aplicaciones potenciales de las microalgas marinas en baja...

Aplicaciones Potenciales de las Microalgas

Marinas en Baja California

Chihuahua, Chih., CIMAV 26 de Octubre de 2010

Jose Luis Stephano Hornedo

Necesidad de Energías Alternas

283309

347 366400

447

511559

607654

702

1

Consumo Mundial de EnergíaMiles de billones de BTUs

1980 1985 1990 1995 2000 2004 2010 2015 2020 2025 2030

Energy Information Administration, E.E.U.U., 20051BTU= 0.293Whr


Energy Information Administration, E.E.U.U., 2008

Dic-19989.16

Jul-2008137.11

Ene-197813.08

2010: Precio Internacional del Petroleo: $81.25 dolares/barril

2010: Precio de la gasolina: 0.63 dolares/litro


2%

1.4%

2.5%

-0.3%

Consumo de Energia Produccion de Petroleo

Consumo de Energía y Producción PetroleraProyección a 2030

Cambio Porcentual Anual

Mundial Mexico


Seguridad Energética

• Cantarell proveía el 60% de la producción Nacional

• En el 2003 Cantarell alcanzó su pico de producción.

• Hoy produce menos de la mitad.

•México posee el 1.2% de las reservas mundiales de petróleo

•Extrae el 5% de la producción mundial.

•El total de las reservas estimadas alcanzará para 30 años.

•Las reservas probadas solo alcanzan para 10 años.

14621.2

15144.4

14717.2

2008

Reservas de Petróleomillones de barriles

Posibles Probables Probadas


Sistema de Información de Energía, México, 2008


Sistema de Información de Energía, México, 2008

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Exportación Importación

Balanza Comercial de HidrocarburosPEMEX Ene/2008 Miles de barriles equivalentes

Petroquímicos

Prod. Petrolíferos

Gas Natural

Crudo

Petroquímicos: Derivados del petróleo no combustibles (etileno, benzeno, etc)

Prod. Petrolíferos: Gasolinas

Necesidad de Biocombustibles

2004 2010 2015 2020 2025 2030

Consumo Mundial de Combustibles Líquidosmiles de billones de BTUs

Electricidad

Transporte

Industrial

Comercial

Residencial


Biodiesel• Resultado de la transesterificación de

triglicéridos.

VariableBiodiesel de Microalgas

Diesel de Petróleo

Densidad (Kg/L) 0.864 0.838

Punto de Inflamación (ºC) 115 75

Viscocidad (mm2/s @40ºC) 5.2 1.9—4.1

Valor de Calentamiento (MJ/Kg) 41 40—45

Relación H/C 1.81 1.81

Punto de Solidificación (ºC) -12 -50 – 10

Ventajas del Biodiesel• Compatible con todos los

motores diesel.

• Biodegradable.

• Menor contaminación.

• Renovable

• Tecnología disponible para su producción.

• Puede utilizarse solo o mezclado con diesel de petróleo

Biodiesel vs Diesel de Petróleo

Emisiones Contaminantes de B20 comparado con

100% Diesel

Emisión %

NOx +2.0

Partículas -10.1

HAPs -21.1

CO -11.0

Microalgas• Organismos fotosintéticos

unicelulares

• Se estima que existen entre 1 y 1.5 millones especies, solo se han identificado alrededor de 65,000

• Son capaces de reproducirse hasta 6 veces en 24 horas

• Existen especies que producen hasta 70% de peso seco en lípidos.

• Presentes en prácticamente todos los hábitats

Ventajas de las Microalgas• No compiten con los alimentos ni

asentamientos humanos

– Se utiliza agua de mar o

salobre.

– Se cultivan en tierras infértiles

• Alcanzan grandes densidades

• Producen hasta 200 veces más

aceites que los cultivos tradicionales.

• El 90% de su peso seco es CO2

absorbido

• No generan desechos

• Aumentan la disponibilidad de alimento

Impacto Ambiental de la Producción de Biocombustibles

Cultivo Producto Emisión de CO2

Kg/MJ

Uso de Recursos

Agua dulce Fertilizante Pesticidas Energía

Maíz Etanol 81-85 Alto Alto Alto Alto

Caña Etanol 4-12 Alto Alto Medio Medio

Pastos Etanol -24 Medio Bajo Bajo Bajo

Madera Etanol/

Biodiesel

N/D Medio Bajo Bajo Bajo

Algas Etanol/

Biodiesel

-183 Bajo Bajo Bajo Medio/

Alto

Soya Biodiesel 49 Alto Medio Medio Medio

Canola Biodiesel 37 Alto Medio Medio Medio

Jatropa Biodiesel N/D Medio Medio/

Bajo

Medio Medio

Palma Biodiesel N/D Alto Bajo Medio Medio

Rendimientos

Cultivo Rendimiento

L /Ha

Superficie Necesaria* Ventajas

Hectáreas

(Millones) %**

Desventajas

Soya 446 594 326

Tecnología Disponible

Compite con Alimentos, Agua.

