Antibiotikumok Antibiotikumok fejlesztése a fejlesztése a genomika genomika

segítségévelsegítségévelKészítette:

Terecskei Kata IV.biológus

Bevezetés:Bevezetés:

1940-1960-as évek: antibiotikumok ‘aranykora’1940-1960-as évek: antibiotikumok ‘aranykora’1970-es évek: megnyertnek hitt csata1970-es évek: megnyertnek hitt csata1985 óta: antibiotikum rezisztencia1985 óta: antibiotikum rezisztencia Methicillin-rezisztens Methicillin-rezisztens Staphylococcus Staphylococcus

aureus aureus (MRSA)(MRSA) Vancomycin-rezisztens Vancomycin-rezisztens EnterococcusokEnterococcusok (VRA)(VRA) Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniae Enterococcus faecalisEnterococcus faecalis Multidrog rezisztensMultidrog rezisztens Mycobacterium Mycobacterium

tubercolosistubercolosis PseudomonasokPseudomonasok

1990-es évekig gyógyszeripar célja: meglevő szerek fejlesztése (pl: tetraciklinek glicilciklinek kinolok fluorokinolok)

Genomika: új molekuláris targetekEscherichia coli, Bacillus subtilis modellek

helyett direkt a patogénnel való munka.

Gram-negatív baktériumok antibiotikum rezisztenciája Magyarországon

Genom szekvenálás: új Genom szekvenálás: új target azonosításának target azonosításának

alapjaalapja• Szekvenálás automatizálásaSzekvenálás automatizálása• Első publikált megszekvenált teljes bakteriális Első publikált megszekvenált teljes bakteriális

genom: genom: Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae (1995) (1995)• Mai antibiotikumok célpontja: DNS, RNS, fehérje, Mai antibiotikumok célpontja: DNS, RNS, fehérje,

sejtfal-szintézis sejtfal-szintézis bővülhet a hatáskörbővülhet a hatáskör• Klasszikus módszer: cidikus vagy sztatikus vegyület Klasszikus módszer: cidikus vagy sztatikus vegyület

keresése keresése Ésszerűbb target-alapú stratégiaÉsszerűbb target-alapú stratégia• Genomika: szekvenálás + bioinformatikai analízisGenomika: szekvenálás + bioinformatikai analízis

Target szelektálásTarget szelektálásKritériumok:Kritériumok: - emberben ne forduljon elő- emberben ne forduljon elő - esszenciális legyen a baktérium - esszenciális legyen a baktérium

növekedéséhez vagy életképességéheznövekedéséhez vagy életképességéhez - expresszálódjon a fertőzés folyamán - expresszálódjon a fertőzés folyamán

és fontos legyen abbanés fontos legyen abban Target spektrum és szelektivitás:Target spektrum és szelektivitás:• ORF azonosításORF azonosítás• In silico vizsgálatokIn silico vizsgálatok• Filogenetikai vizsgálatok (különböző Filogenetikai vizsgálatok (különböző fajokban, egy faj különböző izolátumaiban)fajokban, egy faj különböző izolátumaiban)

In silico vizsgálat fontossága:In silico vizsgálat fontossága: UDP-N-acetil-glükóz- UDP-N-acetil-glükóz-amin enolpyruvát transzferáz (MurA) amin enolpyruvát transzferáz (MurA)

Esszenciális génről van-e Esszenciális génről van-e szó?szó?

Gén-inaktiválás: - plazmid-beépítésGén-inaktiválás: - plazmid-beépítés - transzpozon-inszerciós mutagenezis- transzpozon-inszerciós mutagenezis - allél-replacement mutagenezis- allél-replacement mutagenezis - in vitro kondícionálisan letális mutánsok izolálása- in vitro kondícionálisan letális mutánsok izolálása (géntermék szintjének vagy aktivitásának csökkentése)(géntermék szintjének vagy aktivitásának csökkentése)Problémák: - kapcsolat kimutatása a target gátlása és az Problémák: - kapcsolat kimutatása a target gátlása és az antimikrobiális hatás közöttantimikrobiális hatás között - nonspecifikus hatások- nonspecifikus hatások - nem várt toxicitás- nem várt toxicitás

met-tRNS szintetáz

polipeptid deformiláz

Transzkripció a fertőzés Transzkripció a fertőzés soránsorán

• IVET (in vivo expression technology)IVET (in vivo expression technology)• DFI (differential fluorescent induction)DFI (differential fluorescent induction)• STM (signature tagged mutagenesis)STM (signature tagged mutagenesis)• microarray technikamicroarray technika• RT-PCR alapú technikaRT-PCR alapú technika

