apostila - provas bioquímicas - 2014

7/25/2019 Apostila - Provas Bioqumicas - 2014

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DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA APLICADAProf Zilma G. Nunes

INVESTIGAO DA ATIVIDADE METABLICA DE BACTRIASPROVAS BIOQUMICAS

MEIOS DE TRIAGEM

Os meiosTSI (triple sugar iron),Kliger, CV (Costa e Vernin), SV (Surraco e V. Pereira), Rugai ou IAL(InstitutoAdolfo Lutz) entre outros, oferecem concomitantemente vrias informaes de natureza bioqumica, permitindoestabelecer um diagnstico presuntivo imediato.

- MEIO DETSI

O TSI ou trplice acar e ferro um meio slido para ser usado em tubos de ensaio 13 X100mm, envasado de talmodo que apresenta uma base e uma inclinao. constitudo de glicose (0,1%), lactose (1,0%) e sacarose(1,0%), peptonas, aminocidos (incluindo sulfurados), tiossulfato de sdio e citrato frrico amoniacal (indicador daproduo de H2S), com pH neutro e um indicador de pH, o vermelho de fenol.

O meio semeado com agulha por picada na base e estrias na superfcie. Aps o crescimento da bactria pode-se observar os seguintes resultados:

- Ausncia de fermentao de qualquer dos acares, ficando o meio inalterado, ou at mesmo utiliza osaminocidos com produo de aminas que alcalinizam o meio.

- Fermentao somente a glicose,de modo que os cidos formados mudam o pH do meio apenas na base,que se torna amarelae a inclinao vermelha por utilizao dos aminocidos (por respirao), alcalinizando-aeneutralizando a pequena quantidade de cidos, pois a concentrao de glicose baixa - assim o resultado expresso como K/A(inclinao alcalina e base cida);

- Fermentao a lactose ou a sacarosecom viragem do indicador de todo o meio para amarelo , tanto a basecomo a inclinao permanecem cidas, pois os lcalis produzidos na inclinao so facilmente neutralizados pelagrande quantidade de cidos produzidos na base,tendo em vista quea concentrao desses acares dezvezes maior que a da glicose - o resultado expresso como A/A(inclinao e base cidas).

Nos dois ltimos casos, existe a possibilidade de detectar gases resultantes da degradao do cido frmico emhidrognio e anidrido carbnico, se a bactria possuir o sistema hidrognio frmico liase (os gases so indicadosou visualizados indiretamente por levantar ou fragmentar o meio) o resultado representado como A/A com gs.

H tambm a possibilidade da bactria produzir H2Spor utilizar anaerobiamenteo tiossulfato, captando eltronsatravs da tiossulfato redutase, resultando em gs sulfdrico e sulfito. O sulfeto de hidrognio na presena de saisde ferro forma sulfeto ferroso, originando um precipitado negro insolvel - dessa forma o resultado dadocomo A/A com gs e H2S.

Desse modo, pode-se observar num nico meio os processos fermentativos, respirao aerbia e anaerbia. Autilizao dos acares e aminocidos na inclinao se d apenas porrespirao aerbia, enquanto que na baseos processos so realizados por fermentao (incluindo tambm putrefao, quando da utilizao dosaminocidos bsicos, sulfurados, triptofano, com produo de gs sulfdrico, mercaptanas, aminas, dentre outras).J a utilizao do tiossulfato ocorre por respirao anaerbia, gerando tambm gs sulfdrico.

Este meio , geralmente, usado para diferenciar os gneros das Enterobacteriaceaee para distinguir esta famliade outros bastonetes Gram negativo de origem intestinal.

Tanto o meio agar TSI (triple sugar iron) como o agar Kligler Iron contm glicose em pequena concentrao(0,1%), lactose em concentrao superior (1%), o indicador de pH, vermelho de fenol, para detectar a produo decidos resultantes da fermentao dos hidratos de carbono, tiossulfato de sdio, substrato para a produo deH2S, e sulfato de ferro para a deteco desse produto final. A diferena entre estes dois meios diferenciais que o

TSI possui mais um acar, a sacarose, em concentrao igual da lactose (1%).Ambos os meios so inoculados por picada, na base e por estria, na rampa. essencial que as culturas sejamobservadas aps 18 a 24 h de incubao para evitar que os hidratos de carbono sejam completamente utilizadose que ocorra degradao das peptonas, formando produtos finais alcalinos. na rampa que se faz a leitura dalactose e da sacarose, no fundo do cilindro a da glicose e no meio do cilindro a de H 2S.


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- Rampa alcalina (vermelha) e base cida (amarela):

S a glicose foi fermentada. Os microrganismos degradam, preferencialmente, a glicose em primeiro lugar, mascomo este substrato est presente em concentrao mnima, a quantidade de cido produzida limitada e rapidamente oxidada na superfcie da rampa. Por outro lado, as peptonas do meio so tambm usadas naproduo de substncias alcalinas. No cilindro, a reao cida mantida devido tenso reduzida do oxignio eao crescimento mais lento dos microrganismos. O indicador, vermelho de fenol, muda para amarelo devido

persistncia da formao de cido no cilindro.- Rampa cida (amarela) e base cida (amarelo):

Ocorreu a fermentao da lactose e/ou da sacarose, aps a utilizao total da glicose. Como as duas primeirassubstncias esto presentes em altas concentraes so substratos para a atividade fermentativa contnua commanuteno da reao cida (cor amarela) em todo o meio (rampa e base).

Produo de gs:Nota-se a ocorrncia de fraturas no meio de cultura. Quando ocorre em grande quantidade pode levantar o meiodo fundo do tubo.

Produo de H2S:Ocorre enegrecimento, principalmente na zona intermdia do cilindro. Isto deve-se ao facto do microrganismo emestudo ser capaz de produzir sulfureto de hidrognio (H2S), que se conjuga com um composto de ferro existente

no meio, dando origem a sulfureto de ferro que, sendo insolvel, precipita.- Rampa alcalina (vermelha) e base alcalina (vermelho) e/ou inalterado (tijolo):

No ocorreu fermentao dos hidratos de carbono presentes no meio, nem produo de gs ou de H 2S. Aspeptonas do meio podem ser catabolizadas sob condies anaerbias e/ou aerbias, resultando num pH alcalinodevido produo de amnia. Se s ocorrer degradao aerbia das peptonas, a reao alcalina s evidenciada na superfcie da rampa. Se houver degradao aerbia e anaerbia das peptonas, a reao alcalina visvel em todo o meio.

