan bantlar belirlenmiştir.

Ülkemizdeki bu eksikliği gidermek üzere atmosferde rastladığımız, Acremonium kliense

Grütz, Alternaria alternata Keisler, Aspergillus flavipes (Bainier & R. Sartory) Thom &

Church, Aspergillus niger Van. Tighem, Aspergillus oryzae (Ahlb.) E. Cohn,

Cladosporium herbarum (Pers) Link ex Gray, Cladosporium obtectum Rabenh,

Cylindrocladium floridanum Sobers&Seymour 1967, Penicillium chrysogenum Thom,

türleri bu tezde çalışılmıştır. Elde edilen veriler yapılan çalışmalarla karşılaştırılarak

3

benzer ve ortak bantlar belirlenmiştir. Bu tez ile aynı zamanda çalışılacak türlerde

bulunabilecek muhtemel yeni alerjenlerin belirlenmesi için gerekli olan ön verilerin

sağlanacağı düşünülmektedir.

Ayrıca funguslar her yıl tarımsal ürünlerde milyonlarca dolarlık zarara neden

olmaktadır. Bu organizmaların neden olduğu hastalıkların kontrolü için, fungal türlerin

teşhisi ve karakterizasyonu gereklidir. Fungusların morfolojik karakterlerine göre

yapılan sınıflandırmalar, moleküler sistematikle belirlenen filogenetik ilişkilerle birlikte

yeniden değerlendirilmeye başlamıştır. Taksonlar arasında morfolojik karakterlerin

birbirine anlamlı olmayan benzerliği, indirgenmiş olabileceği ya da taksonlar arasında

ortadan kalkmış olduğu durumlarda, filogenetik analiz için moleküler karakterlerin

kullanımı önem kazanmaktadır (Blackwell vd. 2007). Fungi alemi içindeki grupların

belirlenmesi ve sınıflandırılma çabaları oldukça eski olmakla birlikte, 2004 yılında

başlatılan ve şu anda da devam eden AFTOL (Assembling the Fungal Tree of Life) adı

verilen ortak bir çalışma ile (yeni moleküler filogenetik yöntemler kullanılarak)

fungusların tüm gruplarının en yüksek seviyede moleküler (filogenetik)

sınıflandırılması hedeflenmiştir. Bu çalışmada toplam 195 taksonu içeren bir fungus

grubuyla çalışılmış ve sonuçda 7 filum [Chytridiomycota, Neocallimastigomycota,

Blastocladiomycota, Microsporidia, Glomeromycota, Dikarya: (Ascomycota,

Basidiomycota)] 10 subfilum, 35 sınıf, 129 ordo şeklinde bir sınıflandırma elde

edilmiştir (Hibbett vd. 2007, Kılıçoğlu ve Özkoç 2008).

Birçok fungus türünün sporlarının veya hiflerinin kendi aralarında birbirlerine

benzemesi akla, akrabalık ilişkilerini getirmektedir. Bu tezde protein bantlarından elde

edilen verilere göre istatistiksel analiz yapılmış ve protein profilleri çıkarılan

fungusların birbirleri ile biyokimyasal özellikleri bakımından akrabalık ilişkileri de

araştırılmıştır.

2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ARAŞTIRMALARI

2.1 Kaynak Araştırmaları

2.1.1 Türkiyede yapılan atmosferik fungus çalışmaları

Ülkemizde atmosferdeki mantar sporlarını belirlemeye yönelik farklı yöntemlerle

yapılmış birçok atmosferik çalışma mevcuttur. Çalışmalarda, gravimetrik ve volümetrik

yöntemler kullanılmıştır. Gravimetrik yöntemde, kültür besiyeri (petri) açma ve Durham

aleti ile ölçüm olmak üzere 2 yöntemden faydalanılırken, volümetrik yöntemde Burkard

veya Lanzoni aletleri kullanılmıştır (Şekil 2.

a.

Şekil 2.1 Aerofungus çalışmalarında kullanılan tuzaklar

a. Kültür besiyeri (petri) açma yöntemi,

Aksaray, Antalya, Burdur, Bursa, Çankırı, Düzce, Eskişehir, Karabük, Sivas

Zonguldak ve Trabzon

aleti ile yapılan çalışmalarda

dominant olarak görülmüştür (Çizelge 2.1 ). Ankara, Çorum

İstanbul, İzmir, Manisa, Samsun ve Trabzon

çalışmalarda, genel olarak

Alternaria, Mycelia

(Çizelge 2.2). Adana, Ankara,

4

KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ARAŞTIRMALARI

Kaynak Araştırmaları

Türkiyede yapılan atmosferik fungus çalışmaları


birçok atmosferik çalışma mevcuttur. Çalışmalarda, gravimetrik ve volümetrik



letleri kullanılmıştır (Şekil 2.1).

b.

Aerofungus çalışmalarında kullanılan tuzaklar

. Kültür besiyeri (petri) açma yöntemi, b. Durham aleti, c. Burkard aleti

Aksaray, Antalya, Burdur, Bursa, Çankırı, Düzce, Eskişehir, Karabük, Sivas

ve Trabzon illerinde gravimetrik yöntemin uygulama aracı olan Durham

aleti ile yapılan çalışmalarda Cladosporium, Alternaria ve Ustilago

örülmüştür (Çizelge 2.1 ). Ankara, Çorum, Edirne, Eskişehir, Isparta,

İstanbul, İzmir, Manisa, Samsun ve Trabzon gibi illerde petri açma yöntemi ile yap

çalışmalarda, genel olarak Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Fusarium,

Mycelia ve Scrohulariopsis cinsleri dominant olarak tespit edilmiştir

(Çizelge 2.2). Adana, Ankara, Bursa, Diyarbakır, Kastamonu ve Samsun illerinde

KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ARAŞTIRMALARI


birçok atmosferik çalışma mevcuttur. Çalışmalarda, gravimetrik ve volümetrik



c.

Aksaray, Antalya, Burdur, Bursa, Çankırı, Düzce, Eskişehir, Karabük, Sivas,

illerinde gravimetrik yöntemin uygulama aracı olan Durham

Ustilago cinsi sporları

Edirne, Eskişehir, Isparta,

gibi illerde petri açma yöntemi ile yapılan

Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Fusarium, Rhizopus,

cinsleri dominant olarak tespit edilmiştir

Kastamonu ve Samsun illerinde

5

volümetrik yöntemle atmosferdeki spor konsantrasyonları çalışılmış, Cladosporium,

Alternaria, Leptosphaeria, Periconia, Ustilago, Fusarium, Exosporium ve Epicoccum

cinsi sporlarına dominant olarak rastlanmıştır (Çizelge 2.3) (Şekil 2-2).

Şekil 2.2 Türkiye'de yapılan aerofungus çalışmalarında kullanılan yöntemlerin illere göre dağılımı

Çizelge 2.1 Türkiye’de Durham aleti ile yapılan aerofungus araştırmaları

Şehir Araştırıcılar Fungus sayısı

Atmosferde sporları dominant olarak tespit edilen fungus

cinsleri

AKSARAY Pehlivan ve Koç 2000 1 Alternaria

ANTALYA İnce ve Pehlivan 1991 (Serik) 1 Alternaria

BURDUR Tatlıdil vd. 2001 2 Cladosporium, Alternaria

BURSA Bıçakçı vd. 1999 (İnegöl İlçesi); Tatlıdil vd., 2000 (İznik); Bıçakçı vd. 2001 (Kemalpaşa)

2 Cladosporium, Alternaria

ÇANKIRI Altın vd. 1998 2 Cladosporium, Alternaria

DÜZCE Serbes ve Kaplan 2008 5 Alternaria, Ustilago, Cladosporium

ESKİŞEHİR Asan vd. 2004 (Merkez); Erkara vd. 2008 (Sivrihisar)


KARABÜK Özdoğan ve Kaplan 2008 5 Alternaria, Cladosporium, Ustilago

SİVAS Pehlivan ve Özler 1999 1 Alternaria

ZONGULDAK Alan ve Kaplan 2004 2 Cladosporium, Alternaria

TRABZON Ayvaz vd. 2008 2 Cladosporium, Alternaria

6

Çizelge 2.2 Türkiye’de kültür besi yeri açma yöntemi ile yapılan çalışmalar


Atmosferde sporları dominant olarak tespit edilen fungus

cinsleri

ANKARA

Özkaragöz 1969a, b 14 Alternaria, Aspergillus,

Penicillium, Monilia, Mycelia,

Hormondendrum

Okuyanvd. 1976 20 Penicillium, Aspergillus, Mucor,

Oospora, Nigrospora, Fusarium,

Alternaria

ÇORUM İmalı vd. 2008

10 Aspergillus, Alternaria,

Cladosporium, Monilia,

Penicillium, Rhizopus,

Scolecobasidium, Stachybotrys,

Torula, Ulocladium

EDİRNE

Asanvd.2002 37 Aspergillus, Penicillium, Alternaria

Öktenvd.2005 7 Cladosporium, Alternaria,

Penicillium, Trichoderma,

Fusarium, Rhizopus

ESKİŞEHİR Asanvd.2004 12 Mycelia, Alternaria,

Cladosporium, Penicillium,

Scopulariopsis

ISPARTA Şimşekli vd. 2007 25 Cladosporium, Alternaria,

Mycelia, Penicillium, Aspergillus

İSTANBUL

Çolakoğlu 1996 (Anadolu yakası)

17 Cladosporium, Alternaria,

Epicoccum, Botrytis,

Leptosphaeria

Asan vd.2002 (Terkos gölü)

9 Scopulariopsis, Penicillium,

Cladosporium, Sphaerospermum,

Aspergillus

Çolakoğlu 2003 (Belgrad ormanı)

13 Aspergillus, Penicillium,

Cladosporium, Rhizopus,

Trichoderma

Çolakoğlu 1996 (Avrupa yakası)

18 Penicillium, Aspergillus,

Cladosporium, Alternaria,

Rhizopus, Fusarium

İZMİR Ayata vd. 1989 13 Cladosporium, Alternaria,

Mycelia, Penicillium, Phoma,

Aspergilus

MANİSA Kalyoncu 2008 21 Cladosporium, Aspergillus,

Alternaria

SAMSUN Ulutan vd. 1991 (Çarşamba)

12 Penicillium, Alternaria,

Scopulariopsis, Fusarium

TRABZON Topbaş vd. 2006 11 Penicillium, Alternaria, Fusarium,

Aspergillus, Cladosporium

7

Çizelge 2.3 Türkiye’de volümetrik (Burkard, Lanzoni aleti) yöntemle yapılan aerofungus çalışmaları (Çeter ve Pınar 2009 b).


Atmosferde sporları dominant olarak tespit edilen fungus cinsleri

ADANA

Beyoğlu vd. 2006 (1997-1998)


Çeter vd. 2006

35

Cladosporium,

Alternaria, Epicoccum,

Exosporium, Drechslera,

Periconia

ANKARA

Şakıyan ve İnceoğlu 1995 (1990-1991)


Tekin ve İnceoğlu1995 (1991-1992)


Ceylan ve İnceoğlu 1996 (1993-1994)


Pınar ve Koçak 2000 (1998-1999)

1 Alternaria

Karakuş vd. 2005 (1999-2000)


Ekiz vd. 2005 (2000-2001)


Koçak ve Pınar 2003 (2001-2002)


Çeter ve Pınar 2004 (2003-2004)

35

Cladosporium,

Alternaria,

Leptosphaeria, Ustilago,

Exosporium, Pleospora

BURSA

Ataygül vd. 2007

10

Cladosporium,

Alternaria,

Aspergillus/Penicillium,

Fusarium, Epicoccum

DİYARBAKIR Bursalı ve Doğan 2007 2 Cladosporium, Alternaria

KASTAMONU

Pınar vd. 2008 Çeter ve Pınar 2008

35

Cladosporium,

Alternaria,

Leptosphaeria,

Periconia, Ustilago

SAMSUN

Erkan vd.2006

35

Cladosporium,

Alternaria,

Leptosphaeria,

Periconia, Ustilago

8

2.1.2 Fungal protein çalışmaları

Mikrofungusların protein profillerinin belirlenmesi amacıyla ülkemizde henüz

kapsamlı bir çalışma yapılmamıştır. Ancak yurt dışında bazı cinslere ait

taksonların protein profillerinin belirlenmesini amaçlayan çalışmalar mevcuttur.

Mikrofungusların protein yapılarının belirlenmesindeki en önemli etken, hem

mikrofungusların moleküler düzeyde çalışılarak morfoloji çalışmalarına sistematik

açıdan yarar sağlanacağı düşüncesi, hem de alerjen bantların ortaya çıkarılarak

astım ve alerji alanındaki uzman hekimlere yardımcı olma düşüncesi ön plana

çıkmıştır.

Bendorf vd. (2008), iç ortam atmosferik mantarı Aspergillus versicolor’un spor

allerjenlerini belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada, spor proteinleri için 2

boyutlu jel elektroforezi ve hasta serumlarından immünoblot yapmış ve 20’den

fazla alerjen tanımlamış ve bunların %90’ından fazlasının hasta serumlarıyla

pozitif etki gösterdiğinin sonucuna varmışlardır.

Li vd. (2008), Alerjenlerin başında gelen Cladosporium cladosporioides’in

immünolojik analizi ve kütle spektrometrisini tanımlamak amacıyla yaptıkları

çalışmada, Cladosporium cladosporioides’i karbonat tampon çözeltisi ile

ekstrakte etmişler. Daha sonra bu ekstrakttan SDS-PAGE yöntemiyle protein

bantlarını belirlemişlerdir. Elde edilen jel görüntüsünde 14 bant olduğu

kaydedilmiş ve bunların en belirginlerinin 72 kD, 61 kD, 42 kD, 36 kD, 35 kD, 34

kD, 24 kD, 22 kD, 18 kD ve 14 kD’luk protein bantları olduğunu belirtmişlerdir.

Al-Suwaini vd. (2001), Riyad atmosferindeki funguslar ve bunların ekstraktlarının

allerjenik tepkilerini araştırdıkları çalışmalarında, örnekleri Riyad atmosferinden

izole etmişlerdir. Atmoferden elde ettikleri mikrofunguslardan Aspergillus,

Alternaria, Cladosporium, Penicillium ve Ulocladium cinslerini ekstrakte etmiş

ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforez analizi sonucunda elde

9

edilen protein bantlarının 13 ile 80 kDa arasında olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca

elde edilen ekstraktlarn sıvı ve liyofilize formları steril edilerek, bronşiyal astımı

ve alerjik riniti olan hastalara deri testi olarak uygulamışlardır. Deri testi

sonucunda hastaların %13’ü bu fungal ekstraktlara pozitif tepki göstermiş, alerjik

duyarlılıklarının olduğunu göstermişlerdir.

