antocianina flo

8/4/2019 antocianina flo

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ANLISIS Y CARACTERIZACIN DE ANTOCIANINAS EN DIFERENTESVARIEDADES DE MAZ (Zea mays) BOLIVIANO

Cuevas Montilla E.1, Antezana A.2 y Winterhalter P.1

1Institut fr Lebensmittelchemie, Technische Universitt Braunschweig, Schleinitzstrasse 20,

38106 Braunschweig, Alemania2Universidad Mayor San Simn Cochabamba, Sucre a Parque la Torre, Cochabamba, Bolivia

Palabras clave: Antocianinas, Maz morado,Zea mays, cromatografa en contracorriente, HSCCC

INTRODUCCIONEstudios epidemiolgicos efectuados en varios pases evidencian que el consumo de

frutos y vegetales reducen enfermedades coronarias adems de minimizar los riesgos de

cncer Se ha descrito que algunos compuestos fenlicos de origen vegetal presentan dentro

de la clula actividad antioxidante, reduciendo la concentracin de radicales libres, y en

algunos casos logran establecer grupos de quelacin con iones metlicosLos mecanismos

involucrados de los agentes antioxidantes establecen donacin de electrones o tomos dehidrgeno a los radicales libres. Los agentes antioxidantes presentes en alimentos pueden

reducir trombosis, activar macrfagos e inhibir la tendencia a la peroxidacin[1] Entre los

compuestos que han merecido dichos estudios se encuentran las antocianinas, debido a la

presencia de sustituyentes -OH, los cuales son molculas con alto poder antioxidante [2]

La presencia de antocianinas en las variedades pigmentadas del maz, lo hace un

producto potencial para el suministro de colorantes y antioxidantes naturales. Por ello el

estudio de los pigmentos del maz morado ( Zea Mais) ha despertado un inters sin precedentes. La diversidad gentica del maz se distribuye en razas. En Amrica se han

originado el 90% de todas las razas. Segn Goodman y Brown (1988), en Amrica hay 260

razas de las que 132, aproximadamente la mitad, se encuentran en la regin andina. Dosfactores son la causa de esa gran diversidad: la variacin en usos y la gran variacin

ecolgica. La diversidad fenotpica del maz en la regin andina se expresa en una

extraordinaria variabilidad en color, tamao, forma, textura del grano y de la mazorca.[3]

El maz es un elemento cultural de la misma importancia que el lenguaje, el vestido, la

msica, la culinaria, las costumbres y otras manifestaciones culturales. La vigencia de las

razas de maz es universal. Las razas se mantienen en el tiempo. Hay muchas evidencias de

que las razas de maz son ms perennes que otras manifestaciones culturales. Se mantienen

porque constituyen un fuerte elemento cultural. Si desaparecen las culturas desaparecen

tambin las razas de maz.

En Bolivia el maz es uno de los cultivos ms importantes constituyendo uno de losalimentos bsicos de la poblacin. Uno de los objetivos es lograr que en EEUU y en la UE

tambin se produzcan alimentos a base de maz pigmentado. La idea es "generalizar" el

consumo, minoritario en la mayora de pases, excepto zonas de Mxico Actualmente el

desarrollo de la tecnologa en este pas centroamericano ha permitido explotar el maz como

una materia prima de gran importancia para la industria, tanto en lo bsico como en la

complementaria.

OBJETIVOSBolivia es uno de los centros de diversificacin del gnero Zea y la produccin y

consumo del maz morado es importante, pero se ha estudiado poco las antocianinas en

variedades bolivianas. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue determinar la composicin yperfil de antocianinas en variedades de maz morado cultivadas en Bolivia.


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memorias * red-alfa lagrotech * comunidad europea * cartagena 2008

El objetivo principal es como mencionamos anteriormente buscar las vas de explotar el

maz como una materia prima para la industria a largo plazo. Debido a ello se abre una granposibilidad de emplear maces pigmentados para la extraccin industrial de sus pigmentos,

debido a que por los volmenes de produccin y por la naturaleza de los mismos, es factible

desarrollar una industria competitiva, orientada a satisfacer una de las grandes necesidades, de

alimentacin, cosmticos y salud, al producir pigmentos del tipo de las antocianinas con una

alta capacidad biolgica. Por lo que es necesario realizar estudios como el presente, para poder lograr la extraccin, purificacin, estabilizacin y conocimiento qumico de estos

componentes de naturaleza pigmentada en el maz

ANTECEDENTES BIBLIOGRFICOSSISTEMA ANTIOXIDANTE

Como respuesta a la permanente produccin de Especies Reactivas de Oxgeno (EROs)

que daan estructuras biolgicas, el organismo atena estos efectos deletreos por medio de la

accin de sistemas antioxidantes. Los antioxidantes son sustancias que se encuentran en pequeas concentraciones en comparacin a un sustrato oxidable, que retrasa o inhibe

significativamente la oxidacin del sustrato, y tambin estabiliza las EROS mediante la cesin

de un H

+

y las convierte en compuestos no radicalarios. Otras definiciones hablan deantioxidante como cualquier sustancia que, al estar presente en bajas concentraciones

comparada a las de un sustrato oxidable, previene o retarda la oxidacin de dicho sustrato y

que protege a los sistemas biolgicos frente a efectos potencialmente perjudiciales tanto de

procesos como reacciones que causan excesivas oxidaciones [4].

