Quando i neuroni si ammalano e

degenerano

Antonino Cattaneo

Scuola Normale Superiore

Le Frontiere della Biologia

Accademia dei Lincei e Normale per la scuola

23 febbraio 2016

1

250

-20 0 20 40 60 80

TIME (min relative to HFS)

HFS

200

150

100

0

1 mV

10 ms

FIELD EPSP

1

2

1

2

La plasticita’ sinaptica funzionale: l’efficacia delle

sinapsi aumenta (o diminuisce) in modo duraturo

Il problema della specificita’ sinaptica e

la sintesi proteica locale nei neuroni

La plasticita’ strutturale: spine dendritiche….

…e nuovi neuroni (neurogenesi adulta)

Le interazioni geni-ambiente nelle patologie cerebrali

L’epigenoma: il

risultato di un gioco

tra “writers” (es.

HATs, HMTs) e

“erasers” (es.

HDACs, HDMs),

interpretato dai

“readers”.

10

Engramma: la traccia della memoria

‘Its result, namely, the enduring though primarily

latent modification in the irritable substance

produced by stimulus, I have called an Engram…’

Richard Semon, 1921

Quando i neuroni si ammalano e

degenerano

Malattia di Alzheimer

Malattia di Parkinson

Corea di Huntington

Sclerosi laterale amiotrofica…..e moltre altre

13

Perdere la memoria: la malattia

di Alzheimer

15

La malattia di Alzheimer: una emergenza

World Alzheimer Report 2015, ADI

Aspetti comuni a varie patologie

Vulnerabilita’ selettiva di specifiche

popolazioni neuronali

Aggregazione e misfolding di proteine

Perdita di sinapsi, prima che perdita di

neuroni (malattie sinaptiche)

Forme sporadiche e forme genetiche

La malattia comincia molto tempo prima che i

segni clinici siano manifesti

17

Eziologia e fattori di rischio

• Eta’

• Genetica

– Geni malattia (mutazioni puntiformi (autosomiche dominanti o autosomiche recessive)), amplificazioni geniche

– Alleli che aumentano il rischio (es. ApoE4 e TREM2 in AD)

• Fattori ambientali

• ?

18

Mutazioni genetiche che causano neurodegenerazione

19

Corpi di Lewy: alfa-sinucleina

20

Grovigli neurofibrillari

(tangles): proteina Tau

Placche di

Amiloide:

proteina APP

Ripiegamento e aggregazione

L’aggregazione proteica

e’ un processo chimico-

fisico importante e

generico, nel

ripiegamento di una

proteina, in relazione al

suo panorama energetico

(energy landscape)

22

Aggregazione e ripiegamento: processi in competizione

23

24

Il ripiegamento delle proteine e la loro aggregazione nella cellula sono strettamente

regolate

25

Amiloidi funzionali: non solo patologia

26

Il concetto di prione: dal seme iniziale ai grossi aggregati

Propagazione intra- ed inter-cellulare di aggregati proteici

Perdere la memoria: la malattia di

Alzheimer Non ci sono cure, solo trattamenti

sintomatici

Non e’ possibile una diagnosi precoce

Lo sviluppo della patologia nel cervello

precede di molti anni la comparsa dei

sintomi clinici (e quindi la diagnosi clinica)

30

Grovigli neurofibrillari

(tangles): proteina Tau

Placche di

Amiloide:

proteina APP

La patologia e’ caratterizzata non solo da placche di Ab e grovigli

neurofibrillari di Tau, ma anche da deficits colinergici ,

Paziente di 89 anni

di controllo

Paziente di 84 anni

affetto da AD

La proteina associata ai microtubuli Tau

33

Vie amiloidogeniche e non amiloidogeniche nella

proteolisi di APP

LaFerla et al. Nature Rev. Neurosci 2007

Fasi precliniche e cliniche della MA

Fase preclinica Fase Clinica

15 -20 anni 5-10 anni Tempo

100%

Capacità cognitive

Esprdio Biologico Esordio Clinico

Eventi causali a monte

Riserva Cognitiva

Alzheimer sporadico e familiare

• Mutazioni nei geni APP e Preseniline

• Tauopatie: mutazioni nel gene Tau causano altre forme di demenza (FTD)

36

Come si studia? Da cosa partire?