Canola 1,190 223 122


Compite con Alimentos, Agua.

Jatropa 1,892 140 77


Compite con Alimentos, Agua (250 a 600mm),

Crecimiento Lento

Palma 5,950 45 24


Deforestación

Microalga

20%

Lípidos

39,100 6.8 3.8

Alto potencial de producción de Biocombustibles

y Alimento.

Microalga

50%

Lípidos

97,750 2.8 1.6 Tecnología aún en Desarrollo

Baja California• 3.6% del Territorio

Nacional (71,446 Km2)

• 13.41% de los litorales

mexicanos

(1555.23Km)

– 880Km Pacífico

– 675Km G. California

• Precipitación total anual

de ~100mm.

• Las costas del G. de

California reciben la

menor precipitación

anual del país (40mm)

Baja California

•Temperatura media

anual de 17ºC. •Dic y Ene: 11 y 12ºC

Reuso de Suelos

• Uso intensivo de suelos

para agricultura

– Salinización

– Agotamiento

• Erosión por viento

• Nuevos usos para suelos agrícolas agotados

• Aprovechamiento de suelos sin uso productivo

• Impacto directo en comunidades remotas/marginadas

• Abasto de combustible

• Captura de CO2

– Posible acceso a bonos de carbono

• Creación de una Nueva Industria

Microalgas

Lípidos

Biodiesel

Suplementos Alimenticios

Proteína

Forraje

Alimento

ProteínasRecombinantes

Vacunas

Carbohidratos

Bioetanol

Biomasa

Electricidad

Alimento para Acuacultura

Lagunas de San Quintin,

Baja California.

Salinera San Martin

La Cooperativa Litoral de Baja

California S.A. de C.V. Tiene mas

de 14 lagunas de 10 a 30

hectareas cada una y mas de

1000 hectareas disponibles para

el cultivo de microalgas.

La coloracion roja se debe a

la presencia de Dunaliella

salina.

Cinética de crecimiento de Dunaliella salina

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0 5 10 15 20

Nú

mer

o d

e cé

lula

s

Días

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 5 10 15 20

DO

63

0 n

m

Días

Desarrollo de Microalgas Modificadas

Genéticamente para incremetar la sintesis de

Lipidos

Mutagenesis con Sulfonato de Etil-metano

Importancia del gen de P4H• Modifica proteínas de pared celular

• evitando su integración a esta.

• Glicoproteinas ricas en

hidroxiprolina, extensinas y

arabinogalactinas.

A: pared celular con silenciamiento, las capas

w2 a w6 se pierden mientas que la w1 y w7

pierden densidad.

B: pared celular con silenciamiento, el efecto es

mas acentuado, la pared llega a desprenderse

de la membrana celular.

C: pared celular de Chlamydomonas

normal, con sus capas diferenciadas.

The Plant Cell, Vol. 19: 256-269, January 2007, www.plantcell.org ｪ 2007 American Society of Plant

BiologistsChlamydomonas reinhardtii Has Multiple Prolyl 4-Hydroxylases, One of Which Is Essential for Proper Cell Wall

AssemblyKatriina Keskiaho, Reija Hieta, Raija Sormunen, and Johanna Myllyharjua

http://www.plantcell.org/

Síntesis del gen de P4H y construcción de la

resistencia nourseotricina

• Áreas:

– Suministro de Agua de mar

– Filtración

– Suministro de CO2

– Escalamiento

– Cosecha

– Disrupción celular

– Separación de Biomasa y Aceite

Planta Piloto de

30,000 L para

producción de

aceite crudo

Desarrollo de Microalgas Modificadas Genéticamente para

Produccion de Vacunas y Proteinas Recombinantes

(HA, Interferon 2 alfa, Interleucina 2, Proteina G, etc)

