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de la columna en la búsqueda de nuevos
Sergio Alonso Orgaz
Doctor en Biología
Aplicaciones MARS Hu-14
biomarcadores de enfermedad Cardiovascular
Carlos Martínez Laborde
Licenciado en Química
Laboratorio de Fisiopatología Vascular (Dra. M.G.Barderas – Hospital Nacional de Parapléjicos)
Introducción Resultados Aplicaciones
Necesidad de nuevos biomarcadores
www.who.int/
Introducción Resultados Aplicaciones
El National Institutes of Health (NIH) estandarizó en 2001 la definición de biomarcador
como “una característica que se mide y evalúa objetivamente como indicador de
procesos biológicos normales, procesos patogénicos o respuestas farmacológicas a
una intervención terapéutica”
Proteínas Metabolitos
¿Qué es un biomarcador?
DNA / RNA
Introducción Resultados Aplicaciones
Desde el punto de vista proteómico, un biomarcador es una proteína o grupo de proteínas
cuya variación de expresión permita establecer un diagnóstico en una fase temprana de las
enfermedades, un pronóstico acerca de su desarrollo y/o una evaluación de la respuesta a un
tratamiento.
Proteínas como biomarcadores de enfermedad
Diagnóstico
Pronóstico Seguimiento
Introducción Resultados Aplicaciones
Para que un biomarcador sea interesante desde un punto de vista clínico tiene que cumplir
los siguientes requisitos:
Coste-efectivo Métodos no invasivos Estable y
fácil de cuantificar
Introducción Resultados Aplicaciones
Cualquier tipo de muestra biológica puede ser utilizada para la búsqueda de nuevos
biomarcadores de enfermedad, pero las más interesantes desde un punto de vista clínico
son:
Suero/Plasma Orina
Introducción Resultados Aplicaciones
Obtención mínimamente invasiva
Mínimo coste.
Fácil toma de muestra y procesado
Procesado (factores a tener en cuenta):
Plasma o Suero?
Modo de obtención (posición del paciente…)
Material de recolección de muestra
Almacenamiento (Tª y tiempo)
Inhibidores de proteasas
Ciclos de descongelación
¿Fuente de biomarcadores?
Reflejo de lo que ocurre en el organismo → MEZCLA
Proteínas en muy variadas concentraciones → dificultad detección biomarcadores
PLASMA
Introducción Resultados Aplicaciones
albumin
IgG transferrin
IgM haptoglobin
Complement C3 α-1-antitrypsin
α-2-macroglobulin IgA
fibrinogen
Composición del Plasma
Introducción Resultados Aplicaciones
From Anderson et al. 2002, Mol. Cell. Prot. 1, 867
Dynamic range is 9 to 10 magnitudes Albumin: 30-50 mg/ml Interleukin-6: 1-5 pg/ml
mg/ml
pg/ml
Rango dinámico de concentraciones proteicas en Plasma
Ac específico
Proteína retenida
Introducción Resultados Aplicaciones
MARS Human 14
97,5% - 99,9% de eliminación de 14 proteínas mayoritarias
Introducción Resultados Aplicaciones
H
H
H H
L
L L
H
L L
L L
L
H
H H H H
H H
H
H
H H
Proteínas minoritarias
Tampón A
Proteínas mayoritarias
Tampón B
20 μl plasma
Diluído 1:3 tampón A
Columna MARS Hu-14
HPLC
Proteínas mayoritarias
Fracción retenida
Proteínas minoritarias
Fracción no retenida
L L
L L
L
H
H H H H
H H
H
H
H H
94% de proteínas
plasmáticas
Potenciales biomarcadores
Proteínas a estudiar
Introducción Resultados Aplicaciones
1-Marcador de peso molecular
2-Suero completo
3-Fraccción de proteínas minoritarias
4-Fracción de proteínas mayoritarias
5-Marcador de peso molecular
6-Plasma completo
7-Fraccción de proteínas minoritarias
8-Fracción de proteínas mayoritarias
Suero
Plasma
Introducción Resultados Aplicaciones
4 7
Plasma completo
Tira IPG 24cm pH 4-7 y 10%SDS-PAGE
SD
S-P
AG
E 1
0%
Plasma deplecionado con MARS HU-14
Tira IPG 24cm pH 4-7 y 10%SDS-PAGE
*Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa
MARS Hu-14 Estudio proteómico de plasma en pacientes con Estenosis Aórtica
SD
S-P
AG
E 1
0%
4 7 pH pH
Introducción Resultados Aplicaciones
Plasma completo
Gel 2D-DIGE Plasma deplecionado MARS-14
Gel 2D-DIGE
4 manchas proteicas diferencialmente expresadas
3 aumentadas y 1 disminuídas (p<0.05)
*Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa
71 manchas proteicas diferencialmente expresadas
41 aumentadas y 30 disminuídas (p<0.05)
MARS Hu-14
Introducción Resultados Aplicaciones
Proteína 1
Proteína 3
Proteína 2
MARS Hu-14 Validación mediante Western Blot
*Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa
Plasma deplecionado MARS-14
pH 5,5 7
pH 5,5 7
Introducción Resultados Aplicaciones
MARS Hu-14 Validación mediante 2D-Western Blot
*Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa
Plasma completo
pH 5,5 7
pH 5,5 7
Introducción Resultados Aplicaciones
*Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa
MARS Hu-14 Validación mediante 2D-Western Blot
Plasma completo
pH 5,5 7
pH 5,5 7
Plasma deplecionado MARS-14
pH 5,5 7
pH 5,5 7
Introducción Resultados Aplicaciones
• La columna de afinidad MARS Hu-14 reduce la presencia de las 14 proteínas más
abundantes de suero, plasma, LCR y otros fluidos biológicos.
• Elimina ~ 94% del contenido total de proteína del plasma/suero.
• El sistema de eliminación de afinidad múltiple también ofrece la mayor facilidad de uso,
la mayor selectividad y reproducibilidad en comparación a cualquier otro sistema
equivalente de eliminación de proteínas mayoritarias.
• Como se ha podido ver en los resultados mostrados el uso de la columna MARS Hu-14
supone una excelente herramienta en la búsqueda proteínas como nuevos
biomarcadores de enfermedad.
MARS Hu-14 Resumen y conclusiones
Dra. M. G. Barderas
Dr. F. Gil-Dones
Dr. S. Alonso-Orgaz
Dr. F.de la Cuesta
C. M. Laborde
L. Mourino-Álvarez
F. Akerstrom
C. Bermúdez
Laboratorio de Fisiopatología Vascular Hospital Nacional de Parapléjicos (Toledo)
Gracias por la atención
Unidad de Proteómica Hospital Nacional de Parapléjicos (Toledo)
Dra. M. G. Barderas
Dra. V. M. Dardé
G. Barroso
A. Gallardo
Servicio de Cardiología Hospital Virgen de la Salud (Toledo)
Dr. L. R. Padial
Dr. L. F. López-Almodovar
Dr. J. Moreu