antibodies against hair follicles are associated with alopecia totalis in autoimmune polyendocrine...

5
Antibodies Against Hair Follicles are Associated with Alopecia Totalis in Autoimmune Polyendocrine Syndrome Type I Ha Êkan Hedstrand, Jaakko Perheentupa,* Olov Ekwall, Jan Gustafsson,² Gerd Michae Èlsson, Eystein Husebye,³ Fredrik Rorsman, and Olle Ka Èmpe Department of Medical Sciences, University Hospital, Uppsala, Sweden; ²Department of Women's and Children's Health, University Hospital, Uppsala, Sweden; *Hospital for Children and Adolescents, University of Helsinki, Helsinki, Finland; ³Department of Internal Medicine, Haukeland University Hospital, Bergen, Norway In the autosomal recessively inherited autoimmune polyendocrine syndrome type I (APS I) patients have autoantibodies directed against several endocrine and nonendocrine organs. Alopecia areata is present in about one-third of the patients and usually in the more severe forms, alopecia universalis or totalis. Sera from 39 patients with APS I, diluted 1:150, were used in indirect immuno¯uorescence staining of cryo-sections from normal human scalp. Two hair follicle staining patterns were observed. A cytoplasmic staining of the differentiating matrix, cuticle, and cortex keratinocytes in the anagen hair follicle was seen in ®ve (13%) APS I sera. All these ®ve patients had alopecia totalis, representing 63% of the eight patients with alopecia totalis (p < 0.0001). Furthermore, four (10%) of the APS I sera stained the nuclei of the melanocytes in the hair follicle. Two of these patients had vitiligo. None of 20 healthy control sera stained the keratinocyte cells or the melanocyte nuclei. These data show that many patients with APS I have high-titer autoantibodies directed against the anagen matrix, cuticle, and cortex keratinocytes and a melanocyte nuclear antigen, and also that the hair follicle keratinocyte staining is associated with alopecia, especially alopecia totalis. This study emphasizes the role of the differentiating anagen keratinocytes as an important structure in the autoimmune etiology of alopecia, both in APS I and at least in a subgroup of patients with alopecia areata unrelated to APS I. Key words: APECED/autoantibody/precortical matrix. J Invest Dermatol 113:1054±1058, 1999 A utoimmune polyendocrine syndrome type I (APS I), also called autoimmune polyendocrino-pathy-can- didiasis-ectodermal dystrophy (APECED, OMIM 240300), is a monogenic, autosomal recessive disease characterized by organ-speci®c autoimmu- nity and ectodermal manifestations. Recently the gene autoim- mune regulator (AIRE), coding for a novel protein with characteristics of a transcription factor, was identi®ed on chromo- some 21 (Nagamine et al, 1997; The-Finnish-German-APECED- Consortium, 1997; Bjo Èrses et al, 1999). Two of a classical triad of manifestations, namely mucocutaneous candidiasis, hypoparathyroidism, and adrenocortical insuf®ciency, are required for the diagnosis of APS I (Neufeld et al, 1980). Other severe manifestations include autoimmune chronic active hepatitis, gonadal failure, malabsorption, and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). Ectodermal conditions such as vitiligo, alopecia areata, keratoconjunctivitis, and nail and enamel dystrophy are also frequently present (Ahonen et al, 1990; Betterle et al, 1998). Both cellular and humoral autoimmunity are probably involved in the pathogenesis of APS I. The antigenic structures identi®ed by the autoantibodies are often important, tissue-speci®c key enzymes (Winqvist et al, 1992; Rorsman et al, 1995; Chen et al, 1996; Tuomi et al, 1996; Gebre-Medhin et al, 1997; Peterson et al, 1997; Ekwall et al, 1998). Alopecia areata is probably a heterogeneous disease, with both genetic and environmental factors thought to be involved (Gilhar et al, 1998; McDonagh and Messenger, 1996). In a subgroup of patients, the etiology is probably autoimmune, as there is a strong association with autoimmune diseases such as thyroiditis and pernicious anemia, and as an association with certain MHC haplotypes has been demonstrated (Price and Colombe, 1996). Antibodies directed against hair follicles in patients with alopecia areata have previously been found in studies with western blot (Tobin et al, 1994) and indirect immuno¯uorescence (IIF) (Tobin et al, 1997a). Diseases other than APS I are known to be associated with alopecia areata, e.g., severe alopecia areata has been found to be associated with atopy (Shellow et al, 1992). Interestingly, patients with trisomy 21, having an extra copy of the AIRE gene, are prone to develop severe alopecia areata (Du Vivier and Munro, 1975). Previous studies of autoantibody reactivity of APS I have been instrumental in identifying several autoantigens of importance in more common autoimmune diseases (Mirakian et al, 1998). Although alopecia is a common feature in APS I, affecting 29%± 37% of the patients and occurring between the ages of 3 and 30 y (Betterle et al, 1998), little is known about immunoreactivity against the hair follicle in this patient category. In this study we have used IIF to investigate the presence of autoantibodies against the hair follicle in patients with APS I, and the relationship of these Manuscript received March 9, 1999; revised August 25, 1999; accepted for publication August 26, 1999. Reprint requests to: Dr. Ha Êkan Hedstrand, Department of Medical Sciences, University Hospital, SE-751 85, Uppsala, Sweden. Email: [email protected] Abbreviations: APS I, autoimmune polyendocrine syndrome type I; IIF, indirect immuno¯uorescence. 0022-202X/99/$ 14.00 ´ Copyright # 1999 by The Society for Investigative Dermatology, Inc. 1054

