Uji In Vitro Aktivitas Antimalaria Majalah Farmasi Airlangga, Vol.3 No.3, Desember 2003 99

Uji In Vitro Aktivitas Antimalaria Isolat Dari Androgrphis paniculata Terhadap Plasmodium Falciparum PadaStadium Gametosit.

Rr.Retno Widyowatia), IGP Santaa), Abdul Rahmana), Indah Tantularb), Aty Widyawaruyantia)

a)Bagian Ilmu Bahan Alam Fakultas Farm asi Universitas Airlangga; b)Bagian Parasitologi Fakultas KedokteranUniversitas Airlangga

Research of antimalarial activity toward eradication of Plasmodium falciparum in shizontocyte stage hasbeen done. This article intended to describe the activity of isolate of Andrographis paniculata herbs towarderadication of Plasmodium falciparum in gametocyte stage. Inhibition activity of 5 g/mL isolate against theparasite as the same as Primaquin in 5g/mL.

Keywords : Andrographis paniculata, Plasmodium fa lciparum, Gametocyte, Inhibition activity

PENDAHULUANSalah satu tanaman yang sering digunakan sebagai

obat tradisional di Indonesia adalah sambiloto(Andrographis paniculata) yang mempunyai banyaksekali khasiat, diantaranya untuk penyakit kurap, sakitperut, demam karena gigitan serangga/ular berbisa, tifusdan penyakit malaria (Heyne, 1987).

Beberapa penelitian pendahuluan terhadap aktivitasantimalaria dari tanaman ini telah dilakukan. Suyanto(1995) yang melaporkan bahwa isolat dari ekstrakmetanol Andropraphis paniculata mempunyai dayahambat terhadap pertumbuhan Plasmodium falciparumin vitro pada stadium shizontosida. Kemudian daripenelitian Widyawaruyanti (1999), dilaporkan bahwaekstrak non polar (kloroform dan petroleum eter) dariherba tanaman ini juga mempunyai daya hambatterhadap pertumbuhan Plasmodium falciparum in vitropada stadium shizontosida dengan membandingkanpada kontrol positifnya (kloroquin), tanpa melakukanpenghitungan IC50. Misra (1992) melaporkan ekstrakdari Andrographis paniculata dapat menghambatpertumbuhan Plasmodium berghei . Dua (1999)melaporkan bahwa Andrographis paniculatamempunyai efek sebagai antimalaria pada faseshizontosida dengan harga IC 50 4 μg/mL. MenurutRahman (1999), ekstrak kloroform dari tanaman inimempunyai efek antimalaria in vivo.

Berdasarkan hal tersebut maka dilanjutkan penelitianaktivitas antimalaria isolat dari Andrographispaniculata sebagai bahan uji yang diduga mempunyaiaktivitas antimalaria terhadap Plasmodium falciparumpada stadium gametosit in vitro karena gametosit yangberada dalam tubuh manusia merupakan faktor yangmenentukan terjadinya transmisi penyakit malaria.Gametosit yang terhisap oleh nyamuk Anopheles akanmenjadi gamet jantan dan gamet betina dalam ronggatubuh nyamuk dan memulai fase sporogoni. Selain itupenderita yang di dalam tubuhnya mengandunggametosit bersifat carrier yang dapat menularkanpenyakit malaria.

BAHAN DAN METODETanaman untuk Penelitian . Tanaman yang

digunakan untuk penelitian adalah herba Andrographispaniculata yang diperoleh dari Kediri (± 700 m dpl)pada bulan Juli tahun 2000 dalam keadaan segar,

kemudian dikeringkan terlebih dahulu baru dilakukanektraksi. Determinasi herba dilakukan d an hasilnyadisimpan di Laboratorium Botani -FarmakognosiFakultas Farmasi Universitas Airlangga.

Parasit Penelitian. Parasit yang digunakan adalahisolat Plasmodium falciparum 228 yang diperoleh dariDr. Fumihiko Kawamoto (Oita University, Jepang) dandikembangbiakan di Tropical Disease Center (TDC)Universitas Airlangga Surabaya dengan tehnikpenggantian medium setiap hari tanpa penambahaneritrosit baru sehingga terbentuk stadium gametosit dankultivasi dilakukan berdasarkan metode Trager -Jensen(1976).