Existen diferentes sistemas de defensa antioxidante en el organismo. Uno de ellos estconformado por sistemas enzimticos como la superxido dismutasa, catalasa y glutatin

peroxidasa, siendo stas la primera defensa contra los radicales libres que actan

neutralizando a estas especies altamente reactivas en molculas menos dainas para la clula.

Otros sistemas, no enzimticos, estn conformados por compuestos como caroteniodes,glutatin reducido y las vitaminas C y E que estabilizan las EROs o tambin que provocan la

quelacin de iones metlicos de elementos de transicin como hierro y cobre, que al estar en

estado reducido potencian su autoxidacin y generacin de anin superxido[5].

Los antioxidantes aportados por la dieta disminuyen los efectos de las EROs. Son

variados los alimentos que estn constituidos por estas sustancias y cada vez ms utilizadospor las personas tanto por medio del consumo directo de vegetales y frutas que los incluyen,

como tambin por medio del uso de frmacos. Entre los antioxidantes ingeridos por la dieta se

destacan las vitaminas E y C, los betacarotenos, procianidinas y polifenoles.

POLIFENOLESCompuestos orgnicos que estructuralmente presentan un grupo -OH unido a un anillo

aromtico, se conocen como compuestos fenlicos y aquellos en que se repite este radical sonconocidos como polifenoles. Los compuestos de esta familia presentan variados efectos

beneficiosos para la salud: prevencin contra cncer, propiedades antiinflamatorias,antialrgicas, antitumorales, antimicrobianas, vasorelajantes y antioxidantes. Entre sus

acciones antioxidantes encontramos la inhibicin de la formacin de EROs por medio de lainhibicin de enzimas productoras de EROs como la xantino oxidasa, o la quelacin de los

elementos traza involucrados en la produccin de los mismos; el atrapamiento directo de

EROs y el up-regulation de los sistemas antioxidantes endgenos [6].

Los polifenoles estabilizan las EROs al capturarlas formando el radical aroxilo (FI-O),

para luego reaccionar con un segundo radical, con lo cual adquieren una estructura quinona

estable [6].


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Los polifenoles ms estudiados actualmente son los provenientes del extracto secoestandarizado de Vitis vinifera que contienen antocianinas, procianidinas y proantocianidinas,

entre otros, los cuales son sustancias bioactivas. Estos actan atrapando los radicales librespara luego tranformarlo en especies no radicalarias, por inhibicin de la accin enzimtica de

elastasa e hialuronidasa. Estudios clnicos demuestran que el uso teraputico de los

polifenoles provenientes de la Vitis vinifera, reducen la incidencia de enfermedades

cardiovasculares; disminuye el riesgo de insuficiencia cardiaca; alivio de sntomas enpacientes con insuficiencia venosa.

Dentro de este grupo encontramos a las antocianinas, que se diferencian de otrospolifenoles por poseer azcares dentro de sus grupos funcionales y, en su mayora, presentar

varios grupos OH. Las diferencias individuales entre los antocianinas dependen del nmero

de grupos hidroxilo, la naturaleza y nmero de azcares que estn unidos a la molcula, a laposicin de esa unin y la naturaleza y nmero de cidos aromticos unidos al azcar en lamolcula [2].

ANTOCIANINASLas antocianinas (del griego anthos flor y kyanos azul), son el grupo ms importante de

pigmentos solubles al agua visibles para el ojo humano[7]. Las antocianinas forman parte dela familia de los polifenoles y se definen como flavonoides fenlicos. Los colores rosa, rojo,

azul, malva y violeta de las flores, frutas y verduras se deben a la presencia de estos

pigmentos[8].

Las antocianinas se localizan principalmente en la piel de frutas como manzanas, peras,uvas, zarzamoras, ciruelas, de flores como la jamaica, rosas y verduras como col morada y

maz morado. La funcin que cumplen es la de atraer seres vivos (principalmente insectos ypjaros) para propsitos de polinizacin y dispersin de semillas. La diferencia de color entre

las frutas, flores y verduras depende de la naturaleza y concentracin de antocianinas. Existen

factores adicionales que afectan el color como el pH de la clula, el efecto de copigmentacin

determinado por la presencia de otros flavonoides, temperatura, luz, etc.[9]Las antocianinas, al igual que otras sustancias polifenlicas, se encuentran en la

naturaleza en forma de glicsidos, siendo conocidas sus agliconas como antocianidinas, a lascuales se les une un azcar por medio de un enlace -glicosdico. Se trata de flavonoides, es

decir, sustancias derivadas del ncleo flavano, con un anillo-A benzoil y un anillo-B

hidroxicinamoil.

La estructura de la antocianina es el 2- fenilbenzopirilio de la sal de flavilio. Cuando el

residuo de azcar es un hidrolizado de la antocianina, el resultado es la aglicona, conocida

como se menciona anteriormente como antocianidina. Las ms comunes formas deantocianidinas son: pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina, malvidina y petunidina

En la Figura 1 se muestran los diferentes tipos de antocianinas.

Las clases comunes de glucsidos son: 3-monsido, 3-bisido y 3-trisido, as comotambin 3,5-diglicsido y ms raramente el 3,7-diglicsido con glucosa, galactosa, arabinosa

(es uno de los ms frecuentes) y xilosa. Las antocianinas poseen uniones de azcar en el

anillo-B 3 y 5-hidroxilos. Los dos tipos ms importantes de glucsidos son: el 3-monsidosy el 3-4-diglicsido. Como regla el 3-hidroxil siempre tiene un azcar, exceptuando 3-

desoxipelargonidina, 3-desoxicianidina y 3-desoxidelfina [10].

