ATIVIDADE PRATICA SUPERVISIONADA

UNIVERSIDADE PAULISTA UNIPATIVIDADE PRATICA SUPERVISIONADAPRODUO DE VACINAS RECOMBINANTES E VACINAS DE DNA

1. INTRODUOA vacina contra varola foi desenvolvida h mais de 200 anos por Edward Jenner. Quase um sculo depois Louis Pasteur criou um novo produto contra a raiva, e o chamou de vacina em homenagem a Jenner 1.Do final do sculo XIX at o sculo XX vrias vacinas foram criadas com base em antgenos vacinais inativados, protenas, polissacardeos e agente microbianos atenuados 1.A vacinao a medida mais eficiente para evitar doenas infecciosas. Apesar dos grandes benefcios das vacinas existentes, h ainda muitas doenas para as quais no existem vacinas 2.A biotecnologia moderna e o desenvolvimento de vacinas derivadas de tecnologia de DNA recombinante abriram perspectivas e possibilidades econmicas, motivando laboratrios multinacionais a fazerem grandes investimentos em inovao tecnolgica de vacinas 3.O desenvolvimento de vacinas um importante objetivo no campo da imunologia e, desde o final do sculo XX, h uma mudana em direo a uma abordagem mais racional, baseada no uso da bioinformtica, na utilizao de novos recursos tecnolgicos para obteno e purificao de candidatos vacinais e no desenvolvimento de sistemas de liberao de vacinas mais efetivos 4.As vacinas so preparaes imunognicas compostas por um grupo de substancias (antgenos, adjuvantes, preservativo veculo etc.) que ao serem administrados em indivduos imunocompetentes induzem um estado de proteo contra os efeitos nocivos do agente relacionado 2, 5.Para uma vacina ser eficiente precisa ativar linfcitos T auxiliadores que por sua vez ativam linfcitos B a produzir anticorpos especficos, e produzir clulas citotxicas potentes. As clulas T auxiliadoras geram inmeras clulas de memria que so rapidamente mobilizadas na presena de agente infeccioso no organismo 6.Para a criao de uma vacina bem sucedida, essa deve ter uma formulao segura, atuar em dose nica, baixo custo por dose, produzir imunidade protetora muito alta em indivduos, gerar memoria prolongada, estabilidade biolgica e de fcil administrao 5. comum classificar as vacinas em trs grupos (ou geraes) em razo dos conceitos utilizados na preparao do princpio ativo, os antgenos vacinais 3.As vacinas de primeira gerao so as vacinas vivas atenuadas. So vacinas com microrganismos vivos atenuados que so obtidas pelo cultivo do microrganismo e atenuao por aquecimento, passagens em cultura ou deleo gnica. As vacinas atenuadas disponveis atualmente so as vacinas contra sarampo, caxumba, rubola, BCG e a vacina oral contra febre tifoide. As vacinas atenuadas apresentam algumas vantagens sobre as inativadas. A principal delas a multiplicao do microrganismo atenuado no organismo vacinado, h o envolvimento de todos os componentes do sistema imune no desenvolvimento da imunidade contra a partcula viral integra. A resposta imune completa, e se mantem por longos perodos. Apresentam menor custo de produo. Suas desvantagens incluem risco de reverso da atenuao, no devem ser administradas em pessoas imunodeficientes e exigem maior cuidado no transporte e armazenamento 4,5.Vacinas inativadas. So as mais utilizadas na preveno de doenas virais como a gripe, poliomielite (vacina Salck), raiva e hepatite A e doenas bacterianas como a clera e peste. Os microrganismos so inativados por mtodos qumicos como detergente ou formol. As vacinas inativadas oferecem a vantagem da segurana, pois no h multiplicao do agente no organismo, porm a imunidade menos duradoura, e por esse motivo exige a repetio das imunizaes ao longo dos anos, causando um maior custo na utilizao desses produtos 4,5.Consideradas de segunda gerao a vacina com antgenos purificados (subunidades) so constitudas de antgenos purificados e provenientes de fontes naturais ou sintticas, e antgenos recombinantes. As vacinas so produzidas por recombinao gentica, atravs da engenharia gentica e tcnicas de biologia molecular. Exemplo: hepatite B 3, 5, 6.As vacinas gnicas ou de terceira gerao surgiram com a introduo de genes ou fragmentos de genes, que codificam antgenos potencialmente imunognicos, em vetores virais ou em DNA plasmidial. As vacinas de DNA surgiram como resultado dos avanos biotecnolgicos em DNA recombinante 3.A biotecnologia revolucionou as vacinas de segunda gerao; No incio, essas vacinas faziam uso apenas de toxinas inativadas. O prximo passo o uso de polissacardeos purificados. Protenas purificadas a partir de vrus e bactrias limitavam apenas o cultivo de antgenos especficos, como algumas toxinas, ou obt-los de soro de pacientes infectados, como por exemplo o vrus da hepatite B. com tcnicas aprimoradas de produo de protenas recombinantes por meio de sistema de produo heterloga, bactrias, leveduras, clulas de mamferos e insetos so usados como fontes para antgenos na formulao de vacinas 3.Avanos tecnolgicos deram origem as vacinas de DNA. A informao gentica responsvel pela codificao de antgenos com aplicaes em vacinas, clonada e propagada em linhagens de Escherichia Coli. Procedimento bem mais simples que o da obteno das protenas recombinantes 3.A vacinao com DNA uma das promessas de imunizao contra vrios patgenos e tumores, onde os mtodos convencionais no surtem efeito. Vacinas de DNA produzem resposta imune humoral e celular, tanto para resposta de linfcitos CD4+ quanto CD8+sem a necessidade de microrganismos vivos. Apesar de induzir imunidade protetora, a vacina de DNA nem sempre apresenta bons resultados. A imunidade depende de vrios fatores como a seleo do gene alvo, construo do vetor de expresso, frequncia e via de administrao da vacina, quantidade de DNA, localizao do antgeno codificado pelo plasmdeo e idade, sade e espcies de animais vacinados 2.

