ariadiny de lima caetano

ARIADINY DE LIMA CAETANO

Influência do treinamento físico em esteira sobre a densidade de

receptores B2 para bradicinina, no bulbo e medula espinhal de ratos

normotensos e espontaneamente hipertensos.

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para a obtenção de título de Mestre em Ciências da Saúde.

São Paulo 2008

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ARIADINY DE LIMA CAETANO

Influência do treinamento físico em esteira sobre a densidade de

receptores B2 para bradicinina, no bulbo e medula espinhal de ratos

normotensos e espontaneamente hipertensos.

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para a obtenção de título de Mestre em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Hudson de Sousa Buck Co-orientadora: Profa. Dra. Tânia Araújo Viel

São Paulo 2008

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central da

Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo

Caetano, Ariadiny de Lima Influência do treinamento físico em esteira sobre a densidade de receptores B2 para bradicinina, no bulbo e medula espinhal de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos./ Ariadiny de Lima Caetano. São Paulo, 2008.

Tese de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de pós-graduação em Ciências da Saúde Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador : Hudson de Sousa Buck Co-orientador: Tânia Araujo Viel

1. Exercício físico/fisiologia 2. Calidina 3. Hipertensão 4. Ratos

BC-FCMSCSP/40-08

Dedico este trabalho aos meus pais, José Carlos e Claudete, pelo

incentivo e dedicação ao meu crescimento pessoal, profissional e pelo

exemplo de vida.

As minhas irmãs, Aliany e Ariny, pela compreensão, amizade e apoio

na minha carreira profissional e pessoal.

A minha linda sobrinha Ynaila, pela descontração nos momentos de

estudo e pesquisa.

Aos meus familiares, minha avó Marinalva, meu avô José, ao Júlio e

aos meus tios, tias, primos, primas e amigos que de alguma forma

contribuiram para que pudesse realizar este trabalho.

Muito obrigada por tudo.

Ao meu orientador Prof. Dr. Hudson de Sousa Buck, por ter me aceito

como pós-graduanda, pela paciência, ensinamentos, discussão e

amizade.

À minha co-orientadora Prof. Dra. Tânia Araújo Viel, pelos

ensinamentos farmacológicos, fisiológicos, bioquímicos, entre outros;

pela paciência, dedicação e amizade.

Agradecimentos

Ao Prof. Dr. Osmar Monte, chefe do Departamento de Ciências Fisiológicas (DCF)

da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo (FCMSCSP), pela

oportunidade de realização deste trabalho.

À FCMSCSP pela oportunidade de realizar a pós-graduação.

À Capes e ao FAP- Santa Casa pelo auxilio financeiro.

Ao Prof. Dr. Dino Martini Filho, chefe do Departamento de Ciências Patológicas da

FCMSCSP, por nos disponibilizar o criostato.

À Profa. Dra. Mariana Silva Araújo, do Departamento de Bioquímica da Universidade

Federal de São Paulo (UNIFESP-EPM), pelos ensinamentos químicos e bioquímicos

e pela colaboração nos experimentos com os análogos de bradicinina.

À Profa. Dra. Kátia De Angelis, pelos ensinamentos sobre treinamento físico, na

utilização da esteira ergométrica e por nos passar a programação de atividade física

utilizada neste trabalho.

À Profa. Dra. Débora Hipólide, do Departamento de Psicobiologia da Escola Paulista

de Medicina (UNIFESP-EPM), pelo uso do aparelho de análise de imagem MCID.

Aos amigos do dia-a-dia Maria Fernanda Bittencourt (Mafê), Fábio Agostini, Karis

Dong, Marilia Albuquerque, Ticiana Baraldi, Andrea Gesseff, e Mayra pelos bons

momentos passados no laboratório durante os experimentos (cirurgias, preparo de

ração do grupo da cafeteria e principalmente pelas tardes à frente da esteira).

Aos meus novos sobrinhos, Alexandre e Ana Luiza, pelas visitinhas à FCMSCSP.

A Célia Nascimento, secretária do departamento e Flávio Richete, biotécnico, pelas

conversas e momentos de descontração.

A todos do DCF, muito obrigada.

Lista de Abreviações: 125INa- Iodeto de sódio 125

AP- área postrema

AT1- receptor para angiotensina do subtipo AT1

BK- bradicinina

BSA- soro de albumina bovino

CVLM- bulbo ventrolateral caudal

ECA- enzima conversora de angiotensina

HK- cininogênio de alto peso molecular

HPP-HOE 140- (3-4hydroxyphenyl-propionyl-D_Arg[Hyp3, Thi5, D-TiC7, Oic8]_BK)-

antagonista B2.

HPP-[des-Arg10]-Hoe140 (3-4hydroxyphenyl-propionyl-des-Arg9-D_Arg[Hyp3, Thi5, D-

TiC7, Oic8]_BK)- antagonista B1.

Kd- calidina

L1, L2 e L3- lâminas 1, 2 e 3 da medula torácica

Ls- lâminas 4 e 5

LW – cininogênio de baixo peso molecular

MgCl2- Cloreto de Magnésio

MLBK- Met_Lys_BK

mRNA- ácido ribonucléico mensageiro

NA- núcleo ambíguo

NMDV- núcleo motor dorsal do vago.

NTS- núcleo do trato solitário

PA - pressão arterial

Pa5- núcleo paratrigeminal

PAS- pressão arterial sistólica

pCO2- pressão parcial de dióxido de carbono

PGE2- Prostaglandina E2

PGI2 - Prostaciclina

PIPES- Piperazine –N, N’-bis[2-ethanesulfonic acid]

pO2- pressão parcial de oxigênio

RVLM- bulbo ventrolateral rostral

SHR- ratos espontaneamente hipertensos

SHRS- ratos espontaneamente hipertensos sedentários

SHRT- ratos espontaneamente hipertensos treinados

SNC - sistema nervoso central

sp5- trato espinhal do trigêmio

WS- wistar sedentários

WT- wistar treinados

Índice

1- Introdução..........................................................................................................1

1.1- Sistema Calicreína-Cininas.....................................................................1

1.2- Receptores Cininérgicos.........................................................................2

1.3- Ações centrais das cininas…………………..……………………………...2

1.4- Metabolismo das cininas……………………..……………………………..3

1.5- Distribuição dos receptores cininérgicos no Sistema Nervoso

Central....................................................................................................4

1.6- Mecanismo central de ajuste da Pressão Arterial...................................7

1.7- Exercício Físico e Hipertensão……………………….............….....……10

2- Objetivos..........................................................................................................14