El-Kazzaz vd. (2008), moleküler biyoloji teknikleriyle bazı Fusarium

taksonlarının tanımlanması için yaptıkları çalışmada, Fusarium cinsine ait 7

taksonu (F. semitectum, F. culmorum, F. moniliforme, F. solani, F. graminearum,

F. oxysporum f.sp. lycopersici ve F. oxysporum f. sp. vasinfectum) morfolojik ve

patolojik karakterlerine göre tanımlamışlardır. Bu taksonları tanımlamak için

SDS-Page Poliakrilamid jel elektroforez yöntemini uygulamış ve elde ettikleri

protein bantlarının ölçülmesi sonucu elde ettikleri verileri UPGMA kümeleme

(cluster) analizi yapmışlardır. Kümeleme analizi sonucu dendrogramları çıkarılan

Fusarium izolatları arasında %93,8 benzerliğin olduğunu saptamışlardır.

Gupta vd. (2002), önemli bir inhalant alerjen olan Curvularia türlerindeki IgG ve

IgE bağlayan komponentleri araştırmışlardır. 7 farklı Curvularia türünde (C.

lunata, C. andropogonis, C. clavata, C. lunata var. lunata, C. pallescens, C.

geniculata, C. senegalensis), yarı sentetik bir ortamda 13 günde geliştirilen kültür

örneklerinin SDS-PAGE, immunoblat ve ELISA analizlerini yapmışlardır. Farklı

Curvularia türlerindeki 11-19 protein bandı SDS-PAGE yöntemi ile

çıkarmışlardır. Elde edilen proteinlerinin 12, 20, 31, 45, 53, 78 ve 97 kD’luk

özellikle IgE bağlayıcı ajanlar olduklarını saptamışlardır.

2.2 Kuramsal Temeller

2.2.1 Araştırmada kullanılan örneklerin genel özellikleri

2.2.1.1 Acremonium Link ex Fr.

10

Yaklaşık 100 kadar türü olan Acremonium cinsi, genellikle yavaş gelişen ve hoş

olmayan kokusuyla tespit edilebilir. Acremonium cinsi yutulduğunda toksik etki

yapabilir ve ayrıca mantar alerjisi olan bireylerde mide bulantısı, kusma ve ishale neden

olabilir. Tırnak enfeksiyonlarına ve menenjite neden olabilir (Hee vd. 2012,

www.moldunit.com/acremonium.html 2012).

Çürümüş ya da ölü bitkikerde, toprakta, gıdalarda, nem düzeyi yüksek olan iç

ortamlarda üreyebilirler. Saman nezlesi, astım, enfeksiyon ve diğer ciddi hastalıklara

neden olabilen alerjendir. trichothecene denilen mikotoksin üretme potansiyeline

sahiptir. Penisiline çok benzer bir çalışma mekanizması olan “Sefalosporin” denilen

antibiyotik yapmak için kullanılırlar (www.moldunit.com/acremonium.html 2012).

Acremonium kiliense Grütz

Sabouraud dekstroz agar, glucose ve malt extrakt besiyerlerinde yavaş gelişirler.

Kolonileri malt extrakt agar üzerinde 20°C’de 10 günde 1.8-2.3 cm olmakta, pembemsi,

az ya da çok ıslak görünümlü bazen merkezde kümeli, Sabouraud agar ve daha az

olarak MEA üzerinde kahverengi renkte olmaktadır. 12 gün inkübasyondan sonra çok

sayıda şeffaf, kromofil çeperli 4-8 µm çapında klamidosporlar oluşmaktadır. Konidiler

silindirik 3.1-5.8 x 1.0-1.6 µm ölçülerindedir. A. tubaki’ye benzer ancak A. tubaki çok

daha fazla ve genellikle zincirler halinde klamidospor oluşturur ve besiyerinde herhangi

bir kahverengi renk oluşturmaz. A. kiliense, yaygın bir toprak fungusu olup çayırlardan,

tahıl ekili tarlalardan vs. izole edilmiştir (Hasenekoğlu 1991).

Bu fungus türü, saçta kepeklenme, deri ve tırnak enfeksiyonları, eklem ve alerjik

rahatsızlıklara sebep olmaktadır (Pastorino vd. 2005).

11

2.2.1.2 Alternaria Nees ex Fr.

Dış ortam havası fungusların başında gelse de kolay bir şekilde açık olan camdan içeri

girebilir, insan ve hayvan üzerine yapışan sporları sayesinde iç ortama girebilirler.

Alternaria cinsi yaklaşık olarak 50 türden oluşmaktadır ve bunlar çoğunlukla saprofit

veya bitki patojenidirler. Alternaria alternata yaygın olarak bitkilerde, odun, odun

hamuru, tekstil ve besinlerde saprofitik olarak bulunur. Dağılımı kozmopolitandır

(www.aiha.org). A.alternata, Deuteromycetes’in bir üyesi, en önemli alerjenik

mikrofunguslardan birisidir. (Achatz vd., 1995, Yunginger vd.,1980, Bush vd., 1997,

Paris vd.,1991). A. alternata yaprak dış yüzeylerinde gelişir ve havada özellikle de

Temmuz ve Ağustos aylarında bölgeye bağlı olarak pik yapar (metre küpte 500 spora

ulaşabilir). A. alternata’nın alerjenleri duyarlı kişilerde çok düşük dozda bile reaksiyon

verebilir (Gelişken 2008).

Genellikle ekstrinsik astıma neden olur. Akut semptomları ödem ve bronşial spazmı

içerir, kronik hastalarda pulmonarik amfizem gelişebilir Havada ve yaprak yüzeylerinde

bulunan A. alternata AAL toksin üretemez. Fitotoksin alternariol (bitkiler için toksik bir

bileşiktir) ve benzer metabolitler üretir. Ayrıca A. alternata tenuazonic asid ve ürettiği

diğer toksik metabolitleri ile hayvanve insanlarda hastalıklara neden olabilir (Gelişken

2008).

Alternaria sporlarının burun, ağız verespiratör cihazı üstünde birikebileceği ileri

sürülmektedir (www.aiha.org). Kolonileri yaygın, genellikle gri, koyu siyahımsı

kahverengi veya siyah görünümlüdür. Miselyum tamamen batık veya kısmen yüzeysel,

hifler renksiz, zeytinimsi kahverengi veya kahverengidir. Nadiren stroma oluşmaktadır.

Konidiyofor koyu renkli, bölmeli, bazen belirsiz, dallı veya dalsız olduğunda uçta tek

bir por vardır ve bu pordan tek bir konidi oluşmakta veya uçtaki hücrenin pora lateral

pozisyondaki bir bölgesinden uzaması sonucu genikulat olabilmektedir. Yeni oluşan bu

dal uçta bir konidi oluşturacağı gibi, başka bir genikulat uzantının başlangıcı

olabilmekte, konidiyumlar da doğrudan doğruya fonksiyoner konidiyofor

oluşturabilmektedir. Konidiler tek tek oluşabildiği gibi daha sık olarak basit veya dallı

zincirler meydana getirmektedir. Koyu pigmentli (kahverengi tonları, siyahımsı,

kırmızımsı, yeşilimsi ve sarımsı) ovid, distal uca doğru keskin veya yumuşak şekilde

sivrilmekte, düz veya pürüzlü, ovoid şekil genellikle gelişmenin çok erken evrelerinde

12

ve genellikle ilk bölmenin oluşumundan önce belirgin bir şekilde gaga şeklini

almaktadır. Kültürde sporlanan türler kısa sürede sporlanma yeteneklerini kaybederler.

Bu yüzden yulaf agar, mısır unu agar, ve patates-havuç agar gibi doğal besiyerlerinde

üretilmeleri ve UV’ye yakın ışıkta inkübe edilmeleri önerilmektedir (Rao 1965, Özmay

2007).

Alternaria alternata (Fr.) Keissl.

Majör alerjen olan Alternaria alternata kolonisi genellikle siyah veya zeytinimsi siyah,

bazen de gri renklerde olabilir. Konidiyoforlar tek veya küçük gruplar halinde, dallı

veya basit, düz veya kıvrımlı, bazen genikulat soluk veya orta derecede altınsarısı, dış

çeperli 50 µm’a kadar uzunlukta olabilir. 3-6 µm kalınlığında, 1 veya birkaç apikal

por’u vardır. 1-3 bölmelidir. Konidiler genellikle uzun sık dallanan zincirler halinde,

obklavat, obpriform, ovoid veya elipsoidal, genellikle kısa konik veya silindirik bir

gagaya sahip, bazen bu gaga konidinin üçte biri kadar uzun olmakta, konidiler, soluk

veya orta dereceli altın sarısı renginde, düz veya verrükuloz çeperli, 8’e kadar enine, ve

birkaç tane de boyuna veya oblig bölmeli bütün uzunluk 18-63 µm, eni ise 7-18 µm,

gaga soluk renkli 2-5 µm kalınlığındadır (Ellis 1971, Donsch vd. 1980).

Yaygın olarak bulunan Alternaria alternata sporlarına toprak, bitki, gıda ve iç ortam

havalarında rastlanılabilir. Önemli bir alerjen olan A. alternata’nın spor ve misel

parçaları solunduğunda duyarlı kişilerde ciddi hassasiyette astıma neden olabilir, hatta

ölümcül astıma neden olabilir (Kılıç 2008).

Atmosferik çalışmalarda sık karşılaşılan bu tür son derece yaygın bir saprofit olup,

birçok bitki artığı, gıda, toprak, tekstil maddeleri üzerinde bulunmaktadır.

13

2.2.1.3 Aspergillus Mich. ex Fr.

Aspergillus’lar yeryüzünde hemen her yerde yaygın olarak bulunan hifli mantarlardır.

Doğal yaşam ortamları toprak ve çürüyen bitki materyalidir. Doğadaki temel işlevleri

karbon ve azot çevrimiyle ilgilidir. Bu mantarlar ürettikleri enzimler sayesinde tüm

organik maddeleri ayrıştırarak kullanır ve saprofit olarak yaşarlar. Hayvan ve insanlarda

patojen hale geçebilirler. Üreme hız ve kapasiteleri yüksektir. Atmosfere dağılan

konidiumlar havada asılı kalabilir, toz ve diğer parçacıklarla her yere taşınabilirler.

Havada en yüksek yoğunlukta bulunan mantarlardan biridir. Ortam çalışmalarında

insanların solunumla günde en az birkaç yüz konidi aldıkları belirlenmiştir (Chazalet

vd. 1998, Hosphental vd. 1998, Kantarcıoğlu vd. 2003).

Koloniler ekseri hızla gelişirler, renkleri türlere ve gelişme koşullarına bağlı olarak

beyaz, sarı, sarımsı kahverengi, siyaha yakın kahverengi, kırmızı veya yeşiltonlarında

harelidir. Sık konidiyoforların oluşturduğu bir keçe görünümündedir. Besiyerine dağılan

pigment üretebilirler ve bu pigmentin rengi koloninin hava misellikısmının renginden

farklı olabilir. Hifler bölmelidir, ince veya kalın olabilir. Hifhücreleri genellikle çok

çekirdeklidir. Miselyum çeşitli enzimler ve bazı mikotoksinler üretme yeteneğine

sahiptir. Vejetatif hifin “ayak hücresi” denen özelleşmiş bir hücresinden dik olarak

çıkan konidiyofor denen konidiyum taşıyıcı hiflerin ucu şişkinleşmiştir. Yukarı doğru

oluşturdukları yuvarlak veya ovalbiçimdeki baş kısmına “vezikül” adı verilir. Vezikül

üzerindeki üreyebilen bölüm, türlere göre farklıdır ve bu özellik tür tanımında kullanılır.

Konidiyum yapıcı hücreler olan “fiyalidler” ya doğrudan vezikülün üzerinde veya

metulaların üzerinde doğarlar ve altındaki sap hücre ile birlikte konidiyumlu baş denen

tipik görünümüoluştururlar. Konidiyoforun uzunluğu; bölmeli, bölmesiz veya dallanmış

oluşu veduvarının düz, pürtüklü, dikenli olması gibi özellikleri türe göre farklıdır.

Konidiyumlar bir hücreli, duvarları düz veya pürüzlü, dikenli; şeffaf veya pigmentli

olabilirler (Kantarcıoğlu vd. 2003).

Aspergillus türleri doğada geniş bir bölgeye yayılmış olan saprofit mantarlardır ve

Aspergillosis’e (Solunum problemleri, Öksürük, Ateş, Baş Ağrıları, Göğüs ağrısı,

Tükenme ve düşük enerji) neden olabilir ayrıca bağışıklık sistemi zayıf olan kişilerde ve

14

akciğer rahastsızlğı olan kişilerde de zararlı olabilirler. ilgilidirler

(www.moldunit.com/aspergillus-mold.html, 2012). Aspergillus, ascomycetlerin eşeysiz

devresi gibidir. Aspergillus türleri dünyanın her yerinde yaygın olduğu halde ılık

iklimlerde daha yaygındırlar. Bu türler organik materyallerin üzerinde gelişirler. Birçok

türü kozmopolitandır. Kabul edilmiş 182 türü olmasına rağmen sadece 40 tanesi sık sık

tespit edilmiştir. Aspergillus türlerinin bir kaçının oldukça büyük etkileri vardır. A.

flavus güçlü bir karsinojenolan aflotoksinin başlıca üreticisidir. A. fumigatus hızla

yayılan aspergillozis hastalığına neden olduğundan önemlidir. Aspergillus fumigatus’un

küçük konidia demeti genellikle üst solunum yolunda birikmekte, küçük sporlar tek

başına aşağı solunum yollarına ulaşmaktadır (Burge, 1989; Kurup vd., 1993). A.

versicolor, A. fumigatus gibi inşaat malzemelerinin üzerinde yaygın olan birkaç tür, bazı

bölgelerde son baharda havada yaygın olarak bulunurlar (www.aiha.org).

Bu cins kısaca dik konidiyoforları, uçlarında vesikülleri ve vesiküllerin üzerinde bunları

kaplamış sterigmaları ile karakterize edilirler. Sterigmalar bir tabaka üzerinde gelişebilir

veya doğrudan doğruya vesiküllerden çıkabilirler, fiyalidlerden (sterigma) bazipetal

konidi zincirleri olşur. Vejetatif miselyum dallı ve bölmeli hiflerden oluşmuş renksiz,

parlak renkli veya birkaç türde kahverengimsi hale dönüşmektedir. Konidiyoforlar ayak

hücrelerinden gelişmektedir. Ayak hücreleri özelleşmiş, genişlemiş, kalın çeperli hif

hücreleridir. Konidiyoforlar bu hücrelerden dik olarak gelişirler. Aspergillus türleri

ılıman iklimlerde toprakta çok yaygın olarak bulunur.

Ayrıca kompostlarda, çürüyen bitki atıklarında, depolanmış tahıllarda v.s. de bol

miktarda bulunurlar. Koloni özelliklerinden, koloninin rengi, koloni altının rengi,

büyüme hızı, büyüme şekli, bazal miselyum, yüzey miselyumu, konidi başlarının nisbi

bolluğu ve düzenlenmesi, konidi başlarının şekli gibi kriterler önem arzeder (Raper ve

Fennell 1965, Özmay 2007).