Adems de la glucosilacin, la introduccin de molculas aciladas es un efecto queocurre ampliamente. Los grupos comunes de acilo son los cidos aromticos de los cuales los

ms comnmente encontrados son cidos hidroxicinmicos: p-coumrico, cafeico y ferlico,

y ms raramente el hidroxibenzoico. El color particular de cada antocianina depende del


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nmero y orientacin de los grupos hidroxilos y metoxilos. Un incremento en la hidroxilacinproduce un color azul, mientras un incremento en la metoxilacin produce un color rojo.

Todas las antocianinas son derivadas del catin flavilo bsico. Se conocen ms de 100,las diferencias entre ellas se debe al nmero de grupos hidrxilos, el grado de metoxilacin de

stos grupos, as como la naturaleza y el nmero de los cidos aromticos y alifticos

presentes en la molcula. De todas las antocianinas existentes, slo seis son de inters enlos

alimentos: pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina, petunidina y malvidina (Figura 1).Los restantes son menos frecuentes y se encuentran en algunas hojas [9].

Es comn que una misma antocianidina interaccione con ms de una clase decarbohidrato para formar diferentes antocianinas; la pelargodina es la que produce el color

rojo escarlata de algunas flores y de las fresas; la delfinidina se encuentra en las berenjenas y

la cianidina en col roja, higos, cerezas, ciruelas, y otros frutos.

BIOSINTESIS DE LAS ANTOCIANINASLas antocianinas se sintetizan a partir de la condensacin de dos molculas precursoras

(Figura 2): malonil Co A y p-cumaril-CoA, las que ms tarde formarn anillos A y Brespectivamente.

Las antocianinas son sintetizadas por varias rutas. Sobresalen dos, la del cidoshikmico y la del cido malnico. En la ruta del cido shikmico se convierten carbohidratos

simples derivados de la gliclisis, de la ruta de las pentosas fosfato y ciclo de Calvin en

diversos cidos orgnicos como el cinmico, p-coumrico, cafeico, ferlico, clorognico y

fenilalanina

Cabe resaltar que esta ruta sinttica tambin es compartida por otros compuestosfenlicos. La principal reaccin de biosntesis de los flavonoides es la condensacin de losacilos provenientes de cumaril-CoA y tres molculas de malonil-CoA catalizada por la

enzima chalcona isomerasa que lleva a cabo la isomerizacin de chalcona a flavona, misma

que es convertida en flavones o antocianinas. Los pasos finales en la sntesis de antocianinas

son las acilaciones y las glicosilaciones, primero en el C-3, para estabilizar el catin flavilio[9].

Aglicona R1 R2

Petunidina OH OCH3

Malvidina OCH3 OCH3Pelargonidina H H

Delfinidina OH OH

Cianidina OH H

Peonidina OCH3 HFigura 1. Estructura y sustituyentes de las

antocianinas (Rodrguez- Saona y

Wrolstad, 2001)[11]


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OH

OH

OH

HOOC

NH2

COOH

COOH

COOH

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

OHCOOH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O

OOH

OH

OH

O

OOH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

OOH

OH O

OH

OOH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

OOH

OH

OH

O

OH

Phosphoenolpyruvat + Erythrose-Phosphat

Shikimisure

Phenylalanin

Zimtsure

p-Cumarsure

p-Cumarsure-CoA

MalonylCoAAcetyl-CoA

Gallussure

KaffeesureFerularsure

Chalcon

Flavanon

Flavanonol

Flavan-3-ol

Isoflavon

Flavon

AnthocyanidinFlavonol

+

FACTORES QUE ALTERAN LA ESTABILIDAD DE LA ANTOCIANINALa estabilidad de las antocianinas depende de factores como enzimas, pH, temperatura,

oxgeno, luz, metales, etc. Investigaciones recientes demostraron que existen antocianinas con

ciertas caractersticas, presentando una mayor estabilidad debido al desarrollo de ciertos

mecanismos:

1. asociacin intramolecular: acilacin2. asociacin intermolecular: copigmentacin

3. interacciones con otros compuestos

4. polimerizacin [8].

EFECTO DEL PHEste es uno de los factores ms importantes. Las antocianinas son ms estables en un

medio cido que en un medio neutro o alcalino. En medio cido la forma predominante es la

del in flavilio, el cual da el color rojo, cuando esta es sometida a pH bsico o alcalino, el in

flavilio es susceptible al ataque nucleoflico por parte del agua, producindose la pseudobase

carbinol, esto es a pH 4.5 y seguido se forma la chalcona, las dos formas son incoloras.[13]

Figura 2. Biosntesis de Polifenoles (MACHEIX, FLEURIET und BILLOT, 1990)[12]


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Conociendo esto, las antocianinas tienen su mxima expresin de color a pH cidos

(pH1), y su forma incolora se produce a pH neutros o alcalinos, debido a esta caracterstica se

utilizan a las antocianinas a pH cido o ligeramente neutro en la industria alimenticia. En la

Figura 3 se muestra el comportamiento de la antocianina a diferentes pHs.

