Bancale collocato in serra di nebulizzazione con talee di olivo piantate in perlite. In questo caso è difficile mantenere uniforme l’umidità relativa a causa del notevole volume di aria da umidificare.

Le talee di olivoe di numerose altre

specie sono formate da 4 – 6nodi, con almeno

un paio di foglie suinodi apicali. Nuova tecnica

con talee più piccole.

Doppio tunnelIl controllo dell’umidità relativa in

ambienti molto grandi come quelli delle serre di propagazione non è di facile esecuzione, particolarmente nei periodi a più elevata temperatura. Già da diversi anni il problema è stato ridotto ricoprendo i bancali di radicazione con un tunnel di materiale plastico (doppio tunnel) abbastanza trasparente, in modo da ridurre il volume in cui controllare l’umidità relativa (Fig. 13). I risultati sulla radicazione sono stati rilevanti, grazie al minore stress idrico subito dalle talee che hanno potuto, in questo modo, mantenere un buon livello di attività metabolica anche in presenza di temperature abbastanza elevate. Oggi, la maggior parte delle serre di nebulizzazione utilizza con successo questa tecnica.

Fog-systemIl fog-system è un sistema di umidificazione alternativo alla nebulizzazione grazie al quale vengono prodotte gocce di acqua di dimensioni estremamente piccole fino a generare una sorta di nebbia artificiale. In condizioni di elevata temperatura e radiazione luminosa questa tecnica consente di ottenere livelli di umidità relativa molto elevati e costanti senza dover impiegare le notevoli quantità di acqua necessarie, invece, con la nebulizzazione. In questo modo, il substrato di radicazione può essere modificato nelle sue caratteristiche fisiche (ad esempio impiegando un maggior contenuto di torba) non essendo più necessaria un’elevata capacità drenante. E’ ancora più importante la qualità dell’acqua impiegata che deve avere un minore contenuto di sali e non portare in sospensione alcuna impurità che potrebbe ostruire gli spruzzatori. Il fog-system può essere impiegato contemporaneamente alla nebulizzazione per un migliore controllo dell’umidità relativa oppure da solo. Un effetto fisico del fog-system che si differenzia dalla nebulizzazione è che le foglie non vengono ricoperte di quel velo di acqua che evaporando può contribuire alla riduzione della temperatura dei tessuti fogliari.

Cassone riscaldato Rappresenta un’alternativa alla nebulizzazione con la quale le talee

vengono piantate in un cassone di 40 – 50 cm di altezza, di larghezza e lunghezza variabili, chiuso lateralmente con materiale plastico e provvisto di uno sportello nella parte superiore. La base è corredata di un sistema di riscaldamento che consente l’evaporazione dell’acqua dal substrato di radicazione e il ristagno del vapore nella camera d’aria che si crea al di sopra delle talee. Il ridotto volume di aria del cassone consente di mantenere un elevato livello di umidità relativa. Nel cassone riscaldato sono stati ottenuti buoni risultati di radicazione delle talee e di attecchimento di innesti-talea di olivo.

Una variante alla nebulizzazione consiste nel coprire le taleecon un foglio di polietilene trasparente in modo da ridurre il volume di aria e

mantenere una elevata e costante umidità relativa intorno alle talee.

Qualità dell’acqua di nebulizzazioneE’ un requisito molto importante poiché se l’acqua è troppo ricca di sali, in particolare di calcio, si va incontro a due tipi di problema: il primo che gli ugelli possono otturarsi e non erogare più un’omogenea quantità di acqua, il secondo che con l’evaporazione dell’acqua dalla superficie delle foglie, con il passare del tempo, si forma uno strato calcareo sulla lamina fogliare che ne riduce il metabolismo, in particolare a seguito di una ridotta funzionalità stomatica. Inoltre, le caratteristiche dell’acqua come la durezza e la conducibilità elettrica possono indurre fenomeni di salinità con ripercussioni negative sulla rizogenesi delle tale. In generale, la salinità non dovrebbe superare 100 mg/L. Nel caso di acque dure l’impianto di nebulizzazione potrà essere corredato di un sistema di addolcimento con resine a scambio cationico di ioni di K dal momento che quelle con NaCl possono provocare danni per eccesso di sodio nei tessuti.

