análisis de la diversidad genética de maíces nativos de
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I
Instituto Politécnico Nacional CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
Análisis de la diversidad genética de maíces nativos
de Ocotepec, Veracruz
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN
RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
PAÚL ALÁN BÁEZ ASTORGA
GUASAVE, SINALOA; MÉXICO NOVIEMBRE 2017
II
III
IV
V
El trabajo de tesis -Análisis de la diversidad genética de maíces nativos de Ocotepec,
Veracruz- se desarrolló en el Departamento de Biotecnología Agrícola del Centro
Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad
Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN). El presente trabajo fue apoyado
económicamente por el CONACyT a través del programa Proyectos de Desarrollo
Científico para atender problemas nacionales en los temas de: Combate a la pobreza y
seguridad alimentaria con número de registro 246999.
El proyecto contó con el apoyo del Instituto Politécnico Nacional (IPN), por medio de los
proyectos individuales otorgados por la Secretaria de Investigación y Posgrado (SIP)
(claves: 20150775; 20161778; 20170939).
El alumno Paúl Alán Báez Astorga fue apoyado con una beca para Estudios de Maestría
por parte del CONACyT (No. de becario 708883), con una beca por parte del programa
de Becas de Estímulo Institucional de Formación de investigadores (BEIFI), así como
también con una Beca Tesis Maestría por parte del Instituto Politécnico Nacional.
VI
DEDICATORIA Y AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Nacho por haberme permitido la oportunidad de realizar los estudios de
maestría en su laboratorio, por sus consejos y ayuda para mejorar este trabajo y mi
formación académica.
A los doctores Eduardo, Paco y Mariano por haber formado parte de mi comité
tutorial y ayudar con sus críticas y sugerencias a mejor este trabajo.
Al Dr. Eduardo Sandoval por ser un buen amigo, por sus valiosos aportes
intelectuales a este trabajo, por sus consejos para el análisis de resultados, sugerencias
de uso de programas y haber tenido siempre la disposición de ayudarme.
A la Karla, por ser mi principal guía en este tan largo y a la vez corto camino, por
ser mi madre, amiga, compañera de trabajo y directora de tesis al mismo tiempo, gracias
porque gran parte de lo que hoy se es por ti, me enseñaste a trabajar bajo presión, a
organizarme mejor y desarrollar parte de mis habilidades científicas, ayudaste a mejorar
en muchos sentidos este trabajo, sin tu ayuda no hubiera sido lo mismo y por ello siempre
estaré agradecido.
Al Dr. Francisco Quiroz por su importante donación de maíz para incorporar un
grupo externo a este trabajo, sin su valiosa aportación no hubiera sido tan fácil realizar
esta parte del trabajo.
VII
A mi familia, especialmente a mis padres, mi abuela, hermanos, tía Lupita y Rosa
Iris, por darme siempre su apoyo y consejos, por creer en mí y darme siempre fortaleza
para salir adelante, los amo.
A Carolina mi compañera, amiga y novia, por estar siempre al pie del cañón
conmigo, por tu apoyo incondicional, tu amor y paciencia, por ayudarme a hacer más
fácil este camino el cual recorrimos juntos. Le dedico este trabajo a tu familia por siempre
apoyarme, preocuparse y pedir por mí. Lo dedico especialmente al rey, Santiago, tú y el
siempre ayudaron a inspirarme y hacer más fácil esta etapa de mi vida, sin ustedes no
hubiese sido lo mismo, los amo.
A mis compañeros de laboratorio de Ecología Molecular de la Rizósfera: Alicia,
Ofelda, Jesús, Isela, Julio Anduro, Julio Camacho, Cristian, Jorge, Ricardo, Masud,
Catalina, Alejandra, Nathalí, Arantxa, Jenifer, Lolita, Minerva, Noely, Anaid, Eduardo,
Dulce María, Andrés, Mario y Richi, gracias por su amistad, por el excelente ambiente de
trabajo y tan geniales experiencias vividas.
A mis amigos del Laboratorio de Genómica Funcional: Nadia, Mireya, Priscila,
Carlos, Ing. Biólogo JP, Fer Dávila, Fer Medina, Ayesha, Lupita, Dr. Abraham, Dr.
Eduardo y Dr. Carlos, por haberme adoptado y compartido tan buenos momentos.
A mis compañeros y amigos de maestría: Carlos Alberto, Carlos Ignacio, Shamir,
Nathaniel, Bricia, Jael, Karina, Gadiela, Priscila, Sandy, Andreyna, Yareli, Yoldia, Israel,
VIII
Cecilia, Alan, Ulises, Krysia, Majo, Cindy y Uriel, por los momentos compartidos y haber
hecho de esta una mejor estadía.
Agradecimiento especial a Carlos Ríos, por ser un gran amigo y compañero de
maestría y haberme ayudado con el uso de programas y herramientas bioinformaticas.
A Alicia Fierro por su ayuda en el procesamiento de muestras y Dulce María
Romero por su ayuda en la extracción de ADN y PCR´s masivos.
A mis grandes amigos Fernando, Susana, Sujey, Vianey, Luis, Deisy, profe Bertha
y profe Mónica que siempre me desearon lo mejor, me brindaron su apoyo desde lejos y
fueron siempre parte de mi inspiración para sacar adelante este trabajo.
A mis carnalitos Juan, Jane, Luis, Mariana, Raúl, Olim, Isis, Omar y Edith, mi
primera familia dentro de la investigación, ustedes también formaron siempre parte de mi
inspiración para realizar este trabajo.
IX
Índice
GLOSARIO .................................................................................................................... XII
ABREVIATURAS .......................................................................................................... XIV
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................... XV
ÍNDICE DE CUADROS ............................................................................................... XVII
RESUMEN .................................................................................................................. XVIII
ABSTRACT ................................................................................................................... XX
I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 1
II. ANTECEDENTES .................................................................................................. 3
2.1 Maíz ....................................................................................................................... 3
2.2 Origen y Diversificación ......................................................................................... 3
2.3 Importancia cultural ................................................................................................ 4
2.4 Importancia económica .......................................................................................... 5
2.5 Diversidad del maíz................................................................................................ 6
2.5.1 Diversidad genética ......................................................................................... 6
2.5.2 Razas de Maíz................................................................................................. 8
2.6 Marcadores moleculares para estudiar de la diversidad genética ......................... 9
2.6.1 Polimorfismos en la longitud del fragmento de restricción (RFLP) ................ 10
2.6.2 Polimorfismos de ADN amplificado al azar (RAPD) ...................................... 11
2.6.3 Polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLPs) ......... 11
2.6.4 Microsatélites ................................................................................................ 12
2.7 Nuevas tecnologías de secuenciación masiva (NGS).......................................... 14
2.8 Recursos genéticos y su conservación ................................................................ 16
X
2.8.1 Conservación in situ ...................................................................................... 17
2.8.2 Conservación ex situ ..................................................................................... 17
2.9 Población de Ocotepec ........................................................................................ 18
2.9.1 La milpa ......................................................................................................... 20
III. JUSTIFICACIÓN .................................................................................................. 21
IV. HIPÓTESIS .......................................................................................................... 22
V. OBJETIVOS ......................................................................................................... 22
Objetivo general: ........................................................................................................ 22
Objetivos específicos: ................................................................................................ 22
VI. METODOLOGÍA .................................................................................................. 23
6.1 Área de estudio .................................................................................................... 23
6.2 Material biológico ................................................................................................. 24
6.3 Extracción de ADN de maíz ................................................................................. 25
6.4 Análisis de microsatélites ..................................................................................... 26
6.5 Diversidad genética ............................................................................................. 30
6.6 Análisis de la estructura de la población .............................................................. 30
6.7 Registro de inicio del periodo de floración de los maíces .................................... 31
6.8 Caracterización morfológica de las mazorcas de maíz e identificación racial ...... 32
VII. RESULTADOS .................................................................................................... 32
7.1 Evaluación del grupo de microsatélites para estimar la diversidad genética ....... 32
7.2 Diversidad genética ............................................................................................. 34
7.2.1 Diversidad genética por locus ....................................................................... 34
7.2.2 Diversidad genética por población................................................................. 36
7.3 Estructura poblacional .......................................................................................... 37
7.4 Periodo de floración de los maíces ...................................................................... 45
XI
7.5 Caracterización morfológica de los maíces nativos de Ocotepec Veracruz ......... 46
VIII. DISCUSIÓN ......................................................................................................... 48
IX. CONCLUSIONES ................................................................................................ 58
X. REFERENCIAS ................................................................................................... 60
XII
GLOSARIO
Alelo: Cada una de las formas alternativas que puede presentar un gen. En microsatélites
se refiere a los segmentos de ADN que varían en tamaño uno respecto al otro, por el
número de repeticiones del motivo repetido.
Amplicón: Fragmento de ADN producto de una replicación artificial mediante la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR).
Codominante: Que permite diferenciar entre el estado homocigoto o heterocigoto de un
individuo.
Diploide: Individuo que presenta dos juegos de cromosomas completos.
Distancia genética: Medida de divergencia genética entre dos individuos, poblaciones o
especies.
Diversidad genética: Es el número total de características genéticas dentro de cada
especie.
Equilibrio de Hardy-Weinberg: Ley que establece que la composición genética de una
población permanece en equilibrio siempre y cuando no haya un factor que cambie las
frecuencias alélicas de la población.
Heterocigosidad esperada: Fracción estimada de todos los individuos que podrían ser
heterocigotos para cualquier locus tomado al azar.
Heterocigosidad observada: Número de individuos que son heterocigotos para un locus
en particular.
Heterocigoto: Individuo que presenta alelos distintos en sus cromosomas homólogos.
Homocigoto: Individuo que presenta alelos iguales en sus cromosomas homólogos.
Índice de contenido polimórfico (PIC): Medida de la informatividad de un marcador
molecular.
XIII
K: En el programa STRUCTURE, hace referencia al número de poblaciones o grupos en
los que se encuentra dividida una población.
Marcador genético: Segmento de ADN que se utiliza como marca o punto de referencia
para el análisis de un genoma.
Microsatélite: Segmento corto de ADN de uno a seis pares de bases que se repite en
tándem.
Número de alelos efectivos: Número de alelos con mayor probabilidad de ser
heredados a la progenie de una población.
Número de alelos: Número total de alelos distintos encontrados en una población.
Polimorfismo: Presencia de dos o más alelos.
Variabilidad genética: Es una medida de la tendencia que presentan los genotipos de
una población a diferenciarse.
XIV
ABREVIATURAS
He: Heterocigosidad esperada.
Ho: Heterocigosidad observada.
Ht: Heterocigosidad total esperada.
HWE: Hardy-Weinberg equilibrium (Equilibrio de Hardy Weinberg).
MLG: Multi Locus Genotype (Genotipos multilocus).
Na: Número de alelos.
Ne: Número efectivo de alelos.
NGS: Next Generation Sequencing (Secuenciación de Nueva Generación).
ONG: Organización No Gubernamental.
PCoA: Principal Coordinate Analysis (Análisis de Coordenadas Principales).
PCR: Polymerase Chain Reaction (Reacción en Cadena de la Polimerasa).
PIC: Polymorphism Information Content (Índice de contenido polimórfico).
SSRs: Simple Sequence Repeats (Secuencias cortas repetidas).
AMOVA: Analysis of Molecular Variance (Análisis de varianza molecular)
XV
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Fenómeno de deslizamiento de la hebra durante la síntesis de ADN ........... 14
Figura 2. Milpas de Ocotepec, Veracruz. ..................................................................... 19
Figura 3. Ubicación de la ciudad de Ocotepec, Ayahualulco, Veracruz. ....................... 23
Figura 4. Mazorcas de los morfotipos de maíz de Ocotepec y del grupo externo. ....... 24
Figura 5. Desarrollo de los maíces. .............................................................................. 25
Figura 6. Localización genómica de los microsatélites. ................................................ 28
Figura 7. Mapa de calor.. .............................................................................................. 33
Figura 8. Curva de acumulación de genotipos .............................................................. 34
Figura 9. Prueba de equilibrio de Hardy Weinberg. ...................................................... 37
Figura 10. Estructura poblacional de 118 individuos de cinco morfotipos de maíz de
Ocotepec más 20 individuos de la raza Nal-Tel (GE). ................................................... 40
Figura 11. Estructura poblacional de los maíces nativos de Ocotepec analizada con y sin
los individuos de la raza Nal-Tel. ................................................................................... 41
Figura 12. Composición de los grupos genéticos para K=4. ......................................... 42
XVI
Figura 13. Dendrograma creado por el método del vecino más cercano (Neighbour-
joining) basado en la distancia genética de Provesti. .................................................... 43
Figura 14. Gráfico del análisis de Coordenadas Principales (PCoA) ............................ 44
Figura 15. AMOVA de 3 los grupos detectados por STRUCTUE en los maíces de
Ocotepec. ...................................................................................................................... 45
XVII
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Microsatélites probados para el análisis de la diversidad genética de los
maíces nativos de Ocotepec, Veracruz. ........................................................................ 26
Cuadro 2. Información de los microsatélites probados para el análisis de la diversidad
genética de los maíces de Ocotepec, Veracruz. ........................................................... 27
Cuadro 3. Resultados de electroforesis capilar para los 12 microsatélites seleccionados
a partir del análisis preliminar. ....................................................................................... 32
Cuadro 4. Estadística descriptiva de la diversidad genética estimada en cinco morfotipos
de maíces criollos/nativos de Ocotepec, Veracruz, empleando ocho microsatélites/ SSR/
marcadores. ................................................................................................................... 35
Cuadro 5. Resumen estadístico de la diversidad genética de los morfotipos de Ocotepec,
Veracruz. ....................................................................................................................... 36
Cuadro 6. Comparaciones pareadas de Fst (debajo de la diagonal) y Rst (encima de la
diagonal) entre morfotipos de maíz. .............................................................................. 38
Cuadro 7. Promedio de número de migrantes entre morfotipos (Nm) .......................... 39
Cuadro 8. Registro de floración masculina en plantas de maíz al día 29 de junio del 2016.
