anÁlisis molecular, electrofisiolÓgico y comportamental de
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Laboratorio de Neurofisiología y Comportamiento
Facultad de Medicina de Ciudad Real
Dpto. Ciencias Médicas
ANÁLISIS MOLECULAR, ELECTROFISIOLÓGICO
Y COMPORTAMENTAL DE LOS EFECTOS DEL
PÉPTIDO β-AMILOIDE EN EL HIPOCAMPO DE
ROEDORES
Memoria presentada para optar al grado de Doctor por
Dña. Jennifer Mayordomo Cava
Tesis Doctoral dirigida por:
Dr. Lydia Jiménez Díaz y Dr. Juan de Dios Navarro López
2015
Dña. Lydia Jiménez Díaz, Profesora Contratada Doctor, y D. Juan de
Dios Navarro López, Profesor Contratado Doctor, en el área de
Fisiología de la Facultad de Medicina de Ciudad Real de la
Universidad de Castilla La-Mancha.
CERTIFICAN:
Que el presente trabajo titulado “Análisis molecular,
electrofisiológico y comportamental de los efectos del péptido
β-amiloide en el hipocampo de roedores” ha sido realizado bajo su
dirección por Dña. Jennifer Mayordomo Cava, en el Laboratorio de
Neurofisiología y Comportamiento de la Facultad de Medicina de
Ciudad Real de la Universidad de Castilla-La Mancha, y consideran
que reúne las condiciones de calidad y rigor científico para ser
presentado y defendido como tesis doctoral.
Ciudad Real, 25 de Noviembre de 2015.
Fdo:
Dr. Lydia Jiménez Díaz Dr. Juan de Dios Navarro López
“Un científico en su laboratorio no es un simple técnico. También es un niño frente a los fenómenos naturales que lo
impresionan como si fueran cuentos de hadas”. M. Curie
“si a la larga no consigues explicar a la gente lo que has estado haciendo, el esfuerzo habrá sido inútil”.
E. Schrödinger
A tod@s
los que me rodean
por cuidarme
mimarme,
enseñarme.
Ya sea de forma consciente o
inconsciente,
a una distancia de
unos pocos metros,
o de nueve mil kilómetros.
Muy En Especial, A Mi Familia.
RESUMEN
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad
neurodegenerativa, crónica y progresiva de la cual se estima que en 2050
habrá cerca de 115.4 millones de casos. Debido al grado de envejecimiento
de la población, y dado que es una demencia incapacitante, representa un
problema epidemiológico a escala mundial. Una de las hipótesis que intenta
explicar la fisiopatología de la EA es la presencia del péptido beta-amiloide,
Aβ, en áreas concretas del sistema nervioso central como el hipocampo.
Actualmente no existe consenso en cuanto a cómo el Aβ altera la fisiología
de neuronas, sinapsis, redes y sistemas del cerebro, ni de cómo se genera el
estado de disfunción. En esta línea se postula que la alteración de la
actividad de sistemas de neurotransmisión excitatoria e inhibitoria
promueve estados de hiperexcitabilidad de poblaciones y redes neuronales
afectando a la actividad sincrónica de éstas, dando lugar a la aparición de
déficits cognitivos de memoria asociados a la EA. Los modelos
experimentales han ayudado a identificar varias moléculas y dianas
implicadas en el proceso patogénico. En particular, recientemente se han
identificado dos canales de potasio, K+, que controlan la excitabilidad
neuronal, los canales de potasio rectificadores de corriente de entrada
acoplados a proteína G, GirK, y los canales de K+ dependientes de voltaje,
KCNQ.
El trabajo presentado en esta tesis doctoral se ha centrado en el estudio
de los efectos de Aβ25-35 en el hipocampo. Este es el primer estudio en el
cual se aportan evidencias a nivel molecular, electrofisiológico y
comportamental sobre los posibles mecanismos por los cuales Aβ podría
generar un estado de disfunción sináptica a través de los canales GirK. Los
canales GirK son canales de K+ regulados por la unión de proteínas G,
implicados en el control de la excitabilidad neuronal por regulación del
potencial de membrana en reposo y generación de corrientes postsinápticas
inhibitorias. Aβ, a través de distintos mecanismos y/o cascadas de
señalización intracelular, modularía la actividad de los canales GirK
afectando a la excitabilidad de los circuitos del hipocampo y la integración
de la información sináptica. Estas alteraciones, prolongadas en el tiempo,
podrían generar un desbalance entre los sistemas excitatorios e inhibitorios,
dando lugar al estado de disfunción sináptica que puede estar
desencadenando los déficits de memoria característicos de etapas
tempranas de la EA.
Palabras clave:
Etapas tempranas de la enfermedad de Alzheimer; Aβ25-35; GirK;
tertiapina-Q; rodaja de hipocampo; qPCR; excitabilidad neuronal; EEG;
LTP in vivo; Ritmo theta; Ritmo gamma; memoria de reconocimiento;
habituación en campo abierto; reconocimiento de objetos.
I. ÍNDICE RESUMEN ............................................................................. 11
I. ÍNDICE ....................................................................... 13
II. LISTA DE ABREVIATURAS ..........................................17
III. ÍNDICE DE TABLAS .................................................... 18
IV. ÍNDICE DE FIGURAS .................................................. 19
1. INTRODUCCIÓN ......................................................... 21
1.1 Enfermedad de Alzheimer .................................................................. 22 1.1.1 Fisiopatología en etapas tempranas de la enfermedad de
Alzheimer: Hipótesis amiloide ........................................................ 26 1.2 Hipocampo ........................................................................................ 33
1.2.1 Anatomía del hipocampo ................................................................ 34 1.2.2 Circuitos del hipocampo ................................................................. 36 1.2.3 Hipocampo y memoria ....................................................................38 1.2.4 Actividad oscilatoria del hipocampo ............................................... 41
1.3 Canales de K+ rectificadores de corriente de entrada activados por proteína G, GirK ......................................................................... 45
1.3.1 Composición y distribución de canales GirK en el SNC ................. 47 1.3.2 Mecanismos de activación/inactivación de GirK ........................... 49 1.3.3 Canales GirK, excitabilidad neuronal y transmisión sináptica ...... 53
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS .......................................... 57
3. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................. 61
3.1 Incubación con Aβ y cuantificación de niveles de RNA de receptores y canales en rodajas de hipocampo de rata ..................................... 63
3.1.1 Obtención de muestras de tejido nervioso hipocampal ................. 63 3.1.2 Extracción y purificación del RNA total ......................................... 67 3.1.3 Transcriptasa Reversa-PCR cuantitativa en tiempo real (RT-
qPCR) ............................................................................................. 68 3.1.4 Análisis de los datos expresión génica ............................................ 72
3.2 Inyección intracerebroventricular de Aβ en el hipocampo de ratón in vivo: Estudio electrofisiológico y comportamental ........................ 73
3.2.1 Animales de experimentación ......................................................... 73 3.2.2 Cirugía ............................................................................................. 73 3.2.3 Inyección intracerebroventricular de fármacos con cánula guía
crónica ............................................................................................. 74 3.2.4 Registros electrofisiológicos ............................................................ 76 3.2.5 Prueba de habituación en campo abierto ....................................... 81 3.2.6 Prueba de reconocimiento de objetos nuevos ............................... 84 3.2.7 Procesamiento histológico .............................................................. 87
3.3 Análisis estadístico de los datos .......................................................... 88
4. RESULTADOS ............................................................. 89
4.1 Efecto de la exposición a Aβ sobre la expresión génica en rodajas de hipocampo de rata ...................................................................... 90
4.1.1 Estandarización de la técnica de RT-qPCR en el análisis de los niveles de RNA en rodaja de hipocampo de rata ........................... 90
4.1.2 Efecto de la exposición a Aβ sobre la expresión génica de subunidades de receptores y canales de vías de neurotransmisión excitatoria e inhibitoria del hipocampo ........... 97
4.2 Efecto de Aβ y tertiapina-Q sobre las propiedades de la sinapsis CA3-CA1 del hipocampo de ratón in vivo ............................................ 101
4.2.1 Efecto de Aβ y tertiapina-Q sobre la transmisión sináptica del hipocampo in vivo ......................................................................... 101
4.2.2 Efecto de Aβ y la tertiapina-Q en la facilitación a corto plazo de la sinapsis CA3-CA1 del hipocampo in vivo ................................. 107
4.2.3 Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la potenciación a largo plazo del hipocampo in vivo ......................................................................... 110
4.3 Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la actividad rítmica del área CA1 del hipocampo in vivo ..................................................................... 112
4.4 Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la prueba de habituación en campo abierto ...................................................................................... 116
4.5 Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la prueba de reconocimiento de objetos a corto y largo plazo ....................................................... 118
5. DISCUSIÓN ................................................................ 121
5.1 Aproximación experimental utilizada: Efectos de la exposición a Aβ25-35 sobre el hipocampo de mamíferos ................................ 123
5.1.1 Estudio del efecto de Aβ sobre la expresión génica en un modelo in vitro en rodajas de hipocampo de rata ........................ 124
5.1.1.1 Estandarización del análisis de los niveles de RNA en rodaja de hipocampo de rata ........................................................................ 126
5.1.2 Estudio de los efectos de Aβ sobre los canales GirK en el hipocampo de ratón en un modelo in vivo .................................... 127
5.2 Efecto de Aβ en la expresión génica de receptores y canales glutamatérgicos, colinérgicos y GABAérgicos en rodajas de hipocampo de rata .................................................................... 129
5.2.1 Genes diana de Aβ en el hipocampo ............................................. 129 5.3 Efecto de Aβ sobre los canales GirK en el hipocampo en un modelo de
ratón in vivo .............................................................................. 135 5.3.1 Disfunción de los canales GirK y alteración de la actividad del
circuito hipocampal in vivo .......................................................... 136 5.3.2 Disfunción de los canales GirK y alteración de la transmisión
sináptica en el hipocampo in vivo ................................................ 139 5.3.3 Disfunción de los canales GirK y alteración de la potenciación a
largo plazo en el hipocampo in vivo ............................................. 140 5.3.4 Disfunción de los canales GirK y alteración de los ritmos theta
y gamma hipocampales in vivo .................................................... 142
5.3.5 Disfunción de los canales GirK y déficits de memoria dependiente de hipocampo ........................................................... 147
6. LIMITACIONES DEL ESTUDIO .................................. 151
7. RESUMEN Y CONCLUSIÓN ....................................... 155
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................ 159
9. ANEXOS .................................................................... 183
ANEXO 1: ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL EEG: TRANSFORMADA DE FOURIER Y PODER ESPECTRAL ................................................... 185
ANEXO 2: VALIDACIÓN DE OBJETOS PARA EL TEST DE RECONOCIMIENTO DE OBJETOS NUEVOS ................................................................ 186
10. PUBLICACIONES CIENTÍFICAS ............................... 187
11. FINANCIACIÓN Y LOGÍSTICA ................................... 191
12. NOTA DE LA AUTORA .............................................. 195
II. LISTA DE ABREVIATURAS
ACSF Líquido cefalorraquídeo artificial
APP Proteína precursora del amiloide
Aβ péptido β-amiloide
Cq Ciclo de PCR
EA Enfermedad de Alzheimer
EEG Electroencefalograma
fEPSPs Potenciales de campo postsinápticos Excitatorios
fIPSPs Potenciales de campo postsinápticos Inhibitorios
fPSPs Potenciales de campo postsinápticos
GirK Canales de K+ rectificadores de corriente de entrada asociados a proteína G
GPCR Receptor acoplado a proteína G
HFS Estimulación de alta frecuencia
icv. Intracerebroventricular
LTP Potenciación a largo plazo
mA Miliamperio
MCI Deterioro cognitivo leve
NOR Reconocimiento de Objetos Nuevos
PP Pares de Pulsos
PPF Facilitación por pares de pulsos
PSD Dominio de densidad postsináptica
RD Ratio de discriminación de objeto nuevo
RQI Índice de la calidad del RNA
qPCR PCR cuantitativa a tiempo real
RT-qPCR RetroTranscriptasa-PCR cuantiantitativa a tiempo real
SEM error estándar
SNC Sistema Nervioso Central
St. Estímulo
STP Potenciación a corto plazo
TQ Tertiapina-Q
Vm Potencial de membrana
vs. versus
III. ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Genes de estudio. .................................................................................... 64 Tabla 2. Composición del ACSF empleado en la obtención e incubación de
las rodajas de hipocampo de rata. .......................................................... 65 Tabla 3. Primers utilizados. ................................................................................. 70 Tabla 4. Porcentaje de muestras de RNA de hipocampo obtenidas y
clasificadas de acuerdo al índice de calidad de RNA (RQI). .................. 91 Tabla 5. Resumen de los efectos de la exposición a Aβ en los niveles de RNA
de los distintos genes diana a distintos tiempos de incubación, 30 y 120 min, utilizando como genes de referencia Ppia, Gapdh y Actb. ..... 95
IV. ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Fisiopatología de la enfermedad de Alzheimer ........................... 25 Figura 2. Mecanismos moleculares de disfunción sináptica en la enfermedad de Alzheimer. ............................................................................ 30 Figura 3. Anatomía básica del hipocampo y principales circuitos de información. .................................................................................................. 35 Figura 4. Árbol filogenético de la familia de canales de K+rectificadores de corriente de entrada ...................................................................................... 47 Figura 5. Estructura y rutas de transducción de señales de los canales GirK. .............................................................................................................. 52 Figura 6. Representación esquemática del posible papel de los canales GirK en la integración de la información en espinas dendríticas de neuronas piramidales que reciben tanto inputs excitatorios como inhibitorios ......... 54 Figura 7. Obtención e incubación de rodajas de hipocampo de rata ......... 67 Figura 8. Esquema de la posición de los electrodos y la cánula guía implantados con cirugía ................................................................................. 75 Figura 9. Protocolo experimental de registros electrofisiológicos en el hipocampo de ratón in vivo ........................................................................... 77 Figura 10. Potenciales de campo registrados en el área CA1 tras la estimulación por pares de pulsos de las fibras colaterales de Schaffer ........ 81 Figura 11. Protocolo experimental de la prueba de habituación en campo abierto ............................................................................................................ 83 Figura 12. Protocolo experimental de la prueba de reconocimiento de objetos nuevos ............................................................................................... 85 Figura 13. Verificación histológica de la posición de los electrodos y la cánula guía ..................................................................................................... 88 Figura 14. Medida de la calidad del RNA total extraído de rodajas de hipocampo ..................................................................................................... 93 Figura 15. Expresión relativa de RNA de los genes Actb, Gapdh, Ppia ..... 94
Figura 16. Variabilidad de los niveles de relativos de RNA dependiendo del gen de referencia ............................................................................................ 96 Figura 17. Diferentes procedimientos en el análisis de la estabilidad génica de los genes de referencia .............................................................................. 97 Figura 18. Expresión relativa de genes que codifican receptores y canales implicados en la neurotransmisión excitatoria e inhibitoria del hipocampo durante la incubación con Aβ. ..................................................................... 100 Figura 19. Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la transmisión sináptica basal de la sinapsis CA3-CA1 del hipocampo in vivo ................................................ 104 Figura 20. Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la respuesta provocada en CA1 por estimulación a intensidades crecientes de las fibras colaterales de Schaffer del hipocampo in vivo ................................................................... 105 Figura 21. Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la facilitación sináptica provocada por estimulación por pares de pulsos de la fibras colaterales de Schaffer del hipocampo in vivo ................................................................... 109 Figura 22. Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la potenciación a largo plazo del hipocampo in vivo ....................................................................................... 110 Figura 23. Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la actividad rítimica por bandas de frecuencia en CA1 del hipocampo in vivo ................................................ 113 Figura 24. Efecto de Aβ y tertiapina-Q sobre la actividad rítmica en theta y gamma hipocampal in vivo ..........................................................................114 Figura 25. Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la prueba de habituación en campo abierto ............................................................................................... 117 Figura 26. Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la prueba de reconocimiento de objetos nuevos a corto y largo plazo ............................................................ 119 Figura 27. Efecto de Aβ y tertiapina-Q en el ratio de discriminación del objeto nuevo a corto y largo plazo ............................................................... 120 Figura 28. Esquema resumen de los desórdenes neurales y enfermedades posiblemente asociadas a los canales GirK ................................................. 150 Figura 29. Validación de objeto nuevo -estrella-. ..................................... 186
21
1. INTRODUCCIÓN
Introducción
22
1.1 Enfermedad de Alzheimer
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un tipo de demencia
incapacitante que presenta una prevalencia del 5-7% en personas de más
de 65 años y casi el 50% en mayores de 80 años (Mattson, 2004). Debido
al grado de envejecimiento de la población, según el informe de la
Alzheimer's Disease International, se estima que en 2050 habrá cerca de
115.4 millones de casos de demencia por lo cual representa un problema
epidemiológico a escala mundial (Alzheimer's Disease International,
http://www.alz.co.uk/). La EA es una patología crónica y progresiva que
fue descrita por primera vez en el año 1906 por el psiquiatra y neurólogo
alemán Alois Alzheimer. Uno de los síntomas principales es la aparición
de alteraciones cognitivas, como la pérdida de memoria, las cuales se
agravan con la progresión de la enfermedad. A nivel anatómico hay
atrofia cerebral con presencia de placas extracelulares y ovillos
neurofibrilares formados por la acumulación del péptido beta-amiloide,
Aβ (del inglés, Amyloid-β) y agregados de la proteína tau
hiperfosforilada, respectivamente. Junto a la enfermedad de Parkinson,
de Huntington, varias encefalopatías espongiformes y la esclerosis lateral
amiotrófica, la EA es una de las enfermedades neurodegenerativas con un
mecanismo patológico común caracterizado por la acumulación de
proteínas mal procesadas en distintas zonas del sistema nervioso
(Brettschneider et al., 2015). En la EA estas alteraciones comienzan en el
lóbulo temporal medial y progresan hacia aéreas asociadas en el
neocórtex (Figura 1). Se postula que las primeras anomalías podrían
surgir décadas antes de la aparición de síntomas clínicos (Walsh and
Selkoe, 2004, Sperling et al., 2009). El diagnóstico de EA es complejo, y
hasta hace pocos años sólo se diagnosticaba la EA tras el análisis
histopatológico postmorten del tejido cerebral. Sin embargo,
recientemente ha surgido un cambio conceptual en el diagnóstico de la
EA gracias a la inclusión de biomarcadores para la posible identificación
de distintas etapas de la enfermedad (Dubois et al., 2007). Además de los
pruebas cognitivas y la historia clínica y familiar del paciente, se emplean
Introducción
23
tanto exámenes físicos con pruebas de neuroimagen molecular, entre
ellas, la medida de la concentración de proteínas mal plegadas con
tomografía por emisión de positrones, imagen de resonancia magnética
estructural o análisis de electroencefalograma, EEG (Dubois et al., 2007).
De acuerdo a los resultados obtenidos con estas pruebas la EA se ha
clasificado en tres fases generales: presintomática, prodrómicas y
sintomáticas. La etapa presintomática no podría detectarse dado que no
presenta síntomas. La etapa prodrómica incluye la fase de deterioro
cognitivo leve o MCI (del inglés, Mild Cognitive Impairment). El MCI
está asociado con la aparición de alteraciones sutiles en la memoria
declarativa episódica. En un primer momento, aparecen dificultades a la
h de aprender nueva información y dificultad para recordar eventos
recientes. En pacientes con MCI hay déficits en test de evaluación de
memoria de reconocimiento por ítems (palabras u objetos) novedosos o
familiares (Algarabel et al., 2012). Además, se observan déficits similares
en modelos animales de etapas tempranas de EA (Grayson et al., 2015).
Inicialmente la desorientación en estos pacientes comienza en ambientes
novedosos o poco conocidos, pero posteriormente experimentan
dificultades para encontrar el camino alrededor de lugares familiares,
incluyendo sus propios hogares. Estas funciones cognitivas están
relacionadas con el hipocampo, una de las primeras áreas afectadas en la
enfermedad (Figura 1). En un primer momento, se observan alteraciones
en el lóbulo temporal y en la zona del giro dentado del hipocampo. Con el
progreso de la enfermedad se ve afectado el lóbulo parietal y el lóbulo
frontal (Figura 1), apareciendo déficits en la memoria a largo plazo.
Posteriormente avanza hacia áreas relacionadas con procesos cognitivos
como el pensamiento abstracto, juicio y lenguaje. Finalmente, cuando la
enfermedad está muy avanzada, puede aparecer psicosis con paranoia,
alucinaciones e indiferencia afectiva. La EA termina con la incapacidad
total del paciente y la muerte aproximadamente suele ser una década
después del diagnóstico (Dubois et al., 2007).
El desencadenante de la enfermedad se desconoce. Sin embargo,
estudios bioquímicos indican que la severidad de los síntomas podría
Introducción
24
correlacionar con niveles corticales de Aβ soluble. En este sentido están
en desarrollo distintas técnicas para establecer biomarcadores adecuados
para el diagnóstico de la EA en etapas prodrómicas, de acuerdo a la
presencia de este tipo de proteínas (Langbaum et al., 2013).
Introducción
25
Figura 1. Fisiopatología de la enfermedad de Alzheimer. A. Zonas cerebrales afectadas y progresión de la EA. En la EA temprana-moderada inicialmente se encuentran anomalías en el lóbulo temporal medial, progresando hacia el lóbulo parietal y frontal en etapas más tardías. Durante el desarrollo de la enfermedad, los principales déficits cognitivos que aparecen son en procesos de aprendizaje y memoria, aunque pueden alterarse otras áreas del conocimiento como el pensamiento abstracto, juicio, lenguaje o la personalidad. Lesiones en estas regiones podrían estar asociadas a la presencia de Aβ. B. La hipótesis amiloide postula que distintas formas del Aβ como los monómeros oligómeros, formas solubles de distintos tamaños, protofibrillas y otros metabolitos de la proteína precursora del amiloide ó APP podrían producir un estado de disfunción sináptica en dendritas y sinapsis en etapas tempranas de EA, previamente a la acumulación de Aβ en placas insolubles, y la degeneración neuronal observadas en etapas tardías. Imágenes obtenidas del National Institute on Aging. https://www.nia.nih.gov/alzheimers/
Introducción
26
Los tratamientos disponibles actualmente para la EA están indicados
para etapas medias y tardías de la enfermedad, como son la memantina,
cuya diana son los receptores de tipo NMDA, o inhibidores de la
acetilcolinesterasa (véase sección 1.1.1.1 para más detalle), pueden
retardar la progresión de los síntomas pero no existe una terapia que
revierta o detenga su avance a pesar de los múltiples avances en la
investigación clínica y básica (Langbaum et al., 2013).
Teniendo en cuenta que no hay tratamientos eficaces, la prevalencia
de la EA y el grado de envejecimiento de la población es de alta relevancia
socio-económica diseñar terapias adecuadas que mejoren la salud y la
calidad de vida de los pacientes. En este sentido, el abordaje desde la
investigación de la fisiopatología de esta enfermedad es un tema de gran
interés científico sobre todo enfocado en las primeras fases de la EA.
1.1.1 Fisiopatología en etapas tempranas de la enfermedad de Alzheimer: Hipótesis amiloide
Una de las hipótesis de más relevancia, formulada hace más de 20
años, que postula las posibles causas de la sintomatología y desarrollo de
la EA es la llamada hipótesis amiloide (Walsh and Selkoe, 2004).
Distintas formas del Aβ (monómeros, oligómeros, formas solubles de
distintos tamaños, protofibrillas y otros metabolitos de la proteína
precursora del amiloide ó APP1) podrían producir un estado de
disfunción sináptica en etapas tempranas de la EA, siendo este un paso
previo a la formación de la placas amiloides insolubles, la pérdida de
sinapsis y la muerte neuronal observadas en etapas más avanzadas
(Figura 1). De hecho, algunos autores respaldan el supuesto de que las
placas insolubles de Aβ podrían ser reservorios relativamente inactivos
de las formas solubles neurotóxicas (Mucke and Selkoe, 2012). La
hipótesis amiloide surgió al observar que en muchos pacientes
diagnosticados con EA en etapas tempranas no mostraban una
disminución en el número de sinapsis, y en algunos pacientes los
1Los péptidos de Aβ derivan del corte consecutivo de la proteína precursora del amiloide (APP, del inglés Amyloid Precursor Protein) por β- y γ-secretasas.
Introducción
27
síntomas no correlacionaban con la presencia de placas insolubles (Lacor
et al., 2004, Spires-Jones and Knafo, 2012). Por otro lado, formas
solubles oligoméricas de Aβ aisladas de pacientes de EA sobre la
potenciación a largo plazo ó LTP (del inglés, Long-Term Potentiation) en
el hipocampo, un paradigma experimental clásico de aprendizaje,
memoria y plasticidad sináptica (véase sección 1.2.3.1).
Durante la pasada década ha surgido como hipótesis emergente la
alteración del funcionamiento de redes neuronales debido a la presencia
de formas solubles de Aβ, como proceso previo temprano subyacente a la
aparición de los síntomas sutiles en etapas iniciales de la EA (Palop and
Mucke, 2010, Peña-Ortega, 2013, Stargardt et al., 2015). Estudios de
imagen por resonancia magnética funcional muestran alteraciones en la
actividad neural, como aparición de zonas hiperactivas en áreas
relevantes afectadas en etapas tempranas de la enfermedad (Bakker et al.,
2012, Stargardt et al., 2015). Por ejemplo, pacientes con MCI presentan
hiperactividad en zonas como el hipocampo (Putcha et al., 2011).
Pacientes tratados con levetiracetam, fármaco antiepiléptico que reduce
la actividad hipocampal, presentan mejoría en tareas relacionadas con la
memoria (Bakker et al., 2012). De hecho la hiperactividad en estas áreas
podría dar lugar a la actividad epileptiforme no asociada a convulsiones
que ha sido relacionada con alteraciones cognitivas como la
desorientación en ratones transgénicos de APP humano (Palop et al.,
2007, Palop and Mucke, 2009, Sun et al., 2009). Por otro lado, modelos
animales muestran efectos del Aβ sobre la actividad oscilatoria rítmica
del hipocampo, lo que podría estar correlacionado con déficits en
procesos de aprendizaje y memoria dependientes de éste (Peña et al.,
2010, Sanchez et al., 2012, Sebollela et al., 2012, Verret et al., 2012,
Goutagny et al., 2013). Se postula que este estado de hiperactividad
podría estar causado por un desbalance entre sistemas de
neurotransmisión excitatorios e inhibitorios promovido por la presencia
de Aβ. Esta hiperactividad mantenida en el tiempo generaría procesos
desencadenantes en la disfunción sináptica en estas áreas (Palop et al.,
2007, Sun et al., 2009, Sanchez et al., 2012, Verret et al., 2012). En esta
Introducción
28
línea, el desarrollo de tratamientos farmacológicos basados en la
modulación del balance entre neurotransmisión excitatoria e inhibitoria
parece ser una posible estrategia para el abordaje de la enfermedad desde
etapas tempranas (Huang and Mucke, 2012, Nava-Mesa et al., 2014,
Chumakov et al., 2015).
1.1.1.1 Mecanismos moleculares de Aβ sobre la neurotransmisión en el hipocampo
Los mecanismos específicos que expliquen consistentemente los
déficits neurológicos asociados a EA, a través de los cuales el Aβ produce
daño sináptico y pérdida neuronal en determinadas áreas del SNC, no
están esclarecidos y continúan investigándose. Sin embargo, la utilización
de modelos de estudio, tanto in vitro como in vivo, han aportado
evidencias de los efectos de Aβ a distintos niveles de la sinapsis. La
alteración de la expresión de genes relevantes en múltiples aspectos de la
función sináptica, como genes relacionados con el tráfico vesicular y la
liberación de neurotransmisores, genes de proteínas de anclaje
postsináptico y de adhesión celular de estabilidad de la sinapsis, y genes
de receptores y canales de vías de neurotransmisión excitatoria e
inhibitoria en áreas como el hipocampo (Berchtold et al., 2013, Saura et
al., 2015). La presencia de Aβ también altera niveles de expresión génica
y proteica de receptores y transportadores de glutamato (Albasanz et al.,
2005, Shankar et al., 2008, Miñano-Molina et al., 2011), receptores de
acetilcolina (Tsang et al., 2006, Wu et al., 2008, Caccamo et al., 2009,
Yang et al., 2012) y canales iónicos (Durán-González et al., 2013, Nava-
Mesa et al., 2013, Mayordomo-Cava et al., 2015). Por otro lado también
se han mostrado evidencias sobre la alteración de la excitabilidad (Palop
et al., 2007, Sun et al., 2009, Verret et al., 2012) y la actividad rítmica en
circuitos como el hipocampo (Villette et al., 2010, Rubio et al., 2012,
Villette et al., 2012).
En este sentido, ninguno de los mecanismos propuestos puede ser
descartado, y en última instancia, en su conjunto, las distintas
alteraciones que produce el Aβ podrían estar generando un estado de
Introducción
29
disfunción sináptica, que mantenido en el tiempo podría dar lugar a los
déficits cognitivos asociados a la EA.
Centrándonos en los posibles mecanismos moleculares por los que
Aβ altera la neurotransmisión excitatoria e inhibitoria, principalmente en
el hipocampo, se han aportado datos sobre varias posibles vías de acción
(Figura 2 (Nava-Mesa et al., 2014).
Introducción
30
Figura 2. Mecanismos moleculares en la disfunción sináptica en la enfermedad de Alzheimer. Posible papel de Aβ en la fisiopatología de la EA y diferentes dianas farmacológicas propuestas para su modulación. Varios tipos de Aβ en estados de agregación diferentes alterarían el funcionamiento de neuronas piramidales e interneuronas. La vía glutamatérgica es una diana actual en el tratamiento de la EA a través de los receptores de tipo NMDA (por ejemplo, con memantina), y la vía colinérgica con inhibidores de la acetilcolinesterasa, AChE. Aunque las interneuronas GABAérgicas se postulan en varios modelos de EA, y el sistema GABAérgico surge como una diana emergente a través de la búsqueda de fármacos tanto para receptores GABAA, como a GABAB. No se descarta que el desequilibrio entre neurotransmisión inhibitoria y excitatoria podría ser la base de la disfunción cognitiva en la EA, barajándose la posibilidad de combinar tratamientos para las distintas vías. Abreviaturas: Aβ, β-amiloide; AChR, receptor de acetilcolina; AChE, acetilcolinesterasa; α7-nAChR, receptor nicotínico de acetilcolina α7; BDNF, factor neurotrófico derivado del cerebro; NGF, factor de crecimiento nervioso. Imagen tomada de (Nava-Mesa et al., 2014).
Introducción
31
La desregulación de la transmisión excitatoria glutamatérgica se ha
propuesto como posible mecanismo. Formas solubles de Aβ incrementan
la concentración de glutamato en el espacio sináptico proponiéndose
modificaciones presinápticas tanto en liberación como recaptación de
glutamato, y alteraciones postsinápticas que implicarían la desregulación
de la función y la expresión de receptores ionotrópicos de glutamato de
tipo NMDA (N-metil-D-aspartato), de tipo AMPA (ácido alfa-amino-3-
hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico), Kainato y receptores
metabotrópicos de glutamato, mGluR (Parameshwaran et al., 2008). En
este sentido, parece que los efectos encontrados son dependientes de la
etapa de estudio de la enfermedad. Por ejemplo, el incremento de los
niveles de glutamato en etapas medias de la enfermedad, y la posible
excitotoxicidad del mismo, podría asociarse a una sobre activación de
receptores de NMDA, que podrían dan lugar a cascadas de señalización
dependientes de Ca2+, lo que a su vez podría estimular la producción de
Aβ (Paula‐Lima et al., 2013). En esta línea, la utilización conjunta tanto
de antagonistas de receptores de NMDA, como la memantina, junto con
la activación de receptores inhibitorios, como los de GABAA, para
compensar la excesiva actividad del sistema excitatorio podría ser un
abordaje de interés en las etapas medias de la enfermedad (Paula‐Lima et
al., 2013).