Substrato di radicazioneIl substrato di radicazione ha come funzione principale di sostenere la talea in

posizione verticale ma in relazione alle sue caratteristiche fisico-chimiche può svolgere un ruolo molto importante sulla qualità della radicazione.

I principali requisiti di un substrato sono rappresentati da una buona porosità e una buona capacità drenante per evitare eccessi di acqua, deve trattenere una sufficiente umidità, permettere un’elevata circolazione dell’aria (ossigeno) durante il periodo di radicazione ed essere esente da funghi e batteri.

Nelle serre provviste di impianto di nebulizzazione, il materiale che più si adatta

all’elevato apporto di acqua, è la perlite, costituita da granuli di 1 – 5 mm di diametro di roccia vulcanica porosa, inerte, sterile, leggera (95 – 140 Kg/m3), con pH di circa 6 – 7. La perlite viene posta nel bancale per un’altezza di circa 20 cm, abbondantemente bagnata e leggermente pressata prima di introdurvi le talee. Grazie alle sue caratteristiche è il materiale più adatto come substrato di radicazione quando l’apporto di acqua alle talee è elevato, rispetto anche ad altri componenti come vermiculite, sabbia, ecc.

Perlite

Temperatura e luce

- Temperatura ambientale: evitare la schiusura delle gemme prima della formazione delle radici

-Temperatura del substrato di radicazione (Riscaldamento basale durante i periodi a bassa temperatura (< a circa 10 – 12 °C)

La luce (radiazione solare) può essere eccessiva nei mesi estivi quando deve essere ridotta con reti ombreggianti (al 60 – 80 % ) e imbiancando le pareti interne della serra. Deve, però, essere assicurato un valore sufficiente per l’attività fotosintetica. Nei mesi invernali ed alle latitudini più elevate potrebbe essere utile una illuminazione supplementare.

Imbiancatura della serra per ridurre l’intensità della radiazione solaree quindi della temperatura interna.

Serra provvista di cooling system: a sinistra ventilatori che estraggonol’aria interna; a destra pannelli umidificati attraverso quali l’aria esterna e

costretta a passare, umidificandosi eraffreddandosi.

COOLING SYSTEM

per il controllo della temperatura

RISCALDAMENTO BASALE:

- viene applicato in tutti i casi in cui la temperatura ambientale è inferiore a circa 13 – 15 °C; una temperatura biologicamente più efficace (18 – 20 °C) favorisce la rizogenesi,- la temperatura deve riscaldare solo la parte base delle talee lasciando dormienti (a più bassa temperatura) le gemme esposte all’aria fino a quando la radicazione non è avvenuta e le radici hanno acquisito la capacità di assorbire.

Bancale di radicazioneprovvisto di impianto

di riscaldamento basale.

in generale da circa 45 giorni a 90 giorni in funzione:- dell’attitudine rizogena del genotipo- del periodo dell’anno- della condizione fisiologica delle talee- dello stato sanitario delle talee (ad esempio certe virosi riducono la rizogenesi)

- controllo dello stato sanitario (eventualmente trattare con fungicidi)- verifica costante del funzionamento della nebulizzazione e del riscaldamento basale- eliminazione delle foglie cadute

Durata della fase di radicazione

Cure alle talee in radicazione

ACCLIMATAZIONE DELLE TALEE RADICATE ALL’AMBIENTE ESTERNO AL BANCALE DI RADICAZIONE.

Terminata la radicazione, le radici delle talee legnose sottoposte a riscaldamento basale, le radici e tutta la parte aerea delle talee sottoposte a nebulizzazione (talee provviste di foglie) devono essere abituate (acclimatate) alle nuove condizioni (diverso substrato e ambiente esterno) in cui saranno poste dopo il trapianto.

Per evitare stress idrici e termici è necessario ridurre gradualmente la temperatura basale e l’erogazione dell’acqua fino a valori simili a quelli del nuovo ambiente. Ciò può essere iniziato una decina di giorni prima del trapianto.

Questa fase è particolarmente importante quando le talee in nebulizzazione hanno sviluppato nuovi germogli le cui foglie si adattano alla più elevata umidità relativa riducendo il meccanismo di chiusura stomatica; tale meccanismo deve essere ripristinato gradualmente in modo che la talea risponda prontamente alla minore umidità relativa ambientale dopo il trapianto.