15

Aspergillus niger Van. Tighem

Aspergillus niger, organik maddeler üzerinde aerobik koşullar altında gelişen flamentli

bir fungustur. Doğada toprak, çürüyen bitki materyalleri gibi organik yüzeylerden

gelişirler. Substrattan gelişen sporlar atmosfere dağılır ve bu sayede atmosferde de sık

rastlanılır. A. niger geniş bir sıcaklık aralığında gelişebilir (6-47°C) ancak optimum

sıcaklığı 35-37 °C gibi yüksek bir değerdir. Büyümeyi sınırlayan su aktivitesi diğer

Aspergillus türleri ile karşılaştırıldığında yüksek bir değerdir. (0,88). Ayrıca A. niger

1,4-9,8 gibi geniş bir pH aralığında gelişebilir. Bu özellikler ve hava ile dağılan

konidiosporların verimli üretimi bu türün sıcak ve nemli bölgelerde daha sı ve geniş bir

yayılım göstermesini sağlar (Schuster vd. 2002).

Aspergillus niger kolonileri Czapek agar besiyerinde yavaş gelişmekte ve 10 gün-2

haftada oda sıcaklığında 2,5-3 cm olmaktadır. Oldukça gevşek-kompakt beyaz-hafif sarı

bazal miselyum ve bol miktarda dik ve genellikle yığınlar halinde toplanmış konidi

yapıları bulunmaktadır. Tipik olarak karbon siyahına yakın siyah renkte veya bazen

koyu kahverengimsi siyah renkte, koloni yüzeyini dar bir kenar hariç tamamen

kaplamakta ve koloni altı genellikle renksizdir. Bazen merkezde soluk sarı, konidi

başları tipik olarak büyük ve siyah, özce globoz, daha sonra radiyat veya yaşlandığında

iki veya daha fazla gevşek iyi belirlenmiş sütun halinde yarılmaktadır.

Ayrıca A. niger Otomikoz (Kulakta görülen mantar enfeksiyonu), denen daha çok

tropikal ve subtropikal bölgelerde görülen kronik bir mantar enfeksiyonuna neden

olabilir (Ayberkin 2009).

Aspergillus flavipes Thom ve Church

Czapek agar besiyerinde koloniler oldukça yavaş gelişmektedir. 10 gün- haftada oda

sıcaklığında 3-5 cm olmaktadır. Nispeten derin bazal misellerden ve havai hiflerden bol

miktarda sporlanma olmaktadır. Deve tüyü- soluk fındık renginde, koloni yüzeyi beyaz

konidi başları veya ırklarında kahverengi konidiyoforların renginde, bazı ırklarda

özellikle yeni izole edilmiş olanlarda sıkı yünümsü sarı- portakal renkli hif kitleleri, çok

16

sayıda dallanma göstererek iç içe girmiş şekilde gelişmekte, kalın çeperli uzamış hif

elementlerinden ibarettir. Koloni altı genellikle sarı- kahverengi- kırmızı- kahverengi

tonlarındadır. Bazende oldukça koyu renkli, konidi başları gevşek şekilde kolumnar.

Bazı ırklarda kısa, bazı ırklarda ise radiyat olma eğilimi göstermektedir. Devamlı olarak

beyaz veya çok soluk deve tüyü renginde, sarı-kahverengi konidiyoforlar ile kontrast

oluşturmaktadır. 150-180 x 50-80 µm ölçülerindedir. Havai hiflerden gelişenler daha

incei konidiyoforlar genellikle 500-800 x 5.5-8.0 µm ölçülerinde, bazen daha küçük,

ancak yaşlı kolonilerin kenarlarında gelişenler 2-3 mm uzunlukta, çeper nisbeten kalın

1.0-1.5 µm, mikroskop altında sarı- açık kahverengi renkte, renkler daha çok çeperin dış

tabakasında toplanmıştır. Bunun dışında çeper düz veya hafif granüllü, vesiküller

subgloboz-vertikal olarak uzamış, genellikle açık renklidir. Büyük başlarda 18-25 µm

çapında, globoza çok yakın küçük başlarda ise konidiyoforların genellikle iki katı kadar

çapta, sterigma iki seridir. Bazı ırklarda renksizdir. Diğerlerinde hafif renklidir. Küçük

başlarda vesikülün üst kısmından gelişmektedir. Büyük başlarda ise vesikülü

kaplamaktadır. Birinci seri sterigma 5.5-7.5 x 2.5- 4.5 µm. İkinci seri ise 5-7 x 2.0-3.0

µm ölçülerindedir. Konidiler globoz-subgloboz, 2-3 µm çapındadır. Düz çeperli, renksiz

veya renksiz gibi hülle hücreleri geliştiğinde şişmiş ve genellikle düzensiz dallı hif

elementleri veya daha büyük ve kalın çeperli uzamış hücreler şeklindedir.

Askoma (kleisotesyumlar) sadece birkaç izolatta görülmektedir. Üç hafta içersinde hif

kitlelerinin arasından gelişmektedir. Çeper birkaç tabaka sarı ve ince çeperli hiflerden

oluşmuş, askuslar genellikle 4 sporlu, askosporlar subgloboz, belirsiz bir ekvator

olukları vardır. Düz çeperli şeffaf – soluk sarı, 6.4- 8.0 x 5.6-6.4 µm ölçülerindedir.

Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn

Czapek agar besiyerinde koloniler hızlı gelişmekte ve 10 günde oda sıcaklığında 5-6 cm

olmaktadır. Vejetatif miseller çoğunlukla batık ancak tipik olarak derin gevşek yapılı,

uzun saplı konidi yapıları yüzeyden gelişmekte önce beyaz, birçok ırkta soluk yeşilimsi

sarı, zeytin yeşili deve tüyüne yakın, zeytin yeşili-sarı veya sarımsı limon renkli, diğer

ırklarda sarımsı limon sarısına yakın-donuk limon sarısı, bazı ırklarda ise biraz yeşil

17

renk göstermekte ve hızla koyu zeytin yeşili-deve tüyü haline dönüşmektedir. Daha

sonra tipik olarak açık-donuk kahverengi tonlarına kaymakta, koloni altı renksiz, konidi

divergent veya gevşek şekilde yapışık konidi zincirlerinden oluşmaktadır. Nadiren

gerçek sütunlar oluşmakta, konidiyoforlar genellikle batık misellerden gelişmekte,

renksiz, tipik olarak uzun ve 4-5 mm, bazı ırklarda 2-5 mm’yi nadiren geçmekte,

tabandan itibaren 4-6 µ kalınlıktan yukarıya doğru genişleyerek vesikülün altında 12-25

µm olmaktadır. Çeper nispeten ince bazı ırklarda bütün çeper boyunca veya büyük bir

çoğunluğunda belirgin şekilde pürüzlü, diğer ırklarda hemen tamamen düz, sadece

terminal bölgede pürüzlük izleri farkedilmekte, vesiküller tipik olarak globoz, daha az

olarak şişe şeklinde, sterigmalar bütün yüzeyini veya üstten ¾ kısmını kaplamış,

genellikle ince çeperli ve kolayca deforme olmakta, 40-50 µm veya bazı ırklarda 60-75

µm çapında (uzun saplar üzerinde büyük başlarda), sterigma değişken, genellikle bir

seri, 12-15 x 3-5 µm ölçülerinde veya iki seri, birinci seri 8-12 x 4-5 µm, ikinci seri 8-10

x 3-3.5 µm ölçülerinde, her iki durum aynı ırkta ve hatta aynı konidi başında

görülmekte. Yaşlı yapılarda sterigmalar homojen şekilde şişmemiş, konidiler az veya

çok priform veya eliptikal, ve bazı ırklarda böyle kalmakta, diğer bazı ırklarda ise

olgunlaştığında genellikle subgloboz veya globoz olmakta, farklı ırklarda büyüklükleri

değişmekte, genellikle globoz veya subgloboz olduğunda 4.5 – 7.0 µm, eliptikal

olduğunda 8.0 bazen de 10.0 µm uzun eksenli, bazı ırklarda düz çeperli, diğerlerinde ise

az veya çok pürüzlü, gençken genellikle daha fazla ekinulat, genellikle yeşilimsi-

kahverengimsi sarı tonlarında, çok nadir olarak sklerosyum gelişmektedir.

2.2.1.4 Cladosporium Link ex Fries: Link

Cladosporium’ların çoğu saprofit veya bitki patojeni olan yaklaşık olarak 500 türden

oluşan bir cinstir. Bunların sadece 20 tanesi yaygındır. Cladosporium

sphaerosphermum, C. cladosporoioides ve C. herbarum en yaygın türlerdir. Hepsi

bitkiler, odun, odun tozu ve besinler üzerinde bulunur. Üç tür içinde C.

sphaerosphermum türü özellikle inşaat malzemeleri üzerinde bulunur. Diğer ikisi

yaprak yüzeylerinde bulunurlar. Haziran, Temmuz veya Ağustos aylarında pik yaparak

havada yüksek düzeylerde bulunurlar (metre küpte 10.000 spora ulaşabilirler)

18

(www.aiha.org). Koloniler oldukça yavaş gelişmektedir. Genellikle yeşilimsi-

kahverengi, siyahımsı-kahverengi, bol miktarda konidi geliştiğinde tozlu bir görünüm

almaktadır. Vejetatif hifler, konidiyoforlar ve konidiler aynı şekilde pigmentli,

konidiyoforlar vejetatif hiflerden az veya çok farklı, dik, düz veya dalgalı, dalsız veya

apikal olarak dallı, çok sayıda dallanmış konidi zinciri oluşturmaktadır. En alttaki

konidi en büyük ve bölmeli olup ramokonidi adını almakta, üstteki konidiler ise tek

hücreli, elipsoidal veya fusiform, konidiyoforlar ucunda bulunan 1-3 sayıda geniş

şekilde konik dentiküller üzerinde veya subapikal olarak bir bölmenin altından veya

daha önce gelişmiş konidilerin uçlarından Blastokonidiler gelişmekte, blastokonidiler

bir bölme ile ayrılmakta, bölme kalın çeperli ve koyu renkli, konakçı bitkilerde ve

invitro olaraközellikle amonyum sülfat bulunan besiyerlerinde stomatik yapılar

oluşmaktadır (Ellis 1971, Domsch ve ark, 1980, Von Arx, 1981, Barron 1983,). Dik,

pigmentli, ağaç benzeri blastospor zincirlerden oluşmuş dalları olan konidiyoforlar bu

cins için karakteristik bir özelliktir. Cinsin tanımı genellikle sadece konidiler ile

yapılabilir. Konidilerinde çok belirgin bağlantı kalıntıları görülmektedir (konidi

çıkıntıları), konidiler büyüklük ve bölmemelilik bakımından önemli değişim gösterir

Organik atıklar üzerinde yaygın olan bir cinstir. Aynı zamanda birçok konakçı üzerinde

yaşayan parazit birçok türü vardır (Barron 1983, Özmay 2007).

C. herbarum çok farklı antijen üretebilir ve yaklaşık olarak toplumun %10’u

Cladosporium’a duyarlıdır. Yaprak yüzeylerinde bulunan Cladosporium türleri

materyal toksisitesi gösteren metabolit üretimi yapmaz (www.aiha.org).

Cladosporium herbarum (Pers.) Link ex S.F. Gray

Bitki patojeni olan C. herbarum, toprakta çürümüş bitkiler üzerinde gelişebilirler. Tabii

ortamlarda ve kültürlerde koloniler yaygın, zeytin yeşili veya zeytinimsi kahverengi

renklerinde bulunur. Velvet, koloni altı malt ağar besiyerinde yeşilimsi siyah, stroma

bazen özellikle otsu gövdelerde iyi gelişmekte, konidiyoforlar düz veya dalgalı, bazen

genikulat, çoğunlukla nodoz, soluk-orta zeytinimsi kahverengi veya kahverengi düz

çeperli, 250 mikrona kadar uzunlukta, 3-6 mikron kalınlıkta, terminal veya interkalar

şişkinlikler varsa 7-9 mikron çapındadır. Konidiler oldukça uzun, genellikle dallanmış

19

zincirler halinde, elipsoidal veya oblong, uçlarda yuvarlak soluk- orta kahverengi veya

zeytinimsi kahverengi oldukça kalın çeperli, belirgin şekilde verrukuloz, uzun olmayan

siğilli, tamamiyle 0-1 bölmeli, bazen daha fazla bölmekler de oluşabilmektedir. 5-23x

3-8 (çoğunlukla 8-15x4-6) mikron bir ucunda veya iki ucunda çıkıntılı, çıkıntılar küçük

fakat açık şekilde dışarıya çıkmış, çok kozmopolit bir türdür. Özellikle ılıman zonlarda

yaygın, otsu ve odunsu bitkiler üzerinde, havadan, topraktan gıda maddelerinden tekstil

maddelerinden vs. izole edilmektedir (Ellis 1971).

Cladosporium herbarum ve Alternaria alternata türleri alerjiye neden olan

mikrofungusların başında gelmektedir. Şimdiye kadar tespit edilmiş alerjenlerin büyük

bir kısmı C. herbarum’un hücre içi proteinleridir (Breitenbach 2002).

Cladosporium obtectum Rabenh

Koloniler yaprakların altında, yaygın, soluk zeytinimsi kahverengi, ince, konidiyoforlar

dalgalı, genellikle dallı, çok soluk veya orta soluk kahverengi, düz çeperli, çok sayıda

belirgin ve koyu renkli çıkıntılı, 50 µm’a kadar uzunluktadır. Ancak genellikle daha

kısa, 3-7 µm kalınlıkta, konidiler zincir şeklinde, elipsoidal veya silindirik, 0-5 bölmeli,

soluk-orta kahverengi, düz veya verrukuloz, 8-34 x 5-8 µm, artemisia maritima

yaprakları üzerindedir (Ellis 1976).

2.2.1.5 Penicillium Link ex Gray

Penicillium, Ascomyceteslerin eşeysiz devresini gösterir ve Penicillium türleri dünyanın

her yerine dağılmış olduğu halde ılıman iklimlerde dahayaygındırlar. Bu türler organik

materyallerin üzerinde gelişirler. Doğada; hava, toprak ve bitkilerde yaygın şekilde

bulunduğu gözlenmiştir (Erbakan,1994). Birçok türü kozmopolitandır. Kabul edilen 225

türü var iken sadece 70’ine sık rastlanmıştır. Penicillium türlerinden bazılarının

ekonomik önemi vardır (www.aiha.org).

20

Katı besiyerinde hızlı ürerler. Çoğunlukla koloni yüzeyleri önceleri beyaz sonradan

mavi-yeşil ve tümü pudramsı bir görünüm alır. Kolonilerin tabanları genellikle

beyazdır. Septalı hifler, dallanan ve dallanmayan konidiyoforlar ve konidiyoforlarda

metula adı verilen ikinci dallanmalar görülür. Konidiyumların oluşturduğu ve dallanma

göstermeyen diziler veya zincirler bulunur. Tüm bu yapı ‘Penicillium’ veya fırça

görünümündedir (Erbakan 1994, www.aiha.org).