2. JUSTIFICATIVAEsta pesquisa foi realizada por exigncia da Universidade Paulista, com orientao do professor Carlos Franscischini que ministra a disciplina de Biotecnologia do stimo semestre de graduao em Biomedicina na Universidade Paulista, como um dos requisitos parcial para concluso do stimo semestre.Esta pesquisa foi desenvolvida a partir de aulas prticas ministradas pelo professor Carlos Francisquini e pesquisas desenvolvidas pelos alunos para acrescentar maior conhecimento ao contedo adquirido. No contedo deste trabalho encontra-se a fundamentao terica da produo de vacinas recombinantes e vacinas de DNA assim como exemplos de vacinas recombinantes atualmente empregadas no calendrio vacinal e vacinas de DNA ainda em fases de teste e aprovao.

3. OBJETIVODemonstrar que o conhecimento adquirido durante as aulas ministradas com contedo terico e pesquisas realizadas produziram conhecimentos fidedignos e relevantes.

4. FUNDAMENTAO TEORICA

4.1 VacinasVacinas so preparaes de compostos antignicos, que quando administrada em um individuo acarreta resposta imunitria especifica aquele agente patognico, as vacinas so hoje o meio mais pratico e barato de imunizao e que tem como principal beneficio a imunizao individual e ou coletiva e que administrada ainda em indivduos saudveis 8.

4.2 Vacinas RecombinantesVacinas recombinantes so vacinas produzidas mediante a tecnologias do DNA recombinante. Essa tecnologia faz uso de fragmentos de DNA ligados por ligaes covalentes derivados de duas ou mais fontes biolgicas, geralmente essas fontes so de microorganismos diferentes. Esta tcnica se baseia nos principais princpios da clonagem molecular 9.Os princpios para aplicao da produo de uma vacina recombinante seguem de forma quase idntica a de formao de DNA recombinante, entendendo-se que DNA recombinante uma forma manipulada artificialmente pela juno de duas ou mais sequencias de fragmentos de DNA de microorganismos diferentes 9, 10.O processo de produo de vacinas recombinantes seguem uma serie de etapas para que a produo dessa espcime vacinal seja efetiva e padronizada 10.O primeiro passo para produo de uma vacina recombinante a produo dos fragmentos de DNA recortados com enzimas de restrio em seguida a juno desses fragmentos a um vetor tambm chamado de carreador essa juno feita com enzimas ligase, aps essa etapa ocorre a introduo deste composto a uma clula hospedeira essa etapa tambm chamada de transformao ocorre mediante a tcnicas de eletroporao ou em meio com CaCl2. Em seguida faz-se a seleo destas clulas hospedeiras que possuem os fragmentos de DNA modificados com marcadores ou mesmo com antibiticos. Aps todos os processos esse meio modificado passa por um processo de purificao que descrito individualmente para cada estirpe vacinal (anexo 1) 9anexo 1.Atualmente as principais vacinas produzidas com a tecnologia recombinante so as vacinas contra Hepatite B (vacina HB) e mais recentemente a vacina tetravalente contra o vrus HPV (anti-HPV).

