análisis de la alteración de proteínas en soluciones
TRANSCRIPT
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIA
APLICADA Y TECNOLOGÍA AVANZADA
UNIDAD QUERÉTARO
MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA AVANZADA
Análisis de la alteración de proteínas en soluciones lubricantes
utilizadas en pruebas tribológicas de materiales para prótesis
de rodilla
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA
PRESENTA
Lic. Gloria Isabel Girón de la Cruz
DIRECTORES
Dra. Marlenne Gómez Ramírez
Dr. José Dolores Oscar Barceinas Sánchez
Santiago de Querétaro, Querétaro, México.
Página 1 de 1
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL SECRETARIA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
ACTA DE REGISTRO DE TEMA DE TESIS Y DESIGNACIÓN DE DIRECTOR DE TESIS
Ciudad de México, a 21 de junio del 2021
El Colegio de Profesores de Posgrado de CICATA Unidad Querétaro en su Sesión extraordinaria No. 210618 celebrada el día 18 del mes junio de 2021, conoció la solicitud presentada por el alumno:
Número de registro:
del Programa Académico de Posgrado:
Referente al registro de su tema de tesis; acordando lo siguiente:
1.- Se designa al aspirante el tema de tesis titulado:
Objetivo general del trabajo de tesis:
2.- Se designa como Directores de Tesis a los profesores:
Director: 2° Director:
No aplica:
3.- El Trabajo de investigación base para el desarrollo de la tesis será elaborado por el alumno en:
que cuenta con los recursos e infraestructura necesarios.
4.- El interesado deberá asistir a los seminarios desarrollados en el área de adscripción del trabajo desde la fecha en que se suscribe la presente, hasta la aprobación de la versión completa de la tesis por parte de la Comisión Revisora correspondiente.
Director de Tesis 2° Director de Tesis
Dra. Marlenne Gómez Ramírez Dr. José Dolores Oscar Barceinas Sánchez
Aspirante Presidente del Colegio
Gloria Isabel Girón de la Cruz Dr. Juan Bautista Hurtado Ramos
Apellido Paterno: Girón Apellido
Materno: de la Cruz Nombre (s): Gloria Isabel
A 1 9 0 7 5 3
SIP-13REP 2017
Análisis de la alteración de proteínas en soluciones lubricantes utilizadas en pruebas tribológicas de materiales para prótesis de rodilla.
Maestría en Tecnología Avanzada
Analizar la alteración causada en las proteínas contenidas en cuatro soluciones lubricantes a base de ASB o SFB nativos y desnaturalizados, después de ser sometidas apruebas en un tribómetro de bola en disco bajo diferentes parámetros tribológicos.
Dra. Marlenne Gómez Ramírez Dr. José Dolores Oscar Barceinas Sánchez
CICATA-Unidad Queretaro
esidente e e e e ee eeee eee dededddeddedededdedddel CoCoCoCoCoCoooooooCoooCoCoCooCoooCoCoCCooooCCCooooCoCCCoooCoCoCoCooCoCooCCCCoooCoooooCCCCCooolelelllelellelelleleleeeleeeeeeleeeeeeeeeeeeeeeeeeleleeeelleeeeeegigiggggggigggggggggggigggiggggggggggggggggggggggggg o
Bauuuuuuuuuuuutista HuHHuHuHuuHuHuHuuuuHHuHuHuuHuHuHuHHuHuHHuHuHuHuHuHHHHHHHuHuHuuuuuuuuuHuHuHuuuuHuuHHuuHuHHuuuuuuuuuHHuuuHHHuuuHurrttrtrttrtrtrttrtttrtrtrtrtrtrttrtrtrrtrrttttrtrrtrtrtrtrrtrrtrttrtrrtrtrrttrtrrrtrrrrttrttadadadadadadadaddadadadaddadddaddadadadadadadadadaadaadadadaddadadaadaaddddddadaddadadaddadaddaaaaddddddaddddadadddddda o oooooooooo ooooooo oooooooooooooo oooooooooooooooooo RaRRaRaRaRaRaaRaRaRRRRRaRRRRaRRaRaRaRaRaRaRaRaRaRaRaRRaRaRaRaRRRRaRaRaRRRRaRRaRaRaRaRaRRaRRRaRRaRaRRRRaRaRRRRRaaaRaRRRRaRRRRRRaaaaRammmmmommmmmmmmmmm s
Página 1 de 1
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
ACTA DE REVISIÓN DE TESIS En la Ciudad de siendo las horas del día del mes de
del se reunieron los miembros de la Comisión Revisora de la Tesis, designada por el Colegio de Profesores de Posgrado de: para examinar la tesis titulada:
del (la) alumno (a):
Número de registro: Aspirante del Programa Académico de Posgrado: Una vez que se realizó un análisis de similitud de texto, utilizando el software antiplagio, se encontró que el trabajo de tesis tiene __11__ % de similitud. Se adjunta reporte de software utilizado. Después que esta Comisión revisó exhaustivamente el contenido, estructura, intención y ubicación de los textos de la tesis identificados como coincidentes con otros documentos, concluyó que en el presente trabajo SI NO SE CONSTITUYE UN POSIBLE PLAGIO. JUSTIFICACIÓN DE LA CONCLUSIÓN: ((Por ejemplo, el % de similitud se localiza en metodologías adecuadamente referidas a fuente original) El documento en cada criterio a avaluar por el software anti-plagio Turnitin Similarity presenta menos del 1 % de coincidencia en cada rubro. En la parte de resultados y discusión NO se hallaron coincidencias, por lo que habla de la originalidad del trabajo, lo mismo en la parte de conclusiones no se hallaron coincidencias___ **Es responsabilidad del alumno como autor de la tesis la verificación antiplagio, y del Director o Directores de tesis el análisis del % de similitud para establecer el riesgo o la existencia de un posible plagio. Finalmente y posterior a la lectura, revisión individual, así como el análisis e intercambio de opiniones, los miembros de la Comisión manifestaron APROBAR SUSPENDER NO APROBAR la tesis por UNANIMIDAD o MAYORÍA en virtud de los motivos siguientes: ____Satisface los requerimientos de las disposiciones vigentes.______________________________ __________________________________________________________________________________
COMISIÓN REVISORA DE TESIS
Director de Tesis Dra. Marlenne Gómez Ramírez
Dr. Adrián Luis García García
Dr. Pedro Alberto Vázquez Landaverde
2° Director de Tesis (en su caso)
Dr. José Dolores Oscar Barceinas Sánchez
Dr. Iván Domínguez López
Dr. Juan Bautista Hurtado Ramos
PRESIDENTE DEL COLEGIO DE PROFESORES
Apellido Paterno:
Girón Apellido Materno:
de la Cruz Nombre (s): Gloria Isabel
A 1 9 0 7 5 3
SIP-14 REP 2017
Querétaro 10:05 11
2021 CICATA Qro del IPN
Análisis de la alteración de proteínas en soluciones lubricantes utilizadas en pruebas tribológicas de materiales para prótesis de rodilla
Maestría en Tecnología Avanzada
X
Junio
X
X
Dr Adrián Luis García García
. Juan ananaananaaaaaaann Bautisssssssssssssssssssssta ttatatatatatttaataaatatatatatattatatatatatatattatataa tataaaataaattttaaaaa HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHurtuuurturturturturtrturtrtrturtrtttuurturturturttttturturtuururtrtrtrtturturtrrturtturturtrtu tururturrttttrr adoadadoadoadoadoadoadoadoadodadoadoadodoadodddddodadododdadoaddddadoadoadoadddddadodadodaaaadodoadooadoadadoaaaaddaaaddddoadooo RaRRRRRRRRRRRRRRRR moSIDENTEEEEEEEEEEEEEEEEEE E DDDDDDDDDDDDDDDDDDDEL EELELEEEEELLLLLEELLLLLLLLELELLLLEELLLLL COCOLCOCOCOLOCOOCOOLLCOLCOCOLCCOCOOOOLLLLCCOOOCOLCOLOOOOOOLLLLLCC LLLLLC EGIEEEEEEEEEEEEEEEE O
PPROPPPPPPPPPPPPPPPPPPPP FESORES
edro Alberttertertttertertertereer oooooooooooo Vázzzzzázzzzzqueququequequequequqqququeqquequequeququeqqquqqququeuququeququequequeqquququequeququququeuqueququeuqqqqqqqqqqqqq z Landave
II
CARTA CESIÓN DE DERECHOS
En la Ciudad de México, D.F. el día _14_ del mes de junio del año _2021__, el (la) que
suscribe _Gloria Isabel Girón de la Cruz alumno(a) del Programa de ____Maestría en
Tecnología Avanzada, con número de registro A190753, adscrito(a) al CICATA-IPN-
QRO, manifiesto(a) que es el (la) autor(a) intelectual del presente trabajo de Tesis bajo la
dirección del (de la, de los) _Dra. Marlenne Gómez Ramírez y el Dr. José Dolores Oscar
Barceinas Sánchez y cede los derechos del trabajo titulado Análisis de la alteración de
proteínas en soluciones lubricantes utilizadas en pruebas tribológicas de materiales para
prótesis de rodilla, al Instituto Politécnico Nacional para su difusión, con fines
académicos y de investigación.
Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual, gráficas o datos
del trabajo sin el permiso expreso del (de la) autor(a) y/o director(es) del trabajo. Este
puede ser obtenido escribiendo a las siguientes direcciones [email protected] /
[email protected] Si el permiso se otorga, el usuario deberá dar el agradecimiento
correspondiente y citar la fuente del mismo.
___________________________
Gloria Isabel Girón de la Cruz
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
III
Este trabajo se realizó en las instalaciones del Centro de Investigación de Ciencia
Aplicada y Tecnología Avanzada Unidad Querétaro del Instituto Politécnico Nacional
gracias al financiamiento de la beca nacional con número 926454 otorgada por el
CONACYT y también gracias a las becas BEIFI del IPN obtenidas por el proyecto SIP
con número 20200957.
AGRADECIMIENTOS
A mi familia y amigos por su apoyo incondicional y a mis tutores por su guía oportuna.
IV
RESUMEN
Durante pruebas tribológicas de materiales biocompatibles empleados en prótesis
articulares de rodilla se emplean soluciones lubricantes, las cuales, con base en la norma
ISO 14243-3:2014, deben tener una concentración de 20 g/L de proteínas totales. Los
sueros bovinos (BSs) son los fluidos más utilizados. Este suero tiene una mayor
concentración de albúmina sérica bovina (ASB) con respecto a las globulinas (γ, α y β).
Se ha observado que estas proteínas se alteran o adsorben sobre la superficie de los
materiales, p. ej. como el polietileno de elevado peso molecular, durante pruebas
tribológicas empleando un tribómetro de bola en disco (MTM2-PCS Instruments). Por lo
tanto, el objetivo del presente estudio fue analizar la alteración de las proteínas de cuatro
soluciones lubricantes con una concentración de 20 g/L: ASB nativa y desnaturalizada y
Suero fetal bovino (SFB) nativo y desnaturalizado. Además de demostrar si hay relación
entre las diferentes soluciones lubricantes al utilizarlas en pruebas tribológicas aplicando
lo siguientes parámetros: carga aplicada (L = load) de 2 y 8 N; relación
deslizamiento/rodamiento (SRR = Slide/Roll Ratio) de 20 y 1800%; y velocidad media
(Vm = Mean Speed) de 20 y 80 mm/s. Para lo anterior, todos los ensayos fueron realizados
a 37 ºC con una duración de 6 h cada uno. Como controles, se incluyeron las soluciones
lubricantes incubadas a 37 ºC durante 6 h en su forma nativa o desnaturalizadas mediante
tratamiento térmico. Para cada solución lubricante se realizaron 8 corridas con las
respectivas combinaciones de parámetros; de igual manera, se evalúo si ocurrió una
hidrólisis o desnaturalización de las proteínas al final de cada prueba. Los resultados del
espectro UV-Vis mostraron que las proteínas contenidas en las soluciones lubricantes
sufren cambios en la distribución de sus aminoácidos aromáticos en la superficie,
cambiando su hidrofobicidad y por tanto, desencadenando un proceso de agregación de
proteínas. Además, los resultados obtenidos de la cuantificación de proteínas sugieren
que se afecta la distribución de los aminoácidos básicos exponiéndose o quedando
ocultos, lo que también provoca en algunas pruebas la formación de agregados proteicos.
En el caso de la cuantificación de grupos sulfhidrilo, ninguna de las condiciones utilizadas
provocó la ruptura de los enlaces disulfuro. Los análisis electroforéticos SDS-PAGE
mostraron que dependiendo del tipo de solución lubricante empleada ya sea en su forma
V
nativa o desnaturalizada, y de las condiciones empleadas en el tribómetro, las proteínas
presentes en algunas soluciones pueden sufrir algún grado de hidrólisis, siendo está más
evidente solo en la solución lubricante de SFB nativo bajo los parámetros tribológicos de
valores altos, 8N-1800%-80mm/s. Además, algunas mostraron cambios en su movilidad
electroforética, lo que puede atribuirse a fenómenos de agregación proteica. Con respecto
al COF, muestra que su comportamiento depende del estado de la proteína en la solución
y de los parámetros tribológicos empleados. Por lo anterior, la aportación de esta
investigación fue identificar que la hidrólisis ocurre cuando los parámetros de prueba
tienen sus valores altos. Además, se confirmó que el proceso de desnaturalización es
predominante en las soluciones que se sometieron a las diferentes condiciones de prueba
y que la agregación proteica es un mecanismo de reorganización que utilizan las proteínas
para mantener su estabilidad. Esto amplía el panorama para futuras investigaciones donde
se utilicen otras proteínas como globulinas, además de implementar diferentes buffers
para mantener la estabilidad de las proteínas y aplicar tiempos de prueba más
prolongados, así como diferentes combinaciones de parámetros tribológicos.
VI
ABSTRACT
During tribological testing of biocompatible materials used in knee joint prostheses,
lubricating solutions are used which based on the ISO 14243-3:2014 standard must have
a final concentration of 20 g/L of total proteins. Within these solutions bovine sera (BSs)
are the most used fluids for the preparation of such solutions. This serum has a higher
concentration of bovine serum albumin (BSA) with respect to globulins (γ, α and β). It
has been observed that these proteins are altered and/or adsorbed on the surface of
materials (such as high molecular weight polyethylene) during tribological tests when
using a ball-on-disk tribometer (MTM2-PCS Instruments). Therefore, the objective of the
present study was to analyze the protein alteration of four lubricant solutions at a
concentration of 20 g/L: native and denatured ASB as well as native and denatured fetal
bovine serum (FBS). In addition to demonstrate if there is a relationship between the
different lubricant solutions with the combination of tribological parameters used such
as: applied load (L) of 2 and 8 N; Slide/Roll Ratio (SRR) of 20 and 1800%; and
entrainment speed (Vm) of 20 and 80 mm/s. For the above, all the tests were carried out
at 37ºC with a duration of 6 h each; as controls, the lubricant solutions incubated in oven
at 37ºC for 6 h in their native form or denatured by heat were included. For each lubricant
solution, 8 runs were carried out with the respective combinations of parameters, and it
was also evaluated whether there was hydrolysis or denaturation of the proteins present
in the lubricant solutions at the end of each tribological test. The results of the UV-Vis
spectra showed that the proteins contained in the lubricant solutions underwent changes
in the distribution of their aromatic amino acids on the surface, changing their
hydrophobicity and thus triggering a process of protein aggregation. In addition, the
results obtained from protein quantification suggest that the distribution of basic amino
acids is affected, exposing, or hiding them, which also leads to the formation of protein
aggregates in some tests. In the case of the quantification of sulfhydryl groups, none of
the conditions used caused the disulfide bonds to break. The SDS-PAGE electrophoretic
analyses showed that depending on the type of lubricant solution used, either in its native
or denatured form, and the conditions used in the ball-on-disk tribometer, the proteins
present in some lubricant solutions may undergo some degree of hydrolysis, being more
evident only in the native SFB lubricant solution under the tribological parameters of high
VII
values: 8N-1800%-80mm/s attributed to both higher shear rate and shear force, and higher
loading. In addition, some showed changes in electrophoretic mobility in which the
attribution to protein aggregation phenomena can be suggested. With respect to COF, it
shows that its behavior depends on both the state of the protein in solution and the
tribological parameters. Therefore, the contribution generated by the development of this
project was to identify that hydrolysis occurs in conditions where the values are extreme.
In addition, it was confirmed that the denaturation process is predominant in the solutions
that were subjected to the different parameters of the tribological tests and that protein
aggregation is a reorganization mechanism used by proteins to maintain their stability
during and after the tests. This broadens the outlook for future research where other
proteins such as globulins are used in addition to implementing different buffers to
maintain protein stability and applying different test times that are longer as well as
different combinations of tribological parameters.
VIII
ÍNDICE GENERAL
RESUMEN............................................................................................................................... IV
ABSTRACT ............................................................................................................................. VI
ÍNDICE GENERAL .............................................................................................................. VIII
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................. X
ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................ XII
I. INTRODUCCIÓN ..............................................................................................................1
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA......................................................................2
1.1 Hipótesis ......................................................................................................................4
1.2 Justificación ................................................................................................................5
1.3 Objetivos .....................................................................................................................6
II. MARCO TEÓRICO .......................................................................................................7
2.1 Suero Fetal Bovino como solución lubricante ..........................................................7
2.1.1 Componentes del SFB.........................................................................................8
2.1.2 Proteínas en el SFB ........................................................................................... 10
2.1.3 Albúmina sérica bovina .................................................................................... 10
2.1.4 γ-globulina ......................................................................................................... 12
3.2 Alteración de las proteínas............................................................................................. 13
3.1.1 Técnicas utilizadas en el análisis de proteínas ................................................. 16
3.3 Pruebas tribológicas de biomateriales empleados en prótesis de rodilla .............. 18
3.4 Antecedentes sobre la participación de las proteínas en soluciones lubricantes ........ 19
IV. METODOLOGÍA .............................................................................................................. 28
4.1 Etapa 1 ...................................................................................................................... 29
4.1.1 Preparación de discos de UHMWPE............................................................... 29
4.1.2 Preparación de soluciones lubricantes ............................................................ 30
4.1.3 Pruebas tribológicas en tribómetro de bola en disco ..................................... 32
4.2 Etapa 2 ............................................................................................................................ 34
4.2.1 Espectro de absorción UV-Vis de las soluciones lubricantes empleadas en el
tribómetro de bola en disco.............................................................................................. 34
4.2.2 Determinación de la concentración de proteínas solubles, en las soluciones
lubricantes por el método de Bradford. .......................................................................... 36
4.2.3 Determinación de grupos sulfhidrilos libres por el Método de Ellman en las
soluciones lubricantes....................................................................................................... 36
4.2.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE .............................................. 37
IX
V. RESULTADOS Y ANÁLISIS ............................................................................................ 43
5.1 Resultados de Etapa 2. ................................................................................................... 43
5.1.1 Espectro de absorción UV-Vis de las soluciones lubricantes de ASB y SFB
nativas y desnaturalizadas ............................................................................................... 43
5.1.2 Cuantificación de proteínas totales en soluciones lubricantes empleadas en
pruebas tribológicas. ........................................................................................................ 58
5.1.3 Determinación de la presencia de grupos SH libres en soluciones lubricantes
sometidas al tribómetro de bola en disco. ....................................................................... 64
5.1.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE ....................................... 65
5.1.5 Coeficiente de fricción ...................................................................................... 80
VI. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 83
VII. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 92
VIII. REFERENCIAS .............................................................................................................. 93
IX. ANEXOS ............................................................................................................................ 99
9.1 ANEXO A ....................................................................................................................... 99
9.1.1 Estandarización del Espectro de absorción UV-Vis de las soluciones lubricantes
de ASB y SFB .................................................................................................................... 99
9.1.2 Estandarización de Método de Bradford (Microensayo), para la cuantificación
de proteínas ..................................................................................................................... 101
9.1.3 Estandarización de la Determinación de Grupos sulfhidrilos libres (SH) ......... 102
9.1.4 Estandarización de la concentración de proteína para SDS-PAGE .................. 104
9.2. ANEXO B .................................................................................................................... 105
9.3. ANEXO C ................................................................................................................... 109
9.3.1 Curva de calibración con el standard ASB .............................................................. 109
9.3.2 Curva de calibración con el standard L-cisteína ..................................................... 109
9.4. ANEXO D. Diagramas generales ............................................................................... 110
X
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Conformación estructural de la ASB.......................................................................... 11
Figura 2. Estructura general de la γ-globulina ........................................................................... 13
Figura 3. Los cuatro niveles de estructura organizativa de las proteínas. .................................. 14
Figura 4. Desnaturalización de las proteínas ............................................................................. 15
Figura 5. Hidrolisis proteica ...................................................................................................... 15
Figura 6. Esquema de parámetros y condiciones involucradas en una prueba en tribómetro de
bola en disco .............................................................................................................................. 18
Figura 7. Coeficiente de fricción de BSA y γ-globulina. ........................................................... 20
Figura 8. Comparación de las soluciones lubricantes ............................................................... 23
Figura 9. Concentración de proteínas en relación con el COF................................................... 25
Figura 10. Adsorción de las proteínas a dos velocidades de deslizamiento ............................... 25
Figura 11. Esquema de proteínas adsorbidas y su área de contacto ........................................... 26
Figura 12. Resultados de SDS-PAGE para solución fresca, solución tribológica y por proceso
térmico de ASB a diferentes temperaturas ................................................................................. 26
Figura 13. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio de la ASB, la
ASB escindida y el suero bovino................................................................................................ 27
Figura 14. Plano de los discos de UHMWPE ............................................................................ 29
Figura 15. Representación del desbaste y pulido de los discos de UHMWPE........................... 30
Figura 16. Horno de convección mecánica para incubar controles y desnaturalizar soluciones
lubricantes. ................................................................................................................................. 31
Figura 17. Campana de flujo laminar (Esco Class modelo AHC-40) empleada para la
preparación de las soluciones lubricantes de SFB. ..................................................................... 32
Figura 18. Características del Tribómetro de bola en disco ....................................................... 33
Figura 19. Fundamento de Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). .................... 38
Figura 20. Espectro de absorción de las soluciones lubricantes de ASB nativa. ........................ 47
Figura 21. Espectros de absorción de las soluciones lubricantes de ASB desnaturalizada ........ 50
Figura 22. Espectros de absorción de las soluciones lubricantes de SFB nativo. ...................... 54
Figura 23. Espectros de absorción de las soluciones lubricantes de SFB desnaturalizado ......... 57
Figura 24. Concentración de proteínas totales de las soluciones lubricantes de ASB nativas y
desnaturalizadas ......................................................................................................................... 61
Figura 25. Concentración de proteínas totales de las soluciones lubricantes de SFB nativo y
desnaturalizado........................................................................................................................... 63
Figura 26. Determinación de grupos sulfhidrilo libres en las soluciones lubricantes de ASB
nativa y desnaturalizada. ............................................................................................................ 64
Figura 27. Determinación de grupos sulfhidrilo libres en las soluciones lubricantes de SFB
nativo y desnaturalizado ............................................................................................................. 65
Figura 28. Perfil de proteínas de soluciones lubricantes control de ASB y SFB, todas a una
concentración de 20 μg de proteínas totales. .............................................................................. 70
Figura 29. Comparación de integridad de las proteínas entre las soluciones lubricantes de ASB
nativa y desnaturalizada en comparación con sus respectivos controles. .................................... 74
Figura 30. Comparación de integridad de las proteínas entre las soluciones de SFB nativo y
desnaturalizado con sus respectivos controles.. .......................................................................... 78
Figura 31. Coeficiente de fricción de las soluciones lubricantes de ASB nativa, sometidas a las
pruebas tribológicas en un tribómetro de bola en disco a 37ºC durante 6h. ................................ 80
Figura 32. Coeficiente de fricción de las soluciones lubricantes de ASB desnaturalizada, ....... 81
Figura 33. Coeficiente de fricción de las soluciones lubricanes de SFB nativo. ........................ 82
XI
Figura 34. Coeficiente de fricción de las soluciones lubricantes de SFB desnaturalizado. ........ 82
Figura 35. Espectro de absorción del SFB a concentraciones de 36, 20 y 2 g/L ...................... 100
Figura 36. Espectro de absorción UV-Vis de soluciones de ASB a 0.01 y 0.02 g/L. .............. 100
Figura 37. Cuantificación de proteínas totales en SFB+ASB y SFB a diferentes
concentraciones. ....................................................................................................................... 102
Figura 38. Curva tipo con el aminoácido L-cisteína utilizando una concentración de 1 a 10
mmoles/L. ................................................................................................................................ 103
Figura 39. Ruptura de enlaces disulfuro mediante BME para exposición de grupos sulfhidrilo
en las soluciones de ASB y SFB (20g/L). ................................................................................ 103
Figura 40. Estandarización de la concentración de proteína de las soluciones lubricantes ASB y
SFB, a ser analizadas por electroforesis SDS-PAGE................................................................ 104
Figura 41. Curva de concentración de ASB de 2-40 ug/mL. ................................................... 109
Figura 42. Curva de calibración de L-Cisteína de 1-10 mmoles/L .......................................... 109
Figura 49. Diagrama general de pruebas con la solución lubricante de ASB nativa y
desnaturalizada. ........................................................................................................................ 110
Figura 50. Diagrama general de pruebas tribológicas con la solución lubricante de SFB nativo y
desnaturalizado......................................................................................................................... 111
Figura 51. Diagrama general del Espectro de absorción UV-Vis. ............................................ 112
Figura 52. Diagrama general del Método de Bradford. ........................................................... 112
Figura 53. Diagrama general del Método de Ellman. .............................................................. 112
Figura 54. Diagrama general de Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). ......... 112
XII
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Composición del SFB de la marca BIOWEST ..............................................................9
Tabla 2. Características de la ASB. ........................................................................................... 11
Tabla 3. Métodos utilizados en el análisis de proteínas ............................................................. 16
Tabla 4. Modificaciones de proteínas y su correspondiente método de análisis ........................ 17
Tabla 5. Comparación de los componentes entre el suero sanguíneo humano y la solución
Ringers ....................................................................................................................................... 21
Tabla 6. Componentes de la solución lubricante sintética ......................................................... 22
Tabla 7. Soluciones lubricantes empleadas para pruebas en el tribómetro pin-on-plate ............ 24
Tabla 8. Procedimiento para desbaste y pulido de disco de UHMWPE .................................... 29
Tabla 9. Combinaciones de parámetros tribológicos empleados para las pruebas tribológicas
con cada una de las soluciones lubricantes: ASB y SFB nativos y desnaturalizados. ................. 33
Tabla 10. Valores de máxima absorción de las soluciones lubricantes de ASB nativa. ............. 46
Tabla 11. Valores de máxima absorción de las soluciones lubricantes de ASB desnaturalizadas
................................................................................................................................................... 49
Tabla 12. Valores de máxima absorción de las soluciones lubricantes del SFB nativo. ............ 53
Tabla 13. Valores de máxima absorción de las soluciones lubricantes del SFB desnaturalizado
................................................................................................................................................... 56
Tabla 14. Comparaciones múltiples de Dunnett con un control de la concentración de proteínas
totales de las soluciones lubricantes de ASB nativas y desnaturalizadas .................................... 61
Tabla 15. Comparaciones múltiples de Dunnett con un control de la concentración de proteínas
totales de las soluciones lubricantes de SFB nativo y desnaturalizado ....................................... 63
Tabla 16. Porcentaje de intensidad de la banda mayoritaria de 66.5 kDa, que corresponde a la
albumina en las soluciones control de ASB y SFB. .................................................................... 71
Tabla 17. Porcentaje de intensidad de la banda mayoritaria de 66.5 kDa en la solución
lubricante de ASB nativa ............................................................................................................ 75
Tabla 18. Porcentaje de intensidad de la banda mayoritaria de 66.5 kDa en la solución
lubricante de ASB desnaturalizada ............................................................................................. 75
Tabla 19. Porcentaje de intensidad de la banda mayoritaria de 66.5 kDa en la solución
lubricante de SFB nativo ............................................................................................................ 79
Tabla 20. Porcentaje de intensidad de la banda mayoritaria de 66.5 kDa en la solución
lubricante de SFB desnaturalizado ............................................................................................. 79
Tabla 21. Soluciones lubricantes y su concentración de proteínas............................................. 99
Tabla 22. Aleatorización de las corridas en el tribómetro de bola en disco para las soluciones
lubricantes de ASB nativa. ....................................................................................................... 105
Tabla 23. Aleatorización y preparación de pruebas tribológicas y soluciones lubricantes de ASB
desnaturalizada. ........................................................................................................................ 106
Tabla 24. Aleatorización y preparación de pruebas tribológicas y soluciones lubricantes de SFB
nativo. ...................................................................................................................................... 107
Tabla 25. Aleatorización y preparación de pruebas tribológicas y soluciones de SFB
desnaturalizado......................................................................................................................... 108
1
I. INTRODUCCIÓN
Es frecuente que los sueros bovinos sean los más utilizados para preparar soluciones que
se usan como lubricante en las pruebas tribológicas para prótesis de rodilla, los cuales
buscan reproducir la composición del líquido sinovial (Wong et al., 2013).
