UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

DISCIPLINA DE TÓPICOS AVANÇADOS EM MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS DE

ORIGEM ANIMAL

APOSTILA DA DISCIPLINA DE TÓPICOS AVANÇADOS EM MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS DE ORIGEM

ANIMAL

Professor Jean Berg Alves da Silva

MOSSORÓ-RN

MAIO/2014

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

DISCIPLINA DE TÓPICOS AVANÇADOS EM MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS DE

ORIGEM ANIMAL

MICRORGANISMOS PATOGÊNICOS EM ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL

DISCENTES: Andressa Medeiros de Mendonça Silva

Francisco Vitor Aires Nunes

Jovilma Maria Soares de Medeiros

INTRODUÇÃO AOS MICRORGANISMOS

A contaminação dos alimentos pode ser de natureza biológica, química ou física. Os contaminantes

biológicos incluem as bactérias, vírus, fungos e parasitas; as contaminações de natureza química podem ser

causadas por diversas substâncias potencialmente tóxicas, entre elas, metais pesados, agrotóxicos,

antibióticos, toxinas de animais e plantas; e as contaminações físicas podem ser causadas por diferentes

materiais estranhos ao alimento, como por exemplo, a presença de vidro ou fragmentos metálicos

(DUARTE, 2011).

Os principais grupos de microrganismos, em especial aqueles que têm maior importância no que diz

respeito à Higiene e Segurança Alimentar são: bactérias, fungos, vírus e protozoários. Segundo (ALVES,

2012):

As bactérias patogênicas causam a maioria dos surtos e casos de doenças transmitidas por alimentos,

não só em número como em frequência. Devido à sua estrutura muito simples e por serem

microrganismos unicelulares, as bactérias replicam-se muito rapidamente caso encontrem nutrientes,

temperatura, pH, umidade e concentração de oxigênio adequados.

Os fungos também podem ser responsáveis por este tipo de doenças. Embora existam fungos que

são benéficos e que, inclusivamente, são utilizados na produção de determinados alimentos, como o

queijo, os iogurtes e a cerveja, existem outros que produzem substâncias tóxicas (micotoxinas) que

são prejudiciais para o homem, podendo causar problemas graves de saúde.

Os vírus são também potenciais causadores de doenças de origem alimentar. São incapazes de se

reproduzirem fora de uma célula viva e não se reproduzem nem sobrevivem por longos períodos em

alimentos, sendo simplesmente transportados por eles. Como exemplo pode referir-se os vírus da

hepatite A e o rotavírus.

Os parasitas/protozoários podem, também, ser responsáveis pela ocorrência de doenças de origem

alimentar. Em geral, são específicos para cada hospedeiro animal e podem incluir o homem no seu

ciclo de vida. As parasitoses estão associadas, principalmente, a alimentos mal processados ou a

alimentos prontos para consumo contaminados. Entre os parasitas que podem encontrar no homem

um hospedeiro, salienta-se a Ascaris lumbricoides, Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica,

Giardia lamblia, Toxoplasma gondii, Fasciola hepática.

Os microrganismos provocam alterações nos alimentos, tais como fermentação, putrefação,

modificação na aparência ou pode simplesmente utilizá-los como veículo de disseminação de doenças. As

alterações por microrganismos ocorrem geralmente em frutas, hortaliças, carnes leites e ovos. Essas

alterações podem causar doenças nos homens que ingeri-lo (WALDER, 2006).

CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS

Segundo Forsythe (2002) o termo microrganismo indicador foi sugerido por Ingram, em 1977, para

um organismo marcador cuja presença indicasse a possível presença de um patógeno ecologicamente

similar. Os microrganismos indicadores são mais comumente utilizados para avaliar a segurança e a higiene

alimentar do que a qualidade. Um indicador de segurança alimentar deve apresentar algumas características

importantes.

Os microrganismos indicadores usualmente utilizados são:

Coliformes;

E. coli;

Enterobactérias;

Estreptococos fecais.

DOENÇAS TRANSMITIDAS POR ALIMENTO (DTA’s)

A Organização Mundial da Saúde (OMS) define as doenças transmitidas por alimentos como uma

“doença de natureza infecciosa ou tóxica causada por ou através de consumo de alimentos ou água

contaminados” por agentes biológicos, químicos e físicos. Os microrganismos podem causar alterações

químicas prejudiciais nos alimentos, resultando na “deterioração microbiana” nos quais, utilizam o

alimento como fonte de energia, podem ser patogênicos, podendo afetar tanto o homem como animais, o

que representa risco à saúde (TEIXEIRA, 2014).

A expressão "doenças de origem alimentar" é tradicionalmente utilizada para designar um quadro

sintomatológico, caracterizado por um conjunto de perturbações gástricas, envolvendo geralmente vômitos,

diarreia, febres e dores abdominais, que podem ocorrer individualmente ou em combinação (PINTO, 1996).

Entre as causas mais frequentes de contaminação dos alimentos, destacam-se a manipulação e

conservação inadequadas dos mesmos, além da contaminação cruzada entre produtos crus e processados

(DUARTE, 2011).

Entende-se por infecção alimentar a doença produzida por bactérias capazes de crescerem no interior

do trato gastrointestinal e de onde são capazes de invadir os tecidos ou os fluídos orgânicos do hospedeiro,

ou de produzir toxinas (enterotoxinas). As infecções manifestam-se pela invasão das mucosas ou pela

produção de enterotoxinas (toxinas que atuam no intestino), de cuja interação criam-se condições

patológicas que resultam em doença (PINTO, 1996).

Este tipo de infecções pode ocorrer por dois mecanismos diferentes: infecção não mediada por

toxinas e a infecção mediada por toxinas (toxinfecção). Na infecção não mediada por toxinas ocorre doença

apenas pela ingestão dos microrganismos que, após colonização, podem penetrar e invadir os tecidos. É o

exemplo da ingestão de alimentos contendo Salmonella Typhi, Shigella, Listeria monocytogenes. Na

infecção mediada por toxinas ocorre produção de toxinas no intestino após a ingestão do alimento

contaminado com a forma vegetativa da bactéria. Escherichia coli enterohemorrágica, Vibrio cholerae,

Bacillus cereus (associado à síndrome emética) são apenas alguns exemplos de gêneros bacterianos com

possibilidade de causar toxinfecção alimentar (ALVES, 2012).

As intoxicações alimentares são causadas pela ingestão de alimentos contento toxinas microbianas

pré-formadas. Estas toxinas são produzidas durante a intensa proliferação do(s) microrganismo(s)

patogênico(s) no alimento. As toxinas de origem bacteriana geralmente não possuem odor ou sabor, não

sendo detectável organolepticamente a sua presença no alimento (FORSYTHE, 2002). Alguns exemplos de

microrganismos produtores de toxinas veiculadas por alimentos são Clostridium botulinum, Clostridium

perfringens, Staphylococcus aureus ou Bacillus cereus (ALVES, 2012).

PRINCIPAIS PATÓGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR

Clostridium botulinum

Botulismo é um tipo severo de intoxicação alimentar causada pela ingestão de alimentos contendo

uma potente neurotoxina formada durante o crescimento do Clostridium botulinum, cujos esporos estão

freqüentemente distribuídos na natureza (RAGAZANI, 2008). A toxina causa quatro tipos reconhecidos de

enfermidades em humanos, incluindo botulismo alimentar, botulismo por feridas, colonização intestinal em

adultos e botulismo infantil. O botulismo alimentar ocorre pela ingestão da toxina pré-formada (CARDOSO

et al., 2004).

É adquirida por consumo de alimentos contaminados, tais como embutidos e conservas caseiras que

não sofreram tratamento térmico adequado, ou foram armazenados em condições que permitiram a

germinação dos esporos do C. botulinum presentes no alimento e a multiplicação do microrganismo, tendo

como consequência a produção da toxina botulínica (MURRAY, ROSENTHAL, PFALLER, 2006; JAY,

2005).

Clostridium perfringens

Uma das mais comuns, embora pouco reconhecida, formas de intoxicação alimentar nos EUA é

causada por Clostridrium perfingrens, um bastonete grande, gram-positivo formador de endósporos e

anaeróbico obrigatório. Essa bactéria também é responsável pela gangrena gasosa humana (TORTORA,

FUNK, CASE, 2005).

A maioria dos surtos de gastroenterite por Clostridrium perfingrens estão associados com carnes ou

ensopados de carne contaminados com conteúdo intestinal do animal durante o abate. A requisição

nutricional de aminoácidos pelo patógeno é atendida por esses alimentos e, quando a carne é cozida, o nível

de oxigênio é reduzido o suficiente para o crescimento da bactéria. Os endósporos sobrevivem à maioria dos

aquecimentos de rotina, e o período de geração da bactéria vegetativa é de menos de 20 minutos sob

condições ideais. Assim, grandes populações podem se acumular rapidamente quando os alimentos estão

sendo guardados até a hora de servir, ou quando a refrigeração inadequada leva ao resfriamento lento (JAY,

2005).

O micróbio cresce no trato gastrointestinal e produz uma exotoxina que causa os sintomas típicos de

dor abdominal e diarreia. A maioria dos casos são leves e autolimitados e provavelmente não são

clinicamente diagnosticados. Os sintomas geralmente surgem de 8 a 12 horas após a ingestão. O diagnóstico

com frequência é baseado no isolamento e na identificação do patógeno em amostras de fezes (MURRAY,

ROSENTHAL, PFALLER, 2006).

Escherichia coli

Um dos microrganismos mais prolíficos no trato intestinal humano é E. coli. Essas bactérias

normalmente são inofensivas, mas certas linhagens podem ser patogênicas. Todas as linhagens patogênicas

possuem fimbrias especializadas que permitem que elas se liguem a certas células do epitélio intestinal. Elas

também produzem toxinas que causam distúrbios gastrointestinais, denominados coletivamente

gastroenterites por E. coli (MURRAY, ROSENTHAL, PFALLER, 2006).

Existem vários grupos patogênicos distintos de E. coli. A linhagem enterotoxigênica não é invasiva,

mas forma uma enterotoxina que produz uma diarreia aquosa que lembra um tipo leve de cólera. Uma outra

linhagem patogênica de E. coli é chamada de enteroinvasiva. Esses microrganismos invadem a parede

intestinal, resultando em inflamação, febre e algumas vezes disenteria do tipo Shigella (MURRAY,

ROSENTHAL, PFALLER, 2006).

Essas duas linhagem de E. coli são causas frequentes da diarreia dos viajantes e, nos países em

desenvolvimento e boa parte das diarreia dos lactentes. Provavelmente a maioria dos casos de diarreia dos

viajantes seja causada por E. coli enterotoxigênica. Na maioria das vezes, o agente causador nunca é

identificado. A diarreia dos viajantes é geralmente autolimitada, e frequentemente não se faz uma tentativa

com quimioterapia. Uma vez que seja contraída, o melhor tratamento é a reidratação oral recomendada para

todas as diarreias (TORTORA, FUNK, CASE, 2005).

Recentemente, as linhagens enterohemorrágicas de E. coli tornaram-se bem conhecidas nos Estados

Unidos como causa de vários surtos de doença grave. Estima-se que esses surtos deixem mais de 60 mil

pessoas doentes, com mais de 50 fatalidades a cada ano nos EUA. Ela tem dois grandes fatores de

virulência: a capacidade de aderir à mucosa intestinal e a produção da toxina Shiga. As E. coli

enterohemorrágicas são encontradas no trato gastrointestinal de muitos animais; pelo menos 50% do gado

criado para venda está contaminado, por exemplo. Como resultado da infecção dos animais de fazenda, o

Departamento de Agricultura Norte-Americano descobriu que cerca de 90% da carne moída está

contaminada, embora geralmente em níveis baixos. Essas carnes, se não forem bem cozidas, são uma fonte

potencial de infecção (TORTORA, FUNK, CASE, 2005; JAY, 2005). A carne de aves e de outros animais

também podem estar contaminadas, mas brotos de alfafa crus têm sido responsáveis pela maioria dos casos

relatados (JAY, 2005).

Em humanos, as toxinas Shiga frequentemente causam somente uma diarreia autolimitada, mas em

cerca de 6% das pessoas infectadas ela produz uma inflamação no cólon com sangramento profuso, chamada

de colite hemorrágica. Diferente da Shigella estas E. coli não invadem a parede intestinal, mas liberam a

toxina na cavidade intestinal (TORTORA, FUNK, CASE, , 2005).

Salmonella spp

As bactérias Salmonella são bastonetes Gram-negativos, anaeróbios facultativos e não formadores de

esporos. Seu habitat normal é o trato intestinal dos seres humanos e de muitos animais. Todas as Salmonella

são consideradas patogênicas em algum grau, causando salmonelose, ou gastroenterites (TORTORA,

FUNK, CASE, 2005).

A salmonelose tem um período de incubação de cerca de 12 a 36 horas. A bactéria primeiro invade a

mucosa intestinal e se multiplica ali. Ocasionalmente, passa através da mucosa intestinal para penetrar no

sistema linfático e cardiovascular e dali pode se disseminar para afetar muitos órgãos. Normalmente há febre

moderada, acompanhada de náuseas, dor abdominal, cólicas e febre (MURRAY, ROSENTHAL, PFALLER,

2006).

A taxa de mortalidade geralmente é muito baixa, provavelmente menos de 1%. Contudo, é maior em

lactentes e indivíduos idosos; a morte geralmente é por choque séptico. Normalmente, a recuperação é

completa em alguns dias, mas muitos pacientes continuam a disseminar o organismos nas suas fezes por até

6 meses (MURRAY, ROSENTHAL, PFALLER, 2006).

