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Antígenos Recombinantes e suas aplicações em Imunologia
Bióloga Mariana Monezi Borzi
Doutoranda em Microbiologia Agropecuária
Prof. Helio José Montassier
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESPFACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS – FCAV
CAMPUS DE JABOTICABAL
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Novo Dogma Central
da Biologia Molecular
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• Cópia das sequencias de nucleotídeos de umamolécula de DNAfd parental em duasmoléculas filhas de DNAfd
• Semi-conservativa
Replicação
Fita molde
Fita nova
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É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula
de DNA de fita dupla (gene)
Transcrição
Núcleo
Informação genética
Citoplasma
DNA mRNA
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Consiste na transformação da mensagem contida no mRNA, via tRNA, na sequência de aminoácidos que
constituem a proteína
Tradução
Expressão gênica
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Polímero de aminoácidos de massa molecular acima de 10 KDa, com cada aminoácido unido ao
seu vizinho por um tipo específico de ligação covalente.
Proteína
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Sequencia linear dos
resíduos de aminoácidos
(Ligações peptídicas)
Padrões estruturais:
conformação helicoidal ou
lado a lado
(Pontes de hidrogênio)
Arranjo 3D
(Pontes de hidrogênio,
Forças de Van der Wall,
Interações iônicas)
Arranjo entre
cadeias/subunidades
(Ligações dissulfeto)
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• Antígenos: substâncias (moléculas) estranhas aoSI que são reconhecidas por receptoresespecíficos em linfócitos B e T e também poranticorpos.
• Antígenos recombinantes: proteínas específicasdo agente infeccioso, produzidas artificialmentea partir da clonagem gênica
- Proteínas recombinantes
- Proteínas heterólogas
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Produção em larga escala de proteínas recombinantes a partir da expressão de uma
molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado.
DNA recombinante: sequencia de DNA artificial que resulta da combinação
de diferentes sequencias de DNAs
Tecnologia do DNA recombinante
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Estudos bioquímicosAnálises estruturais
Dificuldades de obtenção Produção de Anticorpos
Imunodiagnóstico
Clonagem gênica: isolamento,
amplificação e purificação de um ou
mais genes a partir do material genético
de um dado organismo.
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Células hospedeiras: Leveduras, Células de
insetos, Células de mamíferos, Células bacterianas
Taxa de crescimento
celular;
Complexidade do meio de
cultura;
Custo do meio de cultura;
Nível de expressão;
Capacidade de expressão
extracelular.
Capacidade de produzir as
modificações pós-
traducionais:
- enrolamento correto;
- formação das pontes
dissulfeto;
- glicosilação;
- fosforilação;
- acetilação.
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• Crescimento rápido
• Pouco espaço físico
• Genética bem compreendida
• Aceita material genético estranho
Escherichia coli
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Vetor: molécula de DNA usada como um veículopara carregar sequências de DNA estrangeirasdentro de uma célula hospedeira.
Plasmídeos:
• Mais simples
• Circulares
• Independentes do cromossomo bacteriano
Vetores de expressão
Gene resistência a
antibiótico
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Expressão de proteína recombinante em E. coli: 3 etapas
- Clonagem Gênica
- Indução da Expressão
- Análise da Expressão
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Vetor de expressão
Preparo do inserto- gene
Reação de ligação
Plasmídeo recombinante
Transformação de E. coli
competente
Plaqueamento e seleção
dos clones recombinantes
Extração do
DNAp e
Sequenciamento
ETAPA
1
amp
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Tampão
de lise
Sonicação Purificação
ETAPA 2
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Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS PAGE)
• Quanto menor for o peso molecular daproteína mais facilmente ela migrarápelos poros do gel de poliacrilamida emrelação às outras
• Após a corrida as proteínas poderão servisualizadas com a aplicação do coranteCoomassie Blue
ETAPA
3
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Preparo da amostra: dodecil-sulfato de sódio e β-mercapto-etanol
Confere carga negativa Separa as cadeias
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260 kDa
72 kDa
52 kDa
42 kDa
10 kDa
Caracterização por SDS-PAGE da Nucleoprotéina recombinante do
Vírus da Influenza Aviária expressa em E. coli.
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Western blotting
• Técnica bioquímica utilizada paradeterminar a quantidade relativa e o pesomolecular de uma proteína dentro de umamistura de proteínas ou outras moléculas.
• Uso de anticorpos específicos
• Detecção de antígenos proteicos
ETAPA
3
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Caracterização por Western Blotting da Proteína NP recombinante do VIA expressa
em E. coli após purificação em resina de níquel-agarose.
1 2 3
260 kDa
72 kDa
52 kDa
42 kDa
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Análise (mapeamento)dos epítopos
Epítopo linear ou contínuo
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Epítopo conformacional ou
descontínuo
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Imunodiagnóstico
• Sorologia - detecção de Acs contra antígenos viraise bacterianos específicos
• Clonagem e expressão da NP do VIA
• Testes de ELISA
• 121 soros testados
• Positivos – Acs presentes no soro reagiam com aNP recombinante
• Negativos – não ocorria reação
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ELISA indireto
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• Apresentam sequencias do material genéticodo agente infeccioso que codificam antígenos
Vacinas de DNA
Clonagem do gene em vetor de expressão (propagação)
Administração ao indivíduo (transfecção)
Células produzem a própria proteína (antígeno)
Resposta imunológica com memória
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• Indução da imunidade protetora emcamundongos contra o câncer e algumasdoenças auto imunes.
• Em humanos:
Vacinas de DNA
Pesquisas direcionadas contra a AIDS, malária, tuberculose,
dengue, hepatite, raiva, leptospirose, teníase etc.
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• Seleção do gene alvo
• Construção do vetor de expressão
• Frequência e via de administração
• Idade, saúde e espécie
Vai depender...
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• Produção em larga escala – menos custo
• Mais fácil o controle de qualidade
• Estáveis a Tº ambiente
• Podem ser liofilizadas
• Sem necessidade de refrigeração – fácil comercialização, transporte, distribuição em regiões de difícil acesso
Vantagens