Las soluciones lubricantes de sueros bovinos más utilizadas son las basadas en el suero
fetal bovino (SFB); en consecuencia, se ha observado que el tipo y concentración de
proteínas contenidas en estas, tienen influencia sobre biomateriales como el polietileno
de ultra alto peso molecular (UHMWPE), utilizado en prótesis de rodilla (Garcia-Garcia
et al., 2018). Además, se ha investigado que de la composición del SFB (proteínas,
lípidos, minerales, vitaminas, hormonas, glucosa, factores de crecimiento, entre otros),
las proteínas tienen un rol importante debido a estar en mayor concentración y mostrar
interacción con los biomateriales, además de modificar la respuesta de desgaste y
coeficiente de fricción, lo que ha desencadenado el interés en profundizar en su estudio
sobre las proteínas presentes en las soluciones lubricantes y como son afectadas o
interaccionan con el biomaterial (Escorcia & Caballero, 2019; Garcia-Garcia et al., 2018).
Las proteínas presentes en el SFB son la albúmina sérica bovina (ASB) y globulinas (α,
β y γ), y se sugiere que tienen una participación individual importante en el lubricante.
Sin embargo, en pruebas tribológicas solo se han logrado realizar experimentos con
soluciones de γ-globulina o ASB, por su disponibilidad comercial (Dwivedi et al., 2017).
Se ha observado que durante las pruebas tribológicas, se muestran cambios en la respuesta
de coeficiente de fricción cuando se utilizan soluciones lubricantes que contengan
proteínas (Barceinas-Sanchez et al., 2017). Por otra parte, hay investigaciones que han
utilizado soluciones lubricantes en las que se induce químicamente, la obtención de
fragmentos de ASB mediante bromuro de cianógeno. Sus resultados sugirieren que las
soluciones con ASB fragmentada, pueden adsorberse más eficientemente en las
superficies del par tribológico que utilizaron (UHMWPE/CoCrMo) tanto en un
tribómetro "pin-on-flat” y un simulador. Además sugirieron que se obtuvo mayor
protección contra el desgaste y un aumento en la fricción, debido a que las películas de
fragmentos de proteínas interactúan de forma adhesiva con la superficie del UHMWPE
(Dwivedi et al., 2017).
Debido a lo anterior, y con la finalidad de evaluar el posible daño que puedan sufrir las
proteínas (hidrolisis o desnaturalización) al final de ensayos tribológicos, empleando un
2
tribómetro de bola en disco, se estudiaron cuatro soluciones lubricantes: ASB nativa, ASB
desnaturalizada, SFB nativo y SFB desnaturalizado a una concentración final de 20g/L
de proteínas totales. Cada solución se sometió a pruebas de 6 h a 37ºC en el tribómetro
de bola en disco (MTM2-PCS Instruments), empleando cargas de 2 N y 8 N; una relación
deslizamiento/rodamiento (SRR): 20 y 1800%; y una Velocidad media (Vm): 20 y 80
mm/s. Durante cada prueba, se obtuvieron valores del coeficiente de fricción (COF) y al
final de cada ensayo, las soluciones lubricantes fueron analizadas para observar cambios
de los aminoácidos aromáticos de las proteínas mediante barridos en el espectro de
absorción UV-Vis (200 a 800 nm); para la cuantificación del contenido de proteínas
totales por el método de Bradford; para la determinación de grupos sulfhidrilo libres por
el ensayo de Ellman y finalmente electroforesis SDS-PAGE para obtener el perfil de
proteínas, y determinar posibles cambios en la movilidad electroforética por la formación
de agregados o fragmentos de proteínas originados por la hidrólisis de proteínas
provocadas por las condiciones empleadas en cada ensayo en el tribómetro de bola en
disco. El conjunto de los análisis realizados permitió ver un panorama más amplio sobre
la posible alteración que puedan sufrir las proteínas presentes en las soluciones
lubricantes ensayadas y que fueron sujetas a diferentes parámetros tribológicos, para con
ello confirmar que el proceso de desnaturalización que en consecuencia provoca la
formación de agregados proteicos y solamente en un caso, las condiciones promovieron
la formación de cierto grado de hidrólisis.
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Actualmente son escasos los estudios enfocados en las alteraciones (hidrólisis o
desnaturalización) que puedan sufrir las proteínas presentes en soluciones lubricantes
durante pruebas las tribológicas de materiales para prótesis de rodilla. En el caso de
soluciones lubricantes, solo se han estudiado algunas basadas en las proteínas γ-globulina
y ASB o la mezcla de ambas, ya sea por la importancia de su interacción o por su
disponibilidad comercial. Sin embargo, la mayoría de los estudios reportados se basan en
el desgaste o fricción que sufre el material. Por consiguiente, el presente trabajo busca
responder las siguientes preguntas:
¿Lograrán las condiciones de las pruebas empleadas en el tribómetro de bola en disco
dañar las proteínas contenidas en las cuatro soluciones lubricantes utilizadas?
3
¿Las proteínas presentes en las soluciones lubricantes (ASB y SFB nativos y
desnaturalizados) sometidas a una misma condición, serán alteradas de la misma forma o
dependerá de la solución ensayada?
¿Se presentará el mismo daño sobre las proteínas cuando se emplee la solución lubricante
en su forma nativa o desnaturalizada?
Estas son algunas de las preguntas que la investigación aquí presentada tratará de
responder.
4
1.1 Hipótesis
Las proteínas presentes en las soluciones lubricantes podrán sufrir alteraciones
(desnaturalización o hidrólisis) dependiendo del tipo de solución lubricante y los
parámetros utilizados en el tribómetro de bola en disco.
5
1.2 Justificación
La lubricación presente en las articulaciones de rodilla es investigada debido a que puede
verse afectada por distintas enfermedades, tales como la osteoartritis, que llega a dañar
rodilla, cadera o manos. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, 40 % de
las personas mayores de 70 años sufre osteoartrosis de rodilla y 80 % de este grupo tiene
algún grado de limitación en el movimiento (Zuart-Alvarado & Martínez-Torres, 2011).
Esto ha promovido un aumento en la demanda de biomateriales que forman parte de la
prótesis de rodilla, tales como el polietileno de ultra alto peso molecular, el cual se utiliza
para dos millones de reemplazos de articulaciones a nivel mundial (Kurtz, 2011). Estas
prótesis se evalúan en simuladores y tribómetros que utilizan soluciones lubricantes como
el SFB que ha sido considerado como por presentar componentes similares al líquido
sinovial humano (Barceinas-Sanchez et al., 2017).
Esta solución lubricante a base de SFB se utiliza a una concentración de 20 g/L de acuerdo
con la ISO 14243-3:2014 (ISO, 2014), la cual contiene diferentes proteínas tales como
ASB y globulinas (α, β y γ), de las que se ha observado promueven cambios en el
coeficiente de fricción en pruebas tribológicas (Barceinas-Sanchez et al., 2017; Garcia-
Garcia et al., 2018). Sin embargo, es necesario investigar nuevos enfoques, por lo cual,
este proyecto busca determinar si las proteínas contenidas en cuatro soluciones
lubricantes a base de ASB o SFB, en su forma nativa o desnaturalizada, todas a una
concentración final de 20 g/L de proteínas totales, presentarán alteraciones como:
desnaturalización o hidrólisis, las cuales pueden evidenciarse al final de las pruebas
tribológicas, y cuyos cambios estarían relacionados con el tipo de solución lubricante y
con los parámetros tribológicos aplicados.
6
1.3 Objetivos
Objetivo general:
Analizar la alteración causada en las proteínas contenidas en cuatro soluciones lubricantes
a base de ASB o SFB nativos y desnaturalizados, después de ser sometidas a pruebas en
un tribómetro de bola en disco bajo diferentes parámetros tribológicos.
Objetivos específicos:
1) Cuantificar la concentración total de proteína soluble en las cuatro
soluciones lubricantes mediante el método de Bradford antes y después
de las pruebas tribológicas.
2) Observar el comportamiento de respuesta de las cuatro soluciones
lubricantes en el espectro de absorción UV-Vis antes y después de las
pruebas tribológicas.
3) Determinar la concentración de grupos sulfhidrilo libres presentes en
las proteínas de las cuatro soluciones lubricantes a través del ensayo
de Ellman.
4) Determinar la integridad de las proteínas de las cuatro soluciones
lubricantes por electroforesis SDS-PAGE antes y después de las
pruebas tribológicas.
7
II. MARCO TEÓRICO
2.1 Suero Fetal Bovino como solución lubricante
Las soluciones de suero bovino son utilizadas como lubricante en pruebas tribológicas de
materiales empleados en prótesis articulares de rodilla, estás deben cumplir con los
requerimientos de la norma establecida por la Organización Internacional para la
Normalización, ISO 14243-3:2014. En el apartado 5 de dicha norma, se menciona que la
solución lubricante debe ser a base de suero bovino, diluido con agua desionizada con
una concentración de proteínas totales de 20 g/L. Además, sugiere el uso de filtros de 2
μm de límite de corte. También recomienda que, para minimizar la contaminación
microbiana, se debe mantener congelado y si se considera necesario, utilizar reactivos
antimicrobianos, tales como azida de sodio (ISO, 2014). Con cada uno de estos
requerimientos, la norma busca estandarizar el uso de la solución lubricante en pruebas
tribológicas, sin embargo, de acuerdo con los indicios de investigaciones realizadas sobre
la participación de las proteínas, se necesitan establecer delimitaciones que uniformen las
soluciones (Galandáková et al., 2017).
En esta norma ISO, además de los requerimientos sobre soluciones lubricantes de suero
bovino, también se establecen los movimientos, materiales y condiciones que todo
simulador de control de desplazamiento debe cumplir. Es importante mencionar que los
requerimientos fueron establecidos para el uso de simuladores, pero que han sido
trasladados con los cálculos pertinentes a otros dispositivos como el tribómetro de bola
en disco (ISO, 2014).
No obstante, en la norma ISO no se hace mención sobre el tipo de suero bovino utilizado,
aunque exista una variabilidad con respecto a su clasificación, relacionada a la edad del
animal del cual la sangre ha sido colectada (BIOWEST & RMBIO). La clasificación del
suero bovino está de acuerdo con las pautas siguientes:
▪ Suero fetal bovino (SFB)
▪ Suero de becerro recién nacido (menor a 14 días)
▪ Suero de becerro macho (desde las 3 semanas hasta los 12 meses)
▪ Suero de becerro (desde las 3 semanas hasta los 12 meses)
▪ Suero de bovino adulto (mayor a 12 meses)
8
En cada uno de los mencionados, se miden los niveles de proteínas totales, la
concentración de IgG (γ-globulina) y la cantidad de endotoxinas ya que se ha observado
que éstas incrementan con respecto a la edad (Biowest & RMBIO).
Dentro de esta clasificación, el que se utilizó como una de las soluciones lubricante en el
presente proyecto fue el SFB. Este suero es distribuido por las empresas con una
concentración de proteínas totales de 36 g/L, entre estas se encuentran la ASB, α-
globulina, β-globulina y γ-globulina (Barceinas-Sanchez et al., 2017; Vavricka &
Beglinger, 2009). Las concentraciones séricas de globulinas son denominadas como α, β
y γ globulina basadas en el fraccionamiento electroforético de las mismas (Shenton et al.,
2015).
Con respecto a su función como solución lubricante en pruebas tribológicas, se ha
observado que al utilizar las soluciones de SFB, el comportamiento del coeficiente de
fricción (COF) es completamente diferente que cuando se usa agua como lubricante
(ausencia de proteínas). Cuando se usa agua como lubricante, el COF es más bajo que
para el SFB (Garcia-Garcia et al., 2018). Se considera que por la presencia de las
proteínas, tiene propiedades de lubricación similares al líquido sinovial (Wang et al.,
2012), lo que permite replicar aproximadamente las condiciones bajo las cuales se
encuentran sometidos los biomateriales utilizados en prótesis de rodilla, una vez
implantadas dentro del cuerpo humano. Además, en las pruebas de desgaste el SFB logra
disminuir considerablemente las partículas desprendidas del material de polietileno
debido a las proteínas presentes, pero en mayor parte a la ASB, que es la transportadora
de lípidos y minerales (Duong et al., 2012; Garcia-Garcia et al., 2018; Sava et al., 2018).
2.1.1 Componentes del SFB
El SFB se recolecta de la sangre de terneros no nacidos (fetos) en cualquier etapa de
desarrollo de los últimos dos tercios de la gestación, que se descubren accidentalmente al
sacrificar vacas preñadas. Se calcula que aproximadamente el 8% de las vacas en la línea
de sacrificio están preñadas en diferentes etapas de gestación. Cifras recientes estiman
que alrededor de 800,000 litros de SFB se producen anualmente en todo el mundo,
correspondiente a 2,000,000 de fetos bovinos, con números en aumento (Van der Valk
et al., 2018).
9
De la sangre se puede separar en una centrífuga un líquido y una fracción celular. La
fracción líquida es el plasma y la fracción celular contiene glóbulos rojos, leucocitos y
plaquetas. El plasma contiene todas las moléculas pequeñas solubles y macromoléculas
de sangre, incluida la fibrina y otras proteínas necesarias para la formación de coágulos
sanguíneos. Si se permite que la sangre o el plasma coagulen, la fase fluida que queda se
llama suero. Posteriormente, con la electroforesis o cromatografía de una alícuota de
suero se logra revelar cuatro picos correspondientes a la albúmina y las globulinas: α, β y
γ (Kotas et al., 2001).
De acuerdo con el certificado de análisis que se obtiene de diferentes proveedores, se
describen los componentes del SFB, además de los estudios de parámetros químicos,
pruebas de calidad y pruebas de eficiencia para cultivo celular. Aunado a esto, se tiene un
tiempo de caducidad de 5 años a partir de la fecha de validación. Para el presente trabajo
se consideró el emitido por el proveedor BIOWEST (Certificate of analysis, México,
USDA approved, BIOWEST, ID number: S00A620004). En el cual se reporta un pH de
7.42 además de sus componentes descritos en la Tabla 1.
Tabla 1. Composición del SFB de la marca BIOWEST (ID number: S00A620004).
Componentes Cantidad en 500 mL
Proteína total 36 g/L
Sodio 134 mMol/L
Colesterol 35 mg/100 mL
Potasio 12.1 mMol/L
Bilirubina 0.22 mg/100 mL
Cloruro 100 mMol/L
Glucosa 114 mg/100 mL
Ácido úrico 3.5 mg/100 mL
Urea 35 mg/100 mL
Calcio 13.7 mg/100 mL
Creatinina 2.5 mg/100 mL
Fósforo 9.6 mg/100 mL
Triglicéridos 63 mg/100 mL
Fosfatasa alcalina 286 IU/L
Hemoglobina 13.89 mg/100 mL
Lactato deshidrogenasa 704 IU/L
Hierro 158 >g/100 mL
SGOT 43 IU/L
SGPT 8 IU/L
Gamma GT 8 IU/L
10
2.1.2 Proteínas en el SFB
El SFB tiene una concentración de proteínas totales que tiene una variación mínima de
acuerdo con cada proveedor, en el caso de BIOWEST presenta un total de 36 g/L de
proteínas totales compuesta por: ASB (16 g/L), α-globulina (14.1 g/L), β-globulina (5.5
g/L) y γ-globulina (0.5 g/L). No obstante, solo se encuentran comercialmente disponibles
dos proteínas: la γ globulina y la ASB (BIOWEST), por lo que solo estas han sido
empleadas en pruebas tribológicas individualmente para observar su comportamiento sin
presencia del SFB. Por lo tanto, un acercamiento al estudio de soluciones conformadas
ya sea por la proteína individual o por la mezcla de ambas, es necesaria para identificar
de qué manera se ven alteradas después de cada prueba tribológica y si interactúan entre
sí, cuando ambas están presentes.
2.1.3 Albúmina sérica bovina
La ASB es la proteína más abundante en mamíferos, es una proteína multifuncional con
una extraordinaria capacidad de unión al ligando, lo que la convierte en una molécula
transportadora para una amplia gama de metabolitos, medicamentos, nutrientes, metales
y otras moléculas (Xu et al., 2013).
De la ASB se han reportado pesos moleculares entre los 65 y 69 kDa, se ha publicado
por ejemplo, pesos de 66 kDa (Quinlan et al., 2005); 66.2 y 66.4 kDa (Sigma-Aldrich,
1990); 66.3 kDa (Giancola et al., 1997); 66.5 kDa, tomado de
https://pdbj.org/emnavi/quick.php?id=pdb-3v03; y 69.3 kDa (Dwivedi et al., 2017).
Consiste en dos cadenas polipeptídicas compuestas por 583 aminoácidos conocida como
estructura primaria. Su estructura secundaria incluye conformaciones hélices, láminas β
y desorganizadas. Donde el 74.2% son hélices (70.2% hélices alfa y 4% hélices 3-10) y
el 25.8% de conformaciones desorganizadas, cada una unida por puentes de hidrógeno.
Además, tiene cambios en la dirección de la cadena por 27 giros β y un giro γ (Protein
Data Bank-PDBsum: PDB id 3v03, tomado de https://www.ebi.ac.uk/thornton-
srv/databases/. Posee una estructura terciaria (globular), estabilizada por diferentes
fuerzas tales como: atracciones electrostáticas, puentes de hidrógeno, interacciones
hidrofóbicas y puentes disulfuro. Es una proteína muy estable debido a que posee 17
enlaces disulfuro, formados por 34 residuos de Cys (cisteína) unidos entre sí por esta
unión covalente, además tiene un residuo de Cys (aminoácido 43) que está expuesto.
11
Es importante mencionar que los puentes disulfuro se unen por dos residuos de Cys cuyos
átomos de azufre están separados por menos de 3 Å por lo que los residuos adyacentes de
Cys son incapaces de puentearse entre sí porque el enlace peptídico trans, que es
altamente favorecido en el plegamiento de proteínas, no permitirá que los grupos SH se
plieguen lo suficientemente cerca entre sí para formar un enlace disulfuro. Por lo tanto,
cada uno de los residuos adyacentes de Cys debe tender un puente hacia los residuos de
Cys en otra parte de la secuencia como se ilustra en la Figura 1 PDBsum: PDB id 3v03
(Rosenoer & Oratz, 2015).
Aunado a esto, la ASB presenta diferentes características descritas en la Tabla 2.
Tabla 2. Características de la ASB (Rosenoer & Oratz, 2015).
Características Descripción
- Punto isoeléctrico en agua a 25 °C 4.7
- pH en una solución al 1% 5.2 – 7
- Incremento del índice de refracción (578 nm) × 10−3 1. 90
- Absorbancia óptica a 279nm a una concentración de 1 g/L 0.667
Figura 1. Conformación estructural de la ASB (Protein Data Bank-PDBsum: PDB id 3v03, Tomado de
https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/.
12
2.1.4 γ-globulina
La γ-globulina está compuesta en gran parte de inmunoglobulinas, que son los anticuerpos
que se unen a los patógenos invasores u otras materias extrañas (Lantto, 2002). Es una
glucoproteína presente en el plasma, sangre y suero, además se encuentra en el líquido
sinovial al ser un filtrado del suero sanguíneo (Iturriaga et al., 2018). Esta γ-globulina es
una fracción constituida por la familia de inmunoglobulinas donde la IgG representa el
90-99% pero contiene trazas de IgA, IgM, IgD e IgE (Berrrón et al., 2002).
Las moléculas de γ-globulina tienen una estructura común de cuatro cadenas peptídicas.
Esta estructura consta de dos cadenas ligeras (L) idénticas, polipéptidos con peso
molecular de aproximadamente 25,000 Da y dos cadenas pesadas (H) idénticas, más
grandes, con 50, 000 Da. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por enlaces
disulfuros, y por interacciones no covalentes como enlaces salinos, enlaces de hidrógeno
y enlaces hidrófobos, para formar un heterodímero (H-L). Interacciones no covalentes
similares y puentes disulfuro unen las dos combinaciones idénticas de cadena pesada y
ligera (H-L) entre sí para formar la estructura básica de γ-globulina de cuatro cadenas (H-
L) un dímero de dímeros (Kotas et al., 2001).
La estructura de la molécula de γ-globulina está determinada por la organización primaria,
secundaria, terciaria y cuaternaria de la proteína. La estructura primaria, está dada por la
secuencia de aminoácidos unidos por enlace peptídico, representa las regiones variables
(V) y constantes (C) de las cadenas pesadas y ligeras. La estructura secundaria se forma
con el plegado de la cadena de polipéptidos extendida hacia adelante y hacia atrás sobre
sí mismo en una hoja plisada antiparalela. Luego, las cadenas se pliegan en una estructura
terciaria de dominios globulares compactos, que se conectan a dominios vecinos mediante
continuaciones de la cadena de polipéptidos que se encuentran fuera de las láminas
plegadas. Finalmente, los dominios globulares de las cadenas de polipéptidos pesados y
ligeros adyacentes interactúan en la estructura cuaternaria, formando dominios
funcionales que permiten que la molécula se una específicamente al antígeno y, al mismo
tiempo, realice varias funciones efectoras como se ilustra en la Figura 2 (Fee et al., 2010;
Kotas et al., 2001)
13
Figura 2. Estructura general de la γ-globulina (Kotas et al., 2001).
3.2 Alteración de las proteínas
Los cuatro niveles de estructura organizativa de las proteínas constan de la disposición
lineal de los aminoácidos unidos por enlace peptídico que constituye la estructura
primaria. El plegado de partes de una cadena de polipéptidos en estructuras regulares (por
ejemplo, hélices y láminas plegadas) genera la estructura secundaria. La estructura
terciaria se refiere al plegamiento de regiones entre características secundarias para dar la
forma general de la molécula o partes de ella conocidas como dominios, con propiedades
funcionales específicas. La estructura cuaternaria resulta de la asociación de dos o más
cadenas de polipéptidos en una sola molécula de proteína polimérica (Kotas et al., 2001)
(Figura 3). Por otra parte, diferentes tipos de enlaces tales como interacciones
electrostáticas, interacciones hidrofóbicas, fuerzas de Van der Waals y enlaces de
hidrógeno entre las cadenas laterales de la proteína, mantienen el correcto plegado de la
misma y determinan la superficie, cuyas propiedades tienen un importante impacto en la
interacción entre las moléculas de la proteína y en sus funciones. Las propiedades de la
superficie de las proteínas, incluyendo la hidrofobicidad y la carga superficial, están
determinadas por los residuos de aminoácidos de la superficie. Pequeñas variaciones en
el entorno químico provocarán cambios estructurales debido a la inestabilidad en
propiedades fisicoquímicas y biológicas de las proteínas, como la temperatura, el pH, los
14
agentes desnaturalizantes, la presión, la fuerza iónica, los disolventes orgánicos, los
ultrasonidos, la radiación y el campo eléctrico (Lan et al., 2020).
Figura 3. Los cuatro niveles de estructura organizativa de las proteínas (Kotas et al., 2001).
Específicamente, las proteínas pueden sufrir alteración, la cual se debe a la
desnaturalización o la hidrólisis que se describen a continuación:
Desnaturalización: Son los cambios producidos en la estructura secundaria, terciaria o
cuaternaria pero que no afectan a la estructura primaria, estos se generan cuando el
entorno presenta modificaciones de pH, disolvente, temperatura, fuerza iónica, entre
otros. Lo que provoca que debido a su adaptabilidad la proteína adquiera una diferente
conformación en su estructura (Figura 4). Por lo que, dependiendo de las condiciones,
las proteínas asumen algunos “estados desnaturalizados” (Murray, 2009).
Por otra parte, el plegamiento de una proteína depende de los siguientes factores:
• Intrínsecos: estructura primaria, presencia de puentes disulfuro, interacciones
hidrofóbicas, interacciones electrostáticas.
• Extrínsecos: fuerza iónica, pH, polaridad del medio, temperatura, presencia de
otros compuestos.
Por lo tanto, existen agentes desnaturalizantes que desestabilizan a las proteínas, entre
estos se encuentran:
15
• Agentes físicos: calor, agitación vigorosa, exposición a la luz UV, alta presión,
radiación (compuesto radiactivo), ultrasonido, entre otros.
• Agentes químicos: pH, altas concentraciones de ácidos, ciertos solventes (etanol,
acetona, etc.), beta-mercaptoetanol, urea, sales de metales pesados, dodecil sulfato
de sodio, etc. (Lehninger et al., 2013).
Figura 4. Desnaturalización de las proteínas (Tomado de
https://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/structure/molecular_interactions/mol_int.html).
Hidrolisis: En esta reacción se introduce una molécula de agua, que rompe el enlace
peptídico para producir los aminoácidos que la constituyen. Una proteína se puede
hidrolizar, ya sea en presencia de un ácido o de una base fuerte, o bien, enzimáticamente
(Figura 5) (Lehninger et al., 2013). En el caso de la hidrólisis la proteína se fragmenta a
péptidos y/o aminoácidos dependiendo del grado de hidrólisis sufrido, perdiendo todos
los niveles de organización a decir estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria
en caso de existir.
Figura 5. Hidrolisis proteica (Tomado de https://biologydictionary.net/hydrolyze/).
16
3.1.1 Técnicas utilizadas en el análisis de proteínas
Se han desarrollado numerosos métodos para medir el contenido de proteínas. Los
principios básicos de estos métodos incluyen las determinaciones de nitrógeno, enlaces
peptídicos, aminoácidos aromáticos, capacidad de fijación de colorantes, absorción
ultravioleta de proteínas y propiedades de dispersión de la luz. Además, debe considerarse
en la selección de un método apropiado factores como: sensibilidad, exactitud, precisión,
tiempos y costo. El análisis de proteínas es necesario cuando se quiere saber: a) contenido
de proteína total b) contenido de una proteína particular en una mezcla c) contenido de
proteína durante el aislamiento y la purificación de una proteína d) Nitrógeno no proteico
e) Composición de aminoácidos. Los principios, procedimientos generales y aplicaciones
se describen a continuación para varios métodos de determinación de proteínas (Helen &
Christopher, 2017) (Tabla 3).
Tabla 3. Métodos utilizados en el análisis de proteínas (Helen & Christopher, 2017).
Método Bases químicas y sensibilidad Principio
Espectroscopía
de infrarrojo
Enlaces peptídicos
La presencia del enlace peptídico en las
proteínas provoca la absorción de radiación a
una longitud de onda específica en la región del
infrarrojo medio o cercano.
Método de
unión a
colorante
aniónico
Residuos de aminoácidos básicos
(de histidina, arginina y lisina) y los
extremos N-terminal de la proteína
Los residuos identificados reaccionan con el
colorante aniónico de ácido sulfónico para
formar un complejo insoluble. El tinte soluble
no unido se mide por absorbancia y se relaciona
con la concentración de proteínas.
Ácido
bicinconinico
Enlace peptídico y aminoácidos
específicos (cisteína, cistina,
triptófano y tirosina)
*20-2000 μg/mL
El enlace peptídico forma complejos con iones
cúpricos en condiciones alcalinas. Los iones
cuprosos son quelados por el reactivo para dar
una coloración que es medida por
espectroscopía.
Bradford Residuos que están cargados
positivamente en la proteína
*1-1500 μg/mL
Cuando Coomassie Brilliant Blue G-250 se une
a la proteína, el colorante cambia de color
rojizo a azulado, y el máximo de absorción del
colorante cambia de 465 a 595 nm (el cambio
es proporcional a la concentración de la
muestra).
Biuret Enlace peptídico
*1–10 mg/mL
El enlace peptídico forma complejos con iones
cúpricos en condiciones alcalinas para dar un
color que se cuantifica por espectroscopia.
Lowry Triptófano y tirosina
*1-1500 μg/mL
Combina la reacción de biuret con la reducción
del reactivo de fenol Folin-Ciocalteu (ácido
fosfomolibdico-fosfotungstico) por residuos de
tirosina y triptófano en las proteínas.
Absorbancia a
280 nm
Tirosina y triptófano
*0.5-2000 μg/mL
Los aminoácidos aromáticos, el triptófano y la
tirosina, hacen que las proteínas se absorban a
280 nm. La absorbancia se puede usar para
estimar el contenido de proteínas.
17
Absorbancia a
190-220 nm
Enlace peptídico
*0.5-2000 μg/mL
Los enlaces peptídicos tienen su máxima
absorción entre 190-220 nm. La absorbancia se
puede usar para estimar el contenido de
proteínas
Determinación
de grupos SH
libres
Grupos SH libres (expuestos)
Se basa en la susceptibilidad de un doble enlace
en el reactivo de Ellman ácido 5,5 0-ditiobis-2-
nitrobenzoico (DTNB) para ser reducido
químicamente por un grupo SH libre. Los
productos de reacción son un disulfuro mixto y
un ácido 5-tio-2-nitrobenzoico (TNB) de color
amarillo
Además de los métodos mencionados, hay otros métodos disponibles para el análisis de
proteínas. Debido a los niveles de organización estructural de las proteínas, estas son
susceptibles a daños como consecuencia del estrés físico o químico. Por lo tanto, las
diferentes modificaciones de la estructura de la proteína pueden estudiarse con diferentes
técnicas analíticas (Sindelar, 1995). En la Tabla 4 se muestran los métodos de análisis
correspondiente a la modificación de la proteína presente.
Tabla 4. Modificaciones de proteínas y su correspondiente método de análisis (Sindelar, 1995).