Por otro lado, tanto en modelos transgénicos que simulan síntomas
asociados a la EA (Marchetti and Marie, 2011), como modelos murinos de
inyección icv. de Aβ in vivo (Freir et al., 2001, Walsh et al., 2002,
Shankar et al., 2008) se han descrito efectos de Aβ sobre la LTP-
mecanismo básico de plasticidad de sinapsis excitatorias, clásicamente
considerado el correlato funcional del aprendizaje y la memoria-
alteraciones que podrían subyacer a los déficits encontrados en pruebas
de aprendizaje y memoria dependientes de hipocampo (Bliss and
Collingridge, 1993).
Otra de las vías afectadas en la EA es la colinérgica, encontrando un
déficit del sistema colinérgico central, sobre todo en etapas medias y
tardías de la enfermedad. Dicho déficit podría ser promovido por la
Introducción
32
pérdida de niveles de acetilcolina (ACh) aunque en etapas tempranas de
la misma los mecanismos deben ser otros, dado que dichas alteraciones
no parecen encontrarse (Terry and Buccafusco, 2003). Se han descrito
efectos de formas solubles y oligoméricas de Aβ sobre la actividad de
receptores de ACh, tanto muscarínicos (mAChR), como nicotínicos
(nAChR). Uno de los posibles mecanismos descritos sería la alteración de
la cascada de transducción de la señal del mAChR de tipo M1 a través de
la proteína G asociada, desacoplando la actividad del receptor con sus
efectores (Tsang et al., 2006, Janickova et al., 2013). El receptor M1 se
encuentra principalmente en la zona postsináptica y está ampliamente
distribuido en el córtex y el hipocampo. Dado que la vía colinérgica desde
septum es un importante regulador de la función hipocampal, agonistas
de los receptores M1 podrían ser fármacos de interés como moduladores
de la función colinérgica en etapas tempranas de la EA (Caccamo et al.,
2009).
Finalmente, algunos modelos transgénicos que sobreexpresan APP y
presentan niveles elevados de Aβ desarrollan de forma temprana
actividad de tipo epileptiforme sin crisis convulsivas (Palop et al., 2007,
Sanchez et al., 2012) hecho que también se observa en ciertos grupos de
pacientes de EA (Palop and Mucke, 2009, Kitchigina et al., 2013, Vossel
et al., 2013). Por ello, se ha propuesto la implicación del sistema
GABAérgico como posible mecanismo subyacente a la aparición de este
tipo de actividad (Lanctôt et al., 2004, Verret et al., 2012, Nava-Mesa et
al., 2014). Aunque en el hipocampo el proceso neurodegenerativo parece
afectar en mayor medida a la vía colinérgica y glutamatérgica que a la
GABAérgica (Tsang et al., 2006, Janickova et al., 2013) algunos modelos
de estudio con mutaciones en genes relacionados con la EA presentan
alteraciones tempranas en esta vía. En el modelo transgénico PS1/APP se
observa neurodegeneración de interneuronas de tipo somatostatina/NPY
(Ramos et al., 2006). Este mismo modelo, presenta hiperactividad en
circuitos corticales, proponiéndose como posible mecanismo subyacente
la disminución de la inhibición sináptica posiblemente por alteraciones
tempranas de la vía GABAérgica (Palop et al., 2007, Busche et al., 2008).
Introducción
33
De modo que Aβ podría tener efectos indirectos en la neurotransmisión
GABAérgica a través de la interacción con la vía glutamatérgica y
colinérgica (Palop et al., 2007, Sun et al., 2009, Sanchez et al., 2012,
Verret et al., 2012). En esta línea, algunas investigaciones aportan
evidencias sobre la modulación de la vía GABAérgica como posible
mecanismo de control de la neurotransmisión excitatoria (Sanchez et al.,
2012) por aumento de la inhibición tónica (Lanctôt et al., 2004) o la
combinación de fármacos dirigidos tanto a vías excitatorias como
inhibitorias (Chumakov et al., 2015). Estas podrían ser posibles
estrategias terapéuticas en el control de zonas con hiperexcitabilidad en
etapas tempranas de la EA.
Como se ha comentado anteriormente, hasta el momento ninguno
de los mecanismos moleculares descritos puede descartarse dado que los
procesos a través de los cuales Aβ produciría un desbalance entre los
distintos sistemas de neurotransmisión en áreas concretas del SNC no
están esclarecidos.
1.2 Hipocampo
El hipocampo es una estructura situada en el lóbulo temporal
medial, propia de mamíferos, conservada entre distintas especies. Desde
el descubrimiento hecho por Brenda Milner y William Scoville en el 1957,
donde la intervención quirúrgica de la formación hipocampal realizada al
paciente HM produjo amnesia anterógrada. Numerosos estudios, tanto
en humanos como animales, han puesto de manifiesto la relación de esta
zona con diversos tipos de memoria. De hecho, distintas alteraciones en
estructuras de la formación hipocampal se han relacionado, además de
con enfermedades como la EA que cursa con déficits de memoria, con
otros desórdenes neurológicos entre los que podemos mencionar
epilepsia, depresión o esquizofrenia (Andersen et al., 2007).
Dado que el hipocampo es una de las primeras áreas en presentar
alteraciones funcionales y anatómicas en la EA, se describirán en mayor
profundidad algunas de las características más relevantes para la
comprensión de esta tesis doctoral.
Introducción
34
1.2.1 Anatomía del hipocampo
El hipocampo, el giro dentado, el subículo y la corteza entorrinal
integran lo que se denomina la formación hipocampal (Andersen, 2007).
Clásicamente la formación hipocampal, junto con la amígdala, se
engloban dentro del sistema límbico el cual ha sido relacionado
ampliamente con el procesamiento de la información emocional. El
hipocampo se estructura en láminas y en la que se distinguen tres áreas
principales: CA1, CA2 y CA32. Dicha subdivisión tiene implicaciones
anatómicas y funcionales ya que en cada una de estas regiones hay tipos
neuronales y se establecen conexiones específicas (Figura 3).
En el hipocampo se pueden distinguir dos tipos de células
neuronales: neuronas piramidales, que comprenden un 70-85% de la
población total, e interneuronas que corresponden al 15-30% de la
población total. El giro dentado está formado además por células
granulares. Tanto las neuronas piramidales, como las granulares son de
carácter excitatorio. El hipocampo, además, está formado por una amplia
red de distintos tipos de interneuronas que regulan su actividad
participando de forma decisiva en la modulación de las respuestas
individuales y poblacionales de las células piramidales a través de señales
inhibitorias.
La organización laminar del hipocampo es fácilmente identificable
en el microscopio con la utilización de tinciones tradicionales como la de
Golgi (Figura 3A). Los somas de las neuronas piramidales quedan
distribuidos en la capa piramidal junto con los cuerpos celulares de
interneuronas GABAérgicas, entre las que predominan las células en
candelabro, que establecen sinapsis inhibidoras con el segmento inicial
del axón de las células piramidales y células en cesto que a su vez
establecen sinapsis inhibidoras con el soma de piramidales (Andersen,
2007).
2 Lorente de Nó, acuñó la terminología de CA1-3 al describir las distintas áreas dentro del hipocampo. Proviene del término Cornu Ammonis ó Asta de Ammon, recordando los cuernos de carnero del dios egipcio Ammón (Lorente de Nó, 1934).
Introducción
35
Figura 3. Anatomía básica del hipocampo y principales circuitos de información. A. Dibujo modificado de Ramón y Cajal en el cual se han indicado las áreas CA1-3, subículo (sub), corteza entorrinal (EC) y giro dentado (DG). B. Esquema de vías aferentes. El principal input llega desde la vía Perforante con información sensorial desde neuronas de la capa II de la corteza entorrinal (ECII) al DG La ruta perforante son principalmente axones excitatorios que contactan con dendritas de células granulares. Proyecciones de las células granulares del giro dentado, fibras musgosas, inervan dendritas de neuronas piramidales de CA3, que a su vez proyectan a piramidales de CA1 a través de fibras colaterales de Schaffer, así como axones al hipocampo contralateral por la vía comisural y a las propias piramidales de CA3, en la vía de asociación. También hay una entrada directa desde la corteza entorrinal a CA3. Desde CA1 hay fibras de salida a subículo y a corteza entorrinal. Otra vía importante de entrada-salida de información es a través de fimbria lateral desde el septum, conocida como el sistema septohipocampal por las conexiones recíprocas existentes. MS-DBB, Septum Medial-Banda diagonal de Broca; V, Vía; F, Fibras; C, Colaterales.
Introducción
36
1.2.2 Circuitos del hipocampo
1.2.2.1 Circuitos intra-hipocampales
Una de las características principales del circuito intra-hipocampal
es la transmisión unidireccional por neurotransmisión glutamatérgica
excitatoria. Desde la corteza entorrinal, vía perforante, llega información
de vías sensoriales a células granulares del giro dentado estableciendo
sinapsis en la capa del stratum lacunosum-moleculare (Figura 3B). Las
células granulares emiten axones denominados fibras musgosas
sinaptando con neuronas piramidales de CA3 en el stratum lucidum. Las
neuronas piramidales de CA3, sinaptan a través fibras colaterales de
Schaffer con piramidales de CA1 en el stratum lucidum. Las propias
neuronas piramidales de CA3 emiten conexiones recurrentes con otras
piramidales de CA3, denominadas fibras de asociación (Figura 3B).
Finalmente, a través de CA1, la información procesada en el hipocampo
se transmite al subículo y de aquí a áreas corticales superiores como la
corteza prefrontal (Figura 3B). Este circuito es mediado por corrientes
postsinápticas excitatorias EPSCs (del inglés, Excitatory PostSynaptic
Currents) rápidas a través de receptores ionotrópicos de glutamato de
tipo AMPA y receptores de tipo Kainato. Las EPSCs lentas son mediadas
por activación de receptores NMDA y por algunos subtipos de mGluR. La
actividad de las neuronas principales es controlada y sincronizada por el
circuito inhibitorio de interneuronas GABAérgicas. En general, corrientes
inhibitorias postsinápticas, IPSCs (del inglés, Inhibitory PostSynaptic
Currents) rápidas son el resultado de la activación de receptores
ionotrópicos de tipo GABAA, y IPSCs lentas derivadas de la activación de
receptores metabotrópicos de tipo GABAB. La neurotransmisión
colinérgica, principalmente proveniente del septum y de la banda
diagonal de Broca (MS-BDD) ejerce una acción moduladora por la unión
de ACh a los receptores nAChRs ó mAChRs que dependiendo del tipo de
receptor, del tipo celular y localización de los receptores en las neuronas
se producen corrientes excitatorias o inhibitorias (Andersen, 2007,
Picciotto et al., 2012). Finalmente, una de las características distintivas de
Introducción
37
la conectividad dentro del hipocampo es que gran parte de su entrada
sináptica surge desde el propio hipocampo. En CA3, las vía recurrente
asociativa y la vía comisural hacia la región CA3 contralateral (Andersen,
2007).
1.2.2.2 Conexiones aferentes: Entrada de información en el hipocampo
La corteza entorrinal es la principal fuente de proyecciones hacia el
giro dentado y a neuronas de CA3. A su vez, la corteza entorrinal recibe
información desde la corteza perirrinal y corteza parahipocampal,
estructuras que reciben proyecciones de áreas de asociación del lóbulo
parietal, temporal y frontal. Se han descrito igualmente proyecciones
directas desde la corteza perirrinal a las neuronas piramidales de CA1.
Aunque en menor proporción, también recibe aferencias de áreas
subcorticales, como proyecciones histaminérgicas del área supramamilar
del hipotálamo posterior, aferencias noradrenérgicas de los núcleos
pónticos y locus ceruleus, serotoninérgicas del rafe medial y
dopaminérgicas del área tegmental ventral. Se han descrito aferencias
excitatorias provenientes de núcleos del tálamo y de la amígdala sobre
interneuronas y neuronas piramidales de CA1. La amígdala se conecta
igualmente con otras áreas de la formación hipocampal, entre ellas la
corteza entorrinal, subículo y parasubículo. Los hipocampos de ambos
hemisferios están conectados a través del sistema comisural (Andersen,
2007).
Tanto células granulares del giro dentado como neuronas
piramidales del hipocampo reciben proyecciones colinérgicas y
GABAérgicas desde MS-BDD a través de fimbria-fórnix, así como
proyecciones glutamatérgicas recientemente descritas (Huh et al., 2010).
En general, la distribución de fibras de la región central del septum
medial conecta con el hipocampo dorsal, mientras que las fibras de las
áreas lateral y posterior alcanzan el hipocampo ventral. Desde la DBB hay
prolongaciones hasta el hipocampo dorsal y ventral. Los principales
neurotransmisores implicados en esta vía tienen efectos distintos. El
Introducción
38
componente colinérgico parece tener un efecto de activación tónica de
neuronas piramidales, mientras las proyecciones GABAérgicas, al inervar
interneuronas inhibitorias y piramidales, podrían ejercer un efecto
desinhibitorio (Toth et al., 1997). Debido al acoplamiento funcional del
sistema septo-hipocampo lesiones en el complejo septal están asociadas a
déficits cognitivos, y una pérdida progresiva de inputs colinérgicos y
GABAérgicos en la región hipocampal se ha asociado con la EA (Colom et
al., 2010, Villette et al., 2010, Leão et al., 2012, Rubio et al., 2012).
Además, se ha propuesto que lesiones en esta área podrían derivar en
alteraciones en la percepción de estímulos ambientales y defectos en la
habituación a los mismos (Vinogradova, 2001).
1.2.2.3 Conexiones eferentes: Vías de salida de información del hipocampo
El hipocampo proyecta principalmente a diferentes áreas
circunvecinas como la corteza entorrinal, corteza perirrinal y el subículo,
además de las proyecciones recíprocas del sistema septo-hipocampal a
través de fimbria-fórnix. Por otro lado, el hipocampo también puede
afectar otras estructuras cerebrales mucho más distantes a través de
proyecciones indirectas y circuitos complejos. Entre estas estructuras se
encuentran el hipotálamo, cuerpos mamilares (vía conexión recíproca
fórnix), y el neocórtex a través de conexiones con corteza entorrinal y
subículo sobre estructuras como el giro del cíngulo. Las conexiones
recíprocas del hipocampo con muchas de estas estructuras, incluida la
amígdala, la corteza prefrontal y de las propias fibras de asociación de
CA3 forman lo que se conoce como sistema límbico, clásicamente
relacionado con procesamiento emocional y la memoria, entre otras
funciones cognitivas (Andersen, 2007).
1.2.3 Hipocampo y memoria
Numerosos estudios, tanto en humanos como en modelos animales,
han puesto de manifiesto la relación de la formación hipocampal con
determinados tipo de memoria. La memoria declarativa o explícita es la
Introducción
39
que define hechos o eventos y engloba la memoria episódica de
reconocimiento de objetos, personas o experiencias Estudio en modelos
de memoria declarativa con lesiones y manipulaciones farmacológicas en
el hipocampo de roedores ha mostrado déficits en la realización de tareas
relacionadas con memoria de reconocimiento (Balderas et al., 2008,
Ennaceur, 2010, Popović et al., 2014). El hipocampo también se ha
relacionado con el reconocimiento de ambientes novedosos y con la
codificación de la información novedosa no contextual (Lee et al., 2005,
Cohen et al., 2013), con procesos de habituación por familiarización con
el ambiente (Thiel et al., 1998, Giovannini et al., 2001, Popović et al.,
2014) y con la memoria de reconocimiento de objetos (Cohen et al.,
2013). En la formación de este tipo de memoria además del hipocampo
están asociadas otras áreas, como el giro dentado, el complejo subicular,
la corteza perirrinal y la corteza entorrinal. La formación de la memoria
podría comprender tres subprocesos, detección y codificación de la
información, consolidación (almacenamiento) y la recuperación de la
información (Vinogradova, 2001, Morris, 2006). Mientras que la región
CA1 se ha sugerido como un lugar de discriminación de novedad,
mientras que el giro dentado-CA3 podrían estar más relacionados con el
recuerdo y la recuperación de la información en un contexto dado
(Lisman and Otmakhova, 2001, Vinogradova, 2001, Manns et al., 2003,
Balderas et al., 2008, Clarke et al., 2010, Cohen et al., 2013).
Una de las principales hipótesis en relación a los procesos celulares
que subyacen al almacenamiento de la información en el SNC es el
aumento en la eficacia de la transmisión sináptica debido a cambios
neuronales persistentes en el tiempo, proceso conocido como plasticidad
sináptica (Bliss and Collingridge, 1993, Morris, 2006, Citri and Malenka,
2008, Bliss et al., 2013). En este sentido uno de los procesos de
plasticidad sináptica más estudiados es la LTP (Bliss and Collingridge,
1993) y alteraciones en la LTP podrían subyacer a los déficits cognitivos
de memoria relacionados con el hipocampo.
Introducción
40
1.2.3.1 Plasticidad sináptica y potenciación a largo plazo en el hipocampo
La plasticidad sináptica podría definirse como cambios persistentes
en la eficacia de las sinapsis de circuitos neuronales en respuesta al flujo
de información que se recibe. El aumento en la eficacia sináptica
implicaría modificaciones en la liberación de neurotransmisor, activación
de rutas de transducción de señales por segundos mensajeros, activación
temprana de genes y síntesis de nuevas proteínas (Takeuchi et al., 2014).
Se postula que este tipo de procesos son la base del “almacenamiento” de
información adquirida durante estados cognitivos concretos. El
hipocampo es una de las zonas donde más se han estudiado distintos
tipos de plasticidad sináptica, clasificadas generalmente por su duración
en el tiempo. Desde pocos milisegundos hasta decenas de segundos,
potenciación a corto plazo o STP (del inglés Short-Term Potentation),
hasta cambios que pueden perdurar minutos y h, como la potenciación a
largo plazo o LTP. Entre los diversos tipos de STP cabe mencionar la
facilitación sináptica. Es un tipo de STP mediado por mecanismos
presinápticos que aparece con la llegada consecutiva de dos o más
potenciales de acción al terminal en un intervalo inferior a un segundo,
estando la segunda EPSC aumentada con respecto a la primera. También
se conoce como facilitación por pares de pulsos, PPF (del inglés Pair
Pulse Facilitation). Puede durar de segundos a unos pocos minutos y
tendría un papel fundamental en el tráfico de la información a través de
las sinapsis. Este proceso se atribuye a un incremento de Ca2+ intra-
neuronal en la presinapsis. Después de un estímulo la concentración de
Ca2+ tendería a disminuir unos pocos milisegundos después, sin embargo,
con la llegada del segundo estímulo, el influjo de Ca2+ se ve aumentado
como resultado de la liberación de Ca2+ residual, aumentando la
probabilidad de liberación de neurotransmisor (Zucker and Regehr,
2002).
En la LTP sin embargo la respuesta de facilitación se mantiene en un
periodo de tiempo que puede ir de minutos a horas. La LTP se puede
inducir después de la aplicación de un estímulo de alta frecuencia
Introducción
41
(tetanizante o trenes de estímulos) y tiene tres propiedades básicas:
especificidad (input provenientes de aferencias similares), cooperatividad
(dependiente de un umbral de estimulación) y asociatividad (mayor
respuesta de un estímulo presentado después de otro estímulo, propiedad
implícita de las sinapsis Hebbianas). De este modo, es necesario que
coincidan activas la zona presináptica y la postsináptica. En el
hipocampo, la estimulación de alta frecuencia de las fibras colaterales de
Schaffer en CA3 provoca un incremento en respuesta registrada en CA1
por aumento en la eficacia sináptica que puede permanecer h, incluso
días (Bliss and Collingridge, 1993). Es dependiente de la activación de
receptores de tipo NMDA, evento que desencadena la entrada de Ca2+ al
interior celular. La activación de receptores de tipo NMDA requiere la
salida del Mg2+ del poro del receptor, suceso dependiente de un potencial
de membrana muy despolarizado. Los mecanismos de expresión de LTP,
son pre- y postsinápticos, y afectan directamente a la eficacia sináptica
(Bliss and Collingridge, 1993). La LTP ha sido asociada con procesos de
aprendizaje dependientes de hipocampo debido a que si se altera la
función de receptores de tipo NMDA aparecen deficiencias tanto en la
adquisición como en la retención de distintas tareas (Gruart et al., 2006,
Morris, 2006, Madronal et al., 2007, Clarke et al., 2010). A su vez, otros
estudios han demostrado cómo el propio proceso de aprendizaje genera
respuestas similares a las producidas tras la inducción de la LTP, por ello
se define como los procesos moleculares subyacentes a la formación de la
memoria (Gruart et al., 2006, Whitlock et al., 2006).
1.2.4 Actividad oscilatoria del hipocampo
El glutamato liberado al espacio extracelular por las células
piramidales se une a sus receptores y provoca la despolarización de la
membrana de las neuronas diana. Por el contrario, el GABA típicamente
hiperpolariza dicho potencial. Por ello, el glutamato es considerado un
neurotransmisor excitatorio y el GABA inhibitorio. Cuando los
neurotransmisores activan receptores en la membrana postsináptica, se
facilitan corrientes iónicas de Na+, K+, Cl- y Ca2+ por apertura de distintos
Introducción
42
canales y receptores y como consecuencia, el potencial de membrana en
reposo varia. Estos eventos se traducen en potenciales postsinápticos
excitatorios EPSPs (del inglés Excitatory PostSynaptic Potentials) y
potenciales postsinápticos inhibitorios, IPSPs (del inglés, Inhibitory
PostSynaptic Potentials). Ambos forman parte de lo que genéricamente
se denomina potenciales de campo provocados o fPSP (del inglés, evoked
field PostSynaptic Potential). Los cambios asociados a los EPSPs y los
IPSPs son varias veces más pequeños que los asociados a los potenciales
de acción y pueden tener una duración de hasta decenas de milisegundos.
El incremento de probabilidad de apertura de canales debido a las
variaciones en el voltaje del potencial de membrana, lleva al movimiento
de iones siendo esta la fuente de flujo iónico a través de la membrana
celular. Las corrientes que fluyen en el espacio extracelular se suman con
las de neuronas circundantes generando potenciales locales. Para
simplificar la terminología el registro extracelular de la actividad
neuronal por pequeños electrodos en zonas concretas del cerebro se
denominará EEG en lugar de LFPs.
Básicamente, el EEG es la superposición de de todos los procesos
iónicos, es decir, la “media” de las corrientes de un gran número de
poblaciones neuronales (Buzsáki et al., 2012). El número de neuronas
que contribuyen al EEG varía en relación con la posición y el tamaño del
electrodo de registro. Por ejemplo, con el uso de electrodos muy finos, de
unas 50 µm, se puede registrar la actividad de decenas de miles de
neuronas vecinas. Debido a la composición del cerebro (fluido
extracelular, membranas neuronales y gliales, neuronas y vasos
sanguíneos, entre otros) actúa como una resistencia que atenúa la
corriente de propagación en el espacio extracelular. Por ello, la actividad
registrada será una media ponderada de corrientes de entrada (de
dendritas y cuerpos celulares) de neuronas cercanas al electrodo
(Buzsaki, 2006).
Finalmente, las neuronas muestran muchos más potenciales de
campo lentos que potenciales de acción rápidos en el mismo instante de
tiempo, alcanzando el umbral en diferentes momentos. Esto permite que
Introducción
43
la suma temporal de las corrientes de EPSPs y IPSPs module la activación
de poblaciones de neuronas de forma sincrónica también denominada
actividad oscilatoria o rítmica. Históricamente, la actividad rítmica ha
sido analizada y clasificada de acuerdo al análisis de frecuencia
dominante (véase ANEXO1). Se han definido arbitrariamente bandas
defrecuencias, relacionándose con estados comportamentales concretos:
Ritmo delta (0,5-3 Hz) característico del sueño, ritmo theta (4-10 Hz)
asociado a exploración y memoria de reconocimiento, ritmo alfa (10-15
Hz), observable durante cierre ocular o en la transición sueño-vigilia, y
otros ritmos rápidos como el beta (15-30 Hz) o el gamma (30-80 Hz)
asociados a otros estados de actividad cognitiva consciente (Buzsaki,
2006).
1.2.4.1 Ritmos theta y gamma hipocampal
El ritmo theta hipocampal es generado principalmente por la
interacción de PSPs, así como de la actividad en reposo de las células del
giro dentado y del área CA1 (Buzsáki et al., 2012). El ritmo theta
hipocampal representa el patrón de EEG en oscilación en una banda de
frecuencia de 4-10 Hz (Buzsaki, 2006). Aunque la función concreta del
ritmo theta no está esclarecida se ha relacionado con memoria episódica
(Colgin, 2013), discriminación de eventos novedosos (Jeewajee et al.,
2008), realización de tareas de atención, navegación (Hasselmo et al.,
2002, Colgin, 2013) y recompensa (Vega-Flores et al., 2014a). En
modelos in vitro se ha visto que el hipocampo aislado puede generar el
ritmo theta (Goutagny et al., 2009, Huh et al., 2010). Sin embargo, datos
in vivo indican que la iniciación y la modulación de este tipo de actividad
es dependiente de proyecciones colinérgicas y GABAérgicas septo-
hipocampales (Toth et al., 1997, Colgin, 2013) y recientemente también
ha sido descrita la posible intervención en el mantenimiento del mismo
por proyecciones glutamatérgicas (Huh et al., 2010). El mecanismo
propuesto como generador del ritmo theta podría derivar de la actividad
de interneuronas inhibitorias GABAérgicas septo-hipocampales. La
inhibición de interneuronas desinhibiría neuronas piramidales en el
Introducción
44
hipocampo de manera sincrónica y el input colinérgico septo-hipocampal
modularía la excitabilidad de éstas (Toth et al., 1997, Vinogradova, 2001).
Lesiones en esta vía están relacionadas con desincronización en la banda
theta de la formación hipocampal y con déficits cognitivos en tareas de
aprendizaje (Vinogradova, 2001, Villette et al., 2010, Rubio et al., 2012,
Vega-Flores et al., 2014b). Esto podría deberse a la posible implicación
del ritmo theta hipocampal en la comparación y codificación de nueva
información vs. recuerdo de la información existente (Hasselmo et al.,
2002) y podría subyacer a los déficits en tareas de aprendizaje en
pacientes con EA (Goutagny and Krantic, 2013, Kitchigina et al., 2013).
Por otro lado, en el hipocampo también se registran patrones de
actividad en la banda de frecuencia gamma (26-80 Hz). Las
interneuronas hipocampales se han propuesto como generadoras de ese
tipo de actividad oscilatoria (Buzsáki and Wang, 2012). La activación o
inhibición de interneuronas GABAérgicas parvalbúmina positivas (PV+)
incrementan o disminuyen oscilaciones gamma, demostrando su posible
implicación en la generación de las mismas (Kepecs and Fishell, 2014).
Estas poblaciones de interneuronas se localizan en el giro dentado y el
área CA3 del hipocampo (Buzsáki and Wang, 2012). Como se ha
comentado, la sincronización de neuronas piramidales hipocampales
parece estar mediada por aferentes colinérgicos y GABAérgicos septo-
hipocampales. Una característica particular de las proyecciones
GABAérgicas es su exclusiva inervación de interneuronas hipocampales.
En concreto, la actividad de éstas proyecciones sobre interneuronas
GABAérgicas PV+ podría modular el ritmo gamma hipocampal (Buzsáki
and Wang, 2012). La actividad gamma parece tener un papel relevante
en la consolidación de la memoria y la realización de tareas ejecutivas
(Buzsáki and Wang, 2012, Lisman and Jensen, 2013). Las oscilaciones en
esta frecuencia, junto con la actividad en theta, se ha propuesto como una
forma de codificación y recuperación de memoria en el hipocampo
(Hasselmo et al., 2002, Lisman and Buzsáki, 2008).
Introducción
45
1.2.4.2 Patrones de actividad neural y enfermedad de Alzheimer
Estudios previos han mostrado el registro anómalo de actividad
oscilatoria en theta y gamma tanto en pacientes (Kitchigina et al., 2013,
Vossel et al., 2013) como en modelos animales de EA (Rubio et al., 2012,
Verret et al., 2012, Goutagny et al., 2013). Las anomalías en los patrones
de actividad cerebral en pacientes con EA son diversas, y varían de
acuerdo al estado de progresión de la enfermedad (Jaeseung, 2004).
Principalmente en pacientes en etapas tempranas de EA el análisis del
poder espectral muestra un incremento de los ritmos theta y delta,
seguido de una disminución de alfa y beta en estado de reposo (Jaeseung,
2004). De hecho, se propone que los cambios tempranos en el ritmo
theta podrían utilizarse como biomarcadores de la EA (Jelic and
Nordberg, 2000, Jaeseung, 2004, Uhlhaas and Singer, 2006, Goutagny
and Krantic, 2013).
La alteración de la actividad rítmica podría estar asociada con una
disfunción en la codificación (Buzsaki, 2006, Tara et al., 2013), la
consolidación y la recuperación de la información (Colgin and Moser,
2010, Colgin, 2013). Se postula que la desincronización en la actividad
rítmica de zonas como el hipocampo podría ocurrir de manera temprana
y estar generada por un desbalance en los sistemas de excitación-
inhibición (Palop et al., 2007, Sun et al., 2009, Sanchez et al., 2012,
Verret et al., 2012, Goutagny and Krantic, 2013) pudiendo subyacer a los
déficits sutiles de memoria de las etapas iniciales de la EA (Verret et al.,
2012, Kitchigina et al., 2013, Peña-Ortega, 2013).
1.3 Canales de K+ rectificadores de corriente de entrada activados por proteína G, GirK
Los canales GirK, también conocidos como Kir3.x, pertenecen a la
familia de canales de K+ rectificadores de corriente de entrada, Kir (del
ingés, K+ Inwardly Rectifying, Figura 4). En mamíferos, la subfamilia
GirK está compuesta por cuatro miembros denominados de GirK1-4 (ó
Kir3.1-4). Las subunidades están codificadas por los genes KCNJ3
Introducción
46
(GirK1; 2q24), KCNJ6 (GirK2; 21q22), KCNJ9 (GirK3; 1q21) y KCNJ5
(GirK4; 11q24)3. También se han descrito 4 isoformas de la subunidad 2,
GirK2A-D, productos del proceso de splicing alternativo que difieren en
el extremo C-terminal del dominio citosólico, y son específicas de tejido y
tipo celular (Hibino et al., 2010).