Datos tomados por la Dra. Simoneta Negrete Yankelevich. .......................................... 46
Cuadro 9. Caracterización morfológica de las mazorcas. ............................................. 47
XVIII
RESUMEN
México es el centro de origen, domesticación y diversificación del maíz. Este
cultivo es una de las principales fuentes de alimento de un gran número de familias
indígenas y campesinas del país las cuales continúan sembrando sus maíces nativos de
forma tradicional. Dichas prácticas se han realizado por cientos de años y han propiciado
la diversificación de este cultivo. La vasta diversidad genética del maíz ha sido
aprovechada en los programas de mejoramiento y lo han convertido en uno de los cultivos
más importantes para el mundo. Por lo tanto, mantener la diversidad genética del maíz
significa conservar un alto potencial genético aprovechable para garantizar la seguridad
alimentaria de un gran número de personas en el mundo. En el presente estudio se llevó
a cabo la caracterización genética de cinco morfotipos de maíz (Amarillo, Blanco, Rojo,
Jaspeado y Negro) manejados en sistemas de milpa por un grupo de mujeres productoras
de la comunidad de Ocotepec, Veracruz, utilizando ocho marcadores microsatélite. El
análisis de los ocho microsatélites en los distintos morfotipos reveló un total de 57 alelos,
con un promedio de 7.13 alelos por locus. La diversidad genética promedio fue de 0.61
siendo el morfotipo blanco el más diverso con una riqueza alélica de 4.37. El valor
promedio del coeficiente de endogamia (Fis) fue de 0.16, lo cual sugiere indicios de
endogamia en los distintos morfotipos de maíz, además de que se encontraron
desviaciones significativas al equilibrio (HWE) en las frecuencias alélicas de los distintos
morfotipos. El coeficiente de diferenciación genética (Fst) entre morfotipos mostró valores
menores a 0.07, lo cual sugiere una baja diferenciación genética entre los mismos. Tres
análisis distintos de estructura poblacional, agrupamiento bayesiano (STRUCTURE),
distancia genética (Provesti) y análisis de coordenadas principales (PCoA), mostraron
que los morfotipos de Ocotepec se encuentran divididos en 3 poblaciones o grupos
genéticos. Interesantemente, estas agrupaciones son independientes del morfotipo de
maíz. La baja diferenciación entre los morfotipos de maíz, sugiere un alto flujo genético
entre los mismos, lo cual puede deberse al manejo que se tiene del cultivo en la
comunidad. Es probable que de continuar con el mismo manejo agronómico en la
comunidad el material genético de estos maíces se erosione, volviéndolos vulnerables,
por lo que será necesario cambiar dichas prácticas e incluir nuevos materiales de otras
XIX
comunidades para ayudar a la conservación de la diversidad genética de los maíces
nativos de Ocotepec.
XX
ABSTRACT
Mexico is the center of origin, domestication and diversification of maize. This crop
is one of the primary food sources for a large number of indigenous and peasant families
in the country who continue to sow their native maize traditionally. These traditional
practices have been carried out for hundreds of years and have led to the diversification
of this crop. The vast genetic diversity of maize has been used in breeding programs and
has made it one of the most important crops in the world. Therefore maintaining the
genetic diversity of maize means keeping a high genetic potential that can be used to
guarantee the food security of a large number of people in the world. In the present work
we characterized the genetic diversity of five maize morphotypes (yellow, white, red,
marbled and black) managed in milpas systems by a group of farmer women from the
community of Ocotepec, Veracruz using eight microsatellite molecular markers. The
analysis of the eight microsatellite revealed a total of 57 different alleles for the general
population, with an average of 7.13 alleles per locus. The average genetic diversity was
0.61, with the white morphotype being the most diverse with an allelic richness of 4.37.
The average value of the inbreeding coefficient (Fis) was 0.16, suggesting inbreeding
among individuals in the different maize morphotypes. Significant deviations in the allelic
frequencies of the maize morphotypes were found. The coefficient of genetic
differentiation (Fst) between morphotypes was lower than 0.07, which suggest a low
genetic differentiation between them. Three different analysis of population structure,
Bayesian grouping (STRUCTURE), genetic distance (Provesti) and principal coordinate
analysis (PCoA), showed that the Ocotepec morphotypes are divided into 3 populations
or genetic groups, which are independent of the maize morphotype. The low differentiation
between maize morphotypes suggests a high genetic flow between them, which may be
due to the management of the crop in the community. It is likely that if the same agronomic
management in the community continues, the genetic material of these maize varieties
will become genetically eroded, making them vulnerable. Thus, necessary practice
changes are needed, as well as the inclusion of new materials from other communities
may help to preserve the genetic diversity of native maize from Ocotepec.
1
I. INTRODUCCIÓN
El maíz es una de las especies cultivadas más diversas del planeta. Se conocen
poco más de 300 razas y cientos de variedades en todo el mundo las cuales representan
la diversidad genética de este cultivo. Estos recursos genéticos son una fuente invaluable
para los programas de mejoramiento de este cultivo con los cuales se hace frente al
desabasto de alimento y los retos biológico-ambientales, por lo que es una prioridad
conservarlos. Actualmente gran parte de la diversidad del maíz es conservada en bancos
de germoplasma de todo el mundo. En éstos se depositan semillas que representan la
diversidad de variedades o razas de las distintas regiones donde este se cultiva. Sin
embargo es reconocido que las prácticas tradicionales del cultivo de maíz llevadas a cabo
por grupos indígenas y campesinos, forman una de las principales estrategias para la
conservación de la diversidad genética de esta especie. En México existen un gran
número de razas de maíz que forman parte de la historia y cultura de los pueblos
mexicanos las cuales se siguen sembrando de manera tradicional, ya sea para
autoconsumo o como fuente de ingreso. Muchas de estas razas aún no han sido
caracterizadas genéticamente, por lo que indudablemente representan una nueva fuente
de germoplasma útil. Por ello es importante conocer la diversidad y estructura genética y
estructura de estos materiales, así como garantizar su conservación para preservar este
acervo genético. Una herramienta para llevar a cabo este tipo de estudios son los
marcadores moleculares, los cuales permiten el análisis directo del material genético.
Aunque hoy en día existe una gran diversidad de marcadores moleculares, los
microsatélites destacan por su sencillez, robustez de sus resultados, reproducibilidad y
economía, por lo que son una opción adecuada para realizar este tipo de estudios. Este
trabajo es parte de un proyecto encaminado a permitir el desarrollo y aumento en la
calidad de vida de un grupo de familias de la comunidad de Ocotepec, Veracruz, México
en la cual la milpa constituye un factor primordial en su bienestar alimenticio. Una de las
partes del trabajo corresponde a conocer los recursos genéticos que esta comunidad
resguarda, por lo que el presente trabajo tuvo por objetivo caracterizar la diversidad
genética de cinco morfotipos basados en color de maíz nativos de Ocotepec, Veracruz,
los cuales son cultivados en sistemas de milpa por un grupo de mujeres productoras,
2
utilizando marcadores moleculares tipo microsatélite. Este análisis permitió el
conocimiento del estado actual de la diversidad genética y de la estructura poblacional
que mantienen los morfotipos de maíz de Ocotepec, así como proponer estrategias de
manejo agronómico que permitan conservar la diversidad genética de estos materiales.
3
II. ANTECEDENTES
2.1 Maíz
El maíz pertenece a la tribu Maydeae, familia Poaceae, género Zea; es la única
especie cultivada de este género (Paliwal, 2001). Es una planta anual, monocotiledónea,
monoica, con un gran desarrollo vegetativo, puede llegar a alcanzar hasta 5 metros de
altura (lo normal son entre 2-2.5 metros). Produce hojas grandes, estrechas, opuestas,
llevadas alternadamente a lo largo del tallo. Todas las variedades de maíz siguen el
mismo patrón general de desarrollo, aunque el tiempo específico y el intervalo entre las
etapas y el número total de hojas desarrolladas pueden variar entre híbridos, estaciones,
tiempo de siembra y ubicación (Ministry of Environment and Forest, 2011).
2.2 Origen y Diversificación
El maíz (Zea mays ssp. mays) es una planta que fue concebida a partir del teocintle
(Zea mays ssp. parviglumis) hace unos 9000 años en la región del río Balsas en el
occidente de México (Bedoya et al., 2017). Desde México, se esparció por toda América
por miles de años, probablemente por dos vías: la primera del occidente y norte de México
hacia el suroeste de Estados Unidos y posteriormente hacia el este de Estados Unidos y
Canadá. La segunda de las tierras altas a las tierras bajas del oeste y sur de México hacia
Guatemala, las islas del Caribe, las tierras bajas de América del Sur y finalmente las
montañas de los Andes. Durante este periodo, el maíz se adaptó a diversos ambientes y
evolucionó gradualmente en cientos de variedades denominadas razas, cada una de las
cuales adquirieron características morfológicas y genéticas particulares, debido
principalmente a la adaptación local y a la selección humana (Matsuoka et al., 2002; Mir
et al., 2013; Bedoya et al., 2017). Posteriormente, el maíz llegó a Europa por España y
Francia a inicios del siglo XVI después de haberse realizado las primeras expediciones a
América (Dubreuil et al., 2006). La llegada del maíz a Asia y África es desconocida debido
a la carencia de datos históricos y contradictorios; sin embargo, Mir et al., (2013) han
4
propuesto una serie de trayectos por los cuales el maíz pudo haber llegado a estos dos
continentesa partir del análisis de razas y variedades de maíz representativas de diversas
partes del mundo utilizando microsatélites. Al este de Asia a través de navegaciones
marítimas, con materiales de México, a Indonesia a partir de materiales del Caribe que
pasaron a través de Europa, a oriente medio y África oriental a partir de introducciones
de materiales de América del Norte y al occidente de África a partir de materiales de
América del sur.
2.3 Importancia cultural
Mesoamérica es considerado uno de los sitios de domesticación de plantas de
mayor relevancia del mundo, sobre todo por el maíz, la planta más domesticada y
evolucionada del reino vegetal, la cual fue parte fundamental de la cultura de los pueblos
mesoamericanos (Carrillo-Trueba, 2009; Quevedo-Pérez et al., 2017). En la cosmogonía
de diferentes civilizaciones como los Teenek, los Náhuatl y los Mayas se comparte la idea
de que los primeros hombres fueron creados a partir de masa de maíz (Quevedo-Pérez
et al., 2017). En el Popol Vuh, libro sagrado de los mayas quichés se menciona: “de maíz
amarillo y de maíz blanco se hizo su carne; de masa de maíz se hicieron los brazos y las
piernas del hombre. Únicamente masa de maíz entró a la carne de nuestros padres…”.
Este cultivo forma parte de la historia y presente de los pueblos de México, representa
miles de años de cultura que han sido heredados a través de generaciones por las
civilizaciones mexicanas que establecieron en él la base de su cultura y religión al
considerarlo como un alimento sagrado (Quevedo-Pérez et al., 2017). El maíz se cultiva
prácticamente en todo el territorio mexicano, y el uso al que es destinado depende de la
forma en que se prepara y/o por el color que puede ser blanco, azul, rojo, amarillo, etc.
El consumo de este cultivo en México es muy alto, generalmente en fiestas, carnavales,
tradiciones, cumpleaños, celebraciones, etc., se sirven platillos que tienen maíz como:
gorditas, tlacoyos, sopes, chalupas, tamales, peneques, y muchos más. Otros alimentos
derivados del maíz son: las tortillas, enchiladas, totopos, sopes, esquites, tacos, pozole,
dulces como el pinole y bebidas como el atole, por mencionar algunos. En celebraciones
como el día de la Candelaria, el día 2 de Febrero, se festeja comiendo tamales de maíz
5
(Cuevas-Mejía, 2014). Por otra parte, ligado a la cultura del maíz se encuentran rituales
y prácticas materiales que son ejercidas durante todo el ciclo entre la siembra y la
cosecha, que posibilitan al campesino lograr finalizar su ciclo de cultivo; estas actividades
son indivisibles en su mundo tradicional, y no se puede hacer una sin la otra. Esto quiere
decir que en el mundo tradicional campesino, las prácticas agrícolas y la cosmovisión se
encuentran ligadas. Estas conexiones entre deidades y los vivos se han mantenido a
través del tiempo con los rituales tradicionales empleados para el éxito de las actividades
diarias de los campesinos (Romero-Contreras, 2004).
2.4 Importancia económica
El maíz es de gran importancia económica para el mundo ya sea como alimento
humano, alimento para ganado o como fuente de diversos productos industrializados. Es
una de las especies cultivadas más productivas, tiene el más alto potencial para la
producción de carbohidratos por unidad de superficie por día y fue el primer cereal en ser
sometido a rápidas e importantes transformaciones tecnológicas en su forma de cultivo
(Paliwal, 2001). El maíz es el segundo cereal en superficie sembrada (184.8 millones de
hectáreas) y el primero en producción (1,037 millones toneladas) del mundo. Los países
con mayor producción de maíz son Estados Unidos, China y Brasil los cuales contribuyen
con el 63% de la producción mundial. México se sitúa en el lugar número siete, aportando
un 2.2% de la producción mundial con 23.2 millones toneladas (FAOSTAT, 2016).
En México, en el año 2016, el maíz ocupó una superficie total de siembra de 7.7
millones de hectáreas, y su valor de producción fue de 99,737 millones de pesos (SIAP
2016). En 2011, alrededor del 80% de la superficie sembrada de maíz en México
correspondía a cultivo de temporal en el que participan pequeños productores que lo
siembran principalmente para autoconsumo (subsistencia). El 20% restante corresponde
a los grandes productores que cultivan el maíz bajo un esquema tecnificado, donde se
emplea un sistema de riego, maquinaria especializada y programas de fertilización y
control de enfermedades y plagas (Fernández-Suarez et al., 2013; SIAP, 2015). A pesar
de que el cultivo de subsistencia de maíz es extenso en superficie, el volumen de
6
producción apenas alcanza el 12% del total, mientras que la producción de la agricultura
tecnificada representa el 85% (INEGI, 2014). Herrera-Cabrera et al., (2002), determinaron
que alrededor del 76% de los productores campesinos de maíz usan semilla criolla y de
éstos el 73% usan su propia semilla, la cual seleccionan al final de cada ciclo de cultivo.
El 24% restante de los agricultores utiliza semilla mejorada. Lo antes mencionado resalta
la importancia de la agricultura de subsistencia en la seguridad alimentaria de las
comunidades rurales más pobres del país, así como en la selección, producción,
conservación y diversificación de éste cultivo en las distintas zonas geográficas del país.
(Fernández-Suárez et al., 2013).
2.5 Diversidad del maíz
La importancia del maíz para el mundo no es solo como alimento o como fuente
para elaboración de productos de importancia industrial, sino también, como un
organismo modelo para estudios de genética, puesto que posee una inmensa diversidad
genética. Desde su lugar de origen en México, se ha distribuido a lo largo de todos los
continentes, presentándose en una gama de colores (blanco, rojo, negro, azul, amarillo,
naranja, entre otros) y formas (cónica, cilíndrica, alargada, corta, entre otras) muy
diversas que difieren de una región a otra (Prasanna et al., 2012).
2.5.1 Diversidad genética
El maíz es el cereal geográficamente más ubicuo, se cultiva en 164 países
alrededor del mundo y es muy probablemente la especie de cultivo más diversa que se
conoce (Leff et al., 2004; Perales y Golicher, 2014; Croptrust, 2016). La diversidad
genética del maíz es un valioso recurso natural que juega un papel clave en la seguridad
alimentaria de un sin número de personas en el mundo. Esta diversidad genética se
encuentra resguardada dentro de diferentes razas de maíz alrededor del mundo, las
cuales son sembradas y mantenidas cada año en los sistemas tradicionales de
7
agricultura familiar de pequeños agricultores (Carvalho et al., 2004; Reif et al., 2006;
Prasanna, 2012). Esta diversidad ofrece oportunidades para el mejoramiento genético.
Una de las razas que ha sido ampliamente utilizada en los programas de
mejoramiento genético es el maíz Tuxpeño, gracias a sus altos rendimientos (n ton ha-1).