Menor tiempo de transformación a producción de proteínas recombinante

Obtención de líneas transgénicas estables encorto tiempo

Producción en medios de cultivo baratos

Producen proteínas complejas

Maquinaria de plegamiento y ensamblaje de proteínas

Interferón alfa 2B (hepatitis B)

Vacunas (anticuerpos,antígenos)

Interleucina 2 (efectoanti-tumoral)

Produccion de Proteinas Recombinantes en Microalgas

Secuencia de HA optimizada para expresion en nucleo

Secuencia de HA optimizada para expresion en cloroplasto

aa 264 PstI NcoI

Digestión con

NcoI y PstI

4,464 pb

2,710 pb pUC57

1,754 pb HA

1 2 3

MW

4 5 6

Digestión

NcoI y PstI

3,687 pb pUC57-UTRs

1,754 pb HA

Ligación

pUC57-UTRs-HA

1

MW

2Ligación pUC57-HA

Región Intergénica de D. salina

≈ 680pb

1 2 3 4 5

MW MWpsbA y R.I

≈ 4.8Kb

Cassette de

Expresion en

Cloroplastos

Anticuerpos VHH de Llama contra A/H1N1 2009

• Fácil manipulación genética.

• Tamaño de 12-15 KDalton.

• Estable a altas temperaturas.

• Alta solubilidad.

• Se une con alta afinidad alantígeno.

• Reconocimiento de sitios

• antigénicos ocultos.

• Rápida penetración de tejidos.

• Buena expresión en sistemas de

• expresión recombinantes.

• Incremento del tamaño funcional de

• las bibliotecas inmunes.

• 85% de similitud con los

• dominios VH humanos.

ATGCCTCTCCCAGCAACCCACGATTTACACATCTCCGGCTCA

ATCAATGGACATGAGTTTGACTTGGAAGGCAGTGGCAAAGGC

AATGCAAAAGAAGGTTATCAGGAGCTCCACCTAAAGTCCAAC

AAGGGTGACCTGTCATTCTCCCCCTGGATCCTGGTCCCAAAC

ATCGGCTACGGCTTCTACCAGTACCTGCCCTTCCCCGACGGA

GCGATGTCGCCTTACCAGGCCGCCATGCACGATGGCTCCGG

ATACGTGATGCATCGTTCAATGCAGTTTGAGGATGGTGCCAT

GCTGCATTCAGACCACCGCTACATCTATAAGGGAAACCATATC

AAAGGAGAGTTTCGGCTGACCGGAAGCGGTTTCCCTGCTGA

CGGCCCTGTGATGACCAACTCGCTGACCGCTGCGGACTGGT

GCGTCGACAAGCTGCTGTACCCAAACGACAACACCATAATCG

GGAAATTCGACTGGACCTACACCACTACCAGTGGCAAGCGCT

ACCAAAGTGATGTGCAGACCAACGTCACATTTGGCAAGCCAA

TAGCGGCCGACATTTTGAAGAAGCAGCCAATGTTCGTGTTCC

GCAAGGTGGAACTCAAGCACACCAAGACTGAGCTCAACTTC

AAGCAGTGGCAGAAGGCATTCCAGGACATCGCCTAG

Proteína Fluorescente Wasabi:

-Estable a temperatura ambiente.

-Madura mas rápidamente que el resto

de las proteínas fluorescentes.

-PFW:663 bp, 221 aa

-Anticuerpo de llama: 450 bp, 150 aa

371 aa, aprox. 37,000 kDa

400 bp500 bp

Regiones Variables de los Anticuerpos de llama (VHH)

Proteína G de Streptococcus sp. recombinante expresada en E. coli

1 mg ---- 69.8 Dlls Liofilizada en polvo Capacidad de unión ~10mg/mg

En microalga expresa 0.0002—0.0006 mg/ml de proteína recombinante de hormona de crecimiento Si se expresa la Proteina G a similares concentraciones la ganancia bruta por L de cultivo es la siguiente:

0.2 mg/L 13,000 L/semana----2600 mg 179140 dlls

Organismo Afinidad proteína A Afinidad proteína G

Humano ++++ ++++

Caballo ++ ++++

Vaca ++ ++++

Cerdo +++ +++

Chivo +/- ++

Borrego - ++

Conejo ++++ +++

Gallina - +

Hámster + ++

Cobayo ++++ ++

Rata +/- ++

Ratón ++ ++

Tabla. Afinidad para anticuerpos de diferentes organismos

Péptido Señal

2 Sitios GA (enlace albumina) 3 Sitios de unión a IgG

Proteina G (P19909)Immunoglobulin G-binding protein G Streptococcus sp.