La función de los canales GirK se relaciona con el mantenimiento del
potencial de membrana en reposo. En condiciones fisiológicas, el
potencial en reposo de una neurona típica es cercano al potencial de
equilibrio del K+ (EK). Este potencial es dependiente del flujo pasivo de K+
por canales de fuga, y el flujo activo por la bomba Na+/K+ ATPasa. En la
neurona, se generan corrientes iónicas con tendencia a generar
potenciales de membrana positivos, por lo que las pequeñas corrientes
rectificadoras de K+ regulan y mantienen más negativo el potencial de
membrana en reposo, modulando la excitabilidad celular.
La actividad basal de los canales GirK contribuye al potencial de
membrana en reposo modificando el potencial voltaje aproximadamente
en unos -8 mV (Lüscher et al., 1997, Stanfield et al., 2002). Los canales
GirK, al igual que el resto de miembros de la familia Kir, son
independientes de voltaje dado que carecen del sensor de voltaje S4. La
regulación de la actividad de GirK es dependiente de la unión de
proteínas G de complejos proteicos asociados a receptores de membrana,
GPCRs. Por otro lado, el flujo iónico está regulado por sustancias
intracelulares como el Mg2+ o distintas poliaminas que se sitúan en el
poro del canal, por lo que otros mecanismos de regulación de la actividad
de dichos canales serán factores que movilicen estas moléculas del poro
(Hibino et al., 2010). Los canales GirK, se encuentran en una gran
variedad de células, entre ellas células cardiacas, sanguíneas,
osteoclastos, células endoteliales, epiteliales, oocitos, células gliales y
neuronas (Hibino et al., 2010).
3 Nomenclatura y localización cromosómica en humano (base de datos consultada: Comité de nomenclatura del Genoma Humano, HGNC. http://www.genenames.org/cgi-bin/genefamilies/set/276).
Introducción
47
1.3.1 Composición y distribución de canales GirK en el SNC
Diferentes combinaciones de las cuatro subunidades de GirK
contribuyen de forma específica a la función del canal y a su distribución
celular y regional. En el SNC, los canales son tetrámeros formados
principalmente por las subunidades GirK1, GirK2 y GirK3 quedando la
expresión de GirK4 restringida a áreas y tipos neuronales muy concretos.
El heterotetrámero GirK1/2 parece ser el más abundante (Koyrakh et al.,
2005a). Los heterotetrámeros GirK2/3 se expresan también ampliamente
y tienen similar actividad que otros canales, sin embargo son menos
sensibles a la activación por subunidades de proteína G de tipo Gβγ
comparada con los tetrámeros que contienen subunidades de GirK1
(Jelacic et al., 2000). Esto podría ser indicativo de las distintas funciones
de cada subunidad dentro del canal. Por ejemplo, ratones knockout de
Figura 4. Árbol filogenético de la familia de canales de K+rectificadores de corriente de entrada, Kir. En humano, hay 15 miembros conocidos, agrupados por homología de secuencia de aminoácidos, divididos en cuatro familias funcionales. Se presenta la nomenclatura de acuerdo a la Unión de Farmacología y el HGNC. Imagen adaptada de: Inwardly rectifying potassium channels, introduction. IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology. IUPHAR, The International Union of Basic and Clinical Pharmacology ; BPS, British Pharmacological Society. Última actualización de la base de datos el 22/01/2015. Accedida el 22/11/2015. http://www.guidetopharmacology.org/GRAC/FamilyIntroductionForward?familyId=74
Introducción
48
GirK2 (Signorini et al., 1997). En estos modelos la expresión de GirK1 se
ve muy reducida, por lo que GirK1 podría no dar lugar a homotetrámeros
funcionales como consecuencia de la falta de secuencia de movilización
del retículo endoplásmico rugoso. Dicha secuencia reguladora del tráfico
del canal hacia membrana estaría localizada en las subunidades GirK2 y
GirK4 (Ma et al., 2002). Pese a que GirK3 se expresa ampliamente en el
SNC, su relevancia funcional como parte del canal es desconocida y
podría tener una función, junto con la variante de splicing GirK2c, en el
tráfico intracelular del canal hacia vías de degradación lisosomal debido a
que contiene en su estructura un dominio del tráfico al lisosoma (Ma et
al., 2002).
Técnicas inmunohistoquímicas y de hibridación in situ en roedores
han permitido dilucidar patrones de expresión y colocalización de
subunidades de GirK 1-3 en varias áreas y tipos neuronales del SNC. Se
han localizado en neuronas piramidales glutamatérgicas de CA1, CA3 y
células granulares del giro dentado (Lüscher et al., 1997, Grosse et al.,
2003, Kulik et al., 2006), GABAérgicas PV+ del hipocampo y del córtex
cerebral, en neuronas colinérgicas de la banda diagonal, y en neuronas
serotoninérgicas del núcleo dorsal del rafe (Saenz del Burgo et al., 2008).
También se localizan en neuronas dopaminérgicas del área tegmental
ventral y de la sustancia negra (Cruz et al., 2004, Michaeli and Yaka,
2010) y noradrenérgicas del locus ceruleus (Torrecilla et al., 2013). La
localización en estas poblaciones neuronales, así como su presencia en
zonas como el bulbo olfatorio, amígdala, tálamo y cerebelo, hacen que la
función fisiológica de GirK sea relevante en vías relacionadas con la
regulación de la nocicepción, analgesia, la homeostasis energética,
actividad motora y coordinación, el sistema de recompensa y el estado de
ánimo (Lüscher and Slesinger, 2010). Por otro lado, técnicas de
microscopía electrónica han permitido localizar a nivel subcelular
subunidades GirK. En las neuronas piramidales de CA1 del hipocampo,
GirK1-2 se localiza a nivel postsináptico tanto en el dominio de densidad
sináptica (PSD) como en sitios extrasinápticos. GirK2-3 podrían estar
formando canales a nivel presináptico en terminaciones axónicas
Introducción
49
excitadoras, lo que demostraría su asociación con sinapsis
glutamatérgicas del hipocampo (Koyrakh et al., 2005a, Kulik et al., 2006,
Fernandez-Alacid et al., 2011). Además, GirK3 se ha localizado en
terminales de interneuronas de CA3 (Grosse et al., 2003) y en
interneuronas de CA1 (Booker et al., 2013), sugiriendo el papel de los
canales en la modulación de la actividad y el procesamiento de la
información en los circuitos del hipocampo.
La subunidad GirK4 se encuentra en menor proporción en neuronas
piramidales de CA3 y CA1 del hipocampo y en células granulares del giro
dentado asociado a otras subunidades de GirK (Spauschus et al., 1996).
También en poblaciones del subículo y la corteza entorrinal, cerebelo,
bulbo olfatorio, ganglios basales y en el hipotálamo ventromedial
(Wickman et al., 2000, Aguado et al., 2008).
Teniendo en cuenta localización diferencial de GirK en dendritas
apicales y basales de las neuronas piramidales de CA3 y CA1 (Kirizs et al.,
2014, Degro et al., 2015) y dada la presencia de GirK tanto en vías
excitatorias como inhibitorias, podrían estar implicados en la integración
de la información dendrítica y en procesos de plasticidad sináptica
(Higley, 2014). Por ello, la desregulación de su actividad podría llevar el
sistema hacia un estado de disfunción comprometiendo la función
normal de zonas como el hipocampo, afectando al procesamiento de la
información en procesos cognitivos como el aprendizaje y la memoria
(Lüscher and Slesinger, 2010, Luján et al., 2014, Nava-Mesa et al., 2014).
1.3.2 Mecanismos de activación/inactivación de GirK
La actividad de los canales GirK regula el flujo de iones K+ al espacio
extracelular y genera corrientes inhibitorias lentas controlando la
excitabilidad neuronal mediante hiperpolarizaciones de la membrana.
La activación de GirK implica la presencia de factores intrínsecos
como Mg2+, Na+ y fosfatilinositol 4,5 bifosfato (PIP2) y subunidades de
proteínas G de la familia Gi/o (Figura 5). Las subunidades de proteínas G
están asociadas a receptores GPCRs del tipo GABAérgico B1-2,
dopaminérgico D2 y D4, adrenérgico M2, serotoninérgico 5-HT1A,
Introducción
50
opioide µ, δ y Κ, y adrenérgico A1 (Hibino et al., 2010). La unión de los
neurotransmisores a este tipo de GPCRs promueve la activación de
proteínas G de la familia Gi/o asociadas a GirK (Figura 5). Una vez unido
el agonista, la subunidad Gα reemplaza GDP por GTP, disociándose de la
subunidad Gβγ, la cual se une directamente a subunidades de GirK en
varios sitios de los dominios N- y C- terminal (Nishida and MacKinnon,
2002). La interacción es estabilizada por PIP2 y Na+ siendo regulada a su
vez por proteínas reguladoras de proteína G, RGS (del inglés Regulators
of G protein Signaling). Estas proteínas regulan la aceleración de la
actividad GTPasa de la subunidad Gα y, por lo tanto, la disponibilidad
celular de subunidades activas-inactivas de proteína G. Están implicadas
en la regulación de la cinética de activación-inactivación de GTPasas,
desensibilización del receptor y tiempo de apertura del canal (Figura 5).
Por ejemplo, la interacción de la proteína RGS7 con GirK vía receptores
GABAB en las neuronas piramidales del hipocampo (Fajardo-Serrano et
al., 2013, Ostrovskaya et al., 2014). La señal termina cuando Gα-GTP es
hidrolizado a Gα-GDP, y la subunidad Gβγ se disocia del canal y se une
de nuevo a Gα para formar el trímero de la proteína Gi/o (Figura 5).
Estudios de cristalografía de la subunidad GirK2, así como estudios
previos de estructura de la subunidad GirK1 y el homólogo procariota
kir3.1-Bac, han permitido determinar los sitios de interacción con las
subunidades Gβγ, PIP2 y el Na+ intracelular (Figura 5). Con base en estos
estudios se ha modelizado el mecanismo de apertura-cierre del canal,
observando un estado de pre-apertura, que sería una conformación
intermedia entre la conformación cerrada y la conformación abierta
derivado de interacciones de las 4 subunidades del canal con iones Na+ y
PIP2 (Whorton and MacKinnon, 2011, Whorton and MacKinnon, 2013).
Por otro lado, GPCRs del tipo colinérgico muscarínico M1 y M2, de
sustancia P, adrenérgicos A1, liberadores de la hormona tirotropina,
bombesina y receptores de endotelina, pueden inhibir la actividad de
GirK por unión de subunidades del tipo Gαq (Figura 5). La activación de
GPCRs acoplados a proteínas Gq/11 estimularían a la fosfolipasa C (PLC),
la cual a su vez llevaría a la activación de la proteína quinasa C (PKC) y a
Introducción
51
la ruptura de PIP2 por lo que la actividad del canal se vería reducida (Cho
et al., 2005). La inactivación producida por PKC podría ser promovida
por fosforilación de aminoácidos específicos de las subunidades de GirK1
y GirK4 (Mao et al., 2004). Otros moduladores citosólicos de GirK
pueden incluir tirosinas kinasas, como proteína quinasa A (PKA),
calmodulina dependiente de Ca2+ quinasa (CaMKII) o la proteína
fosfatasa 1 (PPI) (Luján et al., 2009).
Los distintos mecanismos de modulación de la actividad de GirK, así
como las cascadas de señalización celular en los cuales estarían
implicados, junto con los datos que muestran su distribución selectiva a
nivel celular y regional, sugieren un control diferencial de la transmisión
sináptica y un papel relevante en la integración de la información
dendrítica y la plasticidad sináptica en áreas como el hipocampo.
Introducción
52
Figura 5. Estructura y rutas de transducción de señales de los canales GirK. A. Estructura del complejo GirK- Gβγ. GirK (azul), Gβ (rojo) and Gγ (verde) unidos al dominio C-y N-terminal respectivamente. La interacción de PIP2 (sticks amarillos intramembrana) y el Na+ citosólico (esfera morada), permiten la apertura del canal, y el flujo iónico de K+. El dímero frontal se ha obviado para mayor claridad en la imagen. B. Representación esquemática de la activación del los canales GirK. Los agonistas se unen a los GPCRs, promoviendo dentro de la proteína G el cambio de GDP a GTP. Esto causa la disociación de la proteína G en varios complejos: la subunidad Gβγ y Gα. La subunidad Gβγ se une al dominio citoplasmático de las subunidades de GirK en presencia de PIP2 y Na+ intracelular. C. Rutas de señalización de los canales GirK. La activación de GPCRs acoplados a proteínas G tipo Gi/o, lleva a la activación del canal GirK por unión de Gβγ. La actividad de PKA y PP2A también los activan. La activación de GPCRs acoplados a proteínas G tipo Gq/11 disminuyen la actividad de GirK, a través de la activación de PKC, mientras que PLC, disminuye PIP2 activando GirK. También, varias proteínas moduladores de proteínas G (RGS) regulan la actividad de GirK. Imagen adaptada de (Luján et al., 2009, Whorton and MacKinnon, 2013). Extracel./Intracel.: Medios extra e intracelular.
Introducción
53
1.3.3 Canales GirK, excitabilidad neuronal y transmisión sináptica
La especificidad en la localización de los canales GirK en
compartimentos neuronales y la amplia variedad de mecanismos de
regulación de su actividad, sugieren un papel de estos canales en la
modulación de la transmisión sináptica, por lo que la actividad de los
mismos podrían ser de relevancia sobre la integración de la información
por regulación de input excitatorios e inhibitorios en las células donde se
encuentran (Sodickson and Bean, 1996, Koyrakh et al., 2005a, Higley,
2014). En tejidos nativos la actividad de los canales GirK en ausencia de
la activación del neurotransmisor es baja. La actividad basal de GirK
contribuye al potencial de membrana en reposo aproximadamente en
unos -8 mV (Lüscher et al., 1997, Stanfield et al., 2002). La activación
fisiológica de GirK, por distintos mecanismos descritos en la sección
anterior, generan un flujo iónico de K+, que llevaría a la célula a
potenciales de membrana más negativos que el del K+ hiperpolarizando la
membrana de la neurona y disminuyendo la excitabilidad neuronal. En
neuronas piramidales de CA1 se ha registrado actividad basal sin previa
activación del receptor GABAB, aunque tras la activación del mismo,
dicha actividad aumenta (Chen and Johnston, 2005). Este hecho también
ha sido descrito en neuronas noradrenérgicas del locus ceruleus
(Torrecilla et al., 2013). La activación de proteínas Gi/o acopladas a
GPCRs generan respuestas sinápticas inhibitorias lentas, sIPS, que
reducen la excitabilidad de la neurona vía regulación de la frecuencia de
disparo controlando la transmisión de la información. En concreto, los
canales GirK localizados en sinapsis glutamatérgicas podrían activarse
tras respuestas postsinápticas excitatorias, contrarrestando la respuesta
por hiperpolarización de la membrana postsináptica participando en la
homeostasis neuronal (Lüscher et al., 1997, Takigawa and Alzheimer,
2002) (Figura 6). Este podría ser un mecanismo de control espacio-
temporal de la neurotransmisión excitatoria, a través del sistema
GABAérgico, GABAB-GirK (Kulik et al., 2006, Higley, 2014). Por ello, la
disfunción de GirK podría llevar a la alteración de la excitabilidad
Introducción
54
neuronal, por exceso o por defecto de hiperpolarización. Dichas
alteraciones podrían relacionarse con patologías como la epilepsia o el
síndrome de Down. En este sentido, modelos de ratón knockout con
pérdida de función de GirK2 muestran convulsiones espontáneas y
actividad epileptiforme (Signorini et al., 1997). Por otro lado, modelos de
ratón con GirK2 duplicado que se asemejan a fenotipos de síndrome de
Down, Ts65Dn ó Ts1CjeDS, muestran un largo IPSC mediado por
receptores GABAB postsinápticos (Best et al., 2012). Además, en estos
modelos también hay alteración de la trasmisión sináptica, inhibición de
la LTP y aumento de la LTD hipocampales (Cramer and Galdzicki, 2012),
formas de plasticidad sináptica a largo plazo.
De forma similar a la provocada por protocolos de estimulación de
LTP dependiente de NMDA en la neurotransmisión glutamatérgica de
Figura 6. Representación esquemática del posible papel de los canales GirK en la integración de la información en espinas dendríticas de neuronas piramidales que reciben tanto inputs excitatorios como inhibitorios. Los receptores ionotrópicos GABAA y metabotrópicos, GABAB, regularían señales Ca2+, como el potencial de membrana (Vm) a través de la regulación de receptores ionotrópicos de glutamato de tipo AMPA y NMDA. Canales de Ca2+ dependientes de voltaje, VGCCs. AC, adenil ciclasa; cAMP, AMP ciclíco; PKA, proteína kinasa A; [K+]i, concentración intracelular de K+. Adaptada de (Higley, 2014).
Introducción
55
CA1, las corrientes inhibitorias mediadas por GirK también pueden
potenciarse. Este proceso sería dependiente de la activación de receptores
NMDA y CaMKII, e implicaría la inserción en membrana de subunidades
de GirK, pudiendo ser un mecanismo de modulación de la excitabilidad
neuronal a través de GABAB-GirK (Huang et al., 2005). En cultivos de
neuronas hipocampales, se ha visto que este incremento en membrana
dependiente de la activación de NMDA sería promovido por la
defosforilización de GirK2 por la proteína fosfatasa 1 (PP1) reinsertando
subunidades de GirK en la membrana (Chung et al., 2009).
La activación de GirK está relacionada con el control de pequeños
potenciales postsinápticos espontáneos tanto de origen postsináptico
como presináptico. Por ejemplo, en el córtex, se ha mostrado la
implicación de los canales GirK en la liberación de neurotransmisor
glutamato (Ladera and Godino, 2008, Meneses et al., 2015), y en el área
tegmental ventral su posible papel en la regulación de la liberación de
GABA (Michaeli and Yaka, 2010). En neuronas piramidales de CA1, se
han localizado en la membrana extrasináptica de las terminaciones
axónicas excitadoras, lo que podría ser un posible mecanismo de control
de la sinapsis glutamatérgicas en el hipocampo por modulación de la
liberación de neurotransmisor (Kulik et al., 2006, Fernandez-Alacid et
al., 2011, Cabezas et al., 2012), además de por hiperpolarización
postsináptica (Lüscher et al., 1997, Takigawa and Alzheimer, 2002).
Finalmente, en relación al control de la excitabilidad neuronal, un
punto de interés actual es el posible papel de GirK en el control de la
actividad rítmica de zonas como el hipocampo. En el hipocampo, la
generación de IPSPs es fundamental para el control de la actividad
rítmica característica de esta zona (Scanziani, 2000, Nicoll, 2004). En
otras zonas, como en poblaciones de neuronas talámicas, la corriente
inhibitoria lenta, mediada por receptores GABAB, estaría asociada a la
oscilación talámica característica de 3-5 Hz, con un doble control tanto en
la liberación de neurotransmisor, como en la activación de canales GirK
postsinápticos (Sun et al., 2002, Meneses et al., 2015). A través de
mecanismos similares podrían modular oscilaciones gamma el
Introducción
56
hipocampo por activación de varios tipos de GPCRs, como los de
adenosina A1 (Pietersen et al., 2009), receptores 5HT1A (Johnston et al.,
2014) o NMDA (Tatard-Leitman et al., 2015).
Por ello, dado el papel de los canales GirK en la neurotransmisión
excitatoria e inhibitoria, la integración de la información sináptica, y la
excitabilidad neuronal los hacen una diana potencial para la comprensión
de la génesis o la susceptibilidad del desarrollo de varias patologías como
el Parkinson o el Alzheimer. En este contexto, el uso de líneas de ratones
condicionales transgénicos para canales de GirK ó Knockout de GirK con
especificidad celular son necesarios para determinar la función de GirK
en estas rutas de señalización. Además, la manipulación con distintos
fármacos, agonistas o antagonistas de GirK, es un punto de interés para el
estudio de procesos fisiológicos y de comportamiento asociados a
patologías, siendo dianas de interés para una intervención terapéutica
(Luján, 2010, Nava-Mesa et al., 2014).
57
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Hipótesis y Objetivos
59
Actualmente no existe consenso en cuanto a cómo el Aβ altera la
fisiología de neuronas, sinapsis, redes y sistemas de áreas concretas del
cerebro, ni de cómo estas alteraciones derivan en la aparición de los
déficits cognitivos asociados a la EA. No obstante, una de las hipótesis
más relevantes es el efecto de Aβ sobre los sistemas de neurotransmisión
excitatoria e inhibitoria en zonas como el hipocampo, dado que es de las
primeras áreas en verse afectadas y entre sus funciones destacan su
implicación en los procesos de aprendizaje y memoria. Estudios previos
del laboratorio han aportado evidencias sobre los efectos de la exposición
aguda a Aβ soluble sobre la función de algunos canales de potasio
implicados en el mantenimiento de la excitabilidad neuronal en el
hipocampo. Los canales GirK regulan el potencial de membrana en
reposo y median corrientes postsinápticas inhibitorias, participando así
en el procesamiento de la información en zonas como el hipocampo, y se
ha visto que el Aβ podría estar afectando a su funcionamiento (Nava-
Mesa et al., 2013). Con todo ello, nuestra hipótesis de trabajo ha sido
la siguiente: El Aβ podría alterar los circuitos del hipocampo a través de
la modificación de la actividad de los canales GirK. La disfunción de los
canales GirK generaría un desbalance entre los sistemas de
neurotransmisión afectando a procesos de plasticidad sináptica. Estas
modificaciones podrían subyacer a los déficits de memoria asociados a las
primeras etapas de la EA.
Por ello, el objetivo principal de esta tesis ha sido estudiar a nivel
molecular, electrofisiológico y comportamental los posibles mecanismos
por los cuales Aβ podría estar afectando a los canales GirK en modelos de
estudio de las etapas tempranas de EA.
Este objetivo principal se ha subdividido en los siguientes objetivos
específicos:
1. Determinar el efecto del Aβ sobre la expresión génica de distintas
subunidades de receptores y canales que participan en vías de
neurotransmisión excitatoria e inhibitoria del hipocampo en un
modelo in vitro de EA.
Hipótesis y Objetivos
60
2. Determinar el efecto del Aβ y la posible implicación de los canales
GirK en la transmisión sináptica basal, así como en procesos de
plasticidad sináptica a corto y largo plazo del hipocampo en un
modelo in vivo de etapas tempranas de EA.
3. Determinar el efecto del Aβ y la posible implicación de los canales
GirK en la actividad rítmica del hipocampo en un modelo in vivo de
etapas tempranas de EA.
4. Determinar el efecto de Aβ y la posible implicación de los canales
GirK en procesos de aprendizaje y memoria dependientes de
hipocampo en un modelo in vivo de etapas tempranas de EA.
61
3. MATERIAL Y MÉTODOS
62
Todos los experimentos se han llevado a cabo de acuerdo a Comité ético
para el uso de animales de laboratorio de la Universidad de Castilla-La
Mancha siguiendo la guía del Consejo de la Comunidad Europea
(European Communities Council guidelines;86/609/EEC) y la
regulación española (BOE 252/34367-91, 2005) para el uso de animales
de laboratorio en estudios crónicos.
Material y Métodos
63
3.1 Incubación con Aβ y cuantificación de niveles de RNA de receptores y canales en rodajas de hipocampo de rata
El estudio de los efectos del Aβ sobre patrones de expresión génica
en un modelo in vitro de hipocampo de rata fue realizado mediante la
técnica de PCR cuantitativa en tiempo real. Se han analizado los niveles
de RNA de receptores y canales implicados en vías de neurotransmisión
excitatoria e inhibitoria del hipocampo (Tabla 1).
3.1.1 Obtención de muestras de tejido nervioso hipocampal
3.1.1.1 Animales de experimentación
Los experimentos fueron realizados en rodajas de hipocampo de
ratas Wistar de 50-100 gramos (P23-33), de ambos sexos, enviados desde
el animalario de la Universidad de Valladolid. Tras su llegada, los
animales se separaron en cajas individuales y fueron mantenidos en
ciclos de 12h luz/oscuridad a temperatura (21.5 ± 1ºC) y humedad (55 ±
8%) constantes. La comida y el agua estaban disponibles ad líbitum.
3.1.1.2 Aislamiento del cerebro
Los animales se sacrificaron por decapitación e inmediatamente se
procedió a la extracción de cerebro. La piel se diseccionó para que el
cráneo quedara expuesto, y se retiró hueso craneal con ayuda de una
gubia, hasta que quedaron al descubierto los lóbulos olfatorios, los
hemisferios cerebrales y la mayor parte del cerebelo. Durante todo el
procedimiento, y con la finalidad de preservar en condiciones óptimas el
tejido, el cerebro se mantuvo constantemente húmedo y frío (entre
2-4°C) mediante la aplicación con una pipeta Pasteur gota a gota, de
solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, artificial
cerebrospinal fluid) modificado (Tabla 2) burbujeado con gas carbógeno
(95% O2; 5% CO2).
Material y Métodos
64
Tabla 1. Genes de estudio.
Material y Métodos
65
Una vez se extrajo el encéfalo, se seccionó el nervio óptico y el tallo
cerebral, y se sumergió en ACSF modificado mantenido entre 2-4°C,
también burbujeado con gas carbógeno. Transcurrido ese tiempo, se
procedió al tallado y a la obtención de rodajas de hipocampo de acuerdo
al atlas de (Paxinos and Watson, 2006).
3.1.1.2.1 Soluciones de perfusión
Se emplearon dos tipos de soluciones. Desde la decapitación del
animal hasta la obtención de las rodajas se utilizó ACSF modificado. Para
la incubación se utilizó ACSF normal (Tabla 2).
En todo momento, las soluciones se burbujearon con gas carbógeno
con el fin de mantener adecuados el aporte de oxígeno y el pH de las
mismas (pH 7.2). Todos los productos utilizados en la elaboración de
las soluciones fueron de la marca comercial Sigma (Reino Unido). La
disminución de la concentración de Na+ en ACSF modificado tuvo como
finalidad minimizar la entrada del mismo al interior celular y, por tanto,
la despolarización de las neuronas, sobre todo durante la obtención de los
cortes. Por otra parte, la sustitución de NaCl por sacarosa a una
concentración de 205 mM tuvo como objetivo conservar la osmolaridad
total de la solución.
ACFS Normal (mM) pH = 7.1 – 7.3
ACSF Modificado (mM) pH = 7.1 – 7.3
NaCl 119.00 KCl 2.50 2.50 CaCl2 2.50 2.50 MgCl2 1.50 1.50 NaH2PO4 1.25 1.25 Glucosa 11.00 11.00 NaHCO3 25.00 25.00 Sacarosa 205.00
Tabla 2. Composición del ACSF empleado en la obtención e incubación de las rodajas de hipocampo de rata.
Material y Métodos
66
3.1.1.3 Obtención de las rodajas de hipocampo
Tras el aislamiento de cerebro, rápidamente se realizó el tallado de la
pieza. Para ello, el cerebro se situó sobre una placa de Petri agregando
continuamente ACSF modificado burbujeado con carbógeno, como se ha
descrito anteriormente. Con una cuchilla se realizó un primer corte
perpendicular a la línea antero-posterior del cerebro, a nivel del quiasma
óptico seguido de un segundo corte, paralelo al anterior, a nivel del
colículo inferior. El bloque se apoyó por la parte anterior y se realizó un
tercer corte paralelo a la línea antero-posterior, del 10-20% del volumen
total de la parte más dorsal del cerebro. El bloque final obtenido se fijó
con cianocrilato (Ceys SA, España) sobre una base de aluminio por la
parte dorsal, quedando la parte anterior cortical orientada hacia la
cuchilla del vibratomo. Se obtiene de esta forma el llamado “corte
mágico” del hipocampo (Bischofberger et al., 2006) conservando en unas
condiciones óptimas los circuitos hipocampales en la rodaja. La pieza se
rodeó con bloques de agar al 2 % de unos 5 mm aproximadamente de
espesor y de su misma altura. Los bloques de agar sirvieron para que
durante el corte de la pieza no se desplazara el tejido nervioso. A
continuación utilizando un vibratomo (Micro 7002 SMZ, Reino Unido) se
realizaron cortes horizontales de 300-350 μm de espesor conteniendo el
hipocampo en ambos hemisferios. De cada cerebro tallado se obtuvieron
10-14 muestras de hemisferio cerebral. Los cortes se recogieron en una
placa de Petri y se mantuvieron en ACSF modificado entre 3-4ºC,
burbujeado con carbógeno. Se diseccionó el hipocampo de cada
hemisferio bajo control visual con una lupa (Figura 7). Las rodajas de
hipocampo, se recogieron y se preincubaron, durante al menos diez
minutos desde la disección de la última rodaja, en una placa de Petri con
ACSF normal burbujeado con gas carbógeno a Tª ambiente.
3.1.1.4 Incubación de las rodajas de hipocampo con Aβ
La rodajas de hipocampo se incubaron en condiciones control (en
ACSF normal) y en presencia de Aβ25-35 1 µM (Tocris, Reino Unido). En
ambos casos, las incubaciones se realizaron a distintos tiempos (0, 30 y
Material y Métodos
67
120 min; Figura 7). Tiempo cero significó que no hubo incubación, ni en
ACSF ni con Aβ.
3.1.2 Extracción y purificación del RNA total
La extracción y aislamiento del RNA total de las rodajas de
hipocampo se llevó a cabo usando Trizol (Invitrogen, Reino Unido) y
columnas de homogeneización Qiashredder (Qiagen, Alemania).
Seguidamente, se realizó la purificación del RNA con el Kit de
purificación por columna RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemania). Además,
se llevó a cabo un tratamiento adicional con DNasa I (Qiagen, Alemania),
para eliminar la posible contaminación por DNA y maximizar la pureza
del RNA. Tras la obtención del RNA total de cada rodaja se procedió a la
cuantificación del mismo, midiendo en un espectrofotómetro para
pequeños volúmenes a 260 nm (Nanodrop 2000c, ThermoScientific,
EEUU.), obteniendo los datos de la concentración (ng/µl) del RNA total
de cada muestra. A continuación se analizó la calidad del RNA, por
Figura 7. Obtención e incubación de rodajas de hipocampo. A. Disección de la zona del hipocampo de cada hemisferio cerebral (líneas negras punteadas). B. Representación esquemática del procedimiento de incubación de las rodajas de hipocampo. El tratamiento control corresponde a la incubación en ACSF normal. El tratamiento Aβ corresponde a la incubación con Aβ 1 µM en ACSF normal. Las rodajas se incubaron durante 30 ó 120 min. En tiempo cero las rodajas de hipocampo no tuvieron tratamiento. La incubación se realizó a Tª ambiente y en todos los casos las rodajas se mantuvieron burbujeadas con gas carbógeno. DG: Giro dentado. LEnt: Entorrinal lateral. L: Lateral. C: Caudal. ACSF: Líquido cefalorraquídeo artificial.
Material y Métodos
68
estudio de la pureza e integridad del RNA obtenido, utilizando el sistema
de análisis de calidad por electroforesis automatizada Experion System
(Bio-Rad, EEUU.). Este procedimiento fue realizado por la Unidad de
Genómica del Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”
(IPBLN, España). La integridad y la pureza del RNA vienen indicadas por
el RQI (RNA Quality Indicador) que es un dato numérico entre 10 (RNA
intacto) y 1 (RNA altamente degradado). En los estudios de expresión
génica únicamente se incluyeron muestras con RQI iguales o mayores 7.5
(82.5 % de las muestras; véase sección 4.1.1.1).
