aptameri a dna: materiali innovativi per l'analisi di...

IV Congresso NazionaleIV Congresso NazionaleLe Micotossine nella Filiera AgroLe Micotossine nella Filiera Agro--AlimentareAlimentaregg

Aptameri a DNA:

materiali innovativi per

l'analisi di micotossine

Annalisa De Girolamo, Roberto Schena, Angelo Visconti

Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA)

Roma, 11-13 Giugno 2012

Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA)Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)

AnticorpiAnticorpi

Vantaggi

Elevata selettività e specificità di riconoscimento

Vasto campo di applicazione

Svantaggi

Produzione in-vivoProduzione in vivo

Suscettibilità alla denaturazione

Va iabilità t a i lotti di p od ioneVariabilità tra i lotti di produzione

Costi elevati

MaterialiMateriali innovativiinnovativi per per l’analisil’analisi didimicotossinemicotossine

Polimeri sintetici (Molecularly Imprinted Polymers, MIP)

Frammenti di anticorpi

Tratto da: Maragos, 2009. Anal Bioanal Chem395:1205

Peptidi sintetici AptameriCiclodestrine

Tratto da: Giraudi et al., 2007. J Chromatog A 2:174

Tratto da: Maragos et al., 2008. Food Addit Contam Part A, 25:164

CosaCosa sonosono gligli aptameriaptameri??

Brevi catene oligonucleotidiche a singolo

filamento (ssDNA or RNA)

Sintetizzati mediante un processo di selezione e

amplificazione in vitro chiamato SELEX

(Systematic Evolution of Ligands by EXponential

enrichment)

Sono in grado di legare con elevata specificità edg g p

affinità la molecola bersaglio (proteine, vitamine,

cellule intere, antibiotici, micotossine).cellule intere, antibiotici, micotossine).

Le interazioni tra aptamero e molecola bersaglio sono di

tipo non-covalente (legami idrogeno interazioni elettrostatichetipo non covalente (legami idrogeno, interazioni elettrostatiche,

forze di van der Waals).

AptameriAptameri vsvs anticorpianticorpi

Produzione in-vitro

Lunga “shelf-life”

Elevata riproducibilità tra i lotti di produzione

Elevata stabilità (presenza di solventi, bassi pH)

Denaturazione reversibile senza perdita di specificitàDenaturazione reversibile senza perdita di specificità

Costi di produzione contenutip

Facilmente modificabili con traccianti o fluorofori senza

perdita di selettività e specificità

ProcessoProcesso didi selezioneselezione SELEXSELEX

1 Lib i d di t i

Sequenza fissa (18-20 nt)

Regione random(20-80 nt)

Sequenza fissa (18-20 nt)

-3’5’-

1. Libreria random di aptameri(1013-1015 aptameri)

2 Legame

5. Amplificazione

Prodotto amplificato

PCRMolecola bersaglio 2. Legame

Aptameri specifici

3. Lavaggio 4. Eluizione

Aptameri non specifici

ProcessoProcesso didi selezioneselezione SELEXSELEX

6 Clonaggio6. Clonaggio

7. Sequenziamento

8. Studi di affinità

2 Legame

5. Amplificazione

Prodotto amplificato

PCRMolecola bersaglio 2. Legame

Aptameri specifici

Cicli SELEX(da 6 a 20)

3. Lavaggio 4. Eluizione

Aptameri non specifici

Selezione negativa

Molecole simili

AptameriAptameri specificispecifici per per micotossinemicotossine

Ocratossina A (OTA)

- Cruz-Aguado JA and Penner G., 2008. J Agric Food Chem,

56:10456

- Barthelmebs L, Jonca J, Hayat A, Prieto-Simon B, Marty JL 2011.

Food Control 22:737–743

Fumonisina B1 (FB1)

McKeague M, Bradley CR, De Girolamo A, Visconti A, Miller

DJ, DeRosa MC, 2010. Int. J. Mol. Sci. 11:4864

Aflatossina B1 (AFB1) e Zearalenone (ZEA)

Lee LC, Cruz-Aguado JA, Penner GA (2010) PCT Patent Application,

WO 2011/020198.