INNESTO

Si ricorre all’innesto per:

- modificare la vigoria della pianta- conferire alla pianta una particolare conformazione- propagare un genotipo a difficile radicazione avventizia- superare problemi di natura sanitaria (es. fillossera: vite europea/vite americana)- adattare un particolare genotipo a condizioni pedologiche non appropriate (es. asfissia radicale per ristagno idrico, elevata concentrazione di calcare attivo)- accelerare la fruttificazione- rimediare a danni provocati da agenti vari- allevare branche e rami in zone spoglie di vegetazione

Le parti che compongono una pianta innestata sono:- il portinnesto (ipobionte)- il nesto (epibionte)

le due parti si chiamano anche bionti

Cedrus atlantica glauca pendula:l’innesto modifica la forma

Portinnesto melo: diversa vigoria

Ligustrum ovalifolium

innesto

portinnesto

germoglio cv.

innesto per approssimazione

Innesti a gemma:a) ad occhiob) a pezza

c) alla maiorchinad) ad anello

Innesto a gemma dormiente: viene eseguito alla fine dell’estate su piante in succhio utilizzando gemme dormienti prelevate al momento dell’innesto da piante della cultivar da innestare. Sullo scudetto viene lasciata una porzione di picciolo della foglia; se l’innesto attecchisce, il picciolo, una decina di giorni dopo dissecca e cade; se avvizzisce senza cadere la gemma non ha, probabilmente, attecchito. Innesto a gemma vegetante: viene eseguito in primavera (aprile – maggio) su piante in succhio utilizzando gemme dormienti prelevate da rami raccolti in gennaio e conservati in frigo; i possibili problemi sono dovuti ad una cattiva conservazione ed al fallimento dell’innesto.

CONDIZIONE ESSENZIALE AFFINCHÉ GLI INNESTI A GEMMA ATTECCHISCANO È CHE IL PORTINNESTO SIA IN SUCCHIO

Innesti a marza:a) a spaccob) a spacco terminalec) a doppio spacco inglese

d) a sellae) a cavallo f) a spacco laterale

Innesti a marza:g) a speroneh) a intarsioi) a penna

l) a becco di clarino m) a corona n) a arco o) a ponte

INNESTO A PONTE

Chip budding Maiorchina

Scopi dell’INNESTO ERBACEO:

- ridurre i tempi necessari per ottenere una pianta

- essendo fatto in contenitore (la pianta deve essere sottoposta a forzatura) possiamo eseguire l’innesto indipendentemente dalle condizioni climatiche e disporre di piante anche in periodi non adatti al trapianto.

INNESTO ERBACEOSi esegue su piante i cui tessuti (portinnesto e nesto)

non sono ancora ben differenziati

INNESTO ERBACEO DEL PESCO

melanzanapomodoro

Istogenesi nell’innesto a gemma

Callo di cicatrizzazione

cambiforme

Istogenesi nell’innesto a marza

Callo di cicatrizzazione

Disaffinità di innesto

APPROFONDIMENTI (fino alla dia n. 39)

Sintomatologia della disaffinità di innestoI sintomi associati alla disaffinità di innesto possono essere riuniti in cinque grandi gruppi in relazione alla velocità ed alle modalità con le quali il fenomeno si manifesta.

1) Mancato attecchimento dell’innesto o precoce morte delle gemme ed eventuali germogli (disaffinità totale). Il primo e più evidente sintomo della disaffinità totale è rappresentato dal mancato attecchimento dell’innesto o dalla precoce morte del germoglio del nesto alla ripresa vegetativa. Questa forma di disaffinità si può verificare anche in combinazioni tassonomicamente non molto distanti (melo/pero), o ordinariamente affini (per esempio le cultivar di pesco sono in genere affini al susino Damasco, mentre le cultivar di nettarine manifestano una precoce e totale disaffinità con questo portinnesto).