Ígéretes targetekÍgéretes targetek• Amino-acil tRNS szintetázok: Amino-acil tRNS szintetázok: 20 van a prokarióta sejtben 20 van a prokarióta sejtben 20 új target? 20 új target?Mupirocin - isoleucyl tRNS szintetázt gátolja Mupirocin - isoleucyl tRNS szintetázt gátolja BactrobanBactrobanTM TM • Polipeptid deformilázok:Polipeptid deformilázok:A deformilálás kritikus lépés a bakteriális fehérje-A deformilálás kritikus lépés a bakteriális fehérje-szintézisben, Pdf esszenciális a baktérium szintézisben, Pdf esszenciális a baktérium növekedéséhez. Jól konzervált sok patogén esetében.növekedéséhez. Jól konzervált sok patogén esetében.Actinonin - természetben előforduló antibiotikum, Actinonin - természetben előforduló antibiotikum, Pdf-et gátolja több patogén baktériumban (de nem jó Pdf-et gátolja több patogén baktériumban (de nem jó a farmakokinetikája)a farmakokinetikája)• Zsírsav bioszintézis:Zsírsav bioszintézis:Baktérium - de novo zsírsav bioszintézis több Baktérium - de novo zsírsav bioszintézis több enzimmelenzimmelEmlős - FAS (fatty acid synthase) komplexEmlős - FAS (fatty acid synthase) komplexKettő közt alacsony szekvencia-homológia Kettő közt alacsony szekvencia-homológia szelektív szelektív inhibítorok (isoniazid, thiolactomycin)inhibítorok (isoniazid, thiolactomycin)

Antimikrobiális Antimikrobiális szerek fejlesztése a szerek fejlesztése a

bakteriofágok bakteriofágok genomjának genomjának segítségévelsegítségével

Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus nosocomális fertőzéseknosocomális fertőzések vancomicin, methycillin rezisztenciavancomicin, methycillin rezisztencia megszekvenált genom - esszenciális gének megszekvenált genom - esszenciális gének

azonosításaazonosítása - hőmérséklet-szenzitív - hőmérséklet-szenzitív mutánsok vizsgálatamutánsok vizsgálata - gén inaktiválási - gén inaktiválási

vizsgálatokvizsgálatok

új targetekúj targetek 26 26 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus fág vizsgálatafág vizsgálata 31 polipeptid család -bakteriális növekedést 31 polipeptid család -bakteriális növekedést

gátoltákgátolták

Bakteriofágok:Bakteriofágok: - bakteriális fehérjék - bakteriális fehérjék inaktiválásainaktiválása

- metabolikus folyamatok gátlása- metabolikus folyamatok gátlása

77-es fág ORF104 és DnaI kölcsönhatása77-es fág ORF104 és DnaI kölcsönhatása

kis molekulájú inhibítorok hatásakis molekulájú inhibítorok hatása

S. aureus fág genomS. aureus fág genom150 dsDNS bakteriofág vizsgálata:

Lítikus hatás

3 csoport <20 kbp (p68 fág C1)

~40 kbp (77-es fág B1/B2)

>100 kbp (G1 fág A1)Funkcionális screenelés: 77-es fág

- Arzenit indukálható promóter kontrollja alá helyezett fág ORF

- S. aureus ars operonjáról

- kis mennyiségű 77ORF104 termék esetén is gátlás

- citolitikus polipeptidek (holin, amidáz)

- több fág esetében is

Dot screening

S. aureus S. aureus DnaI DnaI

77ORF104 celluláris targetje77ORF104 celluláris targetje DNS replikáció iniciációjaDNS replikáció iniciációja

77ORF104-DnaI kölcsönhatás:77ORF104-DnaI kölcsönhatás:

DnaI azonosítása affinitás-kromatográfiával

Élesztő 2 hibrid analízis

Far-western analízis

DnaI esszenciális DnaI esszenciális S. S. aureusbanaureusbanRpLLReDnaI - genetikailag módosított

törzs

Spac promóter

RN4220 - kontroll törzs

pMJ8426 plazmid - LacI-t konstitutívan expresszál

77ORF104 expresszió 77ORF104 expresszió gátolja a DNS szintézistgátolja a DNS szintézist

• direkt és specifikus direkt és specifikus

interakció DnaI-velinterakció DnaI-vel• ORF67 ORF67

RNS szintézist gátolRNS szintézist gátol

Antimikrobiális Antimikrobiális szerek hatása DnaI-reszerek hatása DnaI-re

125000 vegyület tesztelése elérhető könyvtárakból

36 hatással volt a DnaI-77ORF104 kölcsönhatásra

11 igen hatásosan gátolta a bakteriális növekedést

ÖsszefoglalásÖsszefoglalás DnaI és DnaN

Sok potenciális target a DNS replikációs folyamatban

Antimikrobiális hatású fág ORF-ek azonosítása

További, DnaI-hez hasonló proteinek azonosítása

Screening: fág ORF-fel bakteriális target azonosítása

Kis molekulájú inhibítorok

További patogének vizsgálata:

- Streptococcus pneumoniae

- Pseudomonas aeruginosa

Köszönöm a figyelmet!