Hifler bölmeli, dar, genellikle 2-3 µm eninde, renksiz veya parlak renkli, düzensiz

dallanmakta ve yoğun ve kompakt miselyum oluşturmaktadır. Koloni kenarı genellikle

çok belirgin, konidiyoforlar farklılaşmamış yüzey altı veya havai hiflerden gelişmekte,

saplar nispeten dar ve ince çeperli, genellikle 1-2 bölmeli, bazı türlerde apikal olarak

şişkin, ancak vesiküller daima 10 µm’dan küçük çapta, karakteristik şekilde penisillat

dallanmış ve ‘penisillus’ denilen yapılar gelişmektedir. Bunlar genellikle terminal ve

doğrudan saplar üzerinde gelişmekte veya bir, iki ve daha fazla metula üzerinde

gelişmekte, fiyalidler terminal ve komptakt vertisiller halinde, nispeten kısa, nadiren 15

µm’ u geçmekte, ampuliform, çok nadir olarak silindiroidal, düz çeperli, uç kısmı

genellikle 3 µm’dan kısa ve daima düz, konidiler bazipetal olarak gelişmekte, genellikle

uzun zincirler halinde, tek hücreli, çok küçük, genellikle 2-4 µm çapında, nadiren 6

µm’u geçmekte, küresel, elipsoidal, priform veya apikulat, nadiren silindiroidal, kitle

halinde gri-yeşil, gri-mavi veya gri, nadir olarak zeytin veya kahverengidir (Pitt 1979,

Hasenekoğlu 1991).

Penicillium chrysogenum Thom

Eskiden Penicillium notatum bilinen Penicillium chrysogenum kolonileri tipik olarak

velvet az veya çok saplı sıkı yapıdadırlar. Konidiyoforlar substrattan bir ekin şeklinde

gelişmektedir. Bazı ırklarda koloniler az veya çok früktoz, bunlarda konidiyoforlar

havai hiflerden gelişmektedir. Genellikle radiyat şeklinde oluklu, eksudat genellkile bol

miktarda oluşur. Parlak sarı damlalar halinde, koloni altı gelellikle eksudatla aynı renkte

parlak sarı renkte, yaşlandığında ise kahverengiye döner. Yüksek su koşulları olan

ortamlarda iyi yetişir (Hasenekoğlu 1991, Ward vd. 2010).

21

2.2.1.6 Cylindrocladium Morgan

Vejetatif miselyum yünümsü, önce beyaz, yaşlandığında kahverengi olmaktadır. koloni

hızlı yayılmakta ve merkezde açık-koyu kahverengi, zincirler halinde çok sayıda

klamidospor ve mikrosklerezyum kümeleri oluşmaktadır. konidiyoforlar iyi gelişmiş ve

farklılaşmış dik veya die yakın, uç kısmına yakın defalarca dallanmakta ve penisillat bir

şekil oluşturmaktadır. konidiyoforların ekseni genellikle uzamakta ve ucu şişmiş bir

uzantı oluşturmakta, konidiler silindirik çok bölmeli, palizat benzeri bir küme

oluşmakta ve mukusla bir arada tutulmakta, simetrik olarak yuvarlak veya hemen

hemen tamamen turunkat uçları vardır (Hasenekoğlu 1991).

Cylindrocladium türlerinin büyük çoğunluğu bitki paraziti olup özellikle ılıman kuşakta

yaygındır.

Cylindrocladium floridanum Sobers ve Seymour

Konidiyofor dalları bir saptan lateral olarak gelişmektedir. primer ve sekonder dallar

bölmesiz veya bir bölmelidir. 10,2-26,0 µm uzunluğunda, tersiyer dallar bölmesiz, 7,8-

10,2 µm, fiyalidler şeffaf, 7,8-15,6 µm, konidiler şeffaf, silindirik, bir bölmeli, 36,4 –

57,2 x 2,6-4,6 µmsteril flamentlerin ucunda, globoz bir vezikül vardır. Ekseri izolatlarda

sekonder steril flamentler bulunmaktadır.

Dünyada tropik ve subtropik bölgelerde yaygın olmakla beraber, birçok bitki

çeşitlerinde patojendir.

22

3. MATERYAL VE YÖNTEM

Çalışmada 6 farklı mikrofungus cinsine ait 9 farklı tür kullanılmıştır. Kullanılan

mikrofungus örnekleri, daha önceden atmosferik ve toprak mikrofungus florası

çalışmalarında elde edilerek teşhis edilmiş ve kültüre alınmış örnekler içerisinden,

atmosferde sık rastlanan taksonlar arasından seçilmiştir.

Çalışma 6 aşamada gerçekleşmiştir.

1. Mikrofungusların üremesi için uygun besiyerlerinin hazırlanması.

2. Özütlenecek mikrofungusların üretilmesi.

3. Üretilen mikrofunguslardan protein özütlemesi.

4. Elde edilen özütlerin total protein miktarlarının belirlenmesi.

5. Elde edilen özütlerin SDS-Page yöntemi ile protein profillerinin belirlenmesi.

6. Protein profilleri belirlenen örneklerin elde edilen veriler kullanılarak MVSP

istatistik programında dendrogramlarının çizilmesi.

3.1 Örneklerin Temini

Çalışmada, daha önceden atmosferik ve toprak mikrofungus florası araştırmalarından

elde edilerek teşhis edilmiş ve kültüre alınmış örnekler kullanılmıştır. Çalışmada

kullanılan örnekler çizelge 5’de gösterilmiştir. Çalışılan örneklerin uzun süre

saklanması için steril şartlarda birer yedekleri yatık Malt extract agarlı tüplere inoküle

edimiştir (İmalı 2005).

23

Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan örnekler

Örnek adı Örneklerin Alındığı Üniversite ve Teşhis Eden

Acremonium kiliense Grütz (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.

Alternaria alternata Keisler β (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.

Aspergillus flavipes Bain ve Sartory (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.

Aspergillus niger Van. Tighem (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.

Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.

Cladosporium herbarum (Pers) Link ex. Gray

(Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.

Cladosporium obtectum Rabenh. (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.

Cylindrocladium floridanum Sobres ve Seymour

(Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.

Penicillium chrysogenum Thom (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.

3.2 Örneklerin Çoğaltılması

3.2.1 Besiyerlerinin hazırlanması

Çalışma boyunca 3 farklı özellikte besiyeri kullanılmıştır. Kullanılan besiyerleri; Malt

extract agar (MEA), Malt extract broth ve Czapek - dox agar (CA)’dır. Besiyerlerinin

içeriği ve hazırlanması aşağıda belirtilmiştir.

Malt extact agar (MEA)

Distile Su 1000ml

Malt Extract 30 gr

Pepton 3gr

Agar agar 15 gr

Tartımı yapılan maddeler ve distile su 1000 mL.’lik erlene konulup, ısıtıcılı manyetik

24

karıştırıcı ile çözdürülür. Otoklavda 1.1 atmosfer basınç altında 121ºC’de 15 dakika

sterilize edilir.

Stok kültür için hazırlanacak olanlar ise ısıtıcılı manyetik karışıtırıcıda eritildikten sonra

15 ml falkon tüplere, içerisinde 10'ar ml besiyeri olacak şekilde dağıtıldıktan sonra

otoklavda sterilize edilir ve otoklavdan çıktıktan sonra tüpler yatırılarak dondurulur

(Rapp1974).

Malt extact broth (MEB)

Distile Su 1000ml

Malt Extract 17 gr

Dehidre besiyeri, 17,0 g/L olacak şekilde damıtık su içinde eritilir ve amaca uygun

kaplara (erlen, tüp vb.) dağıtıldıktan sonra, otoklavda 115ºC’de 10 dakika sterilize

edilir. Aşırı ısıtılmamalıdır. Hazırlanmış besiyeri berrak ve sarı renkli olup, 25°C’da

pH'sı 4,8±0,2’dir (Rapp1974).

Czapek - dox agar (CA)

Distile Su 1000ml

NaN03 3 gr

K2HP04 1 gr

MgS04 0,5 gr

KCl 0,5gr

FeS04 0,01 gr

Sukroz 30 gr

Agar agar 13 gr

25

Dehidre besiyeri, 48,0 g/L olacak şekilde ısıtılarak damıtık su içinde eritilir ve

otoklavda 121°C'da 15 dakika sterilize edilir. Otoklav sonrasında 45-50°C'a soğutulup,

sterilpetri kutularına 12,5'er mL dökülür. Hazırlanmış besiyeri bulanık ve beyazımsı

olup, 25°C'da pH'sı 7,3±0,2'dir (Czapek 1902, 1903).

3.2.2 Örneklerin üretilmesi

Protein ekstraksiyonu için örnekler steril koşullar altında önce hem katı hem de sıvı

Malt extract besiyerlerine ekilerek 7 gün 25°C de inkübasyona tabi tutulmuştur. Katı

besiyerinden örneklerin geri kazanım oranı, sıvı besiyerine oranla daha az ve zor olması

nedeniyle örnekler çalışma boyunca Malt extract broth besi yerlerinde inkübe edilmiştir.

Daha önceden hazırlanarak steril edilmiş içerisinde Malt extract broth (250 ml) bulunan

500ml’lik erlenlere bünzen bek alevi yanında ekim yapılmıştır. Ekim yapıldıktan sonra

erlenlerin ağızları steril pamuklarla kapatılıp etüvde (25°C sıcaklıkta), 7 gün süre ile

inkübasyona tabii tutulmuştur.

3.2.3 Örneklerin özütlenmesi

İnkübasyon sonrası üreyen mikrofungus örnekleri çeker ocak altında bek alevinin

yanında Whatman no. 1 filtre kâğıdı yardımıyla süzülmüştür. Elde edilen filtratlar, steril

filtre kâğıtlarıyla beraber alüminyum folyolara sarılarak 25°C’lik etüvde 24 saat süre ile

kurutulmuştur. Kurutulan örnekler daha sonra hassas terazide tartılmış ve 0,2M fosfat

tamponu (PBS) pH 7.5 ile içerisinde steril kum bulunan soğuk havanlarda öğütülerek

özütlenmiştir.

3.3 Protein Profil Çıkarılmasında Kullanılan Yöntemler

Ham özüt 15000g de 30dk santrifüjlenmiştir. Üst sıvı alınarak spektrofotometrede

(NanoDrop) total protein miktarları ölçülmüştür. Protein kaybı yaşanmaması ve

26

yapılarının bozulmaması için Sigma marka kokteyl proteaz inhibitörü kullanılmıştır.

Örneklerin protein profilleri sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi

yöntemine göre çıkarılmıştır.

3.3.1 Özütlenen örneklerin total miktarlarının belirlenmesi

Örnekler SDS-PAGE ile ayrılmadan önce, her kuyucuğa aynı miktar protein yüklemek

amacıyla total protein miktarları ölçülmüştür. Total protein miktarı ölçümü için,

NanoDrop 1000 Spectrofotometre cihazı kullanılmıştır. Protein miktarları ölçümünde

ilk olarak, kör örnek olarak özütleme sırasında tampon çözeltisi olarak kullanılan, pbs

kullanılmış, daha sonra her örnek için pipetle 2µl hacimde numune alınarak cihazda

okutma yapılmıştır. (http://www.mun.ca/biology/ dmarshall/ nd-1000-users-manual.pdf

2012).

3.3.2 Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)

Elekroforez, bir elektrik alanının etkisi altında yüklü bir partikülün göç etmesi olarak

tanımlanabilir. Aminoasitler, peptitler, proteinler, nükleotidler ve nükleik asitler gibi

biyolojik moleküller iyonize gruplar içerirler Bu sayede herhengi bir pH’da elektrikçe

yüklü katyonlar (+) veya anyonlar (-) olarak olarak bulunurlar. Bir elektrik alan etkisine

maruz bırakılan bu moleküller net yüklerine bağımlı olarak katoda veya anoda doğru

göç ederler. Bu moleküllerin elektriksel alanda göç hızları veya mobiliteleri; alanın

şiddetine, moleküllerin net yüküne, büyüklüğüne, şekillerine, viskozitesine vb. bağlıdır.

Elektroforezde, örnek bir destek matriksi üzerinde göç eder. Bu matriks, kağıt, selüloz,

aselat, nişasta, jel, agaroz veya poliakrilamid jeli olabilir (Zihnioğlu 1996, Balkan

2008).

Elektroforezde, örnek moleküller, belli bir protokole göre hazırlanmış agaroz ya da

poliakrilamid bir jel üzerine uygulanır. Jel burada durgun fazdır. Hareketli faz olarak

elektrik akımı kullanılır. Tampon çözeltiler elektrik akımının geçişini sağlarlar.

27

Elektroforezde, bazik pH’da çalışılarak, moleküllerin negatif yüklü (-) olması sağlanır.

bu sayede elektrik akımı verildiğinden moleküller pozitif kutba doğru göç ederler. Göç

sırasında jel, gözenekli yapısı (yapılacak işleme göre değişebilir) ile süzgeç gibi çalışır

ve ayrışmayı sağlar. Moleküllerin jelden çıkmasını önlemek için küçük molekül

ağırlığına negatif yüklü boya (brom fenol mavisi) kullanılır. Boya en önde gider ve jel

sonuna gelince elektrik akımı kesilir. Daha sonra protein bantları uygun boya ile

boyanarak görünür hale getirilir (Balkan 2008).

Elektroforezde büyük ve asimetrik moleküller yavaş, küçük moleküller ise, hızlı hareket

ederler. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) protein ve 1 akb’ın altındaki DNA

fragmentlerinin ayrımında kullanılabilen, bir dizi işlem içerir. Poliakrilamid jeller

akrilamid ve çapraz bağlayıcı bisakrilamidin kopolimerizasyonu ile hızlanır. Akrilamid

ve bis akrilamid yüzdeleri değiştirilerek amaca göre çeşitli por çaplarında jeller

hazırlanabilir. Jel yoğunluğu arttıkça, por çapı küçülür.

Proteinler, sodyum dodesilsülfat (SDS) ve bir tiol reaktifi (2- merkaptoetanol ya da

dithiothreitol=DDT) içeren ortamda ısıtılarak denatüre edildiklerinde, yaklaşık her iki

aminoasit için bir molekül SDS bağlar. Bağlanan SDS, proteinin negatif elektrik

yüklenmesine neden olur. Bu sayede proteinler elektrik akımı verildiğinde yalnız

molekül ağırlığına göre jelde hareket ederler. Molekül ağırlıkları bilinen standartlardan,

molekül ağırlığı bilinmeyen proteinin molekül ağırlığı çeşitli programlar kullanılarak

hesaplanır. (Zihnioğlu 1996, Balkan 2008).

Özütleme

0,2 M Fosfat Buffered Saline (PBS)

Na2HPO4.12H20 2,75 gr

NaH2PO4.2H2O 8,32 gr

NaCl 9 gr

dH2O 997 ml

Hazırlanan çözeltinin pH’sı 6 N HCl kullanılarak 7,5 olarak ayarlanır.

28

Proteinlerin Jele Yüklenmesi ve Ayrılması

Stok Çözeltiler

A. %30’luk Akrilamid Çözeltisi

B. 1,5 M Tris Tamponu, pH 8,8

Tris 18,17 gr

SDS 0,4 gr

dH2O 100 ml

Hazırlanan çözeltinin pH’sı 6 N HCl çözeltisi ile 8,8’e ayarlanır.

C. 0,5 M Tris Tamponu, pH 6,8

Tris 6,06 gr

SDS 0,4 gr

dH2O 100 ml

Hazırlanan çözeltinin pH’sı 6 N HCl çözeltisi ile 6,8’e ayarlanır.