Otras razas como Bolita y Tuxpeño crema son tolerantes a sequía, la raza Chalqueño
produce altos rendimientos (n ton ha-1) y se puede cultivar en regiones donde la
temporada del cultivo es más larga, mientras que las razas Cónica, Cónica Norteña, Nal-
Tel presentan tolerancia a estrés biótico y abiótico. Las características únicas de las razas
de maíz no se limitan solo a su región de origen, sino al resto del mundo, y es por ello
que se ha analizado la diversidad genética del maíz en diversas partes del mundo
(Prasanna, 2012).
Distintos estudios en escalas desde local hasta internacional se han llevado a cabo
para evaluar la diversidad genética del maíz, utilizando marcadores microsatélites
(Pressoir y Berthaud, 2004; Dubreil et al., 2006; Reif et al., 2006; Vigouroux et al., 2008;
Bracco et al., 2009; Lia et al., 2009; Sharma, 2010, Wasala y Prassana, 2013; González-
Castro et al., 2013; Pineda-Hidalgo et al., 2013; Bedoya et al., 2017). Los resultados de
estos trabajos muestran que los valores de diversidad genética promedio oscilan entre
0.37 y 0.83, de acuerdo a una escala que va desde 0 a 1, donde 1 es el valor más alto
de diversidad. En los trabajos donde se incluyen muestras de diferentes países, los
valores más altos de diversidad genética por población se han observado para México.
Se ha encontrado una relación entre la diversidad genética y la historia evolutiva del maíz;
esto es, se ha observado mayor diversidad genética del maíz en su sitio de origen,
mientras que se ha encontrado lo contrario en los lugares donde este fue introducido más
recientemente (Dubreil et al., 2006; Vigouroux et al., 2008; Bedoya et al., 2017).
8
2.5.2 Razas de Maíz
La primera definición de raza de maíz fue introducida por Anderson y Cutler (1942),
quienes la definieron como un grupo de individuos relacionados con suficientes
características y alto número de genes en común que permiten su reconocimiento como
grupo. Este término ha sido utilizado en maíz y otros cultivos para agrupar individuos o
poblaciones que comparten características morfológicas, ecológicas y genéticas. A su
vez las razas pueden ser agrupadas en complejos o grupos raciales, a partir de una
distribución geográfica y climática y de historia evolutiva (Casiano-de la Rosa 2015).
Las razas de maíz pueden ser nombradas a partir de distintos aspectos, entre
ellos se encuentran: las características fenotípicas de la mazorca, el tipo de grano, lugar
o región de origen donde fueron colectadas o por el nombre con que son conocidas por
los grupos indígenas o mestizos que las cultivan. Este concepto y categoría ha sido de
gran utilidad, pues ha permitido organizar de una mejor forma el material en los bancos
de germoplasma y para su uso en el mejoramiento, a pesar de que una sola raza puede
comprender numerosas variantes (Casiano-de la Rosa 2015).
En el mundo han sido descritas e identificadas cerca de 300 razas de maíz, las
cuales representan del 90-95% de la diversidad genética de esta especie. Sin embargo,
se calcula que menos del 10% de esa diversidad genética es utilizada en los programas
de mejoramiento del cultivo del maíz (Dowswell et al., 1996).
En América Latina se encuentran descritas 265 razas de maíz. La mayoría de
estas están adaptadas a los trópicos, alrededor de un 50% al ambiente de tierras bajas,
40% a tierras altas y un 10% a ambientes intermedios. Así mismo se calcula que un 40%
de las razas de maíz de América tienen endospermo harinoso, 30% son duros, 20%
dentados y 3% tienen granos dulces (Paliwal, 2001).
Por su parte México, considerado como el centro de origen del maíz, cuenta con
un total de 64 razas, de las cuales 59 son nativas. Esto significa que en México se
9
encuentra poco más del 20% del total de las razas del mundo. Las razas mexicanas de
maíz han sido clasificadas en siete grupos raciales: Cónico, Sierra de Chihuahua, Ocho
Hileras, Chapalote, Tropicales precoces, Dentados Tropicales y Maduración tardía
(CONABIO).
2.6 Marcadores moleculares para estudiar la diversidad genética
Los marcadores moleculares son una herramienta que ha revolucionado los
estudios de genética y biotecnología de plantas, gracias a su versatilidad y resultados
robustos permiten estudiar y entender a la naturaleza desde diferentes perspectivas con
enfoques novedosos y complementarios a los que se abordan con herramientas
tradicionales como los marcadores morfológicos y bioquímicos (Vázquez-Lobo y Morales-
García, 2014; Kamaluddin et al., 2017). Los datos de marcadores moleculares han
permitido estudiar con mayor precisión los patrones de diversidad genética y su
distribución; el comportamiento, la selección natural, las interacciones biológicas; la
composición, funcionamiento y dinámica de comunidades microbianas; relaciones
filogenéticas, entre otros (Vázquez-Lobo y Morales-García, 2014). Un marcador
molecular es un segmento de ADN con o sin función y ubicación física conocida que
representa las variaciones entre individuos a nivel de genes o genoma (Alejos-Velázquez
et al., 2014; Burg, 2017; Kamaluddin et al., 2017). Un marcador ideal debería poseer las
siguientes características:
1) Debería ser polimórfico,
2) Capaz de determinar el estado heterocigoto u homocigoto de los individuos (co-
dominante),
3) Tener frecuente ocurrencia en el genoma,
4) Comportamiento selectivo neutro,
5) Fácil acceso (disponibilidad),
6) Fácil y rápido de analizar,
7) Poseer alta reproducibilidad,
8) Fácil intercambio entre laboratorios.
10
Es muy difícil encontrar un marcador que reúna todas las características descritas
anteriormente; a pesar de ello, para el estudio de la diversidad genética existen algunos
marcadores que han sido ampliamente utilizados por su alcance (Parveen et al., 2016).
Para estudios de diversidad genética en poblaciones de maíz han sido
ampliamente utilizados los marcadores moleculares: RFLP, RAPD, AFLPs y SSR
(microsatélites), y más recientemente SNP´s gracias a la aplicación de nuevas
tecnologías de secuenciación masiva (NGS) (Molin et al., 2013; Prasanna et al., 2010).
Cada uno de estos marcadores presenta diferencias en cuanto a costo, rapidez,
requerimiento de ADN, labor técnica, grado de polimorfismo, precisión de las
estimaciones de distancia genética y el poder estadístico de las pruebas (Garcia et al.,
2004).
2.6.1 Polimorfismos en la longitud del fragmento de restricción (RFLP)
El término RFLP se refiere a secuencias específicas de ADN que son reconocidas
y cortadas por enzimas de restricción y que varían entre individuos. Esto quiere decir que
dos individuos pueden ser diferenciados mediante el análisis de los patrones derivados
de la división de su ADN. Los polimorfismos encontrados mediante esta técnica se deben
a las diferencias encontradas en los sitios de reconocimiento de las enzimas de
restricción, las cuales son causadas por cambios en la secuencia de ADN debido a
inserciones o sustituciones de secuencias o nucleótidos únicos (Becerra y Paredes, 2000;
Das et al., 2008).
La técnica consiste en la digestión del ADN mediante enzimas de restricción, la
separación de los fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa, la transferencia
de los fragmentos por capilaridad a una membrana de nylon y la hibridación con una
sonda que puede o no ser radioactiva. Después de la hibridación se obtiene un patrón de
bandeo el cual es analizado y lo cual permite encontrar las diferencias entre individuos
de una población determinada (Becerra y Paredes, 2000).
11
Algunas de las ventajas de los RFLPs es que tienen una alta cobertura genómica,
son marcadores codominantes y son reproducibles entre laboratorios. Sin embargo, entre
las limitaciones de esta técnica se encuentran el requerimiento de grandes cantidades de
ADN, niveles de polimorfismos bajos, se necesita de mucho tiempo, esfuerzo y la
clonación de sondas, además que se trabaja con radioactividad (Becerra y Paredes,
2000; Kamaluddin et al., 2017;).
2.6.2 Polimorfismos de ADN amplificado al azar (RAPD)
Es una técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa. El principio de
esta técnica es la amplificación de fragmentos de ADN usando oligonucleótidos,
cebadores o “primer´s” de 10 nucleótidos de secuencia aleatoria. Los polimorfismos
aparecen cuando se ha producido una pérdida, inserción o cambio de un solo nucleótido
en la cadena molde. Los productos generados por la amplificación se separan mediante
electroforesis en gel de agarosa o acrilamida y las bandas visualizadas, de diferente peso
molecular representan distintos loci (Becerra y Paredes, 2000; Rocha-Manuvie et al.,
2014; Kamaluddin et al., 2017).
Esta es una técnica especial para especies que no cuentan con suficientes datos
genómicos. Es una técnica sencilla y rápida, de bajo costo pero con las desventajas de
presentar baja reproducibilidad y ser un marcador dominante (Becerra y Paredes, 2000;
Parveen et al., 2016; Burg, 2017).
2.6.3 Polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLPs)
Los marcadores AFLPs son la combinación de la técnica de RFLP con la PCR. En
esta técnica, el ADN es digerido con dos enzimas de restricción, una de corte raro (EcoRI
o Pst I) y otra de corte frecuente (Mse o Taq I) para obtener fragmentos de distinto
tamaño. Seguido de esto ocurre la ligación de secuencias específicas llamadas
“adaptadores” a los bordes de los fragmentos generados por la restricción, para
posteriormente llevar a cabo la amplificación selectiva de estos fragmentos utilizando
12
cebadores específicos. El adaptador es una molécula de ADN de doble cadena de 19-22
pares de bases que contiene una secuencia de reconocimiento para el oligonucleótido y
otra secuencia complementaria al sitio de restricción. Los oligonucleótidos utilizados para
la amplificación selectiva contienen la secuencia de reconocimiento al adaptador más uno
a tres nucleótidos (A, T, C ó G) extras en su extremo 3´. Para la detección de los
fragmentos amplificados uno de los oligonucleótidos puede ser etiquetado con
radioactividad, quimioluminiscencia o con un fluoróforo. Al final, los fragmentos se
separan mediante electroforesis en geles de acrilamida o en un capilar por medio de un
secuenciador automático. El nivel de polimorfismo para esta técnica depende de la
combinación de los nucleótidos seleccionados para la combinación con los
oligonucleótidos (Becerra y Paredes, 2000; Serrato-Díaz y Ramos-Ortiz, 2014; Burg
2017; Kamaluddin et al., 2017;).
Los AFLPs son marcadores codominantes, no requieren del conocimiento previo
del genoma y generan resultados reproducibles. Sin embargo, esta es una técnica
bastante cara (Parveen, 2016; Kamaluddin et al., 2017).
2.6.4 Microsatélites
Los microsatélites son regiones de ADN compuestas de pequeños motivos
(secuencias de nucleótidos) de 1 a 6 pares de bases que se repiten en tándem. Se
encuentran tanto en el genoma de eucariotas como procariotas, tanto en regiones
codificantes como no codificantes. De acuerdo a su composición, los microsatélites
pueden ser clasificados en tres tipos: perfectos, imperfectos e interrumpidos. Los
microsatélites perfectos son aquellos en los cuales la secuencia repetida no es
interrumpida por ninguna base o motivo (ejemplo: ATATATATATAT), por el contrario un
microsatélite imperfecto es aquel en donde la secuencia repetida es interrumpida por
alguna base o motivo que no pertenece a dicha secuencia (ejemplo:
ATATATATCGATATAT), mientras que los microsatélites compuestos son aquellos en los
que la secuencia repetida está compuesta de más de un motivo repetido indistintamente
13
(ejemplo: ATATATGCGCGC) (Karaoglu et al., 2005; Oliveira et al., 2006; Saharan y Naef,
2008).
A diferencia de otras regiones del genoma los microsatélites tienen una tasa de
mutación mucho más elevada la cual oscila entre 10-2 a 10-6 nucleótidos por locus por
generación. Esta tasa de mutación varía entre y dentro de especies y depende además
de otros factores como el tipo de repetido, el contenido de GC en las regiones
flanqueantes, el tamaño del alelo y la posición en el cromosoma (Oliveira et al., 2006;
Kantartzi, 2013).
Los microsatélites presentan alto grado de polimorfismo, lo cual usualmente
resulta de la adición o deleción de unidades repetidas enteras o motivos. Esto quiere
decir que los polimorfismos observados en los microsatélites son el resultado de las
diferencias encontradas en cuanto al número de repetidos (Vieira et al., 2016).
El alto grado de polimorfismo de los microsatélites ha sido atribuido a diferentes
factores, entre los que se encuentran errores durante la recombinación, el
entrecruzamiento desigual (unequal crossing-over) y el deslizamiento en el apareamiento
de las hebras durante la replicación del ADN (slippage miss-pairing). Sin embargo, de
estos tres factores se ha descartado que los dos primeros sean los factores dominantes,
dejando al deslizamiento de la hebra como el principal factor en la generación de
polimorfismo (Oliveira et al., 2006).
Durante la síntesis del ADN puede ocurrir la asociación temporal entre las dos
hebras del ADN, cuando esta asociación ocurre de manera errónea se produce el
deslizamiento de las hebras; esto es, se crea un bucle o “loop” en una de las hebras que
impide el apareamiento normal entre ambas; la síntesis del ADN continúa y al final se
obtiene la ganancia de un repetido cuando el loop se forma en la cadena naciente o se
pierde cuando este se forma en la cadena molde (Figura 1).
14
Los microsatélites han sido ampliamente utilizados en estudios de genética, en
distintas áreas como genética de la conservación, genética de poblaciones, mejoramiento
molecular y pruebas de paternidad. Esto, gracias a su naturaleza multialélica, co-
dominancia, abundancia y amplia cobertura del genoma y su alta reproducibilidad y
resolución (Oliveira et al., 2006; Sharma et al., 2010).
Figura 1. Fenómeno de deslizamiento de la hebra durante la síntesis de ADN el cual trae como resultado
cambios en la longitud de los microsatélites debido a la inserción o deleción de motivos (Tomado y
modificado de Vázquez-Lobo y Morales-García, 2014).
2.7 Nuevas tecnologías de secuenciación masiva (NGS)
El enfoque más completo para el análisis de variantes en estudios de diversidad
genética es la secuenciación del ADN, que permite la evaluación simultánea de diversos
tipos de marcadores moleculares (Kiani et al., 2013). La secuenciación del ADN tuvo su
inicio en el año de 1977 con la aparición de los métodos de Sanger y Maxam-Gilbert, los
cuales son considerados como la primera generación en tecnología de secuenciación (El-
Metwally et al., 2014). Durante dos décadas el método de Sanger y sus variaciones
progresivamente mejoradas fueron las técnicas preferidas en la mayoría de los
laboratorios (El-Metwally et al., 2014). Sin embargo, debido al alto costo de la
metodología clásica de secuenciación de Sanger no podía ser aplicada a poblaciones
Inserción Deleción
15
grandes para estudios de diversidad genética (Kiani et al., 2013). Esto cambió con la
aparición de los secuenciadores automáticos y algoritmos bioinformáticas desarrollados,
que aumentaron significativamente y en gran medida la escala de secuenciación y
análisis. El rápido desarrollo en NGS permitió reducir costos, acelerar los procesos y
aumentar la automatización y precisión de la secuenciación (El-Metwally et al., 2014). Por
otra parte, los avances en NGS han hecho posible ampliar los análisis de la variación
genética a genomas completos, ya no solo de especies modelo, sino también de otras
especies (Terraciano et al., 2016). Actualmente, es posible la secuenciación de genomas
completos en tan solo unas horas (Land et al., 2015). Para el diagnóstico de
enfermedades en pacientes pediátricos es posible obtener resultados en tan solo 26
horas utilizando la técnica STATseq (Miller et al., 2015).