3- Material e Métodos………………………………..................……………………15

3.1- Animais………...…………………….................………………………......15

3.2- Teste de Esforço…….....…………………….................…………………15

3.3- Treinamento Físico................................................................................16

3.4- Medidas da Pressão Arterial Sistólica e Avaliação do Peso.................17

3.5- Preparação das amostras.....................................................................17

3.6- Iodação dos Peptídeos……………...........………..................………….18

3.7- Radioautografia “in vitro” de receptores de cininas...............................18

3.8- Quantificação dos receptores................................................................19

3.9- Análise estatística dos dados................................................................20

4- Resultados......................................................................................................21

4.1- Teste de Resistência Física..................................................................21

4.2- Peso dos animais.................................................................................22

4.3- Efeito do treinamento físico sobre a PAS de ratos Wistar

normotensos.........................................................................................23

4.4- Efeito do treinamento físico sobre a PAS de ratos espontaneamente

hipertensos...........................................................................................24

4.5- Comparação da PAS entre SHR e Wistar...........................................26

4.6- Análise Radioautográfica in vitro dos receptores B2 no bulbo e na

medula espinhal torácica......................................................................28

4.6.1- Ratos sedentários......................................................................28

4.6.2- Ratos Wistar treinados..............................................................28

4.6.3- SHR treinados...........................................................................32

4.6.4- Comparação da densidade de ligações específicas para o

receptor B2 entre os grupos SHRS e WS.................................33

4.6.5- Comparação da densidade de ligações específicas para o

receptor B2 entre os grupos SHRT e WT...................................34

5- Discussão........................................................................................................35

6- Conclusão.........................................................................................................42

7- Referências Bibliográficas…..........…………………....................………………43

Resumo…………………....………………………...................................54

Abstract.................................................................................................56

Anexos..................................................................................................57

Introdução

1

Introdução

1.1. Sistema calicreína-cininas.

O papel fisiológico do sistema calicreína-cininas está relacionado à

participação direta ou indireta no controle da pressão arterial, à permeabilidade

vascular, às reações inflamatórias e dolorosas e a diversos eventos patológicos

como asma, alergia, artrite reumatóide, choque endotóxico e pancreatite

(Baumgarten et al., 1985; Calixto et al., 2004; Couture, Lindsey, 2000).

As cininas bradicinina (BK), calidina (Kd) e Met_Lys_BK (MLBK) são

oligopeptídeos liberados no plasma ou líquido intersticial a partir da clivagem do

cininogênio de alto peso (HK com 88-120 kDa) ou baixo peso molecular (LK com 50-

68 kDa), pelas calicreínas plasmática e tecidual, respectivamente (Bhoola et al.,

1992). O sistema calicreína-cininas plasmático está associado à ativação da via

intrínseca da cascata de coagulação sangüínea (Jackson, Nemerson, 1980).

A BK também é liberada quando há oxigenação tecidual inadequada, em

decorrência de perfusão deficiente, ou em infecções, onde várias enzimas

bacterianas podem liberar BK, diretamente de seu precursor (Maeda et al., 1999).

Todos os componentes do sistema calicreína-cininas têm sido amplamente

encontrados tanto no cérebro de ratos (Li et al., 1999) como no de humanos (Bhoola

et al., 1992), onde atuam estimulando a produção de eicosanóides, óxido nítrico,

citocinas e radicais livres (Francel, 1992), aumentando a permeabilidade vascular,

causando edema cerebral (Raidoo, Bhoola, 1998) e abrindo a barreira

hematoencefálica (Mayhan, 2001).

Introdução

2

1.2. Receptores cininérgicos.

Os efeitos biológicos das cininas são mediados através da ativação de dois

tipos de receptores transmembranais acoplados à proteína G, denominados B1 e B2,

inicialmente definidos pela farmacologia clássica (Regoli, Barabé, 1980).

A maioria das ações das cininas é mediada pelo receptor B2, caracterizado

por sua elevada afinidade pela bradicinina e por sua sensibilidade a baixas

concentrações do antagonista sintético seletivo Hoe 140 (Regoli et al., 1998). O

receptor B2 está presente no endotélio, no músculo liso e no tecido nervoso, onde

leva à liberação de fatores de relaxamento e à formação de histamina e

prostaglandinas (Steranka et al., 1988).

O receptor B1 caracteriza-se por uma maior afinidade pelos metabólitos da

cininase I (dês-Arg9BK e des-Arg10Kd) e por apresentar distribuição limitada em

tecidos normais, presente principalmente em condições patológicas, como

inflamação crônica. A indução e aumento na expressão desse receptor podem

ocorrer após alguns eventos como lesão tecidual, tratamento com endotoxinas

bacterianas, certas citocinas, fatores de crescimento derivados de plaquetas e em

doenças neurológicas crônicas (Marceau et al., 1997; Prat et al., 1999 e 2000).

1.3. Ações centrais das cininas.

A BK, quando administrada em altas doses no sistema cerebroventricular ou

na circulação craniana, produz uma diversidade de efeitos comportamentais como,

uma excitação inicial seguida de sedação (Okada et al., 1977), alterações

fisiológicas como dessincronização eletroencefalográfica (Kariya, Yamauchi, 1981),

alterações cardiovasculares e ação antidiurética (Hoffman, Schimid, 1978). A

microinjeção de BK no IV ventrículo, no núcleo paratrigeminal (Pa5) ou na medula

Introdução

3

espinhal torácica de ratos, induz um efeito pressor dependente da estimulação de

receptores B2 (Fior et al., 1993; Lindsey et al., 1997; Cloutier et al., 2002). Em SHR a

resposta pressórica à Bk injetada no ventrículo lateral, IV ventrículo e região torácica

da medula espinhal é maior em relação àquela observada em ratos normotensos

(Martins et al., 1991; Cloutier et al., 2002 e 2004).

1.4. Metabolismo das cininas.

A BK sofre a ação de um eficiente sistema de degradação pelas cininases

que a mantém em concentrações relativamente baixas no sangue e nos tecidos

sendo a cininase 3 ou carboxipeptidase N (Ward, 1991; Bhoola et al., 1992; Regoli,

Barabé, 1980), responsável por 90% da degradação da BK plasmática. Porém, o

principal sistema de degradação das cininas in vivo é realizado no pulmão pela

cininase II, também conhecida como enzima conversora de angiotensina I que,

juntamente com as cininases pulmonares, dipeptidil aminopeptidase IV e

aminopeptidase P, metabolizam 98% da BK em uma única passagem pela

circulação pulmonar (Pesquero et al., 1992). No líquido céfalo-raquidiano foi

identificada, além da cininase II (Wigger, Stalcup, 1978), a metaloendopeptidase EC

3.4.24.15, isolada da fração solúvel de cérebro de rato (Orlowski, 1983) (Figura 1).