3.1.3 Transcriptasa Reversa-PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
Los niveles de RNA de los genes diana y de referencia fueron
cuantificados por RT-qPCR. En la transcripción reversa (RT, reverse
transcription) el RNA total de cada muestra se transcribe a cDNA. Este
cDNA es copiado (proceso denominado amplificación) y cuantificado por
detección de fluorescencia en cada etapa de amplificación (de ahí el
término, cuantitativa en tiempo real). El tipo de sonda utilizada en este
estudio fue TaqMan (Applied Biosystems, EEUU.). La utilización de
sondas TaqMan nos permitió aumentar la especificidad en las qPCR dado
que estas sondas son exclusivas, por homología de secuencia, para cada
gen de interés. La fluorescencia es emitida y detectada en el proceso de
copia del gen.
3.1.3.1 RT: Síntesis de cDNA a partir del RNA total
La síntesis de cDNA a partir de RNA se realizó mediante la técnica
de retrotranscripción (RT) en dos etapas. En la primera etapa, se
agregaron cantidades iguales de 0.198 μg de RNA total, random
nonamers 2 µM (Sigma, Reino Unido), oligo dT20 1 µM (Promega, EEUU)
y dNTPmix (mezcla de los cuatro dNTPs) 0.5 µM, (Promega, EEUU) en
un volumen final de 13 µl, y se mantuvieron en el termociclador (T-
profesional, Biometra, Alemania) durante 5 min a 65°C. Seguidamente se
depositaron las muestras en hielo durante 5 min. En la segunda etapa se
Material y Métodos
69
llevó a cabo la retrotranscripción añadiendo a la mezcla anterior Buffer
First-Strand 5X (Invitrogen, Reino Unido), DTT 0.1 M Inhibidor de
ribonucleasa 40 unidades/µl (Promega, EEUU) y Superscript TM III RT
(Invitrogen, Reino Unido) en un volumen final de 20 µl. Las condiciones
que se siguieron en el termociclador fueron de 25°C durante 5 min, 50°C
durante 50 min y 70°C durante 15 min. El cDNA sintetizado se almacenó
a -20ºC hasta el momento de su utilización.
Se incluyeron dos tipos de reacciones control de detección de
contaminantes externos: Reacciones con muestras de RNA sin
transcriptasa sustituyendo el volumen correspondiente de Superscript
TM III RT por agua libre de RNAasas (muestras NRT, sin enzima de
retrotranscripción, de detección de contaminación por DNA genómico).
Reacciones sin muestras de RNA, sustituyendo el volumen
correspondiente de muestra de RNA por agua libre de RNAasas
(muestras NTC-RT, No Template Control-RT: sin RNA diana que
amplificar, nos permitió detectar los posibles productos degradados). En
ninguno de los casos esperaríamos encontrar productos de amplificación,
indicándonos que únicamente se ha transcrito el RNA diana.
3.1.3.2 qPCR: Cuantificación del RNA
Las qPCRs se realizaron por duplicado para 5 replicados biológicos
(5 animales) en cada una de las condiciones experimentales. Se llevaron a
cabo en el equipo AΒI 7900 Fast Real-Time PCR system (Applied
Biosystems, EEUU.) utilizando cantidades iguales de cDNA, TaqMan
Fast Universal Master Mix (2x) no AmpErase UNG y TaqMan Gene
Expression Assays (20X) (Applied Biosystems, EEUU.) para los genes
diana y de referencia (Tabla 3), en un volumen final de 20 µl por
reacción. Las condiciones que se siguieron en el termociclador fueron de
un ciclo de 20 s a 95 °C, 40 ciclos de 3 s a 95°C y un ciclo de 30 s a 60 °C.
Se incluyeron los controles negativos de la RT (denominadas
muestras NRT y NTC-RT), así como nuevas reacciones de control
negativo de amplificación para la qPCR. Se sustituyó el cDNA diana por
agua libre de RNasas/DNasas (NTC-qPCR, No Template Control-qPCR).
Material y Métodos
70
Estos controles nos permitieron detectar posibles degradaciones de la
sonda. Ningún producto de amplificación fue detectado en los diversos
controles negativos indicando que tanto los productos de la RT como de
la qPCR no estaban ni contaminados ni degradados.
Tabla 3. Primers utilizados.
Material y Métodos
71
3.1.3.3 Cuantificación del RNA por el método del Cq comparativo
La cuantificación de los niveles de RNA de los genes de receptores y
canales de estudio se ha llevado a cabo por el método del Cq4
comparativo. Los valores Cq fueron obtenidos de los gráficos de
amplificación de las reacciones de qPCRs para cada gen de estudio, tanto
genes diana como de referencia. En la obtención de los datos se ajustó el
nivel de línea base y el nivel de threshold se mantuvo automático.
Únicamente se han ajustado los niveles del threshold en aquellos casos en
los que se han comparado Cq de genes diana con curvas estándar
similares (Nolan et al., 2006). El método del Cq comparativo consistió en
la normalización de los valores Cq de cada gen diana en cada condición
experimental con los valores Cq del gen de referencia más estable (véase
sección 5.1.1.1.2) de acuerdo al método 2-∆Cq (Livak and Schmittgen,
2001) siguiendo las indicaciones del fabricante (Applied Biosystems:
User Bulletin 2). Los cambios en los niveles de expresión génica se
representaron como el porcentaje relativo de expresión génica en
condiciones control y en presencia de Aβ, en 30 y 120 min de incubación
con respecto al tiempo cero (t=0, expresión génica basal).
3.1.3.3.1 Validación de los genes de referencia
Con el objetivo de llevar a cabo un procedimiento estandarizado y
reproducible para comparar posibles cambios en los niveles relativos de
expresión génica inducidos por la presencia de Aβ se analizó la validez y
la estabilidad de tres genes de referencia: Actb, Ppia y Gapdh en nuestras
condiciones experimentales (diferentes tratamientos, distintos tiempos
de incubación). En primer lugar se realizó un análisis de los Cq. Se
transformaron en valores relativos de acuerdo al método 2-∆Cq (Livak and
Schmittgen, 2001), normalizándose con el tiempo cero (t=0, expresión
4Cq: ciclo de PCR en el cual el cDNA diana es cuantificado por detección de fluorescencia. En la bibliografía encontramos terminología variada, como ciclo umbral (Ct) o punto de corte (Cp) para nombrar este mismo concepto. Los distintos nombres dependen del instrumento de qPCR utilizado. Con el fin de unificar terminología, en esta memoria se definirá como Cq, de acuerdo a la propuesta de Lefever et al. (2009).
Material y Métodos
72
génica basal). Los cambios en los niveles de expresión génica se
representaron como el porcentaje relativo de expresión génica en
condiciones control y en presencia de Aβ, en 30 y 120 min de incubación
con respecto al tiempo cero (t=0, expresión génica basal). Después se
determinó el mejor gen de referencia mediante dos algoritmos diferentes
NormFinder 0.953 (Andersen et al., 2004) y Beestkeeper 1 (Pfaffl et al.,
2004). Con estos programas analizamos por varios paquetes estadísticos
los Cq de los genes de referencia en las distintas condiciones
experimentales. Obtuvimos un “listado de valores de estabilidad” para
cada gen analizado.
3.1.4 Análisis de los datos expresión génica
Los resultados fueron expresados como media ± error estándar
(SEM). La integridad del RNA, fue analizada comparando los RQIs en
ANOVAs de dos vías, analizando los posibles efectos de la incubación con
Aβ durante distintos periodos de tiempo.
Los niveles relativos de RNA, tanto de los genes de referencia como
de los genes diana, fueron analizados siguiendo una ANOVA de dos vías
(estudio del tratamiento y del tiempo de incubación). Previa a la
realización de las ANOVAs, se estudiaron tanto la distribución de los
datos con las pruebas de normalidad correspondientes así como la
igualdad de varianzas con el test de Levene. En caso en que la
homogeneidad de varianzas fuera asimétrica (p<0.05 en el test de
Levene), se aplicaron transformaciones logarítmicas (log10) de los datos
para su análisis. Si la distribución de estos datos continuó siendo
asimétrica, se usaron test no paramétricos de análisis de la varianza,
Kruskail Wallis (en caso de comparar varias condiciones experimentales
distintas), o Wilconson (si únicamente se compararon dos condiciones
experimentales). Si se encontraron efectos significativos en estos test se
aplicaron las pruebas post hoc correspondientes a una distribución
asimétrica, Games-Howell.
Material y Métodos
73
3.2 Inyección intracerebroventricular de Aβ en el hipocampo de ratón in vivo: Estudio electrofisiológico y comportamental
3.2.1 Animales de experimentación
Se utilizaron ratones C57BL/6J machos jóvenes (4-5 meses de edad,
24-35 g) obtenidos del animalario de la Universidad de Granada. Tras su
llegada, los animales fueron repartidos en grupos de 10 animales por caja.
Después de la cirugía se separaron en cajas individuales. Los animales
fueron mantenidos en ciclos de 12h luz/oscuridad a temperatura (21.5 ±
1ºC) y humedad (55 ± 8%) constantes. La comida y el agua estaban
disponibles ad líbitum.
Todos los experimentos correspondientes a esta parte del estudio se
realizaron en la Universidad Pablo de Olavide de Sevilla y fueron
aprobados por el Comité ético local de dicha Universidad.
3.2.2 Cirugía
Los animales fueron anestesiados con hidrato de cloral al 4% por
inyección intraperitoneal (0.1 ml/10g). Los animales fueron implantados
con dos electrodos bipolares, uno de estimulación y otro de registro en el
hipocampo derecho. El electrodo de estimulación se situó en el área CA3
vía colateral de Schaffer/ vía comisural: 1.5 mm lateral y 2.0 mm
posterior a bregma y1.3 mm desde la superficie del cerebro (Paxinos and
Franklin, 2004). El electrodo de registro se situó en la capa piramidal de
CA1: 1.2 mm posterior y 2.2 mm lateral al bregma, y 1.3 mm desde la
superficie del cerebro (Figura 8; (Paxinos and Franklin, 2004)). Los
electrodos estaban hechos con alambre de tungsteno (Adviento Research,
Reino Unido) de 50 µm, recubierto de teflón. La posición final de los
electrodos se determinó por registro electrofisiológico en el área CA1 del
hipocampo, de acuerdo a los potenciales de campo evocados por pulsos
simples en la vía de las colaterales de Schaffer (Gruart et al., 2006). Se
fijaron al hueso dos alambres de plata desnudos como tierras. Todos los
cables implantados se soldaron a una toma de seis pines (RS Amidata,
España) y se fijaron al cráneo con cemento dental.
Material y Métodos
74
Para la administración de fármacos, se implantó una cánula guía de
acero inoxidable de 26-G (Plastics One, EEUU.) en el ventrículo
contralateral a los electrodos de registro y estimulación (0.46 mm lateral
a bregma, 1.0 mm posterior a la línea media y 1.4 mm por debajo de la
superficie del cerebro (Figura 8; (Paxinos and Franklin, 2004)). Se
adhirió al cráneo con cemento dental y se dejó tapada para así evitar la
entrada de material no deseado a través de ella.
3.2.3 Inyección intracerebroventricular de fármacos con cánula guía crónica
Los fármacos se administraron por inyección icv. a través de la
cánula guía implantada en el ventrículo contralateral a la posición de los
electrodos. Se utilizaron cánulas internas de 33G (1 mm de protrusión)
unidas por un tubo de silicona (0.3 mm ID x 0.64 mm OD, A-M System,
Reino Unido) a una jeringa Hamilton situada en una bomba de infusión
(Legato101, KD Scientific, EEUU.). En todos los casos la administración
de los fármacos se realizó en un volumen final de 3 µl de suero salino, a
una velocidad constante de 0.5 µl/min. Después de las inyecciones las
cánulas internas se dejaron al menos 1 min para la correcta difusión del
fármaco por el ventrículo y evitar su arrastre en la extracción de la cánula.
Se administraron Aβ25-35 (Bachem, EEUU.), y tertiapina-Q (TQ; Abcam
Biochemicals, Reino Unido). En el grupo de Aβ y TQ se realizó en primer
lugar la inyección icv. de Aβ, y transcurridos 15 min se administró TQ
(Aβ+TQ). La concentración utilizada y el protocolo de administración
están indicados de forma específica en cada experimento.
Material y Métodos
75
3.2.3.1 Fármacos de estudio
En este estudio se ha utilizado Aβ25-35 en dosis de 9 nmol ratón de
acuerdo a datos reportados por otros laboratorios con un abordaje similar
al planteado en esta tesis (Maurice et al., 1996, Gengler et al., 2007,
Holscher et al., 2007, D'Agostino et al., 2012, Yang et al., 2012) aplicado
en inyecciones consecutivas o en dosis únicas detalladas en cada
experimento. Por otro lado, se ha utilizado tertiapina-Q, TQ, como
bloqueante de alta afinidad de los receptores de K+ rectificadores de
entrada acoplados a proteínas G (GirK 1/4). Es un péptido sintético
derivado del veneno de abeja europea, que en estudios de hipocampo se
emplea en dosis variables entre los 100 nM y 5 μM, dependiendo del tipo
de estudio (Kanjhan et al., 2005, Mazarati et al., 2006, Best et al., 2012).
En este estudio se ha utilizado TQ a 1 µM, basándonos en estudios previos
Figura 8. Esquema de la posición de los electrodos y la cánula guía implantados crónicamente durante la cirugía. A. Esquema coronal de la entrada de la cánula al ventrículo contralateral a la posición de los electrodos. B. Posición de los electrodos bipolares de de estimulación (St.) y registro (Rec.). El electrodo de estimulación se implantó en el área CA3 del hipocampo derecho para estimular las fibras colaterales de Schaffer (Schaffer coll.). El electrodo de registro fue implantado en CA1 ipsilateral. vl: Ventrículo lateral. cc: cuerpo calloso; cg: corteza cingular; DG, Giro dentado; D, Dorsal; V, Ventral; L, Lateral. Imagen adaptada de (Paxinos and Franklin, 2004, Vega-Flores et al., 2014b).
Material y Métodos
76
del laboratorio (Nava-Mesa et al., 2013) y teniendo en cuenta que dosis
más elevadas se utilizan en modelos agudos de epilepsia (Mazarati et al.,
2006).
3.2.4 Registros electrofisiológicos
Los registros electrofisiológicos fueron llevados a cabo una semana
después del procedimiento quirúrgico. Se realizaron en 6 animales a la
vez, situados por separado en cámaras pequeñas de plástico de
5 x 5 x 1 cm, para prevenir desplazamientos durante las sesiones de
registro. Estas cajas, a su vez, estaban dentro de una caja de Faraday
mayor (30 x 30 x 20 cm) con el fin de aislar de las posibles interferencias
eléctricas.
3.2.4.1 Registro de la actividad eléctrica del área CA1 del hipocampo
El estudio de la actividad rítmica hipocampal se llevó a cabo
mediante el análisis de los registros extracelulares del EEG en el área
CA1. Los registros fueron realizados durante 5 min durante 7 días. El
primer registro, D0, corresponde a la actividad basal -sin tratamiento- y
fue utilizado como registro normalizador de la actividad del resto de días
(D1-7). Los días 2, 3 y 4 (D2-4) se realizaron las inyecciones icv. de Aβ y
TQ (3 nmol/µl y 0.6 µg/μl por día, respectivamente). Una hora después
de cada inyección se registró el EEG. Transcurridas 24, 48 y 72 h de la
última inyección se realizaron nuevos registros (Figura 9A).
Material y Métodos
77
3.2.4.2 Registro de los potenciales postsinápticos provocados
El estudio de los efectos del Aβ y la implicación de los canales GirK
en las propiedades electrofisiológicas de la sinapsis CA3-CA1 hipocampal
se realizó por aplicación de estimulación eléctrica en las fibras colaterales
de Schaffer y registro de los fPSP en el área CA1 del hipocampo (Figura
9). El estímulo eléctrico aplicado fue de un pulso único, cuadrado,
bifásico, de 100 µs de duración.
3.2.4.2.1 Curvas respuesta input/output
Estos experimentos fueron realizados 24 h después de la última
inyección icv. de Aβ y TQ (Figura 9B). Para el estudio de las curvas
input/output se estimuló el área CA3 con pares de pulsos (con 40 ms de
intervalo entre estímulos) a intensidades crecientes de 0.02 a 0.4 mA. En
Figura 9. Protocolo experimental de registros electrofisiológicos en el hipocampo de ratón in vivo. A. Registro del EEG del área CA1 del hipocampo durante 5 min a lo largo de siete días. Previa a la primera inyección icv. se registró la actividad eléctrica basal (D0). B. Metodología seguida para la inducción y el seguimiento de la LTP. LB, Línea base de registro de fPSP provocados por de pares de pulsos (estímulos pareados de 100 μs, 40 ms de intervalo entre estímulos). HFS, Estimulación de alta frecuencia; PP, pares de pulsos tras la HFS durante 30 min, y durante 15 min 24, 48 y 72h después de la HFS. icv., Inyección intracerebroventricular de suero salino, Aβ, TQ ó Aβ+TQ, dependiendo del grupo de estudio; D, Día de experimento.
Material y Métodos
78
cada una de las intensidades los pulsos pareados se repitieron cinco veces
con el fin de promediar los fPSPs para el análisis de los datos.
3.2.4.2.2 Estimulación por pares de pulsos
Estos experimentos fueron realizados 24 h después de la última
inyección icv. de Aβ y TQ, tras la determinación de los umbrales de
respuesta de cada animal con el protocolo input/output (Figura 9B). Se
estudiaron los efectos de la estimulación de las fibras colaterales de
Schaffer con pulsos pareados con diferentes intervalos entre estímulos
(10, 20, 40, 100, 200 y 500 ms). La intensidad del estímulo fue fijada al
30-40% de la cantidad necesaria para provocar la máxima respuesta, es
decir, muy por debajo del umbral para evocar una respuesta de espiga
poblacional (Gruart et al., 2006). Un segundo criterio de selección de la
intensidad del estímulo fue que el segundo estímulo provocara al menos
un potencial de campo al menos un 20 % mayor con el segundo estímulo.
En todos los casos, los pares de pulsos fueron repetidos seis veces con un
intervalo de tiempo de 20 s, con el fin de promediar las respuestas y
evitar posibles interferencias con el proceso de facilitación (Zucker and
Regehr, 2002, Gruart et al., 2006).
3.2.4.2.3 Potenciación a largo plazo
El estudio de la potenciación a largo plazo fue realizado 48 h después
de la última inyección de Aβ y TQ (Figura 9B) 15 minutos antes de la
aplicación del protocolo de estimulación de alta frecuencia (HFS) para la
inducción de la LTP, se estableció la línea base aplicando pares de pulsos
(de 100μs, con un intervalo entre estímulos de 40ms), cada 20s. El
protocolo de HFS consistió en 5 sesiones de 200 Hz en trenes de 100ms,
cada uno de 20 pulsos en un rango de 1/s repetidos 6 veces, a intervalos
de un minuto, es decir, se dieron un total de 600 pulsos durante la sesión
de HFS. Con el fin de evitar respuestas de “espiga poblacional” y/o
actividad epileptiforme en le EEG, la intensidad del estímulo durante la
HFS fue similar a la aplicada en la obtención de la línea base (Figura 9B).
Los animales en los cuales aparecieron este tipo de respuestas después de
Material y Métodos
79
la HFS no fueron incluidos en este estudio. Estas respuestas fueron
verificadas en el registro on-line del EEG y por visualización del animal
tras la estimulación. No obstante, como se ha indicado anteriormente, la
intensidad aplicada para los registros de la línea base, y después de la
HFS, fue del 30-40% de la cantidad necesaria para provocar la máxima
respuesta, es decir, muy por debajo del umbral. Después de la sesión de
HFS, se aplicó el mismo estímulo que el aplicado en el registro de la línea
base, estímulo por pares de pulsos cada 20 s, durante 30 minutos, y
durante 15 minutos los tres días siguientes (días 2, 3 y 4, Figura 9B), con
el fin de comparar la posible respuesta de facilitación típica del
hipocampo. Dado que la potenciación a corto plazo parece ser
dependiente del número de estímulos presentados, después de la HFS la
evolución de los pares de pulsos fue realizada con el mínimo número de
estímulos posibles, por sesión de registro, un total de 45 pares de pulsos
por registro y día (Madroñal et al., 2009).
3.2.4.3 Registro y análisis de datos de actividad eléctrica rítmica y potenciales postsinápticos provocados
Los registros del EEG y las respuestas sinápticas provocadas, fPSPs,
fueron realizados con un amplificador diferencial Grass P511, a través de
una sonda de alta impedancia (2 × 1012 Ω, 10 pF). Fueron digitalizados y
almacenados en un ordenador a través de un convertidor analógico-
digital (CED 1401 Plus, Reino Unido). El análisis del EEG fue realizado
off-line con el programa Spike2 7.10 (CED, Reino Unido). Se
seleccionaron 180 s libres de artefactos de cada registro para el análisis
del poder ecpectral. Para la obtención de los poderes espectrales se utilizó
Spike2 7.10 aplicando la transformada de Fourier (FFT) con ventana
Hanning (véase ANEXOS1 para más detalle). Los parámetros fueron:
8192 puntos de datos (4.16 kHz de muestreo) tamaño de FFT de 1.96 s de
largo con 0.5086 Hz de resolución. Se representaron como media del
poder espectral en cada frecuencia de acuerdo a cada condición. Se hizo
un análisis por bandas de frecuencia de theta (4.1–12 Hz) y gamma
(26.1–80 Hz). Se realizó un análisis cuantitativo de los poderes
Material y Métodos
80
espectrales a lo largo del tiempo en cada uno de los grupos de
tratamiento. Se estudió el efecto de los distintos tratamientos sobre el
EEG en las bandas de frecuencia theta y gamma a lo largo del tiempo.
Para ello se aplicó el análisis estadístico con ANOVA de dos vías en
medidas repetidas. En aquellos casos en los que no se pudo asumir
esfericidad en las muestras se realizó el ajuste de Greenhouse-Geisser.
Las diferencias entre los distintos grupos de tratamiento farmacológico se
determinaron por pruebas post hoc Bonferroni o Games-Howell si la
distribución de las variancias no podía ser asumida.
El análisis de los fEPSPs se realizó off-line por medida de la
pendiente máxima (mV/s) de los fEPSPs con los programas Spike2 7.10 y
Signal 5.07 (CED, Reino Unido). Se promediaron los fEPSPs obtenidos, y
se midió la pendiente promedio resultante durante el periodo de subida,
manteniendo fijo el punto inicial y el final de media dentro de la misma a
lo largo de fEPSPs correlativas. Los puntos de medida se fijaron entre el
10% del inicio y el 10 % antes del final de la pendiente (Figura 10). Los
datos se muestran calcularon en torno a valores absolutos de las
pendientes. En el caso de las curvas input/output los datos se
normalizaron usando como 100% la pendiente máxima (del promedio de
cinco barridos seleccionados con la misma intensidad de estimulación) de
la primera fEPSP de cada animal como su propia línea de base. Se
estudiaron las pendientes de los fEPSP en el primer y el segundo estímulo
(1St y 2St, Figura 19A).
Por otro lado se analizó el ratio entre la respuesta del segundo fEPSP
con respecto al primero: [(St.2 fEPSP/St.1 fEPSP) ×100] y la respuesta
total como la suma del fEPSP St.1 más el fEPSP St.2.
Los datos referentes al estudio de potenciación a corto plazo por
estimulación por pares de pulsos fueron representados como la media de
5 barridos en el mismo intervalo, utilizando el mismo ratio que en la
curva input/output [(St.2 fEPSP /St.1 fEPSP)×100] para cada intervalo
de estímulos (Figura 21A). Los datos de la LTP fueron analizados por
estudio de la evolución de la pendiente del primer fEPSP (Figura 22A).
Todos los datos obtenidos en la LTP fueron normalizados utilizando
Material y Métodos
81
como 100% los valores de los fEPSPs de la línea base registrada el primer
día. A menos que se indique lo contrario, todos los datos son
representados como la media±SEM.
Los datos fueron analizados utilizando una ANOVA de dos vías, con
los días del experimento como medida repetida. Se utilizaron análisis por
contraste simple y repetido para estudiar diferencias significativas entre
los distintos grupos de tratamiento a lo largo del tiempo.
3.2.5 Prueba de habituación en campo abierto
Con el fin de determinar el efecto del Aβ y su posible interacción con
los canales GirK en un tipo de memoria no asociativa dependiente de
hipocampo se realizó la prueba de habituación en campo abierto. Este
estudio fue realizado en un Actímetro AC-5 (35 x 35 x 25 cm, Cibertec
S.A., España) en el cual los animales exploraron libremente el ambiente
detectándose y registrándose los movimientos mediante un sistema de
Figura 10. A. Potenciales de campo, fLPSP, registrados en el área CA1 tras la estimulación por pares de pulsos, PP, indicados como estímulos 1 y 2, St.1 y St2., de las fibras colaterales de Schaffer. El intervalo entre estímulos se fija a 40 ms. La zona sombreada indica la zona de los fEPSPs de análisis de la pendiente. Dicha zona se fija y se mantiene contaste a lo largo del tiempo con el fin de determinar la evolución de la respuesta a lo largo del tiempo. B. Representación esquemática de un potencial de campo formado por una parte excitatoria, fEPSP, y dos inhibitorias, fIPSPs. En la respuesta excitatoria temprana está implicado principalmente el glutamato, mientras que la inhibitoria temprana está promovida por la respuesta de los receptores de GABAA y la inhibitoria lenta, principalmente por los receptores de GABAB. La flecha en el componente GABAB indica que puede durar hasta 300ms. Las latencias medidas para los distintos componentes fueron de 2-5 ms para el Glutamato (Glu), 12-15 ms para el GABAA y 26-30 ms para el GABAB. Imagen adaptada de (Vega-Flores et al., 2014b).
Material y Métodos
82
haces de infrarrojos (Figura 11A). Se realizaron dos pruebas de
exploración en campo abierto. El training fue una prueba de
familiarización con el entorno. Aquí los animales ya fueron
preseleccionados para la administración de los distintos fármacos. 48 h
después del training se inyectaron icv. los fármacos correspondientes a
cada grupo de estudio: suero salino 0.9 %, 9 nmol/μl de Aβ, 0.6 µg/μl TQ,
Aβ+TQ (9 nmol/μl + 0.6 µg/μl, respectivamente). La inyección de los
fármacos se realizó de acuerdo a la descripción de material y métodos
(véase sección 3.2.3). Una h después de la icv. se realizó la prueba de
habituación (Figura 11B). En todas las pruebas, los animales fueron
introducidos en el actímetro en el centro del habitáculo. La actividad
comenzó a registrarse de forma automática desde la detección del animal
en la base del mismo. Cada prueba tuvo una duración de 15 min. El
actímetro fue limpiado en su totalidad con etanol al 70 % (v/v) antes de la
realización de cada prueba.
3.2.5.1 Registro y análisis de datos en el test de habituación en campo abierto
El registro de los datos fue realizado con el software MUX_XYZ16L
(Cibertec, España). La actividad exploratoria fue cuantificada
automáticamente mediante el análisis de los movimientos realizados por
detección y contaje del total de haces cruzados en cada eje por minuto
durante 15 min. En el caso del eje Z, se ajustó el parámetro de intervalo
vertical a una duración mínima de tres segundos para su contaje como
movimiento en dicho eje. Analizamos la actividad total, la actividad en el
plano horizontal y el número de levantamientos durante el training y en
la reexposición. La actividad total fue el sumatorio de los movimientos en
X, Y y Z. La actividad horizontal fue la suma de los movimientos en los
ejes X e Y. El número de levantamientos correspondió al número total de
veces de cruce de haces en el eje Z bajo la premisa estipulada.
Para cada animal se consideró la actividad exploratoria registrada en
el training como su línea base de actividad (100% de actividad) y la
actividad exploratoria en la habituación se representó relativizada a ésta
Material y Métodos
83
de acuerdo a la siguiente fórmula: (Movimientos training/ movimientos
habituación)*100 para cada eje correspondiente. En todos los casos se
representan la media±SEM (%) en un total de 10 animales por grupo de
estudio. Se desestimaron aquellos animales que presentaron escaso o
ningún movimiento durante la realización de las pruebas. Se estudiaron
las posibles variaciones en la actividad exploratoria después de la
administración del Aβ y TQ en cada uno de los grupos (t-test de muestras
relacionadas). Además, con el fin de determinar si existían diferencias
significativas entre los distintos grupos de tratamiento en la misma
prueba se realizó una ANOVA de un factor. En los casos en los que se
encuentran diferencias significativas se procede a los análisis post-hoc
por Bonferroni.
Figura 11. Test de habituación en campo abierto. A. Actímetro. Habitáculo de metacrilato con dos sistemas de 16 haces de infrarrojos. Los bastidores de haces son líneas de emisores-receptores de infrarrojos. El primer bastidor está situado en la base del habitáculo, mapeando la actividad en los ejes X e Y. El segundo bastidor se ajustó a una altura de 3-4 cm de la base para el registro de los levantamientos del animal (eje Z). Una vez situado el animal dentro del actímetro, éste exploró libremente el ambiente. Los movimientos quedaron registrados por el software del aparato. B. Protocolo experimental. El primer test, training, fue un test de actividad exploratoria en campo abierto 48 horas pre- icv. de Aβ, TQ, Aβ y TQ y suero salino. Una hora después de las inyecciones icv. se realizó el test de habituación. Cada test tuvo una duración de 15 minutos en los cuales se registraron todos los movimientos de manera automática. Los registros contabilizaron el número total de movimientos de acuerdo al número de haces de infrarrojos cruzados.
Material y Métodos
84
3.2.6 Prueba de reconocimiento de objetos nuevos
Con el fin de determinar el efecto del Aβ y su posible interacción con
los canales GirK en procesos de memoria de reconocimiento a corto y
largo plazo relacionada con el hipocampo, se realizó la prueba de NOR
con distintos tiempos de fase de retención.
Las distintas pruebas se realizaron en una habitación con luz tenue
dentro de una caja fabricada con madera contrachapada, cloruro de
polivinilo, y acrílico transparente con unas medidas de 30×25×20 cm
(Clarke et al., 2008, Clarke et al., 2010). Los objetos seleccionados fueron
5 piezas de plástico de diferentes formas y colores: dos legos amarillos, un
cilindro rosa, una pelota blanca y negra y una estrella morada. Previa a la
realización de las pruebas todos los objetos habían sido testados por un
grupo externo de animales (véase ANEXO2). En ningún caso hubo
preferencia, en términos de mayor tiempo de exploración, de un objeto
sobre otro. La localización de los objetos dentro de la caja fue fija,
centrados, uno al lado del otro, con una distancia entre ellos de unos 8
cm. Una vídeo cámara fue situada sobre la caja del NOR para la grabación
de las pruebas.