Modificación en la proteína Propiedad física
afectada
Método de análisis
-Oxidación
Cys
Disulfuro
Intercadena
Intracadena
-Met, Trp, Tyr
Hidrofobicidad
(tamaño)
Hidrofobicidad
RP-HPLC, SDS-PAGE, Cromatografía
de exclusión molecular, Espectrometría
de masas
- Hidrólisis de enlace peptídico Tamaño Cromatografía de exclusión molecular,
SDS-PAGE
-Migración de N a O
-Ser, Thr
Hidrofobicidad
Química
RP-HPLC inactivo en la reacción de
Edman
-Migración de α-carboxi a β-carboxi
-Asn, Asn
Hidrofobicidad
Química
RP-HPLC inactivo en la reacción de
Edman
-Desamidación
-Asn, Gln
Carga Cromatografía de intercambio iónico
-Acilación
- grupo α-amino, grupo ε-amino
Carga Cromatografía de intercambio iónico,
Espectrometría de masas
-Esterificación/carboxilación
-Glu, Asp, C-terminal
Carga Cromatografía de intercambio iónico,
Espectrometría de masas
Cambios en la estructura secundaria Hidrofobicidad
Tamaño
Estructura 2ria/3ria
Estructura 2ria/3ria
Agregación
Estructura 2ria/3ria y
agregación
RP-HPLC
Cromatografía de exclusión molecular
CD (dicroísmo circular)
FTIR
Dispersión de la luz
Ultracentrifugación analítica
18
3.3 Pruebas tribológicas de biomateriales empleados en prótesis de rodilla
El término tribología viene del griego y su raíz Tribos significa frotamiento por lo tanto
se define como el estudio interdisciplinario de cómo el desgaste, la fricción y la
lubricación afectan las superficies en contacto y en movimiento relativo. En el contexto
de las prótesis articulares, el diseño general de las articulaciones artificiales se ve
significativamente afectado por las propiedades tribológicas presentes en la articulación
humana (Wong et al., 2013).
Una prueba tribológica de materiales biocompatibles realizada en un tribómetro de bola
en disco, con el nombre comercial: mini máquina de tracción (MTM2), proporciona un
método de detección del material, y a menudo se usa para evaluar cuantitativamente el
rendimiento de desgaste de un material o medir el coeficiente de fricción. El cual consiste
en una bola de acero inoxidable que se carga sobre la superficie de un disco de UHMWPE
moviéndose independientemente entre sí y además se encuentran sumergidos en una
solución lubricante (Garcia-Garcia et al., 2018) . Esta prueba permite a los investigadores
simplificar, aislar y controlar ciertos parámetros y condiciones tales como: la
composición del lubricante, el acabado superficial inicial, el material de rodamiento y la
geometría. Otros factores como el ruido, las entradas y salidas, así como las respuestas se
explican en la Figura 6 (Wong et al., 2013).
Figura 6. Esquema de parámetros y condiciones involucradas en una prueba en tribómetro de bola en
disco (Wong et al. 2013).
19
Por otro lado, en las pruebas tribológicas es relevante medir el coeficiente de fricción
(COF), en donde una superficie se desliza sobre otra con una fuerza necesaria para
hacerlo. Se ha demostrado que el coeficiente de fricción del cartílago articular varía en
un rango relativamente amplio (de tan solo 0.002 a 0.5) dependiendo de la configuración
de carga (Oungoulian et al., 2016). En condiciones fisiológicas en el cartílago articular se
tiene un COF bajo, variando desde 0.002 hasta 0.01, y con un desgaste casi de cero debido
a las propiedades tribológicas especiales del cartílago y líquido sinovial (Konttinen et al.,
2005; Oungoulian et al., 2016); es decir, que se ha demostrado que el líquido sinovial
tiene un bajo coeficiente de fricción y proporciona protección contra el desgaste del
cartílago (Higaki et al., 1998; Jay, 1992).
3.4 Antecedentes sobre la participación de las proteínas en soluciones lubricantes
Se han hecho estudios donde si bien el objetivo principal no era la cuantificación de las
principales proteínas contenidas en el SFB al final de los ensayos, lograron obtener
resultados donde se muestra la participación de las proteínas en pruebas tribológicas de
biomateriales. En dicha investigación, se realizaron pruebas en un tribómetro de bola en
disco para observar el comportamiento del coeficiente de fricción a lo largo de un ciclo
de marcha completo, usando como punto de contacto una bola de acero inoxidable AISI
316L de rodamiento deslizante sobre un disco de polietileno de elevado peso molecular
(UHMWPE) lubricado con una solución de SFB a 37°C a dos concentraciones de
proteínas totales de 20g/L, establecidos por la ISO 14243-3-2014 (ISO 14243-3, n.d.) y
de 36g/L (inicial-no diluida). Lo que observaron fue que durante la fase de apoyo el
coeficiente de fricción es más bajo que durante la fase de balanceo, aunque la carga media
es mayor (efecto contrario a la teoría de lubricación), aunque se considera que no es el
único factor que se debe tomar en cuenta. Además, esta transición se inicia en el primer
plano de cambio, donde también se logra observar que cuando comienza la fase de
balanceo se da un incremento en el coeficiente de fricción, siendo mayor cuando se utiliza
la solución sin diluir (36g/L) con respecto a la solución de 20g/L. Esto podría indicar que
tiene una participación considerable la concentración de proteínas del lubricante utilizado
(Barceinas-Sanchez et al., 2017).
Otro estudio ha abordado la participación de la conformación de la albúmina con respecto
al comportamiento de adsorción sobre superficies articulares en un sistema articular
artificial que consiste en una aleación de CoCrMo deslizante sobre UHMWPE. Para el
20
ensayo implementaron procesos termales a diferentes temperaturas (55°C, 75°C y 90°) a
las cuales fue sometido la albumina, al comparar los resultados mediante electroforesis
en SDS-PAGE de la proteína de interés, no detectaron una banda de proteína adicional
para el control y las soluciones de albúmina experimentales. Concluyendo que los
procesos térmicos a los cuales fue sometida la albumina no la hidrolizaron (Fang et al.,
2009).
Si bien la albumina es la proteína más abundante en el SFB, no ha sido la única que se ha
estudiado de manera independiente. Estudios realizados por Duong et al (2012), buscaron
identificar el rol dependiente de la concentración de albumina de suero bovino y γ-
globulina con respecto a la habilidad de lubricación que poseen sobre una cabeza femoral
a base de cobalto y cromo. Se observó que el coeficiente de fricción de la cabeza femoral
cobalto-cromo disminuyó con el incremento de la concentración de la albúmina de suero
bovino de 10 a 40 mg/L y mostró diferencias significativas entre cualquiera de las
concentraciones utilizadas de albúmina. En relación con γ-globulina, el coeficiente de
fricción disminuyó con las concentraciones 2.5 y 5.0 mg/mL comparado con el grupo
control que utilizó el buffer PBS (Phosphate Buffered Saline), pero un incremento
significativo de este fue observado con una concentración de 7.5 y 12.5 mg/mL (Figura
7). Estos resultados sugieren que la fricción dada de una cabeza femoral de cobalto y
cromo es dependiente de la concentración de ambas proteínas. Al final ellos concluyen
que hay una concentración máxima de albúmina para actuar como una barrera lubricante
efectiva (40 mg/mL), mientras que la habilidad lubricante de la γ-globulina es más
efectiva en el rango de concentración fisiológica (1.0–4.2 mg) presente en el fluido
sinovial humano (Duong et al., 2012).
Figura 7. Coeficiente de fricción de BSA y γ-globulina tomado de (Duong et al., 2012).
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
Co
efi
cien
te d
e fr
icci
ón
(μ
)
Soluciones lubricantes (mg/mL)
21
Por otro lado, ya se han interesado varios investigadores en realizar diferentes fluidos
modelos que contengan de manera análoga los componentes del líquido sinovial para
estudiar la tribología de implantes articulares. Esto debido a que la composición del
líquido sinovial es específica en cada paciente, ya que hay variabilidad en concentraciones
de cada componente. Así, algunos sustitutos para el líquido sinovial humano han sido
desarrollados para estudiar el comportamiento de los diferentes materiales con los que se
elaboran estos implantes, tales como UHWMPE y aleaciones de cobalto.
Inicialmente, se utilizaba como solución lubricante o sustituto del líquido sinovial en
pruebas tribológicas el agua, la solución salina o la conocida solución Ringers, con las
cuales se pretendía probar la biocompatibilidad de ciertos materiales (Tabla 5) (Gomez-
barrena & Trebs, 2008; Kung et al., 2015).
Tabla 5. Comparación de los componentes entre el suero sanguíneo humano y la solución Ringers
(Gomez-barrena & Trebs, 2008).
Sin embargo, estas soluciones no simulaban adecuadamente o no se comportaban como
el líquido sinovial humano y normalmente resultaba en patrones de desgaste no
fisiológicos. En consecuencia, se encontraron otras soluciones lubricantes que se
aproximaban más estrechamente a las propiedades del líquido sinovial humano. Entre
estas, se encuentra el ya mencionado suero de bovino, es el que actualmente es más
utilizado, el cual puede ser suero de ternero bovino o el SFB. El suero bovino es diluido
con agua, buffers, y puede estar adicionado de antibióticos (Gomez-barrena & Trebs,
2008).
Por los motivos antes mencionados, se optó por buscar dos soluciones lubricantes para
ser utilizadas durante las pruebas tribológicas. Por ejemplo, la patente US Patent
Application Publication No. 2007/0160680, protege un lubricante artificial que contiene
suero de ternero bovino. La solución lubricante además incluye aditivos como ácido
Ion Plasma sanguíneo humano Solución Ringer
Na+ 142.0 147.2
K+ 5.0 4.0
Mg2+ 1.5 -
Ca2+ 2.5 2.2
Cl- 103.0 155.7
HCO-3 27.0 -
SO4 2- 1.0 -
SO4 2- 0.5 -
22
hialurónico y fosfolípidos, que se encuentran naturalmente en el líquido sinovial humano.
Adicionalmente, también incluye antibióticos y agentes quelantes. Otro estudio similar
que ya ha sido patentado es la patente US Patent Application Publication No.
2008/0214417 donde exponen estudios que fueron realizados con un fluido sinovial
sintético basado en suero de ternero bovino y suero de bovino neonato.
No obstante, a través de la realización de estos estudios, se han podido dar cuenta que, si
bien el suero bovino mimetiza en cierto grado al líquido sinovial, no representa las
concentraciones encontradas en el mismo. Por ejemplo, el radio de proteínas encontradas
en el líquido sinovial no corresponde adecuadamente en el suero bovino. Por ello, se
desarrolló la patente denominada Syntethic sinovial fluid compositions and methods for
making the same (Stark et al., 2014) donde se encontró que ciertas variaciones en la
concentración de los componentes de la solución lubricante simulaban más acertadamente
el comportamiento del líquido sinovial humano. En esta solución lubricante se maneja
una concentración de proteína total de 15-25 mg/mL, preferentemente 18 mg/mL. Se
respetó la proporción de las proteínas albúmina y γ-globulina encontrada en el líquido
sinovial humano (se ha reportado que están entre las siguientes relaciones: 1.7:1 y 2.3:1),
utilizando en dicha patente un rango entre 1.5:1 y 2.5:1, pero utilizaron preferentemente
una proporción 1.7:1, quedando al final su líquido sinovial sintético de la siguiente
manera (Tabla 6):
Tabla 6. Componentes de la solución lubricante sintética (Stark et al., 2014).
Albúmina
(mg/mL)
γ-globulina
(mg/mL)
Fosfolílpido
(mg/mL)
HA pH Osmolaridad
(mOsm/kg)
Intervalo de
concentraciones
6-18 4-12 0.04-0.1 2-4 7.0-7.4 280-320
Concentración
específica
12 7 0.1 2 7.1 297
*Diluido en buffer PBS
Obtuvieron resultados de la viscosidad del líquido sinovial sintético medido a diferentes
esfuerzos cortantes a 37°C (LV-DV-1 Plus Rotational Viscosimeter, con un spindle 18),
encontrando que conforme aumentaba el esfuerzo constante, la viscosidad iba
disminuyendo, mostrando un comportamiento no newtoniano.
Para observar que tan adecuada era esta solución lubricante sintética, se hicieron pruebas
en un tribómetro “Pin-on-rotating-disk” (LSRH-tribometer, Pin-Disc machine), en el cual
23
se utilizó el par tribológico: pin de cobalto y cromo (CoCr) y un disco de UHMWPE.
Probaron tres soluciones lubricantes aplicando el método de ensayo estándar para pruebas
de desgaste con un tribómetro “pin-on-disk”, obteniendo un gráfico que relaciona el
tiempo en segundos con el coeficiente de fricción (COF), mostrando que este líquido
sinovial sintético mostro una mayor estabilidad con respecto al COF comparado con el
suero bovino y el buffer PBS (Figura 8) (Stark et al., 2014).
Figura 8. Comparación de las soluciones lubricantes basada en Suero bovino, líquido sinovial sintético y
liquido sinovial fisiológico (Stark et al., 2014).
También encontraron que la conformación proteica de las soluciones lubricantes afecta
las propiedades de fricción y desgaste del UHMWPE. Los estudios mostraron que la
superficie del disco de UHMWPE al ser hidrofóbica provocó que la proteína adsorbida
se encontrara desnaturalizada, lo que desencadenó el aumento de la fricción. Sin embargo,
el efecto sobre el desgaste sugirieron que dependía de la concentración de la proteína
presente en cualquiera de las tres soluciones lubricantes, por lo tanto, la modificación de
la superficie por desgaste altera la forma en que las proteínas se adsorben en el disco de
UHMWPE (Liang, 2008; Scanzello et al., 2008).
24
La investigación demostró que la absorción de albúmina de suero bovino en el UHMWPE
tiende a aumentar el comportamiento de fricción y resistencia al corte interfacial del
UHMWPE. La razón de esto es que la superficie hidrofóbica de polietileno desnaturaliza
la proteína durante la adsorción. Entonces las proteínas desnaturalizadas ocupan una gran
superficie, con zonas hidrofóbicas sometidas a adsorción, exponiendo regiones
hidrofílicas. Esto se sabe debido a que los datos del ángulo de contacto apoyan esta idea,
e indican que una capa de proteína desnaturalizada forma una capa de alta resistencia al
corte que aumenta la respuesta de fricción (Karuppiah & Sundararajan, 2018; Liang,
2008). Pero una mayor fricción en la mayoría de los casos no necesariamente implica un
mayor desgaste y por ello se debe evaluar el comportamiento de desgaste del biomaterial
independientemente de experimentos de fricción (Liang, 2008).
Se ha reportado que la adsorción de proteínas aumenta la tasa de desgaste del UHMWPE
(Chandrasekaran & Loh, 2001). En la investigación de Widmer y colaboradores (2001),
utilizaron oxígeno de plasma para modificar la superficie del UHMWPE, y encontraron
que la superficie se volvió más hidrofílica y la modificación condujo a una adsorción de
la proteína, es decir, la proteína tiende a no desnaturalizarse cuando se adsorbe en el
plasma de oxígeno de la superficie del UHMWPE (Widmer et al., 2001).
Nečas et al., 2017, realizaron un estudio que tuvo como objetivo observar el efecto de la
película de proteína adsorbida, sobre el comportamiento de fricción del par de contacto
metal/polietileno. Utilizaron un “pin-on-plate”, el pin de CoCrMo se deslizaba contra la
placa del UHMWPE. El contacto fue lubricado por diversas soluciones de albúmina y γ-
globulina disueltas en buffer PBS. Después de la prueba de fricción, el espesor de la
película adsorbida se evaluó mediante elipsometría espectroscópica y la estructura de las
proteínas adsorbidas fue luego examinado por FT-IR. Las soluciones realizadas se
muestran en la siguiente tabla (Tabla 7):
Tabla 7. Soluciones lubricantes empleadas para pruebas en el tribómetro pin-on-plate (Nečas et al.,
2017).
Solución
lubricante
Proteína Concentración de proteínas (w/w)
1 Buffer PBS 0
2 Albumina 0.4
3 Albumina 0.7
4 Albumina 1.4
5 γ-globulina 0.4
25
6 γ-globulina 0.7
7 γ-globulina 1.4
8 Albumina + γ-globulina 0.7 + 0.7
Lo relevante surge al realizar las mediciones del COF contra la concentración de
proteínas, donde se utilizan diferentes velocidades de deslizamiento: 10 mm/s (a) and 50
mm/s (b) las cuales se observan en los siguientes gráficos (Figura 9):
Figura 9. Concentración de proteínas en relación con el COF a dos velocidades de deslizamiento, 10
mm/s (a) y 50 mm/s (b) (Nečas et al., 2017).
Se observa que a una velocidad de deslizamiento de 10 mm/s conforme aumentó la
concentración de proteínas aumentó el COF, y en mayor medida cuando se usó la mezcla
de albúmina y γ-globulina, en tanto a una velocidad de deslizamiento de 50 mm/s en las
concentraciones de albúmina presenta un mayor COF comparada con la γ-globulina y
con la solución que mezcla de albúmina y γ-globulina muestra un alto COF.
En los siguientes gráficos se mostró que tanto se adsorbió la película de proteínas formada
sobre la superficie del UHMWPE, a 10 y 50 mm/s de velocidad de deslizamiento (Figura
10).
Figura 10. Adsorción de las proteínas a dos velocidades de deslizamiento, 10 mm/s (a) and 50 mm/s (b).
(Nečas et al., 2017).
26
Observaron que a 10 mm/s de velocidad de deslizamiento, conforme aumenta la
concentración de proteínas, se adsorbe en mayor medida las proteínas, especialmente para
la mezcla de ambas proteínas (Albumina + γ-globulina). En el caso de la velocidad de
deslizamiento de 50 mm/s, observaron que la albumina se adsorbió en mayor proporción,
sin embargo para altas concentraciones de proteínas esto no fue así.
Finalmente propusieron un esquema que explica el área de contacto real que se dio entre
las asperezas de polietileno y las proteínas adsorbidas. Con baja velocidad de
deslizamiento, la mayoría de las proteínas se desnaturalizaron. Sin embargo, con alta
velocidad de deslizamiento, algunas fracciones de proteínas adsorbidas aún mantienen su
estructura secundaria y algunas proteínas forman agregados (Figura 11).
Figura 11. Esquema de proteínas adsorbidas y su área de contacto, a dos velocidades de deslizamiento,
10 mm/s (a) and 50 mm/s (b) (Nečas et al., 2017).
Con respecto al estudio específico de las proteínas, se ha abordado la participación de la
conformación de la albúmina con respecto al comportamiento de adsorción sobre
superficies articulares (CoCrMo/UHMWPE). Para el ensayo, implementaron procesos
termales con diferentes temperaturas (55°C, 75°C y 90°C) y al comparar los resultados
mediante electroforesis en SDS-PAGE de la ASB, no detectaron una banda de proteína
adicional para el control y las soluciones de ASB experimentales. Esto implica que los
procesos térmicos no hidrolizaron la molécula en una cantidad significativa (Figura 12)
(Fang et al., 2009).
Figura 12. Resultados de SDS-PAGE para solución fresca, solución tribológica y por proceso térmico de
ASB a diferentes temperaturas (Fang et al., 2009).
En otra investigación se tuvo como objetivo comparar el comportamiento tribológico del
polietileno articulado contra una aleación ortopédica de CoCrMo forjado para tres
lubricantes: ASB escindida, ASB no escindida y suero de ternera recién nacido (control).
27
Consideraron que la escisión de la ASB aumentaría la fricción y la tasa de desgaste del
UHMWPE, con una rugosidad concomitante de la superficie del polímero y la generación
de partículas de desechos de desgaste más grandes. La escisión de la ASB en los cinco
fragmentos se realizó mediante digestión con bromuro de cianógeno (Figura 13). En las
pruebas de desgaste pin-on-flat (POF) contra discos de aleación CoCrMo, la ASB
escindida condujo al menor desgaste del UHMWPE y los coeficientes de fricción más
altos, mientras que la ASB no escindida condujo a las tasas de desgaste más altas. Ellos
consideraron que los fragmentos de proteínas más pequeños pueden adsorberse de manera
más eficiente en las superficies tanto del UHMWPE como del metal, ofreciendo así una
protección contra el desgaste, al tiempo que aumentan la fricción, el tamaño de las
partículas y el alargamiento de las partículas, así como la película formada por las
proteínas. Las películas de fragmentos de proteínas interactúan adhesivamente durante el
deslizamiento. Los resultados de este estudio tienen implicaciones para la metodología
de prueba de desgaste preclínica, ya que sugieren que la concentración de ASB puede ser
más pertinente que la concentración de proteína total para la prueba de desgaste de
polietileno (Dwivedi et al., 2017).
Figura 13. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio de la ASB, la ASB
escindida y el suero bovino (Dwivedi et al., 2017).
Derivado de los antecedentes, el presente proyecto permitirá confirmar si se
desencadenan las mismas alteraciones en las proteínas contenidas en las soluciones
lubricantes de estudio, ya sea empleadas en su forma nativa o previa desnaturalización
térmica, y si la naturaleza o composición de la solución lubricante tiene algo que ver sobre
28
el daño que puedan sufrir estas al ser sometidas a los diferentes parámetros en el
tribómetro de bola en disco.
IV. METODOLOGÍA
Para tener un panorama general de la investigación realizada, se muestra un esquema de
las etapas en las que se dividió el proyecto y lo que se realizó en cada una de ellas, para
de esta forma determinar la alteración de las proteínas presentes en las soluciones
lubricantes al ser sometidas a diferentes condiciones en el tribómetro de bola en disco.
L=Carga
SRR=Relación de deslizamiento/rodamiento
Vm= Velocidad media
Ver Anexo E para diagrama del procedimiento general y de cada técnica.
Preparación de los
discos de UHMWPE
(desbaste y pulido)
Par
ámet
ros
trib
oló
gic
os
37°C
L: 2 y 8 N
SRR: 20 y 1800%
Vm: 20 y 80 mm/s
Tiempo:
6 h
AS
B ASB (nativa)
ASB (desnaturalizada)
(70°C-30 min)
SF
B
FBS (nativo)
FBS
(desnaturalizado) (70°C-
30 min)
Co
ntr
ole
s ASB y SFB
(nativo/desnaturalizado)
incubados a 37°C por 6 h
Espectro de absorción
UV-VIS en el rango
200-600 nm
Cuantificación total
de proteína soluble
(Método de Bradford)
Determinación de
grupos sulfhidrilo
libre (Ensayo de
Ellman)
Electroforesis en gel
de poliacrilamida
SDS-PAGE
ETAPA 1
Pruebas en tribómetro de
bola en disco (discos y
parámetros)
Soluciones lubricantes
(20 g/L)
ETAPA 2
Técnicas para análisis de
proteínas
Análisis e
interpretación de
resultados
29
4.1 Etapa 1
4.1.1 Preparación de discos de UHMWPE
Los discos de UHMWPE se obtuvieron de un procedimiento previo en el que se cortaron
y maquinaron de una barra de 120 y 2 pulgadas de largo y diámetro, respectivamente,
considerando el siguiente plano (Figura 14):
Figura 14. Plano de los discos de UHMWPE (Montes-Seguedo, 2017).
Después del maquinado, los discos de UHMWPE se pasaron por un proceso de desbaste
y pulido con una máquina para desbaste-pulido marca Struers hasta llegar a tener un
acabado espejo, que se observó en un microscopio de campo claro. Para lograr ese
acabado se utilizaron secuencialmente cinco lijas con tamaños de grano 200, 400, 600,
800 y 1200 grit, siguiendo los procedimientos descrito en el trabajo de tesis de Montes-
Seguedo (2017) mostrado en la Tabla 8.
Tabla 8. Procedimiento para desbaste y pulido de disco de UHMWPE empleados en los ensayos
tribológicos con las diferentes soluciones lubricantes (Montes-Seguedo, 2017).
Lija (grit) Tiempo (min) Velocidad (rpm) Carga (N)
400 15
30
400
350
30
20
600 15
30
400
300
25
20
800 20
30
250
200
20
15
30
1200 20
20
250
200
20
15
Además, se midió el espesor de los discos para comprobar que estuviera dentro de la
tolerancia permitida (6 mm ± 0.01). Posteriormente se realizó limpieza por ultrasonido
durante 20 min (Figura 15) y antes de cada prueba se limpiaron nuevamente por 10 min.
4.1.2 Preparación de soluciones lubricantes
Como soluciones lubricantes se utilizaron las siguientes: 2 con SFB (SFB nativo y SFB
desnaturalizado) y 2 con ASB (ASB nativa y ASB desnaturalizada). Cada una de estas
soluciones se llevaron a una concentración final de 20 g/L como lo indica la norma ISO
14243-3:2014. De cada solución se prepararon 45 mL, y para cada experimento, se usaron
40 mL en el tribómetro de bola en disco.
a) Preparación de las soluciones lubricantes de ASB (nativa y desnaturalizada)
Solución lubricante de ASB nativa: El polvo liofilizado de ASB disponible
comercialmente, (≥96% de pureza) se obtuvo de Sigma-Aldrich (A2153-50G). Se
disolvieron 0.9 g en 45 mL de agua destilada para obtener la concentración final de 20
g/L de proteínas. Las soluciones fueron preparadas al momento.
Solución lubricante de ASB desnaturalizada: Las soluciones ASB se prepararon
disolviendo como se indicó anteriormente. La desnaturalización térmica se realizó
Acabado
superficial final
(espejo)
(objetivo 5x)
Acabado
superficial inicial
(maquinado)
(objetivo 5x)
Figura 15. Representación del desbaste y pulido de los discos de UHMWPE.
31
incubando a 70 °C durante 30 min en un horno de convección mecánica (Figura 16) (J.
H. Park et al., 2018).
Figura 16. Horno de convección mecánica para incubar controles y desnaturalizar soluciones lubricantes.
b) Preparación de las soluciones lubricantes de SFB (nativo y desnaturalizado)
El certificado de análisis del SFB con # de catálogo S1650- ID number S00A62004, tiene
fecha de validación 05/02/2019 y fecha de caducidad 05/02/2024. Sometido a triple
filtración (filtro 0.1 μm), tiene como país de origen México y fue certificado por la USDA
(United States Department of Agriculture) (BIOWEST). La botella de SFB estéril de 500
mL se almacenó en un congelador horizontal a -20°C. Dos semanas antes del inicio de
las pruebas, se descongeló la botella de SFB el 19/02/2021, pasándolo de -20ºC a 4ºC
durante toda la noche (12 h). Posteriormente se prepararon alícuotas de 27 mL en tubos
falcon estériles bajo campana de flujo laminar, que fueron nuevamente congeladas a -
20°C hasta su uso. Antes de iniciar cada prueba se descongeló cada alícuota a utilizar
colocándola en el refrigerador a 4°C durante toda la noche previa.
Solución lubricante de SFB nativo: Las soluciones lubricantes de SFB se prepararon
asépticamente realizando una dilución 1:1.8 con agua destilada a un volumen final de 45
mL (20 mL de agua destilada más 25 mL de SFB). Teniendo una solución lubricante
estéril a una concentración final de proteínas totales de 20 g/L, como lo especifica la
norma ISO 14243-3-2014. Todas las manipulaciones se realizaron en una campana de
flujo laminar (Esco Class modelo AHC-40) (Figura 17).
32
Solución lubricante de SFB desnaturalizado: A partir de una solución de SFB nativo a
20 g/L, se realizó la desnaturalización térmica incubándolo a 70 °C durante 30 min (J.
H. Park et al., 2018).
Figura 17. Campana de flujo laminar (Esco Class modelo AHC-40) empleada para la preparación de las
soluciones lubricantes de SFB.
4.1.3 Pruebas tribológicas en tribómetro de bola en disco
Se realizaron los experimentos en el tribómetro de bola en disco (PCS Instruments,
London, UK), que usa una bola de acero inoxidable AISI 316L rodante/deslizante sobre
un disco de UHMWPE, sumergiendo en las soluciones lubricantes anteriormente
descritas a 37°C. Las características del tribómetro se muestran en la Figura 18
(Barceinas-Sanchez et al., 2017).
a) MTM2. Mini-Traction Machine b) Interior de MTM2
33
c) Esquema de la configuración experimental
Figura 18. Características del Tribómetro de bola en disco marca PCS Instruments, London, UK, (Barceinas-Sanchez et al., 2017).
Para los ensayos con cada una de las soluciones lubricantes, se aleatorizaron las pruebas
a realizar por tipo de soluciones de ASB y SFB, tanto nativas como desnaturalizadas, a la
concentración de 20 g/L, especificando los parámetros tribológicos altos y bajos de L,
SRR y Vm (L=Carga; SRR=Relación de deslizamiento/rodamiento y Vm= Velocidad
media).