2) Deperimento con morte del portinnesto in piante adulte (disaffinità ritardata)In questo gruppo si inseriscono quei casi di disaffinità che portano alla morte dell’individuo alcuni anni dopo l’esecuzione dell’innesto; è il caso del pesco innestato su mandorlo, o del mandorlo innestato su Marianna 2624. Queste combinazioni danno origine a piante che crescono e sono in grado di produrre per uno, due anni, ma che, successivamente, manifestano un veloce deperimento e precoce caduta delle foglie; con il deperimento del nesto compaiono anche ampie zone necrotiche a livello dei tessuti floematici del portinnesto, che inevitabilmente finisce per morire.Un caso molto particolare di disaffinità ritardata, in pratica l’unico caso di disaffinità di cui sono ben note le cause ed i meccanismi, è quello riguardante alcune cultivar di pero su portinnesti di cotogno, con particolare riferimento all’East Malling C. In genere l’innesto di pero su cotogno è affine, ma per alcune varietà (“William” e “Kaiser”) dopo qualche anno dall’innesto incomincianoa comparire delle sintomatologie di deperimento dovute ad una progressiva necrosi dei tessuti cambiali, che finisce per alterare la continuità dei due bionti sino a creare una vera e propria decorticazione anulare nel punto di innesto, con la presenza di tessuti necrotici che impediscono la traslocazione degli elaborati tra i due individui.

Classicamente la disaffinità ritardata viene divisa in due categorie:a) Disaffinità superabile mediante l’interposizione di un terzo bionte (intermediario) affine con il portinnesto e la varietà individuata per la produzione (disaffinità localizzata), ed è il caso del pero su cotogno, nel quale l’interposizione di una varietà di pero (“Old Home” o “Beurrè Hardy”) perfettamente affine al cotogno “East Malling C” permette di superare la disaffinità che si manifesta quando le varietà sono direttamente innestate sul portinnesto.b) Disaffinità non superabile mediante l’interposizione di un intermediario affine con il portinnesto e la varietà individuata per la produzione (disaffinità traslocabile), come è il caso delle varietà di mandorlo su “Marianna 2624”.3) Disaffinità per discontinuità dei tessutiQuesta disaffinità insorge quando i due cambiformi, cioè quei gruppi di cellule che ricreano le fasce cambiali nel soggetto e nel nesto, non arrivano a congiungersi al momento dell’attecchimento dell’innesto; con l’attività cambiale i due bionti crescono in modo sincrono, ma rimangono sempre separati da un sottile strato calloso, che consente il regolare trasferimento degli elaborati attraverso il sistema plasmodesmico, ma non consente la continuità dei tessuti xilematico e floematico. In questo modo, crescendo la pianta, la mancata continuità dei tessuti determina al livello del punto di innesto una zona di rottura, rendendo la struttura dell’albero molto sensibile a sollecitazioni meccaniche.Nella combinazione albicocco su mandorlo, la rottura avviene precocemente, nel giro di uno, due anni, mentre quando l’albicocco è innestato su mirabolano, la pianta può crescere per un indeterminato numero di anni, arrivando alla completa maturità produttiva, e poi “scollarsi” senza alcun preavviso, con la caduta dell’intera chioma; il punto di rottura evidenzia la mancata connessione dei tessuti dei bionti lasciando le relative superfici di contatto nette e praticamente speculari; questa combinazione di innesto può essere agronomicamente utilizzata per la adattabilità dell’apparato radicale del mirabolano a suoli “pesanti”.

4) Disaffinità per diverso accrescimento dei bionti e formazione di iperplasie sopra il punto di innesto.In alcune combinazioni di innesto, dopo un attecchimento apparentemente regolare, si possono verificare delle differenze nell’accrescimento diametrale dei due bionti, molto evidenti quando si innesta ad esempio il ciliegio dolce (Prunus avium) su ciliegio delle sabbie (Prunus bessey). In genere, quando il diametro del portinnesto è inferiore a quello della varietà, si determina nella zona basale del nesto un accumulo di sostanze di riserva, prevalentemente amidi, e la formazione di iperplasie, talora anche vistose, come nel caso della Vitis vinifera innestata su portinnesti di specie americane o ibridi americo-americani, o ciliegio dolce su magaleppo o, infine, alcune cultivar di melo su East Malling 9 (Malus pumila var. paradisiaca) ed East Malling 27.Questa forma di disaffinità in melo determina la formazione di piante di rilevante interesse agronomico in specifiche combinazioni di innesto, utilizzando i portinnesti nanizzanti come l’EM 9, che permettono alle varietà di esprimere le elevate capacità produttive e le elevate qualità della produzione.