Gracias al desarrollo de las NGS fue posible secuenciar el genoma completo del
maíz. El genoma de la variedad de maíz conocida como B73 fue secuenciada mediante
pirosecuenciación o secuenciación 454. En este estudio se reportó que el genoma del
maíz está conformado por 2 mil 300 millones de pares de bases, que contiene más de 32
mil genes y que aproximadamente un 85% del genoma está conformado por elementos
transposibles (Schnable et al., 2009). De igual manera, mediante pirosecuenciación, en
México fue secuenciado el genoma de la raza de maíz conocida como maíz palomero,
originaria del centro del país. Comparado con el genoma del B73 se encontró que el
tamaño del genoma del maíz palomero es aproximadamente 22% inferior y que contiene
20% menos DNA repetitivo (Vielle-Calzada et al., 2009).
Los avances en genómica han llevado a la identificación de un gran número de
marcadores de ADN microsatélites y SNPs en maíz, volviendo a estos marcadores los
más adecuados para el estudio de diversidad y estructura genética poblacional. Al
comparar microsatélites vs SNPs obtenidos mediante NGS se ha observado que ambos
marcadores tienen la misma capacidad de resolución para la diversidad genética. Sin
embargo, con respecto a la estructura poblacional, los microsatélites han demostrado ser
más eficientes que los SNPs (Chen et al., 2017). Por otra parte, a pesar de que el costo
de la secuenciación ha disminuido, el uso de microsatélites sigue siendo por mucho más
16
barato, además de que la técnica es más sencilla (Prasanna et al., 2010). Por ello los
microsatélites representan la mejor herramienta para llevar a cabo este tipo de estudios.
2.8 Recursos genéticos y su conservación
Los recursos genéticos han sido definidos en el Convenio sobre la Diversidad
Biológica como: “todo aquel material de origen vegetal, animal o microbiano que contiene
unidades funcionales de la herencia o genes que presentan valor real o potencial (Pardo,
1998). Este término engloba la vasta diversidad que existe entre y dentro de especies de
animales, plantas y microorganismos, la cual es representada por distintos niveles que
comprenden secuencias de nucleótidos, genes específicos, genotipos bien definidos,
individuos, poblaciones y especies a niveles de organización que van desde plásmidos,
organelos, virus, células, tejidos y microbios hasta plantas enteras, animales y hongos.
Los recursos genéticos le permiten a los seres vivos adaptarse y sobrevivir a su entorno
cuando este sufre cambios. Son la materia prima de la que el mundo depende para
garantizar la seguridad alimentaria y la nutrición, así como para preservar los
ecosistemas. Por todo lo anterior, se le considera a los recursos genéticos como la fuente
de riqueza más valiosa entre las sociedades y el mundo natural (McGuire y Qualset, 1986;
Sun, 1999; FAO).
Los recursos genéticos pueden ser clasificados en dos grupos: actuales y
potenciales. Los recursos genéticos actuales comprenden las especies y la diversidad
dentro de las mismas (poblaciones, individuos y genes) que como su nombre lo indica
están siendo utilizadas para cubrir las necesidades humanas. Los recursos genéticos
potenciales son aquellos que no están siendo utilizados en la actualidad pero podrían ser
aprovechados en el futuro (Sun, 1999).
Los recursos genéticos han sido utilizados por el hombre para el mejoramiento de
plantas, animales y microorganismos, con el fin de aumentar la productividad y calidad
17
de los productos alimenticios, así como también para utilizar a estos como una
herramienta en la medicina, agricultura y la industria (Sun, 1999).
Existen dos estrategias principales para la conservación de los recursos genéticos:
la conservación in situ y la conservación ex situ (Iriondo-Alegría, 2001).
2.8.1 Conservación in situ
La conservación in situ consiste en la conservación de los recursos genéticos de
las especies y la diversidad dentro de éstas (poblaciones, individuos y genes) en su sitio
de origen o hábitat natural. Se considera a la conservación in situ como el método más
adecuado para la conservación de los recursos genéticos puesto que implica la
conservación de una entidad biológica dentro del ecosistema en el cual se ha
desarrollado y en el cual continúa en evolución (Sun. 1999, Iriondo-Alegría, 2001).
2.8.2 Conservación ex situ
La conservación ex situ comprende la conservación del germoplasma o recursos
genéticos fuera de su sitio de origen o hábitat natural, y para ello se emplean los
denominados bancos de germoplasma. Los bancos de germoplasma son instalaciones
donde se resguarda a largo plazo el germoplasma representativo de las poblaciones.
Germoplasma que puede estar en forma de semillas, polen y explantes de vegetales, o
cultivo in vitro de los mismos. La ventaja que tiene la conservación ex situ sobre la
conservación in situ es que existe el control directo sobre el material, fácil accesibilidad y
disponibilidad (Sun. 1999, Iriondo-Alegría, 2001).
A pesar de que la mejor estrategia para la conservación de los recursos genéticos
es la protección de los hábitats no se debe dejar de lado a la conservación ex situ, sino
que esta debe ser un complemento para lograr una adecuada conservación de los
recursos genéticos (Iriondo-Alegría, 2001).
18
2.9 Población de Ocotepec
Al censo del 2010, Ocotepec reportó 494 habitantes de los cuales 48.2% son
mujeres y 60.8% son menores de 18 años (INEGI, 2010). Se trata de una población con
alta marginación y particularmente escasa en educación básica. La población
económicamente activa (31.74%) está conformada principalmente por hombres que
migran a trabajar como jornaleros y trabajadores de la construcción en diversas ciudades
(78.2% percibe menos de 2 salarios mínimos). El 89.9% de los adultos se dedica al sector
primario, en específico, a la agricultura familiar de autoconsumo. El grado medio de
escolaridad es de 1.7 (en tanto que en el municipio es de 2.3 y en el estado de 6.4); más
del 50% de las mujeres adultas es analfabeta. Como en gran parte del México rural, la
migración masculina deja a Ocotepec feminizado por gran parte del año. Aunado a las
responsabilidades de llevar la vida familiar, las mujeres en Ocotepec han tenido, cada
vez más, que hacerse cargo de las decisiones relacionadas con el manejo de las milpas
(Figura 2).
19
Figura 2. Milpas de Ocotepec, Veracruz (a y b). Se muestra al maíz interactuando junto a otros cultivos
como calabaza (c) y frijol (d). Flechas en color rojo señalan al maíz, en verde fosforescente fruto de
calabaza, en amarillo flor de calabaza, en azul ejote de frijol, en rosa flor de frijol, en blanco hoja de frijol y
en naranja espiga de maíz.
20
2.9.1 La milpa
La palabra milpa proviene del náhuatl milli (que significa campo) y pan (encima),
es decir, encima del lugar o lugar de cultivo. Se conoce como milpa a una extensión de
campo cultivada con maíz acompañada de diversos cultivos que pueden ser sembrados
o inducidos, esto es: un sistema agro-diverso. La milpa comúnmente está integrada por
maíz, frijol y calabaza (también llamada la tríada de la alimentación mesoamericana),
productos básicos en la alimentación de los mexicanos desde épocas prehispánicas. Las
plantas que son cultivadas en la milpa mantienen relaciones sinérgicas, como ejemplo,
el frijol genera en su raíz nitrógeno que puede ser aprovechado por el maíz, y el maíz a
su vez le brinda soporte al frijol enredador, mientras que por otra parte las hojas de la
calabaza impiden el crecimiento de otras yerbas. Este sistema de cultivo es utilizado
principalmente para el autoconsumo familiar y en muy baja escala para la venta de
productos. Representa una forma de agricultura familiar, pues es allí en donde una
familia produce los diversos alimentos que consumirá a lo largo del año. Asimismo, se le
considera el bastión indispensable de la seguridad alimenticia y la clave para el
aprovechamiento sostenible de la biodiversidad mexicana (Buenrostro, 2009; Santillán,
2014).
21
JUSTIFICACIÓN
El material genético del grupo de productoras de milpas de Ocotepec, Veracruz es
ancestral, ha sido heredado durante generaciones y nunca ha sido analizado, lo que hace
que este sea de interés y probablemente sea una nueva fuente de recursos genéticos
que pueden contribuir a incrementar la diversidad representada en los bancos de
germoplasma del país.
El interés en el análisis de la diversidad genética del maíz es que el grupo de
productoras apoyado por diferentes ONGs continúen conservando este material de
manera in situ, por la importancia económica, cultural y biológica que representa este
cultivo tanto para la comunidad de Ocotepec, como para México y el resto del mundo.
Los recursos que son producidos en las milpas del grupo de productoras forman
una parte muy importante de su fuente de alimentación y proveen un sistema de estudio
único. El proyecto global comprende además, la caracterización de fósforo (P) en la
planta de maíz y su asociación con consorcios microbianos de manera paralela, por lo
que los resultados sumados de cada uno de estos trabajos servirán para brindar
propuestas de manejo agronómico que conduzcan a mejorar la producción de las milpas.
22
HIPÓTESIS
En Ocotepec, Veracruz, los cinco morfotipos de maíz nativos diferenciados por
color son genéticamente distintos a pesar de que comparten características morfológicas.
OBJETIVOS
Objetivo general:
Caracterizar la diversidad genética de cinco morfotipos de maíz nativos manejados
por un grupo de productoras en Ocotepec, Veracruz, utilizando marcadores
microsatélites.
Objetivos específicos:
1. Identificar los microsatélites más polimórficos a partir de un grupo de 21
microsatélites evaluados en los cinco morfotipos de maíz.
2. Caracterizar la diversidad genética de estos morfotipos.
3. Determinar la estructura genética poblacional.
23
METODOLOGÍA
6.1 Área de estudio
El área de estudio es la comunidad de Ocotepec ubicada en el municipio de
Ayahualulco en el Estado de Veracruz. La localidad se encuentra a una altura de 2280
msnm, sus coordenadas geográficas son longitud: 190 21´44” y latitud: -970 09´43” (Figura
3).
Figura 3. Ubicación de la ciudad de Ocotepec, Ayahualulco, Veracruz. La marca roja indica la ubicación
de la comunidad de Ocotepec.
24
6.2 Material biológico
Para este estudio se utilizaron cinco morfotipos de maíz nativo, provenientes de
un grupo de productoras de la comunidad de Ocotepec, Ayahualulco, Veracruz. Los
morfotipos fueron clasificados de acuerdo a su color en amarillo (18 individuos), blanco
(40), rojo (20), jaspeado (10) y negro (30), siendo un total de 118 individuos. Con el
objetivo de contar con un grupo externo, se incluyó maíz amarillo (10 individuos) y blanco
(10) de la raza Nal-Tel, ambos provenientes del estado de Campeche (Figura 4).
Figura 4. Mazorcas de los morfotipos de maíz de Ocotepec y del grupo externo. Debajo de cada mazorca
se muestra el acrónimo. Las letras se refieren a: A= Amarillo, B= Blanco, R= Rojo, J=Jaspeado, N=Negro,
AC= Amarillo Campeche y BC= Blanco Campeche.
Las semillas de cada morfotipo y el grupo externo (138 individuos en total) fueron
esterilizadas superficialmente (Leyva-Madrigal et al., 2015), y pre-germinadas en placas
Petri con medio de cultivo Luria Bertani agar (LB). Una vez pre-germinadas, las semillas
se transfirieron a vasos de medio litro con vermiculita, y se llevaron a invernadero donde
se mantuvieron a 25±3 ̊ C con fotoperiodo natural por un periodo de 21 días. Las plantas
se regaron con 200 ml de agua cada 3 días (Figura 5).
25
Figura 5. Desarrollo de los maíces. a) Semillas pre-germinadas en placas con medio LB-agar; b) Semillas
en vasos con vermiculita; c) Planta de maíz a los 21 días.
6.3 Extracción de ADN de maíz
Para la obtención de ADN genómico (ADNg), se tomaron cuatro muestras de tejido
foliar de cada individuo, de aproximadamente 70 mg cada una, e inmediatamente se
congelaron en nitrógeno líquido. Posteriormente, el tejido fue macerado utilizando el
equipo Tissue Lyser II (QIAGEN) en presencia de nitrógeno líquido, a 30 Hz/min. Una vez
molidas las muestras, se resguardaron a -70˚C en un ultracongelador hasta su utilización.
Laextracción de ADNg, se llevó a cabo empleando el kit para extracción de ADN vegetal
de Qiagen (DNeasy Plant Mini Kit), siguiendo las instrucciones del proveedor. El ADN
extraído se dividió en dos alícuotas; una de ellas se conservó como respaldo a -20˚C, y
la otra se mantuvo a 4˚C para ser utilizada para la amplificación de los microsatélites por
PCR.
Para verificar la calidad del ADNg, se realizó electroforesis en geles de agarosa al
1% teñidos con bromuro de etidio. Los geles se observaron en un transluminador de luz
UV y la imagen del gel se registró mediante fotodocumentador (Bio-Rad) con el programa
Chemidoc-XRS. La cantidad del ADNg se cuantificó en un espectrofotómetro Nanodrop
2000c (Thermo Fisher Scientific).
26
6.4 Análisis de microsatélites
Se seleccionó una batería de 21 microsatélites previamente reportados como
polimórficos (rango de PIC entre 0.39 y 0.9) (Cuadros 1 y 2) y con una elevada eficiencia
discriminatoria, los cuales se encuentran distribuidos en todo el genoma del maíz (Figura
6). Se optimizaron las condiciones de la PCR para cada uno de los marcadores evaluando
distintas temperaturas de alineamiento y concentraciones de ADN genómico.
Cuadro 1. Microsatélites probados para el análisis de la diversidad genética de los
maíces nativos de Ocotepec, Veracruz y valores de PIC obtenidos en trabajos realizados
con otras poblaciones de maíz.
PIC
Microsatélite Register et al., 2001
Smith et al., 1997
Pineda-Hidalgo et al., 2013
Sharma et al., 2010
Shiri, 2011
Wasala y Prasana, 2013
Senior, 1998
phi056 0.67 0.71 0.69
phi064 0.83 0.82
phi120 0.74 0.56
phi96100 0.76 0.84
phi083 0.76 0.75 0.85 0.9 0.67
phi127 0.7 0.76 0.63 0.71
phi053 0.71 0.67
phi072 0.63 0.51 0.66 0.52
phi079 0.73 0.78 0.78 0.55
phi093 0.62 0.69 0.82 0.77
phi006 0.6 0.85
phi331888 0.67 0.85 0.85
phi085 0.79 0.75 0.57
phi031 0.6 0.79 0.78 0.86 0.57
phi078 0.63 0.67 0.6
umc1545 0.76 0.66 0.76
phi034 0.57 0.78 0.68 0.79 0.74 0.71
phi015 0.7 0.84 0.59
phi065 0.77 0.77 0.68
phi041 0.67 0.6 0.59 0.57
phi059 0.39 0.45 0.74 0.6 0.65 0.56
27
Cuadro 2. Información de los microsatélites probados para el análisis de la diversidad genética de los maíces de
Ocotepec, Veracruz.
