aplicaÇÕes atuais da citometria de fluxo na rotina...
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Citometria de fluxo – uma ferramenta
multidisciplinar guiada por hipóteseJanossy G - Cytometry 2004
Profa Dra Irene Lorand-Metze
Universidade Estadual de Campinas
APLICAÇÕES ATUAIS DA
CITOMETRIA DE FLUXO NA
ROTINA LABORATORIAL
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Princípios da citometria de fluxo
multiparamétrica
(acabou a era do positivo e negativo)
Dispensa a separação física de sub-populações
Mede simultaneamente pelo menos cinco
características ( 2 físicas e 3 antígenos) de cada
célula da amostra
Softwares de análise modernos para estudos das
sub-populações e comparação entre tubos e casos
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Estudo do ciclo celular – a aplicação mais
antiga
Estudo das fases do ciclo celular (1960 – 1970) –
ploidia, taxa de proliferação
Corantes: brometo de etídio, PI, DAPI (menos
afetado pela estrutura e composição do DNA)
Medida da incorporação de BrDU, PCNA
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Estudo da apoptose - anexina V
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Estudo do ciclo celular
Atual: estudo simultâneo de ciclinas e DNA
– quantifica a expressão de proteínas nas
diversas fases do ciclo celular em células
individuais
Futuro: estudar o estado funcional de
proteínas: fosforilação, acetilação, etc
ex: quantificar Rb e sua fração fosforilada
na transição G0 → G1
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Ciclo celular em plantas
Estudar tamanho do genoma, taxa de proliferação,
apoptose, etc.
Em protoplastos em cultura
Isolar núcleos por homogeinização
Em pólen
Sorting
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APLICAÇÕES CLÍNICAS CLÁSSICAS
Estudo do sistema imunológico (estado imune)
Diagnóstico de linfomas e s. linfoproliferativas
Classificação de leucemias agudas
S. mielodisplásicas
Quantificação de células CD34+ (TMO)
Hemácias e plaquetas (antígenos de grupos
sanguíneos, aloimunização, etc.)
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O papel da citometria no
desenvolvimento da imunologia moderna
desde os anos 70, produção de numerosos anticorpos
monoclonais contra componentes de células linfoides
permitiu:
Estudo da ontogenia do sistema linfoide
Melhor compreensão da origem dos diversos tipos de
neoplasias linfoides (classificação OMS)
Estudo da reação do sistema imune frente a agentes
infecciosos, d. auto-imunes e transplantes
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Aplicações na imunologia e infectologia
A aplicação clínica mais antiga e uso em larga escala:
quantificar cel. T CD4+ em pacientes com HIV
(diagnóstico e monitorar a efetividade do tratamento
ARV).
Em 2004, no Brasil, 85 citômetros doados pelo Ministério
da Saúde (Programa de AIDS), com controle de
qualidade externo (Mandy FF: Cytometry 2004)
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Flow cytometry reveals T-cell subsets
important in HIV disease Chattopadhyay P, Roederer M Cytometry 2010
Características de resposta imune ao HIV
Ativação, regulação, função e senescência dos
linfócitos T
Importante para o conhecimento da
fisiopatologia e tratamento do HIV
Vacinas ?
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Linfomas e s. linfoproliferativas
A transformação neoplásica pode ocorrer
em qualquer posição do sistema imune
As células linfoides neoplásicas apresentam
alterações de expressão de antígenos em
relação aos normais (fenótipos neoplásicos)
mas conservam o Ag. principal de linhagem
(?)
É a base da classificação OMS
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CD5+
CD10+/BCL-6+BCL-2-
Baço
MALT
CD5-/CD10-
CD38+/CD138+
Medula Óssea
BCL-2+
OMS, 2008
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Linfoma folicular
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Linfomas e s. linfoproliferativas
Usado desde a década de 70
SLP – em sangue periférico
Linfomas – em aspirado de linfonodos, tumores,
líquido pleural, ascítico, pericárdico, liquor, etc.