AptameriAptameri specificispecifici per per micotossinemicotossine

Ocratossina A (OTA)

13 cicli SELEX36 basiAffinità di legame verso OTA (kd): 200 nMAffinità di legame verso OTA (kd): 200 nMCross-reattività verso OTB: 1%

ssDNA Buffer di lavoro

Cations+ +

10 mM TRIS (pH 8.5)

120 mM NaCl

OTA

+ + 5 mM KCl

20 mM CaCl2OTA 20 mM CaCl2

ColonneColonne ad ad affinitàaffinità ((aptamericheaptameriche):):proceduraprocedura propostapropostaproceduraprocedura propostaproposta

Incubazione

Coniugazione

Cross-linker(EDC)

+ DADPA

AptameroOTA

Resina di agarosio(diammino dipropilammina)

Fase stazionaria(0,08 nmol DNA/µL resina)

100 µL fase stazionaria (colonne da 1-mL)Preparazione

colonne

µ ( )

200 µL fase stazionaria (colonne da 1-mL)



De Girolamo A, McKeague M, Miller DJ, DeRosa MC, and Visconti A, 2011. Food Chem., 127:1378

OTA OTA nelnel frumentofrumento duroduro::colonnecolonne aptamericheaptameriche/HPLC/HPLC--FLDFLDcolonnecolonne aptamericheaptameriche/HPLC/HPLC FLDFLD

Estrazione(metanolo:acqua)

Campione naturalmente contaminatocon 1.5 µg/kg OTA

Agitazione, 5 min

Filtrazione (Whatman Nº 4)

Diluizione (1:5) con buffera

Filtrazione (Whatman GF/A)Campione bianco

Purificazione

su colonne aptameriche

Lavaggio

Eluizione con metanolo

Determinazione Determinazione HPLC/FLD HPLC/FLD (λec = 333 nm, λem = 460 nm)


aBuffer di lavoro = 10 mM TRIS (pH 8.5), 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2.

PrestazioniPrestazioni analiticheanalitiche del del metodometodo sviluppatosviluppato

LOQ: 0,08 µg/kg12

)

y = 0.891 x – 0.09r = 0.990Q , µg/ g

8

10

ean

-up

(ng

/g

PTA

/H

PLC

)

Accuratezza: 84%

Precisione: ≤ 8% 4

6

pta

mer

SP

E c

le

Limite di legge

[µg

/kg

], (

AP

Applicabilità: 0,08 - 50 µg/kg0

2

OTA

by

ap

OTA

[

Validazione: 33 campioni di frumento

0 2 4 6 8 10 120

OTA by IMA clean-up (ng/g)OTA [µg/kg], (IMA/HPLC)

(IMA/HPLC vs APTA/HPLC)

RiutilizzoRiutilizzo:: fino a 5 volte (recuperi 92-105%, RSD 2-7%)( p , )


OTA OTA nelnel frumentofrumento duroduro: : Sistema innovativo di rivelazione a fluorescenzaSistema innovativo di rivelazione a fluorescenza

OTA-Sense® system

++

Colonne aptameriche

(OTA-Sense® Affinity column)

Soluzione fluorescente di terbio

(OTA-Sense® buffer solution)

Soluzione di

aptamero per OTA(OTA Sense Affinity column) (OTA Sense buffer solution) aptamero per OTA

Fluorescenza Risolta nel Tempo/

T f i t di E i RiTrasferimento di Energia per Risonanza

De Girolamo A, Lee L, Penner G, Schena R, Visconti A, 2012. Anal Bioanal Chem, in stampa.

FFluorescenza luorescenza RRisolta nel isolta nel TTempo eempo eTrasferimento di Energia per Risonanza Trasferimento di Energia per Risonanza

hh�

Fluorescenza Risolta nel Tempo (TRF)

OTA

Alcuni lantanidi

Terbio (Tb)

Fluorescenza Risolta nel Tempo (TRF)

Terbio (Tb)

Lantanio (La)

Samario (Sm)

Europio (Eu)

….Trasferimento di Energia per Risonanza (FRET)

TRF del TRF del complessocomplesso didi coordinazionecoordinazioneTerbioTerbio--OTAOTATerbioTerbio OTAOTA

Selezione della λem*

700

800 Soluzione standard OTA (100 nM)

Soluzione Terbio (3 M)

λem = 540 nm

500

600

)(3 mM)

Complesso Terbio-OTA

400

500

cen

za

(R

FU

200

300

Flu

ore

s

0

100

450 475 500 525 550 575 600 625 650

*λec = 370 nm

Lunghezza d'onda di emissione (nm)

TRF del TRF del complessocomplesso didi coordinazionecoordinazioneAptameroAptamero--TerbioTerbio--OTAOTAAptameroAptamero TerbioTerbio OTAOTA

Ottimizzazioneconcentrazione terbioconcentrazione terbio

60000U

)

40000

50000

ela

tiva (

RFU

30000

esc

en

za re

10000

20000

Flu

ore Aptamero-Terbio-OTA

(soluzione standard)*

Aptamero-Terbio-OTA (in matrice)**

00 5 10 15 20 25

[Terbio] mM

(in matrice)**

Dati normalizzati rispetto al segnale di background del complesso Aptamero-Terbio.