La prueba completa del NOR consistió en una fase de habituación,
denominada training o familiarización y una fase de reconocimiento del
objeto nuevo a distintos tiempos. En primer lugar, previas a las
habituaciones se realizó la aclimatación de los animales a las nuevas
condiciones ambientales de la habitación donde realizamos el NOR. Cada
animal se mantuvo durante un tiempo aproximado de 2 min en una caja
translúcida pequeña (5 x 5 x 10 cm). Esta aclimatación fue repetida antes
de llevar a cabo cada prueba. Se realizaron tres habituaciones de 5 min
cada una a la caja del NOR simulando en su totalidad las condiciones
experimentales de las pruebas con el fin de minimizar el estrés producido
por la exposición de nuevos ambientes. En estas habituaciones los
animales exploraron el ambiente libremente sin la presencia de los
objetos. Transcurridas 24 h se realizaron los distintos NOR. Cada prueba
tuvo una duración de 5 min. En el training se expuso el mismo objeto por
duplicado (objeto familiar) y en las pruebas consecutivas el objeto de la
Material y Métodos
85
derecha fue sustituido por un objeto nuevo sin cambiar la posición de los
mismos. La primera prueba se realizó 180 min después del training como
prueba de evaluación de la memoria a corto plazo. 24 h después, se
inyectaron por icv. a cada grupo experimental el fármaco
correspondiente: suero salino 0.9 %, 9 nmo/μl de Aβ, 0.6 μg/μl de TQ ó
Aβ + TQ ambos (véase sección 3.2.3 para más detalle). Tras 1 h (corto
plazo) y 24 h (largo plazo) de las inyecciones icv. se realizaron las pruebas
2 y 3, respectivamente (Figura 12).
Figura 12. Protocolo experimental de la prueba de reconocimiento de objetos nuevos. El día 1 se llevó a cabo la fase de habituación a las condiciones experimentales y a la caja del NOR. Los animales exploraron libremente durante 5 min. En esta fase no se presentaron objetos. En el día 2 se realizó el training o fase de familiarización. Se presentaron dos copias idénticas del mismo objeto. El NOR 1 se llevó a cabo tras 3 h de retención. En esta prueba se sustituyó una de las copias por un objeto nuevo. 24 h después, día 3, se administraron por inyección icv. los fármacos correspondientes: Aβ, TQ, Aβ+TQ o suero salino (control). Transcurrida 1 h desde la administración de los fármacos, corto plazo) se realizó el NOR 3, sustituyendo el objeto nuevo por otro objeto nuevo diferente. A las 24 h (largo plazo) se realizó el NOR 3, sustituyendo el objeto anterior por otro nuevo. Todos los objetos utilizados fueron validados previamente por un grupo externo de animales donde no mostraron preferencia significativa por ninguno de ellos (Anexo2). Aquellos animales con nula o escasa actividad exploratoria no fueron tenidos en cuenta (n=6-10 dependiendo del grupo y prueba). Después de la realización de cada prueba por cada animal, tanto los objetos como la caja del NOR fueron limpiados con etanol al 70% (v/v). H: Habituación.
Material y Métodos
86
Los animales fueron introducidos en el centro de la caja, orientados
de espaldas a los objetos, con el fin de que ambos objetos fueran
visualizados por primera vez al mismo tiempo. Previa a la administración
de los fármacos los animales ya fueron preseleccionados para cada uno de
los grupos. Los experimentos se realizaron a ciegas del tratamiento
farmacológico que iba a ser administrado.
Se definió actividad exploratoria sólo aquellos momentos en los que
el animal estaba con la nariz orientada hacia el objeto en un radio inferior
a dos centímetros y/o estaba tocando dicho objeto con las vibrisas.
Caminar alrededor o sentarse en el objeto no fueron considerados como
exploración (Clarke et al., 2008, Clarke et al., 2010, Ennaceur, 2010). Al
finalizar cada prueba tanto los objetos como la caja fueron limpiados con
etanol al 70% (v/v) con el fin de evitar contaminación por señales
olfativas en las pruebas posteriores.
3.2.6.1 Análisis de datos de las pruebas de reconocimiento de objetos nuevos
Se compararon los tiempos relativos de exploración de los dos
objetos de acuerdo a la siguiente fórmula:
ó %
100. Donde
To: fue el tiempo (s) de exploración del objeto (familiar o nuevo) y Ttotal
(s) fue el tiempo total de exploración de los objetos (tiempo exploración
familiar + tiempo exploración nuevo) .
Por otro lado, fue calculado el ratio de discriminación del objeto
nuevo (RD) de acuerdo a: RD
. Ratios de
discriminación próximos a 1 indican preferencia en la exploración del
objeto nuevo, y próximos a -1 preferencia por el objeto familiar. RD
próximos a cero indican que no hubo preferencia por ninguno de los
objetos.
El análisis de los tiempos relativos de exploración del objeto familiar
y los objetos nuevos en cada test fue realizado con una T de Student para
una muestra fijando el valor de contraste en 50 (valores de tiempo
Material y Métodos
87
relativo de exploración significativamente superiores al 50% reflejarían
preferencia de exploración por dicho objeto). Los RD se analizaron por
ANOVAs para determinar si había diferencias significativas entre los
ratios de las distintas pruebas, y mediante la prueba T de Student
determinamos los posibles efectos de los distintos tratamientos en cada
prueba por comparación de los RD con el valor de contraste fijado en este
caso en 0 (sin preferencia por ninguno de los objetos).
3.2.7 Procesamiento histológico
Con el fin de determinar anatómicamente la correcta posición de los
electrodos de registro y de estimulación, después de la realización de los
experimentos se procedió al análisis histológico. Se administró por
inyección intraperitoneal una dosis letal de hidrato de cloral al 4 %. Se
realizó una perfusión transcardial de suero salino al 0.9 % y
paraformaldheído al 4 % con una bomba peristáltica.
El cerebro fue extraído, crioprotegido en sacarosa al 30 % y tampón
fosfato. Se almacenaron a -20 ºC en glicerol al 30 % y etilenglicol al 30 %
en tampón fosfato hasta ser procesados. Se realizaron cortes coronales
seriados de 50 μm con el microtomo de congelación (Leica SM2000R,
Alemania). Las secciones seleccionadas, aquellas que incluían la zona del
hipocampo y el ventrículo lateral, se montaron en portas gelatinizados y
se tiñeron con la técnica de Nissl con azul de toloudina al 0.1 %. En
primer lugar se procedió a la hidratación del tejido pasando las muestras
por una batería de alcoholes (100%-96%-70%-50%-30%; v/v).
Seguidamente se procedió a la tinción con azul de toluidina (en tampón
acetato, pH 4,4) durante dos minutos. Después se procedió al lavado de
las muestras en agua destilada, con el fin de eliminar el colorante en
exceso. Previo al montaje, se realizó la deshidratación del tejido pasando
las muestras por una batería de alcoholes (30 %-50 %-70 %-96 %-
100 %; v/v) y xileno durante 5 min. En último lugar se procedió a montar
con cubreobjetos sellando con DPX. La verificación de la posición de los
electrodos de registro y estimulación y de la cánula guía se realizó por
observación en microscopio (Nikon Eclipse Ti-U, Japón) (Figura 13).
Material y Métodos
88
3.3 Análisis estadístico de los datos
La estadística aplicada se detalla en la sección de análisis de datos de
cada uno de los procedimientos experimentales. Los análisis fueron
realizados con el programa estadístico IBM SPSS 20 para Windows
(SPSS Inc., EEUU.).
Figura 13. Verificación histológica de la posición de los electrodos y la cánula guía. A. Localización electrodo de registro en CA1. B. Localización electrodo de estimulación. C. Localización cánula guía. Se señala con flecha la localización. D, L: dorsal, lateral; vl, ventrículo lateral.
89
4. RESULTADOS
Resultados
90
4.1 Efectos de la exposición a Aβ sobre la expresión génica en rodajas de hipocampo de rata
El estudio de los efectos del Aβ sobre la expresión génica de
receptores y canales implicados en vías de neurotransmisión excitatoria e
inhibitoria en rodajas de hipocampo de rata se llevó a cabo mediante la
técnica de RT- qPCR. Esta técnica de cuantificación se distingue de otras
por su precisión, sensibilidad y rapidez de resultados. Sin embargo, una
de sus mayores limitaciones es la variabilidad de resultados obtenidos
debido a la influencia de variables metodológicas como la calidad del
RNA (Fleige and Pfaffl, 2006) o los genes de referencia utilizados
(Schmittgen and Zakrajsek, 2000, Dos-Anjos et al., 2008). Por ello,
previo al análisis de los efectos del Aβ sobre la expresión génica en el
hipocampo se procedió a la estandarización de la metodología de RT-
qPCR en nuestras condiciones experimentales.
4.1.1 Estandarización de la técnica de RT-qPCR en el análisis de los niveles de RNA en rodaja de hipocampo de rata
4.1.1.1 Calidad del RNA
El RNA total fue extraído y purificado de rodajas de hipocampo. Fue
tratado con DNasa I para maximizar su pureza. Se obtuvieron 44
muestras de RNA total y se analizó la integridad del 91% de las mismas a
partir del valor de RQI (calculado a partir de los electroferogramas
obtenidos mediante el sistema de electroforesis automatizada (Experion
System, Bio-Rad, EEUU.).
Como se ilustra en la Figura 14, un electroferograma muestra el
perfil de RNA de degradación de los RNA ribosomales, de acuerdo a la
premisa de que con el transcurso del tiempo éstos se van degradando y
acumulando como pequeños RNA de bajo peso molecular (aparecen en
el electroferograma como picos). El RQI es calculado con base en las
áreas del electroferograma correspondientes a las regiones 28S, 18S y
pre-18S (Figura 14 A, C, E). En la Figura 14 se muestran tres ejemplos
de tres muestras de RNA con RQI distintos.
Resultados
91
Tabla 4. Porcentaje de muestras de RNA de hipocampo obtenidas y clasificadas de acuerdo al índice de calidad de RNA (RQI).
Los valores de RQI obtenidos se dividieron en cuatro grupos
(definidos según criterio establecido en el laboratorio); RQI menores a 6
(RNA bastante degrado), RQI entre 6 y 7.5 (RNA algo degrado), RQI
entre 7.5 y 8.5 (RNA de buena calidad) y RQI mayores a 8.5 (RNA de
excelente calidad). El 50 % de las muestras de RNA total tuvieron un RQI
mayor a 8.5 (Tabla 4). No se encontraron diferencias de significativas en
la calidad del RNA ni por efecto del tratamiento con Aβ (F(1,35)=0.206,
p=0.652) ni entre los distintos tiempos de incubación (F(2,35)=0.826,
p=0.446). El criterio de inclusión de las muestras de RNA para el análisis
de la expresión génica fue un valor de RQI igual o mayor a 7.00. Se
incluyeron 20 muestras (n=20) de 4 animales diferentes. De estas 20
muestras, el 65% tenían un valor de RQI mayor a 8, es decir, un RNA de
muy buena calidad.
RQI % de muestras RNA
Calidad RNA
RQI 6 2.5 Muy degradado
6< RQI 7.5 15 Ligeramente degradado
7.5< RQI 8.5 32.5 Buena calidad
8.5 < RQI 10 50 Excelente calidad
Resultados
92
Resultados
93
Figura 14. Medida de la calidad del RNA total extraído de rodajas de hipocampo. A, C y E muestran los electroferogramas, donde se representa la fluorescencia con respecto al tiempo (s) de reacción, correspondientes a los perfiles de RNA total de muestras de hipocampo. El primer pico que aparece en los 3 perfiles corresponde al marcador de peso molecular. B, D y F representan las imágenes de los geles virtuales de cada muestra. Se representa el marcador de peso molecular en el carril izquierdo (L) y la muestra de RNA en el carril derecho (M). A. Perfil de RNA con un RQI de 9.1. Los picos corresponden a las subunidades ribosomales 18S y 28S. Las líneas inferiores en estos picos delimitan el área mediada. B. Las dos bandas que se observan corresponden a los RNA ribosomales 28S y 18S, respectivamente. El mayor grosor de la banda correspondiente a 28S indica mayor concentración con respecto al 18S. C. Perfil de RNA con un RQI de 7.1. Se indican con flechas los diferentes picos correspondientes a fragmentos de rRNA de distinto peso molecular que dependiendo del tamaño, aparecen en diferentes momentos a lo largo del tiempo. D. En la muestra se señalan con flechas los fragmentos degradados de diferentes tamaños. E. Perfil de RNA con RQI de 2.1. Se observa una curva correspondiente a RNA muy degradado. F. Es indistinguible cualquier tipo de banda. 18S y 28S: Subunidades ribosomales 18S y 28S, respectivamente; L: Marcador de peso molecular; M: Ejemplo de tres muestras de diferentes RQI, de RNA total de rodajas de hipocampo de rata.
Resultados
94
4.1.1.2 Análisis de los genes de referencia: Actb, Gapdh y Ppia
Se evaluó la variabilidad de la expresión de los genes Actb
(β-actina), Gapdh (gliceraldehído3-fofato deshidrogenasa) y Ppia
(peptidilprolil isomerasa A) en las distintas condiciones experimentales,
incubación con Aβ ó ACFS durante 30 y 120 min.
Los niveles de RNA de Actb, Gapdh, Ppia (Figura 15) no se vieron
afectados ni por el tiempo de incubación (Actb: F(2,18)=1.015, p=0.382;
Gapdh: F(2,18)=1.588, p=0.232; Ppia: F(2,18)=0.006, p=0.994), ni el
tratamiento con Aβ (Actb: F(1,18)=0.869, p=0.364; Gapdh: F(1,18)=0.379,
p=0.546; Ppia: F(1,18)=0.239, p=0.631).
Pese a que los resultados obtenidos reflejaron que no hubo
variabilidad en los niveles de expresión génica en las distintas
condiciones experimentales, encontramos en la bibliografía numerosos
trabajos que apoyan la hipótesis de la necesidad de un estudio de los
Figura 15. Expresión relativa de RNA de los genes Actb (A), Gapdh (B), Ppia (C). Los niveles de RNA (%) corresponden a la media de los Cq en cada condición normalizada con la media del Cq del t=0 (t=0, Cqs basales). En todos los casos el tiempo cero de incubación en ACSF representa el 100% de la expresión génica (t=0) y todos los valores son representados con respecto a dicha condición. Nótese que los niveles relativos de RNA de cada uno de estos genes no varían ni con la exposición a Aβ, ni con el tiempo de incubación. Los datos representan la media±SEM. *p<0.05. ACSF, líquido cefalorraquídeo artificial.
Resultados
95
genes de referencia en mayor profundidad (Bonefeld et al., 2008,
Martinez-Beamonte et al., 2011). Por ello, analizamos la normalización
de los datos con cada uno de los genes de referencia.
En el 55,5 % de los casos hubo una concordancia en los resultados
obtenidos con los tres genes de referencia. En un 27.7 % de los casos los
resultados entre Ppia y Gapdh fueron similares, un 11.1 % entre Gpadh y
Actb, y en todos los caso hubo alguna diferencia entre Ppia y Actb. En un
5.6 % de los casos (en un único gen diana) se obtuvieron distintos
resultados dependiendo del gen de referencia utilizado (Tabla 5).
Tabla 5. Variabilidad en los resultados de los niveles de RNA de 17 genes diana de acuerdo al gen de referencia utilizado. Niveles de expresión génica en rodaja de hipocampo de rata incubada en condiciones control, ACSF ó con Aβ durante 30 y 120 min. Genes de referencia Ppia, Gapdh y Actb.
↑/↓ Aumento/ disminución de los niveles relativos de RNA en presencia de Aβ. – Sin cambio en los niveles relativos de RNA en presencia de Aβ. Nótese que los resultados obtenidos no siempre son coincidentes pese a que los datos corresponden al mismo gen diana.
Resultados
96
Como ejemplo se muestra en la Figura 16 los niveles de RNA del
gen Kcnj5 normalizados con Ppia, Gapdh y Actb. Cuando la
normalización se realizó con Ppia y Gapdh se observó una disminución
en los niveles de RNA de Kcnj5 a los 30 y 120 min de incubación con Aβ
(Ppia: F(1,11)=9.605, p=0.010; Gapdh: F(1,11)=7.953, p=0.017; Figura 16 A
y B). Sin embargo, con Actb solo se observó esta disminución a los
120 min (F(1,11)=5.249, p=0.043; Figura 16C). Estos resultados muestran
la importancia de la selección del gen de referencia en la normalización
de los niveles de expresión génica.
4.1.1.3 Selección del gen de referencia más estable
La selección del gen de referencia más estable en nuestras
condiciones experimentales fue llevada a cabo a partir de la aplicación de
dos algoritmos matemáticos NormFinder (Andersen et al., 2004) y
Bestkeeper (Pfaffl, 2001). Ambos programas calculan el valor de
estabilidad, cuanto menor es ese valor, más estable es el gen. Ppia fue
considerado por ambos programas el gen de referencia óptimo. Los
Figura 16. Variabilidad de los niveles de relativos de RNA dependiendo del gen de referencia. Expresión génica de Kcnj5 normalizada con Actb (A), Gapdh (B) y Ppia (C). En todos los casos el tiempo cero de incubación en ACSF representa el 100% de la expresión génica (t=0) y todos los valores son representados con respecto a dicha condición. Los datos se representan como la media±SEM (%) *, p<0.05. n=4 (replicados biológicos).
Resultados
97
valores Cq de este gen fueron utilizados para la aplicación del modelo 2-
∆Cq en la cuantificación relativa de la expresión génica de los genes diana.
4.1.2 Efecto de la exposición a Aβ sobre la expresión génica de subunidades de receptores y canales de vías de neurotransmisión excitatoria e inhibitoria del hipocampo
Realizamos el estudio del efecto del Aβ sobre la expresión génica de
17 genes que codifican subunidades de receptores y canales implicados
las vías de neurotransmisión glutamatérgica, colinérgica y GABAérgica
en el hipocampo. La cuantificación de los niveles de RNA de cada gen fue
relativizada de acuerdo a la expresión constitutiva del gen de referencia
más estable, Ppia.
No se encontraron cambios en los niveles de RNA de subunidades
de receptores ionotrópicos de glutamato, NMDA y AMPA, a excepción
del gen de la subunidad GluN1, la cual disminuyó significativamente por
efecto del Aβ después de 30 y 120 min de incubación (F(1,9)=7.242,
p=0.025; Figura 18A). Se estudiaron las subunidades 1 y 5 de los
receptores metabotrópicos de glutamato (mGlu1 y 5, respectivamente).
Observamos una disminución de los niveles de RNA de mGlu1 a 30 y
120 min en presencia de Aβ (30 min, p=0.037; 120 min, p=0.034)
Figura 17. Diferentes procedimientos en el análisis de la estabilidad génica de los genes de referencia. Se han utilizado los programas BestKeeper (A) y NormFinder (B) para evaluar el gen más estable en nuestras condiciones experimentales. Se han analizado los genes Actb, Ppia y Gapdh. Un asterisco indica el “mejor gen”.
Resultados
98
mientras que los niveles de mGlu5 se mantuvieron estables (Figura
18A).
Se estudiaron los efectos del Aβ en genes que codifican subunidades
de receptores y canales implicados en vías de neurotransmisión
GABAérgica metabotrópica, como es el receptor GABAB, y uno de sus
efectores, el canal de potasio GirK. No se encontraron variaciones
significativas en los niveles de RNA de las subunidades del receptor
GABAB, GABAB1 y GABAB2 tras la exposición a Aβ. Sin embargo en el
caso del canal de potasio GirK, encontramos diferencias significativas en
la expresión génica de las subunidades Girk2, Girk3 y Girk4. Los niveles
de RNA fueron inferiores después de 30 y 120 min de incubación en
comparación con las muestras incubadas solo con ACFS, sin Aβ (Girk2:
F(1,9)=9.187, p=0.014; Girk3: F(1,8)=12.293, p=0.008; Girk4: F(1,11)=9.605,
p=0.010; Figura 18B).
Se estudió el posible efecto del Aβ sobre la expresión de genes que
codifican subunidades de receptores y canales relacionados con el
sistema de neurotransmisión colinérgico. No hubo cambios de expresión
génica en el receptor muscarínico M1 durante los distintos tiempos de
incubación con Aβ (Figura 18C). Sin embargo, el análisis de los niveles
de RNA de las subunidades que conforman el canal KCNQ (efector del
receptor M1) en presencia de Aβ tras 30 min de incubación mostró una
disminución de los nieles de expresión génica de Kcnq2 y Kcnq3 (Kcnq2,
p=0.035; Kcnq3, p=0.037). Manteniéndose esta disminución en el caso
de Kcnq3 después de 120 minutos de incubación con Aβ (Figura 18C;
p=0.034). Los niveles de RNA de Kcnq5 se mantuvieron invariables
(Figura 18C).
Finalmente, se utilizó la expresión del gen de la proteína de anclaje
al citoesqueleto, Arc como control positivo del estudio. Nuestros
resultados mostraron un incremento de los niveles de RNA de Arc tras
30 min de incubación con Aβ, manteniéndose hasta los 120 min
(F(1,9)=5.428, p=0.045; Figura 18D). Estos resultados sugieren la
implicación de Arc en las alteraciones neurofisiológicas de nuestro
modelo experimental de EA.
Resultados
99
Resultados
100
Figura 18. Expresión relativa de genes que codifican receptores y canales implicados en la neurotransmisión excitatoria e inhibitoria del hipocampo durante la incubación con Aβ. Niveles de RNA de genes que codifican receptores y canales glutamatérgicos (A) GABAérgicos (B) y colinérgicos (C) a 30 y minutos de incubación con ACFS (control) ó Aβ. La cuantificación fue analizada por qPCR normalizando los niveles de expresión génica con el gen de referencia Ppia. La expresión de cada gen en cada punto del tiempo se representa como porcentaje de la expresión génica a tiempo 0 (t=0 min), la cual fue considerada como expresión control basal (100%). A. Niveles relativos de RNA de subunidades de receptores glutamatérgicos ionotrópicos de NMDA: GluN1, GluN2A y GluN2B. Del receptor AMPA: GluA1 y GluA2, y de receptores metabotrópicos, mGlu1 y mGlu5. B. Niveles relativos de RNA de subunidades del receptor GABAB: GABAB1 y GABAB2, y del efector de GABAB, el canal de potasio GirK1-4. C. Niveles relativos de RNA del receptor muscarínico M1 y su efector, el canal de potasio KCNQ: subunidades Kcnq2, Kcnq3 y Kcnq5. D. Expresión relativa de los niveles de RNA de la proteína asociada al citoesqueleto de actividad regulada, Arc. Nótese que la escala en el eje Y, en la gráfica D, es distinta a las escalas presentadas en las gráficas A-C. Los datos son representados como la media±SEM. n=4 (replicados biológicos). *p<0.05. ACSF, líquido cefalorraquídeo artificial.
Resultados
101
En resumen, los datos obtenidos indican que el Aβ modifica los
niveles de expresión de RNA de las subunidades GluN1 y mGlu1 de
receptores glutamatérgicos ionotrópicos y metabotrópicos. Estos
resultados habían sido expuestos anteriormente por otros grupos de
investigación (Hynd et al., 2001, Albasanz et al., 2005). Además,
disminuye los niveles de expresión génica de subunidades de dos canales
de potasio, GirK24 and Kcnq23. Estos canales de potasio regulan la
excitabilidad neuronal y recientemente se han relacionado con la
patofisiología del hipocampo en EA. La desregulación de la expresión
génica podría contribuir al desbalance de los sistemas de
neurotransmisión excitatorio-inhibitorio en el hipocampo que parece ser
una de las causas de la disfunción neuronal que podría subyacer a los
déficits cognitivos en distintos modelos de EA (Palop and Mucke, 2010,
Nava-Mesa et al., 2014).
4.2 Efecto de Aβ y tertiapina-Q sobre las propiedades de la sinapsis CA3-CA1 del hipocampo de ratón in vivo
Estudiamos los efectos del Aβ y el bloqueante de los canales GirK,
TQ, sobre las propiedades electrofisiologicas del hipocampo de ratón in
vivo. Mediante la estimulación de las fibras colaterales de Schaffer y el
registro de la respuesta provocada en CA1 analizamos el estado del
circuito hipocampal y procesos de plasticidad sináptica a corto y largo
plazo.
4.2.1 Efecto de la administración icv. de Aβ y tertiapina-Q sobre las propiedades de la transmisión sináptica del hipocampo in vivo
Para investigar los efectos de la exposición a Aβ y TQ sobre
transmisión sináptica basal medimos las curvas de respuesta
input/output por estimulación de las fibras colaterales de Schaffer con
pares de pulsos, intervalo entre estímulos de 40 ms, a intensidades
crecientes (de 0.02 a 0.4 mA). La visualización de los registros del EEG
tras la aplicación de los estímulos permite observar respuestas anómalas
como espigas individuales, actividad epileptiforme o respuestas
Resultados
102
hiperpolarizantes en los grupos expuestos a TQ y Aβ. En presencia de TQ
observamos este tipo de respuestas en un 37.5 % de los animales, con Aβ
en un 28.6% y con ambos fármacos en un 25 % de los casos. En el grupo
tratado con suero salino, solo encontramos este tipo de respuestas en un
14.3 % de los casos. Estos resultados parecen indicar que el hipocampo
habría más actividad, tanto en presencia de Aβ como de TQ. Los
animales con este tipo de respuestas fueron excluidos en el análisis de los
fEPSPs de las curvas input/output realizadas. Se analizó la pendiente de
los fEPSPs obtenidos tras la aplicación de del primer (St.1) y segundo
estímulo (St.2), en cada una de las intensidades aplicadas. En la Figura
19A se representan ejemplos de los fEPSPs a dos intensidades, indicadas
como 1 y 2 en cada grupo de estudio. Observamos un incremento de la
pendiente de los fEPSPs de acuerdo a la progresión en el aumento
intensidad de estímulo aplicado. En presencia de TQ este incremento
alcanzó un valor máximo a la intensidad marcada (véanse flechas
negras, Figura 19B y E), al igual que en el grupo control, a partir de la
cual se perdieron las diferencias significativas (TQ, F(1,8)=308.678,
p<0.001); suero salino, F(1,10)=103.069, p<0.001). Sin embargo, en
presencia de Aβ y Aβ+TQ, esta estabilización no se observa,
incrementando de forma constante (Aβ: F(1,8)=51.855, p<0.001; Aβ+TQ:
F(1,8)=65.421, p<0.001; Figura 19C y F).
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103
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Figura 19. Efecto de la inyección icv. de Aβ y tertiapina-Q en la transmisión sináptica basal de la sinapsis CA3-CA1 del hipocampo. A. Registros representativos obtenidos de las curva input/output en un animal de cada grupo experimental. Se representan los promedios de 5 pulsos de fEPSPs registrados en el área CA1 tras la estimulación ipsilateral de las colaterales de Schaffer con pares de pulsos (primer estímulo: St.1. Segundo estímulo: St.2, intervalo entre estímulos 40 ms) a intensidades crecientes (0.02-0.4 mA). Ejemplo en intensidades de 0.26 mA (1) y 0.36 mA (2). Las flechas blancas y negras indican el artefacto producido en el registro por los estímulos. B. Representación del promedio de la pendiente de los fEPSPs provocados en el área CA1 tras la estimulación de las fibras colaterales de Schaffer con pares de pulsos: St. 1 (círculo blanco) y St.2 (círculo negro). n=5-7 dependiendo del grupo experimental. Datos presentados como media±SEM de la pendiente en cada uno de los fEPSPs provocados. ANOVA de dos vías, medidas repetidas. *, p<0.05; contraste simple entre la pendiente del segundo fEPSP con respecto al primero fEPSP.
Resultados
105
Por otro lado, el análisis de la respuesta total obtenida
(fEPSP St.1 + fEPSP St.2) mostró diferencias significativas dependientes
de la intensidad del estímulo aplicada (F(19,323)=62.484, p<0.001) y de la
exposición a los distintos tratamientos (F(3,17)=83.606, p<0.001). En
presencia de Aβ y TQ se observó una respuesta total similar en las
distintas intensidades (Aβ vs. TQ, p=0.977) pero diferente a la respuesta
generada con ambos (Aβ vs. Aβ+TQ, p<0.001; TQ vs Aβ+TQ, p<0.01
Figura 20A) y al control (control vs. Aβ, p<0.001; control vs. TQ,
p<0.001; control vs. Aβ+TQ, p<0.01), sugiriendo que las diferencias son
den función de intensidades estas diferencias varían en función de
rangos de intensidad menores o mayores. De hecho, el estudio de la
evolución del ratio de la respuesta provocada
[St.2 fEPSP/St.1 fEPSP)x100], mostró diferencias significativas entre los
distintos grupos dependiendo de la intensidad del estímulo, en un rango
de intensidades de 0.02 a 0.22 mA, el tratamiento administrado tubo
efectos sobre el ratio de respuestas (F(19,323)=3.806, p<0.001; Figura
20B), hallando el grupo Aβ+TQ significativamente diferente al resto
(F(1,18)=11.389, p<0.001). Sin embargo, en intensidades mayores los
ratios de respuesta fueron similares (F(1,18)=0.637, p=0.601; véase punto
indicado, Figura 20B). Estos datos parecen indicar que Aβ y TQ podrían
estar produciendo alteraciones en la transmisión sináptica de CA3-CA1
con un efecto ligeramente diferente cuando ambos están presentes.
Figura 20. Efectos de Aβ y tertiapina-Q en la respuesta provocada en CA1 a intensidades crecientes. A. Evolución del total de la respuesta total obtenida (St.1 fEPSP + St.2 fEPSP) en el área CA1 tras la estimulación pares de pulsos (primer pulso, St.1 y segundo pulso St.2, intervalo entre estímulos de 40ms) a intensidades crecientes (0.02-0.4 mA) de las fibras colaterales de Schaffer. B. Evolución del ratio de los pares de pulsos (St.2/St.1)x100). Se representan las pendientes del segundo fEPSPs expresado como porcentaje del primero fEPSP [2St fEPSP/ 1St fEPSP)*100] para cada par de pulsos, promedio de 6 pulsos por intervalo entre estímulos. La flecha indica la intensidad donde la relación entre los fEPSPs se torna similar para los distintos grupos. n=5-7 dependiendo del grupo experimental. Los datos se muestran como la media±SEM de las pendientes de los fEPSPs. ANOVA de dos vías, medidas repetidas. *p<0.05.
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106
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4.2.2 Efecto del Aβ y la tertiapina-Q en la facilitación a corto plazo de la sinapsis CA3-CA1 del hipocampo in vivo
Evaluamos la función presináptica en la sinapsis CA3-CA1 del
hipocampo, utilizando el protocolo de facilitación por pares de pulsos,
una forma de plasticidad sináptica a corto plazo. En las fibras
presinápticas por aplicación de un par de estímulos en un periodo corto,
se produce la acumulación de calcio en el terminal nervioso presináptico,
aumentando la respuesta. El aumento de la relación de la respuesta del
St.2 fEPSP/St.1 fEPSP (facilitación) en intervalos cortos (<100ms) refleja
principalmente el aumento del calcio presináptico, que a su vez aumenta
la probabilidad de liberación de neurotransmisores. Estudiamos el efecto
de la exposición de Aβ y TQ sobre la respuesta de facilitación
característica de la sinapsis CA3-CA1 en intervalos de tiempo inferiores a
100 ms (F(5,130)=27,301, p<0.001) hallando diferencias significativas
entre los distintos grupos de tratamiento (F(3,26)=0.347; p=0.03). Aβ
generó una respuesta significativamente diferente al control (Aβ vs.
control, p=0.029), entre los intervalos de 20 ms hasta 200ms (20ms:
p=0.033; 40 ms: p=0.014; 100ms: p=0.005, 200 ms: p=0.031), pero
similar en los intervalos de 10 ms (p=0.195) y 500 ms (p=0.264),
pudiendo reflejar cambios presinápticos resultado del aumento de la
liberación de neurotransmisor en respuesta a estímulos pareados.