D. %10’luk Amonyum persülfat

Amonyum persülfat 0,1 gr

dH2O 1 ml

Bu çözelti kullanımdan hemen önce, taze olarak hazırlanır.

Akrilamid 29,2 gr

Bisakrilamid 0,8 gr

dH2O 100 ml

29

E. Örnek Uygulama Tamponu 2x

SDS %4

Tris 0,125 M

Gliserol % 20

2-merkaptoetanol %10

Bromofenol mavisi %0,2

Geri kalan hacim saf su ile tamamlanır.

F. Tank Tamponu 5x, pH 8,3

Tris 0,025 M

Glisin 0,192 M

SDS %0,1

G. Fiksatif

Metanol 500 ml

Asetik asit (glasiyel) 100 ml

dH2O 400 ml

H. Boyama Çözeltisi

Metanol 500 ml

Comassie Brillant Blue 1 gr


dH2O 400 ml

Comassie Brillant Blue’nun iyice çözünmüş olması gerekir.

30

İ. Yıkama Çözeltisi

Metanol 120 ml


dH2O 2200 ml

1 mm kalınlığında jel hazırlamak için gerekli çözelti miktarları Çizelge 1’de verilmiştir.

Çizelge 3.2.Jel hazırlamak için gerekli çözelti miktarları

Ayırma Jeli %12,5 Yığma Jeli %4,5

A Çözeltisi 7,5 ml 0,9 ml

B Çözeltisi 4,5 ml -

C Çözeltisi - 1,5 ml

D Çözeltisi 0,07 ml 0,018 ml

TEMED 0,01 ml 0,01 ml

Saf su 6 ml 3,6 ml

Jellerin Hazırlanması

Ayırma Jeli

Yukarıdaki tablodaki oranlara göre amonyum persülfat (D) çözeltisi hariç olmak üzere

diğer çözeltiler karıştırılır ve bir peristaltik pompa yardımıyla havası alınır. Daha sonra

içine amonyum persülfat çözeltisi eklendikten sonra hızlı bir şekilde jel dökme sistemi

üzerinde bulunan camlar arasına bir enjektör ya da pipet yardımıyla dökülür.

Polimerizasyon yüzeyini düzleştirmek amacıyla jelin üzerine suyla doymuş n-butanol

çözeltisi dökülür. Polimerizasyondan sonra ne butanol çözeltisi dökülür.

Yığma Jeli

Yine yukarıdaki tabloda yığma jeli sütunundaki çözeltiler D çözeltisi hariç karıştırılır ve

31

peristaltik bir pompa yardımıyla karışımın içerisinde bulunan hava uzaklaştırılır. Daha

sonra D çözeltisi ilave edildikten sonra cam plaklara arasına yerleştirilen uygun tarak

aparatının kenarından iki cam arasına akıtılır. Polimerizasyon işlemi tamamlandıktan

sonra bu tarak dikkatli bir biçimde çıkarılır. Jel dökme sisteminden çıkarılan camlar

dikey elektroforez tankına yerleştirilir ve tankın tampon hazneleri 5 kat seyreltilen tank

tamponu ile elektrotların üzerine kadar doldurulur.

Örneklerin Hazırlanması ve Jele Yüklenmesi

Özütleme sonrası elde edilen örnekler eşit miktarda protein içerecek şekilde örnek

tamponu (E) ile karıştırılır. Mikrosantrifüj tüpü içerisinde 5-10 dakika kaynatılan

örnekler tarakların çıkartıldığı yerlerdeki kuyucuklara yüklenir. Daha sonra uygun akım

verilerek proteinlerin jelde ayrımı sağlanır. Bu işlem örnek tamponu içerisinde yer alan

izleme boyası bromofenol mavisinin jelin alt ucuna 0,5 cm kalana dek devam edilir.

İşlem tamamlandıktan sonra tank güç kaynağından ayrılır. Cam plakalar dikkatli bir

şekilde birbirinden ayrılır ve jelin bir kenarı karışıklığı önlemek amacıyla kesilir.

Jellerin Comassie Brillant Blue ile Boyanması

Jel alkole ve aside dayanıklı plastik veya cam bir kapta, hacminin 3-5 katı fiksatif içinde

2 saat boyunca düşük hızda çalkalanır. Fiksatif dökülerek plastik kabın içerisine

boyama çözeltisi katıldı ve oda sıcaklığında yaklaşık 2 saat çalkalanarak bekletilir. Daha

sonra boya çözeltisi uzaklaştırılarak 1-2 dakika fiksatifle çalkalanır. Fiksatif dökülür ve

2 saat yıkama çözeltisinde hafifçe çalkalanır.

Yeni bir yıkama çözeltisine alınan jel, zemindeki boya çıkıp bantlar belirgin hale gelene

dek bu işlem yıkama çözeltisi yenilenerek yapılır (Temizkan ve Arda 2007).

32

Elde Edilen Bantların Molekül Ağırlıklarının Hesaplanması

Yürütülen jeller daha sonra fotoğraflandıktan sonra Macromedia Flash programı

yardımıyla ölçülmüş ve rF değerleri belirlenmiştir. Elde edilen bu rF değerleri, bantların

molekül ağırlıklarının tahmin edilmesinde kullanılmıştır. Molekül ağırlıkları

hesaplanırken, elektroforez markerlarının rF değerlerine göre çizilen standart eğri

denklemi kullanılmıştır.

3.4 MVSP (MultiVariate Statistical Package)

MVSP (İngilizce açılmıyla: Multi Variate Statistical Package), araştırma geliştirme ve

dağıtım, veri madenciliği, metin analizi, istatistiksel analiz ve işbirliği ve dağıtım (toplu

ve otomatik skorlama hizmetler) için kullanılan bir bilgisayar programıdır.

MVSP bilimsel alanlarda çok değişkenli sayısal analizler yapan ucuz ve kullanımı kolay

bir programdır. Sağlık araştırmalarında, fen bilimlerinde, sosyal bilimlerde, pazar

araştırmalarında, anket şirketleri, hükümetler ve eğitim kurumları olmak üzere pek çok

kurum tarafından istatiksel analiz için kullanılan bir bilgisayar yazılımdır.

Kullanımı grafiksel bir kullanıcı arayüzüne bağlı olup, açılır menüler yardımıyla

kolaylaştırılmıştır. Ayrıca makro dilleri yardımıyla kullanıcı kendi amaçları

doğrultusunda programı yönlendirebilmektedir.

Bu program ile, mevcut veriler, t-testi, ANOVA, Korelasyon, Cluster (kümeleme)

analizi ve daha birçok istatistiki analizleri uygulayabilir, verileri grafiksel olarak ifade

edilebilmektedir. (www.kovcomp.co.uk. 2012)

Bu çalışmada MVSP programı kullanılarak jellerden skorlanan verilere göre, örneklerin

istatistiksel analizleri yapılmıştır.

33

4. BULGULAR

Tez çalışmasında, atmosferde sık rastlanan mikrofunguslar gerek yurt içi gerekse yurt

dışı çalışmalar da da araştırılmış, elde edilen verilerene göre tez de kullanılacak

funguslar belirlenmiştir. Belirlenen fungusların protein profilleri sodyum dodesil sülfat-

poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), yöntemi ile çıkarılmıştır.

MVSP programında ikili veri için benzerlik ölçüsüne (Jaccards katsayısına) göre

benzerlikler hesaplanmış ve UPGAMA kümeleme metodu kullanılarak dendrogramlar

çizilmiştir (Şekil 4.1).

Jaccard katsayısı��

��

f01 = farklı sınıfta aynı kümede bulunan obje çifti sayısı

f10 = aynı sınıfta farklı kümede bulunan obje çifti sayısı

f11 = aynı sınıfta ve kümede bulunan obje çifti sayısı

Çalışmada kullanılan örneklerin; sıvı besiyerinde görüntüsü, katı besiyerinde görüntüsü,

SDS-Page yöntemiyle elde edilen bant görüntüleri ve elde edilen bantların molekül

ağırlıklarının hesaplanırken, elektroforez markerlarının rF değerlerine göre çizilen

standart eğri denklemi her örnek için ayrı sayfada olmak üzere aşağıda verilmiştir.

34

A.

B.

Şekil 4.1 a. Çalışmada kullanılan örneklerin protein bant verilerine göre elde edilen dendrogram b. Çalışmada kullanılan örneklerin sistematik verilerine göre elde edilen dendrogram

UPGMA

Jaccard's Coefficient

Aspergillus niger

Alternaria alternata

Cladosporium herbarum

Penicillium chrysogenum

Aspergillus flavipes

Aspergillus oryzae

Cladosporium obtectum

Cylindrocladium floridanum

Acremonium kiliense

0,04 0,2 0,36 0,52 0,68 0,84 1

UPGMA

Jaccard's Coefficient


Aspergillus oryzae

Aspergillus flavipes

Aspergillus niger


Cladosporium obtectum


Cylindrocladium floridanum

Acremonium kiliense

0,04 0,2 0,36 0,52 0,68 0,84 1

35

Örneklerin; petride ve sıvı besiyerinde görüntüsü, kullanılan marker ile elde edilen

bantların görüntüleri;

Acremonium kiliense Grütz

A. B.

C. D.

Şekil 4.2 a. Acremonium kliense’nin katı besiyerinde görüntüsü b. Acremonium kliense’nin sıvı besiyerinde görüntüsü c. Acremonium kliense’den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları. d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri

y = -1,4898x + 2,1659

R² = 0,9424

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8

36

Acremonium kliense Grütz 1925, den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantları;

209 kDa, 120 kDa, 85 kDa, 61 kDa, 52 kDa, 46 kDa, 43 kDa, 35 kDa, 32 kDa, 30 kDa,

29 kDa, 27 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 22 kDa, 21 kDa, 20 kDa ve 19 kDa’dur

(Şekil 4.2).

Ayrıca Acremonium kliense özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için

spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.3).

Şekil 4.3 Acremonium kliense total protein miktarı


A.

C.

Şekil 4.4 a. Alternaria alternataalternata’nın sıvı besiyerinde görüntüsü Page yöntemiyle elde edilen protein bantları değerlerine karşı, Rf değerleri

37

Alternaria alternata Keisler β

B.

D.

Alternaria alternata’nın katı besiyerinde görüntüsü ’nın sıvı besiyerinde görüntüsü c. Alternaria alternata

Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri

’nın katı besiyerinde görüntüsü b. Alternaria Alternaria alternata’dan SDS-. Standart proteinlerin log MW

38

Alternaria alternata’den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantları; 160 kDa,

142 kDa, 132 kDa, 123 kDa, 116 kDa, 108 kDa, 103 kDa, 99 kDa, 92 kDa, 88 kDa, 84

kDa, 81 kDa, 72 kDa, 66 kDa, 64 kDa, 61 kDa, 56 kDa, 52 kDa, 50 kDa, 46 kDa, 44

kDa, 43 kDa, 41 kDa, 37 kDa, 34 kDa, 31 kDa, 26 kDa, 23 kDa, 14 kDa, 11 kDa,

9kDa’dur (Şekil 4.4).

Alternaria alternata, özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için


Şekil 4.5 Alternaria alternata total protein miktarı

39

Aspergillus flavipes Bain ve Sartory

A. B.

C. D.

Şekil 4.6 a. Aspergillus flavipes’in katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus flavipes’in sıvı besiyerinde görüntüsü c.Aspergillus flavipes’den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri

y = -1,4898x + 2,1659

R² = 0,9424

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8

40

Aspergillus flavipes’den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantları; 218 kDa,


25 kDa, 24 kDa, 23 kDa, 22 kDa, 21 kDa, 19 kDa’dur (Şekil 4.6).

Aspergillus flavipes özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için


Şekil 4.7 Aspergillus flavipes total protein miktarı

Aspergillus niger Van. Tighem

A.

C.

Şekil 4.8 a. Aspergillus nigerbesiyerinde görüntüsü edilen protein bantları değerleri

41

an. Tighem

B.

D.

Aspergillus niger’in katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus niger ’in sıvı besiyerinde görüntüsü c. Aspergillus niger’den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf

. Aspergillus niger ’in sıvı Page yöntemiyle elde

. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf

42

Aspergillus niger, den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantlarnın molekül

ağılıkları; 103 kDa, 92 kDa, 89 kDa, 75 kDa, 64 kDa, 61 kDa, 47 kDa, 41 kDa, 24 kDa,

14 kDa’dur (Şekil 4.8).

Aspergillus niger Van. Tighem 1867, özütleme işleminden sonra protein miktarı

belirlenmek için spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.9).

Şekil 4.9 Aspergillus niger total protein miktarı

43

Aspergillus oryzae (Ahlb.) E. Cohn

A. B.

C. D.

Şekil 4.10 a. Aspergillus oryzae’nin katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus oryzae ’nin sıvı besiyerinde görüntüsü c. Aspergillus oryzae ’den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri

y = -1,4898x + 2,1659

R² = 0,9424

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8

44

Aspergillus oryzae’den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantlarının molekül

ağırlıkları; 234 kDa, 134 kDa, 97 kDa, 74 kDa, 50 kDa, 40 kDa, 37 kDa, 32 kDa, 29

kDa, 27 kDa, 26 kDa, 24 kDa ve 23 kDa dur (Şekil 4.10).

Aspergillus oryzae özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için


Şekil 4.11 Aspergillus oryzae total protein miktarı


A.

C.

Şekil 4.12 a. Cladosporium herbarumherbarum’un sıvı besiyerinde görüntüsü SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantlarıMW değerlerine karşı, Rf değerleri

45

Cladosporium herbarum (Pers) Link ex. Gray

B.

D.

Cladosporium herbarum’un katı besiyerinde görüntüsü ’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cladosporium herbarum

Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri

’un katı besiyerinde görüntüsü b. Cladosporium Cladosporium herbarum’dan

. Standart proteinlerin log

46

Cladosporium herbarum’den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantlarının

molekül ağırlıkları; 89 kDa, 85 kDa, 83 kDa, 82 kDa, 78 kDa, 73 kDa, 69 kDa, 62 kDa,

61 kDa, 55 kDa, 47 kDa, 44 kDa, 41 kDa, 36 kDa, 33 kDa, 31 kDa, 30 kDa, 28 kDa, 25

kDa, 23 kDa, 17 kDa, 14 kDa, 11 kDa, 10 kDa ve 9kDa’dur (Şekil 4.12).

Cladosporium herbarum özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için


Şekil 4.13 Cladosporium herbarum total protein miktarı

47

Cladosporium obtectum Rabenh.

A. B.

C. D.

Şekil 4.14 a. Cladosporium obtectum’un katı besiyerinde görüntüsü b. Cladosporium obtectum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cladosporium obtectum’un SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri

y = -1,4898x + 2,1659

R² = 0,9424

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8

48

Cladosporium obtectum’den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantlarının

büyüklükleri; 246 kDa, 136 kDa, 89 kDa, 71 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 31 kDa, 28 kDa, 27

kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 23 kDa, 22 kDa, 21 kDa ve 20 kDa’dur (Şekil 4.14).