Microsatélite Motivo LGa Forward Reverse RA(pb)b Tmc ADN (ng)d
phi056 CCG 1.00 ACTTGCTTGCCTGCCGTTAC CGCACACCACTTCCCAGAA 239-259 55 10
phi064 ATCC 1.11 CCGAATTGAAATAGCTGCGAGAACCT ACAATGAACGGTGGTTATCAACACGC 73-110 58 10
phi120 AAG 1.11 GACTCTCACGGCGAGGTATGA TGATGTCCCAGCTCTGAACTGAC 63-88 52.8 10
phi96100 ACCT 2.01 AGGAGGACCCCAACTCCTG TTGCACGAGCCATCGTAT 268-297 62.5 10
phi083 AGCT 2.04 CAAACATCAGCCAGAGACAAGGAC ATTCATCGACGCGTCACAGTCTACT 122-138 56 20
phi127 AGAC 2.08 ATATGCATTGCCTGGAACTGGAAGGA AATTCAAACACGCCTCCCGAGTGT 112-138 65 20
phi053 ATAC 3.05 AACCCAACGTACTCCGGCAG CTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGAC 170-194 53 20
phi072 AAAC 4.00 ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTT GACAGCGCGCAAATGGATTGAACT 156-172 66.9 10
phi079 AGATG 4.05 TGGTGCTCGTTGCCAAATCTACGA GCAGTGGTGGTTTCGAACAGACAA 180-195 60 20
phi093 AGCT 4.08 AGTGCGTCAGCTTCATCGCCTACAAG AGGCCATGCATGCTTGCAACAATGGATACA 283-295 53 10
phi006 CCT 4.11 AGGCGGCGTGCTGAACACCT CGCTTCATCTCCCGTGACAATG 84-96 67.1 10
phi331888 AAG 5.04 TTGCGCAAGTTTGTAGCTG ACTGAACCGCATGCCAAC 129-136 53.8 10
phi085 AACGC 5.06 AGCAGAACGGCAAGGGCTACT TTTGGCACACCACGACGA 236-266 53 10
phi031 GTAC 6.04 GCAACAGGTTACATGAGCTGACGA CCAGCGTGCTGTTCCAGTAGTT 187-227 58.7 20
phi078 AAAG 6.05 CAGCACCAGACTACATGACGTGTAA GGGCCGCGAGTGATGTGAGT 125-241 63.3 10
umc1545 AAGA 7 GAAAACTGCATCAACAACAAGCTG ATTGGTTGGTTCTTGCTTCCATTA 70-98 56.4 20
phi034 CCT 7.02 TAGCGACAGGATGGCCTCTTCT GGGGAGCACGCCTTCGTTCT 120-250 64.2 10
phi015 AAAC 8.08 GCAACGTACCGTACCTTTCCGA ACGCTGCATTCAATTACCGGGAAG 78-102 65 10
phi065 CACTT 9.03 AGGGACAAATACGTGGAGACACAG CGATCTGCACAAAGTGGAGTAGTC 132-157 61.6 10
phi041 AGCC 10.00 TTGGCTCCCAGCGCCGCAAA GATCCAGAGCGATTTGACGGCA 196-218 69.4 10
phi059 ACC 10.02 AAGCTAATTAAGGCCGGTCATCCC TCCGTGTACTCGGCGGACTC 153-300 66.9 20
a Localización genómica. b Rango aproximado en pares de bases. c Temperatura de alineación para PCR. d Cantidad de ADN para la PCR
28
Figura 6. Localización genómica de los microsatélites seleccionados para este estudio. Se muestran los
10 cromosomas del genoma del maíz. Del lado derecho de cada cromosoma se señala el nombre del
microsatélite seguido en paréntesis de la localización genómica, donde el número entero indica el
cromosoma y los decimales la sección dentro de ese cromosoma en la que se encuentra ubicado el
microsatélite.
Las reacciones de PCR ya estandarizadas contienen de 10-20 ng de ADNg,
amortiguador de PCR 1X, 1.5 mM cloruro de magnesio (MgCl2), 0.5 µM de cada
oligonucleótido, 0.5 mM de dNTP´s y 1 unidad de Taq ADN Polimerasa (Taq DNA
Polymerase, Invitrogen, Cat. No.10342046), en un volumen final de 25 µL. Las
condiciones de PCR fueron las siguientes: desnaturalización inicial de 94oC por 5 min,
seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 94oC por 45 segundos, 30 segundos a la
temperatura de alineamiento correspondiente para cada marcador, extensión a 72oC por
30 segundos y por último una extensión final a 72oC por 5 minutos. Solo para el
microsatélite phi083 se realizó un PCR touchdown (T-PCR). El T-PCR inició con una
temperatura de anillamiento de 63oC, durante los primeros 20 ciclos, la temperatura fue
decreciendo 0.3oC durante cada ciclo hasta llegar a 57oC, mientras que los 15 ciclos
restantes se llevaron a cabo con una temperatura fija de 56oC.
29
Para seleccionar los microsatélites más polimórficos se realizó una evaluación
preliminar con el 50% de los individuos a analizar (69 individuos). El criterio de selección
estuvo basado principalmente en el número de alelos, el porcentaje de individuos
heterocigotos y/o por el número de individuos amplificados. Se realizaron las
amplificaciones con cada uno de los microsatélites previamente presentados. Los
fragmentos obtenidos se sometieron a una electroforesis en geles de agarosa (4% w/v)
teñidos con bromuro de etidio, y como referencia se utilizó el marcador de peso molecular
Gene Ruler Ultra Low Range (Thermo Fisher Scientific), el cual tiene un rango de 10-300
pares de bases. Los geles se visualizaron bajo luz UV en un fotodocumentador (Bio-Rad)
con el programa Chemidoc-XRS. Las bandas observadas se consideraron como distintos
alelos cuando eran de diferente tamaño, según sus pares de bases. Los individuos
restantes (69 individuos), en base a la evaluación preliminar, se analizaron únicamente
con los microsatélites seleccionados empleando las condiciones de PCR previamente
descritas. Posteriormente, se procedió al análisis de los productos de PCR de los
microsatélites mediante electroforesis capilar en el equipo QIAxcel (Qiagen QIAxcel DNA
High Resolution Kit), para determinar el tamaño de cada uno de los alelos amplificados.
Antes del análisis se cuantificaron los productos de PCR en el equipo Nanodrop 2000c
(Thermo Fisher Scientific), obteniéndose lecturas de aproximadamente 200-300 ng/µL
para todas las muestras. Partiendo de esto, se utilizó el método de electroforesis capilar
OH800 en el equipo QIAxcel, recomendado para concentraciones >100 ng/µLy con una
resolución de hasta 3 pares de bases en fragmentos amplificados entre 100 y 500 pares
de bases. El análisis de los fragmentos amplificados se realizó con ayuda del software
QIAxcel Screen Gel (QIAxcel), utilizando el marcador de alineamiento QX alignment
marker 15 pb/600 pb (Cat.No. 145017220) y el marcador de peso molecular QX size
marker 25 pb/500 pb (Cat. No. 145020110).
30
6.5 Diversidad genética
Para conocer la información genética proporcionada por cada microsatélite, se
empleó una matriz alélica (fragmentos) con la información obtenida de cada microsatélite
en cada uno de los individuos de los distintos morfotipos. Se determinó el porcentaje de
datos faltantes para cada microsatélite en cada uno de los morfotipos, utilizando el
paquete “POPPR” implementado en el software R (Kambar et al., 2015). Se descartaron
aquellos microsatélites con ≥10% de datos faltantes en dos o más morfotipos. Para
validar que el número de microsatélites utilizados era suficiente para representar la
diversidad genética poblacional se realizó una curva de acumulación de genotipos en el
paquete “POPPR”. Se calculó el número de alelos (A), el número de alelos efectivos (Ae),
el número de alelos privados (AP), heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He), el
índice de diversidad de Shannon (I) y coeficiente de endogamia (Fis) utilizando el software
GenAlEx 6.5 (Peakall y Smouse, 2012). Se calculó la riqueza alélica (Rs) en el programa
FSTAT V 2.9.3.2 (Goudet, 1995; Lischer y Excoffier, 2012). El índice de contenido
polimórfico (PIC) y porcentaje del alelo más frecuente (AMF) de cada uno de los
microsatélites fue calculado con el programa Power Marker V 3.25 (Liu y Muse, 2005).
6.6 Análisis de la estructura de la población
Se realizó la prueba de equilibrio de Hardy Weinberg (HWE) por microsatélite de
manera individual dentro de cada uno de los morfotipos, así como también un mapa de
calor (heatmap) para representarlo utilizando el paquete POPPR.
Se calcularon los valores pareados del coeficiente de diferenciación genética Rst y
Fst, y la probabilidad de estos basados en 999 permutaciones con el programa Arlequin
3.5.2.2. Con programa GenAlEx 6.5 se realizó la medición indirecta de flujo genético,
calculando el número de migrantes (Nm) entre morfotipos.
31
La estructura poblacional fue analizada a través de tres métodos distintos. El
primero consistió en un análisis bayesiano con el software STRUCTURE 2.3.4 (Pritchard
et al., 2000). Las corridas del programa STRUCTURE se realizaron con 500.000
iteraciones después de un período de calentamiento de 500.000 y un total de 10
repeticiones para cada uno de los valores posibles de K 1 a K 6. Se utilizó el modelo de
frecuencias alélicas correlacionadas. El valor más probable de K fue determinado
mediante dos análisis: uno basado en el LnP (D) y el otro en el ΔK descrito por Evanno
et al., (2005), ambos implementados en la herramienta en línea Structure Harvester (Earl
y Vonholdt, 2012). Se realizaron tres réplicas independientes del análisis para verificar la
consistencia de los resultados. El segundo método para conocer la estructura poblacional
consistió en la creación de un dendrograma mediante el método de agrupamiento del
vecino más cercano (neighbour joining) basado en la distancia genética de Provesti y
utilizando 999 réplicas bootstrap, esto con el paquete “POPPR”. Por último se realizó un
análisis de coordenadas principales (PCoA) en el programa GenAlEx 6.5.
Se realizó el análisis de varianza molecular (AMOVA) de los grupos identificados
por el programa STRUCTURE para los individuos de Ocotepec, se utilizó como distancia
Fst (número de alelos distintos) y Rst (suma de las diferencias de tamaño cuadrado), esto
con ayuda del programa Arlequin 3.5.2.2.
6.7 Registro de inicio del periodo de floración de los maíces
El registro de inicio del periodo de floración se llevó a cabo de manera visual en
12 parcelas experimentales en la comunidad de Ocotepec. Se tomó como inicio del
periodo de floración cuando el 50% + 1 plantas en la parcela presentaban espiga.
32
6.8 Caracterización morfológica de las mazorcas de maíz e identificación racial
Se realizó la caracterización morfológica de mazorcas de cuatro de los cinco
morfotipos de maíz (amarilla, negra, blanca y roja), debido a la falta de muestras del
morfotipo jaspeado. Esto se realizó en base a la guía práctica para la descripción
preliminar de colectas de maíz del proyecto global de maíces nativos de CONABIO
(http://www.biodiversidad.gob.mx/genes/pdf/proyecto/Anexo7_GuiaColecta/GuiaPractic
aMaiz.pdf).
RESULTADOS
7.1 Evaluación del grupo de microsatélites para estimar la diversidad genética
A partir del grupo inicial de 21 microsatélites se seleccionaron 12 con base en el
análisis preliminar en geles de agarosa al 4%. Los microsatélites seleccionados se
analizaron mediante electroforesis capilar y los resultados se muestran en el cuadro 3.
Cuadro 3. Resultados de electroforesis capilar para los 12 microsatélites seleccionados
a partir del análisis preliminar.
Microsatélite Alelos % individuos
heterocigotos
% individuos
amplificados
Rango de
amplificación (pb)
phi96100 8 61.9 96.6 236-300
phi083 7 45.8 100 124-148
phi127 6 30.5 97.5 98-126
phi053 8 45.7 91.5 166-210
phi072 11 63.6 100 128-168
phi079 5 29.6 91.5 177-197
phi006 9 26.3 83.9 75-99
phi031 5 70 100 185-225
umc1545 8 35.3 100 49-85
phi015 7 53.6 99.2 81-109
phi065 5 24.7 95.8 128-158
phi059 9 52.5 90.7 143-167
33
Con base en el criterio de más del 10% de datos faltantes, se descartaron los
microsatélites phi053, phi079, phi006 y phi059 (Figura 7), para finalmente quedarnos con
un grupo de ocho marcadores. Estos ocho marcadores fueron suficientes para explicar
la diversidad genética de los morfotipos estudiados, de acuerdo a los resultados de la
curva de acumulación de genotipos (Figura 8). En la gráfica se puede observar que con
el uso de cuatro marcadores se puede alcanzar a detectar el 90% (106.2/118) de los
MLG, porcentaje que se tomó como referencia para validar el número de marcadores
utilizados.
Figura 7. Mapa de calor que muestra los datos faltantes por locus (eje X) y morfotipo de maíz (eje Y). La
escala de color indica el porcentaje de datos faltantes, oscilando entre 0% (azul) y 27% (rojo). Las letras
indican: A= Amarillo, B= Blanco, R= Rojo, J=Jaspeado, N=Negro.
34
Figura 8. Curva de acumulación de genotipos de los 118 individuos pertenecientes a los distintos
morfotipos de maíz de Ocotepec, Veracruz genotipados con ocho microsatélites. El eje “X” muestra el
número de loci muestreados y el eje “Y” representa el número de MLG observados. La línea roja punteada
representa el 90% de MLG observados (106.2/118).
7.2 Diversidad genética
7.2.1 Diversidad genética por locus
Los resultados de la diversidad genética por microsatélite se muestran en el cuadro
4. Se encontraron un total de 57 alelos distintos en los 118 individuos analizados. El
número promedio de alelos por locus fue de 7.13, oscilando entre 5 (phi065 y phi031) y
11 alelos (phi072). El número promedio de alelos efectivos fue de 2.65, el valor más bajo
y más alto lo obtuvieron los microsatélites phi127 con 1.58 y phi072 con 4.51
respectivamente. En general, los valores de He para los marcadores fueron más altos
que los de Ho, únicamente el microsatélite phi031 mostró un valor mayor de Ho con 0.69
frente al valor de He de 0.65. El valor promedio de He fue de 0.61 y de Ho de 0.49. Los
valores del PIC se encontraron entre 0.36 (phi127) y 0.78 (phi072), con un promedio de
35
0.58. Para el porcentaje del alelo más frecuente se encontró un promedio de 53%, el
porcentaje más bajo se presentó en el microsatélite phi96100 con 30% y el más alto en
el phi127 con 77%. El valor promedio para el índice de diversidad de Shannon fue de
1.27, oscilando entre 0.78 (phi127) y 1.90 (phi072). Para el coeficiente de endogamia (Fis)
se encontró un valor promedio de 0.22, solamente el microsatélite phi031 presentó un
valor negativo (-0.07), el cual indica una proporción mayor de individuos heterocigotos, el
resto de los marcadores presentaron valores positivos desde 0.07 (phi083) hasta 0.58
(phi065) que por el contrario indican una proporción mayor de individuos homocigotos.