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108
Resultados
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Figura 21. Efecto del Aβ y tertiapina-Q en la facilitación sináptica provocada por estimulación por pares de pulsos de la sinapsis CA3-CA1 del hipocampo in vivo. La estimulación por pares de pulsos se realizó con intervalos entre estímulos de 10, 20, 40,100, 200 y 500 ms. La intensidad de corriente fue fijada (de acuerdo al umbral de cada animal) en el 30-40% de la intensidad necesaria para provocar la máxima respuesta, fEPSPs, en cada uno de los animales. A. Promedio representativo de 6 registros de fEPSPs provocados tras la estimulación por pares de pulsos de las fibras colaterales de Schaffer a distintos intervalos entre estímulos: 1- 20ms; 2- 40ms; 3- 100ms. Las flechas indican el artefacto generado tras la aplicación de los estímulos. B. Respuesta provocada en cada uno de los grupos experimentales Salino (círculo), Aβ (cuadrado), TQ (triángulo), Aβ+TQ (diamante), en los intervalos entre estímulos correspondientes, 10, 20, 40, 100, 200 y 500 ms. Los datos se muestran la media±SEM de las pendientes del segundo fEPSPs expresado como porcentaje del primero fEPSP [St.2 fEPSP/ St.1 fEPSP)*100] para cada par de pulsos, promedio de 6 pulsos por intervalo entre estímulos. Nótese que encontramos facilitación en los intervalos entre estímulos inferiores a 100ms y con Aβ observamos más facilitación que en el resto de grupos en los intervalos de 20ms a 200ms. n=7-8 dependiendo del grupo experimental. * p<0.001. ANOVA de dos vías, medidas repetidas; post hoc Bonferroni). ‡ p<0.05; ‡‡ p< 0.01, Aβ vs suero salino. 1: 20ms; 2: 40ms; 3: 100ms.
Resultados
110
4.2.3 Efecto del Aβ y tertiapina-Q en la potenciación a largo plazo del hipocampo in vivo
Evaluamos el efecto de Aβ y TQ, bloqueante de los canales de
potasio GirK, sobre la LTP del hipocampo, un mecanismo de plasticidad
sináptica a largo plazo subyacente a los procesos de aprendizaje y
memoria. La LTP fue inducida por aplicación de estimulación HFS de las
fibras colaterales de Schaffer. Se realizó el análisis de la respuesta de
facilitación provocada en CA1 por medida de la variación de la pendiente
del primer fEPSP a lo largo del tiempo (Figura 22A). Únicamente se
indujo LTP en el grupo control (F(17,102)=6.605; p=0.003; Figura 22B).
No hubo inducción de LTP en presencia de Aβ, TQ, ni Aβ+TQ
(Aβ: F(17,85)=0.957, p=0.513; TQ: F(17,119)=0.835, p=0.651;
Aβ+TQ: F(17,102)=0.614, p=0.874; Figura 22B). La alteración de la LTP
podría subyacer a los déficits tempranos en procesos cognitivos de
memoria relacionados con la EA.
Figura 22. Efectos de la inyección icv. de Aβ y tertiapina-Q en la LTP del hipocampo in vivo. A. Ejemplos representativos de los fEPSPs registrados en CA1, en cada uno de los grupos experimentales, salino, Aβ, TQ y AΒ+TQ antes (línea base, BL) y después (día 1-4) de la estimulación de alta frecuencia (HFS) en la fibras colaterales de Schaffer. Las flechas indican el artefacto generado tras la aplicación del estímulo (St.). B. Curso temporal de la pendiente de las respuestas registradas. El primer día se estableció la línea base de cada animal, y seguidamente se aplicó el protocolo de estimulación de alta frecuencia, continuado de 30 minutos de registro (día 1) y 15 min de registro 24, 48 y 72 h después (días 2, 3 y 4) con el mismo rango de estimulación y frecuencia que los aplicados durante la obtención de la línea base. La respuesta provocada representa la media de los fEPSP±SEM sobre la línea base (%) en cada uno de los grupos experimentales: salino (círculo), Aβ (cuadrado), TQ (triángulo) y Aβ+TQ (diamante). Nótese que únicamente el grupo expuesto a suero salino presenta potenciación a largo plazo (F(17,102)=6.6054; p=0.003.) * p<0.05 (ANOVA de dos vías, post hoc Bonferroni). n=6-8 dependiendo del grupo experimental.
Resultados
111
Resultados
112
4.3 Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la actividad rítmica del área CA1 del hipocampo
Estudiamos el efecto de la inyección icv. de Aβ y TQ sobre la
actividad rítmica del área CA1 del hipocampo, a partir del análisis de
180s libres de artefactos en registros de EEG de 5 min en animal en
reposo. La actividad rítmica hipocampal ha sido relacionada
clásicamente con distintos estados cognitivos, siendo asociada a la
realización de tareas como el aprendizaje y la memoria. Estudiamos las
variaciones de la actividad rítmica por análisis de los poderes espectrales
en bandas de frecuencia a lo largo del tiempo (Figura 23). En presencia
de Aβ, grupos con Aβ y Aβ+TQ, desde el primer día y, con efecto
mantenido a lo largo del tiempo, se encontró un incremento en el poder
espectral (tanto en bajas como altas frecuencias, paneles izquierdo y
derecho, respectivamente Figura 23), siendo menor este incremento en
presencia de Aβ+TQ (Figura 23B y D). La presencia de TQ no pareció
tener efecto sobre el poder espectral. Al igual que lo observado en el
control (Figura 23 A y C).
Resultados
113
Figura 23. Efecto de Aβ y tertiapina-Q en las bandas de frecuencia del hipocampo de CA1. Análisis del poder espectral con transformada de Fourier en 180 s de registro en el área CA1 en cada uno de los días (código de colores de morado a rojo) por grupo de tratamiento: suero salino, Aβ, TQ y Aβ+TQ (de arriba a abajo en la figura). En las gráficas de la izquierda se han representado bajas frecuencias (de 1- 40 Hz) y en las gráficas de la derecha se han representado altas frecuencias (60-80 Hz). El primer día de registro fue realizado previo a las icv. (Día 0, color morado). Las inyecciones fueron realizadas los días 1, 2, 3 (D1-3) registrando 1 h después de cada una. Se realizó el seguimiento de la evolución del EEG durante 24, 48 y 72 h post icv. (D4-6). Nótese que la escala correspondiente al grupo Aβ, tanto en bajas (paneles izquierdos) como altas frecuencias (paneles derechos), es el doble de la escala con respecto al resto de grupos.
Resultados
114
El análisis por bandas de frecuencia en theta y gamma mostró
diferencias significativas a lo largo del tiempo (theta:
F(2.037,961.280)=31.090, p<0.001; Gamma: F(1.579,3000.973)=75.115, p<0.001)
dependientes del fármaco administrado (theta: F(3,477)=23.308, p<0.001;
gamma: F(3,1900)=23.60.134, p<0.001 Figura 24A y B) siendo los efectos
de Aβ superiores a los provocados por Aβ y TQ (Figura 24A y B).
Figura 24. Efecto de la icv. de Aβ y tertiapina-Q sobre theta (A) y gamma (B) hipocampal. A. Theta (4-12 Hz). B. Gamma (26-80 Hz). Cada día (D0-6) se representa el poder espectral correspondiente al intervalo de banda de frecuencia (parte superior de la gráfica) como la media del poder espectral en dicho intervalo (parte inferior de cada gráfica). Se tomó como referencia base, 100% del poder espectral, día 0; D0, sin tratamiento. Los días 1-3 (D1-3) se realizaron una icv./día, y se registró el EEG 1, 24, 48 y 72 h post-icv (D4-6). Nótese que en presencia de Aβ hay un incremento del poder espectral tanto en las bandas de frecuencia theta como gamma. De igual forma, aunque con un incremento menor, ocurrió en presencia de Aβ+TQ. Los datos se representan como media±SEM. ANOVA de dos vías de medidas repetidas. Post hoc Bonferroni: ٭٭٭p<0.001: Aβ vs salino; vs TQ y vs Aβ+TQ. * p<0.05, ***p<0.001: Aβ+TQ vs salino; vs TQ. D: Día.
Resultados
115
Resultados
116
4.4 Efecto de Aβ y tertiapina-Q en el proceso de habituación en campo abierto
Estudiamos el efecto de Aβ y TQ sobre el comportamiento de
habituación en campo abierto, un proceso de memoria no asociativa
dependiente de hipocampo. La habituación ocurre cuando los niveles de
actividad exploratoria disminuyen al re-exponer al animal a un ambiente
conocido. Analizamos la habituación 24 h después de la primera
exposición, denominada training, 1 h tras la inyección de Aβ y TQ.
Durante el training todos los animales exploraron por igual el ambiente
(actividad total: F(3,39)=1.739, p=0.177; horizontal: F(3,39)=1.897, p=0.148;
levantamientos F(3,39)=2.221, p=0.107). En parte superior de la Figura
25A, podemos ver la actividad horizontal registrada en un ejemplo
representativo de cada grupo de tratamiento. Observamos una
habituación al ambiente en la re-exposición al campo abierto, por
disminución de la actividad exploratoria (F(1,35)=77.259, p<0.001)
dependientes del grupo (F(3,35)=2.95; p=0.046; * Figura 25B control:
p<0.001; Aβ: p=0.031; TQ: p=0.002; Aβ+TQ: p=0.004). Sin embargo,
encontramos diferencias significativas en esta prueba entre Aβ, TQ, y
Aβ+TQ. Presentaron mayor número de movimientos que el grupo
control (F(3,38) =8.008 p<0.001; Aβ vs. salino p<0.001, TQ vs. salino
p=0.028, Aβ+TQ vs. salino p=0.030; (‡Figura 25B). Similar respuesta
fue observada con respecto a la actividad horizontal (F(3,38)=8.008,
p<0.001; ‡Figura 25C y D). Sin embargo, el número de levantamientos
no varió entre ambos test (F(1,28)=0.329, p=0.57; Figura 25D). Estos
datos parecen indicar que el Aβ y la pérdida de la función de los canales
GirK, por administración de TQ podrían producir déficits de memoria a
largo plazo dependiente de hipocampo.
Resultados
117
Figura 25. Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la habituación en campo abierto. A. Ejemplo de la actividad exploratoria de un animal representativo de cada grupo: salino, Aβ, TQ y Aβ+TQ. El training fue realizado 48 h antes de la inyección icv. y 1h después se realizó la fase de habituación. Los animales exploraron libremente el ambiente durante 15 min. B. Actividad exploratoria total, sumatorio del número total de haces cruzados en los ejes XYZ. C. Actividad horizontal, sumatorio del número de haces cruzados en XY. D. Número de levantamientos, número total de haces cruzados en Z. Únicamente se contabilizaron aquellos levantamientos en los cuales el animal permaneció sobre sus patas traseras al menos 3s. Nótese que la exploración en el grupo control disminuye con respecto a la exploración inicial y con respecto a la actividad del resto de grupos en la fase de habituación. *p<0.05,** p<0.01,*** p<0.001. Actividad del grupo experimental durante el training vs. habituación (t-test). ‡ p< 0.05, ‡‡ p< 0.01, ‡‡‡ p< 0.001. Actividad del grupo experimental durante la fase de habituación (ANOVA, post hoc Dunnett). Se representa la media±SEM. n=7-10 dependiendo de la prueba y del grupo experimental.
Resultados
118
4.5 Efectos de Aβ y tertiapina-Q en la tarea de reconocimiento de objetos a corto y largo plazo
Estudiamos el efecto de la inyección icv. de Aβ y TQ en la prueba de
NOR como modelo de estudio de memoria de reconocimiento
dependiente de hipocampo. Los roedores muestran más interés en
términos de exploración hacia lo novedoso (Ennaceur, 2010). En la fase
de familiarización con el objeto, training, dos objetos idénticos fueron
expuestos por primera vez y se exploraron por igual (salino: 53.5±5.8;
t(9)=0.604, p=0.561. Aβ: 52.2±7.0; t(9)=0.307, p=0.776. TQ: 51.8±7.7;
t(9)=0.229, p=0.824. Aβ+TQ: 48.1±7.7; t(9)=0.250, p=0.809. Figura
26, training). En la prueba del NOR a corto plazo, previa a las
inyecciones icv., el objeto nuevo, fue explorado en mayor grado que el
familiar (salino: 62.7±4.51; t(5)=2.824, p=0.048. Aβ: 72.1±7.0; t(5)=3.177,
p=0.025.; TQ: 63.1±4.9; t(5)=2.630, p=0.047. Aβ+TQ: 65.2±5.4;
t(5)=2.836, p=0.047. Figura 26, NOR 1). Esta primera prueba mostró la
capacidad de discernir entre el objeto familiar y el objeto nuevo. Se
procedió a evaluar la memoria a largo plazo tras 24 h de retención,
después de 1 h de las inyecciones icv.. Únicamente el grupo salino
(control), exploró durante más tiempo el objeto nuevo (61.7±3.9;
t(7)=2.918, p=0.022. Figura 26, NOR2). En el último test de memoria a
largo plazo, realizado 24 h después, de nuevo sólo en el grupo control el
tiempo relativo de exploración del objeto nuevo fue mayor que el del
objeto familiar (67.7±6.3; t(7) =2.819, p=0.026. Figura 26, NOR3).
Resultados
119
El estudio de los RD mostró que la discriminación del objeto nuevo
fue dependiente de la prueba y del tratamiento (F(3,106)=3.407, p=0.020;
Figura 27). Únicamente en el NOR 1, previo al tratamiento
farmacológico, encontramos RD significativamente superiores en todos
los grupos (salino: t(4)=2,797, p=0.049; Aβ: t(5)=3.173, p=0.025; TQ:
t(5)=2.628, p=0.047; Aβ+TQ: t(4)=2.860, p=0.046) y solo en el grupo
salino (control) el RD fue significativamente diferente en el resto de NOR
Figura 26. Efecto de Aβ y tertiapina-Q en la pruebas de reconocimiento de objetos nuevos a corto y largo plazo. Se analizó el tiempo relativo de exploración de los objetos antes de la administración de los fármacos (pre-tratamiento) y después (post-tratamiento). En el pre-tratamiento, training y NOR 1, los animales ya estaban preseleccionados para el grupo experimental al cual iban a pertenecer. En el training se presentaron dos objetos idénticos. El NOR1 fue realizado tras 3 h de retención.. 24 horas después, se inyectaron icv. salino, Aβ, TQ o Aβ+TQ. 1 h después de las icv. se realizó el NOR 2 (corto plazo), con un objeto nuevo diferente. A las 24 h, se realizó el NOR 3 (largo plazo) con otro objeto nuevo. Nótese, que previa a la administración de los fármacos, el objeto nuevo es explorado más (NOR 1). Sin embargo, tras la administración de Aβ y TQ no diferencian entre familiar y novedoso. Se representa la media±SEM (%). n=6-10 dependiendo de la prueba y del grupo experimental. Análisis realizado por t-test con respecto a un valor prefijado de 50 (tiempo relativo de exploración de ambos objetos similar, * p<0.05, t-test).
Resultados
120
(NOR 2; salino t(7)=2.937, p=0.022. NOR 3: salino: t(7)=2.826, p=0.026;
Figura 27) indicando que en presencia de Aβ y TQ hubo una falta de
discriminación entre objeto familiar y nuevo, manteniéndose en el
tiempo. Estos datos sugieren que la disfunción en los canales GirK podría
subyacer a los déficits en procesos memoria de reconocimiento
dependiente de hipocampo que apareen de manera temprana en la EA.
Figura 27. Efecto de Aβ y tertiapina-Q en el ratio de discriminación del objeto nuevo a corto y largo plazo. Se representa el ratio de discriminación del objeto nuevo. En el training dos copias de un mismo objeto son expuestas por primera vez, y RD próximos a cero indicaron que ambos objetos se exploraron por igual. Sin embargo, tras la fase de retención de 3 h, en el NOR 1, los RD difieren de cero, mostrando preferencia en la exploración del objeto nuevo. 1 h (corto plazo) y 24h (largo plazo) post- icv. únicamente el grupo salino tubo un RD significativamente distinto a cero. Tanto Aβ como TQ alteraron el proceso de discriminación entre objeto familiar y nuevo. Nótese que únicamente el grupo control discriminó los objetos nuevos en cada prueba. Se representa la media±SEM. n=6-10 dependiendo de la prueba y del grupo experimental. (t- test: RD vs 0; donde cero es la exploración por igual de ambos objetos, * p<0.05).
121
5. DISCUSIÓN
Discusión
123
5.1 Aproximación experimental utilizada: Efectos de la exposición a Aβ25-35 sobre el hipocampo de mamíferos
Presentamos un modelo de estudio como aproximación a la
comprensión de la fisiopatología de la EA. Para ello, hemos utilizado el
fragmento sintético Aβ25-35 para determinar sus efectos sobre el
hipocampo encontrando como posible nueva diana de acción los canales
GirK. La administración de fragmentos de Aβ es una práctica extendida
desde la demostración de los efectos tóxicos de monómeros, oligómeros
y fibrillas de Aβ aislados de pacientes de EA sobre procesos relacionados
con el SNC. Por ejemplo, la alteración de la LTP en el hipocampo (Walsh
et al., 2002, Shankar et al., 2008) o la generación de déficits en test de
evaluaciones de funciones ejecutivas y memoria de referencia antes de la
presencia de placas amiloides (Cleary et al., 2005). En este caso, hemos
seleccionado la utilización del péptido sintético Aβ25-35. Corresponde a
los 11 aa (GSNKGAIIGLM) mínimos del dominio intermembrana de APP
que produce efectos tóxicos similares a los de los fragmentos Aβ1-40 y
Aβ1-42 (Kaminsky et al., 2010, Millucci et al., 2010). Es la fracción
predominante en el estudio con modelos animales y hay numerosas
evidencias que muestran efectos tóxicos similares bioquímicos y
alteraciones cognitivas a los observados en pacientes con EA (Kaminsky
et al., 2010, Chambon et al., 2011). El Aβ25-35 se ha localizado en zonas
del sistema límbico de cerebros de pacientes de EA, previa a la presencia
de placas, y parece estar generado de forma natural por escisión
enzimática del fragmento Aβ1-40 (Kubo et al., 2003). La presencia de
este tipo de Aβ promueve la propia producción de Aβ1-42 endógeno y la
generación de otras especies tóxicas de Aβ (Kaneko et al., 2001, Kubo et
al., 2003, Klementiev et al., 2007, Kaminsky et al., 2010, Meunier et al.,
2013). Este hecho, junto con el incremento del Aβ de acuerdo a la
progresión de la enfermedad (Gruden et al., 2004, Kaminsky et al., 2010)
hacen del Aβ25-35 un péptido de gran interés en el estudio de modelos
de etapas tempranas de la EA.
Discusión
124
Entre los posibles distintos mecanismos que pueden subyacer a la
disfunción neural promovida por Aβ25-35 se ha descrito afectación de la
transcripción génica y el tráfico proteico, alteración de niveles de
neurotransmisores, desregulación enzimática, estrés oxidativo,
desregulación de la homeostasis del calcio, de la integridad celular,
apoptosis y muerte celular o alteración del proceso de LTP en el
hipocampo (Kaminsky et al., 2010). Ningún mecanismo puede
descartarse, sobre todo dado que parecen ser dependientes de la etapa de
la enfermedad. Por ello, hemos seleccionado una aproximación al
estudio de las etapas tempranas de la EA utilizando Aβ soluble con la
finalidad de analizar los efectos tóxicos agudos, in vitro e in vivo, sobre
la expresión génica, neurotransmisión, plasticidad sináptica,
excitabilidad y actividad rítmica en el hipocampo, como posibles
mecanismos implicados en déficits cognitivos de las primeras etapas de
la EA.
5.1.1 Estudio de los efectos del Aβ sobre la expresión génica en un modelo in vitro en rodajas de hipocampo de rata
Hemos realizado un estudio sobre los efectos de Aβ en la expresión
génica de 17 genes que codifican subunidades de receptores y canales de
las vías de neurotransmisión glutamatérgica, colinérgica y GABAérgica
del hipocampo en un modelo in vitro con rodajas de hipocampo de rata.
La utilización de rodajas de hipocampo como modelo de estudio de la
fisiopatología de enfermedades como la EA es una excelente elección
dada toda la información disponible sobre la citoarquitectura y la
organización sináptica del hipocampo. La principal ventaja de la
utilización de un modelo in vitro es el control fino de las condiciones
experimentales, a la vez que se preserva la conectividad del cerebro in
vivo (Cho et al., 2007, Fitzjohn et al., 2008). Utilizamos Aβ25-35 a una
concentración de 1 µM, durante 30 y 120 min. La selección de esta
concentración se realizó basándonos en experimentos electrofisiológicos
previos que muestran una disfunción en distintas sinapsis (Ashenafi et
al., 2005, Santos-Torres et al., 2007, Nava-Mesa et al., 2013) en
Discusión
125
hipocampo utilizando Aβ25-35 en concentraciones de 0.5 a 1.5 µM.
Datos previos han mostrado que el Aβ25-35 induce disfunción sináptica
después de unos 20 min post-perfusión perdurando los efectos hasta 2 h.
La actividad máxima dependiente de cambios en la expresión se ha
reportado en torno a una ventana temporal de 0.5 a 2 h (Guzowski et al.,
2001, Parra-Damas et al., 2014). Por ello, 30 y 120 min fueron
seleccionados como ventanas temporales de estudio con el fin de poder
correlacionar posibles efectos en la disfunción sináptica con cambios en
los niveles de RNA (para más detalle véase sección 3.1.1.4).
Por otro lado, hoy en día la técnica de qPCR es utilizada como una
herramienta rutinaria para la cuantificación de la expresión génica. La
gran ventaja es la alta especificidad y la sensibilidad a través del análisis
de muy poca cantidad de muestra. Sin embargo, una de las mayores
limitaciones es la variabilidad de resultados obtenidos debido a la
influencia de variables metodológicas como, la calidad del RNA (Fleige
and Pfaffl, 2006) o los genes de referencia utilizados (Schmittgen and
Zakrajsek, 2000, Bustin, 2002, Huggett et al., 2005, Nolan et al., 2006,
Bonefeld et al., 2008, Dos-Anjos et al., 2008). Por ello, previo al análisis
de los efectos del Aβ sobre la expresión génica en el hipocampo se
procedió a la estandarización de la metodología de qPCR en nuestras
condiciones experimentales. En primer lugar, validando la calidad de
RNA extraído de rodajas de hipocampo de rata a partir del índice de
calidad del RNA. Posteriormente, validando la estabilidad de los genes
de referencia Actb, Gapdh y Ppia por dos algoritmos matemáticos:
NormFinder (Andersen et al., 2004) y Bestkeeper (Pfaffl, 2001). Tras la
validación del modelo de investigación, se realizó el estudio del efecto del
Aβ sobre la expresión génica de 17 genes que codifican subunidades de
receptores y canales implicados las vías de neurotransmisión
glutamatérgica, colinérgica y GABAérgica en el hipocampo.
Discusión
126
5.1.1.1 Estandarización del análisis de los niveles de RNA en rodaja de hipocampo de rata
5.1.1.1.1 Calidad e integridad de muestras de RNA
Una de las mayores limitaciones en la técnica de la qPCR es la
variabilidad de resultados obtenidos debido a la influencia de variables
metodológicas como la calidad del RNA (Fleige and Pfaffl, 2006). Por
ello se realizó el análisis de los RQI. Solo fueron incluidas en el estudio
muestras con RQI mayores o iguales a 7.5, siendo este un punto de
referencia de muestras con RQI de buena o muy buena calidad. Los datos
obtenidos mostraron que ni el tiempo de incubación, ni la incubación
con Aβ afectan a la integridad del RNA extraído de rodajas de hipocampo
de rata, de acuerdo al protocolo establecido. Clásicamente, la integridad
del RNA se determinaba por el ratio de absorbancias 260/280
(indicando la presencia de contaminación de fragmentos proteicos o de
DNA) y el análisis de las bandas de RNA ribosomal por electroforesis en
geles de agarosa. Sin embargo, la utilización de electroforesis de
microfluidos por capilar desarrolla por Bio-Rad (Experion System,
EEUU.) permite hacer estas estimaciones de forma objetiva mediante un
algoritmo basado en las áreas de las regiones 28S, 18S y pre-18S de los
electroferogramas generados evaluando la integridad del RNA de forma
objetiva (Nolan et al., 2006, Bustin et al., 2009). Por ello, podemos
concluir que el RNA utilizado para esta investigación ha sido de buena
calidad, siendo un modelo de estudio adecuado.
5.1.1.1.2 Genes de referencia
Actb, Gapdh y Ppia son genes clásicamente seleccionados como
genes de referencia en estudios de expresión génica en SNC (Bonefeld et
al., 2008). El gen de referencia ideal para la normalización de los niveles
de expresión génica en qPCR sería aquel que constitutivamente esté
activo, y se exprese por igual en todas las muestras y condiciones
estipuladas en el experimento, sin tener en cuenta el tejido, el
tratamiento realizado, la etapa de la enfermedad, o las condiciones
Discusión
127
experimental fijadas (Bonefeld et al., 2008). Encontramos estabilidad de
la expresión génica de estos genes a lo largo del tiempo y en las distintas
condiciones experimentales. Siguiendo las recomendaciones de la guía
MIQE (Bustin et al., 2009) analizamos y clasificamos estos genes de
acuerdo a su estabilidad por dos algoritmos distintos BestKeeper (Pfaffl
et al., 2004) y NormFinder (Andersen et al., 2004). En nuestro estudio
Ppia fue seleccionado entre los tres candidatos como el gen más estable,
tanto con BestKeeper como NormFinder. Este resultado contribuye a
objetivar y estandarizar el análisis de la expresión génica en rodajas de
hipocampo de rata. Además, describimos por primera vez un método de
análisis de la integridad del RNA en rodajas de hipocampo de rata,
metodología utilizada ampliamente en otro tipo de estudios, como son
los electrofisiológicos (Fitzjohn et al., 2008). Por lo tanto, este enfoque
representa una herramienta útil para analizar más a fondo los
mecanismos moleculares implicados en el funcionamiento de los
circuitos del hipocampo.
5.1.2 Estudio de los efectos de Aβ25-35 y sobre los canales GirK en el hipocampo de ratón en un modelo in vivo
Hemos estudiado los efectos de Aβ25-35 y TQ sobre el hipocampo
de ratón C57BL/6J por inyección a través de cánula guía en ventrículo
lateral con jeringa unida a bomba de inyección. La selección de este tipo
de inyección como medio de administración de los fármacos ofrece la
gran ventaja de poder realizar administraciones seriadas o únicas en
distintos tiempos sin necesidad de anestesia continua de los animales y
con un control preciso de la velocidad de entrada del fármaco. Por otro
lado, en ratón es preferible la realización de inyecciones icv. que la
administración por inyección intra-hipocampal dado la probabilidad alta
de daño tisular por reacciones de inflamación en la zona de la inyección.
Por otro lado, la utilización del Aβ25-35 soluble por inyección icv.
en modelos in vivo está muy extendida dado que por su pequeño tamaño
es más difusible (Chambon et al., 2011) y se puede realizar una
aproximación de los efectos tóxicos sobre los circuitos y la respuesta del
Discusión
128
sistema a la presencia de un exceso de Aβ y permitiendo el estudio de los
efectos a lo largo del tiempo. Por ejemplo, la aplicación icv. de agregados
de Aβ25-35 muestra cómo se van distribuyendo por zonas como los
ventrículos laterales, hipocampo, amígdala, núcleo basal de Meynert y
septum después de 24 h de su aplicación (Zussy et al., 2011). En estudios
a largo plazo, de al menos 6 semanas, también se localiza en estructuras
como corteza frontal, así como en tálamo e hipotálamo (Zussy et al.,
2013). Así, este tipo de inyección facilita la administración y se
mimetizan las zonas de distribución de Aβ con las encontradas en
pacientes de EA. En este estudio se ha utilizado una dosis final de
9 nmol/ratón de Aβ25-35, aplicada en una única inyección en los
estudios referentes al comportamiento y en tres inyecciones con un
margen de 24 h entre ellas, en los estudios referentes a la funcionalidad
del circuito hipocampal. De acuerdo a estudios en los que la utilización
de dosis de 9 nmol muestra déficits de memoria en tareas como el NOR
(Maurice et al., 1996, D'Agostino et al., 2012, Yang et al., 2012) y dosis
similares muestran efectos en LTP (Freir et al., 2001, Freir et al., 2003,
Gengler et al., 2007, Holscher et al., 2007, Gault and Hölscher, 2008).
Por otro lado, utilizamos el fármaco TQ como bloqueante selectivo de los
canales GirK, el cual se une al dominio extracelular que une los
segmentos intermembrana M1 y M2 de las subunidades de GirK (Ramu
et al., 2004). Hemos utilizado TQ a una concentración de 1 µM. Las dosis
utilizadas de este fármaco varían de concentraciones de pmolar, nmolar
a µmolar, dependiendo del tipo de estudio. Por ejemplo, las dosis
inferiores, de 100 pmol de TQ se suelen administrar por vía intratecal
para evitar la aparición de espasmos en el torso en estudio de analgesia y
dolor (Marker et al., 2004, Llamosas et al., 2015). En algunos estudios en
rodajas de hipocampo han utilizado dosis de 100 nM, encontrando
resultados de bloqueo parcial de los IPSPs provocados, entre otras causa,
posiblemente debido a la dosis utilizada (Best et al., 2007) como
muestran los resultados de modelos in vitro con oocitos de Xenopus,
donde los efectos de la TQ sobre GirK son dosis dependientes (Kanjhan
et al., 2005). Debido a ello, hemos seleccionado una dosis de 1 µM,
Discusión
129
basándonos en la respuesta inhibitoria obtenida en rodajas de
hipocampo de rata en estudios previos del laboratorio (Nava-Mesa et al.,
2013) y con base en que concentraciones más elevadas de TQ, 5 µM, son
utilizadas en la generación de modelos epilépticos crónicos (Mazarati et
al., 2006), siendo pro-convulsionante y generando actividad
epileptiforme, como ocurre en el caso de los Knockout de GirK2
(Signorini et al., 1997).
5.2 Efectos de Aβ en la expresión génica de receptores y canales glutamatérgicos, colinérgicos y GABAérgicos en rodajas de hipocampo de rata
En el presente trabajo se ha estudiado los efectos del Aβ en la
expresión génica de receptores de neurotransmisores y canales de
sistemas excitatorios-inhibitorios de los circuitos hipocampales. Hemos
aportado información sobre dos dianas reguladas por Aβ, los canales
KCNQ y los canales GirK (Mayordomo-Cava et al., 2015). Ambos tipos de
canales participan en el control de la excitabilidad neuronal y
recientemente han sido relacionados con la patogénesis de la EA (Leão et
al., 2012, Durán-González et al., 2013, Nava-Mesa et al., 2013). Ambas
conductancias al K+, se han visto disminuidas por Aβ, lo cual podría
contribuir a la hiperexcitabilidad y la disfunción de redes neuronales
posiblemente relacionados con los déficits cognitivos que aparecen en las
primeras etapas de la EA (Palop and Mucke, 2010, Mucke and Selkoe,
2012).