4.2.1 Hepatite B e vacina HBS

A infeco pelo vrus da hepatite B (VHB) um dos mais srios problemas de Sade Publica do mundo. Estima-se que existam aproximadamente 350 milhes e 500 milhes portadores desse vrus em varias regies do mundo 11O vrus da hepatite B rotulado como modelo de um vrus pertencente famlia hepadnaviridae. O hospedeiro do VHB o ser humano. Apesar dos hepadnavirus terem uma preferncia pelas clulas hepticas, partculas de DNA de hepadnavirus foram observadas nos rins, pncreas e clulas mononucleares. As principais complicaes so cirrose e cncer heptico, podendo tambm ocorrer hepatite aguda, infeco crnica inaparente (estado do portador) e hepatite crnica 11.A transmisso do VHB pode ocorrer; de me para filho durante o nascimento, por via sexual, ferimentos cutneos, por compartilhamento de agulhas entre usurios de drogas, por transfuso de sangue e hemoderivados, acidentes com material biolgico 11. O vrus da HB circula primariamente no sangue e replica-se nos hepatcitos em torno de 10 cpias m/l X por dia, esse vrus sobrevive ate uma semana fora do corpo humano, no plasma, a vida media do VHB varia de um dia a trs dias, enquanto nos hepatcitos a vida media varia de 10 dias a 100 dias. Com a alta produo de virions a fabricao de VHB mutante influenciada 11, 12.O genoma do VHB constitudo por acido desoxirribonucleico, contendo 3200 nucleotdeos e peso molecular de 3.2 kb. O VHB replica-se por via transcriptase reversa e o gene do VHB tem ordem, nmero e sequncia genomica homlogos aos de certos retrovrus 12.Em 1982, foi habilitada a primeira vacina contra a hepatite B, eram produzidas de plasma de pacientes com infeco crnica, com AgHBs inativados por mtodos fsicos-quimicos. J em 1986, com o avano da tecnologia foram lanadas as vacinas de DNA recombinante, produzida com a insero do plasmidio contendo o gene para o AgHBs dentro de uma levedura (Sacharomices cerevisiae). As clulas do levedo produzem o AgHBs que em seguida ser purificado e utilizado na produo de vacinas. S em 1998, o programa Nacional de Imunizaes (PNI), do Ministrio da Sade, recomenda a vacinao universal das crianas contra hepatite B a partir do nascimento 12.As vacinas contra hepatite B comercializadas no Brasil so produzidas por engenharia gentica. Sua composio Varia de acordo com o fabricante, todas contem o hidrxido de alumnio como adjuvante, j a composio timerosal usada como conservante, nem todas contem em sua composio12.Conforme o PNI a imunizao contra a hepatite B deve ser administrada nas primeira12h de vida ou ate 24h, com o esquema de zero, um e seis meses. Para os adultos deve-se escolher uma data que ser o zero, depois um e seis meses tambm. As vacinas contra hepatite B devem ser administradas por via intramuscular, na regio deltoide (brao) ou no vasto lateral da coxa em crianas pequenas. Os frascos da vacina devem ser conservados entre +2C e +8C, no podem ser congeladas. Depois de abertas devem manter condies de higiene e conservao, as que contem conservantes podem ser utilizadas ate o termino do frasco. O prazo de validade deve ser respeitado 12.