Cuadro 4. Estadística descriptiva de la diversidad genética estimada en cinco morfotipos
de maíces criollos/nativos de Ocotepec, Veracruz, empleando ocho microsatélites/ SSR/
marcadores.
Microsatélite Na Ne Ho He %AMF PIC I Fis
phi96100 8 4.44 0.61 0.77 31 0.74 1.60 0.21
phi065 5 1.80 0.19 0.45 72 0.41 0.87 0.58
phi015 7 3.05 0.50 0.67 41 0.61 1.31 0.26
umc1545 8 2.53 0.42 0.60 60 0.58 1.32 0.30
phi031 5 2.86 0.69 0.65 52 0.60 1.22 -0.07
phi072 11 5.05 0.69 0.80 33 0.78 1.90 0.13
phi083 7 2.30 0.53 0.57 61 0.52 1.14 0.07
phi127 6 1.66 0.28 0.40 76 0.36 0.78 0.30
Promedio 7.13 2.65 0.49 0.61 53 0.58 1.27 0.22
Na: Número de alelos
Ne: Número de alelos efectivo
Ho: Heterocigosidad observada
He: Heterocigosidad esperada
AMF: Porcentaje del alelo más frecuente
PIC: Índice de Contenido Polimórfico
I: Índice de Shannon
Fis: coeficiente de endogamia
36
7.2.2 Diversidad genética por población
La evaluación de la diversidad genética por morfotipo (Cuadro 5) arrojó un
promedio de 4.68 alelos. El número de alelos efectivos fue similar para todas las
poblaciones (2.29-2.88) con un promedio de 2.65 alelos. El promedio para la riqueza
alélica (Rs) fue de 4.01, el valor más alto se presentó en el morfotipo blanco con 4.37,
mientras que el valor más bajo fue para el morfotipo jaspeado con 3.5. Tres de los cinco
morfotipos presentaron alelos privados. Los morfotipos blanco, amarillo y negro
presentaron 7, 5 y 4 alelos privados respectivamente. Los valores de Ho (0.42-0.50 con
un promedio de 0.49) fueron todos menores a los valores de He. Los valores de He fueron
de 0.57 a 0.61 con un promedio de 0.58. El valor promedio para el índice de diversidad
de Shannon (I) varió de 0.92 a 1.2 con un promedio de 1.10. Para el índice de endogamia
(Fis) se encontraron valores de 0.02 a 0.27 con un promedio de 0.16.
Cuadro 5. Resumen estadístico de la diversidad genética de los morfotipos de Ocotepec,
Veracruz.
Morfotipo Na Ne Rs AP Ho He I Fis
Amarillo 4.50 2.59 3.99 5 0.42 0.57 1.09 0.27
Blanco 5.75 2.88 4.37 7 0.48 0.60 1.20 0.19
Rojo 4.50 2.81 4.05 0 0.54 0.61 1.15 0.11
Jaspeado 3.50 2.29 3.50 0 0.50 0.51 0.92 0.02
Negro 5.13 2.72 4.15 4 0.50 0.60 1.16 0.15
Promedio 4.68 2.65 4.01 3.2 0.49 0.58 1.10 0.16
Na: Número de alelos
Ne: Número de alelos efectivo
Rs: Riqueza alélica
AP: Alelos privados
Ho: Heterocigocidad observada
He: Heterocigocidad esperada
I: Índice de Shannon
Fis: Índice de endogamia
37
7.3 Estructura poblacional
La prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) mostró desviaciones
significativas en todos los morfotipos de maíz. Al menos tres de los ocho microsatélites
analizados mostraron desviaciones al equilibrio HWE (Figura 9). Los morfotipos amarillo,
jaspeado y blanco fueron los más cercanos al equilibrio HWE al presentar desviaciones
en tres microsatélites, mientras que el más alejado fue el morfotipo rojo con desviaciones
en cinco microsatélites.
Figura 9. Prueba de equilibrio de Hardy Weinberg por morfotipo de maíz (eje X) y microsatélite (eje Y del
lado derecho se muestra una escala con números (del 0 al 1) y colores (de rosa a azul) la cual indica que
los microsatélites que se encuentran coloreados con rosa se encuentran fuera del equilibrio de Hardy-
Weinberg, ya que presentan un valor de p≤0.05.
38
Las comparaciones pareadas del coeficiente de diferenciación genética (Fst y Rst)
revelaron una baja diferenciación entre morfotipos, con valores de Fst <0.07 y de Rst<0.15
(Cuadro 6). Para Fst todos los valores de las comparaciones pareadas fueron
significativos, mientras que para Rst fueron poco más de la mitad. Los morfotipos más
divergentes genéticamente fueron el rojo y amarillo que presentaron los valores más altos
tanto para Fst como para Rst con valores de 0.06 y 0.146 respectivamente, mientras que
los más similares fueron los morfotipos negro y blanco de acuerdo al valor de Fst= 0.024.
Cuadro 6. Comparaciones pareadas de Fst (debajo de la diagonal) y Rst (encima de la
diagonal) entre morfotipos de maíz.
Morfotipo Amarillo Blanco Rojo Jaspeado Negro
Amarillo - 0.062** 0.146*** 0.066* 0.139***
Blanco 0.033** - 0.036* 0.007 0.026*
Rojo 0.066*** 0.029** - 0.002 -0.006
Jaspeado 0.051** 0.038* 0.054** - -0.018
Negro 0.051*** 0.024** 0.028* 0.036* -
* p ≤ 0.05., **p ≤ 0.01., ***p ≤ 0.001.
En cuanto al número de migrantes (Nm), se encontraron valores altos entre todos los
morfotipos siendo el valor promedio de 7.95 (Cuadro 7). El valor más bajo de Nm se
presentó entre los morfotipos rojo y amarillo con un valor de 3.90, mientras que el más
alto fue entre los morfotipos negro y blanco con 12.19.
39
Cuadro 7. Promedio de número de migrantes entre morfotipos (Nm)
Morfotipo Amarillo Blanco Rojo Jaspeado Negro
Amarillo -
Blanco 9.01 -
Rojo 3.9 9.96 -
Jaspeado 5.71 8.24 5.02 -
Negro 5.28 12.19 10.62 8.19 -
Se obtuvo la estructura poblacional de los maíces nativos de Ocotepec, Veracruz
con los programas STRUCTURE 2.3.4 (Figura 11), POPPR (Figura 13) y GenALex 6.5
(Figura 14).
En un primer análisis con el programa STRUCTURE, el total de individuos
analizados (138) fue agrupado en dos poblaciones (K=2; Figura 10); una conformada
únicamente por individuos de los distintos morfotipos de Ocotepec (99 de 118; Figura
10b, color rojo), y la otra compuesta por los 20 individuos del grupo externo más algunos
individuos de los morfotipos de Ocotepec (Figura 10b, color verde). Con este resultado
es díficil identificar la estructura poblacional de los morfotipos de Ocotepec, por lo tanto
se hizo un segundo análisis eliminando al grupo externo (raza Nal-Tel). Al eliminar al
grupo externo, los maíces de Ocotepec fueron agrupados en tres poblaciones o grupos
genéticos (K=3; Figura 11). Considerando los resultados del segundo análisis,
regresamos al análisis inicial (Ocotepec + Nal-Tel) y observamos la gráfica generada
cuando K=4, la cual nos indica que tres de esas poblaciones se forman con los maíces
de Ocotepec (Figura 11c, colores rojo, azul y amarillo), mientras que la cuarta población
corresponde al grupo externo, la raza Nal-Tel (Figura 11c, color verde). Al comparar los
agrupamientos de los maíces de Ocotepec en los distintos análisis (K=3 vs K=4),
observamos una gran similitud entre las gráficas, por lo que asumimos que existen cuatro
poblaciones en nuestro grupo de datos, de las cuales tres corresponden a los maíces de
40
Ocotepec (Figura 11c, colores rojo, azul y amarillo). En la figura 12 se muestran los 4
grupos genéticos según STRUCTURE y el número de individuos de cada morfotipo que
componen a cada uno de estos (Figura 12). Del total de individuos (138) treinta fueron
clasificados como mezcla por presentar proporciones de pertenencia a cualquier grupo
genético < 0.70.
Figura 10. Estructura poblacional de 118 individuos de cinco morfotipos de maíz de Ocotepec más 20
individuos de la raza Nal-Tel (GE). (a) Evaluación de los resultados arrojados por STRUCTURE, empleando
dos métodos gráficos para la detección del valor más probable de K. La línea roja representa la media del
LnP (D) obtenida de 15 corridas por cada valor de K evaluado. La línea azul representa los valores
calculados de ΔK, basados en la metodología propuesta por Evanno et al., 2005. (b) Estructura poblacional
de maíces nativos de Ocotepec y 20 individuos de la raza Nal-Tel (GE) cuando K=2. Diferentes colores
representan diferentes grupos genéticos o poblaciones. Las poblaciones de la clasificación inicial están
separadas por líneas negras verticales. Cada individuo está representado por una línea vertical delgada.
Los números en el eje Y representan la probabilidad de asignación de cada individuo a cada grupo genético
o población.
41
Figura 11. (a) Estructura poblacional de los maíces nativos de Ocotepec analizada con y sin los individuos
de la raza Nal-Tel (GE). (a) Evaluación de los resultados arrojados por STRUCTURE, empleando dos
métodos gráficos para la detección del valor más probable de K de los 118 individuos de Ocotepec. La
línea roja representa la media del LnP (D) obtenida de 15 corridas por cada valor de K evaluado. La línea
azul representa los valores calculados de ΔK, basados en la metodología propuesta por Evanno et al.,
2005. (b) Estructura poblacional de 118 individuos de Ocotepec cuando K=3. (c) Estructura poblacional de
118 individuos de Ocotepec y 20 individuos de la raza Nal-Tel (GE) cuando K=4. Diferentes colores
representan diferentes grupos genéticos o poblaciones. Las poblaciones de la clasificación inicial están
separadas por líneas negras verticales. Cada individuo está representado por una línea vertical delgada.
Los números en el eje Y representan la probabilidad de asignación de cada individuo a cada grupo genético
o población.
42
Figura 12. Composición de los grupos genéticos para K=4 al analizar los individuos de Ocotepec junto al
grupo externo. Se muestran los cuatro grupos genéticos o poblaciones según el programa STRUCTURE,
el número de individuos de cada morfotipo y porcentaje que estos representan dentro del grupo, y el número
total de individuos que conforma cada grupo genético.
El análisis de agrupamiento generado por el método del vecino más cercano y
basado en la distancia genética de Provesti, reveló un total de tres grupos con un valor
de consistencia del 100% (Figura 13). Aunque los individuos dentro de los grupos no
fueron iguales a los detectados por el programa STRUCTURE, es posible observar cierta
similitud. El grupo 1 se encuentra conformado por un total de 33 individuos, de los cuales
en su mayoría (24) corresponden a individuos asignados a la población roja por el
STRUCTURE, cuatro a la amarilla y seis son individuos mezcla. El grupo 2 lo conforman
mayormente individuos asignados a la población amarilla (21), seguido por 10 de la
población roja y 9 individuos mezcla. El grupo 3 se conformó de 64 individuos, de los
cuales 11 son de la población amarilla, dos de la población roja, 16 corresponden a la
población azul, 21 a la población verde y 14 individuos mezcla. Dentro de este último
grupo observamos a todos los individuos asignados a la población azul en el
STRUCTURE. Los individuos del grupo externo (grupo verde) se ubicaron dentro del
grupo 3, formando una subdivisión dentro del mismo, donde se puede observar a su vez
una separación de acuerdo al color, blancos en la parte superior y amarillos en la parte
inferior.
43
Figura 13. Dendrograma creado por el método del vecino más cercano (Neighbour-joining) basado en la
distancia genética de Provesti de 118 individuos de distintos morfotipos de maíz, nativos de Ocotepec,
Veracruz y 20 individuos de la raza Nal-Tel de Campeche. Los colores de las ramas (rojo, azul, verde y
amarillo) representan la población a la que fueron asignados los individuos en el análisis en STRUCTURE.
Las ramas en color negro representan los individuos considerados como mezcla en el análisis en
STRUCTURE, cuyo porcentaje de pertenencia fue menor a 70%. Del lado derecho de cada rama se
encuentra el nombre de cada individuo, donde la primera letra indica el morfotipo o color de los individuos,
y la segunda C=Chato, B=Bola y P=Puntiagudo, por la forma del grano del maíz. Solamente para los
individuos de la raza Nal-Tel la segunda letra significa el lugar de procedencia (Y=Campeche).Se utilizó la
letra Y para no confundir a los individuos del grupo externo con los de la población de Ocotepec.
44
El análisis de Coordenadas Principales (PCoA) no mostró agrupamientos bien
definidos; sin embargo, se pudo observar una tendencia de agrupamiento similar a la
encontrada por el programa STRUCTURE (Figura 14). La mayor parte de los individuos
asignados a las diferentes poblaciones (roja, amarilla, azul y verde) por el programa
STRUCTURE se mantienen cercanos. En la figura 14 se observa que los individuos de
las poblaciones roja y amarilla se encuentran muy cercanos y sobrelapan, al igual que
las poblaciones verde y azul.
Figura 14. Gráfico del análisis de Coordenadas Principales (PCoA), de los maíces de Ocotepec y la raza
Nal-Tel (grupo externo). El gráfico muestra las dos coordenadas que mejor explican la variabilidad en la
estructura poblacional. Los círculos rojo, azul, verde y amarillo hacen referencia a las poblaciones
detectadas por el programa STRUCTURE.
El AMOVA realizado a los 3 grupos detectados para los morfotipos de Ocotepec
por el programa STRUCTURE reveló que la mayor variación de la diversidad genética se
encuentra dentro de los individuos, siendo para Rst de 82.47%, mientras que para Fst fue
de 76.35% (Figura 15). El porcentaje más bajo de variación para Rst se encontró entre
poblaciones con 2.48, mientras que para Fst se encontró entre individuos dentro de las
poblaciones con 10.56%.
45
Figura 15. AMOVA de 3 los grupos detectados por STRUCTUE en los maíces de Ocotepec. Se muestra
el porcentaje que aportan las diferencias entre y dentro de los individuos y poblaciones a la variación de la
diversidad genética total.