Tabla 9Por cada prueba, se tomó muestra al inicio y final (tiempo 0h y 6h), limpiando
previamente el tribómetro con alcohol y agua destilada. Para cada solución lubricante se
realizaron 8 pruebas cada una con parámetros tribológicos diferentes, los cuales se
enlistan en la Tabla 9. Se realizaron un total de 32 pruebas, donde para cada una de ellas
se utilizó un disco de UHMWPE diferente y con limpieza por ultrasonido durante 10 min
antes de iniciar la corrida, y una solución lubricante preparada al momento. Como
controles se incluyeron las soluciones lubricantes ASB y SFB nativo y/o desnaturalizado,
incubados en horno a 37ºC durante 6h (tiempo que tardó cada prueba en el tribómetro de
bola en disco). En el 9.2. ANEXO B se muestran los datos de las 4 soluciones y los
parámetros aleatorizados.
Tabla 9. Combinaciones de parámetros tribológicos empleados para las pruebas tribológicas con cada
una de las soluciones lubricantes: ASB y SFB nativos y desnaturalizados.
Solu
ción
lubri
cante
Carga
L (N)
Relación de
deslizamiento/rodamiento
SRR (%)
Velocidad media
Vm (mm/s)
2 20 20
34
2 20 80
2 1800 20
2 1800 80
8 20 20
8 20 80
8 1800 20
8 1800 80
Por otra parte, la combinación de parámetros tribológicos establecidos se configuró antes
de cada inicio de las pruebas. Los datos de respuesta que se obtuvieron son los
relacionados al coeficiente de fricción a lo largo de las 6 horas de prueba. Para esto, se
estableció en la edición de pasos de perfil (Profile step editor) los siguientes valores fijos:
1. Profile type: Ball on disc (¾ ball)
2. Step type: Timed step (paso cronometrado)
3. Temperature: 37°C
4. Step duration: 6:00:00 (hh:mm:ss)
5. Logging Interval: 180 s (121 puntos)
Al final de cada prueba, 1 mL de la solución lubricante así como de los controles, se
recolectaron en tubos Eppendorff estériles de 1.5 mL. y conservados en refrigeración a
4°C para ser analizadas el mismo día mediante espectro de absorción UV-Vis (Barrido
de 200 a 600 nm), por el método de Bradford (determinación de proteínas totales) y con
el ensayo de Ellman (determinación de grupos sulfhidrilos libres). Para determinar la
integridad de las proteínas se realizaron electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-
PAGE por prueba y sus respectivos controles, para lo cual 5 mL de muestra repartidas en
alícuotas de 1 mL, fueron colocadas en tubos Eppendorf estériles de 1.5 mL y congeladas
a -20°C hasta su uso, los estudios electroforéticos fueron realizados al final de todas las
rutinas.
4.2 Etapa 2
4.2.1 Espectro de absorción UV-Vis de las soluciones lubricantes empleadas en el
tribómetro de bola en disco.
35
La espectroscopia UV-Visible se basa en la absorción de la luz de un cromóforo debido
a la transición de los electrones desde el estado de reposo a un estado excitado. La
longitud de onda de la absorción y la intensidad de la absorbancia de una molécula
dependen no sólo de la naturaleza química sino también del entorno molecular de sus
cromóforos (Schmid & Beer, 2001). Por ello, la espectroscopia de absorción es una
técnica que se emplea no sólo para cuantificar muestras de proteínas puras, sino que es
también útil para evaluar rápidamente el proceso de agregación de proteínas y péptidos,
obteniendo información significativa sobre el microambiente molecular de los residuos
aromáticos del sistema (Pignataro et al., 2020).
En el presente trabajo, para cada muestra obtenida antes y al final de los ensayos en el
tribómetro de bola en disco, se les realizó un barrido de 200 a 800 nm en un
espectrofotómetro digital ultravioleta (marca Thermo Scientific - GENESYS 10S UV-Vis),
para observar los cambios de absorbancia y desplazamientos en la longitud de onda, y así
utilizar esta información para complementar con las demás técnicas realizadas (Xu et al.,
2013). Para lo cual previamente se realizó una estandarización de las concentraciones
para que no rebasaran las 2 unidades de absorbancia al momento de realizar los barridos.
Ver ANEXO A (9.1.1 Estandarización del Espectro de absorción UV-Vis de las
soluciones lubricantes de ASB y SFB) (Skoog et al., 2008). El procedimiento utilizado
en el presente proyecto fue el siguiente:
Protocolo
1. De cada solución lubricante, se realizó una dilución 1:20 y posteriormente una 1:8,
para llegar a una concentración final de 0.125 g/L (125 μg/mL) de proteínas.
2. Se colocó en una celda de 1 cm de paso óptico y se limpió utilizando agua entre cada
lectura. Se midió solo agua como blanco para dejar el sistema en cero de absorbancia.
3. En cada barrido se configuró:
• Modo de medición: Absorbancia
• L.O. de inicio: 200 nm
• L.O. final: 800 nm
• Velocidad de barrido: media
• Intervalo: 1 nm
36
4.2.2 Determinación de la concentración de proteínas solubles, en las soluciones
lubricantes por el método de Bradford.
El método de Bradford se basa en la reacción del colorante azul de Coomassie G250 con
los residuos de aminoácidos básicos de las proteínas, cuando el colorante está en estado
aniónico (Bradford, 1976). Por lo tanto, al formar el complejo con la proteína se genera
una forma iónica azul, de la cual se estima la cantidad de proteína por la medición de la
absorbancia de la solución a 595 nm.
Para este ensayo se realizó una estandarización de la concentración de proteínas al ser
empleada para la determinación de proteinas, la cual se muestra en el ANEXO A (9.1.2
Estandarización de Método de Bradford (Microensayo). Empleando la técnica de
microensayo, que detecta entre 1 y 25 µg/mL de proteína (Bio-Rad Laboratories, 2010).
Protocolo
1. De cada muestra, se realizó una dilución 1:20 y posteriormente una 1:40 con agua
destilada hasta una concentración final de 0.025 g/L (25 μg/mL). Cada determinación se
realizó por quintuplicado.
2. Para el ensayo, se agregaron 200µL de reactivo de Bradford concentrado (marca Bio-
Rad-cat #5000006) y 800 µL de muestra diluida, para un volumen final de 1 mL, se
mezcló suavemente con un vortex durante 30 segundos, evitando la formación de espuma.
Posteriormente se colocó en una celda de 1 cm de paso óptico. Se limpió utilizando agua
destilada y etanol diluido entre cada lectura. Se midió agua para dejar el sistema en cero
de absorbancia.
4. Se midió a 595 nm las muestras tomadas al inicio y al final de cada prueba, y se restó
el blanco de reactivo (las lecturas se realizaron 10 min después de la reacción).
5.- Para conocer la concentración final de proteínas en cada muestra, se empleó una curva
de calibración de 2 a 40 μg/ml de solución estándar de ASB diluida con agua destilada
mostrada en la Figura 41 (ANEXO C)
4.2.3 Determinación de grupos sulfhidrilos libres por el Método de Ellman en las
soluciones lubricantes.
La presencia de grupos sulfhidrilos libres puede cuantificarse mediante el reactivo
cromogénico ácido 5,5’-ditiobis-(2-nitrobenzoico) (DTNB), conocido también como
37
reactivo de Ellman. El DTNB, tiene un enlace disulfuro oxidante que cuando está en
presencia de -SH libres se reduce formando un disulfuro mixto y liberando una molécula
de ácido-5-tio-2-nitrobenzoico (TNB) que es detectada a 412 nm.
Para el presente proyecto se determinó la concentración de -SH libre con el siguiente
protocolo (Protocolo desarrollado por Gold Biotechnology / FM-000008)(Ellman, 1998).
Protocolo
1. Se preparó la solución stock de DTNB (D8130-5G-Sigma-Aldrich) (≥98%) con
una solución de acetato de sodio 50 mM (Baker ACS, lote #A21C55) más DTNB
2 mM en agua grado biología molecular. El reactivo una vez preparado se
mantuvo en refrigeración.
2. Se preparó una solución Tris 1 M (marca SIGMA-T6066-500G, lote #
116K54131), se ajustó el pH a 8.0 con HCl concentrado.
3. Se elaboró una curva de calibración utilizando el estándar L-cisteína
monohidratada (Jalmek-C440503) para grupos sulfhidrilo libres con las
concentraciones de 1 a 10 mmoles/L mostrada en la Figura 42 (ANEXO C).
4. Para la reacción se realizó la siguiente mezcla, 50 μl de la solución stock DTNB,
100 μl de solución Tris y 840 μl de agua grado biología molecular. Se agregó 10
μl de la muestra (diluida a 1 g/L). Se mezcló la solución con cuidado y se colocó
en cubetas de 1 cm de paso óptico. Se limpió utilizando agua destilada entre cada
lectura.
5. Se mezcló bien y se refrigeró a 4°C durante 30 minutos.
6. Se midió la absorbancia a 412 nm.
4.2.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE
Los geles de poliacrilamida permiten la separación de las moléculas (proteínas) con base
en su peso molecular. Para lo cual, la estructura interna de la proteína debe desorganizarse
para poder ser analizada por este método, para lograr esto, previo a la carga se mezcla la
proteína con un buffer de carga que contiene SDS. Posteriormente la muestra se calienta,
lo que provoca la desnaturalización de la(s) proteína(s), donde cada una quedará con una
carga negativa a través del SDS, independientemente de su punto isoeléctrico. Las
proteínas cargadas negativamente se moverán a través del gel hacia el ánodo cuando se
aplique un campo eléctrico. Las proteínas entonces serán separadas en base a su peso
38
molecular, al terminar la electroforesis, las proteínas se harán visibles mediante una
tinción. Dado que las proteínas sólo se desplazan en una dimensión a lo largo del gel, las
muestras se cargan una al lado de la otra en los "pozos" formados en el gel. Las proteínas
serán separadas por su peso molecular en "bandas" dentro de cada "carril" formado bajo
los pocillos. Un carril se reservará para un "marcador", que es una mezcla comercial de
proteínas con pesos moleculares definidos, y que es útil para determinar el tamaño de las
proteínas de interés El fundamento de la técnica es descrito en la Figura 19 que además
muestra el peso molecular de las proteínas de interés (Hamdan & Righetti, 2005).
Figura 19. Fundamento de Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
(https://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/sds-page.html).
En este proyecto para determinar si hubo alteraciones (hidrolisis y/o desnaturalización)
en la(s) proteína(s) presentes en las soluciones lubricantes a base de SFB y ASB nativa y
desnaturalizada, al final de los ensayos en el tribómetro de bola en disco, todas las
muestras incluyendo los controles fueron analizados por electroforesis en geles de
poliacrilamida (SDS-PAGE) al 10% con el siguiente protocolo (Alamilla Martínez et al.,
2019; Laemmli, 1970; Walker, 2002).
Protocolo
1. Se prepararon volúmenes necesarios de los siguientes buffers y soluciones:
a) 1.5 M Tris-base, pH 8.8 (almacenamiento en refrigeración).
b) 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (almacenamiento en refrigeración).
c) Persulfato de amonio al 10% (almacenamiento a temperatura ambiente).
39
d) SDS al 10% (almacenamiento a temperatura ambiente).
e) Buffer de corrimiento: Tris 6 g, glicina (28.8 g) y SDS (1 g). Levar hasta 1 L
con agua destilada. No fue necesario ajustar el pH (almacenamiento en
refrigeración).
f) Buffer de muestra 2x (almacenamiento en refrigeración):
-0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 5 mL
-SDS 0.5 g
-Glicerol 4 mL
-β-mercaptoetanol 0.25 mL
-Azul de bromofenol, stock 05% 0.025 g
-H20 tridestilada 5 mL (utilizados para disolver SDS y azul de
bromofenol).
g) Solución colorante: 0,1% de azul brillante de Coomassie R250 (Sigma-
Aldrich, 27816) en 40% de metanol y 10% de ácido acético glacial
(preparación 5:4:1→H2O:Metanol:Ácido acético).
h) Solución decolorante: 40% de metanol, 10% de ácido acético glacial
(preparación 5:4:1→H2O:Metanol:Ácido acético).
2. Se utilizó la cámara de electroforesis vertical Mini-PROTEAN® Tetra System de
la marca BIORAD, 10 pozos de 1 mm de grosor.
3. Para el ensamblaje de la cámara electroforética se limpiaron las superficies
internas de las placas cortas (short plates) y las placas largas (glass plates) de
cristal, con alcohol para desengrasarlas, se secaron y se procedió a juntarlas para
formar el casete y sujetarlo en posición vertical con el marco de fundición (casting
frame). Después de colocar los empaques (gaskets) en la base de la cámara
electroforética (casting stands). Se fijó y se revisó que no tuviera fuga el
ensamblado.
4. Gel de separación al 10% (volumen para un gel):
-H2O tridestilada 2.53 mL
-Acrilamida/bisacrilamida (30%, 0.8%) 2.26 mL
-Tris 1.5 M, pH 8.8 1.73 mL
-SDS al 10% 66.7 μL
-Persulfato de amonio al 10% 66.7 μL
-TEMED (al final) 6.7 μL
40
Con una pipeta Pasteur se transfirió esta mezcla de gel de separación al casete de
gel, pasando la solución cuidadosamente por un borde entre las placas de vidrio.
Se continuó añadiendo esta solución hasta llegar a una posición de aprox. 1 mm
del fondo del peine que formará los pozos de carga. Una vez completado esto, se
agregó isopropanol y se retiró una vez que se había polimerizado completamente
el gel de separación.
El gel de carga o concentración se preparó de la siguiente forma (volumen para
dos geles)
-H2O Tridestilada 1.787 mL
-Acrilamida/bisacrilamida (30%, 0.8%) 0.402 mL
-Tris-HCl 0.745 mL
-SDS al 10% 30 μL
-Persulfato de amonio al 10% 30 μL
-TEMED (al final) 6 μL
Inmediatamente realizada la mezcla se vertió al casete del gel, poniendo
inmediatamente el peine (comb) de 10 pozos, dejando polimerizar
completamente. Esto llevó unos 20 minutos.
5. Una vez polimerizados los geles, sin retirar los peines, se colocaron las placas con
los geles en el ensamble de electrodos y posteriormente se colocó dentro de la
celda electroforética, la cual fue llenada con buffer de corrimiento tanto el
depósito inferior hasta la marca de dos geles y luego el depósito interior hasta el
borde. Se retiraron los peines con un movimiento hacia arriba de manera suave y
precisa.
6. Las muestras de SFB o ASB nativas y desnaturalizadas (soluciones lubricantes)
que se encontraban a una concentración de 20 μg/μL, se llevaron a una
concentración final de 2 μg/μL de proteínas. Se eligió dicha concentración por la
previa estandarización mostrada en el ANEXO A (Figura 40). Se prepararon dos
volúmenes de muestra y buffer de carga (2x) y se llevó al termobloque a 95°C por
5 minutos. Después se refrigeró cada muestra hasta ser cargadas en los pozos.
7. Se colocó la guía de carga y se inyectaron 20 μL de la mezcla de muestra y buffer
de carga en cada pozo, por lo que la concentración final de proteínas cargada en
41
cada pozo fue de 20 μg en 20 μL y al final se colocaron 10 μL del marcador de
peso molecular (cat # 161-0375, BIO-RAD) que está en el rango de 10 a 250 kDa.
8. Una vez cargados los pozos de ambos geles, se retiró la guía y se colocó la tapa
de la celda electroforética asegurándose de que los electrodos estuvieran en su
polaridad correcta. Se conectó la fuente de alimentación y se utilizó un voltaje
constante de 200 V por 45 minutos.
9. Se desmontó el aparato y se retiraron las placas del gel, se abrieron las placas
cuidadosamente y se colocó en la solución colorante por 4 horas.
10. Se sustituyó la solución colorante por la solución decolorante, colocando dos
cubos de esponja para que absorbiera el colorante. Se dejó toda la noche (16 h) y
posteriormente se hizo un recambio a una solución decolorante reutilizada (menos
teñida) durante 4 h más. Se tomaron fotografías de los geles y se mantuvieron
hidratados en agua destilada.
11. Finalmente, las imágenes obtenidas de los geles fueron analizados con el software
libre Image J. Se obtuvieron los valores de pesos moleculares y porcentaje de
intensidad considerando el calibrado a centímetros con una imagen (ruler-
millimeters-centimeters-calibration-grid-value-division-cm-measuring-
instrument-precise-length-measurement-143403929). Siguiendo la siguiente ruta:
Peso molecular:
a) Image→Type: 16 bit.
b) Rectangule (selección del perímetro)→Image:Crop→Image→Zoom:
Out[-].
c) Rectangule→Selección del carril completo del marcador de peso
molecular→Analyze→Gel→Select First lane. Mover con la tecla de
flecha hacia el siguiente carril→ Select Next lane. Y así hasta los 10
carriles.
d) Analyze→Gels →Plot lanes. Seleccionar la herramienta “Multipoint” y
señalar el pico máximo de cada curva detectada. Para indicar el frente del
gel señalar un punto sobre la línea vertical después del último punto del
marcardor de peso molecular. Después señalar todos los picos siguientes.
e) Analyze→Measure→Arroja cuadro de resultados con X y Y. Se utilizaron
los valores de X como la distancia en pixeles para calcular Rf del marcador
de peso molecular y con el Log (PM) se obtuvo la ecuación de la recta
para posterior cuantificación de cada muestra (calculados en Excel).
42
Porcentaje de intensidad:
a) Image→Type: 16 bit.
b) Rectangule (selección del perímetro)→Image:Crop→Image→Zoom:
Out[-].
c) Rectangule→Selección de la banda de cada obtenida de cada carril
→Analyze→Gel→Select First lane. Mover con la tecla de flecha hacia
el siguiente carril→ Select Next lane. Y así hasta los 10 carriles.
d) Analyze→Gels →Plot lanes. Seleccionar la herramienta “Straight” y
señalar la base de cada pico detectada de todos los picos.
e) Seleccionar la herramienta “Wand” y dar click dentro del área de cada
curva. Arroja los valores de área de cada curva detectada.
f) Analyze→Gels→Label peaks. Arroja el porcentaje de intensidad que
representa cada banda seleccionada.
43
V. RESULTADOS Y ANÁLISIS
5.1 Resultados de Etapa 2
5.1.1 Espectro de absorción UV-Vis de las soluciones lubricantes de ASB y SFB
nativas y desnaturalizadas
La longitud de onda de la absorción y la intensidad de la absorbancia de una molécula
dependen no sólo de la naturaleza química sino también del entorno molecular de sus
cromóforos (Schmid & Beer, 2001). La absorción de la luz por parte de los cromóforos
de las proteínas permite determinar indirectamente los cambios en la estructura de la
proteína tras una posible agregación, exposición o encubrimiento de aminoácidos. En las
proteínas, el grupo amida (o también conocido como enlace peptídico) absorbe en la
región ultravioleta lejana (180-230 nm), donde se producen dos transiciones
significativas, una a 195 nm (π → π∗) y una segunda más débil a 220 nm (n → π∗).
Por otro lado, en la región cercana al UV (240-295 nm) es donde absorben las cadenas
laterales de los residuos aromáticos como tirosina, triptófano y fenilalanina. Los
aromáticos absorben debido a sus transiciones π → π∗ y la contribución de cada
aminoácido es diferente. El grupo indol del triptófano presenta un máximo cerca de ~280
nm y una transición menos intensa alrededor de ~292 nm. La absorbancia de la tirosina
es menor que la del triptófano, con un máximo observado a ~276 nm y un mínimo a los
~267 y 280 nm. La fenilalanina presenta la transición más débil alrededor de 250 a 270
nm, apareciendo como múltiples y sutiles puntos de inflexión, con un pico centrado cerca
de los 260 nm. En consecuencia, el espectro de UV cercano de una proteína está dominado
por las contribuciones de tirosina y triptófano. Los aminoácidos aromáticos no absorben
por encima de los 310 nm, y la absorbancia de la proteína debería ser casi nula por encima
de esta longitud de onda (Pignataro et al., 2020).
Por otra parte, en el espectro de absorción de las proteínas, un desplazamiento de la banda
a longitudes de onda más bajas (desplazamientos azules), es indicativo de exposición a
un entorno de disolvente más polar por parte de grupos amida y los aminoácidos
aromáticos. Por el contrario, los desplazamientos de la banda a longitudes de onda más
largas (desplazamientos al rojo) implican que estos se encuentran en un entorno más
enterrado y menos expuesto al disolvente (Pignataro et al., 2020).
A continuación, se muestran los espectros de absorción de las cuatro soluciones
lubricantes al final de los ensayos tribológicos para determinar los cambios en las
44
proteínas (indicativo de que los grupos amidas y aminoácidos aromáticos estén cubiertos
o expuestos) de las soluciones lubricantes de ASB nativa (inciso A), ASB desnaturalizada
(inciso B), SFB nativo (inciso C) y SFB desnaturalizado (inciso D), después de las 6 h de
cada prueba tribológica, incluyendo en cada caso los controles respectivos para cada
solución lubricante, los cuales fueron incubados a 37ºC durante 6h. Los resultados se
representan mediante gráficos de dispersión, del espectro de absorción de 200 a 300 nm
con una escala de 0 a 1.8 u.a. (unidades de absorbancia), de las soluciones de ASB nativas
y desnaturalizadas, sometidas a las pruebas tribológicas (gráfico 21 y 22). Además se
presenta un gráfico adicional que exhibe el acercamiento entre los 240-300 nm con una
escala de 0 a 0.16 u.a dentro del mismo gráfico.
Previo a cada gráfico, se muestran tablas que indican valores de longitud de onda donde
se detectó la máxima absorción entre los 200-240 nm (λmax 1), con su respectiva
absorbancia (tablas 11 y 12). También se muestra la longitud de onda de máxima
absorción entre los 240-300 nm (λmax 2) con sus respectivas absorbancias (tablas 13 y
14). Representando con un asterisco (*) la exposición de aminoácidos aromáticos y
amidas (desplazamiento hacia longitudes de onda bajas), dos asteriscos (**) como
cubrimiento de aminoácidos aromáticos y amidas (desplazamiento a longitudes de onda
más altas), y tres asteriscos (***) como dispersión de la luz (agregados proteicos).
A) Espectro de absorción UV-Vis de las soluciones lubricantes de ASB nativa
La Figura 20 muestra el espectro de absorción UV-Vis de la solución lubricante de ASB
nativa, antes del ensayo en el tribómetro, y se presenta con la etiqueta “0 h ctrl-nat”
(círculo rojo relleno) y es el promedio de todos los espectros tomados de las muestras de
las soluciones de ASB nativa antes de iniciar cada prueba tribológica (ocho pruebas para
cada solución lubricante). La solución “37°C-6 h nativa” (cuadro rojo) representa la que
solo fue incubada y no sometida a las pruebas tribológicas (Control). El resto de las
etiquetas representan cada una de las diferentes combinaciones de parámetros utilizados
en las pruebas tribológicas.
En todos los espectros se muestran dos bandas con valores máximos de absorbancia entre
los 217 y 218 nm (banda uno) y entre los 277 a 279 (banda dos), para el caso de la solución
lubricante etiquetada como “37°C-6 h nativa” (cuadro rojo) la primera banda muestra el
45
menor valor de 1.089 u.a. Por el contrario, la solución sometida a la prueba con los
parámetros “2N-1800%-80mm/s” (triangulo relleno) muestra el mayor incremento en
ambas bandas con valores de 1.596 y 0.196 u.a, respectivamente, en comparación con el
sistema control que no fue incubado. También la solución sometida a los parámetros “8N-
1800%-20mm/s” (rombo) muestra en la segunda banda una alta absorbancia de 0.092 u.a.
Sin embargo, se evidencia dispersión de la luz considerable, ya que no regresa a la línea
base, lo que nos indica una posible formación de agregados proteicos.
En la Tabla 10 se observa en la primera banda que hay exposición de las amidas, en la
solución control “37°C-6 h (nativa)” puesto que la banda se desplaza hacia los 217 nm
con la menor absorbancia 1.089 u.a en comparación a los 218 nm de la solución “0 h ctrl-
nat”. Sugiriendo que la temperatura (37°C) y el tiempo (6 h) de incubación per se
provocan ligeras modificaciones en las proteínas. El mismo comportamiento se observa
en las soluciones lubricantes que fueron sujetas a los parámetros “2N-20%-20mm/s”,
“2N-20%-80mm/s”, “2N-20%-80mm/s”, “8N-20%-80mm/s”, “8N-1800%-20mm/s” y
“8N-1800%-80mm/s”. Para la segunda banda, las soluciones sometidas a los parámetros
“8N-20%-20mm/s”, “8N-20%-80mm/s” y “8N-1800%-80mm/s” se muestra una menor
exposicion de aminoácidos aromáticos ya que solo se desplaza un nm, es decir, hacia 278
nm. Por lo tanto, se observa que las combinaciones de parámetros tribológicos provocaron
en las soluciones lubricantes de ASB nativa cambios en la disposición de sus aminoácidos
y enlaces peptídicos (amidas). Lo que sugiere que los cambios en el primer pico
provocaron que los enlaces peptídicos (amidas) fueran expuestas y en el caso del segundo
pico, que representa a los aminoácidos aromáticos, se observó que estos tendían a
permanecer cubiertos. No obstante, solo dos combinaciones de parámetros tribológicos
tienden a la formación de agregados proteicos (2N-1800%-80mm/s y 8N-1800%-
20mm/s).
46
Tabla 10. Valores de máxima absorción de las soluciones lubricantes de ASB nativa sometidas a
diferentes parámetros en el tribómetro de bola en disco.
ASB Nativa
Parámetros tribológicos
Longitud de
onda de λmax 1
(200-240 nm)
Absorbancia
de λmax 1
(u.a.)
Longitud de
onda de λmax 2
(240-300 nm)
Absorbancia
de λmax 2
(u.a.)
0 (ctrl-nat) 218 1.346 279 0.075
37°C-6 h (nativa) 217* 1.089* 279 0.056
2N-20%-20mm/s 217* 1.360* 279 0.077
2N-20%-80mm/s 217* 1.307* 279 0.075
2N-1800%-20mm/s 218 1.381 279 0.078
2N-1800%-80mm/s 218 1.596 277*** 0.196***
8N-20%-20mm/s 218 1.361 278* 0.078*
8N-20%-80mm/s 217* 1.334* 278* 0.076*
8N-1800%-20mm/s 217* 1.331* 277*** 0.092***
8N-1800%-80mm/s 217* 1.343* 278* 0.077*
* Desplazamiento de la banda a longitudes de onda más bajas: exposición de aminoácidos aromáticos (240-
300 nm) y amidas (200-240 nm) al entorno de disolvente
** Desplazamientos de la banda a longitudes de onda más altas: implican que estos aminoácidos aromáticos
y amidas se encuentran en un entorno más enterrado y menos expuesto al disolvente.
***Dispersión de la luz por posible agregación proteica
-Absorbancia más alta (números color rojo)
-Absorbancia más baja (números color azul)
47
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
Ab
sorb
anci
a (u
.a.)
Longitud de onda (nm)
0 (ctrl-nat)
37°C-6 h (nat-incubación)
2N-20%-20mm/s
2N-20%-80mm/s
2N-1800%-20mm/s
2N-1800%-80mm/s
8N-20%-20mm/s
8N-20%-80mm/s
8N-1800%-20mm/s
8N-1800%-80mm/s
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
240 250 260 270 280 290 300
Figura 20. Espectro de absorción de las soluciones lubricantes de ASB nativa sometidas a las pruebas tribológicas en el tribómetro de bola en disco durante 6h a
37ºC.
48
B) Espectro de absorción UV-Vis de las soluciones lubricantes de ASB
desnaturalizada
En la Figura 21 se muestra el espectro de absorción de las soluciones de ASB
desnaturalizadas sometidas a las pruebas tribológicas. Se representa con la etiqueta “0 h
ctrl-nat” (círculo rojo relleno) el promedio de las soluciones lubricantes nativas. Para “0
h ctrl-des” (círculo rojo) el promedio de las soluciones desnaturalizadas previo al inicio
de las pruebas tribológicas. La solución “37°C-6 h desnat” (cuadro rojo) representa la
solución desnaturalizada a 70°C durante 30 min y que posteriormente fue incubada
durante 6 h a 37°C. El resto de las etiquetas representan cada una de las diferentes
combinaciones de parámetros utilizados en las pruebas tribológicas.
La gráfica muestra nuevamente dos bandas con valores máximos de absorbancia entre los
217 y 218 nm (banda uno) y entre los 277 y 278 (banda dos), en el caso de la solución de
“37°C-6 h desnat” la primera banda presenta un incremento en su valor de absorbancia
con valore de1.345 u.a. comparado con la solución “0 h ctrl-des” (1.252 u.a.) (círculo
rojo). Sin embargo, la solución sometida a la prueba con los parámetros “8N-1800%-
20mm/s” (rombo) muestra el mayor incremento en su primera banda con valor de 1.565
u.a. comparado con la solución “0 h ctrl-des”. Por el contrario, en la segunda banda, la
prueba con los parámetros “8N-1800%-80mm/s” (rombo relleno) presenta la mayor
absorbancia (0.129 u.a.) en comparación del resto.
En la Tabla 11 se continúa con el mismo orden que la tabla anterior y también se muestran
con asteriscos los cambios en las proteínas. Se observa que hay cubrimiento de las amidas,
en la solución “37°C-6 h (desnat)” ya que la primera banda se desplaza hacia los 218 nm
con 1.345 u.a en comparación a los 217 nm de la solución “0 h ctrl-des”. Lo que indica
que la temperatura (37°C) y el tiempo (6 h) desencadenan la cobertura de las amidas en
las proteínas previamente desnaturalizadas. El mismo comportamiento (desplazamiento
a los 218 nm) se observa en las soluciones con los parámetros “2N-20%-20mm/s”, “2N-
20%-80mm/s”, “8N-20%-80mm/s”, “8N-1800%-20mm/s” y “8N-1800%-80mm/s”.