4.2.2 HPV e vacina anti - HPVCncer Cervical ou Cncer do colo de tero (CCU) o terceiro tipo de cncer que tem maior incidncia na populao Brasileira feminina e a segunda causa de morte nos pases em desenvolvimento, outros tipos de cncer tambm atinge a populao feminina como a cncer de mama e cncer colorretal que ocupam segundo lugar, a estimativa para novos casos em 2014 de 15.590 13, 14, 30.O Cncer do colo do tero ocorre devido a replicao desordenada do epitlio uterino, esse epitlio responsvel por revestir o colo uterino, com o crescimento desordenado as clulas invadem os tecidos subjacentes aos quais so comprometidos. Com o exame de preveno possvel detectar a fase intra-epitelial e chegar a uma cura rapidamente, pois a sua evoluo progride forma lenta 10-20 anos13. O CCU uma neoplasia em que a chances de cura de 100% devido a forma de progresso da doena13. Alguns fatores contribuem para o desenvolvimento do cncer uterino, refere-se ao estilo de vida e ao ambiente, entre estes fatores esto tabagismo, idade, histrico familiar e hereditariedade, carncia de vitaminas A e C, imunodepresso, e mulheres que possui mltiplos parceiros sexuais masculino que so infectados com doenas sexualmente transmissveis (DST)principalmente vrus HPV (Papilomavirus Humano) . A correlao do HPV com o cncer de colo de tero foi descoberta na dcada de 1949, a partir dessa correlao estudos com o antgeno comearam a ser desenvolvidos. O HPV esta, presente em 100% dos casos, possuindo subtipos oncogenicos. HPV-16 e HPV-18 esses subtipos so os mais virulentos sendo responsveis por cerca de 70% dos cnceres cervicais. a infeco ocasionada, devido ao HPV muito comum entre mulheres sexualmente ativas, devido a sua forma de transmisso sexual, o Papilomavirus Humano pode infecta homem e mulher. Mesmo com a presena do HPV necessrio ter um ou mais fatores para o desenvolvimento do CCU 14,15,16,17.Por ser uma doena de desenvolvimento lento, a sua descoberta na maioria dos casos tende a ser a partir de sintomas como quadros de sangramento vaginal intermitente ou aps a relao sexual, secreo vaginal anormal e dor abdominal associada com queixas urinarias ou intestinais nos casos mais avanados18.

4.2.2.1 HPV-Papiloma VrusO Papiloma Vrus (HPV), pertence aFamliaPapiloma viridae, possuindo cerca de 200 tipos conhecidos atualmente, esse tipo de vrus tem como afinidade infecta mucosas tanto de humanos como de animais, mamferos, repteis e pssaros, dos 200 tipos virais conhecidos,118 descritos, e 100 tipos virais identificados , sendo que 50 tipos virais infectam o colo do tero. O HPV possui cerca de 60 nm de dimetro, possuindo DNA duplo, com 8000 pares de bases, ao qual so possveis distinguir regies: Regio Distal (L), Regio Proximal (E) e Regio de controle (LCR).A Regio Distal (L) constituda por dois genes L1 e L2 esses genes so responsveis pela codificao das capsulas que reveste as protenas virais, a Regio Proximal (E),nesta regio se encontram as protenas responsvel pela replicao, pelo controle da transcrio E1 e E2, e os genes responsveis pela transformao em E5,E6 eE7, a Regio Controle (LCR) responsvel produz os fatores de transcrio nuclear e viral e pela divulgao de sequencias e esta situada entra a regio E e L 13.Os vrus so classificados de acordo com o Grau de Risco Epidemiolgico, sendo os 16,18,31,33,35,39,,45,51,52,56 e 58 de altos risco, os baixo risco so,6,11,40,42,43,44,54,61,70,72,81 e o CP6108.O HPV 16 o mais prevalente e persistente estando presente em 66% dos casos, sendo agente etiolgico do trato genital, e no carcinoma cervical invasor, presena do subtipo viral de 18(15%) seguido dos subtipos 45(9%) e 31(6%) 19.