Interpretao dos possveis resultados do meio TSI:

PICE BASE H2S GS Interpretao mais provvelVermelho Vermelho Neg Neg Sem crescimento: bactria exigenteVermelho Vermelho Neg Neg Crescimento na superfcie: no fermentador ou Gram +Amarelo Vermelho Neg Neg Crescimento na superfcie: Gram + ou no semeadura da baseAmarelo Amarelo Neg V Enterobactrias ou Aeromonas Lac negAmarelo Amarelo Pos V Salmonella, Proteus, Morganella, Providncia e Citrobacter

Pos.: positivo; Neg.: negativo; V.: varivel.


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- MEIO IAL / RUGAI

Atualmente conhecido como IAL(Meio Instituto Adolfo Lutz) foi inicialmente proposto por Rugai & Arajo, em1986, com a inteno de eliminar as falhas existentes nos meios similares at ento usados.

Em 1972, Pessoa & Silva, desenvolveram um meio que possibilitou a pesquisa da motilidade e da descarboxilaoda lisina, concomitantemente com as reaes obtidas no meio clssico de Rugai & Arajo.

Este meio utilizado para identificar as principais espcies de Enterobactrias, Vbrios e Aeromonas, permitindoem um s tubo a leitura, das seguintes reaes: motilidade da bactria indicado pela turvao da lisina na base,lisina descarboxilase, fermentao da glicose em profundidade e da sacarose na superfcie do meio, produo degs sulfdrico (H2S), gs em glicose, utilizao do aminocido L-triptofano (desaminao), hidrlise da uria e notampo do tubo, um desenvolvimento de colorao avermelhada que indica a formao de indol.

O meio IAL constitudo por duas fases, superior e inferior, separadas por uma camada intermediria, chamadavascar, de cerca de 2 mm (0,2 mL).

Nota - Vascar - Vaselina lquida ......... 90 mLCera de carnaba ...... 10 g

Inoculao:com o auxlio de uma agulha bacteriolgica, coletar a amostra da colnia a ser pesquisada e inocularatravs de picada at o fundo do tubo, realizando estrias na superfcie do meio. Incubar em estufa a 37C por 24horas.

Leitura do meio de IAL

Fase Superiorpice:azul: sacarose negativa LTD negativoamarelo: sacarose positiva LTD negativoverde garrafa: sacarose negativa LTD positivocastanho: sacarose positiva LTD positivo

Base:amarelo: glicose positivaazul: uria positivapreto: H2S positivoamarelo com bolhas : glicose e gs positivos

Fase Inferior:violeta : lisina descarboxilase positivaamarelo : lisina descarboxilase negativacom turvao : motilidade positiva (mvel)sem turvao : motilidade negativa se observa nitidamente ocrescimento

Teste de indol na rolha:Aps a incubao pingar assepticamente, 2 3 gotas do reativo deKovacs na rolha do algodo hidrfilo.Indol positivo: algodo fica rosa ou vermelhoIndol negativo: algodo permanece sem cor ou com colorao amarelo.


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- PROVA DE FERMENTAO DE ACARESObjetivo:Determinar a capacidade de um microrganismo de utilizar um determinado acar, com produo de cido.

Base BioqumicaCarboidratos: a) polissacardeos: amido e glicognio

b) dissacardeos: maltose, sacarose, lactosec) monossacardeos: glicose, f rutose

Duas vias metablicas: Oxidao ou Fermentao - sacardeo enzima cidos

Metodologiaa) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio base de Indicador

de Andrade. Pode-se utilizar o mesmo inculo para at 04 tubos ou maisb) Incubar a 37C por 18-24h.

Resultado e Interpretao

RESULTADO COR DO MEIO INTERPRETAO

Positivo Amarelo Presena de cido

Negativo Rosa Ausncia de cido

- PROVA DE PRODUO DE GS A PARTIR DE ACARESObjetivo:Determinar a capacidade de um microrganismo fermentar a glicose incorporada a um meio base,com a produo de gs ou sem a produo de gs.

Base BioqumicaNa fermentao, substratos como hidratos de carbono e lcoois sofrem uma desassimilaoanaerbia, podendo ocorrer produo de compostos orgnicos cidos (cido frmico) que podemser degradados (formiases) gerando gases, como hidrognio e o CO2.

glicose fermentao cido frmico formiase H2 + CO2


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Metodologiaa) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio base de Indicador de Andrade, contendo tubo deDurhan invertido.b) Incubar a 37C por 18-24h.

Resultado e InterpretaoA produo de gs pode ser evidenciada em caldos pela formao de bolha no interior do tubo de Durham ou pela

presena de rachaduras, no caso dos meios slidos.


PositivoAmarelo sem bolhasAmarelo com bolhas

Presena de cido s/ gsPresena de cido c/ gs

Negativo Rosa Ausncia de fementao

- PROVA DE VERMELHO DE METILA (VM)Objetivo:

Determinar a habilidade de um microrganismo de produzir alta concentrao de cidos orgnicos relativamenteestveis a partir da fermentao da glicose, de modo a suplantar a capacidade tampo existente no meio decultura sem, no entanto, metaboliz-los.

Base BioqumicaFermentao cida mista.

Glicose fermentao cido lticocido acticocido frmico H2CO2cido etlico

Metodologiaa) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio de Clark e Lubsb) Incubar a 37C por 24h.c) No momento da leitura, retirar 2,5mL do meio e acrecentar 0,5mL do indicador (vermelho demetila em soluo alcolica a 60%)


RESULTADO COR DO MEIO INTERPRETAOPositivo Vermelho Fermentao cida mistaNegativo Amarelo Ph 6,0

- PROVA DE VOGES PROSKAUER (VP)Objetivo:Determinar a habilidade de um microrganismo de produzir acetona (acetilmetil carbinol), 2,3- butanediol ou diacetila partir da fermentao da glicose.

