apport de la biologie moléculaire en anatomie pathologique · l’anatomie pathologique est...
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Apport de la biologie moléculaire en Anatomie pathologique
LES 25èmes JOURNEES NATIONALES DU TECHNICIEN BIOLOGISTE 20-22 Mai 2016
Dr. Arfaoui Amira
L’anatomie pathologique est l’étude des anomalies de forme
de structure ou de rapports provoqués par les maladies
Plus concrètement toute modification visible dans
l’organisme au cours des maladies est objet de l’anatomie
pathologique.
Qu’est ce que l’anatomie pathologique ??
C’est ce qu’on voit à l’oeil nu, à la loupe et l’on parle alors
d’anatomie pathologique macroscopique.
C’est aussi et surtout ce que on voit au microscope et l’on
parle alors d’histologie pathologique si on on étudie des tissus
et de cytologie pathologique si on étudie des cellules
séparées les unes des autres.
Modifications visibles ???
Les anatomopathologistes sont des « visuels »
Ils travaillent surtout sur de objets transparents «les lames»
qui sont des plaquettes de verre sur lesquelles on a étalé le
matériel biologique que ce soit une biopsie, un frottis ou une
pièce opératoire
Ils observent, raisonnent et émettent un diagnostic qui peut
être certain et précis mais qui peut aussi dans certain cas être
douteux et incomplet
Modifications visibles ???
La Biologie moléculaire
La technique de base de la préparation de ces lames n’a
pas varié depuis plus d’un siècle : elle consiste à faire des
coupes extrêmement fines (5 microns ou moins) à partir
d’un fragment tissulaire enrobé dans la paraffine pour
qu’il acquière une certaine dureté et une consistance
homogène
Visite du laboratoire
d’anatomie pathologique
L’équipe comporte des techniciens, des ouvriers, des
secrétaires, l’ensemble est encadré par le surveillant
En tout, un labo hospitalier comme celui de Charles Nicolle
est une petite entreprise de 20 personnes, si on compte les
médecins et tous les collaborateurs.
Réception des prélèvements & enregistrement
Dissection des pièces et des prélèvements
Préparation des casettes
Technique d’inclusion
La coupe au microtome
Technique de coloration: Manuelle/automatique
Archivage des Blocs
Archivage des Lames
Interprétation au microscope
Interprétation au microscope
Au total: Dans la pratique médicale et depuis très
longtemps, le rôle de cette discipline réside en:
la contribution à élaborer le diagnostic de multiples
maladies,
la précision du pronostic en particulier des pathologies
tumorale
et en l’évaluation de l’effet des traitements.
Une nouvelle révolution est en marche avec l’arrivé de la
biologie moléculaire qui en se basant sur des techniques
innovantes offre des perspectives spectaculaires surtout
en termes de prise en charge des patients cancéreux.
Chimiothérapies standards
•Toxique
•Effets indésirables
• inefficaces
Thérapie ciblée: Cancer du poumon
(Erlotinib/Gefitinib)
Thérapie ciblée: Cancer du sein
(Trastusumab)
Rappel sur la prise en charge des cancers il y a 20 ans:
Les chirurgiens décidaient seuls de la stratégie
thérapeutique
et les radiothérapeutes faisaient la chimiothérapie.
Aujourd’hui:
aucune décision de soin n’est prise sans une réunion de
concertation pluridisciplinaire avec comme clé de voute
le nouveau compte rendu de biopathologie associant les
résultats de l’anapath à ceux de l’analyse moléculaire.
Modifications invisibles ???
Les différents types de Mutation de l’ADN
Les mutations géniques:
une addition (ajout d’une base)
une soustraction (élimination d’une base)
une substitution (remplacement d’une base par une
autre)
délétion d’un fragment d’un gène
Inversion d’un fragment d’un gène
Amplification d’un fragment d’un gène
……….
Les mutations chromosomiques:
perte d’une partie du chromosome
diploïdie
Aneuploïdie
hétéroploïdie
……….
Le nouveau rôle du technicien en Anapath :
De ce fait, tout le personnelle du laboratoire
d’anatomopathologie en particulier les techniciens doivent
impérativement actualiser leurs connaissances (formation
continue) en termes de techniques moléculaires. Ils
acquièrent ainsi un rôle central et de nouvelles
responsabilités envers le matériel biologique reçu et ce
depuis l’étape de fixation tissulaire jusqu’à l’étape
d’extraction et d’amplification de l’ADN.
Temps d’ischémie froide : est défini par le temps écoulé
entre le moment où le prélèvement tissulaire est extrait du
corps humain, par biopsie ou exérèse chirurgicale, et le
moment où le tissu est au contact du fixateur. Ce temps doit
être le plus court possible. Des délais supérieurs à 1 heure diminuent de manière
significative la détection du récepteur de la progestérone (RP) par IHC et ont un effet plus important sur la
détection des signaux HER2 par hybridation in situ fluorescente (FISH) sur pièce opératoire.
Phase pré-analytique
Pour diminuer ce délai d’ischémie froide, une information
de toutes les personnes intervenant dans la manipulation
et le transport des pièces est nécessaire (chirurgiens,
infirmières de bloc opératoire, transporteur, pathologistes
et techniciens).
Des solutions pour le transport, le stockage et la fixation en toute sécurité
des pièces opératoires : Tissue Vaccum
Ce système de stockage sous vide
(absence d’air dans le sac ou les seaux)
permet de conserver les échantillons à
l’état frais jusqu’à 5 jours.
Transport direct au labo d’Anapath
pour les courts trajets et dans des
glacières pour des trajets plus long.
Dans le labo d’Anapath se fait l’étape
de fixation avec, système de
remplissage automatique des seaux
(le Tissue Filling System), et devant un
système de ventilation et d’aspiration
extrèmement puissant permettant de
limiter au maximum le contact avec le
formol
offrant au pathologiste la maitrise de
la durée de fixation.
Ce système est également très
intéressant pour la conservation des
échantillons fixés en attente d’une
éventuelle recoupe.
Phase pré-analytique : Recommandations
Fixation :
Le fixateur recommandé est le formol neutre tamponné à
4%.
Temps de fixation :
La sous- et la sur-fixation doivent être évitées.
La durée maximale de fixation recommandée est de 16h
pour les biopsies
48h pour les pièces opératoires
L’Etape de la Fixation :
Décalcification :
Cette étape est nécessaire pour les prélèvements osseux.
Le type de décalcifiant influe sur la qualité du résultat.
L’EDTA à 10% est le seul décalcifiant toléré en BM
Phase pré-analytique : Avant l’extraction de l’ADN
Phase pré-extraction de l’ADN: Macrodissection
Phase pré-extraction de l’ADN: Macrodissection
Phase pré-analytique: Extraction de l’ADN
Déparaffinage par le xylène et l’alcool
Destruction des membranes cellulaires par des réactions physicochimiques
Centrifugation pour éliminer les protéines et les débris cellulaires et pour récupérer le noyau dans le culot
Digestion de la membrane nucléaire par la protéinase K pour récupérer les filaments d’ADN
1
1
2
Phase pré-analytique:
Extraction de l’ADN
Phase analytique: Amplification de l’ADN
Phase analytique: Amplification de l’ADN
Phase analytique: Amplification de l’ADN
Phase analytique: Amplification de l’ADN
Phase analytique: Amplification de l’ADN
Phase analytique: Amplification de l’ADN
Nombre du copies = 2 n
Analyse par séquençage
Analyse par PCR en temps réel
Hybridation in-situ (FISH / SISH / CISH)
Analyse par NGS
Plateformes hospitalières de diagnostic
moléculaire des cancers
Merci