4.2.2.2 Vacina anti - HPVExistem duas formas de preveno contra o HPV: rastreamento das leses precursoras ou com imunizao contra o HPV 20.Mais de 100 tipos de HPV foram catalogados, entre eles os tipos 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59 e 68 so considerados de alto risco devido a sua associao com o cncer de colo de tero 21,22.O genoma do HPV 16 possui oito genes que codificam oito protenas, onde seis so no estruturais e duas estruturais. Os genes estruturais L1 e L2 codificam as protenas formadoras dos capsdeos maior e menor. Entre as no estruturais a E1 e a E2 esto relacionadas replicao do genoma viral. A E4 parece contribuir indiretamente para a replicao do genoma viral; e as E5, E6 e E7 so designadas como oncoprotenas, pois possuem capacidade de transformar clulas in vivo, e as E6 e E7, induzem tumores in vivo. O E7 se une com o produto do gene Rb causando proliferao celular incontrolada. A ligao do E6 com o produto da protena do gene p53 degrada o primeiro, causando perda da funo de reparo do DNA, impedindo a apoptose 21, 22, 23.O incio do desenvolvimento das vacinas de HPV no havia tcnicas laboratoriais que permitissem obter partculas virais em cultura de tecidos e no existiam modelos animais para a infeco. A maioria das vacinas contra vrus baseada no uso de virions para induzir a produo de anticorpos, no se conseguia produzir virions de HPV. A soluo apareceu quando se descobriu que uma protena, chamada de L1, em combinao com outra, chamada L2, gerava uma estrutura semelhante quela encontrada nos virions. Esta estrutura, morfologicamente semelhante aos vrus, porm vazia, foi chamada de vrus-like particles (VLP). VLPs so destitudas de DNA e, assim, so consideradas seguras, pois induzem forte resposta imune sem o risco de infeco ou de produzir uma neoplasia.Outra grande vantagem das VLPs que podem ser produzidas utilizando clulas de insetos, bactrias recombinantes ou at mesmo fungos 22,23.Na dcada passada comearam os testes para criao da vacina que tinham o HPV como alvo. Foram classificadas como profilticas e teraputicas. As profilticas evitam a infeco pelo HPV e as doenas associadas a ele, as teraputicas induzem regresso das leses pr-cancerosas e remisso do cncer invasivo 21.As vacinas profilticas contra o HPV so compostas pela protena capsdeo L1 do HPV que auto reproduz em partculas vrus- like (VLP). Quando expressa em sistemas recombinantes induzem a forte resposta humoral com anticorpos neutralizadores. A eficcia desta vacina vem sendo testada em modelos animais 22,23.A injeo intramuscular de VLP resulta em resposta imune adaptativa eficaz para clulas T e B, que so capazes de neutralizar e as infeces subsequentes. A vacina HPV16 L1 VLP obteve alto ndice de proteo contra infeco persistente pelo HPV 16 e impediu o aparecimento das NICII e III durante pelo menos trs anos e meio depois da imunizao 24.A vacina bivalente contra os HPV16 e 18, e a quadrivalente, contra os tipos 6, 11, 16 e 18, tm mostrado reduo significativa da incidncia de infeces persistentes pelo HPV 22, 23, 24.Duas vacinas contra o HPV foram aprovadas no Brasil: Cervarix da GlaxoSmithKline e Gardasil da Merck Sharp & Dohme. Ambas possuem a protena L1 do capsdeo viral, produzidas atravs de tecnologia recombinante para a obteno de partculas anlogas s virais (VLPs) dos dois vrus mais comuns nos cnceres cervicais: HPV16 e o HPV18. As quantidades de VLPs assim como o sistema adjuvante diferem em cada vacina 22.Ambas as vacinas disponveis foram desenvolvidas com VLPs oriundas de uma nica protena viral, o L1, que a maior protena estrutural do vrus, e que contm o seu eptopo imunodominante. As vacinas so injetadas por via intramuscular e alcanam vasos linfticos no local da injeo, mimetizando uma viremia e estimulando a produo de anticorpos neutralizantes em quantidades maiores do que a produzida na infeco natural. Ambas as vacinas so administradas em trs doses para se obtiver o mximo efeito imunognico 24.