Para la segunda banda, la solución lubricante sometida a las condiciones “2N-1800%-
80mm/s” sucede un desplazamiento hacia los 277 nm con 0.096 u.a. que indica la
cobertura de los aminoácidos aromáticos. Para las soluciones lubricantes sometidas a los
parámetros “2N-1800%-20mm/s” y “8N-20%-80mm/s”, se muestra la formación de
agregados (dispersión de la luz) ya que no regresan a la linea base.
49
Lo anterior sugiere que los parámetros tribológicos provocaron cambios en la
disponibilidad de aminoácidos aromáticos y amidas en las soluciones de ASB
desnaturalizada. Lo que indica que un daño previo de las proteínas presentes en la
solución lubricante, debido a un proceso de desnaturalización por calentamiento térmico,
tendería a ocasionar que los enlaces peptídicos o amidas (que se representan en la primer
banda) sean cubiertos. Además, se sugiere que se desencadena una mayor exposición de
los aminoácidos aromáticos (que se representan por la segunda banda). No obstante, solo
cuatro combinaciones de parámetros tribológicos tienden en las soluciones lubricantes a
mostrar una mayor formación de agregados proteicos aun considerando la previa
desnaturalización. Dichos parámetros fueron: 2N-1800%-20mm/s, 8N-20%-80mm/s,
8N-1800%-20mm/s y 8N-1800%-80mm/s.
Tabla 11. Valores de máxima absorción de las soluciones lubricantes de ASB desnaturalizadas,
sometidas a diferentes parámetros en el tribómetro de bola en disco.
ASB Desnaturalizada
Parámetros tribológicos
Longitud de onda
de λmax 1 (200-
240 nm)
Absorbancia
de λmax 1
(u.a.)
Longitud de
onda de λmax 2
(240-300 nm)
Absorbancia
de λmax 2
(u.a.)
0 h (ctrl-des) 217 1.252 278 0.067
37°C-6 h (desnat) 218** 1.345** 278 0.072
2N-20%-20mm/s 218** 1.323** 278 0.074
2N-20%-80mm/s 218** 1.406** 278 0.082
2N-1800%-20mm/s 217 1.329 278*** 0.095***
2N-1800%-80mm/s 217 1.287 277* 0.096*
8N-20%-20mm/s 217 1.239 278 0.069
8N-20%-80mm/s 218** 1.405** 278*** 0.098***
8N-1800%-20mm/s 218** 1.565 277*** 0.093***
8N-1800%-80mm/s 218** 1.409** 277*** 0.129***
* Desplazamiento de la banda a longitudes de onda más bajas: exposición de aminoácidos aromáticos (240-
300 nm) y amidas (200-240 nm) al entorno de disolvente
** Desplazamientos de la banda a longitudes de onda más altas: implican que estos aminoácidos aromáticos
y amidas se encuentran en un entorno más enterrado y menos expuesto al disolvente.
***Dispersión de la luz por posible agregación proteica
-Absorbancia más alta (números color rojo)
-Absorbancia más baja (números color azul)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
Ab
sorb
anci
a (u
.a.)
Longitud de onda (nm)
0 (ctrl-nat)
0 (ctrl-des)
37°C-6 h (des-incubación)
2N-20%-20mm/s
2N-20%-80mm/s
2N-1800%-20mm/s
2N-1800%-80mm/s
8N-20%-20mm/s
8N-20%-80mm/s
8N-1800%-20mm/s
8N-1800%-80mm/s
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
240 250 260 270 280 290 300
Figura 21. Espectros de absorción de las soluciones lubricantes de ASB desnaturalizada sometidas a las pruebas tribológicas, en el tribómetro de bola en disco durante 6h a
37ºC.
51
C) Espectro de absorción UV-Vis de las soluciones lubricantes de SFB nativo
En la Figura 22 se presenta la solución lubricante de SFB nativo, donde la etiqueta “0 h
ctrl-nat” (círculo rojo relleno) es el promedio de cada uno de los espectros del SFB nativo,
tomados antes de iniciar cada prueba tribológica. La solución “37°C-6 h nativo” (cuadro
rojo) representa aquella que fue incubada pero no sometida a las pruebas tribológicas. Las
etiquetas restantes representan las diferentes combinaciones de parámetros utilizados en
las pruebas tribológicas.
De igual forma como en los casos anteriores, en todos los espectros se muestran dos
bandas con valores máximos de absorbancia entre los 217 a 219 nm (banda uno) y entre
los 275 a 283 (banda dos), Los resultados muestran que se observan cambios tanto en la
primera banda como en la segunda, con respecto a la absorbancia. Se puede visualizar
qué en la primera banda, las soluciones controles representadas con las etiquetas: “0 h
ctrl-nat” (1.465 u.a.) y “37°C-6 h nativas” (1.463 u.a.), no presentan cambios
considerables. Este mismo comportamiento lo presenta la solución lubricante sometida a
los parámetros “2N-1800%-20mm/s” (1.454 u.a.). Se visualizan además tres soluciones
lubricantes que se encuentran con valores de absorbancias por debajo de los controles
para la banda uno, siendo estas las sometidas a los parámetros: “2N-20%-20mm/s” (1.265
u.a.), “2N-1800%-80mm/s” (1.392 u.a.) y “8N-1800%-20mm/s” (1.345 u.a.). Por el
contrario, las soluciones lubricantes sometidas a las pruebas con los parámetros “8N-
20%-20mm/s” (1.606 u.a.), “8N-20%-80mm/s” (1.523 u.a.) y “8N-1800%-80mm/s”
(1.82 u.a.) para la banda uno muestra valores por encima de los controles. Aunado a esto,
es posible identificar que en la segunda banda la solución “0 h ctrl-nat” solo tiene por
debajo de su valor de absorbancia a la solución lubricante sometida a los parámetros 2N-
20%-20mm/s y el resto se encuentra con valores por encima de esta.
La Tabla 12 muestra los cambios en la absorbancia atribuidas a los desplazamientos de
la longitud de onda, indicando que las proteínas en la solución lubricante de SFB nativo
son modificadas, en la mayoría de las pruebas tribológicas estudiadas. El comportamiento
de la primera banda del SFB nativo muestra desplazamientos a longitudes de onda más
alta con respecto a los 218 nm que presenta “0 ctrl-nat”, lo que indica que hay
encubrimiento de las amidas (enlaces peptídicos). Entre estas se encuentran las pruebas
con los parámetros tribológicos “2N-20%-80mm/s” (219 nm - 1.671 u.a), “2N-1800%-
80mm/s” (219 nm-1.392 u.a.), “8N-20%-20mm/s” (219 nm-1.606 u.a.) y “8N-1800%-
52
80mm/s” (219 nm-1.82 u.a), siendo este último parámetro el que origina una mayor
absorbancia. Por otro lado, también se observa exposición de las amidas de las pruebas
con los parámetros tribológicos “8N-20%-80mm/s” (217 nm-1.523 u.a.) y “8N-1800%-
20mm/s” (217 nm-1.345 u.a.).
Para la segunda banda, la solución sometida a “37°C-6 h (nativa)” muestra un
desplazamiento de 278 nm con 0.097 u.a., hacia una menor longitud de onda con respecto
a los 279 nm del “0 h (ctrl-nat)”. Lo que indica la exposición de los aminoácidos
aromáticos. De manera contraría, la condición “2N-20%-20mm/s” (283 nm-0.06 u.a.)
muestra un desplazamiento de hasta 4 nm hacía la longitud de onda mayor con respecto
al control que fue incubado sugiriendo un mayor encubrimiento de los aminoácidos
aromáticos. No obstante, para las pruebas restantes, se muestran desplazamientos tanto a
mayores como a menores longitudes de onda, sugiriendo encubrimiento o exposición de
aminoácidos aromáticos y la dispersión de la luz que se observa, no permite realizar la
descripción de su comportamiento. Por lo anterior, se considera que las pruebas con los
parámetros tribológicos: “2N-20%-80mm/s”, “2N-1800%-20mm/s”, “2N-1800%-
80mm/s”, “8N-20%-20mm/s”, “8N-20%-80mm/s”, “8N-1800%-20mm/s” y “8N-
1800%-80mm/s” muestran dispersión de la luz por no regresar a la línea base, sugiriendo
mayor formación de agregados proteicos, especialmente bajo los parámetros de “8N-
1800%-80mm/s”. Estos resultados, de forma general sugieren que los componentes
proteicos que se conocen como globulinas en el SFB nativo, promueven una mayor
interacción entre las proteínas desencadenando una mayor agregación, con el posible
autoensamblaje entre las mismas proteínas o con las diferentes que se encuentran
disponibles en la solución.
53
Tabla 12. Valores de máxima absorción de las soluciones lubricantes del SFB nativo, sometidas a
diferentes parámetros en el tribómetro de bola en disco.
SFB Nativo
Parámetros tribológicos
Longitud de
onda de λmax 1
(200-240 nm)
Absorbancia de
λmax 1 (u.a.)
Longitud de
onda de λmax 2
(240-300 nm)
Absorbancia de
λmax 2 (u.a.)
0 h (ctrl-nat) 218 1.465 279 0.084
37°C-6 h (nativo) 218 1.463 278* 0.097*
2N-20%-20mm/s 218 1.265 283** 0.06**
2N-20%-80mm/s 219** 1.671** 278*** 0.131***
2N-1800%-20mm/s 218 1.454 277*** 0.108***
2N-1800%-80mm/s 219** 1.392** 281*** 0.092***
8N-20%-20mm/s 219** 1.606** 278*** 0.119***
8N-20%-80mm/s 217* 1.523* 277*** 0.119***
8N-1800%-20mm/s 217* 1.345* 277*** 0.115***
8N-1800%-80mm/s 219** 1.82** 275*** 0.247***
* Desplazamiento de la banda a longitudes de onda más bajas: exposición de aminoácidos aromáticos (240-
300 nm) y amidas (200-240 nm) al entorno de disolvente
** Desplazamientos de la banda a longitudes de onda más altas: implican que estos aminoácidos aromáticos
y amidas se encuentran en un entorno más enterrado y menos expuesto al disolvente.
***Dispersión de la luz por posible agregación proteica
-Absorbancia más alta (números color rojo)
-Absorbancia más baja (números color azul)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
Ab
sorb
anci
a (u
.a.)
Longitud de onda (nm)
0 h (ctrl-nativo)
37°C-6 h (nat-incubación)
2N-20%-20mm/s
2N-20%-80mm/s
2N-1800%-20mm/s
2N-1800%-80mm/s
8N-20%-20mm/s
8N-20%-80mm/s
8N-1800%-20mm/s
8N-1800%-80mm/s
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
240 250 260 270 280 290 300
Figura 22. Espectros de absorción de las soluciones lubricantes de SFB nativo sometidas a las pruebas tribológicas, en el tribómetro de bola en disco durante 6h a 37ºC.
55
D) Espectro de absorción UV-Vis de las soluciones lubricantes de SFB
desnaturalizado
En la Figura 23 se presenta los espectros de la solución lubricante de SFB
desnaturalizado, donde la etiqueta “0 h ctrl-nat” (círculo rojo relleno) es el utilizado en la
gráfica anterior. La solución “0 h ctrl-des” (círculo rojo) es también el promedio de las
soluciones del SFB desnaturalizado previamente. Para el caso de la solución “37°C-6 h
desnat” (cuadro rojo) representa aquella que fue desnaturalizada e incubada pero no
sometida a las pruebas tribológicas. Las diferentes combinaciones de parámetros
utilizados en las pruebas tribológicas se representan en las etiquetas restantes.
Como en los casos anteriores se aprecian en todos los espectros dos bandas con valores
máximos de absorbancia entre los 217 y 218 nm (banda uno) y entre los 276 a 278 (banda
dos, para el SFB desnaturalizado, la intensidad de la absorbancia se ve alterada tanto en
la primera como en la segunda banda. Se puede observar en la primera banda, que
representa a las amidas, las soluciones sometidas a “0 h ctrl-nat” (1.457 u.a.) y “37°C-6
h desnat” (1.505 u.a.) difieren entre sí. Un comportamiento que muestra valores menores
de absorbancia con respecto a los controles, son las soluciones lubricantes de SFB
desnaturalizado sometido a las condiciones en el tribómetro de “8N-20%-20mm/s” con
(1.385 u.a.) y “8N-20%-80mm/s” (1.296 u.a.). El resto se encuentra con valores de
absorbancia por arriba que los obtenidos en los controles, en este caso la solución
lubricante sometida a las condiciones de “8N-1800%-80mm/s” (1.625 u.a.) presenta la
absorbancia más elevada en la primer banda. Además, se identifica que en la segunda
banda la solución “0 h ctrl-des” y “37°C-6 h desnat” se traslapan en sus valores de
absorbancia (0.095 y 0.097 respectivamente) cuyos valores se encuentran sobre el control
de SFB nativo. El resto de las soluciones lubricantes se encuentra con valores por encima
de estas.
La Tabla 13 explica los cambios por desplazamientos de la longitud de onda, se observa
que las proteínas presentes en las soluciones lubricantes de SFB desnaturalizado sufren
procesos de agregación en la mayoría de las pruebas tribológicas empleadas. El
comportamiento de la primera banda del SFB desnaturalizado de dos pruebas
tribológicas, muestra desplazamientos a longitudes de onda más bajas con respecto a los
218 nm que presenta “0 ctrl-des”, lo que indica que hay encubrimiento de las amidas
(enlaces peptídicos). Entre estas se encuentran las pruebas con los parámetros tribológicos
8N-20%-20mm/s (217 nm-1.385 u.a.) y 8N-20%-80mm/s (217 nm-1.296u.a.).
56
Para la segunda banda, la solución lubricante sometida a “37°C-6 h (desnat)” muestra un
desplazamiento a 277 nm con 0.097 u.a. y “8N-20%-20mm/s” hacia 277 nm- con 0.093
u.a. que indica la exposición de los aminoácidos aromáticos. Dicho comportamiento,
muestra que la complejidad del SFB promueve que los enlaces peptídicos (amidas)
(representados por la primera banda) solo fueron expuestas en dos pruebas (las sometidas
a los parámetros 8N-20%-20mm/s y 8N-20%-80mm/s). Por otro lado, los aminoácidos
aromáticos (segunda banda), tienden a exponerse ya que se desplaza hacia los 276 nm en
el caso de las soluciones sometidas a los siguientes parámetros: incubada a 37°C-6 h y
8N-20%-20mm/s.
No obstante, seis soluciones lubricantes de SFB desnaturalizado mostraron agregación
proteica (dispersión de la luz), las cuales fueron sometidas a las pruebas tribológicas con
los siguientes parámetros: 2N-20%-20mm/s, 2N-20%-80mm/s, 2N-1800%-20mm/s, 2N-
1800%-80mm/s, 8N-1800%-20mm/s y 8N-1800%-80mm/s, lo que indica la misma
tendencia observada en el SFB nativo al interactuar entre las proteínas. Sugiriendo
nuevamente que las globulinas en el SFB desnaturalizado promueven una mayor
interacción entre las proteínas y por lo tanto una mayor agregación.
Tabla 13. Valores de máxima absorción de las soluciones lubricantes del SFB desnaturalizado, sometidas
a diferentes parámetros en el tribómetro de bola en disco
SFB Desnaturalizado
Parámetros tribológicos
Longitud de
onda de λmax 1
(200-240 nm)
Absorbancia de
λmax 1 (u.a.)
Longitud de
onda de λmax 2
(240-300 nm)
Absorbancia de
λmax 2 (u.a.)
0 h (ctrl-des) 218 1.457 278 0.095
37°C-6 h (desnat) 218 1.505 277* 0.097*
2N-20%-20mm/s 218 1.621 276*** 0.126***
2N-20%-80mm/s 218 1.574 278*** 0.115***
2N-1800%-20mm/s 218 1.495 278*** 0.116***
2N-1800%-80mm/s 218 1.579 278*** 0.142***
8N-20%-20mm/s 217* 1.385* 277* 0.093*
8N-20%-80mm/s 217* 1.296* 278 0.092
8N-1800%-20mm/s 218 1.525 278*** 0.113***
8N-1800%-80mm/s 218 1.625 276*** 0.16***
*Desplazamiento de la banda a longitudes de onda más bajas: exposición de aminoácidos aromáticos (240-
300 nm) y amidas (200-240 nm) al entorno de disolvente
** Desplazamientos de la banda a longitudes de onda más altas: implican que estos aminoácidos aromáticos
y amidas se encuentran en un entorno más enterrado y menos expuesto al disolvente.
***Dispersión de la luz por posible agregación proteica
-Absorbancia más alta (números color rojo)
-Absorbancia más baja (números color azul)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
Ab
sorb
anci
a (u
.a.)
Longitud de onda (nm)
0 h (ctrl-nativo)
0 h (ctrl-desnaturalizado)
37°C-6 h (des-incubación)
2N-20%-20mm/s
2N-20%-80mm/s
2N-1800%-20mm/s
2N-1800%-80mm/s
8N-20%-20mm/s
8N-20%-80mm/s
8N-1800%-20mm/s
8N-1800%-80mm/s
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
240 250 260 270 280 290 300
Figura 23. Espectros de absorción de las soluciones lubricantes de SFB desnaturalizado sometidas a las pruebas tribológicas, en el tribómetro de bola en disco
durante 6h a 37ºC.
5.1.2 Cuantificación de proteínas totales en soluciones lubricantes empleadas en
pruebas tribológicas.
Para conocer la concentración final de proteínas presentes en las soluciones lubricantes
de ASB y SFB nativas y desnaturalizadas antes y después de los ensayos en el tribómetro
de bola en disco bajo diferentes parámetros, se empleó el método de Bradford, esta técnica
permite además identificar si hay cambios de los aminoácidos básicos en relación con su
disponibilidad (exposición o encubrimiento), debido a la especificidad del colorante azul
de Coomassie para interactuar con dichos aminoácidos (Ku et al., 2013). En los resultados
se mostrará la comparación entre las soluciones de ASB nativa y desnaturalizada (inciso
A) y la comparación entre SFB nativo y desnaturalizado (inciso B) después de las 6 h que
duró cada prueba tribológica, incluyendo sus respectivos controles que fueron incubados
a 37ºC durante 6 h. Los resultados se representan mediante gráficos de barras que
muestran la media de la concentración de proteínas, obtenida de los quintuplicados de
una sola replica por cada prueba. Las barras de error representan la desviación estándar
típica. Los valores de concentración se expresaron en g/L para todas las soluciones
lubricantes ensayadas. Es necesario plantear que el objetivo de los gráfico y la prueba de
comparación múltiple de Dunnett es proporcionar información que describa los datos,
debido además a que no se realizaron replicas que permitan mostrar información sobre
conclusiones o inferencias. Por lo que cabe resaltar que las barras de error descriptivas
que se representan en las gráficas de barras muestran solamente la dispersión de los datos
y para ver si un solo resultado se ajusta dentro del rango normal (el cual se representa en
con el control). Otro motivo para utilizar las barras de error de la desviación estándar
típica es que no cambia sistemáticamente con respecto al número de muestra (n) por lo
que utilizar SD como estimación de lo desconocido sería viable (Cumming et al., 2007).
Se realizó un análisis de varianza de un factor (soluciones lubricantes de ASB o SFB) con
9 niveles por tipo de solución, de los cuales ocho representan cada una de las
combinaciones de parámetros tribológicos empleados por cada solución lubricante y el
otro, representa el control que fue incubado a 37°C por 6 horas de las soluciones nativas
de ASB y SFB. Aunque en el gráfico se muestra el promedio de las muestras al inicio o
tiempo cero “0 h (ctrl)”, este no fue considerado para el análisis de varianza debido a que
es de interés identificar si la temperatura constante (37ºC) y el tiempo de prueba (6 h)
dañan per se a las proteínas. Como prueba de comparación múltiple se aplicó el método
59
de Dunnett, para crear intervalos de confianza para las diferencias entre la media de cada
una de las ocho combinaciones de parámetros usados en las pruebas tribológicas para
cada solución lubricante y como control, la media de la solución lubricante nativa de ASB
o SFB incubada a 37°C durante 6 h, según corresponda.
Se decidió emplear el ANOVA de un factor debido a que en un estudio tribológico
realizado por Duong et al (2012) representó y analizó el coeficiente de fricción una cabeza
femoral de CoCr empleando técnicas de Microscopía de Fuerza Atómica y utilizando
diferentes concentraciones de proteínas en distintas soluciones lubricantes (ASB, γ-glob
y PBS). Es relevante mencionar que obtuvieron los datos de doce diferentes áreas de la
superficie de una sola cabeza femoral para cada concentración de proteínas, mostrando
también sus resultados con gráficas de barras y el tipo de barra de error que representa la
desviación estándar. Además su muestra (cabeza femoral CoCr) fue la obtenida fue
recuperada de una cirugía de revisión debido a un aflojamiento aséptico 10 años después
de la artroplastia total de cadera (THA), fue seccionada de la principal región de desgaste
para crear una muestra de prueba con una longitud, anchura y espesor de 10 mm, 10 mm,
y 5 mm, respectivamente. Por lo que entre cada prueba con los tres tipos de solución
lubricante que usaron solo se realizaba la limpieza con etanol y baño ultrasónico. Aunado
a esto, ellos realizaron un análisis estadístico de mediante un ANOVA unidireccional para
investigar las diferencias estadísticas entre los coeficientes de fricción obtenidos de los
tres tipos de lubricantes que utilizaron (Duong et al., 2012). En consecuencia, la finalidad
del párrafo anterior fue justificar el uso de ANOVA de una vía de la media de
concentración de proteínas obtenidas de una sola prueba tribológica, ya que la duración
(6 h) y la aplicación inmediata de la técnica de Bradford no permitió realizar replicas,
aunado al coste que representa en tiempo y presupuesto. Finalmente la implementación
de la prueba de comparación múltiple de Dunnett es utilizada para la comparación contra
un control en sistemas biológicos que no permiten tener replicas (Medina-Ceja et al.,
2019).
A) Cuantificación de proteínas totales de las soluciones lubricantes de ASB nativa y
desnaturalizada
60
La Figura 24 muestra la concentración de proteínas totales de las soluciones de ASB
nativas (barras blancas) y desnaturalizadas (barras negras). Se identifican el promedio de
las concentraciones obtenidas de la solución antes de cada prueba “0 h (ctrl)”, la solución
lubricante nativa incubada “37°C/6 h” (recuadro rojo) representa el control, y el resto son
las ocho combinaciones de parámetros en las pruebas tribológicas para cada solución
lubricante. Los asteriscos representan las diferencias significativas con respecto al control
(Tabla 14), los asteriscos color negro muestra aquellas que presentan mayor interacción
entre aminoácidos básicos (exposición) y colorante y los de color rojo aquellas que
presentan una menor interacción entre aminoácidos básicos (encubrimiento) y el
colorante.
Se observa que la solución lubricante de ASB desnaturalizada e incubada a 37°C/6h
(barra negra), no presenta diferencias significativas con respecto a su igual nativo, lo que
indica que el tiempo de incubación y la temperatura tanto en la solución lubricante de
ASB nativa y desnaturalizada no muestra cambios. Sin embargo, parece haber una
tendencia al encubrimiento de sus aminoácidos básicos para las proteínas presentes en la
solución lubricante desnaturalizada.
Por otro lado, se muestra que las soluciones lubricantes de ASB (nativas y
desnaturalizadas) con exposición de aminoácidos básicos debido a cambios en la
disponibilidad en su estructura (mayor interacción con el colorante), fueron las que se
sometieron a las pruebas con los parámetros tribológicos siguientes (asteriscos negros):
“2N-20%-20mm/s (nativa)”, “2N-20%-80mm/s (desnaturalizada)”, “2N-1800%-20mm/s
(nativa)” y “8N-1800%-80mm/s (nativa)”. Lo que indica que en tres soluciones
lubricantes nativas y una solución lubricante desnaturalizada predominó la tendencia
significativamente a la exposición de sus aminoácidos básicos causada por las
condiciones de cada prueba.
Para el caso de aquellas soluciones lubricantes de ASB (nativas y desnaturalizadas) en las
que sus proteínas mostraron plegamientos tales que provocaron un encubrimiento de sus
aminoácidos básicos (menor interacción con el colorante), fueron las que se sometieron
a las pruebas tribológicas siguientes (asteriscos rojos): “2N-20%-20mm/s
(desnaturalizada), “2N-1800%-20mm/s (desnaturalizada)”, 8N-20%-20mm/s (nativa y
desnaturalizada)” y “8N-1800%-80mm/s (desnaturalizada)”. Lo que indica que en cuatro
soluciones lubricantes desnaturalizadas y una solución lubricante nativa predominó la
tendencia significativamente al encubrimiento de sus aminoácidos básicos debido a los
parámetros de cada prueba.
61
Figura 24. Concentración de proteínas totales de las soluciones lubricantes de ASB nativas y
desnaturalizadas sometidas a las pruebas tribológicas a 37ºC durante 6h.
Tabla 14. Comparaciones múltiples de Dunnett con un control de la concentración de proteínas
totales de las soluciones lubricantes de ASB nativas y desnaturalizadas sometidas a las pruebas
tribológicas en un tribómetro de bola en disco a 37ºC durante 6h.
0
5
10
15
20
25
30
Co
nce
ntr
ació
n d
e p
rote
ína
(g/L
)
Pruebas tribológicas
ASB nativa ASB desnaturalizada
**
* *
* * ** *
62
B) Cuantificación de proteínas de las soluciones lubricantes de SFB nativo y
desnaturalizado
En la Figura 25 se grafica la concentración de proteínas totales de las soluciones
lubricantes de SFB nativo (barras grises) y desnaturalizado (barras azules). Se identifican
el promedio de las concentraciones obtenidas de la solución antes de cada prueba “0 h
(ctrl)” y la solución incubada a 37°C durante 6 h (recuadro rojo), siendo la solución
lubricante de SFB nativo la que representa el control, y el resto son las ocho pruebas
tribológicas para cada solución lubricante de SFB nativo y desnaturalizado empleado. Los
asteriscos representan las diferencias significativas con respecto al control (Tabla 15), de
igual forma, los asteriscos representan lo mismo que el gráfico anterior (color negro=
exposición de aminoácidos básicos; color rojo= encubrimiento de aminoácidos básicos).
Se observa que la solución lubricante de SFB desnaturalizado incubado a 37°C/6 h (barra
azul), no presenta diferencias significativas con respecto al control de la solución
lubricante de SFB nativo, por lo que el tiempo de incubación (6h) y la temperatura (37ºC)
no evidencian cambios. Sin embargo, parece haber una tendencia a la exposición de sus
aminoácidos básicos cuando la solución de SFB está desnaturalizada.
Por otro lado, se muestra que las soluciones lubricantes de SFB (nativos y
desnaturalizados) con exposición de aminoácidos básicos (mayor interacción con el
colorante), fueron las que se sometieron a las pruebas con los parámetros tribológicos
siguientes (asteriscos negros): “2N-20%-80mm/s (desnaturalizado)”, “2N-1800%-
80mm/s (desnaturalizado)” y “8N-20%-20mm/s (nativo)” y “8N-1800%-80mm/s
(nativo). Lo que indica que en dos soluciones lubricantes de SFB nativos y dos de SFB
desnaturalizado predominó la tendencia significativamente a la exposición de sus
aminoácidos básicos causada por las condiciones de cada prueba.
Para las soluciones lubricantes de SFB (nativos y desnaturalizados) donde se perciben
plegamientos que en consecuencia provocaron un encubrimiento de sus aminoácidos
básicos (menor interacción con el colorante), fueron las que se sometieron a las pruebas
tribológicas siguientes (asteriscos rojos): “8N-20%-20mm/s (desnaturalizado)” y “8N-
20%-80mm/s (desnaturalizado)”. Lo que indica que en dos soluciones lubricantes de SFB
desnaturalizadas predominó la tendencia de manera significativa al encubrimiento de sus
aminoácidos básicos debido a los parámetros de cada prueba en comparación con el
control.
63
Figura 25. Concentración de proteínas totales de las soluciones lubricantes de SFB nativo y
desnaturalizado sometidas a las pruebas tribológicas a 37ºC durante 6h.
Tabla 15. Comparaciones múltiples de Dunnett con un control de la concentración de proteínas
totales de las soluciones lubricantes de SFB nativo y desnaturalizado sometidas a las pruebas
tribológicas en un tribómetro de bola en disco a 37ºC durante 6h.
0
5
10
15
20
25
Co
nce
ntr
ació
n d
e p
rote
ínas
(g/
L)
Pruebas tribológicos
SFB nativo SFB desnaturalizado
*
*
*
*
*
*
64
5.1.3 Determinación de la presencia de grupos SH libres en soluciones
lubricantes sometidas al tribómetro de bola en disco.