5) Deperimento (disaffinità) indotto da agenti patogeni (virus, viroidi e micoplasmi) in specifiche combinazioni di innesto.I casi di disaffinità indotta da questo gruppo di patogeni sembrano molto diffusi; il loro verificarsi in specifiche combinazioni di innesto può avere sulla coltivazione di una specie conseguenze che possono essere di portata analoga a quella che ha avuto la fillossera per la vite; esemplificativo è il caso del virus della “tristezza” (deperimento), che rende incompatibili gli innesti di arancio dolce (Citrus sinensis), resistente, su arancio amaro (Citrus aurantium), sensibile. L’infezione, che si presenta come un deperimento della chioma di arancio dolce, è letale per il portinnesto e, nelle zone ove questa malattia è presente, è indispensabile scegliere portinnesti resistenti. Un’altra sintomatologia (“pear decline”) legata alla presenza di un micoplasma si verifica nella combinazione di innesto di Pyrus communis (resistente) su Pyrus pyrifolia (pero orientale, sensibile); anche in questo caso si ha una devitalizzazione del portinnesto, e viene segnalata la comparsa di bande necrotiche nel floema sotto il punto di innesto.

Cause della disaffinitàSulle cause della disaffinità si conoscono numerosi studi che ne hanno rivelato le basi biochimiche-fisiologiche. I principali modelli di riferimento sono le combinazioni di pero/cotogno e pesco/Prunus spp nelle quali l’insorgenza dei sintomi iniziali della disaffinità (es. isole necrotiche, tipiche della discontinuità dei tessuti) viene attribuita agli effetti citotossici esercitati dall’acido cianidrico derivato dalla degradazione di glucosidi cianogenici (come amigdalina o prunasina presenti nel soggetto), operata da una coppia di enzimi b-glucosidasi e mandelonitrile-liasi presenti invece nel nesto. Ne sono principalmente colpite le cellule cambiali e quelle floematiche e xilematiche sopra il punto d’innesto. È verosimile che la dinamica di questo meccanismo sia scatenata da segnali di riconoscimento cellulare che inducono la sintesi di proteine specifiche che inducono o sono messaggere del rigetto biologico del nesto, almeno nel caso di disaffinità totale. In proposito risulta che l’innesto di albicocco su susino ibrido (Mirabolano x Marianna), combinazione disaffine osservata “in vitro” attraverso la fusione di due bionti, provoca una rapida sintesi della proteina UGPase (glucosio-pirofosforilasi), messa subito in relazione con la disaffinità.

Un altro meccanismo eziologico della disaffinità è quello riconducibile allo stress ossidativo legato a classi di enzimi, quali le perossidasi (POD), alla cui attività, collegata a quella di alcuni fenoli, può seguire la morte cellulare. Si sa ad esempio che i fenoli, pur essendo considerati in gran parte protettivi, almeno alle concentrazioni medio-basse, possono essere anch’essi causa di tossicità quando, dopo forte accumulo nelle combinazioni disaffini, possono essere ossidati e degradati a chinoni, la cui polimerizzazione produce azione tossica su vari metaboliti secondari, compresa l’inibizione della sintesi della lignina.

Modelli di studio “in vitro” di calli e cellule dei due bionti in combinazione disaffini hanno evidenziato il basilare ruolo di alcune perossidasi, il cui contenuto è fortemente aumentato in coincidenza con l’accumulo di flavanoli che interagiscono col meccanismo di resistenza agli stress ossidativi.

Altri enzimi coinvolti sono l’IAA ossidasi (IAAOx), importante per la lignificazione del nesto, e la polifenolossidasi PPO, che agisce sul metabolismo fenolico. In particolare, nelle combinazioni di pero William e Kaiser/Cotogno (disaffini), co-coltivate in vitro, è stato riscontrato un più forte consumo di ossigeno (da extra-respirazione) connesso con la modulazione della produzione di composti ROS (Reactive Oxigen Species), secondo uno scenario metabolico reattivo di detossificazione e di contrasto dei danni da stress ossidativi. È stata anche riscontrata nelle combinazioni di calli incompatibili una precoce senescenza delle cellule.