Produtos a base de carne são particularmente suscetíveis à contaminação por Salmonella. As fontes de

bactérias são os tratos intestinais de muitos animais, e a carne, especialmente de frango, pode ser

contaminada facilmente em fábricas de processamento. Surtos de salmonelose foram rastreados até ovos

contaminados. Aparentemente, as bactérias são transmitidas aos ovos antes de serem postos, embora

galinhas possam ser assintomáticas. As autoridades de saúde advertem o publico para ingerir somente ovos

bem cozidos. Ovos fritos somente de um lado ou fervidos somente por 4 minutos não estão cozidos o

suficiente para matar a salmonela de forma confiável (JAY, 2005).

O sorotipo de Salmonella mais virulento, S. typhi, causa a infecção bacteriana chamada de febre

tifoide. Esse patógeno não é encontrado em animais; é disseminado somente nas fezes de outros seres

humanos. Antes do saneamento básico adequado, do tratamento da água e da higiene dos alimentos, a febre

tifoide era uma doença extremamente comum. Sua incidência tem declinado, enquanto que a da salmonelose

tem aumentado (MURRAY, ROSENTHAL, PFALLER, 2006).

Staphylococcus aureus

Uma das principais causas de gastroenterites é a intoxicação alimentar estafilocácica, uma

intoxicação causada pela ingestão de uma enterotoxina produzida por S. Aureus. OS estafilococos são

comparativamente resistentes aos estresses ambientais. Eles também possuem uma resistência bastante alta

ao calor; as células podem tolerar 60º C por meia hora. Sua resistência ao ressecamento e radiação auxilia-os

a sobreviver nas superfícies cutâneas. A resistência a pressões osmóticas elevadas auxilia-os a crescer em

alimentos, como presunto salgado, em que a alta pressão osmótica dos sais inibe o crescimento de

competidores (TORTORA, FUNK, CASE, 2005).

S. Aureus habita frequentemente as passagens nasais, a partir das quais contamina as mãos. Dessas

fontes, pode facilmente penetrar no alimento. Se os micróbios são deixados incubando no alimento, eles

reproduzem-se e liberam enterotoxina no alimento. São esses eventos que levam a surtos de intoxicação

alimentar (TORTORA, FUNK, CASE, 2005).

Geralmente, uma população de cerca de 1 milhão de bactérias por grama de alimento produzirá

enterotoxina suficiente para causar a doença. O crescimento do microrganismo é facilitado se os

microrganismos competidores no alimento são eliminados (TORTORA, FUNK, CASE, 2005).

Pudins, tortas de creme e presuntos são exemplos de alimentos de alto risco. Os micróbios

competidores são minimizados em pudins pela alta pressão osmótica do açúcar e pelo cozimento. No

presunto, eles são inibidos por agentes de cura como os sais e os conservantes. Os produtos derivados de

aves também podem abrigar estafilococos se forem manuseados e deixados por algum tempo em

temperatura ambiente. Qualquer alimento preparado com antecedência e não mantido em refrigeração é uma

fonte potencial de intoxicação alimentar estafilocócica. Uma vez que a contaminação do alimento por mãos

humanas não pode ser evitada completamente, o método mais confiável de prevenir a intoxicação é a

refrigeração adequada durante o armazenamento, para impedir a formação da toxina (TORTORA, FUNK,

CASE, 2005).

A toxina em si é termoestável e pode sobreviver por até 30 minutos de fervura. Assim, uma vez que a

toxina é formada, não será destruída quando o alimento for reaquecido, embora as bactérias sejam mortas

(JAY, 2005). A toxina ativa rapidamente o centro reflexo do vômito no cérebro, cólicas abdominais e

diarreias geralmente vêm a seguir. Essa reação é essencialmente de caráter imunológico; a enterotoxina

estafilocócica é um modelo de superantígeno. A recuperação ocorre normalmente dentro de 24 horas

(MURRAY, ROSENTHAL, PFALLER, 2006).

Víbrio spp

As bactérias causadoras da cólera são fortemente associadas com as águas salobras características de

estuários, embora elas também sejam rapidamente espalhadas em água potável contaminada. Os organismos

podem sobreviver indefinidamente, mesmo sem novas contaminações fecais. Sob condições favoráveis, as

células bacterianas encolhem drasticamente para um estado esférico latente, não cultivável. Esse evento tem

sido descrito como um estado tipo esporo sem formação de um efetivo revestimento de esporos. Uma

mudança no ambiente faz com que revertam rapidamente para a forma cultivável. Ambas as formas são

infecciosas. O agente causal é o Vibrio cholerrae, um bastonete Gram-negativo levemente curvo, com um

único flagelo polar (TORTORA, FUNK, CASE, 2005).

As bactérias da cólera crescem no intestino delgado e produzem uma exotoxina, a toxina colérica, que

faz as células do hospedeiro secretarem cloretos, bicarbonatos e água. A perda súbita de eletrólitos e liquido

causa choque, colapso e, frequentemente morte. Devido a perda de liquido, o sangue torna-se tão viscoso

que os órgãos vitais são incapazes de funcionar adequadamente. Os micróbios não são invasivos, e a febre

geralmente não está presente (MURRAY, ROSENTHAL, PFALLER, 2006).

Outros Vibrio causam uma gastroenterite que é geralmente mais branda que a cólera. O Vibrio

parahaemolyticus é encontrado em estuário de água salgada em muitas partes do mundo. Ostras cruas e

crustáceos, como camarão e siri, foram associados a gastroenterites por essa bactéria. Outro vibrião

importante é o Vibrio vulnificus, que também é encontrado em estuários. Ele leva a uma invasão da corrente

sanguínea potencialmente fatal (TORTORA, FUNK, CASE, 2005).

Campylobacter spp

O gênero Campylobacter apresenta aproximadamente 14 espécies, sendo a mais importante delas o

C. jejuni. Os Campylobacter spp são bacilos Gram-negativos não esporogênicos e microaerófilos, muito

sensíveis à desidratação e temperaturas de cocção. O C. jejuni é principalmente associado a animais de

sangue quente e algumas linhagens produzem uma enterotoxina termoestável. Dentre os alimentos

responsáveis pelos surtos o leite cru ou insuficientemente pasteurizado é apontado como principal, assim

como seus derivados. Além disso, as carnes de aves ocupam lugar de destaque nas infecções, como também

as gemas de ovos e água não clorada (JAY, 2005; GERMANO e GERMANO, 2011). Isso é observado em

um estudo realizado por Carvalho e Cortez (2003) que ao avaliar a qualidade microbiológica de produtos

avícolas industrializados e seus derivados observaram que 32,6% das amostras apresentavam-se

contaminadas por C. jejuni. Este microrganismo pode ser transmitido por contato com animais infectados ou

por ingestão de água ou alimentos contaminados e ao se estabelecer no trato intestinal humano pode

provocar diarreia profusa e outros sintomas associados como febre, cefaleia, mal-estar, dores musculares,

sendo esses sintomas cessados entre 2 a 7 dias Os grupos mais susceptíveis à infecção são crianças menores

de 4 anos, os jovens entre 15 e 24 anos, os idosos, os imunocomprometidos e os manipuladores de alimentos

e as formas de prevenção dizem respeito a utilização de água tratada, higiene de manipuladores e

manipulação e conservação dos alimentos em temperaturas adequadas (FORSYTHE, 2002; GERMANO e

GERMANO, 2011).

Listeria monocytogenes

Entre as espécies pertencentes ao gênero Listeria a mais importante, em termos de saúde pública, é a

L. monocytogenes, por ser a mais patogênica para o homem. As listerias são bastonetes Gram-positivos, não

esporulados e apresentam como maior característica a capacidade de se multiplicar à temperatura de

refrigeração, em meios simples sem grandes exigências nutricionais. A L. monocytogenes pode ser isolada

de produtos lácteos, leite cru ou pasteurizado, sorvetes e queijos, produtos crus de origem vegetal, de origem

marinha, refeições preparadas, peixes crus ou defumados e em produtos cárneos crus ou termoprocessados

de diversas origens (JAY, 2005; GERMANO e GERMANO, 2011). Neste último grupo de alimentos Silva

et al. (2004) encontraram L. monocytogenes em 16,66% de amostras de linguiças prontas para o consumo

coletadas de três frigoríficos de Pelotas, RS. Ao ingerir o alimento contaminado pode-se iniciar um processo

infeccioso que apresenta sintomas semelhantes aos da gripe e posteriormente os sintomas gastrointestinais.

Atenção especial é dada as gestantes e pessoas imuossuprimidas, sendo recomendadas como medidas de

prevenção o controle integrado de pragas e as condições higiênicas adequadas na produção de alimentos

(FORSYTHE, 2002; JAY, 2005; GERMANO e GERMANO, 2011).

Shigella

O gênero Shigella é composto por quatro espécies distintas, sendo a S. dysenteriae o principal

patógeno que causa a disenteria bacilar clássica. Esse microrganismo é um bacilo Gram-negativo e mesófilo

típico e algumas de suas cepas ao se multiplicarem produzem a shigatoxina. A falta de higiene pessoal é um

fator comum nos casos de infecção alimentar, sendo os alimentos veículo mais envolvidos os crustáceos,

vegetais crus, saladas, galinha, leite e derivados, além da água, que é apontada como a principal causa de

infecção (JAY, 2005; GERMANO e GERMANO, 2011). Ao analisar um desses alimentos veículo Okura et

al. (2005) encontraram 10,8% de isolados de Shigella sp em amostras de leite cru de microrregiões do

Triângulo Mineiro, MG. Ao ingerir alimentos contaminados com S. dysenteriae pode-se iniciar um processo

inflamatório que ocasiona fezes com sangue e muco, acompanhada de dores abdominais, febre e vômitos,

que podem persistir por até 7 dias. As pessoas mais expostas a essa infecção são as crianças entre 1 e 4 anos

de idade, idosos e pessoas debilitadas, recomendando-se como medidas preventivas a higiene pessoal e de

instalações, o saneamento ambiental e o controle integrado de pragas (FORSYTHE, 2002; JAY, 2005;

GERMANO e GERMANO, 2011).

Yersinia

A Y. enterocolitica é um bacilo Gram-negativo que apresenta a capacidade de se desenvolver em

temperatura de refrigeração. Essa bactéria é geralmente encontrada no ambiente, sendo distribuída no solo e

em águas, as quais são fontes do organismo para animais de sangue quente. A Y. enterocolitica foi isolada

de alimentos como frutos do mar, leite e carnes em geral, sendo a suína uma fonte importante de linhagens

patogênicas em humanos. Após a ingestão de alimentos ou água contaminada a célula bacteriana se

multiplica, produzindo a reação inflamatória e os sintomas de diarreia, dores abdominais e febre. Essa

infecção é mais presente em crianças menores de 7 anos, idosos e pessoas debilitadas, além de também

acometer pessoas que exercem atividades de contato direto com animais para o abate. Para o controle, é

necessário então adotar medidas de higiene em abatedouros e em locais de processamento de alimentos,

assim como evitar o consumo de carne suína crua (JAY, 2005; GERMANO e GERMANO, 2011).

IMPACTO DAS DTA’s PARA SAÚDE PÚBLICA E ECONOMIA GERAL

As doenças causadas por agentes microbianos transmitidos por alimentos constituem preocupação

mundial de saúde pública. Nos últimos anos, a incidência de doenças transmitidas por alimentos tem

aumentado em várias partes do mundo, (BRASIL, 2010) sendo são responsáveis por centenas de mortes,

milhares de hospitalizações e possivelmente complicações irreversíveis (GERMANO e GERMANO, 2011).

Muitos casos de enfermidades causadas por alimentos não são notificadas, pois seus sintomas são

geralmente parecidos com gripes (FORSYTHE, 2002). No Brasil, segundo a Secretaria de Vigilância em

Saúde foram registrados 6.062 surtos de DTA’s no período de 1999 a 2008 (GARCIA e DUARTE, 2014).

Os dados do Sistema de Informações Hospitalares (SIH) do Ministério da Saúde, de 1999 a 2004, mostram a

ocorrência de 3.410.048 internações por DTA com uma média de 568.341 casos por ano, sendo as Regiões

Norte e Nordeste as que apresentam as maiores taxas de incidência (BRASIL, 2005).

Quando se agrega grande número de casos, vê-se que as DTA’s são extremamente custosas. Estima-

se que o custo das DTA nos EUA é de 5 a 6 bilhões de dólares em gastos diretos e perda de produtividade.

No Brasil, os custos com os casos internados por DTA, de 1999 a 2004, pelo SIH, chegam a 280 milhões de

reais, com média de 46 milhões de reais por ano (BRASIL, 2005). Diante do exposto, percebe-se que a

vigilância global de problemas e doenças de origem alimentar pode ter um papel importante na detecção

precoce e na advertência, assim como na rápida investigação e controle de tais problemas. Ela ainda pode

limitar a extensão e a distribuição do problema, prevenindo, dessa forma, muitos casos de enfermidades e

minimizando o impacto negativo no mundo de negócios e na economia dos países (FORSYTHE, 2002).

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Curso de Nutrição, UNIMEP, Piracicaba, SP. 2006. 18p.

USO DE MICRO-ORGANISMOS NA CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL

Bárbara Monique de Freitas Vasconcelos

Lara Barbosa de Souza

MOSSORÓ-RN

MAIO/2014

Com a evolução das civilizações, surgiu a necessidade de estocar e conservar os alimentos. Desde o momento em

que são colhidos, durante o processamento ou estocagem até o consumo, os alimentos estão sujeitos a vários

fatores que podem interferir em sua composição, podendo sofrer deterioração, causadas principalmente por

micro-organismos, enzimas e reações com o oxigênio do ar (SOUSA et. al., 2012).