Base BioqumicaFermentao do tipo butilenogliclica, na qual a glicose fermentada a acetona.A adio do reagente de Barritts (soluo 40% KOH e soluo de -naftol em etanol absoluto) permite detectar apresena de acetilmetilcarbinol (acetona) que percursor da sntese de 2,3 butanediol, pois ocorre a formao deum complexo rosa/vermelho que d essa cor ao meio de cultura. O desenvolvimento de uma cor rosa/vermelha nacultura, 15 minutos aps a adio do reagente de Barritts representa uma prova positiva. A ausncia dessa cor uma prova negativa. Este tipo de fermentao da glicose caracterstico do E.aerogenes.

Glicose fermentao acetona (+ -naftol + KOH 40% cor)


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Metodologiaa) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio de Clark e Lubs.b) Incubar a 37C, por 02 a 05 dias.c) No momento da leitura, acrescentar 0,6 mL (por mL de meio) de -naftol a 5%d) Adicionar 0,2 mL (por mL de meio) de soluo de KOH em soluo alcolica a 40% e agitarvigorosamente por aproximadamente 3 minutos. Depois de decorrido pelo menos 5 minutos,verificar a colorao do caldo.


RESULTADO COR DO MEIO INTERPRETAOPositivo Vermelho pH 4,5Negativo Amarelo pH 6,0

- UTILIZAO DE FONTE DE NITROGNIO: descarboxilao da lisina e da ornitina; dehidrogenao daarginina.

Objetivo:Determinar a capacidade de um microrganismo de utilizar um determinado aminocido, atravs dadescarboxilao.

Base Bioqumica

A descarboxilao de aminocidos, como a lisina, resulta na produo de uma amina e de dixido de carbono. Asbactrias que produzem a enzima descarboxilase da lisina podem descarboxilar a lisina e usar as aminas comopercursoras para a sntese de outras molculas. Adicionalmente, quando certas bactrias fazem fermentao soproduzidos produtos cidos que tornam o meio cido e portanto hostil. Assim, muitas descarboxilases soactivadas por um pH baixo, pois ao remover os grupos cidos dos aminocidos produzem aminas que aumentamo pH do meio que fica mais adequado.

A descarboxilao da lisina pode ser detectada semeando a bactria em um caldo (base de Moeller) contendoesse aminocido, glicose e um indicador de pH (prpura de bromocresol).

As bactrias descarboxilam aminocidos mais ativamente em meio ligeiramente cido e em anaerobiose. Assim,antes da incubao deve ser colocado leo mineral no caldo para impedir o oxignio de atingir as bactrias e inibira reaco. Os cidos produzidos pelas bactrias a partir da fermentao da glicose vo inicialmente baixar o pHdo meio e causar a mudana de cor do indicador de pH de prpura para amarelo. O pH cido ativa ento a enzimaque causa descarboxilao da lisina a aminas e a subsequente neutralizao do meio, que muda de amarelo paraprpura outra vez.

Protenas a) Peptdeosb) Aminocidos

Aminocidos descarboxilase amnia + CO2

Metodologiaa) Inocular a bactria no meio para descarboxilao de aminocidos com auxlio deagulha de inoculao.b) Acrescentar cerca de 0,5mL de leo mineral ao meio de cultura assepticamente. Casoo meio j esteja com o leo mineral no momento da inoculao, cuidar para que a agulhano emita aerossis contaminados ao ser flambada.c) Incubar a 37 C por 24-48h.



Positivo Roxo Presena de amnia ou o microrganismono utiliza a glicose

Negativo AmareloFermentao do acar sem utilizao do

aminocido. Ausncia de amnia

Controle (sem aminocido) Amarelo Fermentao do acar


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- PROVA DE PRODUO DA UREASEObjetivo:Determinar a capacidade do microrganismo em degradar a uria, com formao de amnia.

Base BioqumicaA urease uma enzima hidroltica que ataca a ligao entre o azoto e o carbono em compostos como a ureia,formando o produto final alcalino, amnia, alm de CO2e H2O.

uma prova importante para diferenciar espcies de Proteusde outras bactrias entricas lactose negativas.A presena de urease detectada quando o microrganismo cresce num meio com ureia (meio de ureia deChristensen) que contm tambm o indicador de pH vermelho de fenol. Quando a ureia desdobrada pelaurease, a amnia acumula-se no meio tornando-o alcalino.Este aumento de pH faz com que o indicador de pH presente no meio (vermelho de fenol) passe de amarelo arosa, indicando uma reao positiva para a presena de urease. A ausncia da colorao rosa indica uma reaonegativa.No entanto, basta que ocorra o aparecimento de uma zona do meio rosa para se considerara reao positiva; apenas os microrganismos que produzem precocemente urease tmcapacidade para modificar a cor de todo o meio para rosa forte.

Metodologiaa) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio base.

b) Incubar a 37C por 24h.


RESULTADO COR DO MEIO INTERPRETAOPositivo Rosa Presena de amniaNegativo Amarelo Ausncia de amnia

- PROVA DO INDOLObjetivo:Determinar a habilidade do microrganismo em produzir indol a partir do triptofano.

Base BioqumicaTriptofano triptofanase indol + piruvato + amnia Reativo de Kovacs

Indol + p-dimetilaminobenzaldeido composto quinoidal vermelhoMetodologiaa) Inocular a bactria com auxlio de agulha de inoculao no meio SIM com o cuidado de nochegar ao fundo do tubo (2/3 do meio)b) Incubar a 37C, com papel de filtro embebido em Reativo de Kovac`s (p-dimetilaminobenzaldeido) junto tampa do tubo ou acrescentar algumas gotas do reativo aomeio aps o perodo de incubao.



Positivo Vermelho Composto quinoidalNegativo Incolor Ausncia do composto

A presena deste composto ocorre ao longo da linha de inoculao e indica que houve produo de sulfureto dehidrognio (reaco positiva). A ausncia do precipitado negro evidencia uma reaco negativa.