Introdução

4

Figura 1- Representação esquemática do metabolismo das cininas.

1.5. Distribuição dos receptores cininérgicos no sistema nervoso central.

Os receptores de cininas foram encontrados em diversas regiões do sistema

nervoso central. Ligações específicas de alta afinidade para receptor B2 foram

observadas em culturas primárias de células cerebrais de ratos recém nascidos

(Lewis et al.,, 1985), em cultura de astrócitos corticais de cérebro de ratos

(Cholewinski et al., 1991), em homogenato de hipocampo bovino (Kozlowski et al.,

1988) e em cérebro de cobaias, onde as maiores densidades foram observadas na

ponte, bulbo e medula espinhal, seguidos pelo córtex cerebral e hipocampo

(Fujiwara et al., 1988; Sharif, Whiting, 1991). O mRNA codificador para o receptor B2

foi identificado em tecidos humanos, incluindo a glândula pituitária, hipocampo,

cerebelo e hipotálamo (Ma et al., 1994a) e no hipotálamo e glândula pituitária de

camundongo (Ma et al., 1994b). A presença de receptores B2 foi verificada através

Introdução

5

de imuno-histoquímica em neurônios do hipotálamo, tálamo, núcleo caudado, córtex

cerebral e tronco cerebral de humanos (Raidoo et al., 1996) e na medula espinhal de

ratos e cobaias (Couture, Lindsey, 2000).

Estudos radioautográficos mostraram sítios de ligação para receptores B2 no

bulbo e medula espinhal de rato, cobaia e ovelha (Lopes et al., 1993; Murone et al.,

1997). Em bulbo de humanos hipertensos foi observado um aumento das ligações

específicas para receptores B2 no Pa5 e em núcleos relacionados ao controle

cardiovascular e respiratório central (Buck et al., 2002). Resultados semelhantes

foram encontrados também em SHR (Ongali et al., 2003, Cloutier et al., 2002 e

2004) (Figura 2).

Introdução

6

Figura 2- Distribuição radioautográfica do ligante [125I] HPP-HOE 140 na medula

espinhal torácica de ratos wistar Kyoto (WKY) e espontaneamente hipertensos

(SHR) com 8, 16 e 24 semanas de idade, sem tratamento (S), e SHR tratados com

lozartan (L), zofenopril (Z), ou lisinopril (Li). Note os altos níveis de ligações

específicas para o receptor B2 no corno dorsal de ambos os grupos e a grande

densidade de ligações nos animais SHR. Ligação não-específica na presença de

1 µM de HPP-HOE 140 (NS) (Am J Physiol Heart Circ Physiol. Jun;284(6):H1949-58,

2003).

Introdução

7

Assim como o receptor B2, o B1 já foi encontrado em vários tecidos. O mRNA

para receptor B1 foi localizado em tecidos humanos como o córtex cerebral,

cerebelo, hipocampo, glândula pituitária e hipotálamo (Chai et al., 1996). O receptor

B1 foi localizado nas lâminas 1 e 2 do corno dorsal da medula espinhal

(Wotherspoon, Winter, 2000) e em neurônios de hipotálamo, tálamo, núcleo caudado

e medula espinhal de humanos (Raidoo, Bhoola, 1997), ratos (Campos et al., 2005;

Viel et al., 2007) e no núcleo olivar inferior de humanos pelo método da

radioautografia (Buck et al., 2002).

1.6. Mecanismo central de ajuste da Pressão Arterial.

Os pressorreceptores arteriais constituem o mais importante mecanismo de

controle reflexo da pressão arterial (PA), momento a momento. São

mecanorreceptores constituídos por terminações nervosas livres que se situam na

adventícia de grandes vasos (aorta e carótida) e que são estimulados por

deformações das paredes desses vasos, normalmente provocados pela onda de

pressão pelas características mecano-elásticas da parede. Na pressão basal, os

pressoreceptores descarregam de forma intermitente e sincrônica com a pressão

sistólica, na dependência das variações instantâneas da deformação e da tensão

vascular induzidas pela PA (Krauhs, 1979, Irigoyen, 2001).

Essa descarga ascende pelos nervos vago e glossofaríngeo terminando em

neurônios nos subnúcleos lateral e medial do núcleo do trato solitário (NTS), no

bulbo dorso-medial (de Sousa Buck et al., 2001) que é o local principal de

terminações de fibras aferentes partindo para vários locais, incluindo os

barorreceptores e quimiorreceptores arteriais localizados nos vasos sangüíneos e no

coração (Saha S, 2005). Os neurônios de segunda ordem no NTS enviam projeções

Introdução

8

para outras estruturas do sistema nervoso central (SNC), as quais estão envolvidas

com a geração e modulação da atividade autonômica.

Após o estímulo de barorreflexo, duas vias são ativadas: a estimulação da via

parassimpato-excitatória promove a resposta de bradicardia em conseqüência da

excitação de neurônios que se projetam do NTS para o núcleo ambíguo (NA) ou

para o núcleo motor dorsal do vago (NMDV) (Kannan, 1985, Dampney, 1994

Accorsi-Mendonça et al., 2005). A estimulação simpato-inibitória a partir da ativação

de neurônios do NTS que enviam projeções para o bulbo ventrolateral caudal

(CVLM) promovendo inibição dos neurônios geradores da atividade simpática

localizados no bulbo ventrolateral rostral (RVLM), promovendo assim diminuição da

freqüência de despolarização desses neurônios com conseqüente redução da

freqüência cardíaca, da força contração e vasodilatação periférica (Dampney, 1994).

Essa região medular (RVLM) contém uma rede de projeções neuronais simpato-

excitatórias com uma função crucial na regulação da atividade vasomotora simpática

sobre a pressão arterial (Becker et al., 2005) (Figura 3).

Os barorreceptores cardiopulmonares também são mecanorreceptores e, de

modo geral, participam do controle da pressão arterial qualitativamente de forma

semelhante aos barorreceptores arteriais, no entanto, por serem menos

homogêneos e se situarem dentro de um sistema de baixa pressão, a sua

estimulação se faz muito mais por expansão de volume sangüíneo do que por

alteração de pressão (Grassi, 1994, Campagnole-Santos, Haibara, 2001).