A alimentação de indivíduos com estilo de vida saudável tende a ser, um ato prazeroso e que ao mesmo tempo,

visa a saúde e o bem estar. Atualmente a indústria de alimentos enfrenta grandes desafios para atender aos

anseios do consumidor, buscando oferecer alimentos mais saborosos e ao mesmo tempo seguros. Alimentos

processados, livre de aditivos químicos e submetidos a tratamentos térmicos cada vez mais brandos, a fim de que

estes sejam o mais natural possível e estejam livres de contaminantes. Alguns patógenos alimentares, como a

Listeria monocytogenes e a Escherichia coli O157:H7, bactérias extremamente nocivas à saúde, podem levar à

abortos e até mesmo ao óbito, emergiram à medida que houve um maior consumo de produtos refrigerados.

Assim, há um crescente interesse pelos chamados bioconservantes alimentares (REBELLO&GASPAS, 2010).

As doenças transmitidas por alimentos (DTAs) apresentam grandes índices de mortalidade, principalmente em

crianças, idosos e adultos imunosuprimidos, necessitando, portanto, desenvolver alternativas para conservação

que, associadas às tecnologias já existentes, seja possível disponibilizar à população, alimentos de melhor

qualidade e mais seguros sob o ponto de vista microbiológico e toxicológico (JAY, 2000). Com o aumento do

consumo de alimentos refrigerados e congelados prontos, atendendo à demanda de mercado, aumenta também o

risco do consumo de alimentos contaminados com microrganismos pscicrófilos. Os consumidores têm buscado

alimentos de fácil preparo e mais próximos do sabor caseiro.

As técnicas tradicionais de conservação dos alimentos, como a utilização de temperaturas elevadas, refrigeração

ou congelamento, têm sua eficácia comprometida quando não utilizadas da maneira adequada, sendo assim

importante o desenvolvimento de novas alternativas e que sejam conciliadas com métodos mais modernos e

naturais de proteção do alimento sem que alterem suas características. Diversos micro-organismos e seus

metabólitos vêm sendo utilizados na conservação de alimentos. A ideia de utilizar micro-organismos para

conservar os alimentos, ocorreu por acaso, pois todos os alimentos conservados por algum processo de

colonização microbiana ou transformados em outros produtos por processos fermentativos, podem ser

considerados como métodos de conservação por antagonismo entre os micro-organismos (PAZ, 2001).

A biopreservação é uma técnica utilizada para estender a vida útil dos alimentos e aumentar a sua segurança por

meio da aplicação de uma microbiota protetora como das bactérias ácido-láticas, utilizando-se de suas

propriedades antibacterianas, atribuídas aos produtos finais do seu metabolismo como ácidos orgânicos, peróxido

de hidrogênio, diacetaldeídos, reuterina e seus peptídeos antimicrobianos, as bacteriocinas (SCHULZ et al.,

2003; VÁSQUEZ et al., 2009).

Praticamente todas as bactérias são capazes de produzir substâncias in vitro, que podem ser inibitórias tanto para

elas mesmas quanto para outras bactérias, podendo produzir efeito bactericida ou bacteriostático (JACK et

al.,1995). Essas substâncias podem ser: toxinas, enzimas bacteriolíticas como lisostafina, fosfolipase A e

hemolisinas; subprodutos das vias metabólicas primárias como ácidos orgânicos, amônia e peróxido de

hidrogênio e vários outros metabólitos secundários; substâncias antibióticas como garamicina, valinomicina e

bacitracina, que são sintetizadas por complexos multienzimáticos (sua biossíntese, ao contrário dos agentes tidos

como bacteriocinas, não é diretamente bloqueada por inibidores ribossomais da síntese de proteínas);

bacteriocinas (são proteínas antimicrobianas ou complexos protéicos, usualmente um peptídeo, ativos contra

espécies bacterianas).

Bacteriocinas são peptídios ou proteínas antimicrobianas sintetizadas nos ribossomos das células bacterianas e

liberadas no meio extracelular que apresentam ação bactericida ou bacteriostática sobre microrganismos

taxonomicamente relacionados. Além disso, não promovem alteração na qualidade sensorial do produto,

observando-se o crescente interesse da indústria de alimentos sobre o potencial de utilização destes compostos

em substituição aos conservantes químicos (NASCIMENTO; MORENO; KUAYE, 2008).

Do ponto de vista industrial, as bacteriocinas podem ser uma alternativa muito interessante de agente

antimicrobiano natural para conservação de alimentos. Diante disso, tudo indica que conservadores naturais,

particularmente em adição ou combinação sinergística com outros fatores e técnicas; que já estão em uso, terão

um papel importante em um futuro próximo, principalmente se estes agentes tenham nos alimentos a mesma ação

efetiva verificada em ensaios laboratoriais (GOLD, 1996).

Grande parte dos estudos sobre biopreservação dos últimos anos está concentrada sobre as bacteriocinas,

enfatizando-se sua detecção, produção, purificação,

mecanismo de ação, caracterização bioquímica, propriedades bactericidas, microrganismos inibidores ou

sensíveis e aplicação com êxito na bioconservação de alimentos, como é o caso da nisina (VÁSQUEZ et al.,

2009 ). Pesquisas com bacteriocinas de bactérias láticas têm-se expandido, suas propriedades antagonistas sobre

outros microrganismos aliadas à história de seu uso em produtos fermentados tradicionais as tornam muito

atrativas para serem utilizadas como bioconservantes. Como as bactérias láticas ocorrem naturalmente em muitos

alimentos fermentados, suas bacteriocinas podem ser mais facilmente aceitas como aditivos alimentares pelas

autoridades de saúde e pelos consumidores (ROSA& FRANCO, 2002). Uma vez que a adição de antibióticos não

é permitida em alimentos, as bacteriocinas tornam-se um interessante grupo de biomoléculas com propriedades

microbianas que representam uma boa alternativa. O interesse por esses compostos tem estimulado o isolamento

e a caracterização de peptídios antimicrobianos produzidos por bactérias láticas (PARADA et al., 2007). Desta

forma, a busca por bacteriocinas de micro-organismos considerados seguros como bioconservantes, como as

bactérias láticas, será de grande valia como potencial inibidor de patógenos e deterioradores alimentares.

A utilização de barreiras adicionais para preservar a proliferação microbiana em alimentos refrigerados tem sido

recomendada. Uma barreira que é bem aceita pelos consumidores por ser “natural” e benéfica para a saúde é o

uso da bioconservação. A utilização de culturas protetoras pode contribuir aumentando a segurança e a

atratividade sensorial dos produtos, e ainda fornecer níveis elevados e constantes de qualidade e vida-de-

prateleira (HAMMES&KNAUF, 1994; KROCKEL, 1999).

Apesar do grande número de pesquisa sobre a aplicação de bacteriocinas em bioconservação, o uso efetivo

desses compostos em alimentos ainda é bastante limitado, particularmente às produzidas por Bacillus spp. A

nisina é a única bacteriocina disponível comercialmente para conservação de alimentos. Diversos países

permitem o uso de nisina em produtos como leite, queijo, produtos lácteos, tomates e outros vegetais enlatados,

sopas enlatadas, maionese e alimentos infantis. No Brasil, a nisina é aprovada para uso em todos os tipos de

queijo no limite máximo de 12,5 mg/kg e nosso país é pioneiro na utilização dessa bacteriocina em produtos

cárneos, sendo permitida a sua aplicação na superfície externa de salsichas de diferentes. O produto pode ser

aplicado como solução comercial de nisina a 0,02% em solução de ácido fosfórico grau alimentício. De modo

geral, a nisina é ativa apenas frente a bactérias Gram positivas e seus esporos, não afetando as Gram negativas,

bolores e leveduras (DE MARTINIS, et al. 2002).

Nos últimos 20 anos, a redução no custo e a maior disponibilidade no mercado de enzimas tem estimulado o

interesse da indústria na aplicação desses catalisadores biológicos no processamento de alimentos. Proteases de

Bacillus amyloliquefaciens são muito utilizadas na produção de queijos, com intuito de melhorar o sabor. Essas

enzimas também são usadas para remover proteínas aderidas à espinha de peixes, que são difíceis de serem

removidas mecanicamente, sendo posteriormente usadas na fabricação de enlatados e sopas. Na indústria de

panificação, as proteases são usadas na hidrólise parcial do glútem de farinhas para massas de pães, bolos e

biscoitos. A subtilisina de Bacilus subtilis vem sendo utilizada para proteólise de proteínas de soja na produção

de molho de soja. Além de melhorar a capacidade emulsificante na produção de salsichas e mortadelas, as

proteínas hidrolisadas de soja melhoram o sabor de carnes curadas. Muitas dessas substâncias precisam ainda ser

descobertas e melhor caracterizadas par para utilização pela indústria alimentícia (TUCKER;WOODS; 1995;

CHAPLIN, BUCKE; 1990).

As bacteriocinas produzidas por bactérias ácido-láticas (BAL) despertam grande interesse na fermentação

industrial de alimentos, com capacidade de inibir o desenvolvimento de vários micro-organismos, sejam eles

patogênicos ou deteriorantes, em vários tipos de alimentos, na qual, sua efetividade é freqüentemente relacionada

à fatores ambientais, tais como pH, temperatura, composição, estrutura e microbiota do alimento, ressaltando

que, os alimentos são complexos ecossistemas, o qual ocorrem inúmeras interações com os microrganismos em

que, o balanço e a multiplicação microbiana e a ação benéfica ou maléfica sobre eles, possuem grandes variáveis.

Dentre alguns microrganismos que as bacteriocinas de BAL exercem inibição destacam-se Listeria

monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Clostridium botulinum (BREDHOLT et al., 2001; DE

MARTINIS et al., 2001; FIORENTINI et al., 2001; GUEDES NETO et al., 2005; MELO; SOARES;

GONÇALVES, 2005; SOUZA; SILVA; SOUZA, 2005).

A partir das últimas décadas, o setor de embalagens ativas apresentou grandes

avanços, com a incorporação de substâncias antimicrobianas em superfícies de embalagens, utensílios de preparo

de alimentos, materiais higiênicos, dentre outros. A fim de combater os mais diversos tipos de microrganismos

patogênicos e de outros deteriorantes, a incorporação de substâncias antimicrobianas tem por finalidade

ocasionar a liberação gradativa destas substâncias, sobre a superfície do alimento, reduzindo ou até mesmo

inibindo o crescimento destes microrganismos nos alimentos, melhorando o alimento quanto os aspectos de

segurança microbiológica, além de aumentar o tempo de vida-de-prateleira, através de sua ação em micro-

organismos deterioradores (APPENDINI; HOTCHKISS, 2002; LIMJAROEN et al., 2003; PADGETT; HAN;

DAWSON, 1998).

Os fungos, também são capazes de produzir substâncias de potencial biotecnológico. Estes micro-organismos,

especialmente o gênero Streptomyces possuem a capacidade de sintetizar muitos metabólitos secundário ativos

diferentes biologicamente, como antibióticos, herbicidas, pesticidas, antiparasíticos, além de enzimas como

amilases, celulases, lípases, xilanases. Destes compostos, os antibióticos se destacam devido à sua importância

comercial e terapêutica. A maioria dos actinomicetos endofíticos isolados apresentam atividade antibiótica contra

bactérias Gram-positivas e Candida albicans e fraca atividade contra bactérias gram-negativas (STAMFORD,

1998). Rodrigues (2006), estudando a atividade biocida de actinomicetos, pode observar que a maioria inibiu

bactérias Gram-positivas, dentre elas Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus e Bacillus cereus.

Pesquisadores do mundo inteiro têm procurado alternativas de combate às bactérias patogênicas. Uma dessas

alternativas é a utilização de bacteriófagos como controle biológico, por serem vírus que infectam unicamente

bactérias (STEVEN &

LOESSMER, 2007). Segundo Greer (2005), infecções por bacteriófagos durante a fermentação industrial de

produtos de lacticínio, foram uma das primeiras evidências documentadas da existência de bacteriófagos em

ambientes de produção de alimentos. No ano de 2000, os estudos de Wommack e Colwel concluíram que a

adição de partículas virais concentradas tendem a diminuir a população bacteriana em 20 a 40%

(WITHEY, 2005).

Em 2004 foi publicado artigo sobre a comercialização de um fago que mata a

bactéria Escherichia coli O157:H7; e um fago capaz de remover patógenos de carcaças e áreas de preparo de

alimentos está sendo desenvolvido (THIEL, 2004). Em 2005, estudos demonstraram que a administração oral de

uma mistura de bacteriófagos permite a redução da colonização a nível intestinal de frangos experimentalmente

infectados, diminuindo assim a possibilidade da contaminação dos produtos derivados deles (BORIE et al, 2008).

Em agosto de 2006, a Administração de Drogas e Alimentos dos Estados Unidos (FDA) aprovou o uso de um

preparo de bacteriófagos que tem como alvo a bactéria Listeria, muitas vezes presente na carne de produtos

derivados de

aves (GARCIA, et al, 2008).

As pesquisas recentes na biologia molecular dos bacteriófagos têm enriquecido as possibilidade de aplicações

biotecnológicas, tais como na fagoterapia, biosanitarização, biocontrole e bioconservação de produtos animais e

alimentícios, além de sistemas de identificação de bactérias (GARCIA, et al., 2008). Outro campo promissor é o

uso de bacteriófagos como antibacterianos naturais em produtos alimentícios, no intuito de inibir o crescimento

de bactérias contaminantes. Esta estratégia de controle da população microbiana contaminante poderia trazer

mais segurança uma vez que bacteriófagos não infectam células eucariontes e as drogas antimicrobianas muitas

vezes apresentam certo nível de toxicidade (GARCIA, et al, 2008).

O uso de micro-organismos no controle de populações bacterianas patogênicas apresenta elevado potencial no

contexto de controle microbiológico de alimentos considerando o panorama atual de resistência à

antibioticoterapia e a proibição do uso destas substâncias em diversos alimentos. Assim, microrganismos e seus

metabólicos devem ser estudados quanto à sua atividade antagônica à espécies patogênicas e deteriorantes em

alimentos e testados quanto à viabilidade de aplicação na conservação de alimentos de origem animal.