4.3 Vacina de DNAAs vacinas produzidas com DNA hoje uma das formas de imunizao mais seguras e traz imunizao para uma gama de doenas e tumores. Este tipo vacinal tem sido atualmente a forma mais eficiente e promissora quando comparado com outras tecnologias de imunizao. As vacinas provindas de DNA so capazes de induzir resposta imune tanto humoral quanto celular, o que promove uma resposta de ativao de linfcitos CD4- e CD8-, sem ao menos o contato com o microorganismo vivo 29.A vacina de DNA foi descrita em 1990 quando um plasmdeo contendo um gene que codifica uma protena de interesse foi injetado no musculo de camundongos. O plasmdeo com o gene Reporter expressou um enzima chamada -galactosidase. Na poca alguns estudos foram desenvolvidos a fim de explicar o fenmeno e foi-se avaliado alguns fatores que determinavam a eficincia da transferncia de gene de resposta imunognica conferida aps a inoculao do plasmdeo. Em seguida a introduo de DNA que faz a codificao de uma protena que induz resposta imune contra o vrus da influenza conferiu aos camundongos imunidade adaptativa 29.Na pesquisa humana os estudos envolvendo vacinas de DNA tm sido direcionados quase que exclusivamente para a AIDS (sndrome da imunodeficincia humana), a malria e a tuberculose. Contudo estudos mais aprofundados demonstram resultados significativos na terapia anti tumoral 29.4.3.1. Construo vacina DNAA vacina de DNA vem sendo apresentada como uma eficiente tecnologia usada nos ltimos anos no desenvolvimento de vacinas, no somente contra diversos agentes infecciosos, mas tambm contra doenas autoimunes, cncer e alergias. obtida atravs de tecnologias de DNA recombinante, onde ocorre a transferncia de um gene que codifica uma protena que servir como imungeno para dentro de um vetor que consiga expressar essa protena 25.Um vetor ideal precisa conter as seguintes caractersticas: no pode ser txico, no induzir reaes alrgicas e auto-imune nos pacientes, possuir garantia da sua expresso gnica, ser de fcil reproduo, possuir boa capacidade genmica 25.Os vetores mais utilizados so de plasmdeos bacteriano, por possurem uma segurana biolgica maior, serem de baixo custo, fcil produo e serem bastante estveis. Tambm necessitam ter algumas caractersticas especiais como: possuir uma regio promotora, uma origem de replicao, stio mltiplo de clonagem 26.A vacina feita atravs da inoculao do vetor plasmidial de expresso em clulas eucariticas contendo o antgeno de interesse, o qual tem por finalidade induzir resposta imune nos indivduos vacinados. Uma vez no interior da clula, mais especificamente no ncleo, o DNA plasmidial transcrito e o RNAm segue para o citoplasma onde ocorre a traduo de cpias da protena recombinante 27.A protena recombinante pode ser expressa no citoplasma ou no reticulo endoplasmatico dependendo da estratgia de clonagem utilizada, protenas que se encaminham para a via RE-Golgi, podem ser secretadas para o meio extracelular ou serem expressas na superfcie celular, caso possuem caudas intracitoplasmticas ou se associem a ncoras hidrofbicas. Ser capaz de gerar tanto uma resposta imune humoral, com produo de anticorpos, como uma resposta celular, com induo de linfcitos T citotxicos 27. Resumindo na clula transfectada por vacina de DNA o plasmdeo recombinante transcrito no ncleo da clula e o RNAm traduzido no citoplasma gerando as protenas recombinantes. Estas podem ser processadas e os peptdeos antignicos apresentados por molculas do sistema imune, ou seguirem pela via de secreo e permanecerem ancoradas superfcie celular, ou ainda secretadas pela clula hospedeira 27.A induo dos dois tipos de resposta imune, humoral e celular, fornece vantagens em comparao s vacinas inativadas e de subunidade que produzem principalmente ou exclusivamente uma resposta de anticorpos. Esta resposta de amplo espectro se compara resposta induzida por vacinas vivas atenuadas, sem apresentar, contudo, o risco de reverso para forma patognica do agente infeccioso 28.As vantagens de se utilizar vacinas de DNA, em relao s vacinas de subunidade, por exemplo, se relaciona expresso das protenas aps a imunizao, estabilidade, longo perodo de imunizao, no possui risco infeccioso, fcil preparo e menor custo 28.

5. CONCLUSO

Contudo hoje se observa que a produo assim como o uso de vacinas produzidas mediante tcnicas de biotecnologia e biologia molecular tem sido de uma das formas mais seguras de imunizao e por ser de baixo custo se torna aplicvel em todos os nveis de sade. Tanto no nvel primrio; com a administrao de vacinas e componentes vacinais, como no nvel secundrio; onde vacinas so utilizadas no tratamento contra tumores.

6. ANEXOS

6.1 Anexo 1.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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8. REFERENCIAS ELETRONICAS

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