* [OTA] = 2,5 ng/mL** [OTA] = 2,2 µg/kg

TRF del TRF del complessocomplesso didi coordinazionecoordinazioneAptameroAptamero--TerbioTerbio--OTAOTAAptameroAptamero TerbioTerbio OTAOTA

Valutazione Valutazione effetto matrice*

80000

stabilità complesso*

50000

60000

70000

(R

FU

)

20000

30000

40000

Flu

ore

sce

nza

soluzione std OTA

3.5 mg matrice

7 t i

0

10000

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50

[OTA] ng/mL

7 mg matrice

14 mg matrice

[OTA] ng/mL

*Test del parallelismo e della posizione delle rette: tcalcolato < tStudent

OTA OTA nelnel frumentofrumento duroduro: : OTAOTA--SenseSense®® system system (colonne (colonne aptamericheaptameriche/TRF)/TRF)

Estrazione(acetonitrile:acqua)

OTAOTA SenseSense system system (colonne (colonne aptamericheaptameriche/TRF)/TRF)

(acetonitrile:acqua)Agitazione, 5 min

Filtrazione (Whatman Nº 4)

Purificazione su colonne

Diluizione (1:20) con buffera

Filtrazione (Whatman GF/A)

Purificazione su colonne

aptameriche (OTA-Sense®)

LavaggioLavaggio

Eluizione con metanolo

Diluizione (1:2) con soluzione fluorescente di terbio (OTA-Sense®fluorescente di terbio (OTA Sensebuffer solution)

Aggiunta dell’aptamero

Determinazione Determinazione TRF/FRETTRF/FRET(λec = 370 nm, λem = 540 nm)

OTAOTA--SenseSense®® systemsystem: : prestazioni analitiche del metodoprestazioni analitiche del metodo

LOQ: 0,5 µg/kg y = 0,918x - 0,100r = 0 98514

16

)

prestazioni analitiche del metodoprestazioni analitiche del metodo

Accuratezza: 77%

r = 0,985

10

12

14

en

se®/TR

F)

Precisione: ≤ 6%6

8

10

kg (

OTA

-Se

Linearità: 2,5 - 100 µg/kg2

4

6

[OTA

] µ

g/k

Limite di legge

0

2

0 2 4 6 8 10 12 14 16[OTA] µg/kg (IAC/HPLC-FLD)

Tempo di analisi: < 30 min

Validazione: 29 campioni di frumento naturalmente contaminato

(IMA/HPLC vs OTA-Sense® System)( y )

De Girolamo A, Lee L, Penner G, Schena R, Visconti A, 2012. Anal Bioanal Chem, DOI 10.1007/s00216-012-6076-6

ConclusioniConclusioni II

Sono note in letteratura le sequenze di aptameri a DNA

ifi i t i A f i i B fl t i Bspecifici per ocratossina A, fumonisina B1, aflatossina B1 e

zearalenone.

E’ stata messa a punto una metodica ad hoc per la

preparazione di colonnine ad affinità basate sull’impiegopreparazione di colonnine ad affinità basate sull impiego

dell’aptamero per ocratossina A.

E’ possibile utilizzare le colonne aptameriche in combinazione

con HPLC/FLD per la determinazione di ocratossina A nel

frumento.

Le prestazioni analitiche delle colonne aptameriche sonoLe prestazioni analitiche delle colonne aptameriche sono

comparabili a quelle delle colonne ad immunoaffinità.

ConclusioniConclusioni IIII

E’ stato utilizzato un sistema di rivelazione TRF/FRET basato

sull’interazione ocratossina A – terbio - aptamero per

aumentare la sensibilità del metodo di rivelazione

dell’ocratossina A in campioni di frumento.

Il metodo ha mostrato buone prestazioni analitiche ed una

buona affidabilità. Il metodo è inoltre idoneo all’analisi

parallela di numerosi campioni di frumento.

l i lid l i ll’ lGli aptameri rappresentano una valida alternativa all’utilizzo

degli anticorpi per l’analisi delle micotossine in prodotti

alimentari.

Basilica di S. Nicola, Bari Castel del Monte, BAT

NeoVenturesNeoVenturesBiotechnology Inc.

Linda Lee Maria C. DeRosaGregory Penner David J. Miller

Maureen McKeague

aptameri a dna: materiali innovativi per l'analisi di...

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