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

GERMANA GUIMARÃES REBOUÇAS

JARDEL BEZERRA DE SOUZA

RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE MICRO-ORGANISMOS ISOLADOS DE

ALIMENTOS

Mossoró-RN Maio – 2014

RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE MICRO-ORGANISMOS

ISOLADOS DE ALIMENTOS

I. INTRODUÇÃO

A primeira substância com propriedades antibacterianas foi descoberta em 1928 por Alexander

Fleming em seus estudos com o fungo Penicillium notatum, micro-organismo capaz de produzir a substância

naturalmente, à qual Fleming denominou penicilina (FLEMING, 1929). Em 1942, Waksman referiu-se pela

primeira vez a todos os compostos naturais com estas propriedades e de origem microbiana, pelo termo

antibiótico (CALDERON; SABUNDAYO, 2007).

Hoje em dia, o termo antibiótico engloba não apenas os compostos naturais originados do

metabolismo secundário dos micro-organismos, mas também os compostos sintéticos (ex: quinolonas,

sulfamidas) ou semi – sintéticos, utilizados para o tratamento de infecções no homem, nos animais e nas

plantas. Contudo, recebem denominações diferenciadas quando são utilizados nos animais e nas plantas,

sendo classificados como “drogas antimicrobianas veterinárias” e “pesticidas” respectivamente (IFT, 2006).

O termo antimicrobiano abrange os antibióticos, desinfetantes, higienizantes, antimicrobianos

alimentares, além de outras substancias microbicidas. Os antimicrobianos alimentares são utilizados com a

intenção de inibir o crescimento microbiano ou retardar a deterioração do alimento, tais como as

bacteriocinas (IFT, 2006).

O modo de ação dos antibióticos depende da célula – alvo ao qual se associa para exercer suas

propriedades, bacteriostáticas, bacteriocidas ou bacteriolíticas. Isto é, cada antibiótico tem um alvo

específico nas células bacterianas, humanas ou vegetais. O grupo dos antibióticos beta-lactâmicos, por

exemplo, atuam na síntese da parede celular (WALSH, 2003; TENOVER, 2006; ALEKSHUN; LEVY,

2007; FERNANDES, 2008).

Os principais pontos de ação dos antibióticos são a inibição da síntese do peptideoglicano da parece

celular bacteriana, lesão da membrana citoplasmática e interferência na síntese de ácido nucléico e proteínas.

Assim, a quimioterapia antimicrobiana baseia-se na toxicidade seletiva: matar ou inibir o micro - organismo

sem afetar o hospedeiro. Esta toxicidade consiste nas diferenças entre a estrutura e a composição química

das células procarióticas e eucarióticas (TRABULSI R.L. & ALTERTHUM F., 2008; KRIEG C. E. C. S. &

JUNIOR N. R. P., 1997; TORTORA et al., 2007)

De acordo com a ANVISA, para que um antimicrobiano exerça sua atividade, primeiramente deverá

atingir concentração ideal no local da infecção, ser capaz de atravessar, de forma passiva ou ativa, a parede

celular, apresentar afinidade pelo sítio de ligação no interior da bactéria e permanecer tempo suficiente para

exercer seu efeito inibitório.

Com a disseminação do uso dos antibióticos, tem-se verificados nos últimos 10 a 15 anos um

aumento na resistência de diversos patógenos as drogas utilizadas na terapêutica (ROESCH et al., 2006). A

resistência crescente às inúmeras drogas antimicrobianas revela-se um grande problema na medicina

humana e veterinária (LEVY, 1998), pois constantemente bactérias resistentes são encontradas em alimentos

de origem animal (PALERMO NETO; ALMEIDA, 2006).

A resistência bacteriana pode ser encontrada em micro-organismos isolados de animais produtores de

alimentos, tornando os alimentos de origem animal vias de transferência de bactérias resistentes ao homem

através da cadeia alimentar (RAJALA-SCHULTZ et al., 2004). No trato gastrointestinal genes responsáveis

pela resistência antimicrobiana podem ser transferidos a outras bactérias (WITTE, 2000) da mesma espécie

ou de espécies diferentes, patogênicas ou não (FOOD AND DRUG ASSOCIATION, 2002).

II. MICRO-ORGANISMOS EM ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL

As Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA), Doenças Veiculadas por Alimentos (DVA) ou

simplesmente toxinfecções compreendem mais de 250 tipos, onde muitas são resultados da ingestão de

alimentos contaminados por micro-organismos patogênicos, resultando em sérios ricos para a saúde dos

consumidores, além de grandes perdas econômicas (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND

PREVENTION, 2006; SILVA, 2008; BUZBY; ROBERTS, 2009).

Surtos de DVA geralmente estão associados ao consumo de alimentos visivelmente bons, isto é, de

boa aparência, sabor e odor normais. Desse modo, os alimentos causadores de doenças alimentares são, por

vezes, difíceis de serem identificados, pois a concentração microbiana necessária é menor do que a

concentração necessária para degradar os alimentos. Por isso, alimentos notoriamente contaminados são

raramente responsáveis por surtos, já que suas características organolépticas são desagradáveis e provocam

sensação repulsiva. Nessa situação a contaminação microbiana pode ultrapassar 108 UFC/g do alimento, e o

hábito de “provar para ver se está bom” pode ser bastante arriscado (FORSYTHE, 2010).

O quadro clínico dos pacientes com DVA variam de acordo com o tipo de micro-organismo ou

toxina que foi ingerida, além da quantidade existente no alimento, podendo apresentar sintomas leves e

curtos como náuseas, vômitos, diarreia, até sintomas mais graves e prolongados, tais como diarreia

sanguinolenta e insuficiência respiratória (CARMO et al., 2005; MÜRMANN et al., 2008; FORSYTHE,

2010).

O consumo de alimentos contaminados provenientes de manipulação inadequada e da conservação

ou distribuição em condições impróprias, representam as principais origens dos surtos alimentares que

acometem o homem (GREIG; RAVEL, 2009). Assim, alimentos contaminados em baixas proporções que

não seriam capazes de provocar surtos, em condições errôneas de conservação podem permitir e/ou facilitar

a multiplicação microbiana, aumentando a probabilidade para ocorrência de surtos alimentares (CENTERS

FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 2006; GREIG; LEE, 2009).

Os alimentos de origem animal também estão envolvidos em casos de resistência antimicrobiana,

pois bactérias resistentes têm sido encontradas nesses alimentos (PALERMO NETO; ALMEIDA, 2006).

Muitos estudos constatam que o uso de antimicrobianos em animais contribui para o surgimento de

resistência a diversas classes de antimicrobianos em humanos, principalmente devido a transferência de

bactérias resistentes através da cadeia alimentar (ARIAS; CARRILHO, 2012). No trato gastrointestinal

genes responsáveis pela resistência antimicrobiana podem ser transferidos a outras bactérias (WITTE, 2000)

da mesma espécie ou de espécies diferentes, patogênicas ou não (FOOD AND DRUG ASSOCIATION,

2002).

Diversos micro-organismos patogênicos estão envolvidos nos casos de DVA, dentre eles as

bactérias, vírus e fungos micotoxigênicos (RODRIGUES et al., 2004; GREIG; LEE, 2009). Segundo Welker

et al. (2010), as bactérias são as principais causadoras de doenças alimentares. Fato comprovado por

registros de órgãos de controle sanitário do Brasil, entre os anos de 1999 a 2008, onde as bactérias foram

identificadas como o agente etiológico responsável por 84% dos surtos, enquanto os vírus por 14% dos

casos (BRASIL, 2008).

Segundo FORSYTHE (2002) os micro – organismos causadores de enfermidades transmitidas por

alimentos podem ser divididos em:

Liberadores de toxina: Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, C. botulinum, Vibrio

cholerae, Bacillus cereus, fungos filamentosos.

Causadores de infecções: Salmonella spp, Escherichia coli, Shigella spp, Vibrio parahaemoliticus,

Campilobacter sp, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica.

III. RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA

O aparecimento de resistência a antibióticos e outras drogas antimicrobianas foi, é e provavelmente

continuará a ser um dos grandes problemas da medicina, pois é causada pela mutação espontânea e

recombinação de genes, que criam variabilidade genética sobre a qual atua a seleção natural dando

vantagens aos mais aptos. As drogas atuam como agentes seletivos (SOUZA, 1998).

A origem da resistência antimicrobiana pode ser genética ou não (cromossômica e extra

cromossômica). Na de origem não genética, ou seja, fenotípica, a bactéria adquire resistência a determinada

droga, momentaneamente e, não consegue transmiti-la para sua progênie. Este mecanismo de origem não

genética, geralmente está relacionado a processos de multiplicação bacteriana necessários para a maioria das

ações antibacteriana das drogas (JAWETZ et al., 1991).

Tudo que evita ou danifica o encontro da droga antimicrobiana com seu “alvo” (receptores de

penicilina, unidade 30S e 50S dos ribossomos, enzimas responsáveis pela síntese da parede celular, síntese

de DNA e de mRNA, entre outros) gera maior ou menor resistência. Os alvos geralmente são proteínas,

quase sempre enzimas, importantes para o metabolismo da célula bacteriana. Assim, quanto mais específico

e estratégico para a célula for o alvo, mais eficaz será a droga. A resistência cromossômica surge por

mutação espontânea, que pode ser a simples troca de um nucleotídeo, desde que não torne a bactéria

inviável. A bactéria pode adquirir, após a mutação, resistência cromossômica pela alteração ou

superprodução do alvo, mas também, por mudanças na sítese de proteínas ligadas à permeabilidade do seu

envoltório, alterando a entrada e o acúmulo da droga dentro da célula, dificultando o encontro droga-alvo

(SOUZA, 1998).

O principal mecanismo de uma bactéria sensível, numa população, tornar-se resistente é através da

mutação cromossômica. Outro tipo de resistência pode ser transferida de uma bactéria resistente para uma

sensível por contato. Esta resistência é referida com transferível, transmissível, ou infectível. A resistência

transferível por organismos da mesma espécie e entre espécies diferentes (SMITH, 1974).

Esta transmissão é realizada através de elementos genéticos extracromossomais denominados

plasmídios drogas (JAWETZ et al., 1991). Um tipo de plasmídio, denominado plasmídio R (R = resistência)

contém um conjunto de genes que determinam a resistência contra antibióticos (fator R) e genes FTR (fator

de transferência de resistência) que controlam a replicação autônoma do plasmídeo e são responsáveis pela

transferência de resistência a outras bactérias (KURYLOWICZ, W. et al., 1981).

A resistência bacteriana a antibióticos é um sério problema do ponto de vista clínico e de saúde

pública. Há evidências que o tratamento indiscriminado de animais com antibióticos tornem seus produtos e

derivados, fonte para resistência aos antibióticos na espécie humana. Desta forma, é de extrema importância

o isolamento e identificação desses agentes em laboratório, como prova definitiva no diagnóstico das

enfermidades e, a análise in vitro da sensibilidade antimicrobiana se faz necessário nas amostras isoladas.

Desta forma, contribui-se para um melhor controle, com a utilização de terapêutica adequada, além de

promover um decréscimo na resistência aos antibióticos (GUTIERREZ, L. M. et al., 1990).

IV. CONCLUSÕES

Medidas de controle:

Promoção do uso racional de antimicrobianos;

Treinamento de pequenos proprietários;

Medidas higiênicas – sanitárias;

Autorização e comercialização somente para antibióticos que atendam a padrões internacionais de

eficácia, segurança e qualidade.

Investimentos em pesquisa na indústria farmacêutica.

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

DISCIPLINA: TÓPICOS AVANÇADOS EM MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

DE ORIGEM ANIMAL

MARIA CARLA DA SILVA CAMPÊLO

RODOLFO GURGEL VALE

USO DE PRODUTOS NATURAIS NA CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL

MOSSORÓ –RN

MAIO DE 2014

1. INTRODUÇÃO

Na pré-história, o homem buscava os alimentos apenas para satisfazer suas necessidades, buscando

sempre regiões onde eles eram mais abundantes. Com o passar dos tempos sentiu-se a necessidade de

armazenar estes alimentos para serem consumidos em períodos críticos, como o inverno, onde a comida se

tornava cada vez mais escassa. (DIONYSIO; MEIRELLES, 2009).

Inicialmente, o homem primitivo procurava apenas recolher alimentos e utilizava a parte mais fria e

escura da caverna para estocá-los. As baixas temperaturas permitem retardar ou inibiras reações químicas de

deterioração natural e as atividades enzimáticas sobre os componentes dos alimentos, diminuindo ou

inibindo o crescimento e as atividades dos micro-organismos.

Com o advento da agricultura e da criação de animais, as civilizações, até então nômades, passaram a

viver em locais fixos. No entanto, o cultivo de vegetais depende das estações do ano e condições do clima,

fazendo com que fosse necessário armazenar parte da colheita para os períodos de entre-safra. Além disso,

carnes, peixes e aves degradam com facilidade, de modo que era preciso encontrar meios para melhor

preservar esses alimentos (DIONYSIO; MEIRELLES, 2009).

Em seguida surgiram técnicas e métodos para conservar os alimentos por mais tempo, principalmente

aqueles de origem animal. Dentre as diversas técnicas utilizadas para conservar alimentos destacam-se a

conservação pelo frio, pelo calor, o emprego de substâncias orgânicas e inorgânicas (DIONYSIO;

MEIRELLES, 2009)

Doenças de origem alimentar resultantes do consumo de alimentos contaminados com bactérias

patogênicas e/ou suas toxinas é uma preocupação prioritária para a saúde pública. Muitas tentativas tais

como a utilização de produtos químicos sintéticos, têm sido feitas para controlar o crescimento microbiano e

reduzir a incidência de envenenamentos pela ingestão de alimentos deteriorados. No entanto, produtos

químicos antimicrobianos são, por vezes associada a efeitos adversos, incluindo hipersensibilidade, reação

alérgica e imunossupressão (CAKIR, KORDALI, KILIC & KAYA, 2005).