Os quimiorreceptores periféricos são constituídos por células altamente

especializadas, capazes de detectar alterações da pressão parcial de oxigênio (pO2),

pressão parcial de dióxido de carbono (pCO2) e alterações de pH do sangue. São

localizados bilateralmente na bifurcação da carótida comum ou em pequenos

Introdução

9

corpúsculos entre o arco aórtico e a artéria pulmonar, irrigados com sangue arterial,

(Gonzales, 1994, Campagnole-Santos, Haibara., 2001). Alguns tecidos similares aos

da artéria carótida e corpos aórticos, também têm sido descritos no tórax e abdome,

os quais são chamados de paraganglionar e podem servir como quimiorreceptores

adicionais (Prabhakar, Peng, 2004). Os corpos carotídeos e aórticos são compostos

por fibras sensorias e os impulsos são levados através dos nervos vago e

glossofaríngeo para centro medular, incluindo o NTS. A área quimiorreceptora

central está localizada na RVLM, que responde a mudanças no pH no fluido

intersticial do cérebro e é responsável pelos ajustes circulatórios e ventilatórios

durante a hipercapnia e desequilíbrio ácido-base crônico. Os quimiorreceptores são

responsáveis pela ventilação imediata e aumento da pressão arterial durante a

hipóxia (Timmers et al., 2003).

Introdução

10

Figura 3- Mecanismo de controle central da Pressão arterial. Adaptado de

Am. J. Physiol. 261:R985-R994, 1991.

1.7. Exercício Físico e Hipertensão.

A falta de atividade física associada com vida sedentária são contribuintes

para o aumento de doenças como a obesidade, diabetes tipo 2, osteoporose,

câncer, depressão e doenças cardiovasculares (Dishman, 2006).

Estudos epidemiológicos sugerem que a relação entre o sedentarismo e a

hipertensão é muito forte, a Fundação Nacional do Coração, a Organização Mundial

de Saúde, a Sociedade Internacional de Hipertensão, o Comitê Nacional dos

Estados Unidos sobre Detecção, Avaliação e Tratamento da Pressão Arterial e o

Introdução

11

Colégio Americano de Medicina Esportiva, recomendam a mudanças no estilo de

vida e o aumento da atividade física para prevenção e tratamento de pacientes com

hipertensão (pressão sistólica a partir de 130mmHg e pressão diastólica entre 85-

89mmHg) (Baster T, Baster-Brooks, 2005). Recomenda-se o exercício como uma

estratégia de tratamento para pacientes com níveis de pressão sistólica a partir de

130mmHg e pressão diastólica entre 80-109mmHg (III Consenso brasileiro de

hipertensão).

Estudos realizados nas últimas décadas (Becker, et al., 2005; Zanesco A,

Antunes E. 2007; Collier, et al., 2008) mostram que existem poucas dúvidas quanto

ao efeito benéfico do treinamento físico na hipertensão arterial. Entretanto, essas

experiências mostram que o efeito do treinamento na pressão arterial depende do

tipo de exercício físico, da intensidade e da duração do mesmo. Em geral, o

treinamento físico dinâmico de baixa a moderada intensidade provoca diminuição na

pressão arterial. Isso tem sido freqüentemente descrito na literatura, tanto em

animais de experimentação quanto em homens (Maeceau, 1993; Negrão, 2001).

A resposta cardiovascular durante o treinamento físico é caracterizada por

aumento na pressão arterial sangüínea sem bradicardia, evidenciando que o

barorreflexo estaria “desligado” ou com sua atividade diminuída durante a prática

deste (Krieger et al., 1998).

Estudos prévios demonstram que o treinamento físico pode modificar a

sensibilidade barorreflexa em humanos e animais (Brum et al., 2000, Laterza et al.,

2007). Negrão et al., (1992, 1993), relatou que o treinamento físico diminuiu a

bradicardia reflexa e controle da atividade renal simpática em ratos, de qualquer

forma, estes estudos foram realizados em animais normotensos, em adição, a

atenuação na bradicardia reflexa foi associada com significante alteração intrínseca

Introdução

12

da freqüência cardíaca, a qual pode mascarar o verdadeiro efeito do treinamento

sobre o barorreflexo (Silva et al., 1997).

Durante o treinamento físico, em decorrência a estimulação dos músculos,

ocorre um aumento da pressão arterial, assim as fibras aferentes somáticas

projetam-se até o núcleo do trato solitário (NTS), os neurônios dessa região são

estimulados e excitam os neurônios parassimpáticos do núcleo ambíguo e do núcleo

motor do vago, resultando em um aumento do tônus vagal para o coração. Esta

estimulação durante o treinamento físico pode promover alterações diretamente no

desempenho dos neurônios do NTS, resultando em um aumento da atividade

barorreflexa no período de pós-treino. Alternativamente os estímulos aferentes

podem, indiretamente, modular a atividade do barorreflexo por mudanças na

atividade de outras áreas do SNC, com projeções do NTS para o núcleo

paraventricular e outros núcleos hipotalâmicos, como também para a amígdala e

córtex, os quais enviam novas projeções para o NTS, essas podem ser

consideradas importantes adaptações centrais ao treinamento físico. (Minami et al.,

2006).

Uma característica do treinamento físico é o aumento da expressão gênica da

enzima óxido nítrico sintase que aumenta a biodisponibilidade do óxido nítrico que é

um vasodilatador derivado do endotélio (Horta et al., 2005). O aumento pode ser

devido à ação da bradicinina sobre seus receptores, induzindo a formação deste,

além do aumento na conversão de ácido aracdônico para prostaglandinas

vasodilatadoras, como as PGI2 e PGE2 que favorecem a atividade da bradicinina

(Scott et al., 2004).

Assim como a resposta cardiovascular ao exercício físico, quando a Bk é

injetada no NTS, Pa5 ou medula espinhal torácica, ocorre um aumento prolongado

Introdução

13

da pressão arterial com ausência de bradicardia reflexa, indicando a inibição do

barorreflexo (Fior et al., 1993; Couture, Lindsey, 2000; Cloutier et al., 2002). Estudos

recentes demonstraram a presença de neurônios barosensíveis no Pa5 e aumento

da atividade nos neurônios do núcleo reticular rostral ventral lateral (área pressora)

(Yu et al., 2003; Balan et al., 2004; Caous et al., 2004). Estes resultados sugerem

uma participação dos receptores B2 bulbares na modulação da PA preparando o

organismo, do ponto de vista cardiovascular, para uma situação comportamental

como fuga, defesa ou exercício físico.