Upload: olle

Post on 06-Jul-2016

215 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

��������� ����� ��� �������� � � �������� ���� �������������� �� ���������� ��������� ��� ���� ��� ���� �

������ �������� ����� ����������� �� � ������� ��� ������� ��� ��� ���������� �� ������ �������������� �!��� ��� ���� "��!��#���!�� � ������� $�������� %������� � ������ %������� $�����& �#���!�� � ' !��(� ��� )������(� ������ %������� � ������%������� $�����& �� ����� � )������ ��� *� �������� %������� � ��������� ��������� �������& �#���!�� � +����� ��������� ���������%������� � ������ ,�-��� . ���

�� ��� �������� �������� ���� ���� ������������������� ��� ��� ��� ���� � ���� �� ������� ����������������� �� ����� ����� ��� �� ����� ��� ����������� ��� � ��� �������� � ���� � � ���� ������� ������� � � ��� ������� ��� ������ �� ����� � ��� � � �! �������� ����� ��� � ��������� � �� "# ������� ���� ��� �! ������� $%$&'!�� � ��� �� ���� ��� ������(�� ������ ������� � ��������� �� �� ��� ����� ����� ��� ��� ������� ������ ����� � �� � ��� ���� ����������� ������ � ��� �� � �������� ��� �)!�������! ��� �� ��) *� ��������� �� ��� ����� ��� ������� �� ��� �� +�� �$",� ��� � � �� ��� ����+�� ������� ��� �������� ������! �� ������ -", � ��� ���� ������� ���� �������� ������ �� . '�'''$���� ��� �� �! �� �$',� � ��� ��� � � � ������

��� ������ � ��� ���������� �� ��� ��� ����������� � ���� ������� ��� �������� /��� � 0'������� ���� �� � � ������ ��� *� ��������� ���� � ��� ���������� ������� ���� ���� ��� ���� ����������� ���� ��� � ���� �������� ��������������� ����� ����� ��� ����� ��� �)! �������! ����� ��) *� ��������� ��� � ���������� ������ ������! ��� ��� ���� ��� ��� ������� *� ��������������� � �������� ���� ��������! ����������������� ������� ��� ���� ������1� ��� ��� � ��� �� � �������� ����� *� ��������� � ������ ���� � ���� � �� ��� ���������� ������� � ��������! ���� �� ��� � ��� �� ���� �� � �� ��� � ������� ���� �������� � ���� �� ������ �� ��� �� �������� �� ��������������������������� ������� � �������������� �� �!"#$�!"%& �'''

*� �!!��� � ����� ���� ���� !� ��� + /*�$ +0���� ������ �� �!!��� � ����� ��� 1����1���1��������1�� ��!�� ��� ��� /*��)�#� ��+�2345440� �� � ! � -����� �� � !�� ��������������� �������6�� �� -��1�����7� �� �!!�1

��� ��� �� ��!�� !�������� ��8 ������ �� -��� �� �!1!��� �-��� /*+ �0� � ���- � � � ��� � ��� �������������� � � ������� � ��� � ��� �����7�� � �� ! 1� !� 29 /.�-�!��� �� ��� 9::;& <��1�������1��!��1*��)�#1) �� ��!� 9::;& ,= ���� �� ��� 9:::08<� � � ��������� ��� � !�������� ��� ��!��� !�� ����� ��

������������ ��� ����� ����!� ��� ���� � ���� �����7��������� �>���� � �� ���-� ��� � *�$ + /.������ �� ��� 9:?408 �������� !�������� �� ������� �� �!!��� �� ��� ����� ��������- ����� ������� !����� �� �� ��� �������1�������� �������!������ /+##�08 �� ��!�� � ���� �� ���� �� �����- � �� ���������� ��� � �=��������� ��� ���� ��� ���!�� ��� ��� �� ��� ��>����� ����� /*� ��� �� ��� 9::4& ,���� �� ��� 9::?08 , �������� ��� ��! �� �� �!!���� �� � ����� ��� ���� �� ����� -������ � *�$ +8 <�� ���-���� ������ �����7�� �� ���� ���� ���� �� ��� �!� ��� �����1�����7� ��� ��6�!��

/'��>��� �� ��� 9::2& �!�� �� ��� 9::@& )��� �� ��� 9::A& <� !��� ��� 9::A& ����1������ �� ��� 9::;& ���� � �� ��� 9::;& �������� ��� 9::?08*� ����� ���� �� � ����� � ��� -��� �� �������� ��� � �

-����� ��� ���� �!���� ��� � � �-� �� ��� ���� /����� ����� 9::?& ��# ��-� ��� ������-�� 9::A08 +� � ���- �� �������� �� �� � -� �� � ����� �� �!!���� �� ��� �� � � �-��� ���� � ��� �� �!!��� �������� ���� �� �� ����� ��������� �� ���!��� ��� �� �� ��� ���� � ��� ����� ��)���� ���� ��� ���� ��! ����� /���� ��� ) � !��� 9::A08*��� ���� ������ �-���� ��� � ������� �� ������ ��� �� ��������� ���� ���� ���� ���� � ��� �� ������ ��� ����� �� /< ��� �� ��� 9::30 ��� ������ �!!�� B� ������� /++�0 /< ����� ��� 9::;�08 #������� �� ��� *�$ + �� �� �� �� ��� �������� �� ����� ����� �8-8� ����� �� ����� ���� ��� ���� � ��� �� ��� ����� ��� � �� /$���� � �� ��� 9::208 +������-��� ��������� �� !� 29� �����- �� �C� � �� � �� *+ � -���� �� � �� ����� � ����� �� ����� ���� /#� D���� ��� ��� � 9:;@08���� �� ������ � �� ���� �� ������� � *�$ + ���� ����

����!���� �� ���������- ������ �� ���-��� � �!� ���� ��! � � !! � �� �!!��� �������� /������� �� ��� 9::?08*�� �-� �� ����� �� � � !! � ����� �� *�$ +� �������- 2:EF5;E � �� ������ ��� �����- ������ �� �-�� � 5 ��� 54 �/,���� �� ��� 9::?0� ���� �� �� �� �� � �!!�� ��������-���� �� ��� � ������ �� ��� ����� ���- �8 +� ��� ���� ������ ���� ++� ������-�� �� ������� � �� ���� ���� �-������ ��� � ������ �� ������ ��� *�$ +� ��� �� ���� ����� � ����

�������� ������� ���� :� 9:::& ������ *�-�� 2@� 9:::& �������� �������� � *�-�� 2A� 9:::8 ���� �>���� G #8 ������ �������� #���!�� � �������

$�������� %������� � ������ $�1;@9 ?@� %������� $�����8 �!���G�����8�������H!������8��8��*������� ��G *�$ +� �� �!!��� � ����� ���� ���� !� ��� +& ++��

������ �!!�� B� �������8

44221242IJ::JK 93844 L ) ���-� � 9::: �� <�� $ ���� � +�����-���� #�!� � -�� +��8

$'&2

�� ���� ���� �� ������� � ��� �� ��� � ! ������ ����� ����� ���� ������� *�$ +8

�*<� +*M$ *.# ��<��#$

���3��� $�� ��� ������ � ! 94 $������� ���� . ��-���� ��� 24������� ������ ��� *�$ +� ���� ������ ��� �� ����� ������� *�$ +���� 24 ������ � � ��8 <�� 24 ������� ������ � ������ � ��� !���- �� � A? *�$ + ������ ������ �� ������ ���� �� ������-�� ��/*� ��� �� ��� 9::4& ���������� 9::A& ������ �� ��� 9::?08 <�� ������������������� � ��-� � �� $������ ��� ��� ���� � �� . ��-��������� ��� *�$ + ���� ���� �������� �������� /����1������ �� ���9::;& ������ �� ��� 9::?08 <� � �� $������ *�$ + ������� � � ��!�������� � ���� �������� ���� ����8 , � ���� ������ ��� �����������7������� ������������ ��� �������8 ��� � ��! ��� ��� ���������������� �� ������ �� �� ��� ��� ����� ����!8 . �� � ��! ����� ����� �����- 8 <�� ��!�� � !�� ��� � !�� ��� � � ��� ��C ���� $������� ����������� ��� ��� ��C �� �� . ��-���� ��� 99 ��� ������ �� ������� - ���� ��� �� -��� 9? !�� ��� 29 � !��8 <�� !����-� ��� 2489 � �� �� $������ - ��� 2;89 �� �� . ��-��� - ��� ���5983 �� �� ������� - ��8 <�� ������ ��� �� ����� ���� ������� *�$ + ��� �������� � ! �� #���!�� � #�!� � -� � %������%������� � �����8 *� ����� ���� ��� ����� �� ��� /54E0 � ��$������� ����� /5@E0 � �� �������� ��� � /22E0 � �� . ��-��������� ��� *�$ +8 <��� � �� � ! � ����� �� ����� �� �� /94E0$������� �� /@E0 �������� ��� � /22E0 . ��-��� *�$ + ������8 <���!�����- ��-� ������ ��� �� ����� ���� ����������8 D����- �������� �� � /24E0 $������� 7�� /2@E0 �������� ��� � /22E0. ��-��� *�$ + ������ ��� �� �� ����� ��� �� ����� ���� ������� *�$ +8 *! �- �� ���� ������ ��� �� ����� ���� ������� *�$ +�7�� /@AE0 ��� ����� �� ����� ���� ��� � � /33E0 ��� �� ����� ����8<��� ��� ��� !�� ��� ��C � !�� �� ��� ����� - �� ��� �� !����-� ��� 598: �8 $�� ��� � ������ ��� �� ��� ��� � �� � ��� ������ !!����8

�����+� ��������� * ! ��� �����!�� ! � �� ��� ���� �� �������-���� � �� ���������6�� �� !���� ���1�����7� ����1������ � ���/*.*'*� N������ $��6�����0� � �+<)1� �=�-��� � ���� ���! ����!!�� -� ������ � �+<)1� �=�-��� � ���� �����!�� �!!�� -� ��������� � )�51� �=�-��� � ���� �����!�� �!!�� -� ����� /����� �+!!�� ������ M�� � ���� '�� � ��� �*0 ��� ����8