OH

OH

OR

R1

OH

R2

O+

OH

OH

OR

R1

OH

R2

OOH

OH

OH

OR

R1

OH

R2

OOHOH

OH

OR

R1

OH

R2

O+

3

4'3'

5'

5

7

3

4'3'

5'

5

7

-OH

3

4'3'

5'

5

7

3

4'3'

5'

5

7

-OHH+

-OH

H+

H+

-OHH+

TEMPERATURALa antocianina es destruida por el calor durante el procesamiento y almacenamiento. Un

incremento logartmico en la destruccin de la antocianina ocurre con un incremento en latemperatura. Timberlake (1986) observ que el equilibrio entre las estructuras es endotrmico,

en una direccin de izquierda a derecha:

Base quinoidalCation flavilio Pseudobase carbinolChalcona.

A altas temperaturas el equilibrio cambia hacia chalconas. El retorno de chalconas a

flavilio es lento.[14]

COPIGMENTACINLa copigmentacin es la interaccin electrnica planar en los grupos cromforo de las

antocianinas. Los cambios producidos por el copigmento en la regin visible del espectro del

pigmento es correlacionada con la transformacin de la antocianina en agua, estas formas seproducen por el ataque nucleoflico del agua.

El in flavilio es casi planar y muestra una deslocalizacin electrnica, que se extiende

por todo el grupo cromforo, mientras que la forma hemiacetal tiene dos anillos aromticos

sin conjugar y un anillo central en cual no es planar, por que tiene un carbono tetrahdrico,por lo tanto el in flavilio es la nica especie capaz de copigmentar, por su forma planar. La

copigmentacin provoca un efecto hipercrmico. Debido a la baja estabilidad de la

copigmentacin, se requiere de grandes concentraciones de copigmentos[15].

La debilidad de la copigmentacin es esencialmente de origen entrpico. De hecho,

experimentos de variacin de la temperatura en sistemas diferentes pigmento-copigmento, se

encontr un cambio de entropa negativa por el equilibrio de la copigmentacin. El pigmentoy copigmento en su estado inicial son especies independientes, durante su asociacin es

Pseudobase carbinol, incoloraCatin flavilio, rojo

Chalcona, amarillaBase quinoidal, azul

Figura 3. Estructura de las antocianinas en funcin al pH


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sostenida fuertemente el complejo formado con una reduccin simultnea de los grados delibertad, todo este proceso tiende a una oposicin de copigmentacin. La copigmentacin es

usual en la naturaleza y contribuye a la profusin de colores en las flores y algunos tejidos.

Abe et al (1977) propusieron el trmino "copigmentacin intermolecular" para la asociacin

dbil de antocianinas con compuestos, modificando as el color y la estabilidad del complejoformado; y "copigmentacin intramolecular para el enlace fuerte que forman grupos de cidos

orgnicos con las antocianinas [16].La copigmentacin intermolecular de antocianinas con otros flavonoides produce un

incremento en la absorbancia a una longitud de onda visible (efecto hipercrmico), as como

un desplazamiento a longitudes de onda mayores del mximo de absorbancia (efecto

batocrmico); la copigmentacin intramolecular es la responsable por la estabilidad del colorde antocianinas que poseen dos o ms grupos acilos aromticos. El color se intensifica al

incrementar el contenido de cidos orgnicos como el cinmico y malnico[8]

EFECTOS POSITIVOS DE LAS ANTOCIANINAS SOBRE LA SALUDLas antocianinas poseen conocidas propiedades farmacolgicas utilizadas para la terapia

de un amplio espectro de enfermedades. Las investigaciones realizadas con extractos de Vitis

vinifera ricos en antocianinas, han mostrado que disminuyen la fragilidad y permeabilidadcapilar; tambin efectos antiinflamatorios y actividad antiedema. Adems tienen la propiedad

de proteger los vasos sanguneos del dao ocasionado por los altos niveles de azcar en la

diabetes.[17]

Las antocianinas protegen de muchas maneras. Primero, neutralizan las enzimas quedestruyen el tejido conectivo. Segundo, su capacidad antioxidativa previene los oxidantes del

tejido conectivo daado. Finalmente, reparan protenas daadas en las paredes de los vasos

sanguneos.

Experimentos en animales han demostrado que la suplementacin con antocianinas

previenen efectivamente la inflamacin y el subsecuente dao a vasos sanguneos. Esta

habilidad antiinflamatoria de las antocianinas tambin ayuda contra las reacciones alrgicas.Por otro lado se ha observado que su potencial antioxidante va en contra de radicales

superxidos y perxidos de hidrgeno a travs de numerosos mecanismos, por ejemplo: la

cianidina: Protege la membrana celular de lpidos de la oxidacin por una variedad de

sustancias peligrosas. La cianidina es un antioxidante 4 veces ms fuerte que la vitamina E.La pelargonidina protege el radical amino de la tirosina del peroxinitrilo, un antioxidante

altamente reactivo. Por otro lado, la delfinidina interfiere con el radical hidroxil, uno de los

oxidantes del cuerpo humano[18].

La capacidad antioxidante se relaciona con el nmero de grupos OH que presenten y el

lugar de la sustitucin.Cuando se ingieren, las antocianinas son destruidas en parte por la flora

intestinal y las que son absorbidas se eliminan por la orina y la bilis, con previastransformaciones

Gracias a esta capacidad antioxidante, las antocianinas son catalogadas como agentes

nutracuticos. Varios trabajos reportan sus efectos benficos al prevenir la proliferacin de

clulas cancergenas, proteccin contra enfermedades del corazn y prevencin del dao a

lpidos de alimentos.