Portanto, o propósito deste estudo foi verificar se o treinamento físico

influencia a expressão dos receptores B2 para cininas, no bulbo e medula espinhal

torácica de ratos Wistar normotensos e SHR.

Introdução

14

2. Objetivos.

Localizar anatomicamente e quantificar a densidade de ligações específicas

dos receptores B2 para cininas em:

2.1. Bulbo e medula espinhal de ratos normotensos wistar, após treinamento físico.

2.2. Bulbo e medula espinhal de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) após

treinamento físico.

2.3. Comparar os achados entre as duas linhagens e entre os grupos treinados e

sedentários.

Material e Métodos

3. Material e Métodos

3.1. Animais

Foram utilizados ratos Wistar normotenso (n=12) e SHR (n=12) adultos,

machos, sete semanas de idade (250 – 300g), fornecidos pelo biotério do Instituto

Nacional de Farmacologia da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista

de Medicina. Os animais foram mantidos sob condições controladas de temperatura

e iluminação (ciclo 12h claro/escuro) com livre acesso à água e ração. Todos os

experimentos foram realizados de acordo com as normas éticas de experimentação

animal da Comissão de Ética em Experimentação Animal da FCMSCSP (Protocolo

nº 91).

3.2. Teste de Esforço

O período de adaptação, teste de esforço e o treinamento físico foram

realizados no período da tarde, após as 14 horas. Após quinze dias de adaptação

dos animais ao nosso biotério, os mesmos foram submetidos a um processo de

adaptação em esteira ergométrica (Imbrasport®) por uma semana durante 10

minutos com velocidade de 0,3 km/h (5m/min).

Após a adaptação foi realizado um teste de esforço que consistiu em um

treino com aumento gradual da velocidade de 0,3 a 0,3 km/h (5m/min), tendo o

animal permanecido em cada uma das velocidades por 3 minutos. Até o limite do

animal. Ao final do teste de esforço, os animais foram distribuídos nos grupos Wistar

normotenso sedentário (WS, n=6) e treinado (WT, n=6) e SHR sedentário (SHRS,

n=6) e treinado (SHRT, n=6). Com os resultados do teste de esforço a rotina de

treinamento de cada grupo treinado foi estabelecida e ao final da quinta e da décima

semana de treinamento físico, foi realizado um novo teste de esforço com todos os

15

Material e Métodos

grupos. A partir dos resultados obtidos nos testes de esforço, foi possível avaliar a

eficácia do treinamento físico aplicado (Tancrede et al., 1982).

3.3. Treinamento físico

O treinamento dos animais também foi realizado em esteira ergométrica

adaptada para a atividade física em ratos. Este foi aplicado cinco vezes por semana

durante dez semanas em intensidade baixa (nas primeiras cinco semanas) e

intensidade moderada nas últimas cinco semanas (Tabela 1) (Raad et al, 1990; De

Angelis et al., 1997).

Tabela 1- Velocidade e tempo máximo alcançados no protocolo de treinamento

físico dos grupos treinados.

Semanas Velocidade (km/h) Tempo (minutos)

SHR Wistar SHR Wistar

7 Adaptação à esteira

8 0,7 0,7 30 25

9 1 0,7 50 50

10 1 0,7 55 60

11 1 0,9 60 60

12 1,2 0,9 60 60

13 1,2 0,9 60 60

14 1,2 1 60 60

15 1,5 1 60 60

16 1 1 60 60

17 1,5 1 60 60

16

Material e Métodos

3.4. Medidas da Pressão Arterial e avaliação do Peso.

A verificação da pressão arterial sistólica (PAS) foi realizada no entre 8 e 11h.

Uma semana antes do início do treinamento, a pressão arterial foi aferida por via

indireta (artéria caudal) (Pfeffer et al., 1971), através da utilização de um

esfignomanômetro (W A Baum Co.®), obtendo-se assim os valores da pressão

arterial “inicial”.

Antes das aferições da pressão arterial, os animais eram colocados em uma

caixa de madeira aquecida por uma lâmpada vermelha de 40 W, durante 12

minutos, para que todos os animais se mantivessem nas mesmas condições. Após

este período, cada animal era colocado em uma caixa de contenção, com uma

pequena abertura para a passagem da cauda, onde era acoplado o

esfignomanômetro para a verificação da PAS. A PAS foi aferida em triplicatas

semanalmente durante todo o período de treinamento físico. A partir das três leituras

obtidas fez-se uma média aritmética para obtermos o valor da PAS do animal em

cada semana.

O acompanhamento do peso dos grupos estudados foi realizado

semanalmente após as aferições da PAS.

3.5. Preparação das amostras

Ao término do treinamento físico, os animais foram mortos por inalação de

CO2 e decaptados e o tronco cerebral e medula espinal (região cervical-torácica)

foram removidos e congelados imediatamente em dimetilbutano (Sigma) à –50º C e

guardados à –80º C, até a data do uso (Quirion et al., 1987).

Foram obtidos cortes transversais 20 μm com uso de um criostato (–18 a –22

ºC, Micron HM 505N, Francheville, França) que foram montados em lâminas

17

Material e Métodos

gelatinadas e secos à temperatura ambiente por 5 minutos em um dessecador a

vácuo sendo mantidos a –80º C até a data da radioautografia.

3.6. Iodação dos Peptídeos

A iodação do HPP-HOE-140 foi realizada de acordo com o método descrito

por Gozzo et al (2002) e com algumas modificações. O ligante HPP-Hoe140 (3-

4hydroxyphenyl-propionyl-D_Arg[Hyp3, Thi5, D-TiC7, Oic8]_BK), antagonista B2 (Hock

et al, 1991) foi sintetizado no laboratório do Dr. Domenico Regoli do Departamento

de Farmacologia da Universidade de Sherbrooke, Sherbrooke, Canadá. O análogo

peptídico da bradicinina foi iodado pelo método da cloramina T (Hunter, Greenwood,

1962) pela Dra. Mariana da Silva Araújo do Departamento de Bioquímica, da

Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina. O peptídeo (5 μg)

foi incubado em tampão fosfato 0,05 M por 30 s na presença de 0.5 mCi (18.5 MBq)

de 125INa (Amersham Biosciences GE, Healthcare, Uppsala, Suécia) e 220 nmol de

cloramina T em um volume total de 85 μl. O peptídeo monoiodado foi então

imediatamente purificado por cromatografia líquida de alta eficiência com 0,1% de

ácido trifluoroacético e acetonitrila, com fases móveis.