Se realizaron pruebas para cuantificar los grupos sulfhidrilo libres en cada una de las
soluciones lubricantes utilizadas (ASB y SFB nativo y desnaturalizado) y poder
evidenciar la ruptura de enlaces disulfuro en las proteínas por acción de los parámetros
empelados en el tribómetro de bola en disco para cada uno de los ensayos realizados. Los
resultados para las soluciones lubricantes nativas y desnaturalizadas de ASB y SFB se
muestran en las Figura 26 y Figura 27 respectivamente, incluyendo sus controles. Los
valores obtenidos se expresaron en mmol/L de grupos sulfhidrilos libres para todas las
soluciones lubricantes. Las barras en las figuras representan la desviación estándar de las
medias de quintuplicados realizadas para cada solución. Sólo se obtuvieron cantidades
negativas de grupos sulfhidrilos libres, lo que sugiere que no se produjó la ruptura de los
enlaces disulfuro presentes en las proteínas por las condiciones atribuidas a cada uno de
los parámetros empleados para cada corrida en el tribómetro de bola en disco. Por lo tanto,
la estabilidad de la estructura terciaria de las proteínas en todas las soluciones no se vio
comprometida por ninguno de los parámetros tribológicos utilizados.
Figura 26. Determinación de grupos sulfhidrilo libres en las soluciones lubricantes de ASB nativa y
desnaturalizada, sometidas a las pruebas tribológicas en un tribómetro de bola en disco a 37ºC durante 6h.
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
0 (
ctrl
)
37
°C-6
h (
incu
bac
ión
)
2N
-20
%-2
0m
m/s
2N
-20
%-8
0m
m/s
2N
-18
00
%-2
0mm
/s
2N
-18
00
%-8
0mm
/s
8N
-20
%-2
0m
m/s
8N
-20
%-8
0m
m/s
8N
-18
00
%-2
0mm
/s
8N
-18
00
%-8
0mm
/s
Gru
po
s su
lfh
idri
lo li
bre
s (m
mo
les/
L)
Parámetros tribológicos
ASB nativa ASB desnaturalizada
65
Figura 27. Determinación de grupos sulfhidrilo libres en las soluciones lubricantes de SFB nativo y
desnaturalizado, sometidas a las pruebas tribológicas en un tribómetro de bola en disco a 37ºC durante 6h.
5.1.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE
Los geles de poliacrilamida se forman a partir de la polimerización del monómero de
acrilamida en presencia de cantidades menores de N,N'-metileno-bis-acrilamida
(normalmente denominada "bis-acrilamida"). La polimerización de la acrilamida es un
ejemplo de catálisis de radicales libres, y se inicia mediante la adición de persulfato de
amonio y la base N,N,N',N'-tetrametilendiamina (TEMED). El TEMED cataliza la
descomposición del ion persulfato para dar un radical libre. El oxígeno "absorbe" los
radicales libres y de este modo, se construyen largas cadenas de acrilamida, que se
reticulan mediante la introducción de alguna molécula de bisacrilamida en la cadena en
crecimiento (Walker, 2002). El propósito del gel de carga es concentrar la muestra de
proteínas en una banda nítida antes de que entre en el gel de separación principal, dando
así bandas de proteínas más nítidas en el último gel. El gel de carga tiene un tamaño de
poro que permite que las proteínas se muevan libremente y se concentren bajo el efecto
del campo eléctrico.
Las muestras que se procesan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-
PAGE se hierven primero durante 5 minutos en un buffer de muestra que contiene, entre
otros reactivos, el β-mercaptoetanol y SDS. El mercaptoetanol reduce los puentes
disulfuro presentes, que mantienen unida la estructura terciaria de la proteína. En el caso
del SDS (CH3-[CH2]10-CH2OSO3Na+) es un detergente aniónico que se une fuertemente
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
0 h
(ct
rl)
37
°C-6
h (
incu
bac
ión
)
2N
-20
%-2
0m
m/s
2N
-20
%-8
0m
m/s
2N
-18
00
%-2
0mm
/s
2N
-18
00
%-8
0mm
/s
8N
-20
%-2
0m
m/s
8N
-20
%-8
0m
m/s
8N
-18
00
%-2
0mm
/s
8N
-18
00
%-8
0mm
/s
Gru
po
s su
lfh
idri
lo li
bre
s (m
mo
les/
L)
Parámetros tribológicos
SFB nativo SFB desnaturalizado
66
a la(s) proteína(s) y la(s) desnaturaliza(s). Por tanto, cada proteína de la mezcla se
desnaturaliza por completo con este tratamiento y se abre en una estructura en forma de
varilla con una serie de moléculas de SDS cargadas negativamente a lo largo de la cadena
polipeptídica. Generalmente, se une una molécula de SDS por cada dos residuos de
aminoácidos. Por lo tanto, la carga neta de la proteína nativa queda completamente
anulada por las moléculas de SDS. El buffer de muestra también contiene un colorante de
seguimiento ionizable, normalmente azul de bromofenol, que permite monitorizar el
recorrido electroforético, además de contener sacarosa o glicerol, que da densidad a la
solución de la muestra, permitiendo así que la muestra se deposite fácilmente en el fondo
del buffer de electroforesis (o también conocido como buffer de corrimiento), cuando se
inyecta en el pozo de carga. Una vez que se ha vertido el gel de separación entre las placas
de vidrio y se ha dejado polimerizar, se vierte un gel de carga (o también conocido como
gel de concentración), el cual es más corto sobre el gel de separación, y es en este gel
donde se forman los pozos y se cargan las proteínas. Una vez cargadas todas las muestras,
se hace pasar una corriente a través del gel. Una vez que las muestras de proteínas han
atravesado el gel de carga y han entrado en el gel de separación, los complejos proteína-
SDS cargados negativamente continúan moviéndose hacia el ánodo, y como tienen la
misma carga por unidad de longitud, se desplazan hacia el gel de separación bajo el campo
eléctrico aplicado con la misma movilidad. Sin embargo, al atravesar el gel de separación,
las proteínas se separan, debido a las propiedades de cribado molecular del gel.
Sencillamente, cuanto más pequeña es la proteína, más fácilmente puede pasar a través
de los poros del gel, mientras que las proteínas grandes son sucesivamente retardadas por
la resistencia a la fricción debido al efecto de tamizado del gel. Al ser una molécula
pequeña, el colorante azul de bromofenol no sufre ningún retraso y, por tanto, indica el
frente de electroforesis. Cuando el colorante llega al fondo del gel, se apaga la corriente
y se retira el gel de entre las placas de vidrio, se coloca en una solución de tinción
adecuada (normalmente azul brillante de Coomassie) durante unas horas y, a
continuación, se lava en una solución de desteñido durante la noche. La solución de
desteñido elimina del gel el colorante de fondo no unido, dejando las proteínas teñidas
visibles como bandas azules sobre un fondo claro (Walker, 2002).
Dado que el principio de esta técnica es la separación de proteínas en función de las
diferencias de tamaño, al correr proteínas de calibración de peso molecular conocido en
el mismo gel que la proteína desconocida, se puede determinar el peso molecular de la
67
proteína desconocida. Para la mayoría de las proteínas, un gráfico de log10 de la masa
molecular frente a la movilidad relativa proporciona una línea recta.
Por lo tanto, para determinar el peso molecular de una proteína desconocida, se
determinan las movilidades relativas (Rf) de las proteínas estándar y se traza un gráfico
del logaritmo del peso molecular frente a la Rf:
Rf = (distancia migrada por la proteína/distancia migrada por el colorante)
Existen mezclas de marcadores de peso molecular estándar para su uso en geles de SDS
que pueden obtenerse de diversos proveedores. A continuación, se determina el Rf de la
proteína desconocida y con los valores sustituidos en la ecuación obtenida se calcula el
inverso de log10, es decir, la potencia de cada valor obtenido (Walker, 2002).
A continuación, se muestran los perfiles proteicos de las soluciones lubricantes controles
de ASB y SFB nativo y desnaturalizado, y el perfil de proteínas de cada una de las
soluciones lubricantes sometidas a los parámetros tribológicos comparados contra las
soluciones controles que correspondan. Además, se complementan con los porcentajes de
intensidad y el peso molecular, lo que nos permitirá hacer la interpretación de resultados
para cada grupo de solución lubricante empleada y sometidas a diferentes parámetros
tribológicos.
A) SDS PAGE de controles de soluciones lubricantes ASB y SFB nativos y
desnaturalizados
Para conocer la integridad de las proteínas en las soluciones lubricantes controles se optó
por comparar las provenientes de las soluciones lubricantes de ASB y del SFB nativos y
desnaturalizados, incluyendo el marcador de peso molecular. En la Figura 28 se muestran
los patrones electroforéticos de las soluciones lubricantes control de ASB (carril 2 al 5) y
SFB (carril 7 al 10) respectivamente. En todos los casos se observa una banda mayoritaria
que corresponde a la albúmina con un peso molecular de 66.5 kDa tanto en las muestras
de soluciones lubricantes de ASB y SFB (carriles 2 al 10). Además, en los carriles de la
solución lubricante de SFB (carriles 7 al 9) se aprecian otras bandas minoritarias que
68
fueron más tenues, de las cuales se calcularon sus pesos moleculares resultando en bandas
con pesos moleculares de 56.6, 54.7, 49.1 y 23.4 kDa, respectivamente).
Con relación al perfil de proteínas reportadas en el SFB por la literatura, normalmente
son evidenciadas mediante electroforesis SDS-PAGE con gradiente. Lo anterior sugiere
que sería necesario implementar el uso de aparatos de formación de gradientes en las
electroforesis, para identificar las bandas que corresponde a las globulinas en las
soluciones de SFB (Tiselius, 1937; Walker, 2002).
Por otra parte, se complementan los geles con los valores de la Tabla 16, donde se
muestran los porcentajes de intensidad y peso molecular de la banda mayoritaria de 66.5
kDa que corresponde a la albumina. Se observa que la solución de ASB Nativa 0 h y ASB
nativa incubada a 37ºC durante 6 h son similares, ya que las bandas muestran un
porcentaje de intensidad de 14.8% y 15.1% respectivamente, lo que indica que se detectan
cambios muy leves dados por la temperatura (37°C) y el tiempo de prueba (6 h). Sin
embargo, si se considera que ambas soluciones muestran el mismo peso molecular (65.5
kDa), sugiriendo que su movilidad electroforética no se vio modificada por algún daño
en la proteína.
En el caso de las bandas de la solución de ASB desnaturalizada 0 h y la desnaturalizada
e incubada a 37°C durante 6 h, cuyas bandas muestran un menor porcentaje de intensidad
de 14.1% y 14%, respectivamente. También muestra entre sí un mismo peso molecular
(65.8 kDa). Lo anterior sugiere que el proceso térmico para desnaturalizar a las proteínas
generó cambios, aunque leves, donde las proteínas se mostraron más pesadas debido a
una posible y leve agregación proteica. Sin embargo, al ser cambios leves, sugiere que se
generó una reorganización entre las mismas proteínas, por lo que el proceso de agregación
fue reversible y los cambios en porcentaje de intensidad y peso molecular se deban a la
formación de pequeños agregados compuestos por oligómeros de diferente tamaños
(diméricos, triméricos o monoméricos) (Rodríguez-Bolaños et al., 2020).
Para el caso de los controles de las soluciones lubricantes de SFB Nativo 0 h y SFB Nativo
incubado a 37°C durante 6h, se observa que la banda mayoritaria muestra un peso
molecular 63 kDa que corresponde a la albumina, con porcentajes e intensidades
parecidos de 11.2% y 11.1%, respectivamente. Sin embargo, en las soluciones de SFB
desnaturalizado 0 h y desnaturalizado e incubado a 37 ºC durante 6 h, se muestra una
disminución en el porcentaje de intensidad de la banda mayoritaria con valores de 10.8%
69
y 8.9%, respectivamente, mostrando una reducción más evidente en la incubada. También
se dieron cambios con respecto a su peso molecular de su banda mayoritaria, con pesos
de 62.4 y 63.4 kDa, respectivamente, en el caso de las bandas minoritarias en el SFB
desnaturalizado e incubado a 37ºC, solo se observa la de 56.6 y 23.4 kDa.
Lo anterior propone que los cambios inducidos por el proceso de desnaturalización per
se reducen levemente la estabilidad de estas proteínas al promover la exposición de
algunos residuos o superficies hidrofóbicas para que se den interacciones con proteínas
de albúmina y las globulinas. Es posible, que la mayor diferencia en su porcentaje de
intensidad y peso se deba a que en las soluciones de SFB se formaron agregados más
grandes que fueron irreversibles (Rodríguez-Bolaños et al., 2020).
Figura 28. Perfil de proteínas de soluciones lubricantes control de ASB y SFB, todas a una concentración de 20 μg de proteínas totales, sometidas a electroforesis SDS PAGE
al 10 %. El carril 1 corresponde al MPM, del carril 2 al 5 correspondientes a los controles de las soluciones de ASB y del carril 7 al 10 las de SFB. Condiciones de corrida:
voltaje constante a 200 V durante 45 minutos. Concentración total de proteína de 20 μg en 20 μL.
Tabla 16. Porcentaje de intensidad de la banda mayoritaria de 66.5 kDa, que corresponde a la albumina
en las soluciones control de ASB y SFB.
Solución lubricante
Carril
Porcentajes de
Intensidad de la
banda mayoritaria
(%)
PM (kDa)
Banda
mayoritaria
ASB nativa 0 h 2 14.8 65.5
ASB nativa incubada a
37°C/6 h 3 15.1 65.5
ASB desnaturalizada 0 h 4 14.1 65.8
ASB desnaturalizada
incubada a 37°C/6 h 5 14.0 65.8
- vacío - -
SFB nativo 0 h 7 11.2 63.0
SFB nativo incubado a
37°C/6 h 8 11.1 63.0
SFB desnaturalizado 0 h 9 10.8 62.4
SFB desnaturalizado
incubado a 37°C/6 h 10 8.9 63.4
72
B) Perfil de proteínas de las soluciones lubricantes de ASB nativa y desnaturalizada
sometidas a diferentes parámetros en el tribómetro de bola en disco.
En la Figura 29 (A, B y C) se muestran los perfiles de proteínas de los controles y de las
soluciones sometidas a los diferentes parámetros tribológicos, donde en (A) se muestran
los controles de la solución lubricante de ASB nativa y desnaturalizada, en (B y C) las
soluciones lubricantes de ASB nativa y desnaturalizada, respectivamente. En la Figura
31A, se observa una banda mayoritaria que corresponde a la albúmina contenida en las
soluciones controles nativas y desnaturalizadas de ASB (carril 2 al 5), en la Figura 29B
las soluciones sometidas a las 8 pruebas tribológicas (carriles 2 al 10). Se observa que las
soluciones lubricantes de ASB nativas y complementándose con los porcentajes de
intensidad y peso molecular de la Tabla 17, la solución de ASB nativa incubada a 37ºC
durante 6 h presenta un porcentaje de intensidad de 10.5% y 65.5 kDa de peso molecular.
En comparación con el control incubado, las soluciones que fueron sometidas a los
parámetros tribológicos: 2N-20%-20mm/s y 2N-1800%-20mm/s muestran el mayor
porcentaje de intensidad con 12.5 y 12.1% y con pesos moleculares de 65.2 y 64.8 kDa,
respectivamente. Por otra parte, la solución que presenta un menor porcentaje de
intensidad con respecto al control es la que se utilizó los siguientes parámetros: 8N-
1800%-80mm/s con 8.3% y con un peso molecular de 66.4 kDa. Para el resto de las
soluciones, se observan porcentajes de intensidad parecidos pero mayores que el control
y fueron las que se sometieron a los siguientes parámetros: 2N-1800%-80mm/s (con
10.8% y 65.2 kDa), 8N-1800%-20mm/s (con 11% y 65.7 kDa), 8N-20%-20mm/s y 8N-
20%-80mm/s con 11.5% ambas y 65.2 y 65.7 kDa, respectivamente; y por último la
combinación de parámetros 2N-20%-80mm/s con 11.8% de intensidad y 64.5 kDa de
peso molecular. En todos los casos y a excepción del carril 10, se observan dos bandas
minoritarias de aproximadamente 50 kDa y otra por arriba de los 37 kDa.
Para el caso del gel que representa las soluciones de ASB desnaturalizadas previamente
a 70°C durante 30 minutos y después incubada o sometidas a los parámetros tribológicos
(Figura 29C) es complementa con los valores de la Tabla 18. Se observa que la solución
de ASB desnaturalizada e incubada a 37°C mostró un porcentaje de intensidad de 11.1%
con 65.8 kDa de peso molecular. En comparación, las pruebas que presentaron un mayor
porcentaje de intensidad con respecto al control fueron las sometidas a los parámetros
siguientes: 2N-20%-20mm/s y 2N-20%-80mm con 12.3% y pesos moleculares de 65 y
65.4 kDa, respectivamente. Para el caso que presentó el menor porcentaje de intensidad
73
fue la solución sometida a la combinación de parámetros tribológicos de 8N-1800%-
80mm/s con 9.3% de intensidad y 66.6 kDa de peso molecular. Sin embargo, las
soluciones que se encuentran por debajo del porcentaje de intensidad fueron las sometidas
a las siguientes combinaciones de parámetros: 2N-1800%-20mm/s y 2N-20%-80mm con
10.5 y 10.6% de intensidad y pesos moleculares de 66.1 y 66.6 kDa, respectivamente.
Para el resto de las soluciones, presentaron porcentajes de intensidad igual o cercanos
pero por encima del control, y fueron las sometidas a las combinaciones de parámetros
siguientes: 8N-20%-20mm/s, 8N-20%-80mm/s y 8N-1800%-20mm/s con 11.1, 11.4 y
11.3% de intensidad, respectivamente. Las dos primeras con el mismo peso molecular de
66.1 kDa y la última con 65.8 kDa. De igual forma en todos los casos se observan dos
bandas minoritarias de aproximadamente 50 kDa y otra por arriba de los 37 kDa.
Figura 29. Comparación de integridad de las proteínas entre las soluciones lubricantes de ASB nativa y desnaturalizada en comparación con sus respectivos controles. (A)
Controles de ASB, el carril 1 corresponde al MPM, de carril 2 al 5 se observan las bandas correspondientes a los controles. (B) ASB nativa, carril 1 es el MPM, del carril 2 al
10 indican los diferentes parámetros a los que fueron sometidas las soluciones. (C) ASB desnaturalizada, carril 1 es el MPM, del carril 2 al 10 indican los diferentes parámetros
a los que fueron sometidas las soluciones. Condiciones de corrida: voltaje constante a 200 V durante 45 minutos. Concentración total de proteína de 20 μg en 20 μL.
75
Tabla 17. Porcentaje de intensidad de la banda mayoritaria de 66.5 kDa en la solución lubricante de ASB
nativa sometida a las diferentes condiciones en el tribómetro de bola en disco.
Tabla 18. Porcentaje de intensidad de la banda mayoritaria de 66.5 kDa en la solución lubricante de ASB
desnaturalizada sometida a las diferentes condiciones en el tribómetro de bola en disco.
Parámetros
tribológicos en la
solución ASB nativa
Carril
Porcentajes de
Intensidad de la
banda
mayoritaria (%)
PM (kDa)
Banda mayoritaria
37°C-6h nativa 2 10.5 65.5
2N-20%-20mm/s 3 12.5 65.2
2N-20%-80mm/s 4 11.8 64.5
2N-1800%-20mm/s 5 12.1 64.8
2N-1800%-80mm/s 6 10.8 65.2
8N-20%-20mm/s 7 11.5 65.2
8N-20%-80mm/s 8 11.5 65.7
8N-1800%-20mm/s 9 11.0 65.7
8N-1800%-80mm/s 10 8.3 66.4
Parámetros tribológicos
en la solución ASB
desnaturalizada
Carril
Porcentajes de
Intensidad de la
banda mayoritaria
(%)
PM (kDa)
Banda
mayoritaria
37°C-6h desnaturalizada 2 11.1 65.8
2N-20%-20mm/s 3 12.3 65.0
2N-20%-80mm/s 4 12.3 65.4
2N-1800%-20mm/s 5 10.5 66.1
2N-1800%-80mm/s 6 10.6 66.6
8N-20%-20mm/s 7 11.1 66.1
8N-20%-80mm/s 8 11.4 66.1
8N-1800%-20mm/s 9 11.3 65.8
8N-1800%-80mm/s 10 9.3 66.6
76
C) Perfil de proteínas de las soluciones lubricantes de SFB nativo y desnaturalizado
sometidas a diferentes parámetros en el tribómetro de bola en disco.
La Figura 30 (A, B y C), muestra los controles de la solución lubricante de SFB nativo
y desnaturalizado (A), en las figuras B y C las soluciones lubricantes de SFB nativo y
desnaturalizado sometido a los diferentes parámetros en el tribómetro de bola en disco
respectivamente. En el caso de los controles (Figura 32A), se observa una banda
mayoritaria que corresponde a la albúmina contenida en las soluciones nativas y
desnaturalizadas de SFB incubadas a 37ºC durante 6 h (carril 2 al 5),.En el caso de las
soluciones lubricantes de SFB nativo en la Figura 30B que también se complementaron
con los porcentajes de intensidad y peso moleculares que se muestran en la Tabla 19.
Con base en lo anterior, la solución de SFB nativo incubado a 37ºC durante 6 h presenta
un porcentaje de intensidad de 12.9% y 63 kDa de peso molecular. Si se compara contra
el mencionado control, las soluciones de SFB nativo que presentan el mayor porcentaje
de intensidad fueron las sometidas a las combinaciones parámetros tribológicos
siguientes: 2N-20%-20mm/s y 8N-20%-20mm/s con 14.7 y 14.1% de intensidad, y pesos
moleculares de 62.6 y 62.1 kDa, respectivamente. No obstante, la solución que presenta
un menor porcentaje de intensidad con respecto al control es la que se utilizó la
combinación de parámetros siguientes: 8N-1800%-80mm/s con 1.4% de intensidad y
peso molecular de 62.6 kDa que muestra cierto grado de hidrólisis que en consecuencia
formó un fragmento de 50.5 kDa. Las soluciones lubricantes de SFB nativo que también
se encuentran por debajo de los valores de porcentaje de intensidad del control fueron las
que sometidas a las pruebas con los siguientes parámetros: 8N-20%-80mm/s, 2N-20%-
80mm/s y 8N-1800%-20mm/s con 7.6, 10 y 12.4% con 60.9, 61.4 y 62.1 kDa,
respectivamente. Para el resto de las soluciones, se observan porcentajes de intensidad
cercanos pero mayores que el control fueron las que se sometieron a los siguientes
parámetros: 2N-1800%-80mm/s (con 13.4% y 62.1 kDa de peso molecular) y 2N-1800%-
20mm/s (con 13.6% y 60.9 kDa de peso molecular). En relación a las bandas minoritarias
la de 56.6 kDa no se observa en el carril 8 y 10, la de 54.7 kDa no se observa en los
carriles 2, 8 y 10, las bandas de 49.1 y 23.4 no se observan en ninguno de los casos.
Por otra parte, las soluciones de SFB desnaturalizadas previamente a 70°C durante 30
minutos y posteriormente incubada o sometidas a los parámetros tribológicos (Figura
30C), la cual se complementa con los valores de la Tabla 20. Se observa que la solución
de SFB desnaturalizada e incubada a 37°C mostró un porcentaje de intensidad de 11.3%
77
con 63.4 kDa de peso molecular. En contraste las soluciones que presentan el menor
porcentaje de intensidad fueron las sometidas a las combinaciones parámetros
tribológicos siguientes: 8N-1800%-80mm/s y 2N-1800%-80mm/s con 9.1 y 9.8% de
intensidad, y con pesos moleculares de 63.8 y 64.1 kDa, respectivamente.
Sin embargo, otras de las soluciones que se encuentran por debajo y cercanas del
porcentaje de intensidad fueron las sometidas a las siguientes combinaciones de
parámetros: 8N-20%-80mm/s y 2N-1800%-20mm con 11.2 y 11.1% de intensidad y
pesos moleculares de 63.4 y 64.1 kDa, respectivamente. Para el resto de las soluciones,
se presentaron porcentajes de intensidad igual o cercanos pero por encima del control,
fueron las sometidas a las combinaciones de parámetros siguientes: 2N-20%-80mm/s,
8N-20%-20mm/s y 8N-1800%-20mm/s con 11.6, 11.7 y 11.7% de intensidad
respectivamente, y pesos moleculares de 63.8, 63.8 y 63.4 kDa, respectivamente. En
relación a las bandas minoritarias la de 56.6 y 54.7 kDa no se observa en el carril 10, las
bandas de 49.1 y 23.4 no se observan en ninguno de los casos.
Figura 30. Comparación de integridad de las proteínas entre las soluciones de SFB nativo y desnaturalizado con sus respectivos controles. El carril 1 corresponde al MPM,
mostrando hasta la banda de 25 kDa. Del carril 2 al 5 se observan las bandas correspondientes a los controles. Para los geles de SFB nativo y desnaturalizado el carril 1 es el
MPM, el carril 2 el control correspondiente que fue incubado y del carril 2 al 10 las muestras que indican los diferentes parámetros a los que fueron sometidas las soluciones.
Condiciones de corrida: voltaje constante a 200 V durante 45 minutos. Concentración total de proteína de 20 μg. Muestra inyectada en cada pozo: 20 μL.
79
Tabla 19. Porcentaje de intensidad de la banda mayoritaria de 66.5 kDa en la solución lubricante de SFB
nativo sometida a las diferentes condiciones en el tribómetro de bola en disco.
Tabla 20. Porcentaje de intensidad de la banda mayoritaria de 66.5 kDa en la solución lubricante de SFB
desnaturalizado sometida a las diferentes condiciones en el tribómetro de bola en disco.
Parámetros
tribológicos en la
solución SFB nativo
Carril
Porcentajes de
Intensidad de la
banda
mayoritaria (%)
PM (kDa)
Banda
mayoritaria
PM (kDa)
Banda
minoritaria
37°C-6 h nativo 2 12.9 63 -
2N-20%-20mm/s 3 14.7 62.6 -
2N-20%-80mm/s 4 10.0 61.4
-
2N-1800%-20mm/s 5 13.6 60.9
-
2N-1800%-80mm/s 6 13.4 62.1
-
8N-20%-20mm/s 7 14.1 62.1
-
8N-20%-80mm/s 8 7.6 60.9 -
8N-1800%-20mm/s 9 12.4 62.1 -
8N-1800%-80mm/s 10 1.4 62.6 50.5
Parámetros tribológicos en
la solución SFB
desnaturalizado
Carril
Porcentajes de
Intensidad de la
banda mayoritaria
(%)
PM (kDa)
Banda
mayoritaria
37°C-6 h desnaturalizado 2 11.3 63.4
2N-20%-20mm/s 3 12.5 63.8
2N-20%-80mm/s 4 11.6 63.8
2N-1800%-20mm/s 5 11.1 64.1
2N-1800%-80mm/s 6 9.8 64.1
8N-20%-20mm/s 7 11.7 63.8
8N-20%-80mm/s 8 11.2 63.4
8N-1800%-20mm/s 9 11.7 63.4
8N-1800%-80mm/s 10 9.1 63.8
5.1.5 Coeficiente de fricción
El comportamiento que el COF presenta en cada prueba tribológica con la solución
correspondiente muestra efectos considerables que sugieren estar relacionados con varios
factores. A continuación, se muestran los datos obtenidos del tribómetro de bola en disco.
En estas se pueden observar los ocho parámetros de las pruebas tribológicas utilizando
como solución lubricante la ASB nativa y desnaturalizada y el SFB nativo y
desnaturalizado. Se representan mediante gráficos de dispersión, con una escala de 0 a
0.3 de COF (las unidades son adimensionales) y cómo va cambiado a lo largo de 21600
segundos (6 h). Las etiquetas de línea continua representan la combinación de parámetros
donde la Vm es baja, SRR y L altos, bajos o ambos. Las líneas discontinuas representan
el cambio a Vm alta con la combinación de SRR y L altos, bajos o ambos.
En la Figura 31 se muestra la variación del COF con las soluciones de ASB nativa
utilizando los parámetros tribológicos determinados anteriormente. Se observa una
tendencia de COF entre 0.05 y 1 que se mantiene constante durante las 6 h cuando se
utilizan los siguientes parámetros: “8N-20%-20mm/s”, “8N-20%-80mm/s”, “8N-1800%-
20mm/s” y “8N-1800%-80mm/s” de los cuales coincide que tienen carga alta. Sin
embargo, se muestra un cambio de comportamiento con los siguientes parámetros: “2N-
20%-20mm/s”, “2N-20%-80mm/s”, “2N-1800%-20mm/s” y “2N-1800%-80mm/s”
(cuando se utilizan cargas bajas), ya que inician con un COF entre 0.1 y 0.2 que tiende a
caer paulatinamente durante las 3 primeras horas con un ligero incremento luego de 4 h.