7.4 Periodo de floración de los maíces
El primer morfotipo de maíz en presentar el periodo de floración fue el rojo (parcela
9), para el día 29 de junio ya se encontraba con más del 50 % de individuos con espiga;
para ese mismo día los morfotipos amarillo, blanco y negro en algunas parcelas no tenían
plantas con espiga, mientras que otras se encontraban entre <10 y 30 % de plantas con
espigas (Cuadro 7). Dos días después (10 de julio) se observó más del 50% de las plantas
floreadas y se consideró que entraron en periodo de floración los otros morfotipos (blanco,
amarillo y negro) en el resto de las parcelas (datos no mostrados). En estas parcelas no
se sembraron maíces jaspeados por lo que este parámetro no fue evaluado para este
morfotipo.
46
Cuadro 8. Registro de floración masculina en plantas de maíz al día 29 de junio del 2016.
Datos tomados por la Dra. Simoneta Negrete Yankelevich.
Parcela Morfotipo No. de plantas
con espiga
Porcentaje
aproximado
1 Amarillo 3 <10
2 Amarillo 0 0
3 Amarillo 5 <10
4 Blanco 0 0
5 Blanco 2 <10
6 Blanco 35 30
7 Rojo 5 <20
8 Rojo 0 0
9 Rojo 60 >50
10 Negro 5 <10
11 Negro 3 <10
12 Negro 8 <10
7.5 Caracterización morfológica de los maíces nativos de Ocotepec Veracruz
Se llevó a cabo la caracterización de un total de 14 mazorcas de los morfotipos
negro, blanco, amarillo y rojo (Cuadro 8). En general las mazorcas analizadas
presentaron mayormente forma cónica cilíndrica, con disposición de hileras regular e
irregular, olote blanco y tipo de grano dentado. El resto de características para mazorca
y grano variaron dentro y entre morfotipos. Los resultados obtenidos de la caracterización
fueron comparados con la base de datos de las razas de maíz de CONABIO
(http://www.biodiversidad.gob.mx/usos/maices/razas2012.html), encontrándose mayor
cercanía con el grupo de maíces cónicos cuya distribución abarca parte del pueblo de
Ocotepec.
47
Cuadro 9. Caracterización morfológica de las mazorcas.
Mazorca Granos
ID Mazorca PM FM DH LM AM NF GF LO AO CO CG L G A peso de 100 granos TG
Negra 1 110.85 2 2 9 4.74 16 20 8.5 1.95 Blanco Azul obscuro 14.59 4.07 7.12 33.68 SD
Negra 2 144.75 2 2 11.5 4.93 16 22 9.5 1.73 Blanco Azul obscuro 15.38 4.17 7.22 37.48 SD
Negra 3 249.65 2 4 16.5 5.22 14 29 15.5 2.41 Blanco Azul obscuro 16.15 5.53 9.1 63.18 SD
Blanca 1 177.35 2 1 13 5.05 16 27 13 2.16 Blanco Blanco cremoso 14.51 5.02 7.34 41.96 D
Blanca 2 239.57 2 2 15.5 5.16 18 31 14.5 2.33 Blanco Blanco cremoso 14.64 5.13 7.07 44.18 D
Blanca 3 256.97 1 4 18.5 4.81 14 39 18 2.66 Blanco Blanco cremoso 14.88 4.67 8.51 46.18 D
Amarilla 1 87.9 2 2 10.5 4.1 20 18 10.5 2.07 Blanco Amarillo claro 10.49 4.45 5.95 23.38 D
Amarilla 2 140.3 2 1 12 4.75 19 22 11.5 2.39 Blanco Amarillo claro 13.86 4.51 7.15 35.50 D
Amarilla 3 141.9 1 1 13 4.36 12 26 12.8 1.7 Blanco Amarillo claro 14.19 4.40 8.50 45.14 D
Amarilla 4 184.06 1 2 15.5 4.87 15 27 14.5 1.91 Blanco Amarillo claro 14.13 5.87 8.37 52.40 D
Roja 1 191.28 1 1 15.5 4.54 12 30 15 2.12 Rosado Amarillo naranja 13.25 4.44 8.25 43.56 D
Roja 2 207.11 1 1 16 4.57 12 32 15.5 1.92 Rosado Amarillo naranja 14.28 4.70 9.12 51.26 D
Roja 3 258.79 2 1 16.5 5.1 16 31 16 2.34 Rosado Amarillo naranja 15.87 5.03 7.74 48.92 D
Roja 4 245.04 2 4 18 5.18 14 38 17.5 2.44 Rosado Amarillo naranja 14.33 4.89 8.59 47.30 D
PM= Peso de la mazorca en gramos
FM= Forma de la mazorca: 1= Cónica 2= Cónica cilíndrica 3= Cilíndrica
DH= Disposición de hileras: 1=Regular 2=Irregular 3= Recta 4= Espiral
LM= Largo de la mazorca en centímetros
AM= Ancho de la mazorca en centímetros
NF= Número de filas de la mazorca
GF= Granos por fila
LO= Largo del olote en centímetros
AO= Ancho del olote en centímetros
CO= Color del olote
CG= Color del grano
L= Largo del grano en milímetros
G= Grosor del grano en milímetros
A= Ancho del grano en milímetros
Peso de 100 granos reportado en gramos
TG= Tipo de grano: D= Dentado SD=Semi-dentado
48
DISCUSIÓN
En este trabajo se describe la diversidad y estructura genética de cinco morfotipos
de maíz de Ocotepec, Veracruz, utilizando marcadores moleculares microsatélites. Los
microsatélites utilizados en este trabajo fueron polimórficos en todos los morfotipos y
altamente informativos según la clasificación de Liu et al., (2012). El valor promedio
obtenido para el índice de contenido polimórfico (PIC) fue de 0.58. Seis microsatélites
presentaron valores de PIC alto (>0.5) y dos moderado (0.25-0.5), estos últimos fueron
el phi127 y phi065 cuyos valores de PIC fueron de 0.36 y 0.41 respectivamente. El PIC
de un marcador oscila entre 0 y 1, donde 1 indica el mayor nivel de polimorfismo. El
cálculo del PIC toma en cuenta el número de alelos y la frecuencia relativa de estos, de
tal manera que cuando uno o dos alelos mantienen valores altos en sus frecuencias el
valor de PIC es bajo (González-Castro 2012; Da Silva et al., 2015). Esto fue observado
para los dos microsatélites anteriormente mencionados (phi127 y phi065), los cuales
presentaron un alto porcentaje para el alelo más frecuente (76 y 72%) y el menor número
de alelos (6 y 5 alelos) de los ocho microsatélites analizados (Cuadro 4). Por el contrario,
los microsatélites phi96100 y phi072 presentaron un mayor número de alelos (8 y 11
respectivamente) y un menor porcentaje para el alelo más frecuente (31 y 33%),
obtuvieron los valores más altos de PIC con 0.74 y 0.78 respectivamente. El número de
alelos y el valor de PIC de los microsatélites fueron dos de las principales características
por las cuales estos fueron seleccionados para este estudio. El número de alelos
detectados en cada microsatélite fue similar a lo reportado previamente en otras
poblaciones de maíz (4-26 alelos), mientras que los valores del PIC se mantuvieron altos,
confirmando el alto nivel de informatividad previamente reportado (0.51-0.86), por lo cual
estos marcadores podrían ser considerados para futuros estudios en otras poblaciones
de maíz y quizá en monitoreo de programas de mejoramiento (Smith et al., 1997; Senior
et al., 1998; Register et al., 2001; Sharma et al., 2010; Shiri 2011; Pineda-Hidalgo et al.,
2013; Wasala y Prasana 2013; Da Silva et al., 2015).
49
La información generada por los microsatélites analizados fue suficiente para
explicar la diversidad genética de la población, como lo demuestra la curva de
acumulación de genotipos (Figura 8). Este análisis permite determinar si el número de
marcadores utilizados para evaluar la diversidad de la población es adecuado,
asegurándonos que al agregar más marcadores, la diversidad observada no aumentará
significativamente. El criterio para validar el número de marcadores es observar al menos
el 90% de los MLG y conseguir o acercarse a un “plateau” en la curva (Kambar et al.,
2015). En nuestro trabajo pudimos observar que con el uso de cuatro marcadores se
encontró el 90% de los MLG, mientras que con siete conseguimos el 100%. Este mismo
resultado lo pudimos observar al crear una curva de acumulación de genotipos
aumentando el número de marcadores a 12, agregando los cuatro microsatélites
descartados por el análisis de datos faltantes (datos no mostrados). Con esto
reafirmamos la capacidad de los microsatélites seleccionados para estimar la diversidad
genética de los maíces nativos de Ocotepec.
En total, en este trabajo fueron detectados 57 alelos distintos (Cuadro 4) y una
riqueza alélica (Rs) de 4.01 (Cuadro 5) en los 118 individuos pertenecientes a los cinco
morfotipos de Ocotepec. Estudios en otras poblaciones de maíz al emplear grupos de 9
a 42 microsatélites y evaluando un mayor número de morfotipos, razas, accesiones y/o
colectas, han reportado entre 65 y 550 alelos (Pressoir y Berthaud 2004; Dubreil et al.,
2006; Reif et al., 2006; Bracco et al., 2009; Lia et al., 2009; Sharma et al., 2010; Gonzales-
Castro et al., 2013; Pineda-Hidalgo et al., 2013; Wasala y Prasanna 2013). Estas
diferencias hacen difícil comparar directamente los resultados de nuestro trabajo con el
de otras poblaciones, ya que el número de alelos depende del tipo de marcador, tamaño
de muestra y accesiones. Las diferencias entre trabajos incrementan especialmente
cuando se utilizan mayormente marcadores de carácter dinucleótido, estos tienen una
alta tasa de mutación, por lo que generalmente presentan un mayor grado de
polimorfismo (González-Castro 2012). Bracco et al., (2009) estudiaron la diversidad
genética de seis poblaciones de maíz nativos de Argentina utilizando un grupo de nueve
microsatélites y encontraron un total de 65 alelos con un promedio de 4.78 alelos por
locus, una He promedio de 0.37 y una Rs promedio de 2.94. Wasala y Prasana (2013)
50
encontraron un total de 550 alelos y un promedio de 0.63 y 2.41 para He y Rs,
respectivamente, utilizando 42 microsatélites en 48 accesiones de maíz de la India. Lia
et al., (2009) reportaron un total de 184 alelos y un promedio de He de 0.57 al evaluar
seis razas de maíces nativos del Noroeste de Argentina utilizando 18 microsatélites. A
pesar de la diferencia en el número de alelos encontrados en este trabajo comparados
con los reportados por Bracco et al., (2009), Lia et al., (2009) y Wasala y Prasanna (2013),
los valores de diversidad genética (He) son muy similares, mientras que los valores de
riqueza alélica (Rs) son más altos para los maíces nativos de Ocotepec. Por otra parte el
valor promedio de diversidad genética de la población encontrado en este trabajo
(He=0.58) fue mayor al promedio reportado por Dubreiul et al., (2006) para poblaciones
de Europa (He=0.32) y de Estados Unidos (He=0.35), y similar al valor encontrado por
Reif et al., (2006) para razas de maíz mexicano (HT=0.61). Estos resultados concuerdan
con los reportados por Dubreiul et al., (2006), Vigouroux et al., (2008) y Bedoya et al.,
(2017), donde se ha observado que los maíces que presentan los mayores valores de
diversidad genética son los que se encuentran en México, mientras que los menos
diversos son los que provienen de lugares donde el maíz ha sido introducido más
recientemente. Esto ha sido atribuido a que probablemente durante la expansión del maíz
por el mundo se perdió diversidad genética como resultado del efecto fundador, y por
cuellos de botella generados por la adaptación a nuevos climas y suelos (Vigouroux et
al., 2008). El efecto fundador ocurre cuando una nueva población es comenzada por
pocos miembros de la población original, mientras que el cuello de botella ocurre cuando
el tamaño de una población se reduce por al menos una generación; esta reducción,
permite actuar más rápido a la deriva génica, provocando una disminución de la
diversidad genética en la población. El cuello de botella puede ocurrir también cuando en
una población existe un número muy bajo de individuos genéticamente distintos, lo cual
provoca una marcada disminución en la diversidad genética (UE).
Algunos de los factores que afectan la diversidad genética de los cultivos a lo largo
del tiempo son el proceso de siembra, el manejo, la cosecha y la selección de semillas
por parte de los agricultores (Cömertpay et al., 2012). La moderada diversidad genética
detectada en los maíces de Ocotepec se puede deber a dos fenómenos ligados entre sí;
51
la selección de semilla y los cuellos de botella generados por la práctica anterior (Dyer y
Taylor 2007; Cömertpay et al., 2012). Cada año las productoras hacen una selección de
semilla que será sembrada en el siguiente ciclo de cultivo. Dicha semilla no representa la
diversidad genética de la población inicial, por lo que se corre el riesgo de
sobrerepresentar los alelos frecuentes y subrepresentar o descartar los alelos raros, lo
que se traduce en un cuello de botella. Por otra parte, la siembra de los morfotipos se
realiza de manera simultánea y la polinización no es controlada, por lo que hay migración
de genes hacia todos los morfotipos.
Los morfotipos más diversos en este estudio fueron el Blanco y el Negro, los cuales
presentaron los valores más altos de Na, I, He y Rs con respecto a los morfotipos rojo,
amarillo y jaspeado. La Rs nos permitió comparar la diversidad entre los distintos
morfotipos de maíz, descartando la influencia del tamaño de muestra, puesto que el
cálculo de Rs toma en cuenta esta variación y realiza una estandarización de acuerdo a
la muestra más pequeña (Norton y Ashley 2004). De acuerdo a una encuesta realizada
en la comunidad (datos no mostrados), los morfotipos blanco y negro son los que se
siembran en mayor superficie por desarrollarse mejor en la mayoría de los terrenos, lo
que permite una mayor recombinación en estos morfotipos, incrementando así el número
de nuevos genotipos. Por otro lado, los morfotipos rojo y amarillo, que presentaron los
niveles más bajos de diversidad, se siembran en extensiones de tierra más pequeñas e
incluso algunas productoras han dejado de sembrarlos reduciendo así la generación de
nuevos genotipos. La escasa siembra de estos morfotipos aunado a la selección de
semilla que realizan las productoras puede estar contribuyendo a la pérdida de
diversidad.