3.7. Radioautografia “in vitro” de receptores de cininas

A incubação foi conduzida por 90 min à temperatura ambiente, usando-se 150

pM de [125I] HPP-Hoe 140 (antagonista B2) em tampão PIPES 25 mM (Sigma

Aldrich) contendo o-phenantrolina 1 mM, ditiotreitol 0,014%, bacitracina 1 mM,

captopril 0,1 mM (Sigma Aldrich), BSA (livre de proteases) 0,2% (Intergen,

Livingston, Escócia) e MgCl2 7,5 mM, pH 7,4. A ligação não específica foi

determinada na presença de 2μM do peptídeo não marcado. No fim do período de

18

Material e Métodos

incubação, as lâminas foram lavadas seqüencialmente por 4 vezes de 4 min., cada,

em tampão PIPES 25 mM pH 7,4, gelado e rapidamente mergulhadas em água

destilada para remover o excesso de sais. As lâminas foram secas em corrente de ar

por uma hora e justapostas contra uma folha de filme radioautográfico (Hyperfilm)

por 72 a 96 h, à temperatura ambiente, juntamente com uma micro-escala radioativa

([125I]) (Amersham Biosciences GE, Healthcare, Uppsala, Suécia). Após a

sensibilização dos filmes com a radiação contida nas lâminas, esses foram

revelados em solução D-19 (revelador Kodak) e fixados em solução Ektaflo Kodak.

3.8. Quantificação dos receptores

Os radioautogramas foram quantificados por densitometria óptica, usando-se um

sistema MCID de análise de imagens (Interfocus Europe, UK). Para cada núcleo,

foram realizadas de 5 a 15 leituras por animal. As ligações específicas em cada

região foram determinadas subtraindo-se os valores da ligação total daquelas

ligações na presença dos antagonistas não marcados (Figura 4).

19

Ligação não-específica Ligação Total Ligação Específica

-=

Figura 4- Representação esquemática da obtenção dos valores das ligações

específicas.

Material e Métodos

20

3.9. Análise estatística dos dados

Os resultados foram expressos como média±EPM. A análise de duas vias

(Two-way Anova) seguido do pós-teste de Bonferroni e a analise de uma via (One-

way Anova) seguido do pós-teste de Dunnet foram usadas para comparar os valores

dos níveis de pressão arterial sistólica entre os animais Wistar e SHR sedentários e

treinados. A comparação dos valores obtidos nos testes de esforço foi utilizada

Anova seguido do pós-teste de Tukey-Kramer. Para as diferenças entre as

densidades de receptores B2 foi utilizado teste t de Student. Somente valores para

(P) menor que 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

Resultados

4. Resultados

4.1. Teste de resistência física.

A capacidade aeróbia foi avaliada pela resposta no teste de esforço. Ao inicio

do experimento, a capacidade aeróbia foi similar entre os grupos (WS: 21.7±1.7;

WT:20.0±3.3; SHRS: 25.0 ± 3.3; SHRT: 26.6 ± 1.6 m/min). Entretanto, os animais

submetidos ao treinamento físico apresentaram um aumento na velocidade máxima

de corrida quando comparado com o primeiro teste após cinco semanas (WS: 20.0 ±

3.3 vs. WT: 33.3 ± 1.7; SHRS: 23.3 ± 3.3 vs. SHRT: 43.3 ± 1.7 m/min) e dez

semanas (WS: 20.0 ± 1.7 vs. WT: 38.3 ± 1.7; SHRS: 28.3 ± 3.3 vs. SHRT: 46.7 ±

1.7 m/min) de treinamento físico e também quando comparado com os grupos

sedentários. O aumento na velocidade de corrida nos grupos treinados está

associado com o aumento do consumo máximo de oxigênio (Brooks e White, 1997;

Rodrigues et al., 2006) demonstrando a eficácia do treinamento físico aplicado neste

estudo (Figura 5).

Wistar

0

1

2

3SedentáriosTreinados

Teste 1 Teste 3Teste 2

**

Velo

cida

de (K

m/h

)

A)

21

Resultados

SHR

0

1

2

3 SedentáriosTreinados

Teste 3Teste 2Teste 1

Velo

cida

de (K

m/h

) **

B)

Figura 5- Resultados dos testes de esforço realizados após cinco dias de adaptação

à esteira (Teste 1), após cinco semanas de treinamento físico (Teste 2) e ao final do

protocolo (Teste3) de treinamento físico. Comparação do Teste 1 em relação ao

Teste 2 e Teste 3 (P<0,001). Anova seguido do pós-teste Tukey-Kramer (Paineis A e

B).

4.2. Peso dos animais

No inicio do protocolo de treinamento físico todos os grupos apresentaram

peso entre 250g e 300g. Na 9ª semana idade os animais WT apresentaram redução

do peso corpóreo em relação ao seu grupo sedentário (P<0,05), mas esta diferença

não persistiu até o final do protocolo de treinamento físico. Os animais SHRT e

SHRS não apresentaram diferenças no peso corpóreo (Figura 6).

Quando comparamos os animais SHRS e WS, observamos que na 11ª

semana de idade os animais SHRS apresentaram peso menor em relação aos

animais WS, persistindo até o final do experimento (P<0,05, P<0,001). Nos animais

22

Resultados

treinados a diferença de peso foi observada a partir da 13ª semana de idade

(P<0,01) (Figura 6).

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

100

200

300

400

500

600

WSWTSHRSSHRT

*

#

## ######## ##+ +++ ++

Idade (Semanas)

Peso

(g)

Figura 6- Peso corpóreo dos grupos estudados (WS – ratos Wistar sedentários. WT -

ratos Wistar treinado, SHRS – ratos espontaneamente hipertensos sedentários.

SHRT - ratos espontaneamente hipertensos treinados n=6). Comparação entre WT e

WS: * P<0,05; comparação entre SHRS e WS: #P<0,05 e ##P<0,001; comparação

entre SHRT e WT: +P<0,01. Two way anova seguido do pós-teste de Bonferroni.

4.3. Efeito do treinamento físico sobre a PAS de ratos Wistar normotensos.

Em ratos Wistar normotensos a PAS foi avaliada semanalmente durante todo

o treinamento físico. O treinamento durou 10 semanas, com início na 8ª semana de

idade até a 17ª semana de idade dos animais. No decorrer do período experimental

não foram observadas alterações significantes da PAS dos animais sedentários

(Figura 6). A PAS do grupo WS foi de 111,9±1,94 mmHg na 7ª semana e de

117,3±1,24 na 17ª semana de idade (Tabela 2, Figura 7).