• Dai geni-malattia e dalle proteine che aggregano (modelli transgenici, studi cellulari)

• Dai fattori di rischio

• Dai meccanismi di neuroprotezione

• Da studi genetici di larghe coorti di individui (GWAS) per individuazione di geni che conferiscono rischio o protezione

37

L’ipotesi amiloide ha dominato la scena negli ultimi anni ma…..

Immunoterapie per colpire Ab

39

Fallimenti delle sperimentazioni cliniche dirette al peptide A b

• L’ipotesi e’ sbagliata?

• Trattamenti troppo tardivi? (problema della diagnosi precoce)

• Specie molecolare “bersaglio” (A b fibrillare) non ottimale?

• Molte strade diverse portano alla neurodegenerazione

40

Molte strade differenti portano alla neurodegenerazione

41

Colpire le forme precoci del peptide Ab

(Ab oligomers), identificando dove si

formano inizialmente

Colpire i meccanismi a monte della cascata

amiloidogenica e/o attivare meccanismi di

neuroprotezione (interrompere circoli viziosi)

Unificare gli studi sulla manipolazione degli

engrammi con le ricerche sulla

neurodegenerazione

42

Oligomeri di Aβ nella patogenesi della malattia di

Alzheimer

Aβ plaque

Oligomeri di A beta :

•100 volte piu’ neurotossici delle

fibrille

•Legano specificamente le membrane

sinaptiche

X X

Anticorpi conformazionali anti-AβOs

Anticorpi conformazionali che neutralizzano

le fasi precoci della oligomerizzazione

45

46

Targeting intracellulare e sinaptico

1. Citoplasma

2. Reticolo endoplasmico

3. Via secretoria

4. Mitocondri

5. Sinapsi (pre- e post-)

Targeting intracellulare di anticorpiricombinanti anti-AβOs

47

Intrabody scFvA13-KDEL in 7PA2 cells (fAD: hAPP_V717F)

Extracellular Intracellular

Aβ AβOs Aβ AβOs

Extracellular Aβ profile

WB and DB analysis

(see also poster n.6)

SELDI-TOF

immunoproteomic

analysis

Meli et al., Nat Comms 2014

Conditioned

Media

(CM)

Lysates

Colpire le forme precoci del peptide Ab (Ab

oligomers), identificando dove si formano

inizialmente

Colpire i meccanismi a monte della

cascata amiloidogenica e/o attivare

meccanismi di neuroprotezione

(interrompere circoli viziosi)

Unificare gli studi sulla manipolazione degli

engrammi con le ricerche sulla

neurodegenerazione

49

Probe trial

SO* NE SE NO 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

T i m

e i

n q

u a

d r

a n

t (

s e

c )

wt

AD11

quadrants

WT mice

AD11 mice

Probe trial

SO* NE SE NO 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

T i m

e i

n q

u a

d r a

n t (

s e

c )

wt

AD11

quadrants

WT mice

AD11 mice

Probe trial

SO* NE SE NO 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

T i m

e i

n q

u a

d r

a n

t (

s e

c )

wt

AD11

quadrants

Probe trial

SO* NE SE NO 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

T i m

e i

n q

u a

d r

a n

t (

s e

c )

wt

AD11

Probe trial

SO* NE SE NO 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

T i m

e i

n q

u a

d r

a n

t (

s e

c )

wt

AD11

quadrants

WT mice

AD11 mice

Cholinergic deficit

b -amyloid plaques

Phosphorylated tau

Memory loss

Neutralizzare NGF nel cervello adulto induce una

neurodegenerazione progressiva simile all’ Alzheimer

Ruberti et al. 2000; Capsoni et al., 2000, 2002

MMSE scoreC

ort

icalpro

tein

levels

TrkA

proNGF

30 15 0

MMSE scoreC

ort

icalpro

tein

levels

TrkA

proNGF

30 15 0

Counts and Mufson, 2005

++

Neurodegeneration

(sortilin, p75NTR)

Survival

(TrkA, p75NTR)

proNGF NGF

Normal conditions

(WT)

Unbalance NGF/proNGF

Decreased protease activity

AD:AD:++

Neurodegeneration

(sortilin, p75NTR)

Survival

(TrkA, p75NTR)

proNGF NGF

Normal conditions

(WT)

Unbalance NGF/proNGF

Decreased protease activity

AD:AD:

Furin

MMPPlasmin

Other convertases

Neurodegeneration,Cell death

Survival

Sortilin

p75NTR

p75NTR

TrkA

proNGF NGF

Final outcome: depending on the relative ratios

NeuronNeuron

Furin

MMPPlasmin

Other convertases

Neurodegeneration,Cell death

Survival

Sortilin

p75NTR

p75NTR

TrkA

proNGF NGF

Final outcome: depending on the relative ratios

NeuronNeuron

L’ipotesi dello sbilanciamento NGF/proNGF

Come utilizzare NGF per sperimentare una terapia per

AD?