��� ������ $���� ����� ��� ���� � ! � ������ ����� ����- ��-��� ��-��8 <��� ��� � �� ��� �� ��� ��� � �� � ��� ������ !!���8 <�� ����� ��!��� ��� �!!������� �� �� ���1� �� �� ��������� �� � 6�� �� A�! ���� �� ��� � �� � F;4�) ���� ������8 ,�� �������-� �� ���� �� ��� ��1���� � 9 �� 7C�� �� ��� �� � 2!��� ����� ���� ��� � !�� � ���� ���! /$�-!�� $8 M ���� ��0 F ������ 9G24�� ����� � ����� /AJ; �,$J2E ,$*O 9J; ���� �0 F � 94!�� � !�!�����8 +������ � ��� ����� ��� ��� ���!���� ��� ���� ���������� 9G9@4 �� ����� � ����� � O3�) �� � ! �� ���!�� ����-� ���� �� ��� �� ������� � ��� �+<)1 )�51� �=�-��� ���� ���������������� ������ 9G@4 �� ����� � ����� � 54!�� � !�!�����8 <�� ���� �� ��� ������ �� �,$ ��� �!�� ������ ����������� � ���8 �������� ��� ��� ! ���� ��� 489E �1������������!��� ������ �� :848 �� -���� ��� ���� ����- � N����394 ���� M��� $��� ��� �� ��8 *�� ������ ��� ���� ��� ����������-�8 . � ��� -����� � ������- ��� ��� !��8

���������� ������ ������(� �C�� �� ��� ���� � !��� ����������� � � � ����� ������- ���� ������ ������ ��� ��� ��� ��� ����� �����- 8

�$%M<$

������� ����� � <� ������ ������- ����� ��� ����������- *�$ + ��� /�� $08 <�� 7� ��� � � �- �� ����!�� ������- � �� �����������- ����� � �� ��� ���� !��C� ������� ���� �C8 . ������- ��� ���� ��� � �� *��� ������ �� �������������� !��C� ���� �� ����� �� � �������� ��� �� ����

��� � $� ��� ������ ����� � � �� ���! ����� ����� ��� ����������� � � �� ��� � �������� /�0 $�����- � �� !��C� ������� ���� C�!�� � �C ����� ���� /7� ����08 /�0 $�����- � ������ ������� �� �� ������� /��� �� ����08 /�0 ) � � ���! �� ���- � �����7�������- � �� � ������8 ����� ���G 944�!8

D�M8 995� .�8 A #�)��,� 9::: *�$ +� �*+ ��MM+)M� +��%.� �*)<+D+<P $'&&

����������� /�� $�08 <�� ��� �� ���� � ������ � ������������ ����� �!!������� ��=���� �� ��!�� ������� /�� $�08'��� ���� �� � ���� ������- ��� �� ���!���� ��� ���� �������� ��� � �����- ��� ���� ������ �� ��� � �� !���� ����������� ��������- � ������ ���-�� /�� 008 * ��!��� �� ����������� ������- � ��� ��� �� ������ �� ����� �� �- �� ����� ���� � �� �����!�� ��� �� ����� �� �- �� �� ����� /��� � �� ��08 $�����- � �� ��C��� ���� ��� ���� ��� � � *�$ + ������ � � � ��� ��� ��� �-���� �� � ������7�8 < ������� ��������- ������� � �C�������� ������ �������� �� ������- ��� � ����1����� ����� �� �� ��- �� ������- ������� �� ��-���� O OOO8

��������� � �������� ���� ������� ���� ��� �� � ��������� ����� � <� /24E0 � �� ��� � ! �� 94 $������������ ��� ��� /9@E0 � � �� � ! �� 24 ������� ������� ����� -��� 7�� /95E0 � �� 5: *�$ + ���� ��������� �� !��C�������� ��� � �C ������- ���� /����� �08 *�� � ���� 7�������� ��� �� ����� ����� ��������- A5E � �� ��-� ��������� �� ����� ���� /� Q 4844490 ��� 32E � ��� 92 *�$ + ��������� �� ����� /�R 48449308 $��! � ! �� � ���� ������ ���

�� ����� ���� ������� *�$ + ��� ������ �� !��C� ��� ����� �� ������� �� �������� �� *�$ + ������- �������� � !���� �� � �������� ��� � ������ ���� �� /�� "0 <�������� ��� ��� �� ����� ����8 <�� !��C ������- ��� � ������� ��� � ! �� . ��-��� ������ �� � � �� /�� $�08<��� /55E0 � �� *�$ + ������ -����- �� !��CJ� �C ������-���� ��� ��� �����- � �� � �������� ��� ���� � ��� � ��������� ��� ������- ���� ��� �����- /�R 484;08<�� ������- � �� !���� ���� �� �� ��� � ������� ���

�����!�� ��� ���� �� ��� /54E0 � �� 94 $������ ��� ��/@E0 � �� 24 ������� ������� � ������- � � /94E0 � �� 5:*�$ + ������8 �� ����� � ��� �����- � ��������- 22E � ������ *�$ + ������ ��� �����- � ��� �� ��� �� ����� ����8 . ���������� ��-��7��� ��� ���� �� ��� � ���� � ����� � ������ � ������� �� �����!�� ������-8

#+$)%$$+�.