Propiedades:

593 aa (1,779 pb)

63 kDa

Nco I 6-His Enterokinasa MET 3 Sitios de unión a IgG STOP Pst I

Proteina G (Lab. Meredith Gould)Immunoglobulin G-binding protein G

Streptococcus sp.

Propiedades:

216 aa (657 pb)

24 kDa

Codones optimizados para alta expresión en cloroplasto

PRUEBAS DE

SELECCIÓN CON

PRUEBAS DE TRANSFORMACION

CON

CONSTRUCCION

PARA

TRANSFORMACION

MUTACIONES

DIFERENTE

REGIÓN DE

RECOMBINA

CION

GEN

INTRODUCID

O

SILENCIAMIENTO

DEL GENPROMOTOR FUNCION

ATR

AZI

NA

O D

CM

U

HIG

RO

MIC

INA

CLO

RA

NFE

NIC

OL

NO

UR

SEO

TRIC

INA

LASS

ER

AG

RO

BA

CTE

RIU

M

TUM

EFA

CIE

NS

BO

LITA

S D

E

VID

RIO

BIO

BA

LIST

ICA

NU

CLE

O

CLO

RO

PLA

STO

ALMA L. SANCHEZ

QUIÑONES

EXPRESION

DE HASS35 VACUNA

FERNANDA ANA

SOSA B.

SERGIO QUIÑONES P.

JOSE A. ECHANOVE J.

EXPRESION

DE HASS35 VACUNA

IBRAHIM GUZMAN

OROSTICO

1.4 PROPIL

HIDROXILASARBCS2 FACILITAR LA

RUPTURA DE LA

PARED CELULAR

PARA LA

OBTENCION DE

ACEITE CRUDO.

RAYMUNDO AGUAS EXPRESION

DE DGTAATPA AUMENTO DE

SINTESIS DE

LIPIDOS

DANTE MAGDALENO

MONCAYO; HAYDEE

LOPEZ RODRIGUEZ

INTERLEUCIN

A 2

MUTACION

HA

MODIFICADA

TERAPIA ANTI-

TUMORAL.

AUMENTO DE

SINTESIS DE

LIPIDOS.

VACUNA

CAROLINA MENDOZA

DAMIAN;

CEASAR IVAN ORTIZ

ALCARAZ

EXPRESION

DE HA

INTERFERON

2 α

ATPA VACUNA

TRATAMIENTO DE

HEPATITIS C

ALEJANDRO

CARBALLO AMADOR

PROTEÍNA G ATPA PURIFICACION DE

ANTICUERPOS

ETAPA 2: DESARROLLO DE ALGAS MODIFICADAS GENETICAMENTE

07/Ago/2010 al 06/Ago/2011

Transformacion con Laseres pulsados

Mediana potencia

Mediana Potencia

Veneranda Garces (CICESE, UABC)

Alta Potencia

Adaptación de D.salina a diferentes concentraciones de NaCl y en

diferentes medios previo a la transformación con A.tumefaciens

Concentraciones de NaCl: 50, 100, 150, 200 y 250 mM

Medio Yu Sun et al. 2006.

Medio Johnsons Modificado (Borowitzka,M.A.,1988)

Se seleccionó 250mM de NaCl debido a que

Dunaliella salina muestra mejor crecimiento que

a las demás concentraciones de NaCl.

Adaptación de A.tumefaciens a diferentes concentraciones de NaCl

Agrobacterium crece en cualquier concentración de NaCl en medio YEM, sin embargo se

decidió utilizar 250mM para que ambas células estén a la misma salinidad.

Concentraciones de NaCl: 50, 100, 150, 200 y 250 mM

Dia 0Dia 3

Seleccion de las Microalgas Transformadas

Selección y Mantenimiento

4 a 6 Semanas

9 a 15 meses

Selección y Mantenimiento

Escalamiento

Producción en Planta Piloto16,000L

1 2 3 4 5

ProductosPrimera Planta Piloto

16,000 Litros

Especies Actuales

Segunda Planta Piloto

2,000,000 Litros

Colección de Especies

para uso en Biotecnología

Especies Mejoradas

Genéticamente

Productos

• Colección inicial de microalgas

– Lípidos

– Proteínas

– Carbohidratos

• Aceite crudo de microalgas

aplicaciones potenciales de las microalgas marinas en baja...

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