Debido al inters de la sustitucin de los colorantes sintticos por su posible toxicidad,

se han buscado nuevas fuentes de colores naturales, como las antocianinas presentes en losmaces pigmentados


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MAZ MORADO (Zea Mays) COMO FUENTE DE ANTOCIANINAS

Zea mays es una gramnea anual originaria de las Amricas introducida en Europa en el

siglo XVI. Actualmente, es el cereal con mayor volumen de produccin en el mundo,

superando al trigo y el arroz. En la mayora de los pases de Amrica, el maz constituye la

base histrica de la alimentacin regional y uno de los aspectos centrales de la culturamesoamericana. El uso principal del maz es alimentario. Puede cocinarse entero, desgranado

(como ingrediente de ensaladas, sopas y otras comidas). La harina de maz (polenta) puedecocinarse sola o emplearse como ingrediente de otras recetas. El aceite de maz es uno de los

ms econmicos y es muy usado para freir alimentos[19]

El maz morado es una variedad de maz que posee la coronta y los granos de color

morado y es originario del altiplano andino (Bolivia y Per). Contiene diferentes tipos deAntocianinas, siendo la cianidina-3- -glucsido, su pigmento mayoritario el cual es un

importante antioxidante. Figura 4 nos muestra la gran variedad de coloraciones del maz

morado

Figura 4. Maiz morado

Tambin el extracto de maz morado puede ser usado en productos cidos (p. ej.

bevidas, jugos) donde se desee un color rojo. A un colorante extrado a partir del de maz

morado se le clasifica con el nmero E-163 (EEC). Adems del pigmento principal cianidina-3-glucsido, se han encontrado en variedades de maz morado: pelargonidina - 3- glucsido,

peonidina-3-glucsido, cianidina-3-maloilglucsido, pelargonidina-3-malonilglucsido, y

peonidina-3 - malonilglucsido) en extractos comerciales de maz morado [20] y granos del

mismo [21]. Adems, cianidina - 3-dimalonilglucsido como compuesto minoritario enalgunas variedades.

Las Antocianinas del maz morado son ms estables que la Enocianina de la uva, a laluz, al calor y principalmente a los cambios de pH. Las Antocianinas del maz Morado a un

pH entre 3 y 3.5 permanecen de un color rojo amarillento, mientras que la Enocianina se torna

azulada en esa condicin.

LA CROMATOGRAFA CONTRACORRIENTE (CCC)La cromatografa a contracorriente (CCC) es un tipo de cromatografa lquido-lquido,

donde tanto la fase estacionaria como a fase mbil son lquidas.La cromatografacontracorriente es la tcnica cromatogrfica de separar solutos por sus diferentes coeficientes

de distribucin en dos solventes inmiscibles.

Desde su nacimiento hace casi 60 aos la tecnologa se ha desarrollado cada vez ms.Mediante la eliminacin de soportes slidos, se evita la adsorcin permanente de la sustancia


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analizada en la columna, y se puede recuperar casi el 100 %. El instrumento tambin es de

fcil conmutacin entre los distintos modos de funcionamiento con slo cambiar losdisolventes. Con la cromatografa lquido-lquido, los investigadores no estn limitados por la

composicin de las columnas disponibles en el comercio para su aparato. Casi cualquier par

de soluciones inmiscibles pueden ser utilizados en cromatografa lquido-lquido, y la mayora

de los aparatos se pueden manejar en el modo estndar o en fase inversa. Los costes del

disolvente tambin son generalmente ms baratos que para HPLC, y el costo de losadsorbentes slidos se elimina por completo. Otra de las ventajas es que los experimentos

realizados en el laboratorio puede ser llevadas fcilmente a escala industrial.

La CCC se puede concebir como un proceso en tres etapas: la mezcla, la estabilizacin, y laseparacin (aunque a menudo se produce de forma continua). La mezcla de las fases es

necesaria para que la superficie de la interfase entre ellos tenga un gran tamao, y se pueda

mover el analito entre las fases de acuerdo a su coeficiente. Un coeficiente de particin es la

relacin de la cantidad de analito encontrada en cada uno de los disolventes en equilibrio, yest relacionado con la afinidad del analito por uno de los disolventes sobre los otros. La fase

mvil se mezcla con la fase estacionaria a lo largo de toda la columna. El grado de retencinde la fase estacionaria (inversamente proporcional a la cantidad de fase estacionaria perdida o

"sangrada" en el curso de una separacin) es un parmetro crucial. Los instrumentos de mayorcalidad tienen una gran retencin de la fase estacionaria. El tiempo de estabilizacin es una

propiedad del sistema de disolvente y la matriz de la muestra, teniendo ambas una graninfluencia en la retencin de la fase estacionaria.

A partir de los 80, el Dr YoichiroIto con su desarrollo de la

centrfuga planetaria inici la era de

la High Speed Countercurrent

Chromatography (HSCCC) a la que pertenecen la mayor parte de

equipos que se fabrican hoyda.[22]

Ventajas de La Cromatografa Contracorriente de Alta Velocidad (HSCCC)

Gran capacidad de carga, hasta el 10% del volumen de la columna, rango amplio:desde miligramos hasta decenas de gramos en el mismo equipo

Adsorcin no irreversible, se recupera el 100% del analito. Tanto la fase estacionariacomo la fase mvil son lquidos, por lo que la muestra puede recuperarse sin ningn

tipo de prdida. (No hay problemas de adsorcin o cambios catalticos)