<��� ���� �� �� �� ������ ��� *�$ + ���� ��-�1���� ���� ���� �����- �-���� � � �����������- ����� ������� !���� ���� �� �� ��� � ������� � ����� ��� ����� ��� � � ��� ��!�� �� ���-��� �� ������ ��� *�$ +8 <�� ������- ��� �����������- ����� ���� �� �� !��C� ������� ��� � �C��� ��� ������ �� �� ����� ��� �� ����� ���� ������� *�$ +8*� ����� ���� �� *�$ + ������ �� � � �� ������ !�������1

� �8 <�� ! � � !! � � ! �� *�$ + ������ �� �� ����� ���� ����������8 +� � ���� �� ���� ��� � ! ������ ��� �� ��������� ������� *�$ +� ������ 9G@4� �� ��� ������� �-������ ���� ������ �� ������ !��C� ��� ��� ����/< ��� �� ��� 9::;�0� ��������- ��� -��� �� ���-��� �� ����������8 +� � ��� ����� ����- ��� ������- ��� ������ ��� ��-��� � ��� �� � ����� ��� ��� ������ 9G9@48 +� ������ ��� � ������- ����� ��� ���� ��� ��� ����� �8 <��!��C ������- ���� ��� � ��� �� � �-�� ��� ����� ����� ����� ���� /�R 4844930 �� �� ��� ��� ���� � ��� � ��� ����� ! � ����� �� ����� ���� /� Q 4844490� �� � �� � �� ���� ! *�$ + ������ ��� ����� �� ����� ���� �� ��� ���������- ����8 <�� *�$ + ��� �� �� �� � ���� ��-�1���� ���� ����� ��� ������ �-���� -��1�����7� ��6�!�� ����� �!� ���� � �� �����7� ����� /'��>��� �� ��� 9::@& �������� ��� 9::?08 $ !� � ���� ���� ��� ���� � ��� �� ���� ���-��� �� �� �� �!!��� ��������� �8-8� 291��� C����� ����� ����� *���� �(� ������� /'��>��� �� ��� 9::20� ����1�����������-� ��6�!� �� �� �!!��� ��!��� ����� �����7������/'��>��� �� ��� 9::@& )��� �� ��� 9::A0� ��� -���!�� ��������� C����� A@ �� �������1�������� ������� !������ /<� !� ����� 9::A08<�� �!!�� ������� �-���� �� ��� � ������ !��C� �������

��� � �C ����� ���� �������� �� ��� ���� !�-� ������� ��������� � �� �!� �� �� ���-�� � ��� �� *�$ +� �� ��� ���� ����� ������� *�$ +� �� �������� �� �� ������� ��� ���� ���� �-���� �� ��!� ������ �� �� � �� ��� � !�� � �1*�$ + ������ ��� �� ����� ���� ����8 $ !� � �� �� ������� � ����� !�� ���� ���� ���� ������ �-���� ���������� �� ��� � �� ++� ����� � ����� �� ��� ����� �� >������������� �� !��� ����!� /��� �� �� ��� 9::;08

��� � 0� 4����� ������ ���� ��� � � � ��� ������������������+� �������� ����� ������ ��������� ����� � ������ ������ �� ����������� ��� *�$ + ���& -���� ���!���� ��� �����7����� ��8 +����� �!!�� B� ������� ������- � � !�� ��!�� ���-����� � ������ ��� �� ���! � ! � ����� ��� *�$ + �� ���- ������� ��� ��� �� ����8 ����� ���G 944�!

����� �� ������� ����� � ��� �� ������� �� �������� ��� ������� �� "# ������� ���� ��� �

$�����- ���� #�� �� .�!��J �� � ����� ��� ��� �� � ����� ��� � ��� �� � ������

���CJ� �CJ������ *� ����� 92J5: /59E0 @J92 /32E0 4 484493

����� 3J5: /94E0 4 4

���� ?J5: /24E0 @J? /A5E0 4 Q 484449

D����- :J5: /25E0 5J: /55E0 2J54 /;E0 484;

����� ���� *� ����� 92J5: /59E0 9J92 /?E0 5J2; /99E0 S48::