Figura 31. Coeficiente de fricción de las soluciones lubricantes de ASB nativa, sometidas a las pruebas
tribológicas en un tribómetro de bola en disco a 37ºC durante 6h.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 3600 7200 10800 14400 18000 21600
Co
efi
cie
nte
de
fri
cció
n
Tiempo (s)
2N-20%-20mm/s
2N-20%-80mm/s
2N-1800%-20mm/s
2N-1800%-80mm/s
8N-20%-20mm/s
8N-20%-80mm/s
8N-1800%-20mm/s
8N-1800%-80mm/s
81
En la Figura 32 se muestra la variación del COF con las soluciones de BSA
desnaturalizada. Se observa una tendencia de COF similar a la observada cuando se utiliza
ASB nativa, sin embargo, la diferencia está en que al utilizar la solución de ASB
desnaturalizada, las oscilaciones incrementan y decaen en diferente tiempo con cargas
altas (“8N-20%-20mm/s”, “8N-20%-80mm/s”, “8N-1800%-20mm/s” y “8N-1800%-
80mm/s”). Sin embargo, para los parámetros: “2N-20%-20mm/s” y “2N-20%-80mm/s”
presentan cambios sutiles a lo largo del tiempo. Para “2N-1800%-20mm/s” y “2N-
1800%-80mm/s” también muestran una tendencia bastante similar entre sí.
Figura 32. Coeficiente de fricción de las soluciones lubricantes de ASB desnaturalizada, sometidas a las
pruebas tribológicas en un tribómetro de bola en disco a 37ºC durante 6h.
En la Figura 33 se muestra el comportamiento del COF con las soluciones de SFB
desnaturalizado. Se observa una tendencia de COF similar a la observada cuando se
utiliza ASB nativa y desnaturalizada, excepto en el caso de las pruebas que utilizan los
siguientes parámetros: “2N-1800%-20mm/s” y “2N-1800%-80mm/s” (cargas bajas),
“8N-1800%-20mm/s” y “8N-1800%-80mm/s” (cargas altas). En estos casos, el COF
presenta un comportamiento que sugiere no siguen alguna tendencia o patrón.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 3600 7200 10800 14400 18000 21600
Co
efi
cie
nte
de
fri
cció
n
Tiempo (s)
2N-20%-20mm/s
2N-20%-80mm/s
2N-1800%-20mm/s
2N-1800%-80 mm/s
8N-20%-20mm/s
8N-20%-80mm/s
8N-1800%20mm/s
8N-1800%-80mm/s
82
Figura 33. Coeficiente de fricción de las soluciones lubricanes de SFB nativo, sometidas a las pruebas
tribológicas en un tribómetro de bola en disco a 37ºC durante 6h.
En la Figura 34 se muestra el comportamiento del COF con las soluciones de SFB
desnaturalizado. Se observa una tendencia de COF si bien similar a la observada en SFB
nativo, pareciera un comportamiento aún más incierto en casi la mayoría de las
combinaciones de parámetros tribológicos.
Figura 34. Coeficiente de fricción de las soluciones lubricantes de SFB desnaturalizado, sometidas a las
pruebas tribológicas en un tribómetro de bola en disco a 37ºC durante 6h.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 3600 7200 10800 14400 18000 21600
Co
efi
cie
nte
de
fri
cció
n
Tiempo (s)
2N-20%-20mm/s
2N-20%-80mm/s
2N-1800%-20mm/s
2N-1800%-80mm/s
8N-20%-20mm/s
8N-20%-80mm/s
8N-1800%-20mm/s
8N-1800%-80mm/s
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 3600 7200 10800 14400 18000 21600
Co
efi
cie
nte
de
fri
cció
n
Tiempo (s)
2N-20%-20mm/s
2N-20%-80mm/s
2N-1800%-20mm/s
2N-1800%-80mm/s
8N-20%-20mm/s
8N-20%-80mm/s
8N-1800%-20mm/s
8N-1800%-80mm/s
83
VI. DISCUSIÓN
Se han reportado cambios conformacionales de las proteínas contenidas en suero de
ternera bovina al 25% y en líquido sinovial humano, al ser empleadas en pruebas de
desgaste de bolas de cromo-cobalto-molibdeno (CoCrMo) en diferentes tipos de
tribómetros como el de bola en disco o perno en disco. Ellos analizaron los depósitos
orgánicos de la superficie después de la prueba por Espectroscopia de absorción y sus
resultados mostraron que los depósitos eran principalmente proteínas desnaturalizadas
con un mayor contenido de láminas β. Para identificar las estructuras de lámina β no
nativas utilizaron la imagen fluorescente de las películas depositadas mediante el
colorante molecular tioflavina T y sus resultados indicaron fibrillas de lámina β no nativas
agregadas. En cuanto a la presencia de depósitos en la huella de desgaste mediante
microscopía electrónica de barrido, sus resultados mostraron una huella reducida debido
a la proteína depositada. Por lo tanto, se cree que la formación de películas de proteínas
insolubles y desnaturalizadas es el principal mecanismo de lubricación que contribuye a
la protección de la superficie de la bola de CoCrMo durante su frotamiento contra el
polietileno (Stevenson et al., 2019). Además se ha reportado también que las proteínas
fetales del suero se desnaturalizan debido al cizallamiento dentro del volumen confinado
cerca de la zona de contacto. Sugieren que las proteínas desnaturalizadas forman
agregados insolubles, particularmente sin contenido de lámina β, que es una estructura de
fibrillas de tipo amiloide (Stevenson et al., 2019). En otro estudio, se observaron
diferencias significativas entre las películas frescas (no probadas) y los depósitos de suero
fetal posteriores a una prueba que indicaban la desnaturalización de las proteínas. Los
depósitos de proteínas tenían un mayor contenido de láminas β y parecían estar adheridas
y sólidas cuando se secaban (Schmid & Beer, 2001).
Dado que los valores de absorbancia en el espectro UV-Vis reportados en la literatura no
corresponden a soluciones lubricantes sometidas a pruebas tribológicas (Pignataro et al.,
2020) , no se dispone de datos para comparar con los resultados obtenidos en el presente
trabajo. Sin embargo, de acuerdo con el principio de absorción de la radiación en el rango
UV por las proteínas, donde los aminoácidos aromáticos (tirosina, triptófano y
fenilalanina) absorben luz entre 280-300 nm y el enlace peptídico de la cadena principal
de la proteína absorbe la luz en el rango entre 180-230 nm (Skoog et al., 2008), se
considera que en las proteínas nativas, si los residuos aromáticos están ocultos en el
84
núcleo hidrofóbico de la molécula, se muestran un pequeño desplazamiento en su
absorbancia, que se invierte cuando quedan expuestos al desplegarse la proteína.
Generalmente, las diferencias de absorbancia entre las formas nativas y desnaturalizadas
de una proteína son pequeñas, pero útiles para monitorear los cambios conformacionales
de una proteína (Schmid & Beer, 2001). En el presente trabajo, se observó que en la
solución de ASB nativa, las proteínas presentaron cierta tendencia a exponer sus enlaces
peptídicos (amidas) y a mantener ocultos sus aminoácidos aromáticos después de haber
sido sometidas a las pruebas tribológicas. Sin embargo, se observó que en la solución
lubricante de ASB nativa incubada a 37°C-6 h y las sometidas a los parámetros 2N-
1800%-80mm/s y 8N-1800%-20mm/s se formaron agregados proteicos por la dispersión
de la luz detectada en sus espectros. Esto coincide con el proceso de agregación de
proteínas, el cual está estrechamente relacionado con los cambios en la hidrofobicidad
superficial y carga, que es consecuencia de la exposición gradual y los cambios en la
distribución de los aminoácidos cargados en la superficie (Schmid & Beer, 2001). No
obstante, la solución de ASB desnaturalizada mantiene sus enlaces peptídicos (amidas)
cubiertos y tiende a la exposición de los aminoácidos aromáticos. Por lo que estos
cambios generaron agregados proteicos solo en las pruebas en las que se usaron los
parámetros: 2N-1800%-20mm/s, 2N-1800%-80mm/s, 8N-20%-80mm/s y en mayor
medida 8N-1800%-80mm/s.
Para el caso de las soluciones lubricantes de SFB nativo, se sugiere que las proteínas
(tanto la ASB como las globulinas) promueven una mayor interacción entre sí, resultando
en una mayor agregación proteica. Esto se sugiere debido a que en más combinaciones
de parámetros tribológicos se detectó dispersión de la luz, como en las pruebas que
emplearon los siguientes parámetros: “2N-20%-80mm/s”, “2N-1800%-20mm/s”, “2N-
1800%-80mm/s”, “8N-20%-20mm/s”, “8N-20%-80mm/s”, “8N-1800%-20mm/s” y
“8N-1800%-80mm/s”.
Con relación a las soluciones lubricantes de SFB desnaturalizado, se observó que los
enlaces peptídicos (amidas) mostraron tendencia a exponerse al igual que los aminoácidos
aromáticos. No obstante, las soluciones lubricantes que mostraron agregación proteica
(dispersión de la luz), fueron las sometidas a las pruebas tribológicas con los siguientes
parámetros: 2N-20%-20mm/s, 2N-20%-80mm/s, 2N-1800%-20mm/s, 2N-1800%-
80mm/s, 8N-1800%-20mm/s y 8N-1800%-80mm/s en mayor cantidad. Lo que indica la
misma tendencia a formar agregados en presencia de las globulinas.
85
En cuanto a la concentración de proteínas, se han realizado estudios en los que se ha
comprobado que la eficacia como lubricante de la ASB y γ-globulina depende de su
concentración. Para ello, usaron un nivel máximo de concentración de ASB y un nivel
fisiológico de concentración de γ-globulina sobre una cabeza femoral de cromo-cobalto.
Los coeficientes de fricción disminuyeron al aumentar las concentraciones de ASB de (10
a 40 mg/mL). Con la γ-globulina los coeficientes de fricción disminuyeron
significativamente en las concentraciones de 2.5 y 5.0 mg/mL, pero aumentó con 7.5 y
12.5 mg/mL, sugiriendo que la fricción de la cabeza femoral depende de la concentración
de ASB y γ-globulina. Sin embargo, remarcaron que existe una concentración máxima
para que la ASB actúe como un lubricante, mientras que la capacidad lubricante de la γ-
globulina es más eficaz en el rango de concentración fisiológica que tiene dentro del
líquido sinovial humano (Duong et al., 2012).
Otros investigadores utilizaron un simulador de articulación de rodilla para verificar un
método para estudiar la formación de una película lubricante sobre la prótesis de rodilla.
Encontraron que la capa de ASB es considerablemente más gruesa en comparación con
la de γ-globulina sugiriendo que se debe a la mayor concentración de ASB en las
soluciones que utilizaron (mezclas de ASB 24.6 mg/mL + γ- 6.1 mg/mL e individuales)
(Nečas et al., 2019). En otro estudio, el ácido hialurónico y la γ-globulina mejoraron
significativamente la fricción del cartílago solo en la osteoartritis (OA) en fase avanzada,
pero no en la OA normal ni en la fase inicial (Park et al., 2014).
Por otra parte, se han reportado diferencias significativas entre las películas frescas (no
sometidas a las pruebas) y los depósitos de SFB posteriores a la prueba. Los depósitos de
proteínas tenían un mayor contenido de láminas β y parecían ser adherentes y que se
solidificaban cuando se secaban. Esto se observó a través de una prueba que se desarrolló
para medir la fricción y el desgaste de los materiales de los implantes de cadera en
condiciones de deslizamiento recíproco. Sus resultados mostraron que los volúmenes de
fluido <1,5 mL se vieron afectados por la pérdida de volumen por evaporación,
aumentando efectivamente la concentración de proteínas, lo que dio lugar a un desgaste
menor. Los depósitos estaban compuestos principalmente por proteínas desnaturalizadas,
por lo que el análisis confirmó la importancia de las proteínas del SFB en la determinación
del desgaste de los pares de CoCrMo (Stevenson et al., 2018). Los estudios mencionados
mostraron la importancia no sólo de las proteínas (en particular la ASB y la γ-globulina),
sino también de los demás componentes del SFB.
86
De acuerdo con los resultados del presente estudio, en relación con la concentración de
proteínas, se muestra que algunas de las soluciones lubricantes de ASB (nativa y
desnaturalizada) tuvieron exposición de aminoácidos básicos debido a cambios en su
conformación lo que provocó una mayor interacción con el colorante. Estas soluciones
lubricantes fueron las que se sometieron a las pruebas con los parámetros tribológicos
siguientes: “2N-20%-20mm/s (nativa)”, “2N-20%-80mm/s (desnaturalizada)”, “2N-
1800%-20mm/s (nativa)” y “8N-1800%-80mm/s (nativa)”. Lo que indica que en tres
soluciones nativas y una desnaturalizada predominó significativamente la exposición de
sus aminoácidos básicos causada por las condiciones de cada prueba, mostrando un
aumento en la concentración de proteína total cuantificada. Para el caso de aquellas
soluciones lubricantes en las que sus proteínas mostraron encubrimiento de sus
aminoácidos básicos, tuvieron una menor interacción con el colorante y en consecuencia,
una menor concentración de proteínas totales. Dichas soluciones lubricantes de ASB tanto
nativa como desnaturalizada fueron las que se sometieron a los siguientes parámetros
tribológicos: “2N-20%-20mm/s (desnaturalizada), “2N-1800%-20mm/s
(desnaturalizada)”, 8N-20%-20mm/s (nativa), 8N-20%-20mm/s (desnaturalizada)” y
“8N-1800%-80mm/s (desnaturalizada)”. Lo que indica que en cuatro soluciones
desnaturalizadas y una nativa predominó la tendencia significativa al encubrimiento de
sus aminoácidos básicos y en consecuencia la detención de concentraciones menores de
proteínas totales en solución.
En relación con las soluciones lubricantes de SFB se observa que cuando sucede la
exposición de aminoácidos básicos y, por lo tanto, una mayor interacción con el colorante,
se muestra una mayor concentración de proteínas, siendo éstas las sometidas a las pruebas
con los parámetros tribológicos siguientes: “2N-20%-80mm/s (desnaturalizado)”, “2N-
1800%-80mm/s (desnaturalizado)”, “8N-20%-20mm/s (nativo)” y “8N-1800%-80mm/s
(nativo). Lo que indica que en dos soluciones nativas y dos desnaturalizadas predominó
la tendencia significativa a la exposición de sus aminoácidos básicos causada por las
condiciones de cada prueba.
Para las soluciones lubricantes de SFB (nativos y desnaturalizados) donde se perciben un
encubrimiento de sus aminoácidos básicos (menor interacción con el colorante y menor
concentración de proteínas) fueron las que se sometieron a las pruebas tribológicas
siguientes: “8N-20%-20mm/s (desnaturalizado)” y “8N-20%-80mm/s
(desnaturalizado)”. Lo que indica que en dos soluciones desnaturalizadas predominó la
87
tendencia de manera significativa al encubrimiento de sus aminoácidos básicos debido a
los parámetros de cada prueba, en comparación con el control, para este caso ninguna
solución lubricante de SFB nativo mostraron un valor que hiciera pensar sobre la
aparición de plegamientos en las proteínas. Esto sugiere que hubo aumento o disminución
en la disponibilidad de los aminoácidos básicos (Arg, Lys e His), probablemente debido
a que las proteínas se agregaron como consecuencia de los cambios en su conformación,
ocultando aminoácidos básicos que podrían interactuar con el colorante azul de
Coomassie.
Con respecto a la estabilidad de los enlaces disulfuro de la estructura terciaria de las
proteínas en todas las soluciones lubricantes, no se ve comprometida por ninguno de los
parámetros tribológicos utilizados, de tal manera que los grupos sulfhidrilos libres no han
sido expuestos. Sin embargo, los resultados típicos sobre los grupos sulfhidrilos libres
han sido ampliamente conocidos como grupos funcionales importantes en muchas
proteínas alimentarias (es decir, el reactivo de Ellman se aplica a la harina, la clara de
huevo, la leche y sus productos) (Stevenson et al., 2018). Sin embargo, se sabe que se
presenta la exposición de los grupos sulfhidrilos en el procesamiento por ultra-alta
temperatura UHT- 9s sometida a 151.7 °C para la leche pasteurizada. Por lo que, en las
proteínas del suero de la leche, la presencia de grupos sulfhidrilo libres se produce de
forma concomitante con el desarrollo del sabor a cocido. Además la inestabilidad de las
proteínas del suero de la leche durante el tratamiento térmico (leche desnatada calentada
a 100 o 90°C durante 30 minutos) provoca ruptura de los enlaces disulfuro de las proteínas
en el suero de leche, exponiendo así sus grupos sulfhidrilo (Patrick & Swaisgood, 1976).
Lo explicado anteriormente, ejemplifica las condiciones que permiten cuantificar los
grupos sulfhidrilo por la ruptura del enlace disulfuro. Por lo tanto, en el presente estudio
se confirma que las condiciones tribológicas y la desnaturalización previa de las
soluciones lubricantes utilizadas no exponen los grupos sulfhidrilo de las proteínas
presentes en las soluciones lubricantes y que fueron sujetas a diversos parámetros
tribológicos.
De acuerdo con los resultados publicados en 2009 por Fang et al. sobre el efecto de
procesos térmicos implementados con diferentes temperaturas (55, 75 y 90 °C) y
comparados mediante electroforesis en SDS-PAGE de la ASB, se propuso que no
detectaron bandas de proteína adicionales, tanto para el control como para las soluciones
de ASB experimentales. Sugirieron que los procesos térmicos no hidrolizaron la molécula
88
(Fang et al., 2009). De manera similar sucede con la mayoría de las soluciones lubricantes
de ASB y SFB (nativos y desnaturalizados) empleados en esta investigación, ya que en
las combinaciones de parámetros tribológicos no se detectó la hidrólisis de las proteínas
presentes en las soluciones lubricantes ensayadas, a excepción de la solución lubricante
de SFB nativo que fue sometida a los parámetros 8N-1800%-80mm/s, donde se
observaron dos bandas con diferentes pesos moleculares de 62.6 y 50.5 kDa, que no
corresponden a la albumina que es la proteína mayoritaria y, que por lo tanto, nos indican
la hidrólisis de la proteína. Lo que sugiere que una velocidad y fuerza de cizallamiento
mayor debido a altos valores de Vm y SRR aunado a la carga elevada pudieron originar
la hidrólisis de las proteínas presentes en la solución de SFB nativa, debido a factores
relacionados a la complejidad del SFB acompañado del estrés mecánico, el cambio de la
presión hidrostática y la posible variación del pH (Barceinas-Sanchez et al., 2017).
También se debe mencionar que fue la única solución que presentó turbidez al final de
las 6 horas de prueba. Sin embargo, es posible que las otras soluciones que no presentaron
hidrólisis en las mismas condiciones de parámetros altos, sea debido a que sus cambios
fueron temporales y reversibles, por lo que de alguna manera lograron corregirse
formando posiblemente agregados entre sí o con los componentes del medio disponibles
(Rodríguez-Bolaños et al., 2020).
Otra de las investigaciones que han realizado estudios de electroforesis SDS-PAGE es la
de Dwivedi et al., (2017). Ellos compararon el uso de tres lubricantes (ASB escindida,
ASB no escindida y suero de ternera recién nacido) y sus efectos sobre el comportamiento
tribológico de pruebas donde se utilizó el par de UHMWPE/CoCrMo. Ellos sugieren que
la hidrólisis química de la ASB aumentaría la fricción y la tasa de desgaste del UHMWPE.
En pruebas de desgaste pin-on-flat (POF) contra discos de aleación CoCrMo, la ASB
escindida condujo al menor desgaste de UHMWPE y coeficientes de fricción más altos,
mientras que la ASB no escindida condujo a las tasas de desgaste más altas. Ellos
consideraron que los fragmentos de proteínas más pequeños pueden adsorberse de manera
más eficiente en las superficies tanto del UHMWPE como del metal, ofreciendo así
protección contra el desgaste, al tiempo que aumentan la fricción (Dwivedi et al., 2017).
Con relación a los resultados presentados con el uso de soluciones lubricantes de ASB y
SFB nativos y desnaturalizados, se puede sugerir que, si bien los fragmentos hidrolizados
que fueron inducidos provocaron menor desgaste y mayor COF debido a su mejor
adsorción. Nuestros resultados sugieren que primero las proteínas de las soluciones de
89
ASB nativa y desnaturalizada como de SFB desnaturalizado, tienden primero a formar
agregados proteicos, antes de permitir que se presente cierto grado de hidrólisis. Por lo
anterior, debe considerarse primero la respuesta a formar agregados por parte de las
proteínas, antes de abordar el uso de fragmentos obtenidos de manera inducida y no
debido a la prueba tribológica.
Esto debido a que la agregación proteica está relacionada con efectos adversos en otras
muchas enfermedades como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington
y la enfermedad de Parkinson, que están asociadas a la agregación de proteínas. La
agregación de proteínas es un proceso complicado y suele ir acompañada de cambios en
la conformación molecular que implica el desdoblamiento de las proteínas (Lan et al.,
2020).
Por lo observado en el patrón electroforético de las soluciones de ASB y SFB
desnaturalizados, posiblemente se indujo la agregación proteica tanto por el proceso de
desnaturalización inducida (70°C-30 min) como por el sometimiento a las pruebas
tribológicas. Esto debido a que la distribución de las formas poliméricas de ASB según
la fuente comercial, en este caso: Sigma presenta los siguientes porcentajes de forma
polimérica: Monómero (38.7±1.0 %), Dímero (30.1±1.4%) Tetrámero (21.6±1.1 9%) y
Hexámero (6±0.6%). Lo que nos sugiere que en caso de no encontrarse como monómero,
la ASB puede formar agregados con sus diferentes formas poliméricas por una
distribución de expansión/compactación estructural, donde se propone que los agregados
se forman a partir de especies dentro del conjunto del estado nativo que implican
interacciones no covalentes e hidrofílicas (Atmeh, 2007). Además, la ASB experimenta
varias transiciones dependientes del pH asociadas a reordenamientos que conducen a
cambios en las dimensiones moleculares y estas transiciones están asociadas a cambios
estructurales secundarios (Lan et al., 2020).
Por otro lado, para el caso de las soluciones de SFB, se sabe que no son una mezcla
homogénea, y tienen fracciones proteicas bien definidas: ASB y globulinas (α, β y γ), las
cuales difieren con respecto a la ASB por su peso molecular (65 kDa y 150 kDa,
respectivamente). Además las globulinas, tienen aproximadamente el mismo peso
molecular pero sus propiedades electroquímicas son muy diferentes, como el punto
isoeléctrico, la γ globulina tiene un pH = 6.0, en cambio las globulinas α y β tienen un pH
= 5.1. Además, las movilidades son muy diferentes, especialmente en las reacciones
90
alcalinas (Tiselius, 1937). Lo que sugiere que para las soluciones lubricantes de SFB tanto
nativas como desnaturalizadas, se debe considerar el pH de las globulinas para entender
su comportamiento e interacción y así visualizarlas mediante electroforesis, la cual se
sugiere sea por gradiente (Walker, 2002).
Con relación al comportamiento del COF, se sabe que éste depende de los parámetros
tribológicos (Vm, SRR y L). Sin embargo, se ha observado que el COF es menor cuando
se utiliza una solución lubricante que contenga proteínas, por otra parte, algunos
investigadores han propuesto que la velocidad media |Vm| no presenta un efecto
significativo sobre el COF (Garcia-Garcia et al., 2018). Otros investigadores demostraron
que a una velocidad de deslizamiento baja, igual a 10 mm/s, existía una correlación lineal
entre el COF y el espesor de la película proteica adsorbida. Así pues, un aumento de la
fricción iba acompañado del aumento de la película de proteínas. Ellos observaron que
en las soluciones de ASB y γ-globulina que utilizaron velocidad de deslizamiento baja,
dichas proteínas sufrieron cambios conformacionales sustanciales, perdiendo su
estructura original. Por el contrario, las proteínas podían mantener su estructura
secundaria cuando era utilizada una mayor velocidad de deslizamiento (50 mm/s). Este
fenómeno se lo atribuyeron a la diferente estructura de la ASB y la γ-globulina en su
estado nativo (Nečas et al., 2017). En otro estudio, se observó que los procesos térmicos
inducen la pérdida de la estructura secundaria de la ASB, en consecuencia, la estructura
desdoblada conduce a una mayor tasa de adsorción en la superficie del material y da lugar
a un aumento del COF. Se sugirió que la ASB desdoblada puede formar una capa
compacta de proteína que tiende a adherirse a la superficie hidrofóbica del UHMWPE
que da lugar a un aumento del COF (Fang et al., 2009).
De acuerdo con esta investigación, se sugiere que es importante identificar el estado de
la proteína (nativa o desnaturalizada) en las soluciones lubricantes antes y después de
realizar las pruebas tribológicas, ya que se observó que tienen una influencia en el
comportamiento del COF. Por otro lado, la variación en las ocho combinaciones de
parámetros tribológicos en relación con el tipo de solución lubricante usada mostró que
la combinación de valores altos y bajos en cada uno de los parámetros tribológicos,
tuvieron influencia sobre el COF a lo largo de las 6 horas de prueba. Se observó también
que cuando se utilizaba la solución lubricante de ASB nativa, la combinación de
parámetros que mantenían fijo el valor de carga en 2N, tenían un comportamiento similar.
De manera contraría sucedió que cuando el valor fijo de carga es alto (8N), ya que estas
91
combinaciones mostraron la tendencia del COF a disminuir pasadas aproximadamente
las primeras tres horas. No obstante, cuando a estas mismas combinaciones de parámetros
se les aplicó la solución de ASB desnaturalizada previamente, las pruebas que utilizaron
el valor fijo de carga baja (2N), sugirieron un patrón de comportamiento similar, aunque
con diferencias sutiles en el COF al inicio de la prueba. Sin embargo, cuando se utilizaron
los parámetros con carga fija alta (8N), las oscilaciones tuvieron un incremento
considerable a lo largo del tiempo de la prueba. Por otra parte, cuando se utilizaron las
soluciones lubricantes de SFB nativo en cada una de las pruebas, se observó que no se
repitió el patrón de comportamiento específicamente en la combinación de parámetros
que compartieron carga baja: “2N-1800%-20mm/s” y “2N-1800%-80mm/s”. También en
las que compartieron carga alta, que fueron las siguientes: “8N-1800%-20mm/s” y “8N-
1800%-80mm/s” no se observó un patrón similar a los anteriores. Para el caso de las
pruebas en las que se utilizó el SFB desnaturalizado, se presentan fluctuaciones más
erráticas y sin un patrón evidente como en las anteriores pruebas.
Por lo tanto, como se ha sido observado por otros investigadores, las diferencias
observadas en el COF parecen estar relacionadas con la combinación de los diferentes
valores de parámetros tribológicos, así como con los cambios en relación con el estado
en el que se encuentren las proteínas en solución. Además de la complejidad que presente
cada solución lubricante, ya que es posible sugerir que entre más sencilla sea la
composición de la solución, más estable permanece el COF, inclusive si se utilizan
valores extremos, como en el caso de los valores altos empleados en este trabajo.
92
VII. CONCLUSIONES
En este trabajo se analizaron los posibles cambios sufridos por las proteínas presentes en
cuatro soluciones lubricantes (ASB y SFB nativos y desnaturalizados) al final de las
pruebas en un tribómetro de bola en disco, mostrando que:
1. Los cambios en las absorbancias detectados en la solución lubricante de ASB y
SFB nativos y desnaturalizados, tras los ensayos tribológicos se deben a la exposición o
encubrimiento de los residuos aromáticos contenidos en las proteínas. Dicha exposición
gradual de las proteínas y los cambios en la distribución de los aminoácidos cargados en
la superficie, cambian la hidrofobicidad y las propiedades de carga de las proteínas. Por
lo tanto, el fenómeno de dispersión de la luz observado en las soluciones lubricantes
sugiere que se produjo un proceso de agregación de proteínas.
2. La concentración de proteínas totales en las cuatro soluciones lubricantes
estudiadas al final de los ensayos, mostró algunas diferencias significativas entre las
distintas combinaciones de parámetros tribológicos y tipo de solución lubricante. Por lo
tanto, se sugiere que los residuos de aminoácidos básicos y los grupos amidas (enlaces
peptídicos) en las proteínas, interactúan y se reorganizan entre sí posiblemente formando
agregados durante de las pruebas tribológicas.
3. Los enlaces disulfuro que permiten que la estructura terciaria de las proteínas
permanezca estable, no sufrieron ruptura, lo que sugiere que en las soluciones lubricantes
de ASB o SFB nativos y desnaturalizadas, los parámetros empleados en las pruebas
tribológicas no ocasionaron daño a nivel de estos enlaces.
4. Los análisis electroforéticos SDS-PAGE mostraron que dependiendo del tipo de
solución lubricante empleada ya sea en su forma nativa o desnaturalizada, y de las
condiciones empleadas en el tribómetro de bola disco, las proteínas presentes en algunas
soluciones lubricantes pueden sufrir algún grado de hidrólisis, siendo está más evidente
en la solución lubricante de SFB nativo bajo los parámetros tribológicos de valores altos;
sin embargo, la mayoría mostraron cambios en la movilidad electroforética, lo que puede
atribuirse a fenómenos de agregación proteica.
5. Se ha demostrado que el COF depende tanto del estado de la proteína (nativa y
desnaturalizada) contenida en las soluciones lubricantes, así como de las condiciones de
los parámetros tribológicos empleados.