Se usa menos solvente (10-25%) que en los procesos equivalentes de HPLC

Puede trabajar con extractos brutos que contienen partculas

Reproducible: el perfil de la elucin est slo en funcin de la relacin entre la tasa de

distribucin y el volumen de la fase estacionaria

Puede ser usada como un proceso cromatogrfico o de extraccin

Puede ser usada en Fase Inversa o Fase Normal, o intercambiarlas durante el proceso

Ideal para la automatizacin

Inyector

Coil

Bomba

Detector Disolucin

Fraccionador

Figura 5. Esquema de un equipo de HSCCC

segn SUTHERLAND (1987)[23]


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MATERIALES Y MTODOSMaces utilizados en el estudio

Se utilizaron seis muestras de grano pigmentado colectadas en cuatro diferentesdepartamentos de Bolivia. La informacin sobre sitios y clave de colecta, color de grano, y laubicacin del pigmento en el mismo, se presenta en la tabla 1.

Tabla 1. Descriptores de los maices analizados

Denominacin Proveniencia(Departamento)

Clave Color/Ubicacin

Ayzuma (1) Chuquisaca BO2M - 903 Prpura/aleuronaTuimuru (2) Cochabamba BO2M -1876 Prpura/aleurona

Huaca Songo (3) Cochabamba BO2M -1540 Rojo/pericarpioChecchi (4) Cochabamba BO2M -1844 Prpura, moteado/aleuronaOke (5) Potos BO2M-1433 Prpura/aleuronaKulli (6) Cochabamba BO2M-1866 Negro/pericarpio, tusa =

morada

MTODO DE AISLAMIENTO DE ANTOCIANINAS A PARTIR DE MAZ MORADOEXTRACCIN Y PURIFICACIN

Las muestras analizadas en este trabajo, corresponden a los concentrados obtenidosapartir de las diferentes variedades de maz arriba mencionados. Estas muestras fueronfacilitadas por el Dr. Gonzalo vila desde el Centro de Investigaciones Ficoecogenticas dePairumani, Fundacin Simn I. Patio, Cochabamba, Bolivia La Figura 6 nos muestra unesquema del proceso de extraccin, caracterizacin y purificacin de las antocianinas del mazmorado

Figura 6. Esquema de extraccin y procedimiento de purificacin de las antocianinas

Maz molido

Extracto crudo

Mezcla de

substancias

1) Extraccin con MeOH:cido actico19:1

2) Rotaevaporacin, liofilizacin

Extracto XAD-7

Fraccionamiento con HSCCC

Fracciones

Control de pureza con HPLC

1) Adsorcin en amberlita XAD-72) Lavado con agua3) Elucin con MeOH/c. actico

19:14) Rotaevaporac in5) Liofilizacin

Substancia pura

Purificacin por medio de HPLCpreparativa

LC-MS/MS HPLC-DAD

LC-MS/MS


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Aproximadamente 100 g de grano entero de cada variedad fueron molidos con un

procesador de alimentos domstico, desengrasados 2 a 3 veces con n-hexano con agitacin

por aprox. 5 horas, posteriormente secado a temperatura ambiente por 12 horas y finalmenteextrados con una mezcla de metanol:cido actico: (19:1 v/v), a temperatura ambiente y con

agitacin, durante 24 h cada una. El extracto as obtenido fue rotaevaporado, congelado a -24C y liofilizado en un tiempo aproximado de 48 horas.

Una vez redisuelto en agua, se aplic a una columna de Amberlita XAD-7 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), utilizando como disolvente de lavado agua, y como eluyente

metanol:cido actico: (19:1 v/v) y finalmente rota evaporado y liofilizado nuevamente.

Separacin del extracto XAD 7 por medio de cromatografa a contracorriente de altavelocidad (HSCCC)

El extracto XAD 7 obtenido fue fraccionado con al ayuda de un equipo de HSCCC. La

pureza e identidad de las fracciones as obtenidas fueron controladas por HPLC-DAD y

Cromatografa de lquidos acoplada a espectrometra de masas (LC-MS) sucesivamente. Las

muestras antes de inyectarse se filtraron a travs de un acrodisco de 0.45 m (Millipore,Bedford, MA), inyectando un volumen de 20mL. Se us como sitema de solventes: ter

terbutilmetlico/n-butanol/acetonitrilo/agua 2:2:1:5, acidificado con 0,1% de cido

trifluoroactico. La velocidad de flujo fue 4,0 mL min1

. La deteccin de las antocianinas se

realiz a 520 nm y el modo de elucin utilizado fue "Head to tail" (fase liviana = menos densacomo fase estacionaria)

RESULTADOS Y DISCUSIN

IDENTIFICACIN DE LAS ANTOCIANINASSe identificaron dos antocianinas mayoritarias en todas las variedades de maz morado

estudiadas, independientemente de su origen: cianidina-3-glucsido (42,5%), y cianidina-3-(6"malonil)-glucsido (30,7%).

Los tiempos de retencin de las antocianinas mayoritarias fueron 24,01 y 33,56 min,

respectivamente, valores que coinciden con los estndares utilizados para su identificacin

(Figura 8). Los resultados concuerdan con los reportados por Fossen et al. (2001)[24], quienes

encontraron las mismas antocianinas en flores y hojas de maz morado y sealan, al igual queDe Pascual-Teresa et al. (2002)[21] y Schwarz et al. (2003)[25], a la cianidina-3-glucsido

como la antocianina mayoritaria en maz morado, seguida por la cianidina-3-(6"malonil)-

glucsido.