Todos los morfotipos y loci de microsatélites analizados mostraron desviaciones
significativas del equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE), con un valor promedio del índice
de endogamia (Fis) de 0.16. Los microsatélites phi065 y umc1545 presentaron los valores
más altos de Fis con 0.58 y 0.30, respectivamente, y fueron los únicos que presentaron
desvíos significativos de HWE en todos los morfotipos. Valores positivos de Fis indica la
existencia de una mayor proporción de individuos homocigotos dentro de la población
52
debido al apareamiento entre individuos estrechamente relacionados o apareamiento
endogámico (Mohammadi y Prasanna, 2003; Pressoir y Berthaud 2004). El maíz es una
planta que presenta reproducción mixta (Allard, 1999), lo que significa que se puede
autofecundar, y por lo tanto, presentar cierto nivel de endogamia. Se ha observado que
un 90% de la descendencia de una planta de maíz proviene de reproducción por
cruzamiento, mientras que un 10% proviene de la autopolinización (Allard, 1999). Sin
embargo, algunos estudios sugieren que la autofecundación no contribuye
significativamente a la endogamia en poblaciones de polinización abierta, sino más bien
al emparejamiento selectivo, es decir, el apareamiento entre individuos relacionados con
alelos idénticos (Kahler et al., 1989). Este emparejamiento selectivo está influenciado por
la selección de semillas hecha por los agricultores de Ocotepec, la distribución espacial
de los morfotipos de maíz dentro y entre las parcelas, la convergencia en el período de
floración y la compatibilidad cruzada de los diferentes morfotipos (Pressoir y Berthaud,
2004). La selección de las semillas se realiza se realiza año con año a partir de un número
reducido de mazorcas que de acuerdo al criterio de las productoras son las mazorcas
donde hubo mejor llenado de grano, las semillas utilizadas para la siembra son las
correspondientes a la parte media de la mazorca, las semillas de la parte inferior y
superior son descartadas para este fin (Ruíz-Morales, comunicación personal). Esta
selección propicia a que se esté reduciendo la diversidad genética de los morfotipos, y
también contribuye a que la población se encuentre fuera de equilibrio de HWE con
índices significativos de endogamia, pues como se mencionó anteriormente, esta
selección no es representativa de la diversidad genética inicial de las poblaciones.
Desvíos significativos de HWE han sido encontrados en otras poblaciones de maíz
nativas al ser evaluadas con microsatélites (Pressoir y Berthaud 2004; Reif et al., 2006;
Lia et al., 2009; Pineda-Hidalgo et al., 2013). De acuerdo a los resultados encontrados
en este trabajo, además del apareamiento endogámico sugerido por los valores de Fis
encontrados y la selección llevada a cabo por las productoras, otro factor que podría estar
afectando al equilibrio de Hardy-Weinberg es el alto flujo genético entre los morfotipos, el
cual es sugerido por el número de migrantes promedio (Nm=7.9) encontrado entre
morfotipos.
53
Se detectaron alelos privados en tres de los cinco morfotipos analizados, con un
promedio de 3.2 alelos. Sin embargo, la frecuencia de éstos es muy baja en los distintitos
morfotipos, con una media de 0.052 (datos no mostrados). Es posible que no se hayan
encontrado alelos privados en los morfotipos Jaspeado y Rojo por el alto flujo genético
que existe entre los morfotipos, esto es, el flujo genético podría haber permitido que alelos
que en algún momento se encontraban solo en los estos morfotipos ahora se encuentren
en los demás. Por otra parte, la baja frecuencia detectados en los alelos privados
encontrados en los morfotipos Blanco, Negro y Amarillo pudiera estar relacionada a la
selección realizada por las productoras, pues como se mencionó anteriormente esta no
es representativa de la diversidad genética, por lo que cada ciclo es más probable que
los alelos más frecuentes continúen en población, mientras que los más raros, como los
alelos privados vayan desapareciendo.
A pesar de la presencia de alelos privados, la diferencia entre morfotipos es muy
baja, lo cual se debe a la falta de representatividad de los alelos privados entre los
individuos de los morfotipos de maíz, como se explicará más adelante. En otras
poblaciones, la alta presencia de alelos privados bien representados en las poblaciones,
han contribuido a detectar diferenciación genética entre razas de maíz de una región
(Bracco et al., 2009). Es probable
La estructura genética de una población es el resultado de la interacción de
diversos mecanismos como la mutación, migración, selección y deriva génica, los cuales
operan de manera azarosa a lo largo de la historia de vida de las especies (Loveless y
Hamrick, 1984). A pesar de la diferencia clara en el color de los maíces de Ocotepec, las
comparaciones pareadas de Fst y Rst revelaron valores bajos de diferenciación genética
entre los morfotipos (≤ 0.06 y <0.15 respectivamente), los cuales fueron todos
estadísticamente significativos para Fst y en su mayoría para Rst (Cuadro 6). Los
morfotipos blanco y el negro mostraron menor diferencia genética, con un valor de Fst =
0.02, mientras que los más divergentes fueron el rojo y el amarillo con Fst = 0.06 y
Rst=0.146. El flujo genético estimado según el número de migrantes fue alto según los
criterios de Eguiarte et al., (2010), quienes menciona que valores de Nm > 4 son
54
considerados altos y previenen la diferenciación local. El numero promedio de migrantes
encontrado fue de 7.95 (Cuadro 6) para los morfotipos, presentándose los valores más
altos entre los morfotipos blanco y negro (Nm= 12.191) y los más bajos entre los
morfotipos amarillo y rojo (Nm= 3.904). Los niveles de flujo genético concuerdan con la
frecuencia y extensión sembrada de cada uno de los morfotipos. Los morfotipos blanco
y negro son sembrados en mayor extensión por lo que es de esperarse que exista un
mayor intercambio de material genético entre ellos que con los otros morfotipos,
reduciendo así su diferenciación. Además, pudimos observar que los morfotipos
mantienen la sincronía en el periodo de floración y son compatibles entre ellos, lo que
junto con la cercanía entre parcelas, ha facilitado el intercambio genético en los
morfotipos más representados. Generalmente las plantas con reproducción sexual por
cruzamiento, que en maíz es la principal forma de reproducción, mantienen valores bajos
de diferenciación genética entre poblaciones, gracias a que este sistema permite el
intercambio genético entre individuos genéticamente menos relacionados (Ballesteros-
Mejia et al., 2016). Por otra parte la dispersión de semillas y polen de maíz ha sido
reportado como un mecanismo que permite el intercambio de material genético a larga
distancia entre poblaciones de maíz. La dispersión de semillas ayuda al intercambio
genético aun cuando las poblaciones se encuentran a kilómetros de distancia, y esta
ocurre gracias al intercambio de semillas entre pueblos (Loveless y Hamrick 1984;
Karasawa 2016). En algunas comunidades indígenas de México es común el intercambio
de semillas, el cual permite el flujo genético entre poblaciones distantes (Pressoir y
Berthaud 2004) y contribuye al mantenimiento de la diversidad genética en las
poblaciones locales de maíz (Dyer y Taylor, 2008). Sin embargo, esta práctica no es
común entre las productoras de Ocotepec y suele hacerse solo si hay escasez de semilla
para la siembra (Ruíz-Morales, comunicación personal).
Para marcadores moleculares tipo microsatélites se ha encontrado una relación
significativa entre los valores de Fst y el modo de polinización, sistema de apareamiento
y el hábitat en diferentes poblaciones de plantas de la región Neotropical. Las plantas que
son polinizadas por insectos del orden lepidóptera, que presentan un sistema de
reproducción mixto y que habitan en manglares, campos rocosos y sabanas rocosas
55
presentan valores de Fst mayores que aquellas plantas que son polinizadas por
murciélagos, aves y otros insectos y que su sistema es por cruzamiento (Ballesteros-
Mejia et al., 2016).
Los resultados de los distintos análisis llevados a cabo para inferir la estructura de
la población fueron consistentes en cuanto a que la población se encuentra divida en tres
grupos genéticos y/o poblaciones, independientes del color del maíz. A pesar de que se
pudieron detectar alelos privados en tres de los cinco morfotipos analizados (Amarillo,
Blanco y Negro), la frecuencia promedio de estos alelos fue de 0.052, lo que significa que
de todos los individuos dentro de cada morfotipo ese alelo solo se presenta en 3
individuos en promedio, y por ello no es suficiente para que estos morfotipos que
presentan alelos privados formen cada uno un grupo genético.
En el agrupamiento bayesiano del programa STRUCTURE observamos que los
resultados iniciales al evaluar la población de maíces de Ocotepec junto al control
sugerían la división de los individuos en dos poblaciones (K=2) de acuerdo a la región de
procedencia: Ocotepec y Campeche. Esto puede deberse a que el programa está
diseñado para detectar el nivel más alto de estructura genética (Lia et al., 2009). Por lo
anterior, se exploró la posibilidad de detectar subestructura realizando el análisis solo con
los individuos pertenecientes a los cinco morfotipos de Ocotepec y se detectaron 3 grupos
genéticos y/o poblaciones.
En otras poblaciones de maíz evaluadas con microsatélites (Vigouroux et al., 2008;
González-Castro, 2012; Bedoya et al., 2017) y SNPs (Wu et al., 2016) se ha observado
agrupamiento de acuerdo a la distribución geográfica y altitud. Vigouroux et al., (2008)
encontraron que existe una correlación baja entre las razas de maíz y la distancia
genética al evaluar razas representativas de América. Sus resultados muestran mayor
correlación entre la distribución geográfica y la distancia genética, lo cual sugiere que
existe un fuerte componente geográfico en la organización de la diversidad genética a
escala continental. Por otra parte, un estudio reciente realizado por Caldu-Primo et al.,
(2017) en 5 razas de maíz sugiere el uso de un grupo de 34 SNPs 34 informativos para
56
altitud y raza de maíz (14 y 20 SNPs, respectivamente) para realizar el análisis de la
diversidad fenotípica del maíz mexicano a partir de las razas. Los morfotipos de maíz de
Ocotepec pertenecen a una misma región, no existe ningún tipo de aislamiento de los
mencionados anteriormente, entonces los morfotipos se cruzan indistintamente entre si
y por lo tanto no hay diferencia genética entre estos. En los resultados de estructura
poblacional se puede observar que los tres grupos genéticos encontrados en los distintos
análisis se conforman por individuos que pertenecen a los cinco morfotipos de maíz de
la comunidad.
Actualmente la diversidad genética que mantienen los maíces de Ocotepec es
moderada comparada con la encontrada en otras poblaciones de maíz nativo en México
(Pressoir y Berthaud 2004; Reif et al., 2006; Vigouroux et al., 2008; Pineda-Hidalgo et al.,
2013;). Sin embargo, pensamos que es probable que esta diversidad podría ir en
disminución, esto de acuerdo a los resultados de estructura genética, flujo genético, los
valores de Fis y el promedio alto del porcentaje de los alelos frecuentes (53%)
encontrados, además de las prácticas de manejo realizadas en la comunidad. Los
resultados del análisis de diferenciación genética junto a los del AMOVA nos sugieren
que la diversidad genética es alta dentro de los individuos más no entre morfotipos, esto
quiere decir que no existen diferencias genéticas entre morfotipos. Po ello, al ser los
morfotipos genéticamente iguales es poco probable que ingresen nuevos alelos y que la
diversidad genética aumente.
La diversidad genética les permite a los individuos adaptarse a condiciones
heterogéneas y cambiantes en su entorno, por ejemplo, resistir a plagas y enfermedades
(Hellin, et al., 2010). La pérdida de diversidad genética de los morfotipos de maíces de
Ocotepec los volvería vulnerables ante cualquier situación de este tipo, y en el caso más
extremo estos materiales podrían desaparecer, y con ello una de las principales fuentes
de alimento para las personas de la comunidad. En este sentido, es una prioridad que los
morfotipos de maíz que son cultivados en la comunidad de Ocotepec, no solo se
conserven, sino que aumenten su diversidad genética, para de esta manera garantizar la
seguridad alimentaria de la población. Una estrategia que podría ayudar a conservar la
57
diversidad genética de la población de maíces nativos de Ocotepec sería la introducción
de nuevo germoplasma, lo cual pudiera realizarse mediante una técnica conocida como
retrocruza limitada. Esta técnica consiste en la cruza del material local con un material
exógeno con características deseables, ya sea criollo o híbrido. La nueva generación
producida (F1) se vuelve a cruzar con el material local (retrocruza) y de la generación
producida (F2) se hace una selección en base a las características de interés para los
productores (Sahagún-Castellanos et al., 2008). Esta técnica ha sido utilizada para llevar
a cabo el mejoramiento de poblaciones nativas de maíz en México, así como para
mantener la diversidad genética de las mismas (Cervantez et al., 2014). En Cuzalapa,
Jalisco, ha sido ampliamente estudiado el sistema de intercambio de semillas y se ha
demostrado que la introducción de maíz foráneo en un sistema local puede ayudar a
conservar la diversidad de las variedades nativas, siempre y cuando el manejo de las
variedades introducidas sea apropiado. Aquí los agricultores inician sembrando
aproximadamente un 5% del total de la superficie con el maíz foráneo, esto para medir
su desempeño en la región. La siembra del maíz foráneo no se hace aislada, sino en
conjunto con el resto de los maíces locales, lo cual permite que estos se puedan mezclar.
Esta práctica permite un sistema dinámico donde la diversidad del cultivo está en
constante evolución (Brush, 1999, Dyer y Taylor, 2008).
Por otra parte las productoras podrían realizar una selección más específica de los
materiales que utilizaran para sembrar, esto con el fin de además de conservar la
diversidad lograr al mismo tiempo una mejora tradicional del maíz local. Esto,
seleccionando las mejores plantas a partir del monitoreo basado en sus aspectos
fisiológicos, como altura, número de mazorcas, grosor del tallo, su salud, entre otros
aspectos (Herrera-Cabrera et al., 2002). Estas prácticas deben complementarse con la
conservación ex situ de semillas representativas de todos los morfotipos de la comunidad,
para proteger parte de la diversidad genética contra cualquier desastre que pueda afectar
a la población de cultivos en pie.
58
CONCLUSIONES
Los ocho marcadores microsatélites seleccionados del grupo inicial de 21,
mostraron ser polimórficos y presentaron valores altos de informatividad, con suficiente
capacidad para explicar la diversidad genética de los maíces nativos de Ocotepec,
Veracruz.
La diversidad genética revelada en la población fue alta entre individuos, más no
entre morfotipos, es decir, no existen diferencias genéticas entre los morfotipos de maíz
estudiados. Los morfotipos blanco y negro fueron los más diversos de la comunidad, muy
probablemente porque las productoras han sembrado en menor cantidad los morfotipos
amarillo, rojo y jaspeado. Sin embargo, estos últimos mantienen valores intermedios de
diversidad, no muy inferiores a los de los otros morfotipos.
Los maíces de Ocotepec, Veracruz se encuentran estructurados en tres grupos
genéticos, de acuerdo a los resultados obtenidos de los distintos análisis. Estos se
encuentran conformados por individuos de todos los morfotipos, con distintos porcentajes
de pertenencia a dichos grupos. Estos resultados rechazan nuestra hipótesis inicial la
cual proponía que cada morfotipo correspondería a una población bien diferenciada entre
los maíces analizados (cinco grupos genéticos).
Se sugiere que la forma en que se cultivan los maíces (sistemas de milpas), la
sincronía en el periodo de floración entre los morfotipos, el hecho de ser una especie de
polinización abierta, el alto flujo genético entre morfotipos, así como la selección que ha
sido llevada a cabo por las productoras a lo largo de los años son las causas principales
de la actual diversidad y estructura genética que presentan los maíces nativos de
Ocotepec, Veracruz. Los resultados sugieren que de continuar con las mismas prácticas
que se han llevado hasta la fecha es muy probable que las poblaciones continúen
aumentando su endogamia. Esto significaría una reducción de la diversidad genética y
muy probablemente tendría un impacto negativo para los maíces de la comunidad. Por
59
ello es necesario realizar prácticas que promuevan la conservación y al mismo tiempo
ayuden a aumentar la diversidad genética de los maíces nativos de la comunidad.
60
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