D����- :J5: /25E0 2J: /22E0 2J54 /;E0 482

�)�������� �� ��� � �����(� �C�� ��8

$'&- ��#$< *.# �� <�� ��% .*M �� +.D�$<+�*<+D� #� �*<�M��P

<�� ��� ���� !��C ����� � �� ��� � ������ ���� ���� �������� � ���� � �� �!� �� ������ �� �� ����� ����8 +������� ��� �� ����� ���� �� �C����� � � �M*1# ���+)*�F9� ! ������� �!� �� � �� �!!��� ������ �� ��� ����� ��� �� ������ �� ��� ���� !��C � ���� ��� ���� �������8 .���� �� � ����� ��� � ������� �� �� ������ � ��� ������� �� ������ ����������� ��� ��� �C����� � � ����! ������� ������ /������-� ��� ,������� 9:?@& ��# ��-� ����� 9::508 +� ����� �� �� ������ ���� ��!�-� ��� � ������� ���� ����� ���� ��� ���� � ��� ��� �� �� ��� ���� !��C/������-� ��� ,������� 9:?308 <�� � �������� � � � !! ��� ���-�� �� �� ����� �� ���� �� �� ������ �� �� )5�J���! ��� ���� �� ����� ������� �-���� �����������- !��C����� ����� ��� � ������- ���� ��!��� �� ���� �� *�$ + ����� ����� ��� ���� ��! ����� /< ��� �� ��� 9::;�08 <�� ������ � �� ���! � ! �� � � ������ ��� �� ����� ���� ������� *�$ + �� ��� �� ��!� ������� �� �� *�$ +������� ���� ���-���� ��� � ��������8 ����! �� � ������� �� �� �� �� ��-�� � ������ � �� ����� ���� ��� ����� ��) ����� ++ �������� �� �M*1#T;� # 99� ��� # 3���� �� ! � � !! � �� ������ ��� � �-1������- �� ����� ���� ���������� ��� �� � �-1������- ����� �� ����� ����/���� ��� ) � !��� 9::A08 *�$ + �� � ! � -���� ������� ��� ����� ������ -���� �� �!!��� �-��� � *+ �� ��� ������ ���������7�� /.�-�!��� �� ��� 9::;& <��1�������1��!��1*��)�#1) �� ��!� 9::;08 <�� ��� �� *�$ + �� � ��� ����� ��� ���M* � �� � �� � ��� � �� � �������� � � � !! � ��� � ������!��CJ� �C �� ���-�� �� *�$ + ��� ��� � ����� � ���- �� ������� ��� �� ����� ���� ������� *�$ +8 <�� ��� -����� �� � *+ � �� ��!�� �� �!!���� �� ��� *�$ +� ��������-�� ����� ����� �!���� �� ����������8 +� ������ �!!�� �� ��-�C���!��� �� ��� ������ 7�� ��� � ������ ��������-���� � ������6�� ���� �� � ��!�� ����� �����8 <�� ��� � � ���� �� �� ������ �� ��� � �� ���� ��� C������ �� ��*�$ + �� ���-�� /������ �� ��� 9::?0� �� � ����� �� ���� ���-�� �� ��� ����� �� � �!��� ���� � � ����� ����� ��� ��� ������ �� ��� � �� ����� � ����� � �!!�� �� ��-8 <���!�� �� � �������� ���� ���- ������� �� �� ���-��� �������� � ������- ������� ���� ����8+� ��� ����� ��� � ! � � *�$ + ������ /94E0 �� ���

!���� ���1�����7� ������- �� ��� � ������� ��� �����!��� � ��� ! ��� �����- � ��������- 22E � �� �����- ������&� ����� �������� ��-��7����� ��� � ������ �� ��� �!�����!�� � �����- ������8 + ���� �� � ����� ��� ����� ��� �� ������ -����- !���� ��� ������- ���� ����� � �����- �� �� ����8 ������ � !� �����- ������ !�� ��� ������ ���� �� ��� ��� � �� ++� ����� � ������ ������- � �������-���� ����8 ) !���!��17C���- !���� ��� ���� ���� �������� ���� ���� ������ ��� �� �!!�� B� ����� � !���!��7C�� � �� /+)�<08 <�� ������� ��� ������ �� �� ����! � �� !���� ���� �� �� �����!�� ��� ��� ��� ����� �� ���� ! *�$ + ������� � ��� � �� ! ��� �����- /��6 �� ��� 9:;;&� ����6 �� ��� 9:?908 '�� +)�<� ������� ��� ��� �� ���-���� ��� � ������ !���� ����� �� � �� !���� ��� ���� ������� � ��� ++� ��� � ���� ���������� �� *�$ + ������8+!!�� ������� �-���� �����!�� ��� ��� � ������ �����7�!���� ��� ���-��� ��� ���� ���� ���� �� �� ��� ��� � !�����- ��� �� ����� ���� ������� ���������� /< ��� ���,����� 9::A08 �� ����� ��--��� � � !! � ���-�� �� �������!�� ��� ��� � ������ !���� ����8 ������� �-���� � �� ������ ��� � ������1����� � ���12� ��� ��6�!�� �� ��!������ ��������� ���� ���� �!������� �� !���� ��� �� ���-����� � ��!�� � ������ /$ �- �� ��� 9::3& "�!� �� ��� 9::;�08 <������6�!��� � ����� �� � ���� �� �� �� ����! ��� �� ���

��� � "� ��� ������ � �� ���! ����� ����� ��� �������� $��� ! /�0 �� ����� ��� �� ����� ���� ������� *�$ +& /�0 �� ��!�*�$ + ����� �� �� �� $/�0 � �����- �� 7� ������- ����8 /�0 ) � ����! �� ���- � �����7� ������- � �� � ������8 ����� ���G 944 �!8

D�M8 995� .�8 A #�)��,� 9::: *�$ +� �*+ ��MM+)M� +��%.� �*)<+D+<P $'&5

�������� �� �� ���-��� ����� �� ������ ������- �� �� ����� ����8 *�� � ��� ������ ���� ������ � �7! � ������ �� �!�= �� ���-�� �� �����- /"�!� �� ��� 9::;�& I�� �� ��� 9:::0 +� � ������ �� �� ���� �� �� �� !��� ������ ��� *�$ +