La presenza di un’accresciuta sintesi di polifenoli nella disaffinità d’innesto può essere utilizzata anche a fini diagnostici; alcuni fenoli (es. catechine ed epicatechine) sono stati indicati come possibili marcatori biochimici della disaffinità, utili per monitorare il grado di affinità (o di disaffinità) con i possibili portinnesti.Come prima detto, l’affinità intervarietale (intraspecifica) normalmente è elevata, ed il suo livello può essere studiato valutando mediante elettroforesi i profili isoenzimatici, in particolare quelli di perossidasi e proteine, che possono essere classificati come fattori di compatibilità.

Sintomi di disaffinità

Combinazioni affini

pero /cotogno albicocco/mirabolano

Juglans regia /J. nigramelo/M9

Per superare la disaffinità d’innesto si può utilizzarel’innesto con Intermediario o sottoscudo

Oppure vedi metodo che segue

I fase: innesto a gemma dormiente (fine agosto) dellacultivar su un ramo di una pianta dell’intermediario

(affine con cultivar e portinnesto)

intermediario

Cultivar disaffine

II fase: innesto a marza (a triangolo), in marzo, sul portinnesto

intermediario

Vantaggio: si evita il rischio che la cultivar disaffine venga a contatto con i tessuti del portinnesto, come potrebbe avvenire con l’innesto

a gemma a doppio scudo

Fattori ambientali favorevoli all’attecchimento dell’innesto:

- temperatura adeguata (15 – 25°C)- umidità (relativa e del terreno) sufficiente- stato sanitario

MicroinnestoPuò essere impiegato per:- produrre piante virus esenti (portinnesto e meristema virus esenti, termoterapia per l’apice meristematico)- eseguire saggi di virus indexing (i sintomi appaiono più precocemente che

in vivo)- determinare precocemente fenomeni di incompatibilità di innesto- indurre ringiovanimento in materiale vegetale prelevato da piante mature- propagare piante a difficile radicazione

Fig. 13 - Microinnesto del pistacchio.

Fig. 14 - Identificazione precoce della presenza di virus in tessuti di vite mediante innesto in vitro.

E’ una tecnica con la quale una marza di una varietà a difficile radicazione viene innestata su talee di un portinnesto a facile radicazione.

Gli innesti-talea vengono forzati in ambiente riscaldato dove l’elevata e costante umidità e una temperatura ottimale consentono la contemporanea saldatura dell’innesto e la radicazione del portinnesto.

Questa tecnica presenta il vantaggio, rispetto all’innesto su

semenzale, di richiedere un tempo minore per l’attecchimento dell’innesto e, in particolare,

di produrre piante caratterizzate da una maggior uniformità genetica del portinnesto, evitando così anche quelle più o meno evidenti differenze biologiche e agronomiche derivanti dall’eterogeneità dei semenzali.

INNESTO-TALEA

1

2

3 4

6

5

Forzatura degli innesti-talea

7

Innesto - talea Vite

Preparazione della talea portinnesto

Inserimento della marza Fasciatura con parafilm

Radicazione avvenutaDurante la radicazione sotto mistInnesti-talea pronti per la radicazione

Innesto - talea Agrumi

Innesto - talea Agrumi

Micropropagazione E’ una applicazione della coltura in vitro

La coltura in vitro è una tecnica che consiste nel coltivare in condizioni ambientali controllate, su substrati artificiali, in ambiente asettico, porzioni di tessuto differenziato o indifferenziato per ottenere un “prodotto” (es. callo, sospensioni cellulari, germogli, radici, embrioni somatici, protoplasti, ecc) con caratteristiche diverse in

relazione agli obiettivi prefissati.

Impieghi della coltura in vitro

• - micropropagazione• - organogenesi (rizogenesi, caulogenesi)• - embriogenesi somatica• - produzione di semi artificiali• - microinnesto• - embriocoltura (coltura di ovulo e di ovario)• - coltura di antere e polline• - coltura di callo• - colture di cellule in sospensione • - colture di protoplasti (cellule con plasmalemma ma senza parete cellulare)

Cenni storici e situazione attuale della micropropagazione in Italia.