Se pudo observar que existen diferencias en el perfil de antocianinas minoritarias entreespecies de maz; que si bien son mnimas como lo demuestra la Figura 7, ocasionan una

diferencia enorme en el color y pigmentacin de las diferentes variedades de maz morado.Esta variacin se define en colores que van desde el rojo, pasando por el morado (completo o

moteado) hasta el casi negro en el caso del Kulli.

La siguiente Tabla Nr.2 nos presenta de manera resumida identificacin y caractersticas

espectroscpicas de las antocianinas minoritarias de las diferentes variedades de de Maz

morado analizadas en nuestro estudio. Una comparacin directa entre las 6 variedadesestudiadas la podemos apreciar grficamente en la Figura 7, en la cual observamos tanto la

similitud en el perfil antocinico (Antocianinas mayoritarias) como las diferencias en el perfil

de las menores (La enumeracin va de acuerdo con Tabla 1)


12/17

[90]


Tabla 2. Identificacin y caractersticas espectroscpicas de las antocianinas minoritarias

Variedad Antocianinas (minor) tR(min)

[M]+(m/z)

MS/MS(m/z)

Ayzuma peonidina-3-glucsido

pelargonidina-3-(6"malonil)-glucsido

31.78

36,99

463

519

301

271, 433

Tuimuru pelargonidina-3-glucsido

An no caracterizado

26,63

30.51

433

535

271

287

Huaca Songo pelargonidina-3-glucsido

peonidina-3-glucsidopelargonidina-3-(6"malonil)-glucsido

peonidina-3-(6"malonil)-glucsido

26,63

31.7836,99

38,81

433

463519

549

271

301271, 433

301, 463

Checchi An no caracterizado


36,06

38,81

635

549

475, 306

301, 463

Oke pelargonidina-3-glucsido

An no caracterizado

peonidina-3-glucsido

pelargonidina-3-(6"malonil)-glucsidopeonidina-3-(6"malonil)-glucsido

26,63

30.51

31.78

36,9938,81

433

535

463

519549

271

287

301

271, 433301, 463

Kulli An no caracterizadopeonidina-3-glucsido

pelargonidina-3-(6"malonil)-glucsido

cianidina-3-(3", 6"dimalonil) -glucsido


30.5131.78

36.99

37,82

38,81

535463

519

621

549

287301

271, 433

287, 449

301, 463

Figura 7. Cromatograma de HPLC comparativo de las variedades estudiadas


13/17

[91]


Time [min]210 350280140

Absorbance[520nm]

70

12

3

4

Las antocianinas en las semillas de maz morado de las variedades analizadas, son de

tipo simple y no aciladas, ya que su estructura est conformada por el grupo cromforo ynicamente un azcar, que es la glucosa . Esta estructura qumica minimiza pues su uso

potencial como colorantes naturales para alimentos, ya que son menos estables a cambios de

pH que las aciladas; sin embargo, poseen una actividad antioxidante sobresaliente, por lo que

las antocianinas del maz morado pueden considerarse valiosas como agentes antioxidantes

[25]Para una mejor caracterizacin y elucidacin espectroscpica de las antocianinas

extradas, sobretodo de aquellas minoritarias, se hace necesario el aislamiento y purificacin

de ms cantidades de extracto y es pecisamente aqu donde se despliegan todas las ventajas de

la cromatogrfia contracorriente , que nos permite llegar de manera fcil, rpida y eficiente a

tal objetivo. A continuacin se describen los resultados de la separacin HSCCCejemplarmente en el Maz variedad Kulli.

FRACCIONAMIENTO DEL EXTRACTO XAD 7 DE MAZ KULLI POR MEDIO DEHSCCC

Para la separacin se utilizaron 500 mg del extracto XAD 7. Las separaciones se

realizaron por cromatografa en contracorriente a alta velocidad HSCCC y el equipo utilizado para tal operacin fue un modelo CCC-1000. La Figura 8 nos muestra el cromatograma

HSCCC a una longitud de onda de 520 nm.

Se obtuvo un total de 4 Fracciones

ms la fraccin residuo llamada coil, que

fueron separadas con ayuda de

cromatografa de capa fina. El control dela identidad y pureza de las fracciones

separadas fueron monitoreadas con ayuda

de HPLC-DAD y Cromatografa de

lquidos acoplada a espectrometra demasas (LC-MS) sucesivamente. HSCCC

Fr. 1 (llamada fraccin de ruptura) est

compuesta mayoritariamente por

pigmentos polimricos, Fraccin 2contiene un pigmento identificado

tentativamente como un dimero de

flavanol y cianidina-3,5-diglucsido,

llamado (epi)catequina- cianidina-3,5-diglucsido y que ya ha sido identificada en anterioresestudios en un polvo colorante a base de maz morado[26]. Una purificacin sucesiva yanlisis con Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear (RMN) se encuentran en curso.