- TESTE DE PRODUO DE CIDO SULFDRICOObjetivo:

Determinar a habilidade do microrganismo em produzir acido sulfdrico, por degradao de aminocidossulfurados (cistena).

Base BioqumicaMuitas protenas so ricas em aminocidos sulfurados, como a cistena. Quando estas protenas esto presentesno meio de cultura podem ser degradadas pelas enzimas microbianas a aminocidos que so utilizados como


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nutrientes. A cistena, na presena da enzima cistena dessulfurase, perde o seu tomo de enxofre, que por suavez reduzido pela adio de hidrognio da gua para formar H2S. O H2S ento produzido pela hidrogenao(reduo) do enxofre orgnico presente no aminocido cistena.O meio de cultura agar SIM contm peptonas (a cistena um dos componentes) e tiossulfato de sdio comosubstratos sulfurados, e sulfato ferroso amoniacal (Fe (NH4)2SO4) que actua como indicador da presena de H2S.Como o H2S incolor e, por conseguinte, no visvel. O sulfato ferroso amoniacal serve como indicador, pois oferro combina-se com o H2S formando sulfureto de ferro que um precipitado negro insolvel.

Por outro lado, o H2S pode ser produzido pela reduo de compostos sulfurados inorgnicos, como os tiossulfatos(S2O3

2-), os sulfatos (SO42-) e os sulfitos (SO3

2-). Quando o meio contm tiossulfato de sdio algunsmicrorganismos tm capacidade para o reduzir a sulfitos usando a enzima tiossulfato redutase, com libertao deH2S. Os tomos de enxofre, ento, atuam como receptores de hidrognio durante a oxidao dos compostosinorgnicos.

Cistena cistena sulfidrilase acido pirvico + cido sulfdrico + amnia + gs de cido sulfdrico

ons frricos sulfeto

Metodologiaa) Inocular a cultura com auxlio de agulha de inoculao no meio SIM, com o cuidadode no alcanar o fundo do meio de cultura (2/3 do meio).

b) Incubar a 37 C.c) Observar se h crescimento bacteriano e a formao de precipitado negro.

Resultado e InterpretaoA formao de precipitado negro indica a presena de H2S no meio. Na ausncia deH2S o meio permanece inalterado.

RESULTADO COR DO MEIO INTERPRETAOPositivo Negro Presena de H2SNegativo Incolor Ausncia de H2S

- PROVA DE MOTILIDADEObjetivoVerificar se o microrganismo dotado de flagelos (mvel) ou no (imvel)

Base BioqumicaA motilidade observada atravs do aspecto do meio, isso decorre pelo do fato de o meio ser semi-slido, o quepermite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo caso a bactria possua flagelos. Se amotilidade positiva o aspecto do meio ficar turvo enquanto que motilidade negativa o crescimento s serobservado na zona da picada. Fica mais fcil de observar a motilidade pondo os tubos contra uma folha de papelpautado, comparando o tubo inoculado com um tubo no inoculado.

Metodologiaa) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio base.

b) Incubar a 37C por 24h.Resultado e Interpretao

RESULTADO ASPECTO DO MEIO INTERPRETAOPositivo Turvo Presena de flagelosNegativo Inalterado Ausncia de flagelos

- PROVA DA OXIDAO E FERMENTAO DA GLICOSE ( O\F)Objetivo:Determinar o tipo de metabolismo do microrganismo, se e oxidativo, fermentativo ou facultativo.

Metodologiaa) Inocular a bactria com auxlio de agulha de inoculao em dois tubos contendo meio com verde debromocresol.b) Cobrir um dos tubos com 1 mL de leo mineral estril. c) Incubar a 36 C.


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RESULTADO COR DO MEIO INTERPRETAOOxidativo Amarelo ou verde no tubo sem leo Aerbio

Fermentativo Amarelo nos dois tubos Facultativo

- PROVA DO CITRATOObjetivo:Determinar a habilidade do microrganismo de utilizar o citrato como nica fonte de carbono(meio de citrato de

Simmons).

Base BioqumicaNa ausncia de glicose ou lactose fermentveis, alguns microrganismos so capazes de usar o citrato como nicafonte de carbono para produzir energia. Esta capacidade depende da presena de citrato permease que facilita otransporte do citrato para o microrganismo. Uma vez dentro da clula o citrato degradado pela enzima citratase,produzindo cido oxalactico e acetato. Estes produtos so depois convertidos enzimaticamente em cido pirvicoe CO2.

O meio de citrato de Simmons contm citrato de sdiocomo nica fonte de carbono, NH4+como fonte de azoto e

o indicador de pH,azul de bromotimol. Esta prova feita com meio em rampa e sem base, uma vez que o O2necessrio para a utilizao do citrato. Quando o microrganismo remove o citrato do meio e o oxida, ocorrelibertao de CO2. Durante esta reao o meio torna-se alcalino, pois o CO2 gerado combina-se com sdio

(fornecido pelo citrato de sdio) e gua para formar carbonato de sdio, que um produto alcalino. A presena decarbonato de sdio faz aumentar o pH e virar o indicador de pH do meio de verde para azul forte.

Citrato +NH4 piruvato CO2 + Na + H2O Na2CO3 (pH alcalino)

Metodologiaa) Inocular a bactria, com auxlio de agulha de inoculao, em estrias na superfcie do agarinclinado.b) Incubar a 37C/24h.



Positivo Azul Utilizao do citratoNegativo Verde No houve utilizao do citrato


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- PROVA DO MALONATOObjetivo:Verificar se a bactria utiliza malonato de sdio como nica fonte de carbono e sulfato de amnio como nicafonte de nitrognio.Base BioqumicaO malonato liga-se competitivamente desidrogenase succnica, impedindo sua ao cataltica sobre o cidosuccnico, com interrupo do ciclo de Krebs. Esta reao tira da bactria sua principal fonte de energia e impede

a formao de outros intermedirios necessrios ao metabolismo. A utilizao do sulfato de amnio produzhidrxido de sdio, o qual alcaliniza o meio tornando-o azul. A mudana de cor verde para o azul propiciado peloaumento do pH, visualizado atravs da viragem do indicador azul de bromotimol do verde para o azul.