5.2.1 Genes diana de Aβ en el hipocampo
Recientes trabajos sugieren el impacto del Aβ en la transcripción
génica como un evento importante que precede a la neurodegeneración
(Sebollela et al., 2012). En este sentido, recientes estudios de
microarrays en tejido hipocampal (Berchtold et al., 2013), o en célula
única de neuronas de CA1 (Counts et al., 2014) revelan la regulación a la
baja de genes implicados en la sinapsis. Un estudio muy interesante
revela cambios en los perfiles de expresión génica en neuronas de CA1 en
Discusión
130
componentes pre y postsinápticos en etapas de MCI. Los autores
remarcan que el conocimiento del perfil de expresión génica
dependiendo del tipo celular y la etapa de la enfermedad, en particular
en etapas con deterioro cognitivo leve, será fundamental para detectar
genes vulnerables y poder abordar posibles terapias por esta vía (Counts
et al., 2014). En este sentido, se ha descrito el aumento de la expresión
de genes como ARC en pacientes con EA y en modelos animales
(Kerrigan and Randall, 2013). En el modelo de estudio que presentamos,
hemos encontrado un aumento de la expresión génica de Arc, resultados
que van en consonancia con los presentados por otros autores (Lacor et
al., 2004, Kerrigan and Randall, 2013). La sobreexpresión de Arc se ha
relacionado con déficits en aprendizaje, lo que sugiere una base
molecular para la pérdida específica en tareas de memoria de forma
temprana en la EA. La modulación de la expresión génica de Arc por Aβ
podría tener un posible papel en las alteraciones neurofisiológicas de
nuestro modelo experimental de EA.
Aunque los mecanismos precisos no son totalmente conocidos, se
ha visto que alteraciones sinápticas que llevan a una hiperactividad de
los circuitos podrían ser eventos tempranos en la EA (Sperling et al.,
2009). En este sentido recientemente han sido descritos como posibles
dianas del Aβ dos canales de potasio que participan en el control de la
excitabilidad neuronal del hipocampo. Los canales de potasio KCNQ
(Durán-González et al., 2013) y los canales de potasio rectificadores de
corriente de entrada (Nava-Mesa et al., 2013). El presente trabajo,
describimos como efecto del Aβ una disminución de los niveles de RNA
de diferentes subunidades de estos canales. También encontramos que el
Aβ reduce la expresión génica de la subunidad del receptor ionotrópico
de glutamato, GluN1 y del metabotrópico, mGlu1.
5.2.1.1 Receptores de glutamato y Aβ
A pesar de las evidencias que hay de los efectos del Aβ sobre la
neurotransmisión glutamatérgica, en nuestras condiciones
Discusión
131
experimentales solo encontramos modificaciones significativas en
subunidades de receptores de tipo NMDA y mGlu.
La activación de receptores NMDA ha sido extensamente
relacionada con la disfunción sináptica involucrada en la EA (Paula‐Lima
et al., 2013). En este estudio no encontramos diferencias significativas en
los niveles de expresión de las subunidades de receptores de NMDA,
GluN2A ni GluN2B, mientras que GluN1 disminuyó en presencia de Aβ.
De acuerdo con estos resultados, los niveles de GluN1 también fueron
disminuidos en córtex cerebral de pacientes con EA (Hynd et al., 2001).
Esta reducción también se ha encontrado en tejido de cerebro de rata (Xi
et al., 2015). Además, en el estudio de alteraciones de la expresión génica
de receptores glutamatérgicos en etapas tardías de EA esporádico, han
mostrado GluN1 es regulado a la baja en el hipocampo de estos pacientes
por PCR y métodos de hibridación en array (Jacob et al., 2007). Sería
muy interesante saber qué ocurre en etapas tempranas de la EA, cuando
los mecanismos compensatorios no hubieran actuado aún.
Niveles de RNA de GluN2B y GluN2A fueron disminuidos en
regiones susceptibles de regiones de cerebros postmorten de pacientes
con EA, como el hipocampo o el córtex (Hynd et al., 2004). Por el
contrario, como en nuestro estudio, otros no han encontrado evidencias
en cerebros de pacientes con EA, de los efectos de Aβ sobre los niveles de
RNA de GluN2A y GluN2B (Mishizen-Eberz et al., 2004).
El Grupo I de receptores metabotrópicos de glutamato, mGlu1 y
mGlu5, participan en la regulación de la plasticidad sináptica y la
excitabilidad glutamatérgica postsináptica (Pinheiro and Mulle, 2008).
Nosotros encontramos que Aβ disminuye los niveles de RNA de mGlu1
pero no hay diferencias significativas en cuanto a la expresión génica de
mGlu5. Resultados similares han sido reportados en el córtex cerebral de
pacientes con EA (Albasanz et al., 2005), donde mGlu1 es regulado a la
baja (sin cambios en mGlu5) por disminución significativa en sus niveles
de expresión, los cuales correlacionan con la severidad de la enfermedad.
La neurotransmisión glutamatérgica, a través de los receptores de
tipo AMPA ha sido ampliamente relacionada con la patología de la EA.
Discusión
132
En ratones transgénicos APP/PS1, la expresión de las subunidades
GluA1-4 del receptor AMPA, no se encuentran sobreexpresadas,
sugiriendo que la sobreexpresión de Aβ, por sí sola, no afecta a la
transcripción de subunidades de este receptor de glutamato (Shemer et
al., 2006). También se ha visto, que oligómeros de Aβ reducen la
fosforilización de la subunidad GluA1, llevando a una menor expresión
en membrana sin evidencias en una alteración a nivel de transcripción
(Miñano-Molina et al., 2011). Nuestros resultados van dirigidos en ese
sentido, dado que no se observan cambios a nivel de expresión génica, no
pudiendo descartar que existan cambios a nivel de proteína. Por otro
lado, la subunidad GluA2 del receptor de glutamato AMPA, ha sido
ligada a efectos tóxicos del Aβ (Gaisler-Salomon et al., 2014). Se ha
observado un incremento de RNA de GluA2 en la zona de la corteza
prefrontal de pacientes con EA (Williams et al., 2009). Sin embargo, en
este último estudio solo fue utilizado un gen de referencia en la
validación de los datos, lo que podría explicar que no encontremos
diferencias significativas en nuestras condiciones experimentales.
5.2.1.2 Canales de K+ y Aβ
Estudios previos en el laboratorio han mostrado que la perfusión del
péptido Aβ25-35 en rodajas de hipocampo de rata, altera la
neurotransmisión septo-hipocampal a través de sinapsis fimbria-CA3,
disminuyendo la conductancia de los canales GirK. Entre los efectos
encontrados se incluyen, despolarización de neuronas piramidales de
CA3, incremento de la resistencia de entrada, y disminución de la
neurotransmisión inhibitoria mediada por receptores GABAB (Nava-
Mesa et al., 2013). Los canales GirK podrían tener un papel relevante en
los mecanismos subyacentes a la pérdida de la ritmicidad septo-
hipocampal que promueve fallos en la plasticidad sináptica y la
formación de la memoria relacionados con la EA (Nava-Mesa et al., 2013,
Nava-Mesa et al., 2014). La incubación con Aβ induce una regulación a la
baja de tres genes que codifican para las subunidades de GirK2, GirK3 y
GirK4. Los niveles de RNA de GirK2 y Girk3 fueron alterados en 30 y 120
Discusión
133
min. A partir del estudio de animales transgénicos, se ha visto la
implicación de GirK2 en la aparición de fenotipos con déficits cognitivo
en pruebas de aprendizaje y memoria, sistema de recompensa,
coordinación motora, epilepsia, o síndrome de Down (Lüscher and
Slesinger, 2010, Luján et al., 2014).
También hemos encontrado una disminución de la expresión génica
a lo largo del tiempo en los niveles de RNA de Girk4. Los niveles de
expresión génica de GirK4 son muy bajos en ciertas regiones del cerebro
si se comparan con los niveles encontrados del resto de subunidades. En
la formación hipocampal, la expresión de GirK4 es mayoritaria en
neuronas piramidales de CA3 pero moderada en piramidales de CA1 y
células granulares del giro dentado (Wickman et al., 2000). Sin embargo,
aunque las técnicas inmunohistoquímicas muestren una expresión baja
de esta subunidad en la formación hipocampal, el knockout de Girk4
tiene alteraciones en test de memoria y aprendizaje espacial (Wickman et
al., 2000). Es plausible entonces que la qPCR nos haya permitido
encontrar modulación de la transcripción por Aβ en rodajas de
hipocampo, mientras que con las técnicas inmunohistoquímicas
utilizadas hasta el momento no se haya podido detectar cambios sutiles,
como ha ocurrido en otros tejidos del sistema nervioso con otros canales
de potasio (Navarro-Lopez et al., 2009). Entonces, nuestros resultados
muestran una nueva metodología de detección de cambios en la
expresión génica de Girk4, los cuales podrían explicar las alteraciones en
el sistema hipocampal que implican déficits cognitivos asociados a esta
subunidad (Wickman et al., 2000).
Por otro lado, los resultados han mostrado que el Aβ no modula de
manera significativa los niveles de RNA de M1. Entre los distintos tipos
de receptores muscarínicos, M1 ha sido ampliamente relacionado con la
EA (Tsang et al., 2006, Caccamo et al., 2009, Fisher, 2012). Se ha visto
que el Aβ afectaría a la interacción entre el receptor M1 proteínas G
asociadas (Janickova et al., 2013). Los canales KCNQ son los efectores de
receptores muscarínicos. Son 5 miembros KCNQ1-5, codificados por
cinco genes distintos KCNQ1–5 (Gutman et al., 2003). En particular, se
Discusión
134
ha demostrado que los heterómeros de KCNQ2-3 (Wang et al., 1998),
KCNQ4 (Kubisch et al., 1999), KCNQ5 (Schroeder et al., 2000),
participan en el mantenimiento de la corriente de tipo M y juegan un
papel crucial en la regulación de la excitabilidad neuronal (Delmas and
Brown, 2005). Los canales M clásicos, están formados por KCNQ2-3
(Wang et al., 1998, Delmas and Brown, 2005). Hemos encontrado que la
expresión de ambas subunidades se encuentra disminuida por Aβ en el
hipocampo, en nuestro modelo de estudio. En consonancia con nuestros
resultados, recientemente se ha visto que la corriente de potasio de tipo
M en el área septal medial podría tener un papel relevante en la
patofisiología de la EA (Leao et al., 2012), explicando por qué
bloqueantes de la corriente de potasio de tipo M dejan de mejorar la
cognición en ensayos clínicos de EA (Rockwood et al., 1997). También se
ha visto una regulación a la baja de Kcnq2 en el hipocampo (Durán-
González et al., 2013). En estas condiciones, la reducción de la corriente
de K+ de tipo M, aumentaría rápidamente la excitabilidad de las células
piramidales del hipocampo, y de interneuronas GABAérgicas, generando
pérdida de ritmicidad y actividad sincrónica (Leao et al., 2012, Durán-
González et al., 2013). Después de 120 minutos, no hubo diferencias
significativas en la expresión génica de Kcnq2, sugiriendo algún tipo de
mecanismo compensatorio para restaurar el estado pre-incubación con
Aβ. Esto también ocurre con efectos a largo plazo (Leao et al., 2012,
Durán-González et al., 2013). Finalmente, se ha demostrado
recientemente que el control de la excitabilidad mediada por KCNQ5 en
el hipocampo podría ser a través de la modulación de la inhibición
sináptica (Fidzinski et al., 2015). Sin embargo, en nuestras condiciones
experimentales, no encontramos variaciones en los niveles de expresión
génica, sugiriendo que, en un principio, KCNQ5 no parecería estar ligado
a la patofisiología de la EA.
Podemos concluir que, basándonos en un método de análisis
estandarizado y validado, hemos mostrado la modulación de los niveles
de RNA por Aβ25-35 en rodajas de hipocampo de rata. Además de
informar de la modulación de la neurotransmisión glutamatérgica en el
Discusión
135
hipocampo por Aβ, mostramos la evidencia de dos dianas de Aβ que
participan en el control de la excitabilidad y recientemente han sido
relacionadas con la AD, los canales KCNQ (Leao et al., 2012, Durán-
González et al., 2013) y GirK (Nava-Mesa et al., 2013, Mayordomo-Cava
et al., 2015). Aβ disminuye la expresión de ambos tipos de canales. Dada
la implicación de estos canales en el control de la excitabilidad neuronal,
podrían contribuir a una hiperexcitabilidad y una disfunción en circuitos
neuronales, que podrían subyacer a la patofisiología de las etapas
tempranas de la EA (Palop and Mucke, 2010, Mucke and Selkoe, 2012).
Nuestros datos están en la misma dirección con el nuevo concepto de
reducción de la excitabilidad y aumento de la ritmicidad como nuevo
enfoque prometedor en EA (Ma et al., 2002, Huang and Mucke, 2012,
Leão et al., 2012, Mucke and Selkoe, 2012, Verret et al., 2012). La
presencia de convulsiones y actividad epileptiforme en algunos sujetos
con EA, apoyan la hipótesis de que redes neuronales con actividad
anómala pueden contribuir a los déficits sinápticos y cognitivos (Palop
and Mucke, 2009). La utilización de fármacos antiepilépticos como
activadores de KCNQ (Linley et al., 2012) o GirK (Lüscher and Slesinger,
2010, Kaufmann et al., 2013, Luján et al., 2014) podrían mejorar esos
déficits a pesar de que actualmente no haya evidencia clínica disponible
(Nava-Mesa et al., 2014).
5.3 Efectos del Aβ sobre los canales GirK en el hipocampo en un modelo in vivo de etapas tempranas de EA
Hemos estudiado los efectos del Aβ y su posible acción sobre los
canales GirK como posible mecanismo de disfunción temprana en el
hipocampo in vivo. Para ello, se implantaron electrodos bipolares
extracelulares y analizamos la respuesta provocada en CA1 tras la
estimulación en CA3, vía colaterales de Schaffer. Este es un modelo
excelente de estudio de la neurotransmisión CA3-CA1 en el hipocampo
(Gruart et al., 2006, Madroñal et al., 2009). Se aplicaron varios
protocolos de estimulación con el fin de evaluar aspectos como la
excitabilidad en el hipocampo o la evolución de la respuesta de
Discusión
136
facilitación en CA1 a corto y largo plazo. Las curvas de respuesta input-
output proporcionan una aproximación sencilla sobre el estado del
circuito hipocampal. Aumentando la intensidad de estimulación
paulatinamente, y manteniendo el intervalo entre estímulos fijo,
podemos obtener información relevante sobre el estado de excitabilidad
del sistema y el grado de respuesta provocada (Gruart et al., 2006,
Madronal et al., 2007). Por el contrario, el estudio de la estimulación por
pares de pulsos, la intensidad de estimulación se mantiene fija
(determinada previamente a una intensidad fija) y se varia el intervalo
entre estímulos, proporciona información relevante sobre el proceso de
facilitación a corto plazo y la modulación presináptica en la liberación de
neurotransmisor (Zucker and Regehr, 2002). Por otro lado, la aplicación
del protocolo HFS en las fibras colaterales de Schaffer se provoca la
inducción de la LTP en la región CA1 del hipocampo, mecanismo de
plasticidad sináptica a largo plazo y modelo clásico de procesos de
aprendizaje y memoria (Bliss and Collingridge, 1993).
5.3.1 Disfunción de los canales GirK y alteración de la actividad del circuito hipocampal
En el modelo de estudio que presentamos, encontramos que en CA1
hay cierto grado de hiperexcitabilidad reflejado en el aumento del
número de respuestas epileptiformes tras la aplicación de estimulación a
intensidades crecientes (0.02 a 0.4 mA; con pares de pulsos a 40 ms de
intervalo entre estímulos) en las fibras colaterales de Schaffer. Hay
varios estudios que muestran la alteración del funcionamiento de redes
neuronales, con zonas hiperactivas sugiriendo que la presencia de Aβ
como un evento temprano subyacente a la aparición del deterioro
cognitivo leve característico de las etapas tempranas de EA (Putcha et al.,
2011, Bakker et al., 2012, Vossel et al., 2013). Se postula que estas
alteraciones podrían comenzar años antes de la aparición de los
síntomas, dado que en algunos casos, el análisis de tejido postmorten de
pacientes sin síntomas cognitivos ha revelado la presencia de depósitos
de Aβ (Palop and Mucke, 2009, Sperling et al., 2009). Estas zonas de
Discusión
137
hiperactividad podrían estar relacionadas con zonas hiperexcitables. Por
ejemplo, modelos de transgénicos de APP humano, en concreto los
ratones J20, presentan actividad epileptiforme basal en el giro dentado
(Palop et al., 2007, Sanchez et al., 2012) y la corteza parietal (Verret et
al., 2012). Otros modelos no transgénicos, de inyección de varias
especies de Aβ, como protofibrillas, acaban desarrollando este tipo de
actividad en las mismas áreas, aunque parece ser que las formas
oligoméricas no muestran ese mismo patrón (Minkeviciene et al., 2009).
En relación a esto, el tratamiento con levetiracetam, fármaco
antiepiléptico que reduce la actividad hipocampal, tanto en transgénicos
(Sanchez et al., 2012) como en pacientes (Bakker et al., 2012) produce
una mejoría en la realización de tareas de memoria de reconocimiento.
En las condiciones de registro de nuestro modelo, registros de EEG de 5
minutos, con el animal en movimiento restringido hayamos este tipo de
actividad en presencia de estimulación, pero no de forma basal. La
diferencia de resultados entre modelos de estudio podría ser debido a
que en dichos modelos se realizan registros del EEG en libre movimiento
del animal monitorizados durante 24 h en periodos de tiempo de al
menos de dos semanas (Palop et al., 2007, Busche et al., 2008,
Minkeviciene et al., 2009, Verret et al., 2012, Nava-Mesa et al., 2013).
Dichos autores proponen el desbalance entre vías excitatoria e
inhibitorias como posibles mecanismos de alteración de la actividad de
estas zonas. Apoyando esa hipótesis otros autores también han aportado
datos sobre el incremento de actividad de la vía excitatoria en
piramidales del hipocampo (Minkeviciene et al., 2009, Sun et al., 2009)
o la alteración de la vía GABAérgica (Palop et al., 2007, Sun et al., 2009,
Sanchez et al., 2012, Verret et al., 2012). En este sentido, los canales GirK
en el hipocampo contribuyen a la excitabilidad neuronal (Lüscher et al.,
1997, Chen and Johnston, 2005, Hibino et al., 2010) siendo candidatos
de estudio. En el modelo transgénico Knockout de GirK2 los animales
presentan convulsiones espontáneas y son más susceptibles a la
presencia de antagonistas de GABA, mostrando hiperexcitabilidad
generalizada (Signorini et al., 1997). En modelos de epilepsia por
Discusión
138
estimulación eléctrica repetida la activación de canales GirK a través de
receptores de galanina de tipo 2 previene la actividad epileptiforme y las
convulsiones asociadas (Mazarati et al., 2006).
Un resultado llamativo es la similitud de resultados entre Aβ y TQ
administrados por separado y administrados juntos. Cabría esperar que
si cada uno, de manera independiente, altera la actividad neuronal del
hipocampo, la presencia de ambos produjera un efecto diferente, incluso
sinérgico. Este efecto no ha sido observado, pudiendo reflejar la
activación de mecanismos compensatorios que, por rutas alternativas,
disminuyan el posible exceso de excitabilidad en el sistema. Apoyando
esta hipótesis hay un estudio sobre posibles mecanismos de regulación
de la expresión génica y proteica de subunidades de GirK en respuesta a
choques eléctricos (Pei et al., 1999). Estos autores aportaron evidencias
de la regulación diferencial dependiente de área del hipocampo, tanto de
mRNA y de proteína GirK1 y GirK2, en respuesta a la aplicación de
choques eléctricos in vivo en rata. Los cambios en los niveles de mRNA
de subunidades de GirK aparecen en el giro dentado, y niveles de mRNA
de GirK2 aumentan tras 6 y 24 h de la estimulación, mientras que el
mRNA de GirK1 disminuye a las 6 h pero aumenta a las 24h. Los niveles
de proteína solo se ven aumentados tras 24 h. Los autores postulan que
estos resultados podrían reflejar mecanismos complejos implicados en la
regulación de GirK in vivo como neuroprotección ante el exceso de
actividad (Pei et al., 1999). Con base en estos resultados, en CA1 podría
haber algún tipo de mecanismo compensatorio similar, con el fin de
disminuir la excitabilidad promovida por Aβ y TQ. Experimentos de
análisis de niveles de expresión de genes y proteínas de subunidades de
GirK in vivo serían de gran interés para poder corroborar esta hipótesis.
Por todo ello, junto con el hecho de la localización de subunidades
de GirK tanto en neuronas piramidales como en varios tipos de
interneuronas de las áreas CA3 y CA1 del hipocampo (Grosse et al.,
2003, Kulik et al., 2006, Booker et al., 2013, Degro et al., 2015) así como
en granulares del giro dentado (Pei et al., 1999, Cabezas et al., 2012)
sugieren que la disfunción de los canales GirK podría estar alterando el
Discusión
139
balance entre vías glutamatérgicas y GABAérgicas en el hipocampo, y
esto podría subyacer a la aparición de alteraciones tempranas en
procesos de memoria dependiente de hipocampo asociados a las
primeras fases de la EA.
5.3.2 Disfunción de los canales GirK y alteración de la transmisión sináptica en el hipocampo
La inyección icv. de Aβ induce una mayor respuesta de facilitación a
corto plazo que la esperada en la sinapsis CA3-CA1 (Madroñal et al.,
2009, Vega-Flores et al., 2014b) pudiendo reflejar modulación por parte
de Aβ del proceso de liberación de neurotransmisor (Zucker and Regehr,
2002). En este sentido otros autores han encontrado efectos de Aβ a
nivel presináptico en sinapsis excitatorias del hipocampo (Larson et al.,
1999, Abramov et al., 2009, Romani et al., 2013, Hilla et al., 2014). Los
mecanismos por los cuales Aβ podría estar afectando a la plasticidad
sináptica a corto plazo no parecen ser mediados por los canales GirK. El
bloqueo con TQ no ha ejercido un efecto sobre la facilitación por pares de
pulsos, aunque se ha localizado GirK2 en terminales axónicos de CA1
interactuando con GABAB (Fajardo-Serrano et al., 2013, Ostrovskaya et
al., 2014). En el estudio de mecanismos de facilitación a corto plazo en
CA1 de rodaja de hipocampo de ratón, la alteración de la actividad de
GirK en un modelo de ratón transgénico con falta de función para una
proteína reguladora de su actividad tampoco parece indicar la
implicación de dichos canales (Ostrovskaya et al., 2014). Además, la
utilización de TQ en rodajas de hipocampo de rata tampoco parece
afectar a la liberación de neurotransmisor en CA3-CA1 (Skov et al., 2011).
En este tipo de estudios, el efecto principal mediado por los canales GirK
es postsináptico a través de GABAB (Lüscher et al., 1997, Takigawa and
Alzheimer, 2002, Nava-Mesa et al., 2013). De hecho, en ratones
Knockout de GirK2, corrientes postsinápticas provocadas por receptores
están ausentes, mientras que la acción presináptica inhibitoria no se
altera, sugiriendo que la pérdida de GirK2 no está interviniendo en el
elemento presináptico de neuronas piramidales de CA1 (Lüscher et al.,
Discusión
140
1997). No obstante, pese a que las distintas evidencias no sugieren
función de GirK en vías presinápticas de CA3-CA1 del hipocampo, sí se
ha visto este tipo de actividad vía complejo GABAB-GirK en sinapsis de
axones de células granulares de giro dentado(Cabezas et al., 2012), del
cerebelo (Aguado et al., 2008, Fernández‐Alacid et al., 2009) y del área
tegmental ventral (Michaeli and Yaka, 2010) posiblemente debido a que
se localizan próximos a la zona activa de dichos terminales axónicos
(Aguado et al., 2008, Ladera et al., 2008, Meneses et al., 2015).
Con todo ello se pone de manifiesto que el Aβ a nivel presináptico
en CA3-CA1 estaría actuando por mecanismos alternativos a GirK, dado
que los datos sugieren que no están implicados en la modulación de la
liberación de glutamato en esta sinapsis. Sin embargo, no puede
descartarse la afectación de otros circuitos como el de las células
principales del giro dentado a CA3 dado el papel que ejercen los canales
GirK en dichas sinapsis.
5.3.3 Disfunción de los canales GirK y alteración de la potenciación a largo plazo en el hipocampo
En la aproximación al estudio de etapas tempranas de EA por
inyección icv. de Aβ hemos observado alteración en la inducción de la
LTP en el hipocampo. Los resultados que presentamos, van en la línea de
los obtenidos por otros laboratorios en modelos similares (Freir et al.,
2001, Freir et al., 2003, Gengler et al., 2007, Holscher et al., 2007, Wu et
al., 2008). En nuestro modelo, una dosis total de 9 nmol aplicada en 3
inyecciones de 3 nmol/día promueve un bloqueo de la LTP al menos
hasta 72 h tras la última inyección. Las investigaciones in vivo sobre los
efectos del Aβ en la inhibición de la inducción y el mantenimiento de la
LTP sugieren dosis dependencia, donde dosis inferiores a 3 nmol
afectarían al mantenimiento de la LTP, mientras que dosis superiores de
hasta 100 nmol de Aβ bloquean su inducción (Freir et al., 2001, Freir et
al., 2003). Por otro lado, también se ha propuesto que los efectos sobre la
LTP serían reversibles con el tiempo (Holscher et al., 2007). En este
sentido, la aplicación de distintas terapias de reducción de niveles de Aβ
Discusión
141
inducen mejoras en estos procesos, pudiendo subyacer a la mejoría en
tareas de aprendizaje y memoria en modelos animales de EA (Dodart et
al., 2002). Los mecanismos por los cuales el Aβ induce alteraciones en la
LTP no están esclarecidos, y hay diversas evidencias que sugieren que el
Aβ influye en la homeostasis y la señalización celular modulando la
actividad de distintos receptores y canales. El proceso de inducción de la
LTP hipocampal es dependiente de señales excitatorias mediadas por
receptores glutamatérgicos de tipo NMDA y AMPA, señales inhibitorias
rápidas mediadas por receptores GABAérgicos GABAA, y señales
inhibitorias lentas mediadas por GABAB (Bliss and Collingridge, 1993).
Entre las distintas dianas de Aβ se encuentran receptores de la vía
glutamatérgica (Dominic et al., 2002, Cleary et al., 2005, Shankar et al.,
2008), colinérgica (Shinoe et al., 2005, Gu and Yakel, 2011) y
GABAérgica (Zhang et al., 2009) y distintos receptores acoplados a
proteínas G (Thathiah and De Strooper, 2011). Los datos que hemos
aportado sugieren que los canales GirK podrían estar implicados en la
inducción de la LTP de CA3-CA1 del hipocampo. La disfunción de los
canales GirK, por ganancia o por pérdida de función ha sido relacionada
con alteraciones en la LTP. Por ejemplo, en rodajas de hipocampo de
ratones Knockout de GirK2 la LTP se ve aumentada (Cramer et al.,
2010). Por el contrario, en modelos de sobreexpresión de GirK2, como
los Ts65Dn, la LTP se ve disminuida (Kleschevnikov et al., 2012). Otros
autores apuntan hacia un desbalance entre la inhibición mediada por
GABAA y GABAB en la región CA1 alterada por la disfunción de GirK2
(Best et al., 2012). Estas datos sugieren que es necesario un rango
óptimo de actividad de los canales GirK para que se produzcan con
normalidad procesos de plasticidad sináptica (Victoria et al., 2015). En
este sentido Aβ podría estar actuando directamente sobre GirK
inhibiendo su función (Nava-Mesa et al., 2013) a través de la regulación
de la expresión génica de las subunidades que conforman el canal
(Mayordomo-Cava et al., 2015). No obstante, no puede descartarse que la
acción de Aβ sea a través de mecanismos indirectos por alteración de la
actividad de GPCRs cuya actividad está ligada a la activación o
Discusión
142
inactivación de GirK. En esta línea, en el hipocampo los canales GirK
forman complejos proteicos con GABAB (Fernandez-Alacid et al., 2011,
Fajardo-Serrano et al., 2013) y se expresan tanto en dendritas como en el
soma de neuronas piramidales e interneuronas del hipocampo (Koyrakh
et al., 2005b, Lüscher and Slesinger, 2010) generando respuestas
inhibitorias lentas (Lüscher et al., 1997). Por ello, la alteración de la
actividad de GirK podría afectar al balance de señales excitatorias e
inhibitorias en esta área, pudiendo alterar procesos de plasticidad
sináptica a largo plazo. En este sentido, serían necesarias nuevas
investigaciones para esclarecer vías y cascadas de transducción de
señales por los cuales la actividad de los canales GirK podría estar
modulando procesos de plasticidad sináptica a largo plazo.
5.3.4 Disfunción de los canales GirK y alteración de los ritmos theta y gamma hipocampales
En el estudio de los efectos del Aβ sobre el EEG en el hipocampo en
ratón despierto hemos observado alteraciones en la actividad del circuito
hipocampal registrando un incremento en las bandas de frecuencia theta
y gamma. En pacientes con EA se registran anomalías en los patrones de
actividad cerebral que varían de acuerdo al estado de progresión de la
misma (Jaeseung, 2004). Modelos animales de EA, tanto transgénicos
como por inyección de Aβ, también presentan alterada la actividad
oscilatoria en theta y gamma (Palop et al., 2007, Peña et al., 2010,
Villette et al., 2010, Rubio et al., 2012, Verret et al., 2012, Goutagny et
al., 2013). La reducción del ritmo theta se ha relacionado el
procesamiento de información novedosa. La ausencia de un cambio en el
pico de frecuencia theta podría estar implicada en la detección de
novedad y su alteración parece afectar a la codificación de la información
relacionada con reconocimiento de novedad (Jeewajee et al., 2008,
Villette et al., 2010). Por ello, anomalías es la sincronización en theta
podrían subyacer a los déficits de memoria observados en la EA, ya que
la detección de ítems novedosos podría ser un requisito previo para la
codificación y almacenamiento de la información (Buzsáki et al., 2012).