Dessa forma, consumidores tem buscado cada vez mais introduzir em sua alimentação produtos

naturais, de alta qualidade, minimamente processados, isentos de conservantes químicos (GOULD, G.W.,

1995). A indústria de alimentos tem passado por constantes pressões para que sejam removidos os

conservantes químicos e que adotem alternativas naturais para a preservação do tempo de vida dos produtos

alimentícios. Entre estas alternativas encontram-se os sistemas antimicrobianos naturais, resultantes de

recursos renováveis (TASSOU, C. C. et al., 1995)

Portanto, tem havido um crescente interesse em pesquisas sobre agentes antimicrobianos naturais

alternativos, incluindo os extratos e óleos essenciais de várias espécies de plantas comestíveis e medicinais,

ervas e especiarias que são relativamente menos prejudicial à saúde humana.

Óleos essenciais derivados de plantas possuem grande potencial como agentes naturais para a

conservação de alimentos devido ao seu conteúdo antimicrobiano, e a sua utilização como agentes

antimicrobianos em sistemas alimentares podem ser considerados como um fator intrínseco adicional para

aumentar a segurança e a vida de prateleira dos alimentos. Assim, diversos estudos tem avaliado sua

atividade antimicrobiana, bem como dos condimentos e/ou especiarias, que progressivamente têm sido

adicionados aos alimentos com o intuito de melhorar as características organolépticas e proporcionar o

aumento da vida útil dos alimentos de origem animal.

2. CONSERVAÇÃO

Conservar alimentos é garantir um alimento seguro e, ao mesmo tempo, atender a demanda de manter os

atributos nutricionais e de qualidade, tendo resultado na crescente busca de técnicas alternativas para a

conservação dos alimentos. Desta forma, a conservação de alimentos tem por objetivo eliminar ou retardar a

atuação dos micro-organismo, fazendo com que haja o aumento da vida de prateleira, conservando suas

propriedades organolépticas e nutricionais originais e ainda podendo acrescentar atributos desejáveis para

que o produto torne-se mais atrativo aos olhos do consumidor (VALSECHI, O.A, 2001)

Atualmente são conhecidas diversas técnicas e tipos de conservantes para impedir ou retardar a

deterioração dos alimentos, dentre elas a conservação pelo calor que se baseia no emprego de temperaturas

ligeiramente acima das máximas que permitem a multiplicação dos microrganismos, de forma a provocar a

sua morte ou a inativação de suas células vegetativas. Os principais métodos de conservação por calor são

pasteurização, esterilização, desidratação, dessecação e defumação(VALSECHI, O.A, 2001).

Outro método de conservação é através do frio que bastante utilizado na conservação dos alimentos

perecíveis, tanto os de origem animal como os de origem vegetal. Basicamente, o frio conserva os alimentos

porque retarda ou inibe a multiplicação microbiana. Isto ocorre porque o metabolismo microbiano é

efetuado através de reações enzimáticas as quais são influenciadas, em suas velocidades, pela temperatura.

Sendo as principais técnicas utilizadas: a refrigeração, congelamento e liofilização (VALSECHI, O.A,

2001).

Os alimentos podem ser ainda ser conservados pela utilização de conservantes químicos, que impedem

ou retardam as alterações provocadas por micro-organismos. A ação antimicrobiana dos conservantes

baseia-se em efeitos sobre um ou mais dos seguintes componentes/atividades: DNA, membrana plasmática,

parede celular, síntese proteica, atividade enzimática e transporte de nutrientes.

3. IMPORTÂNCIA DA CONSERVAÇÃO

A indústria alimentícia visa à produção de alimentos inócuos e que apresentem vida longa de prateleira.

Contudo, a atual demanda por alimentos de boa qualidade, minimamente processados, livres de conservantes

químicos, porém com vida útil longa, têm tornado essa busca cada vez mais premente e necessária.

(DIONYSIO e MEIRELLES, 2009).

Muitos alimentos são perecíveis por natureza e necessitam de proteção contra a deterioração durante seu

preparo, armazenamento e distribuição a fim de assegurar-lhes o tempo de prateleira desejado. Como os

produtos alimentícios são comercializados, frequentemente, em áreas distantes do seu local de produção, por

questão de segurança o prazo de validade desses produtos deve ser estendido. O uso de baixas temperaturas

na cadeia de distribuição possibilitou o comércio internacional de produtos perecíveis. Contudo, a

refrigeração por si só não garante a qualidade e a segurança desses alimentos, necessitando a associação com

outros métodos de conservação, como, por exemplo, embalagens em atmosfera modificada a fim de

prolongar a vida útil dos produtos. Mesmo assim, essas medidas não eliminam microrganismos indesejáveis

(HOLLEY; PATEL, 2005).

Garantir a segurança e, ao mesmo tempo, atender à demanda para a conservação de atributos nutricionais

e de qualidade têm resultado na crescente busca de conservantes naturais com potencial aplicação em

alimentos, que possam ser utilizados sozinhos ou em combinação com outra tecnologia. Todavia, a escolha

do antimicrobiano deve ser baseada na compatibilidade química e sensorial deste com o alimento alvo, na

sua efetividade contra microrganismos indesejáveis, segurança, dentre outras características (SETTANNI;

CORSETTI, 2008).

Nas últimas décadas, diversos conservantes naturais têm sido investigados para aplicações práticas,

sendo utilizados na inativação de enzimas e microrganismos, sem efeitos adversos significativos nas

propriedades nutricionais e organolépticas dos alimentos. Os estudos relatados nesta revisão mostram que os

agentes antimicrobianos naturais descritos podem oferecer vantagens para o processamento de alimentos,

uma vez que aumentam a sua vida útil e a segurança, além de permitirem que novos produtos com melhor

qualidade e propriedades nutricionais sejam introduzidos no mercado. Todavia, por serem constituídos por

diversos compostos químicos, apresentam respostas diferentes frente à diversidade microbiana e condições

intrínsecas de cada alimento. Como a eficácia de todo antimicrobiano sofre influência da composição

química do alimento, há necessidade de se determinar, com precisão, a condição mais efetiva de cada um

deles para cada alimento (MACHADO et al., 2011).

Espera-se, em um futuro próximo, o aumento do uso de conservantes naturais em bens de consumo

devido ao apelo do “consumismo verde”, que estimula o uso e o desenvolvimento de produtos naturais. Isso

se aplica aos setores da cosmética, medicamentos e alimentos (MACHADO et al., 2011)

4. CONSERVANTE SINTÉTICO

A adição de produtos químicos aos alimentos já era praticada pelo homem pré-histórico, através da

defumação, salga e fermentações. Atualmente, com o avanço da indústria, há uma grande disponibilidade de

substâncias aprovadas para serem utilizadas nos alimentos com diversas finalidades, tais como: melhorara

sua coloração, textura ou aroma, bem como conservá-los por maior tempo. Dentre os aditivos empregados

em alimentos, com a propriedade de prolongar a vida útil dos produtos, destacam-se os antioxidantes

(substâncias que retardam o aparecimento de alterações oxidativas no alimento, como BHA, BHT, etc.), e os

conservantes (substâncias que impedem ou retardam a alteração dos alimentos provocada por

microrganismos ou enzimas, como ácidos benzóico, bórico e sórbico, nitritos, nitratos, propionatos, etc.)

(Dionysio, R. B., MEIRELLES F. V. P).

O número de compostos utilizados como conservantes em alimentos é relativamente pequeno, pois como

serão ingeridos junto com o alimento, medidas de segurança são necessárias, visando a saúde do

consumidor. Para isso, o Codex Alimentarius da FAO (Food and Agriculture Organization) e a ONU

(Organização das Nações Unidas) estabelecem para a maioria dos aditivos alimentares a “dose diária

aceitável” expressa em mg/kg de peso corpóreo.

5. CONSERVANTES NATURAIS

São substâncias de origem microbiana, animal ou vegetal. A biopreservação, como é chamada a

utilização das substâncias microbianas, refere-se à extensão da vida de prateleira e melhoria da segurança

dos alimentos a partir de microrganismos e/ou seus metabólitos (ROSS et al., 2002).

Agentes antimicrobianos de origem animal, na maioria das vezes, desempenham funções de defesa do

hospedeiro. Muitos são polipeptídios que, após hidrólise enzimática, liberam peptídeos biologicamente

ativos (TIWARI et al., 2009).

As substâncias com potencial antimicrobiano de origem vegetal são plantas, ervas e especiaria, muitas

vezes utilizadas como condimentos alimentares para promover maior vida útil dos alimentos, impedir ou

retardar o crescimento microbiano, podendo ou não conferir sabor, aroma e/ou cor aos produtos.

5.1. ERVAS E ESPECIARIAS

Além de seus efeitos aromatizantes, algumas especiarias e ervas têm ação antimicrobiana em plantas e

patógenos humanos (BRANDI et al. , 2006). Tecnologias de processamento de alimentos, tais como

conservantes químicos possuem uma menor capacidade em patógenos de alimentos, tais como Listeria

monocytogenes, ou retardar a deterioração microbiana totalmente (GUTIERREZ, BARRY-RYAN, &

BOURKE, 2009).

Com a difusão das modernas técnicas de preservação houve interesse acentuado e renovado sobre

algumas especiarias, utilizadas principalmente como condimentos alimentares. Além de participarem como

ingredientes de inúmeros alimentos, tornando-os mais saborosos e digestivos, apresentam ação indireta e

complementar como agentes antimicrobianos devido à presença de óleos essenciais (BARA, 1992).

Os antimicrobianos de origem vegetal são comumente produzidos por destilação a vapor e

hidrodestilação. Métodos alternativos como a extração com fluido supercrítico, proporciona maior

solubilidade e melhores taxas de transferência de massa. Outro ponto importante são os parâmetros

empregados na obtenção destes óleos, como a temperatura e a pressão que conduz a extração de

componentes diferentes quando está alterada, podendo levar ainda a uma ação diferenciada da esperada

(BURT, 2004).

5.1.1. Óleos essenciais

Desde os primeiros registros históricos, extratos vegetais de plantas aromáticas têm sido utilizados

com diferentes fins em alimentos, medicamentos e cosméticos. Os óleos essenciais, além de apresentarem

atividade antioxidante e antiinflamatória são considerados como os agentes antimicrobianos mais

importantes presentes nas plantas (BAJPAI et al., 2008). São constituídos por misturas complexas de

compostos, podendo conter mais de 60 componentes, e caracterizam-se pela presença de dois ou três

compostos majoritários, que determinam a sua propriedade biológica. Contudo, acredita-se que os

componentes em menores quantidades desempenham um papel fundamental na atividade antibacteriana do

óleo, possivelmente pela produção de efeito sinérgico com outros componentes, como é o caso do orégano

(PASTER et al., 1995), tomilho (MARINO et al., 1999) e sálvia (MARINO et al., 2001). Todavia, a

composição química do OE de uma determinada planta pode variar em função da época de colheita, origem

geográfica e diferentes partes da planta.

Óleos essenciais são compostos por terpenos, sesquiterpenos e diterpenos, com diferentes grupos de

hidrocarbonetos alifáticos, ácidos, álcoois, aldeídos, ésteres acíclicos ou lactonas (FISHER , PHILLIPS,

2006). Óleos essenciais e outros extratos de plantas são os principais responsáveis para atividades

antimicrobianas em plantas, ervas e especiarias. Estes extratos podem ser obtidos a partir de plantas, de

especiarias e através de vários métodos, tais como vapor, destilação a frio, seca e vácua. Estes compostos de

plantas, incluindo glicosídeos, saponinas, taninos, alcalóides, e os ácidos orgânicos e outros, estão presentes

como partes do sistema de defesa da planta original contra infecções microbianas (BAJPAI et al., 2008 e

CEYLAN, FUNG, 2004). Os principais componentes dos óleos essenciais podem constituir até 85%, e

demais são geralmente em níveis residuais (BURT, 2004 ; GROSSO et al., 2008).

Existe relatos que os componentes fenólicos são os principais responsáveis pelas atividades

antibacterianas desses óleos, porém há evidencias que compostos não fenólicos, podem ser mais efetivos

contra bactérias Gram negativas, além de também serem eficazes contra fungos (TURINA et al., 2006).

5.1.2. Principais produtos naturais estudados

Orégano: O carvacrol (30%) e timol (27%) são os principais constituintes do óleo essencial de

orégano (Origanum compactum) proporcionando atividade antimicrobiana sobre micro-

organismos.(BAKKALI et al., 2008).

Coentro: O linalol (68%) é o principal constituinte do óleo essencial do coentro (Coriandrum

sativum) o que confere sua atividade antimicrobiana e antioxidante (BAKKALI et al., 2008)

Tomilho: demostrou atividade antimicrobiana mais forte em comparação com a vancomicina (30

mcg) e eritromicina (15 mcg) ( Toroglu de 2007).

O cravo-da-índia contém eugenol, um poderoso antioxidante que conserva os alimentos. Fenóis

possuem propriedades antioxidantes por ter a capacidade de doar hidrogênio para radicais livres,

tornando esse radical estabilizado por ressonância (Dionysio, R. B., Meirelles F. V. P).

A canela, por sua vez, contém além do eugenol, o cinamaldeído, um bom conservante e

aromatizante, além de apresentar excelente atividade fungicida e inseticida (Dionysio, R. B.,

Meirelles F. V. P).

Uma importante característica dos óleos essenciais e seus constituintes é a hidrofobicidade, que lhes

torna capaz de alterar a permeabilidade da membrana celular e mitocondrial, tornando-as mais

permeáveis com consequentes perdas de íons e moléculas (CARSON et al., 2002).