Metodologiaa) Inocular a bactria, com auxlio de ala de inoculao no caldo malonato.b) Incubar a 37C/24hc) Observar se houve crescimento bacteriano e a colorao do meio.

Resultado e InterpretaoA viragem da cor verde para o azul indica prova positiva para a utilizao do malonato. Amanuteno da corverde indica prova negativa para a utilizao do malonato.

RESULTADO COR DO MEIO INTERPRETAOPositivo Azul Utilizao do malonatoNegativo Verde No houve utilizao do malonato

- PROVA DO NITRATO

Objetivo:Verificar a capacidade de um microrganismo de reduzir o nitrato a nitrito.

Base BioqumicaA reduo dos nitratos por alguns microrganismos aerbios ou anaerbios facultativos ocorre na ausncia de

oxignio. Nestes microrganismos a respirao anaerbia um processo oxidativo pelo que as clulas usamsubstncias inorgnicas como os nitratos (NO3-) ou os sulfatos (SO4

2-) para fornecer oxignio que sosubsequentemente utilizados como aceitadores finais de eltrons durante a formao de energia. Nesse processo,os nitratos so reduzidos a nitritos (NO2

-).

Por outro lado, alguns desses microrganismos possuem capacidade enzimtica para atuarem sobre os nitritosreduzindo-os a amnia (NH3

+) ou a azoto molecular (N2). A capacidade de alguns microrganismos reduzirem osnitratos pode ser usada na sua identificao.

Metodologiaa) Semear o microrganismo em um caldo nutritivo suplementado com 0,5% de nitrato de potssio (KNO 3) comofonte de nitratos (caldo nitrato), com auxlio de ala bacterilogica.b) Incubar a 37C/24h.

c) Proceder leitura dos resultados adicionando 0,5mL da soluo A (c. sulfanlico) e, a seguir, 0,5mL dasoluo B ( -naftilamina). Os nitritos presentes no meio vo reagir com esses reagentes produzindo umamudana de cor imediata para vermelho.

Nota: se a cultura no mudar de cor existem duas possibilidades: o microrganismo possui enzimas que reduziramos nitratos a nitritos e estes a amnia ou a azoto molecular ou os nitratos no foram reduzidos pelomicrorganismo.Resultado e Interpretao

RESULTADO COR DESENVOLVIDA INTERPRETAOPositivo Vermelho a vinho Reduz nitrato a nitritoNegativo Inalterado* No reduz nitrato a nitrito

* - Para determinar se os nitratos foram ou no reduzidos a nitritos, adiciona-se uma pequena quantidade de zincoem p cultura incolor que j contm os reagentes. Uma vez que o zinco reduz os nitratos a nitritos, oaparecimento de uma cor vermelha aps a sua adio revela que os nitratos no foram reduzidos a nitritos pelomicrorganismo (reao negativa). Por outro lado, se a adio de zinco no produzir uma mudana de cor indicaque os nitratos j tinham sido reduzidos a nitritos e este a amnia ou a azoto (reao positiva).


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- PROVA DE INIBIO PELO KCNObjetivo:Verificar se o microrganismo capaz de crescer em presena de 0,5% de KCN.

Base BioqumicaO KCN inibe a cadeia respiratria por ligao aos citocromos, o que, por sua vez, inibe o crescimento microbiano.No entanto, algumas bactrias so tolerantes ao KCN e por isso conseguem crescer em sua presena.

Metodologiaa) Inocular a cultura, com auxlio de uma agulha bacteriolgica, um tubo de gua peptonada com KCN.b) Incubar a 37C/24h.c) Observar se houve crescimento bacteriano.Nota: O meio distribudo em tubos 13x 100mm1mL por tubo.


RESULTADO ASPECTO DO MEIO INTERPRETAOPositivo Turvo Tolerante ao KCNNegativo Inalterado No tolerante ao KCN

- PROVA DA CITOCROMO-OXIDASEObjetivo:Determinar se um microrganismo possui a enzima citocromo oxidase.

Base BioqumicaEste sistema enzimtico est relacionado com o citocromo c da cadeia respiratria de alguns microrganismos, queoxidam o reagente dihidrocloreto detetrametil-p-fenilenodiamina originando colorao prpura. Este reagente,de cor rosa plido, age como um substrato artificial, fornecendo eltrons e, consequentemente, ficando oxidado etornando-se um composto escuro (prpura) na presena de oxidase e de oxignio livre.

Metodologiaa) Colocar uma ou duas gotas do reagente incolor dihidrocloreto tetrametil p-fenilenodiamina, recm-preparado e protegido da luz, em uma tira de papel de filtro.b) Espalhar uma colnia do microrganismo (cultura de 18-24h) sobre a rea do papel de filtro contendo oreagente, utilizando uma ala de platina, um basto de vidro ou palito de madeira.c) Observar por at 60seg.

e. C e.e. COLI

Resultado e InterpretaoA prova considerada positiva quando na mistura do reagente com a massa bacteriana desenvolve-se a corprpura em at 1 minuto e considerada negativa quando a colorao da massa bacteriana permanece comcolorao inalterada. A alterao da cor da cultura aps o perodo de tempo estipulado consequncia daoxidao do reagente em contato com o ar.

RESULTADO COR DESENVOLVIDA INTERPRETAOPositivo Prpura Citocromo oxidase +Negativo Inalterado Citocromo oxidase -

As enterobactrias so oxidase negativas e podem ser diferenciadas de outras famlias de bastonetes Gramnegativos. Como a famlia Pseudomonadaceae e a famlia Vibrionaceae. A prova pode ser feita tambm emculturas em meios slidos, adicionando-se o reagente oxalato de p-aminodimetilanilina. A reao inicia-se com odesenvolvimento de cor rsea, marrom e finalmente uma colorao negra na superfcie das colnias, indicativa daproduo de citocromo-oxidase (teste positivo). O teste negativo se no ocorrer alterao da cor ou houver odesenvolvimento de uma cor rsea plida.