Bahan Pembanding. Kontrol negatif yang digunakanpada penelitian ini adalah parasit malaria bentukgametosit yang tidak diberi bahan uji dan sebagaikontrol positif digunakan primakuin (Sigma,USA).

Bahan. Metanol teknis (Brataco, Sby, Ind.), etil asetatteknis (Brataco, Sby, Ind.), aquabidest, khloroformteknis (Brataco, Sby, Ind.), plate silika gel F 254(E.merk, Darmstadt, Germany), media RPMI 1640(Rosewell Parla Memorial Institute), Buffer phosphatsalin, gentamisin, ACD (asam sitrat, tri sodium sitrat,dekstrosa), eritrosit manusia (PMI, Sby, Ind.), pewarnagiemsa dan serum manusia (PMI, Sby, Ind.).

Alat. Dalam penelitian ini dibutuhkan beberapa alatyaitu maserator, rotary-evaporator, TLC-scanner,Laminar Air Flow, inkubator CO 2 dan otoklaf.

Preparasi Isolat dari Andrographis paniculata .Serbuk kering Andrographis paniculata 2 kg diekstraksiberulang dengan metanol 95 % pada suhu 60 0C denganmenggunakan maserator 4x@24 jam. Ekstrakdipekatkan dengan rotavapor. Ekstrak pekat ini dikocok4 kali dengan pelarut campuran etil asetat-air (200:150)ml selama 5 menit, fraksi etil asetat yang diperolehdipekatkan dengan rotavapor dan dilakukanrekristalisasi. Dari hasil fraksinasi serbuk keringAndrographis paniculata sebanyak 2 kg diperolehkristal 14,408 g dan dengan KLT diperoleh noda denganRf 0,125 (merah ungu), titik lebur 220 ± 100C (FisherJohn’s Point Apparatus). Konsentrasi yang digunakandalam bahan uji adalah 1, 3 dan 5 g/ml denganmelarutkan dalam DMSO dan etanol 95 % (1:9) ml.Untuk pengencerannya ditambahkan RPMI 1640.

Penyiapan Plasmodium falciparum untukPembiakan. Biakan Plasmodium falciparum 228 dari

Majalah Farmasi Airlangga, Vol.3 No.3, Desember 2003 Widyowati et.al.100

penyimpanan beku dihangatkan pada suhu 37 0C sambildikocok-kocok terus sampai cair, lalu dimasukkandalam tabung sentrifus steril dan disuspensik an dengan2,0 ml larutan NaCl 12 % tetes demi tetes, didiamkan 3menit kemudian ditambah 8,0 ml NaCl 1,6 % kemudiandisentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 5menit. Setelah itu ditambahkan NaCl 1,6 % sebanyak3,0 ml dan dilakukan sentrifuse 1500 rpm selama 5menit. Lalu ditambahkan dengan RPMI lengkap 3,0 mldan disentrifuse 1500 rpm selama 5 menit. Supernatanselalu dibuang. Packed cell (0,2 ml) disuspensikandengan RP-HS (RPMI dengan serum manusia)sebanyak 4,5 ml dan ditambah dengan 0,25 ml laruta nRBC 50 % hematokrit dan dimasukkan ke dalam botolkultur. Biakan dimasukkan dalam candle jar dandiinkubasi pada suhu 370C. Setiap 24 jam mediumdiganti dengan medium yang baru. Kadar hematokritawal kultur dibuat 5 %. Penggantian medium dilakukansetiap hari dan dicek kadar parasitemianya denganhapusan darah. Bila kadar parasitemia tinggi dilakukansub kultur dengan penambahan RBC kemudiandiinkubasi di candle jar selama 24 jam. Tapi bila kadarparasitemia rendah, medium hanya diganti secara biasadan dibiakan terus tanpa penambahan sel darah merahhingga terbentuk parasit pada stadium gametosit.