���� ��-�1�� �� ���� ���� ������ �-���� � � � ��� � ������1�����7� ����� ��� ���-�� ��� � !���� ��� ������ ���-��� ����� �� ��� � ������ ������- � �� !��C� ������� ��� � �C��� ����� ��� �� ����� ���� ��� ���������� ��� �� ! � ������ !� �� ����� ����8 <�� ��!����� ������ �� ������- ������� ������ ��� *�$ + ��� �� ����� ���� ������� *�$ + � ������ �� ����� �� ��!� �� ���-��8 *� � ! ��� ������ �!!��� ��� ���� *�$ + �� ��� ������ ������� *�$ + ������ ��� � ���� �����1�����7� �� ���� ���� � ��-� ���� !����-��! ����� �� ���� �����7��� � � �� �� ���-�� ��� ������� �� !��C ������- ����8 �� ����� ��� ���� �!�����6��� �� � �� �����������- ��� ���� !��C ����� ���� ���!� �� ������ �� �� �� �!!��� �� � -� � �� ����� ���������� �� ����� �� *�$ + ��� � ���� �� � ���- �� � ��������� �� ����� ���� ������� *�$ + � �� �!!��� �-��8

��� ����� ��� ��������� �� ������ ���� ��� ������� �������� �������� ��� ������

��� ������ ���������� ���� ��� ������� ������� �� ��������� ��� !������" ����

��� ����� ��� ��� ������� ���� ��� �#"� $����� ���� ��� ��� ������ %������

��� $� ����" &����� '������� ��� (����� (������� ��� �)���� ���������

����������� *� �������+� ���� ��� ���� ���� ��� ������ �,� - ����� ��������

��� *� (��� �.��� �������� ��� *� �������� �/�/� �� *��������� ��

%������������ 0��1������ (�������� 0������ ��� ��������� �� ���� ��� ����� �����

�������

��� �.)�$

*� ��� �� ��������!� $� $����� +� ��������� �G )������� ����� � � �� �!!���� ����� ��� ����1�����������1 �� ��!�� ��� ��� /*��)�#0 �� � ����� � A? ������8 % ��� 2 ��� 522G9?2:F9?5A� 9::4

,���� )� ��--� .*� D ��� �G )������� ����� :5G �� �!!��� � ��-����������� !� ��� 98 2 ���� ��������� ����� ?5G943:F94@@� 9::?

,= ���� �� ��� 1����� �� "��� ��� �� *�� ��� �� ��� ��� M� %�!���� +GM ����6�� � � �� *��)�# � ��� �� ������ ������ ������8 (�� ���3���� ?G2@:F2AA� 9:::

)��� $� $������ �� ,���� )� �� ��G *� ���� ���� �� �� -���� ��6�!�� ���� �!!��� � ��-������� ���� !�� *���� �(� �������� ��� ��!��� ����� ������8 2 ���� ��������� ����� ?9G9?;9F9?;A� 9::A

#� D���� *� ��� ##G *� ����� ����� �� �!!����� ��� # ��(� ���� !�8 !���� 2 9G9:9F9:2� 9:;@

������ �� ������� �� ��!����� M� �� ��G +����7��� � � �� ���� ��� C������� �� �������� �� ���-��8 ������ 5@2G2;:F2?5� 9::?

��� �� *� M���� $� .�� ��� � *� �� ��G 291��� C����� �� ���� ���� �� ���������� ��� ��� ���� �� �!!��� �������� �� ��-��� �����7� � *���� �(��������8 ,��-��� #������ �-���8 ���� )� -������ 94;G539F53A� 9::;

����1������ �� ������� �$� ������� � �� '��>��� �� � �� � *� �!�� ��"��!�� �G )� �� !� �3@4+*2 ��� � !��� M1�!�� ���� ����� C����� �������� �� ���-��� �� �� �!!��� � ����� ���� ���� !� ��� +8 !����� 392G35:F33@� 9::;

����� *� %��!��� P� ,���6�� <� *��� ,� "����� $G *� �!!��� ��� � ��/�� ����� ����0 ������� �� < ��!�� ���� ��!�� ����� �C����� �$)+# !���8 2 ���� -�1��� 949GA2FA;� 9::?

��6 ")� ��66� M*� "������� )�� "�6 $+G *� �!!��� �����- G ����� � ����� ���� !������1� �����- �����8 % ��� 2 ��� 2:;GA53FA5;� 9:;;

� ����6 .� . ����� �M� M��� *,� ,���� �)G *��� ���� !���� ����8�������� �� ������ ��� �����- ��� �� ��� !�� ����� �� �����������8���� *������� 99;G;4@F;4?� 9:?9

"�!� ��� ���� �-� #�� ���.��� $� '�� � ��� '��!�� *�G #���� � �� ������ �� ���� ���� �� ������ ��� �����- ����- 5@$1��������� !����� ��!�� � ������ �� � ��� �!!�� �����8 2 -�1��� *�������94:GA:F;5� 9::;�

"�!� ��� ���� �-� #�� '�� � ��� '��!�� *�G +!!�� �������� � �!���� -���� ��6�!� �� ���-��� ��� �����- ���G �������� � � ��1�������� ���� ���� � ������ ��� � ������1����� � ���12 /< �1208 ����)� -������ 94:G3:@F@44� 9::;�

��# ��-� *�� ������-� *�G <�� ��� -������ � �� ����� ����8 *������� ����93GAA9FA;4� 9::A

��# ��-� *�� $� ���� �*� $���� )� ���� "� ������-� *�G �M* ��� +)*�19�C����� � �� �� ����� ���� �� ��� ��� �� �� G �� �� � �� �����8 !� 2*������� 92:G2@4F2@A� 9::5

������-� *�� ,������ $$G *� ����� ����G ��-� ��� ���� � !�� �� ������ � -� � �� �- ���- ���� ���8 !� 2 *������� 994G9@@F9A2� 9:?3

������-� *�� ,������ $$G �C����� � � �M*1# �� ���-�� ��� � ������� ���� ����� ����8 2 -�1��� *������� ?@G@A:F@;2� 9:?@

������� � M ������ �� , �66 ��G #���� ��� � � ��� �� ���-��� �� ��!���� �!!����8 ������ 5@2G2@@F2@A� 9::?

.�-�!��� "� ���� � �� $� �$� �� ��G � ��� ��� �� ���- � �� *��)�# -���8%�� 3���� 9;G5:5F5:?� 9::;

.������ �� ������� .� ,��66�� G *� �!!��� � ��-������� ���� !��8 ,��������� :G9@3F9A2� 9:?4

��������� �G *� �!!��� � ����� ��� ����1�����������1�� ��!�� ��� ���/*��)�#08 (��� ����� ��� 2?G5@5F5@A� 9::A

���� � �� %�� � ������ �� " �� "G +!!�� �������� � � �� �� -������6�!� �� ���-��� ��� �� �!!��� � ��-������� ���� !� ��� + /*�$ +0���& ���� �������� � ���������� ��! �� �!!���� �3@4�9; ����3@4�298 ���� )� -������ 94;G55@F534� 9::;

���� D�� ) � !�� ,'G ������� ��� � �����-���� � ���� � �� ����� ����8*������� ���� 93GA;:FA?:� 9::A

�!�� �� ������� �$� '��>��� �� ,= �� �� "���� � �*� "��!�� �G * !���1M1�!�� 1���� ����� C������ � ���� C�� �� �����1�������� ��6�!�� �� � ���1���� �� ���-��8 ,��� %��� ���� ��� 0�� :2G?A2AF?A2:� 9::@

$���� � 'D� ������ ��� " �PG � 7�� � �� ����� ����G � >���� ����� �������� � ����� ��� ��!���8 -�� 2 *������� 59G9?AF9?:� 9::2

$ �- P�� ) �� �� M� P� N ���� ,� ,������� �� ������� .G <�� �� �� ������ �� �� �!!��� �����- 8 ������ 533G943:F94@2� 9::3

<��1�������1��!��1*��)�#1) �� ��!G *� �� �!!��� �������� *��)�#������� �� !��� �� �� � � ��� -��� ������- � ��#1��� 6���17�-�� !����8 *� �!!��� � ����� ��� ����1)����������1�� ��!��#�� ���8 %�� 3���� 9;G5::F345� 9::;

< ��� #�� ,���� �)G #������ � ����� �� � !���� ���� �� ����� �� ���� ������� ��� �����!��8 ,������ ���� ��� :G543F594� 9::A

< ��� #�� ������� .� ��� � #*� ,���� �)G *��� ���� ��� � ������� ���� ����� ����8 2 -�1��� *������� 942G;29F;23� 9::3

< ��� #�� ���� $"� $ �- �$� ,���� �)G ��� � ������ ������ �-��� ������ ���� �� ������ ��� �� ����� ����8 ���� *������� 955G@;FA9� 9::;�

< ��� #�� $�����- ��� "��- M� �� , --��� #� ,���� �)G *� ���� ���� ���� ������� �� )5�J��� !��� ��� �� ����� ����1 ���� ��� � ��8 2 -�1��� *�������94:G52:F555� 9::;�

<� !� <� ,= ��� �� ��� �� *� ������ �� ��������� �� M��!�� *� ������� *G*��� ���� -���!�� ���� ����� C����� ��� �������1�������� ������� �������� ��� �� �!!��� � ����� ���� ���� !� ��� +8 2 ���� �������������� ?9G93??F93:3� 9::A

'��>��� �� "���� � �*� "��!�� �G 291��� C������ � !�= �� ���-�� ����� ����� *���� �(� �������8 ������ 55:G9@@:F9@A2� 9::2

'��>��� �� ����1������ �� ������� � �� �6�� ��� M������� �� "���� � �*�"��!�� �G +����7��� � � �� !��� - ����� �� ���-��� �� ������ ��������� �����7������ ��� ��� ����� ����� ������8 2 ���� ��������� �����?4G9;9;F9;25� 9::@

I�� N� )��� #� ��� #� ,���� �)G D����- ���� ���� �� � ������ � ������8���� *������� 95@G39;F322� 9:::

$'&6 ��#$< *.# �� <�� ��% .*M �� +.D�$<+�*<+D� #� �*<�M��P