E. coli Pseudomonas

Vibrio


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- ATIVIDADE DA -GALACTOSIDASE (PROVA DA ONPG)

ObjetivoVerificar se microrganismos que se comportam como lactose-negativos produzem a enzima -galactosidase,sendo deficientes apenas da permease.

Base Bioqumica

As enzimas essenciais ao metabolismo deste hidrato de carbono so a -galactosidase que hidrolisa a lactose, agalactose e glicose e uma permease que transporta a lactose atravs da membrana celular, tornando-a disponvelpara -galactosidase intracelular. Algumas bactrias so deficientes na produo da permease e por issocomportam-se com se fossem lactose negativas. Os verdadeiros no fermentadores da lactose no possuem a -galactosidase.Nesta prova, em vez de pesquisar simplesmente a fermentao da lactose, pesquisa-se a produo de -galactosidase. Com este propsito, utiliza-se o substrato artificial ONPG (o-nitrofenil--D-galactopiranosdeo) nolugar da lactose. Um nmero suficiente de molculas de beta-galactosidase pode difundir para fora das clulascatalisando a hidrlise do ONPG, que d origem a galactose e o-nitrofenol, O ONPG incolor, mas o o-nitrofenoloriginado na hidrlise, amarelo em soluo alcalina. O teste do ONGP muito mais sensvel que a prova defermentao da lactose convencional.

Metodologia

a)Num tubo de ensaio contendo gua destilada e um disco de ONPG, inocula-se a bactria,aps esta ter sido semeada num meio com lactose;b) Incubar a 37C.c) Aps 20 minutos a 1 hora de incubao, verifica-se se ocorreu mudana de cor de incolorpara amarelo, caso contrrio a incubao deve continuar por at 24 horas.

Resultado e InterpretaoSe o tubo ficar amarelo a prova positiva para a atividade da -galactosidase. Se o tuboficar incolor a prova negativa para a atividade da -galactosidase.

RESULTADO COR DO MEIO INTERPRETAOPositivo Amarelo

Presena de -galactosidaseNegativo Incolor Ausncia de -galactosidase

- PROVA DA FENILALANINA DESAMINASEObjetivoVerificar se as bactrias produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina.

Base BioqumicaQuando a fenilalanina presente no meio desaminada, d origem ao cido fenilpirvico, que reage com o cloretofrrico (10%) adicionado ao meio, formando uma cor verde.No entanto, algumas bactrias podem usar os cidos orgnicos em reaes de biosntese, alm de eliminarem as

aminas formadas.

Metodologiaa) Inocular a bactria, com auxlio de ala de inoculao no caldo malonato.b) Incubar a 37C/24hc) Acrescentar algumas gotas da soluo de cloreto frrico a10%.d) Observar se h surgimento de cor.

Resultado e InterpretaoSe o reagente e a superfcie do meio de cultura permanecerem inalterados o resultao daprova negativo e se tomarem a colorao verde ou verde azulada o resultado positivo.


Positivo Verde Presena de cido fenilpirvicoNegativo Incolor Ausncia decido fenilpirvico


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- PROVA DA CATALASEObjetivo:Determinar se o microrganismo possui a enzima catalase

Base Bioqumica

A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio (H2O2) em gua e oxignio.

H2O2 catalase 2H2O + O2

Metodologiaa) Inocular a bactria com auxlio de agulha de inoculao em agar inclinado ouem placa;b) Incubar a 37C/24h;c) Verter 0,1 mL (ou algumas gotas) de gua oxigenada sobre o crescimentobacteriano e observar.Nota: Este teste pode ser feito tambm colocando uma colnia em uma lmina eadicionando-se uma gota de gua oxigenada.

Resultado e InterpretaoRESULTADO ASPECTO DO MEIO INTERPRETAO

Positivo Formao de bolhas Catalase +Negativo Ausncia de bem bolhas Ausncia de catalase

- PROVA DA COAGULASEObjetivoVerificar a capacidade de microrganismos coagularem o plasma meso em presena de anticoagulante.

Base Bioqumica

As coagulases so enzimas com capacidade para coagular o plasma sanguneo atravs de um mecanismo similarao da coagulao normal.

A atividade da coagulase utilizada para distinguir a espcie Staphylococcusaureus das demais espcies do gnero. Pode ser feita de duas maneiras: emlmina e em tubo.Nacoagulase ligada ou conjugada, pesquisa-se a presenada enzima que se encontra ligada parede celular bacteriana (no est presenteem filtrados de cultivos. Quando as clulas bacterianas so suspensas em plasma(fibrinognio), formam-se cordes de fibrina entre elas, o que causa agrupamentosob a forma de grumos visveis.A coagulase livre uma substncia similar trombina (presente em filtrados decultivos). secretada extracelularmente e reage com uma substncia presenteno plasma denominado Fator de Reao com a CoagulaseCRF, para formar um

complexo que, por sua vez, reage com fibrinognio que convertido em fibrina,originando os cogulos.

Metodologia- Prova dacoagulase em tubo (coagulase livre):a) Colocar 0,5mL de plasma (obtido de sangue de carneiro, cavalo ou coelho) em um tubo de ensaio pequeno (13x 100mm);b)Com auxlio de uma agulha bacteriolgica, suspender uma colnia da cultura em estudo em caldo BHI e colocarem estufa 37C at que turve. Se necessrio, acertar a turbidez at o tubo 0,5 da escala de MacFarland;c) Em um tubo de ensaio estril, colocar 0,5mL de plasma reconstitudo e 0,5 ml do caldo BHI com crescimentobacteriano recm preparado;d) Incubar em estufa 37C at que turve.

e) Verificar a formao de cogulos aps 2h, 4h, 6h e 24h de incubao pela inclinao do tubo em um ngulo dequase 90. A formao de cogulo a qualquer momento encerra a prova, que considerada positiva. A ausnciade coagulao aps 24 horas de incubao indicativa de uma prova negativa.