Tabela 1: Lista de ervas e especiarias já estudadas que apresentam atividade antimicrobiana contra micro-

organismos patogênicos e deteriorantes em alimentos.

Nome da planta Eficaz contra Referência

Coentro, orégano,

alecrim, salsa.

Bactérias Gram + e Gram -, incluindo L.

monocytogenes.

Angioni et al., 2004; Ceylan e

Fung, 2004; Daferera et al., 2000;

El-Zemity et al., 2008.

Pimenta,

manjericão-de-

folha-larga,

eucalípto, sementes

de cominho,

capim-limão, erva-

cidreira.

B. subtilis, C. botulinum, E. coli, L.

monocytogenes,

S. typhimurium e S. aureus.

Angioni et al., 2004; Burt, 2004;

Ceylan e Fung, 2004; El-Zemity

et al., 2008.

Cravo, sage,

canela, marijoram,

allipse.

Os agentes patogénicos, tais como B. subtilis,

C. botulinum, E. coli, L. monocytogenes, S.

typhimurium, S. aureus.

Gutierrez et al., 2008b; Ho et al.,

2008; e Lopez-Malo vigília et al.,

2005.

Basil, baía e capim-

limão.

Espectro amplo efeito antibacteriano contra

microrganismos patogénicos Gram +

e Gram -.

Ceylan e Fung, 2004 e

Skocibusic et al., 2006.

Manjericão,

coentro, canela,

orégano e tomilho.

Staphylococcu s spp. Gutierrez et al., 2008b; Lopez-

Malovigília et al., 2005 e Romeo

et al., 2008.

Orégano, salvia,

tomilho e Satureja

hortensis L.

S. aureus e E. coli. Bousmaha-Marroki et al., 2007;

Burt, 2004 e Razzaghi-Abyaneh

et al., 2008.

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habitualmente utilizados na indústria de

alimentos.

Mahmoud et al., 2007.

Cumin B. cereus, B. subtilis, C. botulinum, L.

monocytogenes, P. fluorescens, S. enteritidis,

S. aureus.

Ceylan e Fung, 2004.

Endro C. botulinum, P. aeruginosa, S. aureus, Y.

enterocolitica.

Ceylan e Fung, 2004.

Erva-doce B. cereus, C. botulinum, S. enteritidis, S.

aureus, Y. enterocolitica.

Ceylan e Fung, 2004.

Alho Espectro amplo efeito antibacteriano contra

Micr-oorganismos patogénicos Gram + e

Gram -.

Ceylan e Fung, 2004.

Hortelã-pimenta Espectro amplo efeito antibacteriano contra

Micro-organismos patogénicos Gram + e

Gram -.

Ceylan e Fung, 2004.

Cebola E. coli, S. typhimurium, S. dysenteriae, S.

aureus.

Ceylan e Fung, 2004.

(Tabela adaptada de TAJKARIM, M.M et al., 2010)

5.1.3. Mecanismo de Ação

Os mecanismos de ação dos antimicrobianos naturais não são completamente compreendidos, bem como

os efeitos toxicológicos e sensoriais (BURT, 2004, DAVIDSON, 2006; GAYSINSKY e WEISS, 2007;

GUTIERREZ et al. ,2009; LOPEZ-MALO VIGÍ LIA et al. 2005, MORIERA et al. 2007; PATRIGNANI

et al.,2008; PERIAGO et al. 2006; PONCE et al. 2008; RAYBAUDI MOSQUEDA-MELGAR et al.,

2008; ZAIKA, 1988). Porém são relatados na literatura alguns possíveis modos de ação dos constituintes

dos óleos essenciais destes antimicrobianos naturais (DAVIDSON, 2001; BURT, 2004; BAKKALI et al.,

2008).

A obtenção e aplicação dos antimicrobianos por diferentes métodos de exposição, podem demostrar

notáveis diferenças no modo de ação dos óleos especiais e especiarias (GONI et al., 2009). A

estereoquímica, lipofilicidade e outros fatores podem afetar a atividade biológica destes compostos que

podem ser alterada positiva ou negativamente por ligeiras modificações (VELURI, et al, 2004).

É possível que o efeito dos compostos fenólicos seja dependente da concentração. Baixas concentrações

afetam a atividade enzimática, principalmente as enzimas associadas com a produção de energia, enquanto

altas concentrações podem causar desnaturação proteica. É consenso que os compostos fenólicos alteram a

permeabilidade da membrana celular, permitindo assim a perda de macromoléculas, como exemplo, ribose e

glutamato de sódio. Podem ainda interagir com proteínas da membrana celular causando deformação na sua

estrutura e funcionalidade. Isotiocianatos por meio de clivagens oxidativas das ligações de dissulfetos

levam à formação de radicais tiocianatos, que promovem a inativação de enzimas extracelulares

(MACHADO T.F. et al, 2011).

5.1.4. Efeito sinérgico dos produtos naturais

Quando o efeito combinado das substâncias é maior do que a soma dos efeitos individuais, isto é

sinergia; antagonismo acontece quando uma combinação mostra menos efeito em comparação com as

aplicações individuais. Os efeitos sinérgicos de alguns compostos, além dos principais componentes dos

óleos essenciais, tem sido demonstrado em alguns estudos (ABDALLA et al, 2007; BECERRIL et al.,

2007.; ROTA et al., 2008). A aplicação da combinação de carvacrol e timol pode melhorar a eficácia de

dos óleos essenciais contra micro-organismos patogénicos (TAJKARIMI M.M. et al., 2010).

O sinergismo entre carvacrol e p-cimeno, um antimicrobiano muito fraco, pode facilitar o transporte do

carvacrol na célula através do inchaço da parece celular do Bacillus cereus (BURT, 2004).

A atividade antimicrobiana combinada entre o óleo essencial de cravo e a canela mostrou-se menos ativo

na fase líquida, quando comparado com o mesmo combinado em fase de vapor (GONI et al. , 2009).

Quando testado o sinergismo entre a embalagem a vácuo e o óleo essencial de orégano foi possível

observar uma redução do crescimento de Listéria monocytogenes. Resultados semelhantes foram

encontrados quando testou o cravo e o coentro usados contra Aeromonas hydrophila em carnes de porco

embaladas a vácuo.

6. CONCLUSÃO

Estudos têm demonstrado, cada vez mais, que a ação dos antimicrobianos de origem natural tem se

tornado cada vez mais eficientes sobre micro-organismos patogênicos e deteriorantes oferecendo vantagens

no processamento de alimentos, como o aumento na vida útil, da segurança e da qualidade microbiológica

dos alimentos.

7. REFERÊNCIAS

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Universidade Federal Rural do Semi-Árido

Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal

Tópicos Avançados em Microbiologia de Alimentos de Origem Animal

Professor: Jean Berg Alves da Silva

Métodos de detecção de microrganismos em alimentos de origem animal

Componentes: Ciro Jose Fernandes Silva

Fernanda Araujo dos santos

Katia Tatiana de Lima Lopes

Mossoró-RN

Maio, 2014

INTRODUÇÃO

Este trabalho tem como objetivo, apresentar os principais métodos utilizados para detectar e

quantificar os principais microrganismos que se encontram nos alimentos de origem animal destinados ao

consumo humano, uma vez que os microrganismos estão intimamente relacionados com a disponibilidade,

abundância e qualidade dos alimentos. Os alimentos são facilmente contaminados com microrganismos

durante a sua manipulação e processamento e após ter sido contaminado, se torna um meio para o

crescimento dos mesmos. Dessa forma, se os microrganismos tiverem um meio propício ao seu

desenvolvimento, podem mudar as características físicas e químicas dos alimentos, causando a sua

deterioração.

Neste contexto, a prática de análise microbiológica dos alimentos é imprescindível para se verificar

quais e quantos microrganismos estão presentes, a fim de se conhecer as condições higiênicas em que o

alimento foi preparado, os riscos que o mesmo pode oferecer a população e se esse alimento terá ou não a

vida útil pretendida, como também para observar se os padrões e especificações microbiológicos, nacionais

ou internacionais, estão sendo atendidos adequadamente.

Para isso, muitos métodos são relatados na literatura para detecção quantitativa e qualitativa de

microrganismos em alimentos. Atualmente esses métodos são classificados como métodos convencionais e

métodos rápidos. Os métodos convencionais são aqueles desenvolvidos há muitos anos e que ainda vêm

sendo empregados como métodos oficiais, e os métodos rápidos, os quais vêm se desenvolvendo de forma

espantosa devido a sua praticidade e a necessidade de se abreviar o tempo de análise e melhorar a

produtividade dos laboratórios. Entretanto, o procedimento a ser empregado é determinado de acordo com o

tipo de alimento a ser analisado e ao propósito da análise, como também depende do microrganismo a ser

pesquisado.

MÉTODOS CONVENCIONAIS

Dentre os métodos convencionais, temos a contagem de microrganismos em placa, que é considerado

um método geral, o qual pode ser utilizado para contagem de grupos microbianos, como os aeróbios,

mesófilos, aeróbios psicrófilos, termófilos, bolores e leveduras, variando o tipo de meio, a temperatura e

tempo de incubação. Esse método consiste basicamente no plaqueamento de alíquotas do produto

homogeneizado e de suas diluições em meios de cultura sólidos, adequadamente selecionados em função do

microrganismo a ser enumerado.

O plaqueamento pode ser feito por semeadura na superfície do meio de cultura previamente

distribuído em placas de Petri estéreis (semeadura em superfície), ou então o meio de cultura pode ser

adicionado após a transferência das alíquotas para as placas de Petri vazias (semeadura em profundidade).

As placas são então incubadas a uma combinação de tempo e temperatura adequada para a determinação a

ser feita, durante a qual os microrganismos se multiplicam formando as colônias visíveis, que podem ser

enumeradas manualmente ou com o auxílio de contadores automáticos.

Apesar da aparente simplicidade dessa técnica, ela é bastante trabalhosa e sujeita a erros, levando em

consideração que: os microrganismos estão arranjados em pares, tétrades, cadeias e cachos,

consequentemente, o número de colônias que aparece na placa não corresponde ao número de células

individuais presentes, além disso, quando muitas diluições precisam ser plaqueadas também pode haver

erros, bem como algumas partículas de alimentos podem ser confundidas com colônias, levando a um falso

resultado positivo, sendo a leitura dos resultados bastante difícil, pois pode variar de acordo com o analista,

além de ser cansativa e imprecisa, mesmo quando contadores automáticos são empregados.

Outro método convencional utilizado é a técnica do Número Mais Provável (NMP) ou também

chamada de técnicas de tubos múltiplos. Esta é outra maneira utilizada nos laboratórios de microbiologia de

alimentos para estimar a contagem de alguns microrganismos, como coliformes totais, coliformes fecais, E.

coli, e Staphylococcus aureus.

Nessa técnica do Número Mais Provável, o produto a ser analisado, após homogeneização, é

submetido à pelo menos três diluições decimais seriadas. De cada uma dessas diluições, alíquotas iguais são

transferidas para três ou para cinco tubos contendo o meio de cultura escolhido e um tubo coletor de gás

(tubo de Durhan). Todos os tubos são incubados, e em seguida, os positivos são identificados. Pelo número

de tubos positivos em cada uma das diluições empregada determina-se o Número Mais Provável por grama

de produto, tendo como base a tabela estatística de Hoskins para três ou para cinco tubos.

O Número Mais Provável é estimado de respostas onde resultados são relatados como positivos e

negativos em uma ou mais diluições decimais da amostra. Por esta técnica pode-se obter informações sobre

a população presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a população real de coliformes (teste

confirmativo) e sobre a população de coliformes de origem fecal (coliformes fecais).

Os métodos microbiológicos convencionais embora confiáveis e eficientes exigem disponibilidade

de tempo e grande trabalho laboratorial. Ainda que as técnicas de análise convencionais tenham sua

sensibilidade bem documentada, o tempo necessário para obter resultados é muitas vezes longo demais

para as exigências da indústria.

MÉTODOS RÁPIDOS

Para resolver ou amenizar os problemas citados anteriormente, iniciou-se o uso de outras técnicas

de detecção de microrganismos em alimentos de origem animal. Essas técnicas são mais rápidas,

melhoram a eficiência dos laboratórios, simplificando trabalhos, reduzindo custos no geral e aumentando a

capacidade analítica. Adicionalmente, essas técnicas são mais confiáveis, pois em sua maioria não precisa

ser preparado pelo analista, os kits já vem prontos. Com isso, observa-se aumento na precisão dos

resultados. É sempre importante lembrar, que apesar de todas essas vantagens, o microbiologista sempre

será necessário para interpretar os dados.

Quando comparados aos métodos convencionais, os métodos rápidos apresentam algumas

melhorias, principalmente nas etapas de preparação das amostras; separação e concentração das células-

alvo, toxina ou vírus; e na detecção final.

Para preparação das amostras, há duas formas de agilizar: uma consiste no método de preparar

uma lâmina com ágar seletivo ou não-seletivo, pressionar no alimento a ser analisado e levar diretamente

para incubação sem precisar realizar várias diluições; a outra forma consiste em utilizar o diluidor

automático.

Em relação a separação e concentração do microrganismo-alvo, havia uma necessidade de encurtar

o tempo de detecção e melhorar a especificidade dos procedimentos testes e isso foi alcançado utilizando

os métodos de separação imunomagnética (IMS), técnica de filtro epifluorescência direta (DEFT) e

membrana de grade hidrofóbica. A separação imunomagnética consiste de partículas superparamagnéticas

que foram encobertas por anticorpos para o organismo-alvo e posteriormente foram encubadas em caldo

enriquecido; os antígenos vão se ligar aos anticorpos e depois serão atraídos a um lado do tubo de ensaio

utilizando um ímã. A técnica de filtro epifluorescência direta (DEFT) e membrana de grade hidrofóbica

permite a visualização do número de colônias de microrganismos existentes, expressando o resultado em

unidades formadoras de colônias (UFC/100mL), a diferença é que no primeiro os microrganismos serão

tingidos com laranja de acridina e a membrana poderá ser levada diretamente ao microscópio, já no

segundo a amostra do alimento é pré-filtrada e depois submetida a um filtro de membrana que aprisiona

os microrganismos em uma rede de 1600 compartimentos, devido a efeitos hidrofóbicos. A membrana é,

então, colocada em uma superfície de ágar apropriada, e a contagem de colônias é determinada após um

período de incubação adequado.