Importanza commerciale: produzione di specie ornamentali, forestali, arboree, medicinali, officinali

Vantaggi della micropropagazione:- propagazione di genotipi recalcitranti- propagazione di cloni specifici- propagazione di specie a lenta moltiplicazione (es. orchidee, rizomatose, felci, palme, ecc.)- non dipendenza dalle condizioni ambientali- produzione di piante virus esenti (con apposita procedura)- diffusione di nuove cultivar molto richieste dal mercato- propagazione di specie e cultivar ad elevato valore di mercato- conservazione del germoplasma (crioconservazione, espianti incapsulati)- produzione di elevate quantità di piante in spazi e tempi ridotti- facilità di programmare la produzione- piante esenti da patogeni- piccole dimensioni delle piante che facilitano il trasporto

Numerosi fattori influenzano

l’accrescimentodelle colture

in micropropagazione

Prelievo apice

Allungamento dei germogli

Moltiplicazione dei germogli

Colture in moltiplicazione Germogli pronti per la radicazione

Germogli radicati Piantine in acclimatazionePiantine acclimatate

Fasi della micropropagazione.

• Impianto in vitro

- scelta del tipo di espianto (true-to-type), stato di vegetatività

- sterilizzazione dell’espianto

- scelta del substrato di coltura

- stabilizzazione della coltura

• Moltiplicazione dei germogli

• Allungamento dei germogli

• Radicazione dei germogli

• Acclimatazione delle piantine

Scelta del tipo di espianto

Importante è la conformità genetica (true-to-type) Tipi di espianto:- Meristema gemmario, apice di germoglio, gemma dormiente

Sterilizzazione dell’espianto- Obiettivo: eliminare contaminanti (funghi e batteri) presenti sulla

superficie esterna dell’espianto

Preparazione del materiale vegetale che costituirà l’espianto- Pretrattamenti con fungicidi sulla pianta madre - Maggiore facilità di sterilizzazione del materiale vegetale giovane fatto crescere in condizioni ambientali controllate- Difficoltà di eliminazione dei contaminanti interni ai tessuti Trattamento degli espianti -Agenti sterilizzanti: alcool, acqua ossigenata, ipoclorito di sodio

o di calcio, cloruro di mercurio.

Le operazioni di trasferimento delle colture avvengono sotto cappa a flusso laminare di aria sterile

Lampada UV per la sterilizzazione del vano della cappa prima del suo impiego

Scelta del substrato di coltura- E’ una delle scelte più importanti (da esso dipende la risposta di crescita delle colture)- Non esistono parametri o riferimenti specifici (indicazioni di massima dall’analisi dei componenti dei tessuti)

- Substrato di riferimento Murashige e Skoog (MS)

- Componenti del substrato ritenuti essenziali:- Sali inorganici- Composti organici- Agente gelificante

Sali inorganici:- macroelementi (azoto, fosforo, potassio, calcio, magnesio)- microelementi (boro, cobalto, rame, manganese iodio, zinco e ferro)- esistono molte combinazioni di macro e micro i formulazioni diverse

Macronutrients (mg/l)   Micronutrients (mg/l)  

Ammonium nitrate (NH4NO3) 1,650mg/l Boric Acid (H3BO3) 6.2mg/l

Calcium chloride (CaCl2*H2O) 440mg/l Colbalt chloride (CoCl2*6H2O) 0.025mg/l

Magnesium sulfate (MgSO4*7H2O)

370mg/l Cupric Sulfate (CuSO4*5H2O) 0.025mg/l

Potassium phosphate (KH2PO4)

170mg/l Ferrous sulfate (FeSO4*7H2O) 27.8mg/l

Potassium nitrate (KNO3) 1,900mg/l Manganese sulfate (MnSO4*4H2O) 22.3mg/l

    Potassiom Iodine (KI) 0.83mg/l

   Sodium molybdate

(Na2MoO4*2H2O)0.25mg/l

    Zinc Sulfate (ZnSO4*7H2O)c 8.6mg/l

    Na2EDTA*2H2Oa 37.2mg/lb

Composti inorganici

Vitamine• 2.0 mg Glycine, • 0.5 mg Nicotinic Acid, • 100 mg myo-Inositol, • 0.5 mg Pyridoxine HCl, • 0.1 mg Thiamine HCl