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- Prova da coagulase em lmina (coagulase ligada):a) Traar dois crculos com lpis de cera em uma lmina de vidro;b) Colocar duas gotas de gua destilada ou soluo fisiolgica estril dentro de cada crculo;c) Com auxlio de uma agulha bacteriolgica agregar uma colnia em estudo em cada crculo, homogeneizandodelicadamente;d) Colocar uma gota de plasma para a prova de coagulase em um dos crculos;e) Homogeneizar com auxlio da agulha bacteriolgica;

f) Inclinar a lmina delicadamente, para frente e para trs e observar se h a formao de grumos no crculoonde foi adicionado o plasma, caracterizando uma reao positiva. A homogeneidade do lquido na lmina, sem aformao de grumos, caracteriza a prova como negativa.Nota: A ocorrncia de aglutinao no crculo onde foi colocado apenas o soro fisiolgico indica que a cepa emestudo auto-aglutinante, o que invalida a prova.


RESULTADO COR DO MEIO INTERPRETA OPositivo Bolhas Catalase +Negativo Sem bolhas Ausncia de catalase

- PROVA DA DNAse:

Objetivo usado para detectar a degradao do cido Desoxirribonucleico (DNA), contido no meio de cultura, porbactrias que possuem uma enzima extracelular, a desoxirribonuclease,

Base BioqumicaA enzima DNAse, que quebra o DNA em subunidades compostas denucleotdeos, produzida por muitas espcies de microrganismos.Assim, esta prova muito til para diferenciaro gnero Serratiadognero Enterobacter; a espcie Staphylococcus aureusdas espcies de

estafilococos coagulase negativos e Moraxella catarrhalisde espciesde Neisseria. O DNA acrescentado ao meio de cultura e se no hidrolisado precipitado por uma soluo de HCl a 0,1N, que torna o meio opaco. Quando oDNA hidrolisado forma-se um halo translcido em torno da cultura.

Metodologiaa) Fazer uma estria ou uma macrocolnia na superfcie do agar DNAse co oauxlio de uma ala bacteriolgica.b) Incubar a 37C por 18 a 24h.c) Derramar cerca de 1mL de HCl a 0,1N na superfcie do meio de cultura, fechare deixar descansar por cerca de 5min.


A presena de zona clara em volta da colnia indica reao positiva. Caso no haja atividade dessa enzima o HClreagir com o cido nuclico intacto, formando um precipitado (meio opaco), o que indica a reao negativa.

RESULTADO ASPECTO DO MEIO INTERPRETAOPositivo Formao de halo translcido Presena de DNAseNegativo Ausncia de halo translcido Ausncia de DNAse

- PROVA DA HIDRLISE DO AMIDOObjetivo:Verificar se os microrganismos em estudo possuem a habilidade para hidrolisar o amido.

Base BioqumicaO amido um polissacardeo de elevado peso molecular. Para ser transportado para o interior da clula e serutilizado, necessrio, primeiro, que ele seja quebrado em unidades menores (dextrinas, glicose e maltose), o quedepende da produo e secreo de vrias amilases.


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Metodologiaa) Inocular a cultura em agar amido;b) Incubar a 37C/24h;c) Cobrir com uma soluo de iodo(3 a 4 mL por placa) e observar.Resultado e Interpretao


Positivo Halo translcido Presena de amilaseNegativo Ausncia de halo Ausncia de amilase

O iodo reage com o amido para formar um complexo azul escuro. Assim, o surgimento de uma zona clara emtorno do crescimento bacteriano aps a adio de iodo a um meio que contenha amido indica que a -amilase foiproduzida pela bactria. Se no ocorrer a formao de uma zona clara ao redor do crescimento bacteriano, oamido no foi hidrolisado, indicando que a cultura em teste no produtora da -amilase.

- PROVA DA HIDRLISE DA GELATINA

Objetivo

Determinar a capacidade do microrganismo excretar uma enzima hidroltica extracelular capaz de degradar agelatina (gelatinase).

Base BioqumicaA gelatina uma protena produzida pela hidrlise do colgeno, que abaixo dos 25C mantm as suaspropriedades de gel e slida, enquanto acima dos 25C lquida.Determinados microrganismos tm capacidade de produzir gelatinase, que atua hidrolisando a gelatina emaminocidos. Se a degradao ocorre no se consegue restaurar as caractersticas de gel da gelatina, mesmo abaixas temperaturas (fica lquido).A hidrlise da gelatina uma caracterstica importante na diferenciao dos microrganismos e pode tambm serusada para determinar a sua patogenicidade.

Metodologia

a) Inocular por picada um meio de cultura em tubo, suplementado com 12%de gelatina;b) Incubar a 37C durante 24 a 48 h;c) Colocar a cultura a 4C durante 30 minutos ou num banho de gelo durante3 a 5 minutos.

Resultado e InterpretaoSe a gelatina foi hidrolisada pela gelatinase, o meio mantm-se lquido apsrefrigerao (reao positiva). Se o microrganismo no possui gelatinase, omeio resolidifica durante o perodo em que est no frigorfico (reaonegativa).


Positivo Halo translcido Presena de gelatinaseNegativo Ausncia de halo Ausncia de gelatinase

Amilase negativa Amilase positiva


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- PROVA DA HIDRLISE DA CASENAObjetivoDeterminar a capacidade do microrganismo produzir e excretar uma enzima hidroltica capaz de degradar acasena.

Base BioqumicaA casena a mais importante protena do leite, sendo uma macromolcula, composta por aminocidos ligados

entre si por ligaes peptdicas, incapaz de penetrar na membrana celular dos microrganismos. Para que acasena seja utilizada pelos microrganismos, tem de ser degradada em peptonas, polipeptdeos, dipeptdeos efinalmente em aminocidos. Este processo quando os microrganismos produzem enzimas proteolticas(proteases) que catalisam a hidrlise da casena em aminocidos, os quais so depois assimilados ecatabolizados pelas clulas.Nesta prova utiliza-se o agar Milk (agar leite) para demonstrar a atividade hidroltica das proteases. O meio composto por agar nutritivo suplementado com leite que contm a protena casena. Esta protena do leite umasuspenso coloidal que d ao meio a sua cor e opacidade. Aps incubao deste meio, os microrganismos quesecretam proteases exibem uma zona de protelise, que aparece como uma rea translcida rodeando ocrescimento bacteriano.