23

Resultados

O grupo WT apresentou redução significante da PAS na 14ª, 15ª, 16ª e 17ª

semana de vida em relação à primeira medição (P<0,05 e P<0,001). Na 17ª semana

a PAS registrada foi de 90,0±2,43, apresentando uma redução de 18,6 mmHg em

relação ao valor registrado na 7ª semana (P< 0,001). Quando comparamos os

achados entre WS e WT, observamos uma redução significante da PAS partir da 15ª

semana no grupo treinado (P<0,05 e P< 0,001) (Tabela 2, Figura 7).

4.4. Efeito do treinamento físico sobre a PAS de ratos espontaneamente

hipertensos.

Neste experimento, realizado nas mesmas condições descritas no item 4.2,

os grupos SHRS e SHRT apresentaram PAS inicial de 145,3±2,45 mmHg e

149,4±2,45 mmHg, respectivamente (Tabela 2). A partir da 10ª semana de idade os

SHRS apresentaram aumento significante da pressão arterial chegando ao valor de

178,0±3,60 mmHg na 17ª semana de idade ao contrário dos SHRT que

apresentaram PAS de 122,66±0,66 mmHg no mesmo período.

No grupo SHRT foi observado um aumento significante da PAS entre a 8ª e a

10ª semana de idade. A partir da 11ª semana, a PAS dos animais SHR treinados

diminuiu para 144,65±1,8 mmHg, deixando de apresentar diferença significante da

PAS registrada na 7ª semana de idade, antes da instalação do estado hipertensivo.

Comparando os grupos SHRS e SHRT, observamos que a partir da 11ª semana de

idade, os valores da PAS apresentaram diferença significante (Figura 8, Tabela 2).

24

Resultados

Tabela 2- Média da PAS (em mmHg) dos animais com 7ª e 17ª semanas de idade.

GRUPOS TRATAMENTO 7ª semanas 17ª semanas

WISTAR SEDENTÁRIO 111,9±1,94 117,3±1,24

TREINADO 108,6±2,73 90,0±2,43

SHR SEDENTÁRIO 145,3±2,45 178,0±3,60

TREINADO 149,4±2,45 122,66±0,66

Wistar

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

80

90

100

110

120

130

WSWT

***

**+++ ++++

Idade (Semanas)

Pres

são

arte

rial

sist

ólic

a (m

mHg

)

Figura 7- Pressão Arterial Sistólica (PAS) dos animais Wistar, durante dez semanas

de treinamento. WS – ratos Wistar sedentários. WT - ratos Wistar treinados (n=6)

(Comparação entre os animais WT e WS: Two-way anova seguido de pós-teste de

Bonferroni: * P< 0,05 e ** P< 0,001. Comparação entre a 7ª semana de treinamento

com as semanas subseqüentes dos animais WT: One-way anova seguido de pós-

teste de Dunnet, + P<0,05 e ++ P<0,001).

25

Resultados

SHR

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

80

100

120

140

160

180

200SHRSSHRT

*******

+ ++

++

## ## # ####

## #### ##

Idade (Semanas)

Pres

são

arte

rial

sist

ólic

a (m

mHg

)

Figura 8- Pressão Arterial Sistólica (PAS) dos animais espontaneamente hipertensos

(SHR), durante dez semanas de treinamento. SHRS – ratos espontaneamente

hipertensos sedentários. SHRT - ratos espontaneamente hipertensos treinados.

(n=6) (Comparação entre os animais SHRT e SHR, Two-way anova seguido de pós-

teste de Bonferroni, * P< 0,001. Comparação entre a 7ª semana de treinamento e as

semanas subseqüentes dos animais SHRT: One way anova seguido de pós-teste de

Dunnet, + P<0,001. Comparação entre a 7ª semana de treinamento e as semanas

subseqüentes do animais SHRS: One way anova seguido de pós-teste de Dunnet, #

P<005 e ##P<0,001).

4.5. COMPARAÇÃO DA PAS ENTRE SHR E WISTAR

Comparando os valores da PAS entre os grupos SHRS e WS, observamos

diferença significante desde o início do treinamento físico (P<0,001). Na última

semana a PAS do grupo Wistar sedentário foi 60,7 mmHg menor que o grupo SHR

sedentário (Figura 9).

26

Resultados

Nos animais treinados (SHR e Wistar) a PAS foi estatisticamente diferente

desde a 7ª semana de idade, sendo que na 17ª semana a PAS dos animais Wistar

foi 32,7 mmHg menor quando comparado com os animais SHR (P<0,001) (Figura 9).

Treinados x Sedentários

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

60

80

100

120

140

160

180

WSWT

SHRSSHRT

* **********+ + + + + + + + + + +

Idade (Semanas)

Pres

são

arte

rial

sist

ólic

a (m

mHg

)

Figura 9- Pressão Arterial Sistólica (PAS) dos grupos estudados. (SHR T – ratos

espontaneamente hipertensos treinados; SHR S – ratos esponteamente hipertensos

sedentários; WS – ratos Wistar sedentários; WT – ratos Wistar treinados).

Comparação entre os animais SHRS e WS: *P<0,001. Comparação entre os animais

SHRT e WT: +P<0,001 Two-way anova seguido do pós-teste de Bonferroni.

27

Resultados

4.6. Análise Radioautográfica in vitro dos receptores B2 no bulbo e na medula

espinhal torácica.

4.6.1. Ratos sedentários.

A radioautografia in vitro para o receptor B2, em ratos Wistar, e SHR

sedentários apresentou ligações específicas para o antagonista B2 ([125I] HPP-Hoe

140) no núcleo paratrigeminal (Pa5), trato espinhal do trigêmio (sp5), no núcleo do

trato solitário (NTS), área postrema (AP) e nas lâminas 1 e 2 (L1 e L2) da medula

torácica. Essas ligações variaram de 1,51 a 7,64 fmol/mg de proteína para o grupo

Wistar e de 1,34 a 7,89 fmol/mg de proteína para os animais SHR. (dados completos

na Tabela 3).

Tabela 3 – Densidade de ligações específicas para receptores B2 nos grupos Wistar,

e SHR treinados e sedentários.