Na detecção final, as melhorias ocorreram utilizando melhores meios de cultura (substratos

cromogênicos e fluorogênicos, enriquecimento de motilidade e Sistema Petrifilm), imunoensaios, ELISA,

aglutinação em látex, microbiologia de impedância/condutância e PCR. Técnica de bioluminescência de

ATP, detecção de proteína pela reação de biureto e citometria de fluxo também vieram contribuir para que

as detecções se tornassem mais rápidas.

Os meios de cultura melhorados permitem a observação dos microrganismos a partir da

observação de compostos brilhantes e fluorescentes (substratos cromogênicos e fluorogênicos), da

motilidade (utilizando meios semissólidos para observar a motilidade bacteriana do organismo-alvo), e da

utilização do sistema Petrifilm (que é uma alternativa ao plaqueamento convencional, já que a placa e o

meio já vêm prontos para uso).

Os imunoensaios e ELISA possuem maior especificidade e automação potencial. Consistem de

anticorpos monoclonais sobre placas para capturar o antígeno-alvo. O antígeno capturado é então

detectado usando um segundo anticorpo que pode estar conjugado a uma enzima. A adição de um

substrato facilita a visualização do antígeno-alvo. A técnica exige que o organismo-alvo esteja em uma

concentração de 106 UFC/ml, apesar de alguns testes relatarem um limite de sensibilidade de 104. Portanto

o pré-enriquecimento convencional e mesmo o seletivo podem ser necessários antes do teste.

Na aglutinação em látex as partículas de látex são cobertas com soro de coelho, o qual é reativo

contra o antígeno-alvo. Dessa forma, as partículas vão aglutinar-se na presença do antígeno, formando

uma estrutura compacta. Esta precipita no fundo de uma placa em forma de V e tem uma aparência difusa.

Se não há antígeno presente, então uma mancha bem definida aparecerá.

A microbiologia de impedância/condutância é baseada na propriedade que os microrganismos têm

de alterar a transmissão da corrente elétrica através de um meio de cultura. Isso ocorre devido a mudança

da composição química desse meio a partir da atividade metabólica dos microrganismos presentes.

Durante a multiplicação microbiana, moléculas grandes (proteínas, lipídeos, carboidratos) se transformam

em moléculas menores (aminoácidos, ácidos graxos, ácidos orgânicos), quimicamente mais ativas; o

acúmulo desses metabólitos finais resulta em alterações mensuráveis na condutância e impedância

elétrica do meio.

A PCR (reação em cadeia de Polimerase) detecta os patógenos a partir da amplificação de DNA ou

RNA sem o uso de organismo vivo. É uma técnica com alta especificidade, mas não garante a presença de

um organismo viável.

A bioluminescência de ATP consiste na detecção de microrganismos vivos ao se encontrar ATP

partir da reação de luciferina-luciferase. Esse método é mais utilizado para monitorar a higiene no local

desejado e pode ser afetado por resíduos contendo sanificantes (cloro livre), detergentes, íons metálicos,

pH ácido e básico, cores fortes, muitos sais e álcool. A detecção de proteína utiliza a reação de biureto e

pode ser uma alternativa a técnica anterior.

A citometria de fluxo se baseia na dispersão da luz pelas células e marcas fluorescentes que

discriminam os microrganismos do material de fundo como os resíduos de alimentos utilizando anticorpos

marcados.

DETECÇÃO DE ALGUNS MICRORGANISMOS PRESENTES EM ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL

Campylobacter

Essa é uma das bactérias mais comuns como fontes de DTA´s nos produtos a base de frango.

Pelo fato das células das bactérias terem o risco de ficarem estressadas durante o processamento do

alimento, é recomendado que haja um estágio de pré-enriquecimento para recuperação das células antes da

sua determinação.

Como o organismo é microaerófilo, é necessária uma atmosfera adequada para seu crescimento ideal

(6%de oxigênio e 10% de dióxido de carbono).

Existe uma grande variedade de meios de crescimento disponível para o campylobacter. Sendo o

caldo Parks e Sanders o meio de enriquecimento mais usual.

Listeria

Os principais métodos de detecção de Listeria são os recomendados pelo Food and Drug

Administration (FDA), U.S. Department of Agriculture (USDA) e pelo Health Protection Branch do

Canadá.

O mais comum é avaliar a presença/ausência desses microrganismos em 25g de amostras de um

produto. No caso do Brasil, a RDC Nª12 da ANVISA, preconiza a necessidade desse teste, apenas para

queijos.

Os métodos convencionais de detecção da bactéria demoram alguns dias para confirmação de

Listeria spp. e mais outros para confirmação de Listeria monocytogenes.

Para os procedimentos de detecção, a fase de pré-enriquecimento é inexistente, já que iria facilitar a

proliferação de outros microrganismos que crescem mais rápido do que a Listeria. Existem inúmeros caldos

de enriquecimento e plaquemento, porém o caldo Froser é o mais utilizado, enquanto que o ágar Oxford e

ágar PACCAM são mais comuns para o plaqueamento. Agentes seletivos como a colistina, e a polimixina B

são utilizados para inibir outros patógenos competidores.

As colônias típicas de Listeria são cercadas por uma zona negra proveniente a compostos fenólicos

de ferro. Para identificação de Listeria monocytogenes é necessário a realização de testes bioquímicps e

sorológicos complementares (teste CAMP).

Staphylococcus aurueus

Na RDC Nº 12 da Anvisa, a enumeração de estafilococos coagulase positiva tem como função

substituir a determinação de Staphylococcus aurueus. Existindo uma tolerância determinada para cada grupo

de alimentos.

De acordo com FDA o meio mais indicado para o isolamento dessa bactéria é o Ágar Baird Parker

(ABP). Esse meio possui como agentes seletivos o telurito de potássio, a glicina e o cloreto de lítio. Além de

possuir o piruvato de sódio para ajudar a recuperação de células lesadas.

A redução do telurito pela bactéria confere uma coloração negra ao redor da colônia, já a hidrolise da

gema de ovo forma halos ao redor da colônia.

Após a formação de colônias suspeitas, é necessário fazer o teste de coagulase em tubos para

detecção a coagulase livre e a ligada.

Os coágulos são classificados desde reação negativa (quando não há formação de coágulos) até

reação 4+ (coagulação de todo conteúdo do tudo).

Ainda existe outro teste específico e menos subjetivo do que a coagulase. O teste de termonuclease

envolve a mudança de cor do azul para o rósea do meio de cultura.

Clostridium perfringens

São bactérias que possuem esporos bastante resistentes a altas temperaturas. Os alimentos cárneos

geralmente estão associados como o veículo para intoxicações por esse microrganismo.

Para detecção de baixos números de células é necessário o pré-enriquecimento das amostas. Existem

inúmeros meios de crescimento sendo os sulfitos e os ferrosos mais utilizados mundialmente.

Como o escurecimento das colônias pelo uso de sulfito e ferro não é uma característica exclusiva

dessa bactéria, se faz necessário o uso de outras técnicas mais apuradas para distinguir o Clostridium

perfringens dentro do grupo dos sulfitos-redutores.

Dentre desses testes específicos se destacam o teste Nagler que usa a antitoxina tipo A para

neutralizar a atividade da lecitanase e o teste CAMP reverso, que utiliza do Streptococus agalactiae (grupo

B) para identificação do Clostridium perfringen.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Observou-se que para uma detecção mais rápida de microrganismos, os métodos rápidos são os

mais indicados. Os métodos convencionais ainda são os mais indicados por serem considerados os oficiais,

mas aos poucos eles serão trocados ou então utilizados em associação com os métodos rápidos. Para

escolha de um desses métodos, o essencial é saber qual o tipo de microrganismo que está sendo estudado.

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DÉBORA ALVES DE CARVALHO FREIRE

JOSUÉ DE OLIVEIRA MOREIRA

Micotoxinas em Alimentos de Origem Animal

Mossoró/RN

Maio 2014

1. INTRODUÇÃO

As barreiras internacionais impostas na comercialização dos produtos de origem animal e os problemas sérios de

saúde pública tem gerado uma maior preocupação com a qualidade sanitária dos alimentos. Para a garantia da

competição dos produtos brasileiros no mercado globalizado esforços devem ser feitos por parte dos produtores,

indústrias e governo. Afim de, aumentar a segurança sanitária dos produtos brasileiros aumentando assim a

competitividade desses produtos, bem como a segurança alimentar da população brasileira.

Nesse contexto, surgem as micotoxinas, as quais devem ser controlas para a obtenção de alimentos saudáveis ao

consumidor. Essas são substâncias tóxicas liberadas por fungos, podendo apresentar capacidade mutagênica,

carcinogênica e hepatotóxica (JAY, 2005). Alguns surtos são relatados ao longo da história tendo como agentes

as micotoxinas. Mas, foi a partir da descoberta das aflatoxinas na Inglaterra, em 1960 que o estudo desses

metabólitos obteve maior atenção. De modo que, a elaboração de leis que estipulam níveis máximos de

micotoxinas em alimentos têm sido uma preocupação mundial (FREIRE et al., 2007).

Os gêneros dos fungos mais comumente associados com micotoxinas que ocorrem, naturalmente, são

Aspergillus, Penicillium e Fusarium. Essa são contaminantes naturais de difícil controle em alimento. Estima–se

que cerca de 25% de todos os produtos agrícolas do mundo estejam contaminados por tais substâncias

(BENETT; KLICH, 2003). A produção de micotoxinas depende do crescimento fúngico, portanto, pode ocorrer

em qualquer época do crescimento, colheita, ou estocagem do alimento. Contudo, o crescimento do fungo e a

presença de toxinas não são sinônimos, porque nem todos os fungos produzem toxinas. Por outro lado as

micotoxinas podem permanecer no alimento mesmo após a destruição dos fungos que as produziram (FREIRE et

al., 2007).

Mesmo que a verdadeira toxicidade de muitas micotoxinas ainda não tenha sido

demonstrada para humanos, o efeito desses compostos em animais de laboratório e em ensaios in vitro deixa

poucas dúvidas a respeito de sua toxicidade potencial. No mínimo 14 micotoxinas são carcinogênicas, sendo as

aflatoxinas as mais potentes (WANKENNE, 2009).

O homem pode ser contaminado por micotoxinas através do consumo de alimentos processados ou in natura.

Também pode ingerir carne de animais alimentados com ração contaminada, pois a toxina pode ser transmitida

pelo corpo do animal através da sua carne, leite ou ovos. Alguns alimentos com contaminação potencial, como o

milho, podem ter seus produtos derivados, como o óleo refinado, isento da toxina, pois há a destruição da mesma

no processo de transformação do produto (WANKENNE, 2009).

As micotoxinas ocorrem e exercem seus efeitos tóxicos em quantidades extremamente pequenas nos alimentos.

Por isso, a sua identificação e avaliação quantitativa geralmente requer amostragem sofisticada, preparação de

amostras, extração e técnicas de análise (WANKENNE, 2009).

Logo, a melhor estratégia é o controle, um sistema profilático que impeça a proliferação e crescimento fúngico,

inibindo, conseqüentemente, a formação de aflatoxinas. A curto prazo devemos nos concentrar na armazenagem

e conservação dos grãos para consumo humano e dos animais e, a longo prazo, na seleção de variedade de

cereais mais resistentes à infecção fúngica e técnicas de manejo fitossanitário são de interesse prático para o

controle das micotoxinas (MALLMAMM et al., 1994). Inda, é possível controlar o crescimento de fungos em

produtos armazenados através do controle ambiental ou uso de preservativos ou inibidores naturais. (REIS;

CORRÊA; FERNANDES, 2010)

2. HISTÓRICO

Os metabólitos produzidos por fungos filamentosos (microfungos), ao entrarem na cadeia alimentar, têm sido

responsáveis por verdadeiras epidemias em humanos e animais ao longo da história. O caso mais conhecido é o

do ergotismo, que foi responsável pela morte de milhares de pessoas na Europa, no milênio passado

(MATOSSIAN, 1981). Outros surtos relatados incluem a aleuquia alimentária tóxica (ATA), que matou cerca de

100.000 russos entre 1942 e 1948 (JOFFE, 1978); a stachybotryotoxicose, que matou milhares de cavalos,

também na Rússia, em 1930 (MOREAU, 1979) e a aflatoxicose que matou 100.000 perus jovens no Reino

Unido, em 1960, sendo também responsabilizada pela morte de outros animais e até, provavelmente, de humanos

(RODRICKS et al., 1977; PITT; HOCKING,1986). Em dois estados vizinhos, no noroeste da Índia, em 1974, foi

confirmado um surto de aflatoxina B1 em 397 pessoas, após a ingestão de milho contaminado. Cerca de 108

pessoas morreram. Outro surto devido à ingestão de alimento contaminado com aflatoxina B1 foi verificado no

Quênia, em 1982, quando 20 pessoas adoeceram e 12 delas morreram (FREIRE et al., 2007).