Cladosporium obtectum, özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için


Şekil 4.15 Cladosporium obtectum total protein miktarı

49

Cylindrocladium floridanum Sobers ve Seymour

A. B.

C. D.

Şekil 4.16 a. Cylindrocladium floridanum’un katı besiyerinde görüntüsü b. Cylindrocladium floridanum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cylindrocladium floridanum’un SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri

y = -1,4898x + 2,1659

R² = 0,9424

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8

50

Cylindrocladium floridanum’dan SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantları; 167


kDa, 23 kDa, 21 kDa ve 20 kDa’dur (Şekil 4.16).

Cylindrocladium floridanum, özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek

için spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.17).

Şekil 4.17 Cylindrocladium floridanum total protein miktarı


A.

C.

Şekil 4.18 a. Penicillium chrysogenumchrysogenum

SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantlarıMW değerlerine karşı, Rf değer

51

llium chrysogenum Thom

B.

D.

Penicillium chrysogenum’un katı besiyerinde görüntüsü chrysogenum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Penicillium chrysogenum

Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değeri

’un katı besiyerinde görüntüsü b. Penicillium Penicillium chrysogenum’dan

. Standart proteinlerin log

52

Penicillium chrysogenum’dan SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantları; 106


kDa, 57 kDa, 41 kDa, 33 kDa, 24 kDa, 20 kDa, 14 kDa, 12 kDa, 11 kDa ve 10 kDa’dur

(Şekil 4.18).

Penicillium chrysogenum özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için


Şekil 4.19 Penicillium chrysogenum total protein miktarı

53

5. TARTIŞMA VE SONUÇ

Son yıllarda hava da bulunan mantarların konsantrasyonlarındaki yükseliş ve bunlara

bağlı alerjilerdeki artış, ticari ve tarım amaçlı ürünlerin muhafazasında karşılaşılan

problemler günümüzde mikrofungus araştırmalarını önemli hale getirmiştir. Bu nedenle

özellikle aerobiyologların mikrofunguslara büyük ilgi göstermesine neden olmuştur. Bu

çalışmada da atmosferde sık rastlanan mikrofunguslara ait taksonların protein profilleri

belirlenmiştir.

Bu tez çalışmasında Acremonium kliense, örneğinden SDS-Page yöntemi ile 19 farklı

büyüklükte protein bandı elde edilmiştir. Elde edilen protein bantlarının molekül


kDa, 30 kDa, 29 kDa, 27 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 22 kDa, 21 kDa, 20 kDa ve 19

kDa’dur (Şekil 4.2).

Acremonium kiliense’den elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine

göre Aspergillus niger ile aralarında 2 (46 kDa, 24 kDa), Aspergillus flavipes ile 9 (46

kDA, 35kDa, 29kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 22 kDa, 21 kDa, 19 kDa), Aspergillus

oryzae ile 4 (29 kDa, 27 kDa, 26 kDa, 24 kDa), Alternaria alternata ile 5 (61 kDa, 52

kDa, 46 kDa, 43 kDa, 26 kDa), Cladosporium obtectum ile 6 (27 kDa, 26 kDa, 25 kDa,

24 kDa, 22 kDa, 21 kDa), Cladosporium herbarum ile 4 (85 kDa, 61 kDa, 30 kDa, 25

kDa), Cylindrocladium floridanum ile 6 (29 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 21 kDa, 20

kDa), Penicillium chrysogenum ile 4 (85 kDa, 61 kDa, 24 kDa, 20 kDa) ortak bantları

olduğu belirlenmiştir. Ayrıca yapılan araştırmalara göre literatürde Acremonium

kiliense’ye ait protein çalışmalarına rastlanmamıştır.

Acremonium kiliense’den elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 22 kDa,

26 kDa, 29 kDa, 32 kDa ve 46 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde

alerjen olarak tanımlanmış olan [Alt a 7 (22 kDa), Cla h 7 (22 kDa) YCP4 protein], [Alt

a 13 (26 kDa) Glutathion-S-transferaz], [Alt a 8 (29 kDa) Mannitol dehidrogenaz] ve

54

[Pen ch 18 (32 kDa) vakuolar serin proteaz] proteinlerden biri olma ihtimalini akla

getirmekte ve ileride Acremonium kiliense için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya

çıkmasında yarar sağlayacağı düşünülmektedir.

Çalışmada Aspergillus cinsine ait 3 farklı tür çalışılmıştır. Aspergillus flavipes

örneğinden SDS-Page yöntemi ile 17 farklı büyüklükte protein bandı elde edilmiştir.

Elde edilen protein bantları; 218 kDa, 115 kDa, 81 kDa, 59 kDa, 46 kDa, 39 kDa, 35


kDa’dur (Şekil 4.6).

Aspergillus flavipes’den elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine göre

Acremonium kiliense ile aralarında 9 (46 kDA, 35kDa, 29kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa,

22 kDa, 21 kDa, 19 kDa), Aspergillus niger ile aralarında 4 (24 kDa, 40 kDa, 46 kDa,

59 kDa), Aspergillus oryzae ile 5 (23 kDa, 24 kDa, 26 kDa, 29 kDa, 40 kDa), Alternaria

alternata ile 4 (23 kDa, 26 kDa, 46 kDa,81 kDa), Cladosporium obtectum ile 7 (21 kDa,

22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 28 kDa), Cladosporium herbarum ile 3 (23

kDa, 25 kDa, 28 kDa), Cylindrocladium floridanum ile 7 (29 kDa, 28 kDa, 26 kDa, 25

kDa, 24 kDa, 23 kDa, 21 kDa), Penicillium chrysogenum ile 1 (24 kDa) ortak bantları

olduğu belirlenmiştir.

Aspergillus flavipes’den elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 22 kDa, 26

kDa, 28 kDa, 29 kDa ve 46 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde alerjen

olarak tanımlanmış olan [Alt a 7 (22 kDa), Cla h 7 (22 kDa) YCP4 protein], [Alt a 13

(26 kDa) Glutathion-S-transferaz], [Cla h 8 (28 kDa) Mannitol dehydrogenaz ], [Alt a 8

(29 kDa) Mannitol dehidrogenaz], ve [Cla h 6 (46 kDa) Enolaz] proteinlerden biri olma

ihtimalini akla getirmekte ve ileride Aspergillus flavipes için tanımlacak olan yeni

alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar sağlayacağı düşünülmektedir.

Çalışmada kullanılan bir diğer Aspergillus örneği de Aspergillus niger’den SDS-Page

yöntemi ile 10 farklı büyüklükte protein bandı elde edilmiştir. Elde edilen protein

55

bantlarının molekül ağırlıkları; 105 kDa, 92 kDa, 89 kDa, 75 kDa, 64 kDa, 61 kDa, 47

kDa, 41 kDa, 24 kDa, 14 kDa’dur (Şekil 4.8).

Aspergillus niger’den elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine göre

Acremonium kiliense ile aralarında 2 (46 kDa, 24 kDa), Aspergillus flavipes ile

aralarında 4 (24 kDa, 40 kDa, 46 kDa, 59 kDa), Aspergillus oryzae ile 3 (24 kDa, 40

kDa, 74 kDa), Alternaria alternata ile 5 (14 kDa, 46 kDa, 64 kDa, 92 kDa, 103 kDa),

Cladosporium obtectum ile 2 (24 kDa, 89 kDa), Cladosporium herbarum ile 2 (14 kDa,

89 kDa), Cylindrocladium floridanum ile 1 (24 kDa), Penicillium chrysogenum ile 3 (14

kDa, 24 kDa, 89 kDa) ortak bantları olduğu belirlenmiştir.

Aspergillus niger için literatürde tanımlanmış alerjen bantlar; Asp n 14 (105 kDa) Beta-

xylosidaz (Sander vd. 1998), Asp n 18 (34 kDa) Vakuolar serin proteaz (Shen vd.

1999), Asp n 25 (66-100 kDa) 3 fitaz B (Baur vd. 2002). Literatürde tanımlanmış

alerjen protein bantların bir kısmının bulanamaması ekstraksiyon işlemleri ve boyama

sırasında çevresel koşullardan kaynaklandığı düşünülmektedir. Ayrıca Aspergillus niger

besiyerinde siyah bir renk aldığı için protein ekstraksiyonu sırasında ve jel görüntüleme

sırasında büyük zorluklar yaşanmıştır.

Aspergillus niger’den elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 46 kDa olan

protein bandının bulunması, literatürde alerjen olarak tanımlanmış olan [Cla h 6 (46

kDa) Enolaz] proteini olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride Aspergillus niger için

tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar sağlayacağı düşünülmektedir.

Aspergillus cinsine ait 3. örnek olan Aspergillus oryzae’den SDS-page yöntemi ile 13

farklı büyüklükte protein bandı elde edilmiştir. Elde edilen protein bantlarının molekül


kDa, 27 kDa, 26 kDa, 24 kDa, 23 kDa’dur (Şekil 4.10).

56

Aspergillus oryzae için literatürde tanımlanmış alerjen bantlar; Asp o 13 (34 kDa)

Alkalin serin proteaz (Shen HD vd. 1998), Asp o 21 (53 kDa) TAKA-amilaz A

(http://fermi.utmb.edu/cgi-bin/SDAP/sdap_02?dB_Type=0&allid=171, 2012). Bu

tezde literatürde tanımlanmış Asp o 13; alkaline serin proteaz (34 kDa) protein

bandı ekstraksiyon sonrası elde edilerek jel üzerinde görüntülenmiştir (Şekil 4.10).

Aspergillus oryzae’den elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine göre

Acremonium kiliense ile aralarında 4 (29 kDa, 27 kDa, 26 kDa, 24 kDa), Aspergillus

flavipes ile aralarında 5 (23 kDa, 24 kDa, 26 kDa, 29 kDa, 40 kDa), Aspergillus niger

ile 3 (24 kDa, 40 kDa, 74 kDa), Alternaria alternata ile 4 (23 kDa, 26 kDa, 34 kDa, 37

kDa), Cladosporium obtectum ile 4 (23 kDa, 24 kDa, 26 kDa, 27 kDa ), Cladosporium

herbarum ile 1 (23 kDa), Cylindrocladium floridanum ile 4 (23 kDa, 24 kDa, 26 kDa,

29 kDa ), Penicillium chrysogenum ile 2 (24 kDa, 97 kDa) ortak bantları olduğu

belirlenmiştir.

Aspergillus oryzae’den elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 26 kDa ve

29 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde alerjen olarak tanımlanmış olan

[Alt a 13 (26 kDa) Glutathion-S-transferaz] ve [Alt a 8 (29 kDa) Mannitol

dehidrogenaz], proteinlerden biri olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride Aspergillus

oryzae için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar sağlayacağı

düşünülmektedir.

Saeednejad vd. (2010) İran atmosferinde rastlanan Aspergillus cinsine ait 3 fungus

türünün protein banlarının belirlenmesi için yaptıkları çalışmada Aspergillus

fumigatus, Aspergillus flavus ve Aspergillus niger örneklerini saboraud glucose

agar besiyerinde inkübe etmiş ve sonrasında SDS-page yöntemiyle protein

profillerini çıkarmışlardır. Aspergillus niger’den elde ettikleri 26 farklı protein

bantlarının büyüklüklerinin 11,5 kDa, 13,5 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 28 kDa, 31 kDa, 30

kDa, 34 kDa, 35 kDa, 36 kDa, 38 kDa, 40 kDa, 42 kDa, 47 kDa, 48 kDa, 50,5 kDa, 56,5

kDa, 63 kDa, 69 kDa, 74,5 kDa, 78,5 kDa, 83 kDa, 95 kDa, 101 kDa, 120 kDa, 178 kDa

olduğunu belirtmişlerdir.

57

Atmosferde sık rastlanan funguslardan ikinci olan Alternaria’dan, Alternaria

alternata türünden SDS-Page yöntemi ile 31 farklı protein bandı elde edilmiştir. Elde

edilen protein bantlarının molekül ağırlıkları; 160 kDa, 142 kDa, 132 kDa, 123 kDa,



kDa, 31 kDa, 26 kDa, 22 kDa, 14 kDa, 11 kDa ve 9kDa’dur (Şekil 4.4).

Alternaria alternata için literatürde tanımlanmış alerjen bantlar; Alt a 5 (11 kDa)

Ribozomal protein P2 (Vouge vd. 1998), Alt a 12 (11 kDa) Asit ribozomal protein P1

(www.allergen.org 2012), Alt a 7 (22 kDa) YCP4 protein (Achatz 1995),Alt a 13 (26

kDa) Glutathion-S-transferaz (www.allergen.org 2012), Alt a 8 (29kDa) Mannitol

dehidrogenaz (Schneider 2006), Alt a 6 (45 kDa) Enolaz (Breitenbach 2002), Alt a 10

(53 kDa) Aldehit dehidrojenaz ve Alt a 4 (57 kDa) Disulfit izomeraz (Achatz 1995) dır.

Bu tezde Alternaria alternata’dan literatürde tanımlanmış 8 protein bandından 6 sı elde

edilerek jel üzerinde görüntülenmiştir (Şekil 4.4).

Alternaria alternata’dan elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine göre

Acremonium kiliense ile aralarında 5 (61 kDa, 52 kDa, 46 kDa, 43 kDa, 26 kDa),

Aspergillus flavipes ile aralarında 4 (23 kDa, 26 kDa, 46 kDa,81 kDa), Aspergillus

oryzae ile 4 (23 kDa, 26 kDa, 34 kDa, 37 kDa), Cladosporium obtectum ile 4 (23 kDa,

26 kDa, 31 kDa ), Cladosporium herbarum ile 7 (9 kDa, 11 kDa, 14 kDa, 23 kDa, 31

kDa, 41 kDa, 61 kDa), Cylindrocladium floridanum ile 4 (23 kDa, 26 kDa, 31 kDa, 72

kDa), Penicillium chrysogenum ile 4 (11 kDa, 14 kDa, 41 kDa, 61 kDa) ortak bantları

olduğu belirlenmiştir.

Alternaria alternata’dan elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 34 kDa,

46 kDa ve 66 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde alerjen olarak

tanımlanmış olan [Asp n 18 (34 kDa) Vakuolar serin proteaz, Pen ch 13 (34 kDa) ve

Asp o 13 (34 kDa) Alkalin serin proteaz], [Cla h 6 (46 kDa) Enolaz] ve [Asp n 25

(66-100 kDa) 3 fitaz B], proteinlerden biri olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride

58

Alternaria alternata için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar

sağlayacağı düşünülmektedir.

Atomosferde sık rastlanan fungusların en başında gelen Cladosporium cinsinden 2

farklı tür çalışılmış, bunlardan Cladosporium herbarum’dan SDS-page yöntemi ile

25farklı protein bandı elde edilmiştir. Elde edilen protein bantlarının molekül ağırlıkları;



kDa, 14 kDa, 11 kDa, 10 kDa ve 9 kDa’dur (Şekil 4.12).