93
VIII. REFERENCIAS
Alamilla Martínez, D. G. (Instituto P. N., Gómez Ramírez, M. (Instituto P. N., & Rojas
Avelizapa, N. G. (Instituto P. N. (2019). Caracterización parcial de las
biomoléculas de Alternaria alternata MVSS-AH-5 implicadas en la biorreducción
de metales. Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada
Unidad Querétaro. Posgrado en Tecnología Avanzada.
Atmeh, R. (2007). Albumin Aggregates : Hydrodynamic Shape and Physico - Chemical
Properties. 2(2), 169–182.
Barceinas-Sanchez, J. D. O., Alvarez-Vera, M., Montoya-Santiyanes, L. A.,
Dominguez-Lopez, I., & Garcia-Garcia, A. L. (2017). The coefficient of friction of
UHMWPE along an entire walking cycle using a ball-on-disc tribometer under
arthrokinematics and loading conditions prescribed by ISO 14243-3:2014. Journal
of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials, 65, 274–280.
https://doi.org/10.1016/j.jmbbm.2016.08.032
Bio-Rad Laboratories. (2010). Bio-Rad protein assay (Bradford). Bio-Rad, 1–24.
Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
Biochemistry, 72(1–2), 248–254. https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3
Chandrasekaran, M., & Loh, N. L. (2001). Effect of counterface on the tribology of
UHMWPE in the presence of proteins. Wear, 250–251(1–12), 237–241.
https://doi.org/10.1016/S0043-1648(01)00646-9
Chang, J. Y. (1997). A two-stage mechanism for the reductive unfolding of disulfide-
containing proteins. Journal of Biological Chemistry, 272(1), 69–75.
https://doi.org/10.1074/jbc.272.1.69
Cumming, G., Fidler, F., & Vaux, D. L. (2007). Error bars in experimental biology.
Journal of Cell Biology, 177(1), 7–11. https://doi.org/10.1083/jcb.200611141
Duong, C. T., Lee, J. H., Cho, Y., Nam, J. S., Kim, H. N., Lee, S. S., & Park, S. (2012).
Effect of protein concentrations of bovine serum albumin and γ-globulin on the
frictional response of a cobalt-chromium femoral head. Journal of Materials
Science: Materials in Medicine, 23(5), 1323–1330. https://doi.org/10.1007/s10856-
012-4603-9
Dwivedi, Y., Laurent, M. P., Sarvepalli, S., Schmid, T. M., & Wimmer, M. A. (2017).
Albumin protein cleavage affects the wear and friction of ultra-high molecular
weight polyethylene. Lubricants, 5(3). https://doi.org/10.3390/lubricants5030033
Ellman. (1998). Ellman ’ s Test Protocol. Peptides, 1(1998), 13600.
https://doi.org/10.1021/bi973101r.Ellman
Escorcia, V. S., & Caballero, A. D. (2019). células epiteliales dentales * Impact of
bovine fetal serum concentration on dental epithelial cells Impacto da
concentração de soro bovino fetal nas células epiteliais dentárias. 15(1), 276–284.
Fang, H. W., Hsieh, M. C., Huang, H. T., Tsai, C. Y., & Chang, M. H. (2009).
Conformational and adsorptive characteristics of albumin affect interfacial protein
boundary lubrication: From experimental to molecular dynamics simulation
94
approaches. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 68(2), 171–177.
https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2008.09.029
Fee, C. J., Billakanti, J. M., & Saufi, S. M. (2010). Methods for purification of dairy
nutraceuticals. In Separation, Extraction and Concentration Processes in the Food,
Beverage and Nutraceutical Industries. Woodhead Publishing Limited.
https://doi.org/10.1533/9780857090751.2.450
Galandáková, A., Ulrichová, J., Langová, K., Hanáková, A., Vrbka, M., Hartl, M., &
Gallo, J. (2017). Characteristics of synovial fluid required for optimization of
lubrication fluid for biotribological experiments. Journal of Biomedical Materials
Research. Part B, Applied Biomaterials, 105(6), 1422–1431.
https://doi.org/10.1002/jbm.b.33663
Garcia-Garcia, A. L., Alvarez-Vera, M., Montoya-Santiyanes, L. A., Dominguez-Lopez,
I., Montes-Seguedo, J. L., Sosa-Savedra, J. C., & Barceinas-Sanchez, J. D. O. O.
(2018). Regression models to predict the behavior of the coefficient of friction of
AISI 316L on UHMWPE under ISO 14243-3 conditions. Journal of the
Mechanical Behavior of Biomedical Materials, 82, 248–256.
https://doi.org/10.1016/j.jmbbm.2018.03.028
Giancola, C., De Sena, C., Fessas, D., Graziano, G., & Barone, G. (1997). DSC studies
on bovine serum albumin denaturation effects of ionic strength and SDS
concentration. International Journal of Biological Macromolecules, 20(3), 193–
204. https://doi.org/10.1016/S0141-8130(97)01159-8
Gomez-barrena, E., & Trebs, R. (2008). Special modes of corrosion under physiological
and simulated physiological conditions. 4, 468–476.
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2007.12.003
Hamdan, M., & Righetti, P. G. (2005). Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis. In Proteomics Today (pp. 273–340).
https://doi.org/10.1002/0471709158.ch5
Helen, S. J., & Christopher, R. D. (2017). Rheology Principle for Food Analysis. Food
Analysis, 213–226. https://doi.org/10.1007/978-3-319-45776-5
Higaki, H., Murakami, T., Nakanishi, Y., Miura, H., Mawatari, T., & Inamoto, Y.
(1998). The lubricating ability of biomembrane models with dipalmitoyl
phosphatidylcholine and γ-globulin. Proceedings of the Institution of Mechanical
Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine, 212(5), 337–346.
https://doi.org/10.1243/0954411981534114
ISO 14243-3, 2014 Implants for surgery – wear of total knee-joint prostheses - Part 3:
Loading and displacement parameters for wear-testing machines with dis-
placement control and corresponding environmental conditions for test, Second
edition. International Organization.
Iturriaga, V., Mena, P., Oliveros, R., Cerda, C., Torres, D., & del Sol C., M. (2018).
Importancia del líquido sinovial en la articulación temporomandibular y sus
implicancias en la patología articular. International Journal of Morphology, 36(1),
297–302. https://doi.org/10.4067/S0717-95022018000100297
Jay, G. D. (1992). Characterization of a bovine synovial fluid lubricating factor. I.
Chemical, surface activity and lubricating properties. Connective Tissue Research,
95
28(1–2), 71–88. https://doi.org/10.3109/03008209209014228
Karuppiah, K. S. K., & Sundararajan, S. (2018). IJTC2006-12164 ULTRA-HIGH
MOLECULAR WEIGHT POLYETHYLENE. 1–7.
Konttinen, Y. T., Zhao, D., Beklen, A., Ma, G., Takagi, M., Kivelä-Rajamäki, M.,
Ashammakhi, N., & Santavirta, S. (2005). The microenvironment around total hip
replacement prostheses. Clinical Orthopaedics and Related Research, 430, 28–38.
https://doi.org/10.1097/01.blo.0000150451.50452.da
Kotas, T., Analysis, E., Buildings, S., Society, A., Engineers, A., Analysis, E., &
Buildings, S. (2001). Chapter 4 随机变量的数字特征 Chapter 4 随机变量的数字
特征 (Vol. 3, Issue Chapter 2, pp. 73–102). https://doi.org/10.1016/B978-0-08-
044529-8.50007-0
Ku, H. K., Lim, H. M., Oh, K. H., Yang, H. J., Jeong, J. S., & Kim, S. K. (2013).
Interpretation of protein quantitation using the Bradford assay: Comparison with
two calculation models. Analytical Biochemistry, 434(1), 178–180.
https://doi.org/10.1016/j.ab.2012.10.045
Kung, M. S., Markantonis, J., Nelson, S. D., & Campbell, P. (2015). The synovial lining
and synovial fluid properties after joint arthroplasty. Lubricants, 3(2), 394–412.
https://doi.org/10.3390/lubricants3020394
Kurtz, S. M. (n.d.). Ultra-High Molecular Weight Polyethylene in Total Joint
Replacement and Medical Devices.
Laemmli, U. . (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. In Nature Publishing Group (Vol. 228, pp. 726–734).
Lan, H., Liu, H., Ye, Y., & Yin, Z. (2020). The Role of Surface Properties on Protein
Aggregation Behavior in Aqueous Solution of Different pH Values. AAPS
PharmSciTech, 21(4), 1–13. https://doi.org/10.1208/s12249-020-01663-7
Lantto, J. (2002). Antibody Evolution and Repertoire Development. In Department of
Immunotechnology Lund University.
Liang, J. (2008). Investigation of Synthetic and Natural Lubricants. North Carolina
State University.
Medina-Ceja, L., Villalpando-Vargas, F., Girón de la Cruz, G. I., Lara- Vazquez, A. M.,
Flores-Mancilla, L., Salazar-Sánchez, J. C., & Morales-Villagrán, A. (2019). Effect
of Chronic Krill Oil Supplement on Seizures Induced by Pentylenetetrazole in the
Hippocampus of Adult Rats with Previous Febrile Seizures. Journal of Food
Science, 84(7). https://doi.org/10.1111/1750-3841.14679
Montes-Seguedo, J. (2017). Mapeo del coeficiente de fricción en función de condiciones
artrocinemáticas clínicamente relevantes en prótesis de rodilla. Instituto
Politécnico Nacional.
Murray, R. K. (Robert K. (2009). Harper’s illustrated biochemistry. McGraw-Hill
Medical.
Nečas, D., Sadecká, K., Vrbka, M., Gallo, J., Galandáková, A., Křupka, I., & Hartl, M.
(2019). Observation of lubrication mechanisms in knee replacement: A pilot study.
96
Biotribology, 17(February), 1–7. https://doi.org/10.1016/j.biotri.2019.02.001
Nečas, D., Sawae, Y., Fujisawa, T., Nakashima, K., Morita, T., Yamaguchi, T., Vrbka,
M., Křupka, I., & Hartl, M. (2017). The Influence of Proteins and Speed on
Friction and Adsorption of Metal/UHMWPE Contact Pair. Biotribology, 11, 51–
59. https://doi.org/10.1016/j.biotri.2017.03.003
Oungoulian, S. R., Durney, K. M., Jones, B. K., Ahmad, C. S., Clark, T., & Ateshian,
G. A. (2016). Oungoulian et al 2015_Wear and damage of articular cartilage with
friction against orth implant mater.pdf. J Biomech, 48(10), 1957–1964.
https://doi.org/10.1016/j.jbiomech.2015.04.008.Wear
Park, J., Duong, C., & Sharma, A. R. (2014). Effects of Hyaluronic Acid and c –
Globulin Concentrations on the Frictional Response of Human Osteoarthritic
Articular Cartilage. 1–19. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0112684
Park, J. H., Jackman, J. A., Ferhan, A. R., Ma, G. J., Yoon, B. K., & Cho, N. J. (2018).
Temperature-Induced Denaturation of BSA Protein Molecules for Improved
Surface Passivation Coatings. ACS Applied Materials and Interfaces, 10(38),
32047–32057. https://doi.org/10.1021/acsami.8b13749
Patrick, P. S., & Swaisgood, H. E. (1976). Sulfhydryl and Disulfide Groups in Skim
Milk as Affected by Direct Ultra-High-Temperature Heating and Subsequent
Storage. Journal of Dairy Science, 59(4), 594–600.
https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(76)84246-4
Pediatr, A., Igg, L., Igg, L., Igg, L., Igg, L., & Igg, L. (2002). !Artículo de revisión 1
Gammaglobulina. 23(6), 369–376.
Pignataro, M. F., Herrera, M. G., Dodero, V. I. (2020). Evaluation of Peptide / Protein
Self-Assembly and. Molecules, 25, 4854.
Quinlan, G. J., Martin, G. S., & Evans, T. W. (2005). Albumin : Biochemical.
https://doi.org/10.1002/hep.20720
Rodríguez-Bolaños, M., Miranda-Astudillo, H., Pérez-Castañeda, E., González-
Halphen, D., & Perez-Montfort, R. (2020). Native aggregation is a common feature
among triosephosphate isomerases of different species. Scientific Reports, 10(1),
1–14. https://doi.org/10.1038/s41598-020-58272-4
Rosenoer, V. M., & Oratz, M. (n.d.). Albumin Structure, Function and Uses.
Sava, M. M., Munteanu, B., Renault, E., Berthier, Y., & Trunfio-Sfarghiu, A. M.
(2018). Tribological Analysis of UHMWPE Tibial Implants in Unicompartmental
Knee Replacements: From Retrieved to In Vitro Studies. Biotribology, 13(May
2017), 1–15. https://doi.org/10.1016/j.biotri.2017.11.001
Scanzello, C. R., Plaas, A., & Crow, M. K. (2008). Innate immune system activation in
osteoarthritis : is osteoarthritis a chronic wound ?
Schmid, F., & Beer, L. (2001). Biological Macromolecules : Spectrophotometry
Concentrations. 1–4.
Shenton, J. M., Henson, K. L., & Rebelatto, M. C. (2015). Consequences and Indicators
of Test Article-Related Immune Suppression in Nonhuman Primates. In The
Nonhuman Primate in Nonclinical Drug Development and Safety Assessment.
97
Elsevier Inc. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-417144-2.00011-1
Sigma-Aldrich. (1990). Product Information: Albumin from bovine serum.
SigmaAldrich, 815(1), 2–5.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=A2058
Sindelar, R. D. (1995). Pharmaceutical biotechnology. In Current opinion in
biotechnology (Vol. 6, Issue 6). https://doi.org/10.1016/0958-1669(95)80119-7
Skoog, D., Holler, F., & Crouch, S. (2008). Espectroscopía atómica. In Principios de
análisis fundamental.
Stark et al. (2014). US Patent Application Publication (Patent No. No. 8, 716, 204 B2).
Stevenson, H., Jaggard, M., Akhbari, P., Vaghela, U., Gupte, C., & Cann, P. (2019).
The role of denatured synovial fluid proteins in the lubrication of artificial joints.
Biotribology, 17, 49–63. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.biotri.2019.03.003
Stevenson, H., Parkes, M., Austin, L., Jaggard, M., Akhbari, P., Vaghela, U., Williams,
H. R. T., Gupte, C., & Cann, P. (2018). The development of a small-scale wear test
for CoCrMo specimens with human synovial fluid. Biotribology, 14, 1–10.
https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.biotri.2018.04.001
Tiselius, A. (1937). Electrophoresis of serum globulin: Electrophoretic analysis of
normal and immune sera. The Biochemical Journal, 31(9), 1464–1477.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16746478%0Ahttp://www.pubmedcentral.ni
h.gov/articlerender.fcgi?artid=PMC1267100
van der Valk, J., Bieback, K., Buta, C., Cochrane, B., Dirks, W. G., Fu, J., Hickman, J.
J., Hohensee, C., Kolar, R., Liebsch, M., Pistollato, F., Schulz, M., Thieme, D.,
Weber, T., Wiest, J., Winkler, S., & Gstraunthaler, G. (2018). Fetal Bovine Serum
(FBS): Past - Present - Future. Altex, 35(1), 99–118.
https://doi.org/10.14573/altex.1705101
Vavricka, S. R., & Beglinger, C. (2009). Serum Protein Electrophoresis : An Underused
but Very Useful Test. 203–210. https://doi.org/10.1159/000212077
Walker, J. M. (2002). The Protein Protocols Handbook (J. M. Walker (ed.); Second
edi).
Wang, K., Zhou, C., & Hong, Y. (2012). R EVIEW A review of protein adsorption on
bioceramics. March, 259–277.
Widmer, M. R., Heuberger, M., Vörös, J., & Spencer, N. D. (2001). Influence of
polymer surface chemistry on frictional properties under protein-lubrication
conditions: Implications for hip-implant design. Tribology Letters, 10(1–2), 111–
116. https://doi.org/10.1023/A:1009074228662
Wong, L., Brandt, J.-M., & Wyss, U. (2013). the Effect of a More Clinically Relevant
Lubricant on the Wear of Polyethylene for Orthopaedic Applications.
Xu, H., Yao, N., Xu, H., Wang, T., Li, G., & Li, Z. (2013). Characterization of the
interaction between eupatorin and bovine serum albumin by spectroscopic and
molecular modeling methods. International Journal of Molecular Sciences, 14(7),
14185–14203. https://doi.org/10.3390/ijms140714185
Zuart-Alvarado, Rubén; Martínez-Torres, J. (2011). Osteoartrosis y patologías crónicas.
98
Revista Médica Del Instituto Mexicano Del Seguro Social, 49(6), 637–642.
99
IX. ANEXOS
9.1 ANEXO A
9.1.1 Estandarización del Espectro de absorción UV-Vis de las soluciones
lubricantes de ASB y SFB
Se realizaron pruebas para determinar la concentración de proteínas totales presentes en
las soluciones lubricantes que nos permitieran tener una señal adecuada en el
espectrofotómetro UV-Vis, sin llegar a la saturación del sistema de detección. Se
emplearon dos soluciones lubricantes que se muestran en la Tabla 21. Con cada solución
se realizó un barrido en el espectro UV-vis de 200 a 800 nm, para conocer qué absorbancia
corresponde a las soluciones de proteínas a diferentes concentraciones.
Tabla 21. Soluciones lubricantes y su concentración de proteínas.
Soluciones
lubricantes
Concentración de proteínas totales
ASB 0.01 g/L 0.02 g/L
SFB 36 g/L 20 g/L 2 g/L
La Figura 35 muestra los espectros de absorción de la solución de SFB a las
concentraciones de 36 g/L (azul), 20g/L (rojo) y 2 g/L (gris) de proteína total. Se observó
que con el SFB (36 g/L), se saturó la señal con una absorbancia de 4 a.u. Por lo que se
hicieron diluciones de la muestra. Posteriormente, se realizó un barrido del SFB (20 g/L)
(recomendada por la ISO 14243-3:2014), mostrando que también hubo una saturación de
la señal con valores de 4 a.u. Por este motivo, se buscó tener una concentración de 2 g/L,
donde ya fue posible percibir dos picos de absorbancia diferentes; el primero alrededor
de 3.5 a.u., entre los 200 y 250 nm; otro con una absorbancia aproximada de 3.5 a.u.,
entre los 250 y 300 nm y uno más que se percibió alrededor de los 400 nm con 0.5 a.u.
100
Figura 35. Espectro de absorción del SFB a concentraciones de 36, 20 y 2 g/L
La Figura 36 muestra el espectro de absorción de la ASB a las concentraciones de
0.01g/L y 0.02 g/L. Si bien, estos picos de absorbancia de ambas concentraciones no son
semejantes a las utilizadas en el SFB, puede confirmarse que la albúmina se observa en
la longitud de onda de 200-250 nm. Sin embargo, presenta una absorbancia de alrededor
de 0.3 a.u., en el caso de la solución a 0.02 g/L y en el caso de la solución de 0.01 g/L se
tiene una absorbancia de 0.15 a.u.
Figura 36. Espectro de absorción UV-Vis de soluciones de ASB a 0.01 y 0.02 g/L.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
sorb
anci
a (a
.u.)
Longitud de onda (nm)
ASB (0.02 g/L)
ASB (0.01 g/L)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
200 250 300 350 400 450 500
Ab
sorb
anci
a (a
.u.)
Longitud de onda (nm)
SFB (36g/L) SFB (20g/L) SFB (2g/L)
101
9.1.2 Estandarización de Método de Bradford (Microensayo), para la
cuantificación de proteínas
Se llevó a cabo la estandarización del método de Bradford para cuantificar las proteínas
contenidas en las siguientes soluciones: SFB y mezcla de ASB + SFB ambas a una
concentración final de 20 g/L. Posteriormente se realizaron diluciones 1:40 y 1:800 para
llegar a una concentración teórica de 0.5 y 0.025 g/L respectivamente, y ver la dilución a
realizar en la cuantificación de proteínas totales en las soluciones lubricantes empleadas.
Estos resultados permitieron establecer que deben realizarse diluciones 1:40 y
posteriormente 1:800 para lograr la reacción del colorante azul de Coomassie con las
proteínas contenidas en las muestras que están a una concentración inicial teórica de 20
g/L. La Figura 37, muestra que al determinar el contenido de proteínas totales en las
muestras sin diluir se obtuvieron datos de concentración de 0.078 g/L y 0.082 g/L para
las muestras de (SFB + ASB) y SFB, respectivamente, representadas por las barras
negras. En este caso el alto contenido de proteínas presentes en la muestra original,
origino que la cantidad de reactivo empleado fuera insuficiente para reaccionar con las
proteínas presentes en la muestra. Cuando se realizó una dilución 1:40 en ambas muestras,
se obtuvo una concentración de proteínas de 2.96 g/L tanto para la mezcla (SFB + ASB)
como para el SFB, representado por las barras blancas. Al realizar una dilución 1:800 de
ambas muestras, se obtuvo una concentración de proteínas totales de 22.6 g/L y 17.7 g/L
para las muestras (SFB + ASB) y SFB respectivamente, representado por las barras
punteadas. Indicando que dicha dilución es la indicada para realizar los estudios de
cuantificación de proteínas totales en las soluciones lubricantes ensayadas.
102
Figura 37. Cuantificación de proteínas totales en SFB+ASB y SFB a diferentes concentraciones.
9.1.3 Estandarización de la Determinación de Grupos sulfhidrilos libres (SH)
A partir del aminoácido hidrocloruro de L-cisteína monohidratado empleado como
estándar para la curva de calibración, se prepararon diluciones para obtener
concentraciones entre 1 y 10 μM cubriendo el rango de trabajo necesario (Figura 38).
Este experimento se realizó por quintuplicado para cada concentración. Además de la
curva de calibración se utilizó simultáneamente la fórmula para conocer la concentración
en molaridad de grupos sulfhidrilo libres (Ellman, 1998):
𝑀𝑜𝑙𝑎𝑟𝑖𝑑𝑎𝑑 = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜
13600𝑀−1𝑐𝑚−1
0
2
4
6
810
12
14
16
18
20
2224
26
SFB (15 g/L) + ASB (5 g/L) SFB (20 g/L)
Co
nce
trac
ión
Pro
tein
as (
g/L)
Tratamiento
20 g/L dilución 1:40 dilución 1:800
103
Figura 38. Curva tipo con el aminoácido L-cisteína utilizando una concentración de 1 a 10 mmoles/L.
Para observar los grupos sulfhidrilo libres de las soluciones de ASB y SFB se optó por
inducir químicamente la ruptura de los enlaces disulfuro, empleando como agente
desnaturalizante el β-mercaptoetanol a dos concentraciones (0.25 y 1 mM) incubados a
23ºC durante 16 h (Chang, 1997), al final del proceso la concentración de grupos
sulfhidrilo libres fue determinada al emplear la curva tipo y la formula (Figura 39).
Figura 39. Ruptura de enlaces disulfuro mediante BME para exposición de grupos sulfhidrilo en las
soluciones de ASB y SFB (20g/L).
y = 0.119x + 0.0372R² = 0.9862
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ab
sorb
anci
a a
412
nm
Concentración mmoles/L
-2000
-1800
-1600
-1400
-1200
-1000
-800
-600
-400
-200
0
200
400
600
800
1000
ASB+BME SFB+BME
μM
gru
po
s SH
Muestras tratadas
0.25mM BME
1 mM BME
0.25mM BME
1 mM BME
Fórmula
Curva Fórmula Curva
104
9.1.4 Estandarización de la concentración de proteína para SDS-PAGE
Se prepararon soluciones de proteínas de ASB y SFB a las concentraciones finales de 30,
20, 15 y 10 µg en un volumen final por pozo de 24 µL, considerando un buffer de carga
2x. Se utilizaron las soluciones de SFB (del carril 2 al 5) y ASB (del carril 6 al 9). Se
utilizaron las condiciones de corrida de 200 V durante 45 min y el gel obtenido se muestra
en la Figura 40. Por consiguiente, para obtener bandas más nítidas, se eligió utilizar la
concentración de 20 µg de proteína total para todos los tipos de soluciones lubricantes
que fueron sometidas a los diferentes parámetros en el tribómetro de bola en disco para
los estudios electroforéticos.
Figura 40. Estandarización de la concentración de proteína de las soluciones lubricantes ASB y SFB, a
ser analizadas por electroforesis SDS-PAGE.
9.2. ANEXO B
Tabla 22. Aleatorización de las corridas en el tribómetro de bola en disco para las soluciones lubricantes de ASB nativa.
BS
A n
ati
va
Combinación L (N) SRR (%) Vm (mm/s) Tiempo
(h)
Disco Parámetros
aleatorios
# de disco
aleatorio
1 2 20 20 6
8
Rutina 1:
combinación 8
10
2 2 20 80 6 Rutina 2:
combinación 1
19
3 2 1800 20 6 Rutina 3:
combinación 5
24
4 2 1800 80 6 Rutina 4:
combinación 3
5
5 8 20 20 6 Rutina 5:
combinación 6
6
6 8 20 80 6 Rutina 6:
combinación 7
15
7 8 1800 20 6 Rutina 7:
combinación 2
26
8 8 1800 80 6 Rutina 8:
combinación 4
17
106
Tabla 23. Aleatorización y preparación de pruebas tribológicas y soluciones lubricantes de ASB desnaturalizada.
BS
A d
esn
atu
rali
zad
a
Combinación L (N) SRR (%) Vm (mm/s) Tiempo
(h)
Disco Parámetros
aleatorios
# de disco
aleatorio
1 2 20 20 6
8
Rutina 1:
combinación 6
2
2 2 20 80 6 Rutina 2:
combinación 3
29
3 2 1800 20 6 Rutina 3 :
combinación 2
14
4 2 1800 80 6 Rutina 4 :
combinación 7
27
5 8 20 20 6 Rutina 5 :
combinación 8
21
6 8 20 80 6 Rutina 6 :
combinación 4
13
7 8 1800 20 6 Rutina 7 :
combinación 5
28
8 8 1800 80 6 Rutina 8 :
combinación 1
22
107
Tabla 24. Aleatorización y preparación de pruebas tribológicas y soluciones lubricantes de SFB nativo.
SF
B n
ati
vo
Combinación L (N) SRR (%) Vm (mm/s) Tiempo
(h)
Disco Parámetros
aleatorios
# de disco
aleatorio
1 2 20 20 6
8
Rutina 1:
combinación 5
9
2 2 20 80 6 Rutina 2:
combinación 1
8
3 2 1800 20 6 Rutina 3:
combinación 2
20
4 2 1800 80 6 Rutina 4:
combinación 4
30
5 8 20 20 6 Rutina 5:
combinación 6
3
6 8 20 80 6 Rutina 6:
combinación 8
23
7 8 1800 20 6 Rutina 7:
combinación 7
11
8 8 1800 80 6 Rutina 8:
combinación 3
1
108
Tabla 25. Aleatorización y preparación de pruebas tribológicas y soluciones de SFB desnaturalizado.
SF
B d
esn
atu
rali
zad
o
Combinación L (N) SRR (%) Vm (mm/s) Tiempo
(h)
Discos Parámetros
aleatorios
# de disco
aleatorio
1 2 20 20 6
8
Rutina 1:
combinación 8
16
2 2 20 80 6 Rutina 2:
combinación 4
18
3 2 1800 20 6 Rutina 3 :
combinación 3
25
4 2 1800 80 6 Rutina 4 :
combinación 5
12
5 8 20 20 6 Rutina 5 :
combinación 1
4
6 8 20 80 6 Rutina 6 :
combinación 6
8
7 8 1800 20 6 Rutina 7 :
combinación 2
2
8 8 1800 80 6 Rutina 8 :
combinación 7
22
9.3. ANEXO C
9.3.1 Curva de calibración con el standard ASB
Se realizó una curva de calibración con el standard de BSA (≥96% de pureza) que se
obtuvo de Sigma-Aldrich (A2153-50G) en el rango de concentración de 2 a 40 μg/mL.
Se obtuvo una nueva ecuación de regresión para calcular la concentración de proteína
total de acuerdo con la ley de Lambert-Beer (Figura 41).
Figura 41. Curva de concentración de ASB de 2-40 ug/mL.
9.3.2 Curva de calibración con el standard L-cisteína
Se realizó curva de calibración con el standard de L-cisteína monohidratada (Jalmek-
C440503) de 1-10 mmoles/L. A partir de la ecuación de regresión se determinó la
cantidad de grupos sulfhidrilo libres de acuerdo con la ley de Lambert-Beer en todas las
muestras sometidas a las pruebas tribológicas (Figura 42).
Figura 42. Curva de calibración de L-Cisteína de 1-10 mmoles/L
y = 0.0349x + 0.1414R² = 0.9701
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
Ab
sorb
anci
a a
595
nm
Concentración (μg/mL)
y = 0.132x + 0.0403R² = 0.9953
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Ab
sorb
anci
a a
412
nm
Concentración (mmoles/L)
9.4. ANEXO D. Diagramas generales
Figura 43. Diagrama general de pruebas con la solución lubricante de ASB nativa y desnaturalizada.
Figura 44. Diagrama general de pruebas tribológicas con la solución lubricante de SFB nativo y desnaturalizado.
Figura 45. Diagrama general del Espectro de absorción UV-Vis.
Figura 46. Diagrama general del Método de Bradford.
Figura 47. Diagrama general del Método de Ellman.
Figura 48. Diagrama general de Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).