Composti organici

Regolatori di crescita• Auxina 0.5–5 mg/l • Citokinina 0.04–10 mg/l

Auxine (in radicazione)

Effetti fisiologici

Cellule, organi e tessuti bersaglio Effetto - Cellule nei fusti e coleoptili Distensione della cellula - Parete cellulare nei giovani fusti e nei coleoptili in via di sviluppo Aumento dell'estensibilità - Radici e foglie Regolazione dell'accrescimento - Gemme laterali Inibizione della crescita - Frutto in via di sviluppo Regola l’accrescimento - Tropismi Mediano gli effetti della luce e della gravità

Tipo:- Acido indolbutirrico (IBA)- Acido naftalenacetico (NAA)- Acido indolacetico (IAA)

- Concentrazione: 0,1 – 2 mg/l

CitokinineEffetti fisiologici

- Stimolano la divisione cellulare - Stimolano la morfogenesi (formazione di gemme e germogli) in colture in vitro - Stimolano la crescita delle gemme laterali liberandole dalla dominanza apicale- Controllano l’espansione della foglia modificando l’espansione cellulare (effetto miniaturizzante) - Possono favorire l’apertura stomatica- Favoriscono la differenziazione dei cloroplasti (stimolando la sintesi della clorofilla)

Il bilancio auxine/citokinine è cruciale durante la divisione cellulare e la differenziazione dei essuti

Concentrazione citokinina (mg/l)

Effetto del diversa concentrazione di citokinina

Numero di germogli

Lunghezza germogli (cm)

Concentrazione ottimale?

2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

10

1

3.0

1

Tipo di citokinina: • - N6 -benzyladenina (BA)• - Kinetina • - N6 – isopentenyl-adenina (2IP)• - Zeatina (ZEA)• - Thidiazuron (composto citokinino-simile)• - N-2-chloro-4-pyridyl N-phenylurea (CPPU)

Concentrazione: 0.3 – 3 mg/l

Gibberelline

La più efficace è la GA3

Nella micropropagazione questa gibberellina è impiegata nella fase di moltiplicazione ed allungamento dei germogli ma non durante la radicazione (ha effetto inibente sulla rizogenesi). Concentrazione: 0,1 – 0,2 mg/l in moltiplicazione; 0,5 – 0,6 in allungamento dei germogli

- Saccarosio 20 – 30 g/l- Agar 5 - 10 g/l

Importanza del saccarosio:1) Rifornisce le colture di energia per l’accrescimento2) Influisce sulla pressione osmotica del substrato

(influisce sulla capacità di assorbimento dei nutrienti e dell’acqua – può ridurre la vitrescenza)

Problematiche delle colture in vitro nei riguardi dell’attività fotosintetica.

Tale processo può manifestarsi ma è ostacolato 1) dalla ridotta intensità della luce e

2) dalla carenza di anidride carbonica

AgarViene usato per dare una consistenza gelatinosa al substrato e mantenere le colture nella posizione ritenuta ottimale (verticale) per l’accrescimento.

E’ prodotto da alghe rosse ed è purificato a diversi livelli (Agar alimentare e da laboratorio)

Quantità variabile: 3 - 4 g/l fino a 8 - 10 g/l

Influisce sulla diffusione dei componenti del substrato disciolti

nella fase liquida. Effetto sull’accrescimento (vedi fig.)

Accrescimento

Conc. di Agar

Fasi successive della preparazione del substrato:Dopo aver miscelato tutti i componenti del substrato si procede alla:

- Misurazione ed aggiustamento pH del substrato: con KOH 1 N (se acido) oppure con HCl 1 N se alcalino). Il valore ottimale del pH è compreso tra 5.2 e 5.8

- Sterilizzazione del substrato in autoclave a 121°C per 20 min.

- Raffreddamento ed utilizzazione del nuovo substrato

Condizioni ambientali della camera di crescita

- temperatura: 22 – 24 °C- luce:

- intensità circa 50 µmoli m -2 s -1 (problemi fotosintesi) - fotoperiodo 16/8 - qualità

- UR

Camera dicrescita