Uji Aktivitas Antimalaria. Pengujian isolat dariAndrographis paniculata dilakukan dalam lempengsumur mikro steril yang terdiri dari 24 sumur. Bahan ujisebanyak 20 l dimasukkan tanpa diuapkan langsungditambah suspensi parasit sebanyak 480 l dandiinkubasi pada suhu 370C selama 24, 48, 72 dan 96jam. Setelah 24 jam medium pada masing -masingsumur diambil kira-kira 250 l, kemudian ditambahkanmedium yang berisi bahan uji dengan konsentrasi yang

sama dengan awal. Selanjutnya diinkubasi dalam candlejar pada suhu 370C. Setelah 48 jam dilakukanpenggantian medium tanpa bahan uji. Pembuatanhapusan darah tipis dilakukan pada 72 dan 96 jam.Kemudian dibuat sediaan tetes darah tipis dan dihitungjumlah eritrosit yang terinfeksi gametosit pada sumuruji dan kontrol negatif. Jumlah gametosit yang matiadalah jumlah eritrosit yang terinfeksi gametosit padasumur kontrol negatif dikurangi dengan jumlah eritrosityang terinfeksi pada sumur uji. Untuk melihat jumlaheritrosit yang terinfeksi gametosit digunakan mikroskopdengan perbesaran 10x100, data yang diperolehdianalisa dengan program SPSS Window 10.0menggunakan analisa probit untuk memperoleh harga IC50.

HASIL DAN PEMBAHASANPengujian antimalaria ini dilakukan pada sumur mikro

dan dibuat hapusan darah tipis kemudian dihitungjumlah eritrosit yang terinfeksi parasit fase aseksual danseksual, maka diperoleh hasil seperti pada tabel 1 dan 2.

Besarnya aktivitas dari t iap konsentrasi diketahuidengan menghitung prosen penghambatan yangdiberikan oleh bahan uji terhadap pertumbuhanPlasmodium falciparum pada stadium gametosit yaitudengan menghitung jumlah eritrosit yang terinfeksigametosit pada fase I-V (Tabel 3 dan 4). Pada hari ke-3isolat dengan konsentrasi yang tertinggi mempunyairata-rata daya hambat lebih kecil dari primakuin.Sedangkan hari ke-4 tidak ada perbedaan rata-rata %penghambatan antara primakuin dan isolat padakonsentrasi tertinggi (α=0.05). Maka isolat dariAndrographis paniculata mempunyai daya hambat danaktivitas yang sama dengan primakuin.

Tabel 1. Hasil Penghitungan Eritrosit yang Terinfeksi Parasit Fase Aseksual dan Seksual terhadap Plasmodiumfalciparum pada 72 jam tiap 5000 eritrosit.

Bahan uji Konsentrasi(g/ml)

. Eritrosit yangterinfeksi parasit

fase aseksual

. Eritrosit yangterinfeksi parasit fase

seksual. Gametfase I-III

. Gamet faseIV-V

Total

Kontrol Negatif - 19 40 1 4114 42 1 43

Isolat A. panicu lata 1 26 39 - 39- 20 35 2 37

3 18 28 3 3118 27 1 28

5 17 22 - 228 18 2 20

Primakuin 1 31 28 2 3021 28 2 30

3 11 24 - 2421 27 1 28

5 13 16 2 1822 18 1 19

Uji In Vitro Aktivitas Antimalaria Majalah Farmasi Airlangga, Vol.3 No.3, Desember 2003 101

Tabel 2. Hasil Penghitungan Eritrosit yang Terinfeksi Parasit Fase Aseksual dan Seksual terhadap Plasmodiumfalciparum pada 96 jam tiap 5000 eritrosit.Bahan uji Konsentrasi

(g/ml). Eritrosit yangterinfeksi parasit

fase aseksual

. Eritrosit yangterinfeksi parasit fase

seksual. Gametfase I-III

. Gamet faseIV-V

Total

Kontrol Negatif - 21 27 3 3021 28 4 32

Isolat A. paniculata 1 23 22 1 2319 20 1 21

3 22 18 1 199 19 2 21

5 8 13 1 145 10 2 12

Primakuin 1 9 19 2 2111 18 1 19

3 6 16 - 164 18 2 20

5 6 11 3 145 12 - 12

Tabel 3. Hasil Penghitungan % Penghambatan Pertumbuhan Plasmodium falciparum pada 72 jam tiap 5000 eritrositBahan uji Konsentrasi

(g/ml)Total eritrosit

yang terinfeksi gametosit% Penghambatan Rata-rata %

Penghambatan(Var.)