Fraccin 3 contiene mayormente copigmentos y ningna antocianina. La fraccin 4 contiene

el compuesto mayoritario de la variedad, cianidina-3-glucsido, con una pureza de80% y el

compuesto minoritario con un in molecular [M]+ (m/z) de 477 y una fragmentacin del inmolecular de MS/MS 287, lo que nos seala que se trata de un derivado de la cianidina Una

purificacin sucesiva y anlisis con Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear (RMN)

se encuentran igualmente en curso. Finalmente en la fraccin Coil se enriquecieron entre

otros, el segundo pigmento mayoritario cianidina-3-(6"malonil)-glucsido con una pureza de60%y el resto es una fraccin mezclada que contiene pelargonidina-3-(6"malonil)-glucsido,

peonidina-3-(6"malonil)-glucsido y la antocianina no acilada peonidina-3-glucsido comocomponentes minoritarios. A continuacin nos resumen Figura 9 y Tabla 3 las caractersticas

Figura 8. Cromatograma HSCCC de Maz

Kulli 520 nm


14/17

[92]


cromatogrficas y espectrometrics de las antocianinas aisladas y caracterizadas a partir de lavariedad de maz morado denominada Kulli

Tabla 3. Identificacin y caractersticas espectroscpicas de las antocianinas de Maz moradovariedad Kulli

picoa compuesto tR(min)

rea(%)

[M]+(m/z)

MS/MS(m/z)

1 cianidina-3-glucsido (mayor) 23.98 42,5 449 287

2 An no caracterizado 30.51 2,5 535 287

3 peonidina-3-glucsido 31.78 1,8 463 3014 cianidina-3-(6"malonil)-glucsido (mayor) 33.57 30,7 535 287, 449

5 pelargonidina-3-(6"malonil)-glucsido 36.99 1,9 519 271, 433

6 cianidina-3-(3", 6"dimalonil) -glucsido 37,82 2.6 621 287, 449

7 peonidina-3-(6"malonil)-glucsido 38,81 3,1 549 301, 463a (epi)catequina- cianidina-3,5-diglucsido 6,67 10,8 899 306, 449

aenumerado de acuedo con Figura 8

Una purificacin sucesiva de las fracciones obtenidas con HSCCC y anlisis conEspectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear (RMN) de las mismas, as como tambin

estudios preliminares sobre la capacidad antioxidante de los diferentes extractos y sustancias

purificadas se encuentran actualmente en curso

1

75362

4

a

Figura 5. Cromatograma HPLC- DAD del extracto XAD 7 de maz Kulli a 520 nm


15/17

[93]


CONCLUSIONES

La composicin de antocianinas presente en los maces originarios de Bolivia es muysimilar a la que presentan algunos mesoamericanos ya descritos en estudios anteriores.

Las antocianinas mayoritarias identificadas en los granos de maz de las variedadesestudiadas fueron la cianidina-3-glucsido y la cianidina-3-(6"malonil)-glucsido

respectivamente

Las tcnicas de cromatografa en contracorriente y HPLC son herramientas primordialespara la extraccin y caracterizacin de las antocianinas, ya que permiten una purificacin yseparacin a gran escala para la ejecucin de estudios y anlisis posteriores (por ejemplo

TEAC, DPPH, estudios de biodisponibilidad etc..); adems de que permiten enriquecer y

concentrar componentes minoritarios para su completa elucidacin.

Por la naturaleza qumica de las antocianinas identificadas en las variedades de mazmorado estudiados, su uso potencial sera como fuente de antioxidantes, ms que como

colorantes naturales.

EQUIPOS Y PARMETROS

1. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)a) analtica

Bomba: Jasco PU-980 Intelligent HPLC Pump

Detector: Jasco MD-910 Multiwavelength Detector

Inyector: Rheodyne 7125 con inyector de muestra de 20 L

Degasificador: Jasco DG-980-50 3-Line Degaser

Software: Borwin-PDA Versin 1.0

Columnas: Luna 5 C18 (2), 250 4,6 mm (Phenomex, Aschaffenburg)Synergi (250 x 4,6 mm, 5 m), Phenomenex)

b) preparativa

Bomba: Knauer HPLC-Pump K-1001

Detector: Knauer K-2600 Variable Wavelength Monitor

Inyector: Knauer K-55960 con inyector de muestra de 200 L

Software: Eurochrom 2000 para Windows V.2.05

Columna: Luna 5 C18 (2), 250 10 mm (Phenomex, Aschaffenburg)

2. CROMATOGRAFA DE LQUIDOS ACOPLADA A ESPECTROMETRA DE MASAS(LC-MS)

Equipo: Esquire-LC, Bruker Daltonics (Bremen); LC-ESI-MS/MS con Ion

Trap Mass Spectrometry

Software: HP ChemStation con EsquireControl, Anlisis

Bomba: HP Series 1100 HPLC Pump G1312A BinPump

Detector: Merck Hitachi L-4000 UV Detector

Registrador: Shimadzu C-R6A ChromatopacInyector: Rheodyne 7725, on inyector de muestra de 20 L


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SISTEMA DE SOLVENTES (DISOLUCIONES) Y GRADIENTEDisolucin A: Agua/Acetonitrilo/cido frmico 87:3:10 (v:v:v)

Disolucin B: Agua/Acetonitrilo/cido frmico 40:50:10 (v:v:v)

Flujo: 0,5 ml/min

Gradiente: 0 min 6% B, 20 min 20% B, 35 min 40% B, 40 min 60% B, 45 min

90% B, 55 min 6% B3. HIGH SPEED COUNTERCURRENT CHROMATOGRAPHY (HSCCC)

Equipo: High Speed modelo CCC-1000 Pharma-Tech Research Corporation,Triplecoil;

Volumen total Triplecoil: 850 mL

Bomba: Jasco, Biotronik HPLC-Pump BT 3020

Detector: Knauer K-2501

Inyector : 20 mL

Fraccionador: Pharmacia LKB Super Frac Fraction Collector

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antocianina flo

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