Vantagem: pode-se estudar sub-populações e
suas características fenotípicas, de proliferação e
apoptose
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Classificação das leucemias agudas
Uma das mais antigas áreas de aplicação
Desde há 15 anos uso da técnica multiparamétrica
Permite distinguir normal x neoplásico – base para
quantificar DRM
Mandatório para LLA, acessório para LMA
Consagrada como técnica de eleição para
diagnóstico, classificação e pesquisa de doença
residual pós-tratamento.
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Racional
na hemopoiese normal, a expressão dos
marcadores de linhagem e de maturação são
coordenados por um grupo de genes que
obedecem a um estreito controle e coordenação.
Nas neoplasias, este mecanismo é rompido
(dissociação de maturação, expressões
aberrantes, promiscuidade de linhagem)
Porém, os principais marcadores de linhagem são
mantidos nas neoplasias (???)
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LMA-M0 com 2 sub-populações
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Síndromes mielodisplásicas
Diagnóstico diferencial entre
SMD e citopenias não-clonais
(casos com cariótipo normal)
procura de fatores prognósticos
para indicar tratamento e TMO
Racional: igual às leucemias
agudas e linfomas
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Papel da citometria de fluxo nas SMDs
Contar blastos, células CD34+ e seus sub-
tipos
Identificar fenótipos aberrantes nos blastos
Estudar alterações na maturação
mielomonocítica e eritroide
Diminuição da produção de linfócitos B
Aumento de apoptose nos precursores
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Quantificação de células-tronco para
terapia celular
CD34+ : em aspirado de medula, produto de
aférese, cordão umbilical (transplantes
alogênico e autólogo), etc
Células mesenquimais de várias origens
(tratamentos ainda experimentais)
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Quantificação de cel. CD34+ em Medula óssea
R2
R1
R1 e R2
R3
R1 e R2 e R3
R4
R1
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NOVAS APLICAÇÕES
Multiparamétrica (> 5 cores) em imunologia
e ciclo celular
Vias de sinalização celular
Toxicidade de nanopartículas
Teste de viabilidade bacteriana
Diagnóstico de malária
Separação de células vivas para cultura
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Toxicologia
Toxicidade de nanomateriais por ex.
Detecção de TiO2 em células em cultura por
citometria – pela mudança no SSC e viabilidade
por PI
Zucker RM et al Cytometry 2010
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MALÁRIA - DETECÇÃO DE PARASITASBhakdi SC et al Cytometry 2007, Shapiro HM. Henning U Cytometry 2010
Objetivo: substituir a “gota espessa”
Técnica baseada em corantes DNA / RNA (YOYO-1, SYTO-
16, acridina orange)
Descrita para roedores (usada desde 1970 para pesquisa de
antimaláricos)
Ex: sangue periférico + acridina orange (diferencia DNA /
RNA) - Leitura em FL1 / FL3 Bhakdi SC et al 2007
Concentração mínima de parasitas detectada 0.3%
Métodos experimentais e necessitando de validação.
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Detecção de proteínas de fusão
Objetivo: substituir o PCR (citometria é mais rápida)
Detecção é importante para introdução rápida de
terapia alvo-específica em leucemias (LLA Ph+ e L.
promielocítica)
Técnica descrita em 2009 – em fase de validação
CBA (cytometric immunobead assay) – é qualitativo
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Ensaio de CBA Weercamp F et al Leukemia 2009
beads recobertos com
anticorpo anti-BCR + anti-
abl-PE (proteína de fusão)
testados com lisado de
células leucêmicas
Leitura no FL2
Células normais não dão
sinal PE +
Só pode ser usada junto com os padrão-ouro (citogenética ou PCR)
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Novos softwares de análise
Lugli E et al Cytometry 2010
Na aquisição multidimensional são gerados conjuntos de
dados (list modes) de até 20 características / célula
Soluções de análise supervisionada e não-supervisionada
Estratégias de gating sequencial, SPICE, análise estatística
dos list modes (cluster analysis, principal component, etc)
Objetivo: encontrar numa amostra, as múltiplas sub-
populações de células e suas interações (imuno, vacinas,
etc)
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O desenvolvimento da citometria
multiparamétrica depende de:
Melhora do hardware
Mais anticorpos e outros reagentes
Melhora dos softwares de análise
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