Cladosporium herbarum için literatürde tanımlanmış alerjen bantlar: Cla h 2(45 kDa),

Cla h 5(11 kDa) Acid ribosomal protein P2 (Achatz 1995), Cla h 12 (11 kDa) Acid

ribosomal protein P1 (www.allergen.org, 2012), Cla h 7(22 kDa) YCP4 protein (Achatz

1995), Cla h 8 (28 kDa) Mannitol dehydrogenaz (Simon-Nobbe 2006). Cla h 6 (46 kDa)

Enolaz, Cla h 10 (53 kDa) Aldehit dehydrogenaz (Achatz 1995). Bu tezde

Cladosporium herbarum’dan literatürde tanımlanmış 7 protein bandından 4’ü elde


Cladosporium herbarum’dan elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine

göre Acremonium kiliense ile aralarında 4 (85 kDa, 61 kDa, 30 kDa, 25 kDa),

Alternaria alternata ile 7 (9 kDa, 11 kDa, 14 kDa, 23 kDa, 31 kDa, 41 kDa, 61 kDa),

Aspergillus flavipes ile aralarında 3 (23 kDa, 25 kDa, 28 kDa), Aspergillus oryzae ile 1

(23 kDa), Cladosporium obtectum ile 9 (17 kDa, 23 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 31 kDa, 36

kDa, 45 kDa, 71 kDa, 89 kDa), Cylindrocladium floridanum ile 6 (23 kDa, 25 kDa, 28

kDa, 31 kDa, 36 kDa, 47 kDa), Penicillium chrysogenum ile 10 (10 kDa, 11 kDa, 14

kDa, 33 kDa, 41 kDa, 61 kDa, 78 kDa, 82 kDa, 85 kDa, 89 kDa) ortak bantları olduğu

belirlenmiştir.

Cladosporium herbarum’dan elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 36

kDa olan protein bandının bulunması, literatürde alerjen olarak tanımlanmış olan [Pen

59

ch 35 (36.5 kDa) Transaldolaz] proteini olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride

Cladosporium herbarum için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar

sağlayacağı düşünülmektedir.

Cladosporium cinsinin tezde kullanılan bir diğer türü Cladosporium obtectum’dan SDS-

page yöntemi ile 16 protein bandı elde edilmiştir. Elde edilen protein bantlarının

molekül ağırlıkları; 246 kDa, 136 kDa, 89 kDa, 71 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 31 kDa, 28

kDa, 27 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 23 kDa, 22 kDa, 21 kDa ve 20 kDa’dur (Şekil

4.14).

Cladosporium obtectum’dan elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine

göre Acremonium kiliense ile aralarında 6 (27 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 22 kDa, 21

kDa), Alternaria alternata ile 4 (23 kDa, 26 kDa, 31 kDa ), Aspergillus flavipes ile

aralarında 7 (21 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 28 kDa), Aspergillus

oryzae ile 4 (23 kDa, 24 kDa, 26 kDa, 27 kDa ), Cladosporium herbarum ile 9 (17 kDa,

23 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 31 kDa, 36 kDa, 45 kDa, 71 kDa, 89 kDa), Cylindrocladium

floridanum ile 9 (21 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 28 kDa, 31 kDa, 36 kDa,

167 kDa), Penicillium chrysogenum ile 2 (24 kDa, 89 kDa) ortak bantları olduğu

belirlenmiştir.

Cladosporium obtectum’dan elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 22

kDa, 26 kDa, 28 kDa, 36 kDa ve 45 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde

alerjen olarak tanımlanmış olan [Alt a 7 (22 kDa), Cla h 7 (22 kDa) YCP4 protein], [Alt

a 13 (26 kDa) Glutation-S-transferaz], [Cla h 8 (28 kDa) Mannitol dehidrojenaz], [Pen

ch 35 (36.5 kDa) Transaldolaz] ve [Alt a 6 (45 kDa) Enolaz ve Cla h 2(45 kDa)]

proteinlerden biri olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride Cladosporium obtectum

için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar sağlayacağı


60

Atmosferde rastlanan Cylindrocladium cinsine ait bir tür çalışılmıştır. Cylindrocladium

floridanum’dan SDS-Page yöntemi ile 14 protein bandı elde edilmiştir. Edilen protein

bantları; 167 kDa, 95 kDa, 72 kDa, 47 kDa, 36 kDa, 31 kDa, 29 kDa, 28 kDa, 26 kDa,

25 kDa, 24 kDa, 23 kDa, 21 kDa ve 20 kDa’dur (Şekil 4.16).

Cylindrocladium floridanum’dan elde edilen protein bantlarının moleküler

büyükülüklerine göre Acremonium kiliense ile aralarında 6 (29 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24

kDa, 21 kDa, 20 kDa), Alternaria alternata ile 4 (23 kDa, 26 kDa, 31 kDa, 72 kDa),

Aspergillus flavipes ile aralarında 7 (29 kDa, 28 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 23 kDa,

21 kDa), Aspergillus oryzae ile 4 (23 kDa, 24 kDa, 26 kDa, 29 kDa ), Cladosporium

herbarum ile ile 6 (23 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 31 kDa, 36 kDa, 47 kDa), Cladosporium

obtectum ile 9 (21 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 28 kDa, 31 kDa, 36 kDa, 167

kDa), Penicillium chrysogenum ile 2 (20 kDa, 24 kDa) ortak bantları olduğu

belirlenmiştir.

Cylindrocladium floridanum’dan elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü

26 kDa, 28 kDa, 29 kDa ve 36 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde

alerjen olarak tanımlanmış olan [Alt a 13 (26 kDa) Glutation-S-transferaz], [Cla h 8

(28 kDa) Mannitol dehyirojenaz], [Alt a 8 (29kDa) Mannitol dehidrojenaz] ve [Pen ch

35 (36.5 kDa) Transaldolaz] proteinlerden biri olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride

Cylindrocladium floridanum için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında

yarar sağlayacağı düşünülmektedir.

Atmosfer çalışmalarında sık rastlanan ve major alerjenlerden olan Penicillium cinsine

ait bir tür çalışılmıştır. Çalışılan tür; Penicillium chrysogenum’dan SDS-page yöntemi

ile 20 protein bandı elde edilmiştir. Elde edilen protein bantları; 106 kDa, 100 kDa, 97


kDa, 32 kDa, 24 kDa, 20 kDa, 14 kDa, 12 kDa, 11 kDa ve 10 kDa’dur (Şekil 4.18).

61

Penicillium chrysogenum için literatürde tanımlanmış alerjen bantlar: Pen ch 33 (16

kDa) Calreticulin (http://fermi.utmb.edu/cgibin/SDAP/sdap_02?dB_Type=0&allid=

1259, 2012), Pen ch 18 (32 kDa) vakuolar serin proteaz, Pen ch 13 (34 kDa) alkaline

serin proteaz (Shen vd. 1999), Pen ch 35 (36.5 kDa) Transaldolaz (www.allergen.org

2012) Pen ch 20 (68 kDa) N-acetil glukozaminidaz (Shen vd. 1995) Bu tezde

Penicillium chrysogenum’dan literatürde tanımlanmış 5 protein bandından 2’si elde


Penicillium chrysogenum’dan elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine

göre Acremonium kiliense ile aralarında 4 (85 kDa, 61 kDa, 24 kDa, 20 kDa)

Alternaria alternata ile 4 (11 kDa, 14 kDa, 41 kDa, 61 kDa), Aspergillus flavipes ile

aralarında 1 (24 kDa), Aspergillus oryzae ile 2 (24 kDa, 97 kDa), Cladosporium

herbarum ile ile 10 (10 kDa, 11 kDa, 14 kDa, 33 kDa, 41 kDa, 61 kDa, 78 kDa, 82 kDa,

85 kDa, 89 kDa), Cladosporium obtectum ile 2 (24 kDa, 89 kDa), Cylindrocladium

floridanum ile 2 (20 kDa, 24 kDa) ortak bantları olduğu belirlenmiştir.

Penicillium chrysogenum’dan elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 11

kDa, 57 kDa, ve 100 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde alerjen olarak

tanımlanmış olan [Alt a 5 (11 kDa) Ribosomal protein P2 ve Cla h 5(11 kDa) Acid

ribosomal protein P2], [Alt a 4 (57 kDa) Disulfit isomeraz] ve [Asp n 25 (66-100 kDa)

3 fitaz B] ve proteinlerden biri olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride Penicillium

chrysogenum için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar sağlayacağı


Tüm örneklerin özütleme işleminden sonra, total protein miktarlarını belirlenmek için

spektrofotometrede ölçümleri yapılmıştır. Spektrofotometrede total protein miktarları

Acremonium kiliense’den 7.99 mg/ml, Alternaria alternata’dan 3.78 mg/ml, Aspergillus

niger’den 5.51 mg/ml, Aspergillus flavipes’den 26.17 mg/ml, Aspergillus oryzae’den

16.43 mg/ml, Cladosporium herbarum’dan 17.82 mg/ml, Cladosporium obtectum’dan

29.47 mg/ml, Cylindrocladium floridanum’dan 14.52 mg/ml ve Penicillium

chrysogenum’dan 24.71 mg/ml olarak ölçülmüştür (Şekil 5.1).

Şekil 5.1 Çalışmada kullanılan örneklerin özmiktarları

Özütleme işleminden sonra elde edilen verilere göre en yüksek total protein miktarının

Cladosporium obtectum (29.47 mg/ml) ve en düşük total protein miktarının ise

Alternaria alternata’dan (3.78 mg/ml) olduğu

Alternaria alternata’dan elde edilen total protein miktarının düşük olmasına rağmen

aeroalerjen fungusların en başında gelmesinin en büyük nedeninin, atmosferde çok

yaygın olarak bulunması ve diğer mikrofunguslara göre daha fazla farklı pr

sahip olması düşünülmektedir.

Çalışmada kullanılan örneklerden

büyüklükleri Laemmli (1970)’e göre

programı kullanılarak taksonlar arasında kümeleme analizi

0

5

10

15

20

25

30

To

tal

pro

tein

mik

tarı

(m

g/m

l)

62

Çalışmada kullanılan örneklerin özütleme işlemi sonucu total protein



Alternaria alternata’dan (3.78 mg/ml) olduğu belirlenmiştir.



yaygın olarak bulunması ve diğer mikrofunguslara göre daha fazla farklı pr

sahip olması düşünülmektedir.

Çalışmada kullanılan örneklerden SDS-page sonucu elde edilen bantların, molekül

Laemmli (1970)’e göre hesaplanmış ve elde edilen veriler MVSP

programı kullanılarak taksonlar arasında kümeleme analizi yapılmıştır

ütleme işlemi sonucu total protein





yaygın olarak bulunması ve diğer mikrofunguslara göre daha fazla farklı proteinlere

sonucu elde edilen bantların, molekül

hesaplanmış ve elde edilen veriler MVSP

yapılmıştır.

63

Elektroforez sonucu ayrılan protein bantlarının moleküler ağırlığı, elektroforez

markerları kullanılarak hesaplandıktan sonra, bantlar molekül ağırlığı ve pattern

özellikleri göz önüne alınarak eşleştirilmiştir. Daha sonra farklı olarak belirlenen her

bant için örnekler “1” ve “0” olarak skorlanmıştır. Elde edilen tablo uzaklık

hesaplanması için kullanılmıştır. Uzaklık hesaplanması için ikili (binary) veriler için en

çok kullanılan yöntemlerden biri olan Jaccards'ın katsayısı göz önünde tutulmuştur. Son

aşamada ise MVSP istatistik programı kullanılarak elde edilen matriksin kümeleme

analizi UPGMA (Ağırlıklı Olmayan Çiftleştirilmiş Grup Metodu Aritmetik Ortalaması)

yöntemine göre yapılarak dendrogram hazırlanmıştır (Şekil 4.1 a).

Ayrıca yapılan çalışmayı karşıllaştırmak amacıyla örneklerin taksonomik

sınıflandırmasına da aynı metod uygulanmış ve elde edilen veriler ile de dendrogram

hazırlanmıştır (Şekil 4.1 b).

Dendrogramlar karşılaştırıldığında protein profilleri verilerine göre hazırlanan

dendrogramın Aspergillus flavipes ile Aspergillus oryzae arasındaki beklenen sonucu

verdiği ancak aynı cins üyelerinden Aspergillus niger’in beklenenden uzak olduğu

görülmektedir. Bunun sebebinin ise Aspergillus niger’den diğer türlere nazaran protein

eldesinin çok daha zor olduğu, özellikle jel üzerinde koyu bir görüntü oluşturması

nedeniyle protein bantlarının yeterince elde edilemediği düşünülmektedir.

Ancak majör alerjen taksonların bir kümelenme oluşturmasında, bu türlerin arasındaki

ortak proteinlerin diğerlerine oranla daha fazla olması ve muhtemel ortak alerjenlerin

etkisinin olduğu düşünülmektedir.

Bu çalışmadan elde edilen verilerin, ileride yapılması muhtemel olan yeni alerjenlerin

tanımlanmasında, taksonlar arsında ortak alerjenlerin tanımlanmasında ve bu

taksonların atmosferdeki yoğunluklarının atmosferde olası alerjen protein miktarlarının

hesaplanmasında yararlı olacağı düşünülmektedir.

64

KAYNAKLAR

Anonymous. 2012 http://www.allergen.org/. Erişim Tarihi: 10.07.2012

Anonymous. 2012 http://www.aiha.org/governmentaffairs-pr/htm1/mold-glossary.htm. Erişim Tarihi: 11.07.2012

Anonymous.2012 http://fermi.utmb.edu/cgibin/SDAP/sdap_02?dB_Type=0&allid= 1259 . Erişim Tarihi: 09.08.2012

Anonymous. 2012 http://fermi.utmb.edu/cgi bin/SDAP/sdap_02?dB_Type=0&allid= 171. Erişim Tarihi: 09.08.2012

Anonymous. 2012 http://www.kovcomp.co.uk/mvsp/mvsp3fea.html Erişim Tarihi: 14.08.2012

Anonymous. 2012 http://www.moldunit.com/acremonium.html Erişim Tarihi: 14.08.2012

Anonymous. 2012 http://www.mun.ca/biology/ dmarshall/ nd-1000-users-manual.pdf Erişim Tarihi: 23.08.2012

Achatz, G., Oberkofler, H., Lechenauer, E., Simon, B., Unger, A., Kandler, D., Ebner, C., Prillinger, H., Kraft, D. and Breitenbach, M., 1995. Molecular cloning of majör and minor allergens of Alternaria alternata and Cladosporium herbarum. Mol Immunol, Vol. 32(3); pp.213–227.

Alexopoulos, C.J. and Mims, C.W. 1979. Intro-ductory mycology. John Wiley and Sons, 632p., NewYork.

Al-Swaini, A.S., Hasnain, S.M. and Bahkali, A.H. 1999. Viable airborne fungi in Riyadh, Saudi Arabia, Aerobiologia, Vol. (15); pp.121-130

Al-Subai, A., 2002. Air-borne fungi at Doha, Qatar. Aerobiologia,Vol. 18(3-4); pp.175-183

Ayberkin, E. ve Çiftçi, E. 2009. Çocuklarda Aspergillus Enfeksiyonları. Çocuk Enfeksiyonları Dergisi, Vol.3(3);pp.118-25

Balkan, B. 2008. Katı Substrat Fermentasyonu ile Ham Nişastayı Parçalayan Yeni Bir Fungal Amilaz Üretimi Saflaştırılması ve Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi. Trakya Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 77 s. Edirne.