3. MICOTOXINAS

As micotoxinas são metabólitos secundários, aparentemente sem qualquer função no metabolismo normal dos

fungos. Elas são produzidas, ainda que não exclusivamente, durante maturação do fungo. São moléculas

diferenciadas, com estruturas que variam de simples anéis heterocíclicos a anéis heterocíclicos irregularmente

dispostos. Estudos têm revelado a existência de, pelo menos, cerca de 400 diferentes micotoxinas (BETINA,

1984). A classificação das micotoxinas não é uma tarefa fácil. Em virtude da diversidade de sua estrutura

química, das origens de sua biossíntese, de seus amplos efeitos biológicos, e de serem produzidas por uma

enorme variedade de espécies fúngicas (FREIRE et al., 2007).

A maioria das micotoxinas apresentam como características serem: inodoras, insípidas, incolores, liposolúveis e

termoestáveis. (BEZERRA, 2014) As micotoxinas podem entrar nas cadeias alimentares humana e animal por

meio de contaminação direta ou indireta. A contaminação indireta de alimentos e rações ocorre quando um

ingrediente qualquer foi anteriormente contaminado por um fungo toxigênico, e mesmo que o fungo tenha sido

eliminado durante o processamento, as micotoxinas ainda permanecerão no produto final. A contaminação direta,

por outro lado, ocorre quando o produto, o alimento ou a ração, se torna contaminado por um fungo toxigênico,

com posterior formação de micotoxinas (FREIRE et al., 2007).

A maioria dos alimentos e rações pode permitir o crescimento e o desenvolvimento de fungos produtores de

micotoxinas, tanto durante a produção, quanto durante o processamento, o transporte e o armazenamento

(FRISVAD e SAMSON, 1992). A ingestão de micotoxinas pelo homem ocorre principalmente pela ingestão de

produtos vegetais contaminados, bem como pelo consumo de produtos derivados de outros alimentos, tais como

leite, queijo, carnes e outros produtos animais (SMITH et al., 1995).

3.1.AFLATOXINA

O termo aflatoxina foi formado a partir do nome do seu principal agente produtor (Aspergillus flavus toxina). As

principais aflatoxinas conhecidas são denominadas de B1, B2, G1 e G2, com base na fluorescência delas sob luz

ultravioleta (B=Blue, G=Green) e na sua mobilidade durante a realização de cromatografia de camada delgada.

Elas são produzidas principalmente por Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus (FREIRE et al., 2007).

Alguns substratos são extremamente favoráveis ao crescimento de fungos aflatoxigênicos e à formação de

aflatoxinas. A contaminação natural de cereais, sementes oleaginosas, amêndoas, especiarias e de outras

commodities é ocorrência comum em inúmeros países. Algumas culturas tornam-se contaminadas ainda no

campo, antes da colheita, enquanto que outras se contaminam após a colheita, quando são armazenadas em

condições de elevada umidade e temperatura (KLICH, 1987; DIENER et al.,1987).

As aflatoxinas possuem a capacidade de se ligarem ao DNA das células, de modo que afetam a síntese proteica,

além de contribuirem para a ocorrência da aplasia tímica (ausência congênita do timo e das paratireóides, com

conseqüente deficiência da imunidade celular; também conhecida como síndrome de Di George) (RAISUDDIN,

1993). Aflatoxinas têm propriedades oncogênicas e imunosupressivas, induzindo infecções em pessoas

contaminadas com essas substâncias.

No Brasil, aflatoxinas têm sido encontradas em amendoim e seus derivados (SANTOS et al., 2001; OLIVEIRA

et al, 1997; CALDAS et al., 2002), em alimentos destinados a bovinos e em leite líquido (TAVEIRA e MIDIO,

1999; PEREIRA et al., 2005), em amêndoas de castanha-do-brasil e de cajueiro (CASTRILLON e PURCHIO,

1988; FREIRE et al., 1999; 2000). Perus, frangos e suínos alimentados com rações contaminadas com aflatoxinas

apresentam uma nítida redução de imunidade, ocasionando sérios problemas econômicos aos produtores (SMITH

et al., 1995).

3.2.OCRATOXINA

A ocratoxina A foi descoberta em 1965 como um metabólito de Aspergillus ochraceus durante estudos que

objetivavam descobrir novas moléculas de micotoxinas (VAN DER MERWE et al., 1965). Ela apresenta

estrutura química semelhante à das aflatoxinas, sendo representada por uma isocumarina substituída, ligada a um

grupo L- fenilalanina. A Ocratoxina tem sido encontrada em aveia, cevada, centeio, trigo, grãos de café e em

outros produtos para consumo humano e animal.

Ocratoxina A está associada a nefropatias em todos os animais estudados até o momento. É no ser humano,

entretanto, onde essa substância tem a mais longa meia-vida para sua eliminação (CREPPY, 1999). Além de ser

reconhecidamente nefrotóxica, a ocratoxina A comporta-se, também, como hepatóxica, imuno-supressora,

teratogênica e cancerígena (BEARDALL e MILLER, 1994; KUIPER-GOODMAN e SCOTT, 1989; PLÉSTINA,

1996; SCHLATTER et al., 1996). Ela tem sido encontrada no sangue e em outros tecidos animais e no leite,

inclusive em leite humano (MARQUARDT e FROHLICH, 1992), bem como em carne suína para consumo

humano (FINK-GREMMELS, 1999).

3.3.FUMONISINAS

As fumonisinas constituem um grupo o qual engloba, até o momento 16 substâncias. Essas substâncias são

produzidas por diversas espécies do gênero Fusarium. As fumonisinas são responsáveis, também, pela

leucoencefalomácia em equinos e coelhos (MARASAS et al., 1988; BUCCI et al., 1996; FANDOHAN etal.,

2003); edema pulmonar e hidrotórax em suínos (HARRISON et al., 1990) e efeitos hepatotóxicos,

carcinogênicos e apoptose (morte celular programada) em fígado de ratos (GELDERBLOM et al., 1988; 1991;

1996; POZZI et al., 2000). Ao contrário de outras micotoxinas, as quais são solúveis em solventes orgânicos, as

fumonisinas são hidrossolúveis, o que tem dificultado seu estudo. É provável que muitas outras micotoxinas

permaneçam ainda desconhecidas, graças a essa característica de hidrossolubilidade. No Brasil, essas

micotoxinas já foram detectadas em vários substratos, especialmente no milho para ração animal.

3.4. TRICOTECENOS

Os tricotecenos constituem um grupo de, aproximadamente 150 metabólitos produzidos por fungos dos gêneros

Fusarium, Myrothecium, Phomopsis, Stachybotrys, Trichoderma, Trichotecium, Verticimonosporium e,

possivelmente, outros fungos mais (COLE e COX, 1981; SCOTT, 1989; UENO, 1983).

A despeito do elevado número de moléculas já identificadas, apenas algumas delas ocorrem naturalmente. Dentre

os tricotecenos mais importantes, podem ser citados o desoxinivalenol (DON), o nivalenol (NIV), a toxina T2, a

toxina HT2 e o diacetoxiscirpenol (DAS). Os tricotecenos são reconhecidos pela forte capacidade de inibição da

síntese proteica eucariótica, interferindo nos estágios inicial, de alongamento e do terminal da síntese proteica.

Os tricotecenos foram os primeiros compostos comprovadamente envolvidos na inibição da atividade da

transferase peptídica (STAFFORD e McLAUGHLIN, 1973; WEI et al., 1974).

3.5.OUTRAS MICOTOXINAS

Conforme mencionado, anteriormente, uma quantidade aproximada de 500 diferentes micotoxinas já foi isolada e

caracterizada, quimicamente, ao longo das últimas quatro décadas. Entretanto, as pesquisas têm se concentrado

naquelas substâncias que apresentam efeitos mais significativos sobre a saúde humana e animal (BETINA,

1984). Dentre estas, podemos citar ainda a zearelonona, a patulina e alcalóides ergóticos. Ainda, ultimamente,

muitas micotoxinas, até então pouco estudadas, passaram a chamar a atenção dos pesquisadores, em virtude de

seu indiscutível potencial tóxico.

4. DIAGNÓSTICO DE MICOTOXINAS

As micotoxinas encontram–se nos alimentos em baixas concentrações e assim requerem métodos analíticos

sensíveis e confiáveis para sua detecção. Devido à variedade de estruturas químicas destes compostos, não é

possível usar um método padrão para detectar todas as micotoxinas. Os métodos de extração e limpeza devem ser

confiáveis e são vitais para o sucesso da análise. Eles demandam a maior parcela do tempo total da análise e são

dependentes da matriz e da estrutura da toxina (IAMANAKA et al., 2010).

Os principais métodos de extração utilizados para análise de micotoxinas são: extração líquido–líquido, extração

por fluido supercrítico e extração em fase sólida. A extração líquido–líquido é baseada na diferença de

solubilidade das toxinas em fase aquosa e em solventes orgânicos. Na extração com fluido supercrítico é

utilizado um fluido, como o CO2 por exemplo, para extrair o composto da matriz. Esta técnica não é tão

adequada para análises de rotina devido ao seu elevado custo. Na extração em fase sólida a toxina fica retida em

cartuchos preenchidos com diversos tipos de materiais, sílica gel, fase reversa, troca iônica, carvão ativado e

anticorpos específicos para cada micotoxina, como é o caso das colunas de imunoafinidade, técnica mais

largamente utilizada atualmente (IAMANAKA et al., 2010).

Os principais métodos de separação para análise de micotoxinas são cromatografia de camada delgada,

cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas, cromatografia líquida de alta eficiência e

cromatografia gasosa. A cromatografia de camada delgada é uma técnica simples e barata, na qual é possível

analisar qualitativamente vários compostos concomitantemente, e pode ser utilizada também como método semi–

quantitativo. A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas é uma técnica recente e é considerada

atualmente, referência na análise de micotoxinas. Nesta técnica, não há necessidade da limpeza da amostra e

várias micotoxinas podem ser analisadas simultaneamente (IAMANAKA et al., 2010)..

Atualmente existem kits de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) para análise das principais

micotoxinas, porém, as reações falso-positivas dificultam ainda, a sua utilização como alternativa aos métodos

reconhecidos pela AOAC (Association of official analytical chemists), sendo necessária a confirmação por

métodos químicos como a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Os imunoensaios desempenham

um papel importante na análise de micotoxinas, pois disponibilizam uma gama de métodos que podem ser

utilizados tanto nos laboratórios como ensaios quantitativos, como no campo, para triagem (ONO et al., 2004).

5. TRATAMENTO E PREVENÇÃO

Logo, a melhor estratégia é o controle, um sistema profilático que impeça a proliferação e crescimento fúngico,

inibindo, conseqüentemente, a formação de aflatoxinas. A curto prazo devemos nos concentrar na armazenagem

e conservação dos grãos para consumo humano e dos animais e, a longo prazo, na seleção de variedade de

cereais mais resistentes à infecção fúngica e técnicas de manejo fitossanitário são de interesse prático para o

controle das micotoxinas (MALLMAMM et al., 1994).

Medidas preventivas devem ser tomadas em todo o estágio de plantio, colheita, transporte, estocagem e

processamento do produto final. Algumas medidas práticas que podem contribuir para se não eliminar

totalmente, pelo menos manter em níveis bem baixos e aceitáveis a presença de micotoxinas em alimentos

destinado ao consumo humano e dos animais, são: adoção de práticas agrícolas corretas; destoxicidade quando

possível de alimentos e rações contaminadas; controle dos alimentos e rações em relação à contaminação pelas

micotoxinas de maior destaque.

6. LEGISLAÇÃO BRASILEIRA

Legislações têm sido adotadas em muitos países com o intuito de proteger os consumidores contra os efeitos

nocivos das micotoxinas em alimentos in natura e processados, e até mesmo em rações para animais de abate e

de estimação. As legislações mais conhecidas são aquelas que regulamentam os níveis de aflatoxinas, não

obstante legislações para outras micotoxinas estejam sendo também implementadas rapidamente. Existem

diversos fatores que conduzem à elaboração dessas legislações. Por exemplo, existem os aspectos científicos, tais

como a disponibilidade de informações toxicológicas, o conhecimento acerca da distribuição das micotoxinas nos

alimentos, além da metodologia analítica. Também, devem ser considerados os aspectos políticos e econômicos,

principalmente com relação aos interesses comerciais e aos impactos na disponibilidade da oferta de alimentos

(VAN EGMOND e DEKKER, 1995;VERARDI e FROIDMONT-GORTZ, 1995; VAN EGMOND e JONKER,

2004).

Até 2003, tem se observado que um maior número de micotoxinas encontra- se sob legislação, tendo-se elevado

também o número de produtos e commodities analisados. Os limites de tolerância têm se mantido nos mesmos

níveis ou têm mostrado uma tendência para decrescerem, enquanto que os métodos de amostragem e de análise

têm se tornado mais diversificados e muito mais detalhados. Uma tendência extremamente interessante é a

harmonização das legislações nos países pertencentes aos diferentes blocos econômicos, tais como

Austrália/Nova Zelândia, Comunidade Européia e Mercosul (FREIRE et al., 2007).

Em 22 de fevereiro de 2010 foi publicado no Diário Oficial da União, nº 37, página 72-73, a Resolução RDC Nº

7, de 18 de fevereiro de 2010, que dispõe sobre limites máximos de micotoxinas em alimentos, incluindo limites

para aflatoxinas, ocratoxina A, desoxinivalenol, fumonisinas, patulina e zearalenona, em alimentos prontos para a

oferta ao consumidor e em matérias-primas (IAMANAKA et al., 2010).

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Com base no conteúdo exposto, é esperado que as micotoxinas devam continuar sendo objeto de pesquisa de

institutos e universidades, para que produtores, indústrias e governos tenham informações para melhorar e

garantir a qualidade sanitárias dos produtos de origem animal.

De modo que, o assunto de micotoxinas é muito importante no âmbito de saúde humana e animal, e para a

economia. As medidas de prevenção ainda é o melhor caminho para o controle. Para tanto, o uso de métodos para

remoção ou descontaminação necessitam serem bem estabelecidos afim de auxiliar o processo.

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