Metodologiaa) Inocular por estrias na superfcie de uma placa de Petri contendo o agar leite;

b) Incubar a 35C durante 48h;c) Observar se h a ocorrncia de uma zona clara em torno da cultura .

Resultado e InterpretaoA perda da opacidade do meio resultante de uma reao hidroltica com formao de aminocidos solveis eno coloidais e representa uma reao positiva. Na ausncia de proteases, o meio que envolve o crescimento domicrorganismo mantm-se opaco (reao negativa).

RESULTADO ASPECTO DO MEIO INTERPRETAO

PositivoHalo translcido em trono do

crescimento bacterianoAtividade hidroltica da casena

Negativo Ausncia de halo Ausncia de atividade hiroltica

- PROVA DA HIDRLISE DO HIPURATO:Objetivo:Verificar a capacidade de microrganismos de hidrolisar o hipurato de sdio em seus componentes: glicina e cidobenzico.

Base BioqumicaOs Streptococcus agalactiae(grupo B) so capazes de sintetizar a enzima hipuricase, quehidrolisa o hipurato em glicina e cido benzoico.

Metodologia

a) Preparar solues de hipurato de sdio a 1% em gua destilada estril;b) Distribuir 0,4mL em tubos 13x100mm com tampa de rosca e congelar a te o momento douso;c) Emulsificar uma alada do crescimento da cultura em agar BHI sangue de carneiro;d) Incubar em banho Maria por 2 horas a 37C.e) Adicionar 0,2mL da soluo de nihidrina a 3,5% em uma mistura a 1:1 de acetona ebutanol e reincubar em banho Maria por 10min.f) Verificar se h o desenvolvimento de uma colorao violeta escura.Nota: a soluo de nihidrina deve ser conservada no escuro e temperatura ambiente.

Resultados e interpretaoO surgimento da colorao violeta escura indica reao positiva enquanto a permanncia da soluo como incolorindica a reao negativa.

RESULTADO COR DO MEIO INTERPRETAOPositivo Violeta escuro Presena de hipuricaseNegativo Inalterado Ausncia de hipuricase


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- PROVA DA BILE E ESCULINAObjetivoVerifica a capacidade de certas espcies de estreptococos de hidrolisar a esculina em presena de sais biliares.

Base BioqumicaA esculina quimicamente um derivado da cumarina (6--glicosdeo-7-hidroxicumarina), quepertence classe dos glicosdeos. A capacidade de hidrolisar a esculina, originando

escutelina, em presena de1 a 4% bile uma caracterstica de todos os estreptococos dogrupo D e do gnero enterococo. Nesta prova a escutelina reage com ons frricos presentesno meio resultando em um precipitado escuro.

Metodologiaa) Inocular a cultura por estrias na superfcie e por picada no agar bile esculina com auxlio deagulha bacteriolgica;b) Incubar a 37C durante 1 a 4dias;c) Observar diariamente se h a enegrecimento do meio. Se o meio permanecer inalterado aofinal de 4 dias finalizar a prova e consider-la como negativa.

A reao positiva quando observado um enegrecimento difuso na superfcie do gar ou,em certos casos, um halo marrom ou negro ao redor das colnias.

RESULTADO COR DO MEIO INTERPRETAOPositivo Marrom a negro Presena de gelatinaseNegativo Inalterado Ausncia de gelatinase

Provas Bioqumicas em Sistemas Miniaturizados

Para se proceder realizao de provas laboratoriais baseadas em diferenas nas actividades bioqumicas dos

microrganismos podem ser usados sistemas miniaturizados de multitestes (kits comerciais de provasbioqumicas) que permitem identificar a espcie. So usadas microtcnicas que incorporam um conjunto de meiosnuma nica unidade. Dois destes sistemas disponveis comercialmente so:

1- Sistema API (Analytical Profile Index) 20 E

O sistema API 20 E uma verso miniaturizada das provas bioqumicas convencionais usado para identificaodas Enterobacteriae e outros bacilos Gram negativo. um sistema de mictotubos pronto a usar que permiterealizar 22 provas e culturas puras isoladas apropriadamente num meio de cultura.

Consiste numa tira de plstico composta por 20 microtubos individuais, cada um dos quais contendo um meiodesidratado. Os meios ficam hidratados quando da inoculao da suspenso do microrganismo a ser ensaiado,sendo depois a tira de plstico incubada num tabuleiro tambm de plstico com cobertura para evitar a

evaporao. Aps incubao (18-24h a 35-37 C), a identificao do microrganismo feita pelo mtodo tradicionalde verificar a mudana de cor nos microtubos, aps o sistema indicador ter sido alterado pelos metabolitos oupelos reagentes.

A identificao da bactria desconhecida consiste na determinao de um cdigo de 7 dgitos (profile indexnumber) e na consulta do API 20 E Profile Index Booklet ou de um sistema de computador designado API 20 EPRS (profile recognition system).


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2- Sistema de multitestes Enterotube II

Consiste num tubo contendo 12 compartimentos com meios de cultura slidos e uma agulha de inoculao. Estaagulha toca numa colnia isolada e depois de uma s vez os microrganismos so arrastados atravs dos 12compartimentos, de modo que todos os meios fiquem inoculados. Desta maneira so realizadas 15 provasbioqumicas com uma s sementeira. Aps incubao, a mudana de cor de cada compartimento interpretadade acordo com as instrues do fabricante para identificar o microrganismo.

A partir dos resultados e consultando um manual obtm-se um cdigo de 5 dgitos que permite identificar abactria. Este mtodo tornou-se mais eficiente permitindo a identificao das Enterobacteriaceaepor meio de umsistema de computador designado ENCISE (Enterobacteriaceaenumerical coding and identification system for

enterotube).

3- Bactray

apostila - provas bioquímicas - 2014

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