Barron, G.L. 1983. The genera of Hyphomycetes from soil. Robert E. Krieger Pubishin Company, 364 p., Malabar, Florida.

Başbülbül, Özdemir, G., Bıyık, H., Kalyoncu, F., Kalmış, E. ve Oryaşın, E. 2011. Aydın, İzmir ve Manisa illerinde Endüstriyel Atıksular ile Kirlenmiş Toprakların Mikrofungus Florasının Belirlenmesi. Ekoloji, Cilt 20(80); s.66-73.

Baur, X., Melching-Kollmuss, S., Koops, F., Strassburger, K. and Zober, A. 2002. IgE

mediated allergy to phytase -- a new animal feed additive. Allergy, Vol. 57(10);pp.943-5

Bavbek, S., Erkekol, F.Ö., Çeter, T., Mungan, D., Özer, F., Pınar, N.M ve Mısırlıgil, Z. 2006. Sensitization to Alternaria and Cladosporium in patients with respiratory allergy and outdoor counts of mold spores in Ankara atmosphere. Turkey Journal of Asthma, Vol.43(6);pp.421-6.

65

Benndorf, D., Muller, A., Bock, K., Manuwald, O., Herbarth, O., Vonbergen, M. 2008. Identification of spore allergens from the indoor mould Aspergillus versicolor. Allergy Vol.63(4);pp.454-60.

Blackwell, M., Vilgalys, R., James, T.Y. ve Taylor, J.W. 2009. Fungi. Eumycota: mushrooms, sac fungi, yeast, molds, rusts, smuts, etc. Tree of Life Web Project. Retrieved, http://tolweb.org/Fungi/2377.

Breitenbach, M., Simon-Nobbe, B. 2002. The Allergens of Cladosporium herbarum and Alternaria alternata. Chem Immunol, (81);pp.48–72

Chazalet, V., Debeaupuıs, J. P., Sarfatı, J., Lortholary, J., Rıbaud, P., Shah, P., Cornet, M., Vu Thien, H., Gluckman, E., Brücker, G. and Latgé, JP. 1998. Molecular typing of environmental and patient isolates of Aspergillus fumigatus from various hospital settings. J Clin Microbiology, Vol.36(6);pp.1494-500.

Czapek, F. 1902-1903. Untersuchungen über die Stickstoffgewinnung und Eiweiß bildung der Pflanzen Beitr. Chem. Physiol. u. Pahtol, Vol.(1); pp.540-560, Vol.(3); pp.47-66.

Çeter, T., Alan, Ş., Pınar, N.M. and Altıntaş, D.U., Airborne spore concentration in Adana Turkey, 2004. 2006. The 8th International Congress on Aerobiology, p.211, Neuchatel, Switzerland.

Çeter,T. 2004. Ankara havasında bulunan fungus sporlarının cinsleri ve bunların meteorolojik faktörlerle değişimi (2003-2004). Yüksek lisans tezi. Ankara Üniversitesi, 134 s., Ankara.

Çeter, T. 2008. Kastamonu ili (Merkez) atmosferi polen ve sporları ve bunların meteorolojik faktörlerle değişimi Ocak 2006-Aralık 2007. Doktora tezi. Ankara Üniversitesi, 279 s., Ankara.

Çeter, T. ve Pınar, N.M. 2009 a. Ankara atmosferi mantar sporları konsantrasyonu ve meteorolojik faktörlerin etkisi (2003 Yılı). Mikrobiyoloji Bülteni, Cilt (43); s.627-638.

Çeter, T. ve Pınar, N.M. 2009 b. Türkiye’de yapılan atmosferik fungus spor çalışmaları ve kullanılan yöntemler. Asthma Allergy Immunol, (7);3-10.

De Vouge, M.W., Thaker, A.J., Zhang, L., Muradia, G., Rode, H. and Vijay, H.M. 1998. Molecular cloning of IgE-binding fragments of Alternaria alternata allergens. Int Arch Allergy Immunol, (116); pp.261–268

Domsch, K.H., Gams, W. and Anderson, T.H., 1980. Compendium of soil fungi. Academic press., 377s., London.

El-Kazzaz, M.K., El-Fadly, G.B., Hassan, M.A.A., and El-Kot, G.A.N. 2008. Identification of some Fusarium spp. using molecular biology techniques. Egypt journal of phytopathology, Vol. 36(1-2); pp.57-69

Ellis, M.B., 1971. Dematiaceous Hyphomycetes. Comman Wealth Mycological Institue, 608p., UK.

Erbakan, N., 1994. Saprofit mantarlar ve hastalıkları. Grafik Sanatlar ve Matbaacılık A. Ş., 241s., Ankara.

Erkan, M.L., Çeter, T., Atıcı, A.G., Özkaya, Ş., Alan, Ş., Tuna, S. ve Pınar, N.M. 2006. Samsun ilinin polen ve spor takvimi. XIV. Ulusal Allerji ve Klinik İmmünoloji Kongresi, Side, Antalya. .

66

Gelişken, R. 2008. Adana’daki Ev İçi Mantarlardan Protein Ekstraktlarının Hazırlanması ve Alerjik Taramada Yararlanılan Deri Testinde Kullanılabilirliği. Yüksek Lisans tezi. ÇukurovaÜniversitesi, 103 s., Adana.

Gupta, R., Sing, B.P., Sridhara, S., Kumar, R. and Arora, N. 2002. Identification of cros reactive proteins amongst different Curvularia species. Internatianol Archives of Allergy and Immunlogy, Vol. 127(1); pp.38 -46

Hasenekoğlu, İ., 1991. Toprak Mikrofungusları. Atatürk Üniversitesi Yayınları, 7 Cilt Erzurum.

Hibbett, D.S., Binder, M., Bischoff, J.F., Blackwell, M., Cannon, P.F., Eriksson, O.E., Huhndorf, S., James, T., Kirk, P.M., Lücking, R., Lumbsch, H.T., Lutzoni, F., Matheny, P.B., Mclaughlin, D.J., Powell, M.J., Redhead, S., Schoch, C.L., Spatafora, J.W., Stalpers, J.A., Vilgalys, R., Aime, M.C., Aptroot, A., Bauer, R., Begerow, D., Benny, G.L., Castlebury, L.A., Crous, P.W., Dai, Y.-C., Gams, W., Geiser, D.M., Griffith, G.W., Gueidan, C., Hawksworth, D.L., Hestmark, G., Hosaka, K., Humber, R.A., Hyde, K.D., Ironside, J.E., Kõljalg, U., Kurtzman, C.P., Larsson, K.-H., Lichtwardt, R., Longcore, J., Miadlikowska, J., Miller, A., Moncalvo, J.-M., MozleyStandridge, S., Oberwinkler, F., Parmasto, E., Reeb, V., Rogers, J.D., Roux, C., Ryvarden, L., Sampaio, J.P., Schüßler, A., Sugiyama, J., Thorn, R.G., Tibell, L., Untereiner, W.A., Walker, C., Wang, Z., Weir, A., Weiss, M., White, M.M., Winka, K., Yao, Y.-J. and Zhang, N. 2007 A higher-level phylogenetic classification of the Fungi. Mycology Research Vol. (111) ; pp.509-547.

Hosphental, D. R., Kwon-Chuang, K. J. and Bennett, J. E., 1998. ConcentratIons of airborne Aspergillus compared to the Incidence of İnvazive Aspergillosiss:lack of Correlation. Med Mycol, Vol.(36); pp.165–168.

İmalı, A., Koçak, M. ve Yalçınkaya, B. 2008. Çorum ili atmosferinde hava ile taşınan alerjen funguslar. 19. Ulusal Biyoloji Kongresi, p.318, Trabzon.

İmalı, A., 2005. Van (Merkez İlçe) Atmosferindeki Fungus Florası ve Mevsimsel Dağılımı. YYÜ Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora tezi, 120s., Van.

İnal, A., Karakoç, G.B., Altıntaş, D.U., Pınar, M., Çeter, T.,Yılmaz, M. and Kendirli, S.G. 2008. Effect of outdoor fungus concentrations on symptom severity of children with asthma and/or rhinitis monosensitized to molds. Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology, Vol. 26(1);pp.11-7.

Kantarcıoğlu, A. S. ve Yücel, A., 2003. Aspergillus cinsi mantarlar ve İnvazıv aspergilloz: mikoloji, patogenez, laboratuar tanımı, antifungallere direnç ve duyarlılık deneyleri. Cerrahpaşa Tıp Dergisi, Vol. (34); pp.140–157.

Kılıç, M., Altıntaş, D.U., Güneşer, Kendirli, S., Yılmaz, M., Bingöl, Karakoç ve G., İnal, A. 2008. Çocukluk Çağı Astımında İnhalan Allerjenlerin Cinsi ile Astım Şiddeti ve Prognozu Arasındaki İlişki. Astım Allerji İmmünoloji, Vol. 6(2);pp.66-73.

Kılıçoğlu, M. ve Özkoç, İ., 2008. Fungal sistematikteki moleküler gelişmeler. Anadolu Journal of Agricultural Sciences, p. 65-72.

U. K. Laemmli (1970). Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature Vol. 227;pp. 680 – 685.

67

Li, L., Li, Q., Liu, Z. and Wu, H. 2008. Immunological analysis and mass spectrometry identification of the major allergen from Cladosporium cladosporioides. Wei Sheng Yan Jiu (Journal of hygiene research), Vol. 37(1);pp.50-2.

Özmay, Aka, Y., 2007. Adana’daki ev dışı (outdoor) fungusların izolasyonu, identifikasyonu, mevsimsel dağılımı ve alerjik hastalıklarla ilişkilendirilmesi, Yüksek Lisans tezi. Çukurova Üniversitesi, 88 s., Adana.

Ökten, S.S. ve Asan, A. 2009. Hastane iç ortam havasının mikrobiyal açıdan incelenmesinin önemi. XI. Ulusal Tesisat Mühendisliği Kongresi, s.717-723, TESKON, İzmir.

Pastorino, A.C., Menezes, U.P., Marques, H.H.S., Vallada, M.G., Cappellozi, V.L., Carnide, E.M.G. and Jacob, C.M.A. 2005. Acremonium kiliense infection in a child with chronic granulomatous disease. Braz J. Infect Dis, Vol.(9);pp.529 534.

Pitt, J.I. and Hocking, A.D., 2009. Fungi and food spoilage. Third Edition. Springer, 519p., Australia.

Rao, R.P., 1965. The fungus genus Alternaria in Bombay-Maharashtra I. And II. Sydowia Vol. (18); pp.44-64, 65-85.

Raper, K.B., fennell, D.I., 1965. The genus Aspergillus. The Williams & Wilkins Comp. 686 pp., USA,

Rapp, M. 1974. Indikatorzusätze zur Keimdifferenzierung auf Würze- und Malzextrakt Agar. Milchwiss., Vol. (29);pp.341-344

Saeednejad, L., Sabokbar, A., Khosravi, A., Bayat, M. and Bakhtiari, A. 2010. Determining Protein Patterns for Three Fungus Species Aspergillus fumigatus, Asp. flavus and Asp. niger, Obtained from Outdoor Air in Iran. Global Veterinaria,Vol. 4(2); pp.130-134.

Sakiyan, N. ve Inceoğlu, Ö. 2003. Atmospheric concentrations of Cladosporium Link and Alternaria Nées spores in Ankara and the effects of meteorological factors. Turk J Bot, Cilt.(27);s.77-81.

Sander, I., Raulf-Heimsoth, M., Siethoff, C., Lohaus, C., Meyer, H.E. and Baur, X. 1998. Allergy to Aspergillus-derived enzymes in the baking industry: identification of beta xylosidase from Aspergillus niger as a new allergen (Asp n 14). J Allergy Clin Immunology, Vol. 102(2):pp.256-64.

Schneider, P.B., Denk, U., Breitenbach, M., Richter, K., Schmid-Grendelmeier, P., Nobbe, S., Himly, M., Mari, A., Ebner, C. and Simon-Nobbe, B. 2006. Alternaria alternata NADP dependent mannitol dehydrogenase is an important fungal allergen. Clin Exp Allergy, Vol. (36);pp.1513–1524.

Schuster, E., Coleman, N. D., Frısvad, J. C. and Dıjck, P.W.M., 2002. On The Safety of Aspergillus niger-A Review. Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol.(59);pp.426–435.

Sen, B., Asan, A. 2001. Airborne fungi in vegetable growing areas of Edirne, Turkey. Aerobiologia, (17); 69-75.

Shen, H.D., Liaw, S.F., Lin, W.L., Ro, L.H., Yang, H.L. and Han, S.H. 1995. Molecular cloning of cDNA coding for the 68 kDa allergen of Penicillium notatum using MoAbs. Clin Exp Allergy, Vol.(25);pp.350–356.

Shen, H.D., Lin, W.L.,Tam, M.F., Wang, S.R., Tzean, S.S., Huang, M.H. and Han, S.H. 1999. Characterization of allergens from Penicillium oxalicum and P. Notatum

68

by immunoblotting and N-terminal amino acid sequence analysis. Clin Exp Allergy, Vol.(29);pp.642–651.

Shen, H.D., Tam, M.F., Chou, H. and Han, S.H. 1999. The importance of serine proteinases as aeroallergens associated with asthma.Int Arch Allergy Immunology, Vol.119(4);pp.259-64.

Simon-Nobbe, B., Denk, U., Schneider, P.B., Radauer, C., Teige, M., Crameri, R., Hawranek, T., Lang, R., Richter, K., Schmid-Grendelmeier, P., Nobbe, S., Hartl, A. and Breitenbach, M. 2006. NADP-dependent mannitol dehydrogenase, a major allergen of Cladosporium herbarum. J Biol Chemistry, Vol. (281): pp.16354-16360.

Temizkan, G. ve Arda, N. 2004. Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler. Nobel tıp kitabevleri, 345s., İstanbul.

Von, J.A. 1981. The genera of fungi sporulating in pure culture. 3rd Ed. J. Cramer. 424p., Vaduz.

Ward, M.D.W., Chung, Y.J., Copeland, L.B. and Doerfler, D.L. 2010. A comparison of the allergic responses induced by Penicillium chrysogenum and house dust mite extracts in a mouse model. Indoor Air, Vol. (20); pp.380–391.

Wuethrich, B. 1989. Epidemiology of allergic diseases: Are they really on the increase. Int. Arch. Allergy Appl. Immunology, Vol.(90); pp.3-10.

Zihnioğlu, F. 1996. Protein saflaştırması ve karakterizasyonu elektroforetik yöntemler, Biyokimya lisansüstü yaz okulu 150s., Çeşme, İzmir.

69

ÖZGEÇMİŞ

ADI/SOYADI : Burhanettin YALÇINKAYA

Doğum Yeri : Muş

Doğum Tarihi : 25Ocak 1986

Medeni Hali : Evli

Yabancı Dili : İngilizce

Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)

Lise :Gemlik Celal Bayar Anadolu Lisesi, 2003

Lisans :Gazi Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, 2004-2008

Çalıştığı Kurumlar ve Yıl

TÜBİTAK – Ulusal Metroloji Enstitüsü (UME) 2011 –

MEB-Sakarya İl Milli Eğitim Müdürlüğü 2010-2011

ankara Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ yÜksek...

Documents