Kontrol Negatif - 41 0 043 0

Isolat A. paniculata 1 39 7,14 9.52 (2,38)37 11,91

3 31 26,19 29,76 (3,57)28 33,33

5 22 47,62 50,0 (2,38)20 52,38

Primakuin 1 30 28,57 28,5730 28,57

3 24 42,86 38,09 (4,76)28 33,33

5 18 57,14 55,95 (1,19)19 54,76

Tabel 4. Hasil Penghitungan % Penghambatan Pertumbuhan Plasmodium falciparum pada 96 jam tiap 5000 eritrositBahan uji Konsentrasi

(g/ml)Total eritrosit

yang terinfeksigametosit

% Penghambatan Rata-rata %Penghambatan

(Var.)Kontrol Negatif - 30 0 0

32 0Isolat A. paniculata 1 23 25,81 29,03 (3,23)

- 21 32,263 19 38,71 35,48 (3,23)

21 32,265 14 54,84 58,07 (3,23)

12 61,29Primakuin 1 21 32,26 35,48 (3,23)

19 38,713 16 48,39 41,94 (6,45)

20 35,485 14 54,84 58,07 (3,23)

12 61,29

Majalah Farmasi Airlangga, Vol.3 No.3, Desember 2003 Widyowati et.al.102

Untuk mengetahui hubungan antara peningkatankonsentrasi dengan besarnya aktivitas dibuat grafikantara konsentrasi dengan % penghambatan kemudiandianalisa menggunakan probit dari program SPSSwindow 10.0 sehingga akan dik etahui harga IC50

(Gambar 1 dan 2).

Gambar 1. Grafik Analisis Probit dari Daya HambatIsolat dari Andrographis paniculata terhadap P.falciparum Stadium Gametosit pada 72 jam

Gambar 2. Grafik Analisis Probit dari Daya HambatIsolat dari Andrographis paniculata terhadap P.falciparum Stadium Gametosit pada 96 jam

Pada hari ke-3 didapatkan IC50 isolat dariAndrographis paniculata 4,92 g/ml tidak berbedasecara bermakna dengan IC 50 primakuin yaitu 4,54g/ml. Pada hari ke-4 IC50 isolat dari Andrographis

paniculata 4,28 g/ml tidak berbeda secara bermaknadengan IC50 primakuin yaitu 4,05 g/ml (α = 0.05).

Kesimpulan. Berdasarkan hasil penelitian tersebutdapat disimpulkan isolat dari Andrographis paniculatamampu menghambat pertumbuhan Plasmodiumfalciparum pada stadium gametosit in vitro.

Ucapan Teimakasih. Ucapan terima kasihdisampaikan kepada drh. Suhintam Pusarawati, MKes,Dra. Wiwied Ekasari, MSi, Apt, Drs. Herra Studiawan,MS, Direktur beserta staf TDC Unair, Kepala lab dankaryawan fitokimia dan Laboratorium Dasar Bersamayang telah banyak membantu dalam penyelesaianpenelitian ini, serta Fakultas Farmasi yang telahmendanai penelitian ini melalui Project Grand QUE 2000.

DAFTAR PUSTAKADepartemen Kesehatan (1979), Materia Medika

Indonesia III, Jakarta, hal.20Departemen Kesehatan (1983), Pemanfaatan Tanaman

Obat-obatan, Jakarta, hal.95-119Dua (1999), Screening of Natural/Synthetic Compounds

for Antimalarial Activity , p.77-81Heyne K, 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia, Jilid 3,

Terjemahan Badan Litbang Kehutanan, Jakarta, hal926-927

Misra P, Pal N, Guru P, Katiyar V, Srivastava, Tando n,(1992), Antimalarial activity of Andrographispaniculata against Plasmodium berghei in Mastomysnatalensis, International Journal of Pharmacognocy30 (4), p. 263-274

Mubin A, Pain S, (1992), Malaria Tropika denganBeberapa Komplikasi, Cermin Dunia Kedokteran no.74, Jakarta, hl. 48-51

Rahman A, Futura T, Kajima S (1999), AntimalariaActivity of Malaysian Medicinal Plants, Journal ofEthnopharmacology 64, p. 249-254

Suyanto (1995), Uji Aktivitas Antimalaria Secara InVitro Isolat Andrographis paniculata Nees, Skripsi,Fakultas Farmasi Universitas Airlangga

Trager W, Jensen S B (1976), Human Malaria Parasitesin Continuous Culture, Science, p. 673-675

Widyawaruyanti A (1999), Aktivitas ImunomodulatorSenyawa-senyawa Diterpenoid dari Andrographispaniculata Nees Terhadap Fungsi SitotoksisitasLimfosit T-Sitotoksik (CD 8+) Mencit, Tesis,Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga,Surabaya