Discusión
143
El ritmo theta hipocampal se registra en el giro dentado y del área
CA1 del hipocampo y su iniciación y modulación parece ser dependiente
de proyecciones colinérgicas y GABAérgicas septo-hipocampales (Toth et
al., 1997, Lisman and Buzsáki, 2008, Colgin, 2013). Recientemente
también ha sido descrita la posible implicación en el mantenimiento del
mismo por proyecciones glutamatérgicas procedentes del septum medial
y la banda diagonal de broca (Huh et al., 2010). Lesiones en esta vía
están relacionadas con desincronización en la banda theta hipocampal y
han sido relacionadas con déficits cognitivos en tareas de aprendizaje
(Vinogradova, 2001, Villette et al., 2010, Rubio et al., 2012, Vega-Flores
et al., 2014b). Esto podría deberse a la posible implicación del ritmo
theta hipocampal con la comparación y codificación de nueva
información vs. recuerdo de la información existente (Hasselmo et al.,
2002) y podría subyacer a los déficits en tareas de aprendizaje y
memoria en pacientes con EA (Goutagny and Krantic, 2013, Kitchigina et
al., 2013). Se ha mostrado que la inyección aguda de Aβ produce
alteraciones en la modulación del ritmo theta, incrementándolo en
contra de la disminución esperada en la discriminación de objetos
(Villette et al., 2010). Por otro lado está bien establecido que las
oscilaciones gamma en el hipocampo podrían tener un papel un papel
relevante en codificación y reconsolidación de la memoria (Buzsáki and
Wang, 2012, Lisman and Jensen, 2013). Se ha hipotetizado sobre la
interrelación de theta y gamma en los distintos estados o fases del
procesamiento de la información en el hipocampo. El acoplamiento entre
theta-gamma podría tener un papel funcional, siendo la interacción
entre estas oscilaciones determinante para la separación o la integración
de información nueva (Hasselmo et al., 2002, Lisman and Buzsáki,
2008, Lisman and Jensen, 2013). Alteraciones en la relación entre estos
tipos de oscilaciones se han asociado a déficits en tareas de aprendizaje y
memoria (Leung and Shen, 2007, Goutagny and Krantic, 2013, Tara et
al., 2013). Nuestros resultados muestran alteración de ambas bandas de
frecuencia, por lo que no puede descartarse que esto afecte a la
Discusión
144
correlación entre ellas y al procesamiento de la información en el
hipocampo.
Clásicamente el sistema septo-hipocampal ha sido relacionado con
la generación y mantenimiento de la actividad rítmica hipocampal
gracias a la presencia de fibras colinérgicas y GABAérgicas (Toth et al.,
1997, Buzsaki, 2006, Colgin, 2013) y recientemente también se ha visto
la posible implicación de proyecciones glutamatérgicas (Huh et al.,
2010). Daños en el sistema colinérgico y glutamatérgico alterarían el
sistema GABAérgico (Colom, 2006) y el desbalance entre los la
neurotransmisión colinérgico-GABAérgico podría estar implicado en la
disfunción de discriminación de información novedosa en el hipocampo
(Jeewajee et al., 2008). Por otro lado, recientemente se ha descrito como
proyecciones GABAérgicas, que inervarían interneuronas GABAérgicas
del hipocampo podrían estar modulando el ritmo gamma hipocampal
(Buzsáki and Wang, 2012, Kepecs and Fishell, 2014). En esta línea, en
modelos de inyección de Aβ25-35, se observa la alteración de la función
colinérgica septo-hipocampal, así como pérdida de fibras colinérgicas a
largo plazo (Yamaguchi et al., 2002, Stepanichev et al., 2004, Yamada et
al., 2005, Stepanichev et al., 2006). Por otro lado, también se han
aportado evidencias sobre la disfunción de neuronas glutamatérgicas
septales, implicando efectores de receptores muscarínicos, los canales de
K+ KCNQ (Leao et al., 2012, Durán-González et al., 2013). Además se ha
visto que Aβ afecta a la modulación de la actividad de receptores
muscarínicos M1 a través de la alteración del anclaje con la proteína G
asociada (Janickova et al., 2013), hecho que podría a su vez afectar a la
modulación de la actividad de GirK (Hill and Peralta, 2001). Por otro
lado, otros autores han aportado evidencias de que la alteración de la vía
septal GABAérgica en modelos de ratón transgénico de APP humana,
previa a la aparición de placas (Palop et al., 2007, Villette et al., 2010,
Villette et al., 2012) altera la actividad rítmica en el hipocampo y podría
subyacer a la aparición de déficits tempranos en tareas de
reconocimiento de objetos (Palop et al., 2007, Villette et al., 2010).
Discusión
145
Las corrientes postsinápticas inhibitorias lentas provocadas por la
activación de los canales GirK podrían estar implicadas en la generación
de actividad rítmica de poblaciones neuronales del hipocampo
(Scanziani, 2000, Nicoll, 2004). De hecho, recientemente se han descrito
en humano la presencia de polimorfismos genéticos en un solo
nucleótido (SNPs) en el exón 4 del gen KCNJ6, codifica a GIRK2, con
alteraciones en la banda theta de la zona frontal (Kang et al., 2012). Por
otro lado, dos estudios recientes han mostrado como la alteración de la
actividad de los canales GirK de neuronas piramidales podrían estar
modificando oscilaciones gamma en el hipocampo (Johnston et al.,
2014, Tatard-Leitman et al., 2015). Estudios actuales han demostrado
que anomalías en oscilaciones gamma pueden llevar a un desbalance
entre circuitos de excitación-inhibición, de neuronas piramidales
glutamatérgicas ye interneuronas (Tatard-Leitman et al., 2015). En este
sentido, se ha descrito recientemente en un modelo transgénico de
receptores de NMDA, como la disminución de la expresión de GirK2
podría estar relacionada con la alteración de la excitabilidad produciendo
un incremento en oscilaciones gamma (Tatard-Leitman et al., 2015). Por
el contrario, la modulación de la actividad de GirK por activación de
receptores 5-HT1A produce una disminución del ritmo gamma en
células piramidales del hipocampo (Johnston et al., 2014). En el
hipocampo, la actividad de los receptores GABAB estaría íntimamente
relacionada con los canales GirK (Lüscher et al., 1997, Fajardo-Serrano
et al., 2013, Ostrovskaya et al., 2014). Hay datos que muestran como la
utilización de antagonistas de receptores GABAB aumentan la actividad
en theta y gamma (Leung and Shen, 2007). En esta línea, con el fin de
modular el balance entre la neurotransmisión excitatoria/inhibitoria en
el hipocampo datos recientes muestran como la manipulación
farmacológica de la actividad de receptores GABAB podrían mejorar
déficits cognitivos asociados a la presencia de Aβ (Chumakov et al.,
2015). Por ello en la manipulación farmacológica de GirK por bloqueo
con TQ cabría esperar una respuesta similar a la observada al manipular
GABAB. Estos resultados tal vez podrían explicarse debido a que aunque
Discusión
146
en el hipocampo los canales GirK presentan cierto grado de actividad
basal (Lüscher et al., 1997, Stanfield et al., 2002) su activación a partir
del receptor GABAB promueve un grado de hiperpolarización mayor
mediada por el aumento de las respuestas inhibitorias GABAB-GirK
(Chen and Johnston, 2005).
Sin embargo, en el estudio aquí presentado el bloqueo de los canales
GirK por TQ no ha producido una repercusión sobre la actividad rítmica
basal. Esto podría ser debido a la utilización de una dosis inferior a la
necesaria, tal y como indican algunos autores, donde no registran la
respuesta inhibitoria esperada posiblemente por la utilización de dosis
bajas de TQ (Kanjhan et al., 2005, Best et al., 2007). No obstante, en
presencia de Aβ y TQ podrían haberse generado mecanismos
compensatorios de activación de GirK, como el tráfico de más canales a
la membrana (Blednov et al., 2001, Harashima et al., 2006). A priori,
cabría esperar un efecto sinérgico por aumento de la actividad eléctrica
en presencia de Aβ y el bloqueo de las corrientes inhibitorias de GirK con
la utilización de TQ. Sin embargo, el incremento de la actividad en theta
y gamma ha sido menor que únicamente con Aβ. En respuesta a exceso
de actividad eléctrica, se ha observado un aumento de la expresión en
membrana de subunidades de GirK, quizá como medida para aumentar
la respuesta inhibitoria en zonas hiperexcitables (Pei et al., 1999). En
otros modelos de estudio de pérdida o ganancia en GirK2 también se ha
visto como se regula la expresión de otras subunidades de GirK (Blednov
et al., 2001, Harashima et al., 2006). Por ejemplo, el ratón weaver es un
modelo de estudio de la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson.
Tiene una mutación en GirK2 que mantiene al canal constitutivamente
activo en neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra y el área
tegmental ventral. En etapas tempranas, las neuronas dopaminérgicas
no están aparentemente dañadas, pero finalmente acaban en muerte
celular por posible excitotoxicidad mediada por GirK2. Sin embargo,
neuronas del área tegmental ventral no parecen estar afectadas
pudiéndose deber a la presencia de la subunidad de GirK3, que podría
regular a la baja la expresión de GirK2 como compensación al exceso de
Discusión
147
actividad. Estas alteraciones podrían subyacer a la aparición de actividad
epileptiforme y déficits de memoria asociados a la progresión de esta
enfermedad (Lüscher and Slesinger, 2010). El estudio de vías de
regulación de la actividad de los canales GirK en este tipo de situaciones
sería de gran interés para la posible comprensión de los mecanismos
subyacentes a la patología de enfermedades como la EA, el Parkinson o
el síndrome de Down.
Estos datos parecen apuntar que Aβ a través de que algún tipo de
mecanismo indirecto, posiblemente a través de la modulación de la
actividad de GPCRs y/o cascadas de señalización intracelular, afectaría a
la actividad de los canales GirK, que podrían tener una posible respuesta
homeostática en compensación a la hiperexcitabilidad en el hipocampo.
Prolongado en el tiempo, esto podría alterar el balance entre los sistemas
excitatorios e inhibitorios, pudiendo subyacer a los déficits cognitivos de
memoria relacionados con las etapas tempranas de la EA.
5.3.5 Disfunción de los canales GirK y déficits de memoria dependiente de hipocampo
En el presente trabajo se han estudiado los efectos de la inyección
icv. de Aβ y la modulación de la función de los canales GirK, por
inyección del bloqueante TQ, en tareas de memoria de reconocimiento
dependiente de hipocampo, el test de habituación en campo abierto y el
NOR. Uno de los primeros rasgos del deterioro cognitivo observados
tanto en modelos animales como en pacientes de EA con deterioro
cognitivo leve son la aparición de alteraciones en la memoria de
reconocimiento (Algarabel et al., 2012) y el estudio de alteraciones en
este tipo de memoria mediante el manejo de modelos animales ha sido
ampliamente utilizado (Chambon et al., 2011, Grayson et al., 2015). Estos
test están basados en la premisa de que los roedores por naturaleza
exploran en mayor medida lo nuevo que lo familiar (Ennaceur, 2010).
Por ello, previa exposición a un ítem –entorno u objeto- explorarán en
mayor medida aquello desconocido. Ambos test son particularmente
atractivos como modelos de estudio dado que no requieren motivaciones
Discusión
148
externas, ni recompensas. En el caso del test de habituación en campo
abierto sesiones repetidas de re-exposición al mismo ambiente
reflejarían procesos de memoria de reconocimiento del ambiente como
familiar reflejado como comportamiento de habituación (Müller et al.,
1994) siendo este tipo de respuestas dependiente de hipocampo (Thiel et
al., 1998, Popović et al., 2014). Hemos observado una respuesta de
habituación anómala. Nuestros resultados muestran que la modulación
de la actividad de GirK con TQ produce alteraciones en la habituación en
campo abierto. En este sentido, Knockout de GirK1 y GirK2 tienen un
retraso en la habituación en el test de campo abierto (Blednov et al.,
2001, Pravetoni and Wickman, 2008, Llamosas et al., 2015). Sin
embargo, no ocurre en los Knockout de GirK3, ni GirK4 (Pravetoni and
Wickman, 2008). Estos datos parecen apuntar hacia las subunidades
GirK1-2 como posibles dianas de Aβ en este tipo de memoria. No
obstante, el knockout de Girk4 presenta deficiencias en aprendizaje y
memoria en laberinto acuático, un modelo de estudio de memoria
espacial dependientes de hipocampo (Wickman et al., 2000). El
knockout de GirK1 además presenta disfunción en un test de
discriminación de olores (Kourrich et al., 2003) por lo que no se puede
descartar la importancia relativa de cada subunidad dependiendo del test
realizado.
Por otro lado, aportamos datos de la alteración de la discriminación
de objetos nuevos y familiares, 24 y 48 h después de la inyección icv. de
Aβ y TQ. Estos resultados sugieren déficits en la distinción entre la
información almacenada referente al objeto familiar y la información
nueva que se está procesando (Müller et al., 1994, Lee et al., 2005,
Ennaceur, 2010). Modelos similares de inyección icv. de Aβ también han
mostrado defectos en este tipo de tarea a largo plazo, aunque en muchos
de los casos la administración del Aβ era previa al training, con lo cual
estos datos sugieren que el Aβ, además, podría estar afectando la fase de
codificación y consolidación de nueva información (Tsunekawa et al.,
2008, D'Agostino et al., 2012, Lu et al., 2012, Chumakov et al., 2015).
Este es el primer estudio que relaciona la pérdida de función de los
Discusión
149
canales GirK, por administración del bloqueante TQ, sobre procesos de
memoria de reconocimiento de objetos nuevos. Al igual que ocurre con
Aβ, los datos sugieren que la alteración de la función de GirK, puede
estar afectando al proceso de discriminación entre la información
almacenada y la nueva información por procesar. En la literatura
encontramos referencias sobre el efecto de la sobreexpresión de la
subunidad de Girk2 en triples transgénicos de modelos de síndrome de
Down y alteraciones en la memoria de reconocimiento de objetos,
sugiriendo un posible papel de GirK2 en este tipo de memoria
(Kleschevnikov et al., 2012). Esta información sugiere que la alteración
de la funcionalidad del canal, por exceso o por defecto, produce déficits
cognitivos. En esta línea, recientes estudios aportan datos muy
interesantes, donde la activación y/o inactivación de vías
excitatorias/inhibitorias son necesarias para una correcta discriminación
entre ítems familiares y novedosos (Haettig et al., 2013). El balance entre
excitación/inhibición en el área CA1 del hipocampo podría ser relevante
en la correcta codificación y discriminación de información familiar y
novedosa (Vinogradova, 2001, Cohen et al., 2013, Haettig et al., 2013,
Cohen and Stackman, 2015). Bajo esta hipótesis se está comenzando a
combinar fármacos para modular el balance entre vías
excitatorias/inhibitorias en modelos de etapas tempranas de EA por
inyección icv. de Aβ25-35, donde se revierten los déficits observados en
este tipo de tareas (Chumakov et al., 2015).
En el modelo de estudio de EA que planteamos la disfunción de los
canales GirK, en áreas como el hipocampo, podría estar alterada desde
las etapas tempranas de la EA. La alteración de la actividad de los
canales GirK muestra déficits en procesos de reconocimiento y
discriminación de información familiar y novedosa. Por lo tanto,
podemos sugerir la posible implicación de los canales GirK en
alteraciones subyacentes a los déficits cognitivos asociados a etapas
tempranas de EA (Figura 28).
Discusión
150
Figura 28. Esquema resumen de los desórdenes neurales y enfermedades posiblemente asociadas a los canales GirK. Se muestra una visión sagital del cerebro de rata, resaltando regiones las cuales podrían tener un papel los canales GirK. En naranja se resaltan cambios en la excitabilidad neuronal dependientes de GirK, y en gris, por producción de muerte neuronal, derivada del mal funcionamiento de dichos canales. SNc: Células de la sustancia negra. VTA: Área tegmental ventral. PAG: Área gris periacueductal. LC: Locus ceruleus. DRG: Ganglio de la raíz dorsal. Cerebral córtex: Córtex cerebral. Hippocampus: Hipocampo. Cerebellum: Cerebelo. Spinal Cord: Médula espinal. Imagen adaptada de (Lüscher and Slesinger, 2010).
151
6. LIMITACIONES DEL ESTUDIO
Y PERSPECTIVAS FUTURAS
Limitaciones y Perspectivas Futuras
153
Esta investigación ha sido una aproximación a la comprensión de la
fisiopatología asociada a los déficits cognitivos tempranos en la EA con
un abordaje experimental diseñado a partir del estudio de modelos
animales. Se ha realizado un estudio a nivel molecular, electrofisiológico
y comportamental de los posibles mecanismos por los cuales el Aβ
podría estar alterando la función del hipocampo. Una de las mayores
limitaciones en el estudio de la EA con modelos animales es que ningún
modelo animal replica completamente la patogénesis de la enfermedad,
sino que los modelos que hay ofrecen la posibilidad de trabajar distintos
aspectos de la enfermedad. Se ha realizado un abordaje a través de la
administración de péptidos Aβ para el estudio de los efectos de formas
solubles en el cerebro y su relación con la sintomatología asociada en
ausencia de placas. Sin embargo, una de las mayores limitaciones en este
tipo de modelos es en relación a la utilización de distintas especies de Aβ,
como, Aβ1-42, Aβ1-40 o Aβ25-35. Además, en numerosas ocasiones, la
comparación de resultados entre distintos laboratorios es compleja, dada
la variedad de protocolos de preparación de las soluciones de Aβ. La
utilización de diferentes especies de Aβ, junto con la posibilidad de
varios estados de agregación, implica que no necesariamente se va a
inducir la misma toxicidad y el impacto anatómico y funcional no tiene
por qué ser idéntico (Chambon et al., 2011). En este sentido, las recientes
investigaciones clínicas de la medida de la concentración de proteínas
por distintas técnicas de resonancia magnética están aportando datos de
interés al respecto (Dubois et al., 2007).
Teniendo en cuenta que los tratamientos disponibles actualmente
para la EA enfocados a la modulación de la vía glutamatérgica y
colinérgica (como la memantina o los inhibidores de la
acetilcolinesterasa) pueden retardar la progresión de los síntomas pero
acaban dejando de tener eficacia y no revierten ni detienen el avance de
la enfermedad, el estudio de la vía GABAérgica en la EA está tomando
relevancia en los últimos años (Langbaum et al., 2013, Nava-Mesa et al.,
2014).
Limitaciones y Perspectivas Futuras
154
En este sentido, distintas líneas de investigación sobre los canales
GirK en modelos in vitro e in vivo sugieren su posible papel en
patologías como el Parkinson, la epilepsia o el síndrome de Down
(Lüscher and Slesinger, 2010). Sin embargo, la farmacología de estos
canales sigue siendo en gran parte desconocida. Aunque un buen
número de fármacos, entre los cuales se encuentran antipsicóticos o los
antidepresivos, bloquean los canales GirK, la inhibición de los mismos
no es demasiado selectiva y se necesitan altas concentraciones para
producir efecto (Luján et al., 2014). Por otro lado, hasta hace poco, no se
disponía de activadores selectivos de estos canales. Recientemente se
han propuesto como activadores selectivos la naringina (Yow et al., 2011)
y el ML297 (Kaufmann et al., 2013). La disponibilidad de agonistas de
los canales GirK puede arrojar datos interesantes sobre mecanismos
celulares y rutas de transducción de señales implicadas. En esta línea,
sería de gran interés el estudio de la posible reversión de los efectos de
Aβ a partir de la activación o bloqueo de la inactivación de GirK.
155
7. RESUMEN Y CONCLUSIÓN
Resumen y Conclusión
157
En el presente estudio hemos utilizado la exposición a Aβ25-35 en dos
modelos experimentales como aproximación a la comprensión de la
fisiopatología asociada a los déficits cognitivos de memoria tempranos
característicos de la EA. Para ello, se ha realizado un estudio a nivel
molecular, electrofisiológico y comportamental de los posibles mecanismos
por los cuales el Aβ podría estar generando un estado de disfunción
sináptica alterando la función del hipocampo. Tanto en el modelo in vitro de
rodaja de hipocampo de rata, como en el in vivo de inyección icv. en ratón,
los resultados obtenidos sugieren que Aβ podría causar efectos sobre la
actividad de los canales GirK en el hipocampo a distintos niveles.
1. Aβ afecta a la expresión génica de las subunidades GirK2, GirK3 y
GirK4 en el hipocampo.
2. Aβ inhibe la inducción de la LTP de la sinapsis CA3-CA1 hipocampal a
través de la afectación de la actividad de los canales GirK.
3. Aβ afecta a las características electrofisiológicas de la sinapsis CA3-CA1
del circuito hipocampal induciendo patrones de actividad rítmica en
theta y gamma. La actividad de los canales GirK podría estar implicada
en la compensación temprana de este tipo de respuesta.
4. Aβ puede estar generando alteraciones en la discriminación entre
familiaridad y novedad por mecanismos que afectan a la actividad de
los canales GirK pudiendo subyacer a la aparición de déficits en
memoria de reconocimiento dependiente de hipocampo asociados a
etapas tempranas de EA.
Por todo ello, Aβ a través de distintos mecanismos y/o cascadas de
señalización intracelular, puede estar modulando la actividad de los canales
GirK afectando la excitabilidad de los circuitos del hipocampo y la
integración de la información sináptica. Estas alteraciones, prolongadas en
el tiempo, afectarían al balance entre los sistemas excitatorios e inhibitorios,
generando un estado de disfunción sináptica pudiendo desencadenar en los
déficits cognitivos de memoria característicos de etapas tempranas de la EA.
159
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
160
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183
9. ANEXOS
Anexos
185
ANEXO 1: Análisis cuantitativo del EEG: Transformada de Fourier y poder espectral
El registro del EEG en CA1 proporciona información sobre la actividad
oscilatoria del hipocampo. Debido a la naturaleza peculiar de las señales de
EEG, es necesario aplicar métodos de análisis específicos. La señal neuronal
está compuesta por muchas señales provenientes de distintas proyecciones
neuronales, interneuronas o células gliales, entre otras. En general, el EEG
representa la sumación lineal de potenciales de campo continuos y de
potenciales de acción rápidos. La actividad cerebral tiene múltiples
frecuencias y evoluciona con el tiempo. En consecuencia, su análisis
requiere una combinación de métodos analíticos y una de las herramientas
más tempranamente desarrolladas fue el análisis de la frecuencia
dominante. La representación de la frecuencia dominante muestra la
cantidad de señal que se encuentra dentro de cada banda de frecuencia en
una gama de frecuencias, mientras que el dominio del tiempo muestra cómo
una parte de la señal va cambiando a lo largo del tiempo (Buzsaki, 2006). La
cuantificación de la señal por el método de la transformada de Fourier. Este
método descompone las señales del EEG en un conjunto de ondas
sinusoides, y construye una representación comprimida de dominancias
relativas de varias frecuencias. Esta representación se denomina, poder
espectral, y describe la relación entre la amplitud de señales extracelulares y
la frecuencia temporal de las mismas (Buzsáki et al., 2012). Cuando se
introduce la variable tiempo en la ecuación se denomina transformada
rápida de Fourier (FFT, Fast Fourier Transform). Es un análisis
cuantitativo del EEG, porque proporciona una aproximación de cómo varía
el contenido en frecuencias a lo largo del tiempo. Con este método, el EEG
puede dividirse en múltiples pequeñas ventanas (también denominadas
épocas), donde la transformada de Fourier es calculada en cada una de ellas.
Se hace posible así la representación de sucesivos poderes espectrales y la
evolución del contenido de frecuencias a lo largo del tiempo (Buzsáki et al.,
2012).
Anexos
186
ANEXO 2: Validación de objetos para la prueba de reconocimiento de objetos nuevos
El objetivo de la validación de objetos nuevos es evaluar aquellos
objetos que por sus propias características son explorados con mayor
frecuencia que otros y desestimarlos en la realización de la tarea NOR. Para
ello se exponen parejas de objetos a un grupo de al menos 10 animales. Al
realizar la exposición a parejas de objetos no debe haber preferencia por
ninguno de ellos, debiendo de ser explorados ambos por igual. Ninguno de
estos animales se incorporó después a los experimentos que engloban esta
tesis. Estos test de validación de objetos se realizan en idénticas condiciones
experimentales que el resto de test (cepa animal, cirugía y duración del test
NOR).
La Figura 29 muestra el ejemplo de la validación de un objeto nuevo-
estrella- frente a un objeto testado previamente en el laboratorio –lego- . No
hay una preferencia por ninguno de los objetos expuestos, siendo el tiempo
relativo de exploración de la estrella similar al tiempo de exploración del
lego p=0.766 (t(9)=0.307). Dado que no hay preferencia por este objeto, se
utilizó como objeto nuevo en los experimentos diana del NOR.
Figura 29. Validación de objeto nuevo -estrella- . A. Esquema ilustrativo del procedimiento experimental. B. Test de validación de un objeto nuevo- estrella- C. Tiempo relativo de exploración de los objetos (%): Es el tiempo que se explora cada objeto en relación al tiempo total de exploración. n=10. Ac, Aclimatación a la sala de experimentación; H, Habituación a las condiciones experimentales.
187
10. PUBLICACIONES CIENTÍFICAS
Publicaciones Científicas
189
Dada la relevancia del tema de estudio parte de los resultados
obtenidos ya han sido publicados en una revista de impacto en el campo de
estudio. El artículo derivado es el siguiente5:
Mayordomo-Cava J, Yajeya J, Navarro-López JD, Jiménez-Díaz L.. Amyloid-β25-35 Modulates the Expression of GirK and KCNQ Channel Genes in the Hippocampus. PLoS ONE 10(7): e0134385. (2015). doi:10.1371/journal.pone.0134385. http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0134385
Por otro lado, durante el periodo de realización de este tesis los
resultados se han presentado en Congresos de relevancia para la comunidad
neucientífica. Se aporta un resumen donde se destacan alguno de ellos.
18 comunicaciones como primera autora, 3 comunicaciones orales y 15
pósters:
4 Internacionales: Society for Neuroscience (SfN), EEUU. 2015 ó
Federation of all European Neuroscience Societies (FENS), Italia
2014.
3 nacionales: Sociedad Española de Neurociencia (SENC) Granada
2015. Comunicación oral seleccionada por el Comité Científico
organizador de interés relevante en el campo:
Mayordomo-Cava J. Nava-Mesa MO., Jiménez-Díaz L., Yajeya J. y Navarro-López JD.. La disfunción sináptica inducida por el péptido β-amiloide en la sinapsis septohipocampal fimbria-CA3 implica a los canales GirK. XV Congreso Nacional de la Sociedad Española de Neurociencia. Oviedo, 2013.
10 regionales: Jornadas de Jóvenes investigadores de Albacete
(AJIAB) Albacete 2014 ó Ciudad Real Biomédica, del Hospital
General Universitario de Ciudad Real, HGUCR 2014.
5 Con el fin de ser respetuoso con el medio ambiente y evitar la impresión innecesaria del mismo, únicamente se facilita el enlace a la página de la revista científica Plos One, dado que dicho artículo es de consulta con libre acceso.
Publicaciones Científicas
190
1 Capítulo de libro:
Mayordomo-Cava J, Jiménez-Díaz & Navarro-López JD. Expresión génica de receptores glutamatérgicos en rodajas de hipocampo de rata. Efecto del péptido β-Amiloide (25-35). Encuentros en Neurociencias, vol. I, ISBN: 978-1-4461-2634-9; Ed. Lulu Enterprises, Inc. 2011 (in press).
Así mismo, de acuerdo al compromiso que la autora tiene con la
ciencia, más en concreto la neurociencia, ha participado en eventos de
difusión de la ciencia en los cuales se ha expuesto el tema de la enfermedad
de Alzheimer al público general:
Mayordomo-Cava J.. COMUNICACIÓN ORAL. ¿Qué falla en un cerebro con Alzheimer?. Ciudad Real, II Semana Mundial del Cerebro. 2012. Universidad de Castilla-La Mancha, UCLM.
191
11. FINANCIACIÓN y LOGÍSTICA
Financiación y Logística
193
Esta tesis ha sido realizada en el marco de lo que supongo que se
recordará como la primera gran recesión económica del s. XXI. En España,
y en concreto en Ciencia, se venía reflejando en los presupuestos del Estado
desde 2008, y el año que se hizo más patente -desde mi humilde punto de
vista y dentro de Castilla-la Mancha- fue 2010-2011. De ahí, en picado, a los
presupuestos ridículos actuales. Un País que no tiene entre sus
prioridades el respaldo a la ciencia (ni a la educación) está
condenado al fracaso en su desarrollo, y por ende, condena a sus
ciudadanos. Hay un lema que dice: Sin ciencia, no hay futuro.
No obstante, he tenido financiación de supervivencia de distintas
entidades, Organismos y personas, lo cual es de agradecer. Esta financiación
ha sido intermitente, pero vital.
En particular, y sobre todo, gracias a los Dres. Lydia Jiménez y Juan de
Dios Navarro. La financiación recibida por ellos en los comienzos de este
proyecto fue un pilar fundamental para echar unos buenos cimientos.
Gracias a su trabajo y apoyo he podido contar con contratos y proyectos
para financiarme. Queda decir lo agradecida que les estoy por todo lo que
me han enseñado y por supuesto, por tolerar mis caprichos y dilaciones en
el desarrollo de esta tesis.
A los Dres. Miguel Merchán y Javier Yajeya (BFU2009-07341) de la
Universidad de. Salamanca. Al Programa Ramón y Cajal (RYC-2009-
03827). MINECO-FEDER (BFU2011-22740, BFU2014-56164-P) y a la
Fundación Eugenio Rodríguez Pascual.
A la Excma. Diputación de Ciudad Real y la Universidad de Castilla La-
Mancha por el Proyecto de Iniciación a la Investigación (DIPUCR-6).
A la Dirección General de Política Universitaria, Ministerio de
Educación, Cultura y Deporte de España por la concesión de una beca de
investigación para la realización de una estancia en la Universidad Pablo de
Olavide de Sevilla (MHE2011-00118).
Por otro lado, los trabajos en investigación desde mi corta experiencia,
se nutren y salen adelante gracias al apoyo y el respaldo logístico de muchos.
El desarrollo de esta tesis ha sido así, repleta de colaboraciones. Por ello,
Financiación y Logística
194
estoy tremendamente agradecida a todos aquellos que han permitido y
facilitado que esto pudiera salir adelante.
A la Dra. Mairena Martín, del Laboratorio de Bioquímica de Ciudad
Real, por el despliegue de medios prestado. Gracias a todos los miembros
del laboratorio por el tiempo que me dedicaron en mis continuas consultas
PCRenianas.
Al Profesor José María Delgado y la Dra. Agnés Gruart por abrirme las
puertas de la División de Neurociencias de par en par. La electrofisiología in
vivo y el estudio del comportamiento animal llamaron a mi puerta gracias a
su acogida. Agradecerle a cada miembro de la División de Neurociencias de
la Universidad Pablo de Olavide de Sevilla su recibimiento y todo lo que me
enseñaron. Fue un placer. Ningún experimento hubiera sido posible sin la
colaboración y el apoyo técnico de José María González Martín y María
Sánchez Enciso. Me enseñaron muchísimo sobre metodología in vivo!!!.
También agradecer a José Antonio Santos Naharro su apoyo con el equipo
de electrofisiología y el desarrollo de algún que otro aparatejo -a destacar- el
bautizado como Locator 2.0.
Al Dr. Germán Vega por sus conocimientos en Spike, Signal, Excel,
análisis de datos y cómo no, en neurociencia. Gracias por responder y
suscitar tantas cuestiones en mí. No soy capaz de calcular todo lo que ha
aportado a este trabajo. Gracias.
Finalmente agradecer a la Facultad de Medicina de Ciudad Real y a la
Universidad de Castilla-La Mancha haberme brindado la oportunidad de
participar en un proyecto como este. Más allá de la formación científica que
he adquirido con la realización de esta tesis, he participado en diversas
actividades y proyectos aquí organizados que han favorecido el desarrollo de
competencias transversales que completan y hacen satisfactoria mi
formación como doctoranda.
195
12. NOTA DE LA AUTORA
“Uno nunca se da cuenta de lo que ha hecho, sólo puede ver lo que queda por hacer”.
M. Curie