NGF e’ un potente sensibilizzatore del dolore

Barriera ematoencefalica

Come utilizzare NGF per sperimentare una terapia per AD?

Tuszynski et al., Nat. Med. 2005; JAMA 2015

“Togliere il dolore” dalla molecola del NGF

E’ possibile ingegnerizzare una molecola di NGF che ne

mantenga tutte le proprieta’ neurotrofiche, ma ne elimini

la capacita’ di indurre dolore?

HSAN V: Malattia genetica rara di insensibilita’ congenita

al dolore

Simona Capsoni

HSAN V NGF R100: painless NGF

R100 R100 R100 D75

C-term C-term

p75

TrkA TrkA

NGF61/100 decreases plaque load in 5xFAD mice

SCUOLA NORMALE SUPERIORE

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

0 10 20 30 40 50 60

Rel

.Am

p.

Time (min)

5xFAD+NGFp

wt

5xFADHFS

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

25 50 100 200

PP

rati

o

ISI (ms)

wt

5xFAD

5xFAD+NGFp

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

0 50 100 150 200

PP

rat

io

ISI (ms)

wt

5xFAD

5xFAD+NGFp

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10

% R

el.

Am

p.

Stim.Int. (V)

wt

5xFAD

5xFAD+NGF

A

B C

NGF61/100 rescues synaptic transmission and

LTP deficits in the entorhinal cortex of 5xFAD

mice

SCUOLA NORMALE SUPERIORE

62

Omeostasi del ripiegamento delle proteine: il

network della proteostasi

63

La risposta della cellula al protein misfolding:

unfolded protein response (UPR)

64

Letargo e plasticita’ sinaptica

65

La perdita della

capacita’ di riformare

le sinapsi, dopo

ibernazione, e’ un

evento precoce nella

neurodegenerazione

66

SCUOLA NORMALE SUPERIORE

Colpire le forme precoci del peptide Ab (Ab

oligomers), identificando dove si formano

inizialmente

Colpire i meccanismi a monte della cascata

amiloidogenica

Unificare gli studi sulla manipolazione

degli engrammi con le ricerche sulla

neurodegenerazione

67

Incontrarsi a meta’ del tunnel, partendo dalle due estremita’ opposte

68

Engrams: memory traces

Alla ricerca dell’engramma: necessita’ e di sufficienza

Una memoria puo’essere codificata da (in) una popolazione di

neuroni

Questi neuroni possono essere geneticamente marcati, per una

successiva identificazione e manipolazione

La loro ablazione o silenziamento abolisce la memoria (necessita’)

E’ possibile indurre un comportamento innescato da una specifica

memoria, attivando direttamente una popolazione di neuroni

“identificati” come attivi durante l’apprendimento?

Fear Conditioning

Optogenetica

73

Optogenetics to induce or to

change memories

75

Protocollo sperimentale

In presenza di Dox, tTA non si lega

a TRE e la ChR non viene

espressa, ma la “marcatura

genetica” dei neuroni attivati in A

resta

ChR espressa in assenza di Dox,

nei neuroni attivati nel contesto A

Topi abituati nel contesto A, poi

esposti ad uno shock, nel contesto

B, ed infine riesposti al contesto A,

in presenza di Dox e di Luce.

Stimolazione optogenetica

delle cellule-engramma

La stimolazione ottica delle cellule-

engramma induce una risposta

comportamentale

Durante la prima fase di abituazione

(contesto A) topi non mostrano

“Freezing”

Dopo il training con fear conditioning e

marcatura delle cellule-engramma con

ChR (contesto B), I topi esposti al

contesto A mostrano freezing, ma solo

quando si accende la luce.

Le cellule del DG che hanno espresso c-

fos (e quindi ChR) durante il training

definiscono una popolazione la cui

attivazione e’ sufficiente per

richiamare la memoria, misurata dalla

risposta comportamentale.

Optogenetics to induce or to

change memories

Creazione di una falsa memoria

80

81

82

83

84