GRUPOS WISTAR SHR

ÁREAS TREINADOS SEDENTÁRIOS TREINADOS SEDENTÁRIOS

NTS 2,94±0,13 1,75±0,27 3,61±0,30 3,26±0,27

PA5 7,64±0,22 6,53±0,26 7,89±0,23 7,40±0,15

AP 3,61±0,24 1,99±0,66 4,27±0,21 4,20±0,21

SP5 4,81±0,19 3,63±0,11 4,49±0,17 3,88±0,14

L1 2,15±0,11 2,41±0,37 2,36±0,16 4,59±0,21

L2 1,51±0,07 1,59±0,06 1,49±0,10 1,34±0,10

4.6.2. Ratos Wistar treinados.

Nos ratos Wistar treinados foram observadas ligações específicas para o

receptor B2 nos mesmos núcleos que apresentaram ligações específicas em ratos

sedentários. No entanto os animais treinados apresentaram aumento significante de

28

Resultados

ligações específicas para o receptor B2 na AP (81, %), no NTS (68%), sp5 (32,61%)

e no Pa5 (17 %) em relação ao seu grupo controle. (Tabela 3, Figura 10, 11 e 12).

Wistar

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

NTS APPa5 L2L1sp5

***

*

****

TreinadosSedentários

Liga

ção

espe

cífic

a [12

5 I]-H

OE

140

Figura 10- Ligação específica do antagonista B2 iodado [125I] HPP-Hoe 140 (150

pM, 90 min, temperatura ambiente) no bulbo e medula espinhal de ratos

normotensos treinados e sedentários. As colunas e barras verticais são as médias ±

erro-padrão. A comparação estatística para os grupos treinado e sedentário está

indicada por * P< 0,01, ** P < 0,001 e ***P<0,0001 (n=6). Teste t de student.

29

Resultados

Figura 11- Fotomicrografia pseudocolorida de radioautograma representando a

distribuição anatômica de receptores B2 na região torácica da medula de ratos Wistar

(a) sedentários (b) treinados; e SHR (d) sedentários (f) treinados. Ligações não-

específicas estão representadas em (c: Wistar e f: SHR). Abreviações: lâmina 1, 2 e

3 respectivamente.

30

Resultados

Figura 12- Fotomicrografia pseudocolorida de radioautograma representando a

distribuição anatômica de receptores B2 na região torácica da medula de ratos Wistar

(a, b, c) treinados (d, e, f) sedentários; SHR (g, h, i) sedentários e (j, k, l) treinados.

Ligações não-específicas estão representadas em (c, f, i, l). Abreviações: área

postrema (AP), núcleo do trato solitário (NTS), núcleo paratrigemial (Pa5) e trato

espinhal do trigêmio (sp5).

31

Resultados

4.6.3. SHR treinados.

Nos animais SHR treinados, quando comparados com seu controle sedentário,

houve uma diminuição significante nas ligações específicas para receptores B2 nas

lâminas 1 (48,49%) e 2 (33,52%) da região torácica da medula espinhal. No sp5

observamos o aumento de 15,69% de ligações específicas em relação ao controle

(Tabela 3, Figura 11, 12 e 13).

32

SHR10.0

SedentáriosTreinados

7.5

5.0

2.5

0.0NTS L2L1sp5APPa5

***

*Liga

ção

espe

cífic

a[12

5 I]-H

oe 1

40

Figura 13- Ligação específica do antagonista B2 [125I] HPP-Hoe 140 (150 pM, 90 min,

temperatura ambiente) no bulbo e medula espinhal de SHR treinados e sedentários.

As colunas e barras verticais são as médias ± erro-padrão. A comparação estatística

para os grupos treinados e sedentários está indicada por *P< 0,01 e

**P<0,0001(n=6). Teste t de student.

Resultados

4.6.4. Comparação da densidade de ligações específicas para o receptor B2

entre os grupos SHRS e WS.

A quantificação de receptores B2 no grupo SHR variou de 0,3071 a 7,897

fmol/mg e do grupo Wistar de 1,194 a 7,641 fmol/mg de proteína. Ao compararmos

as duas cepas, observamos um aumento nas ligações específicas do NTS (86,18%),

Pa5 (13,35%), lâmina 1 da medula torácica (90,70%) e na AP (110,40%) dos

animais SHR em relação ao grupo Wistar (Figura 14, Tabela 3).

Sedentários

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

NTS Pa5 sp5 AP L1 L2

*

**

*

** **

SHRSWS

Liga

ção

espe

cífic

a [12

5 I]-H

OE

140

Figura 14 - Ligação específica para o antagonista B2 iodado [125I] HPP-Hoe 140 (150

pM, 90 min, temperatura ambiente) no bulbo e medula espinhal dos grupos

estudados (SHRS- ratos esponteamente hipertensos sedentários; WS- ratos Wistar

treinados). As colunas e barras verticais são as médias ± erro-padrão. *P<0,01 e

**P<0,0001(n=6). Teste t de student.

33

Resultados

34

4.6.5. Comparação da densidade de ligações específicas para o receptor B2

entre os grupos SHRT e WT.

Ao compararmos os valores dos animais SHR e Wistar treinados, observamos

que nos animais SHR treinados houve aumento significante no NTS (22,76%)(Figura

15).

Treinados

7.5

10.0

SHRTWT

5.0

2.5

0.0NTS Pa5 sp5 AP L1 L2

*

Liga

ção

espe

cíf

HO

E 14

0ica

[125 I]-

Figura 15- Ligação específica do radioligante [125I] HPP-Hoe 140 (150 pM, 90 min,

temperatura ambiente) a receptores para bradicinina do subtipo B2. Comparação

entre os grupos treinados (SHRT- ratos espontaneamente hipertensos treinados e

WT- ratos Wistar treinados). As colunas e barras verticais são as médias ± erro-

padrão. A comparação estatística para os grupos treinados e sedentários está

indicada por *P<0,05 (n=6). Teste t de student.

Discussão

35

5. Discussão

Esse estudo teve a finalidade de avaliar o possível envolvimento dos

receptores centrais para bradicinina na redução da pressão arterial sistólica de ratos

SHR após treinamento físico em esteira. A proposta baseou-se na ampla distribuição

do receptor B2 no sistema nervoso central de diversos mamíferos, incluindo o ser

humano, e sua função na resposta cardiovascular hipertensora após injeção de BK

no NTS, Pa5 ou na medula espinhal torácica de ratos normotensos e

espontaneamente hipertensos. Também foi considerada, para a proposta desse

estudo, a ausência de bradicardia reflexa durante o aumento da PA após a injeção

de BK no NTS, Pa5 ou medula espinhal torácica, uma resposta semelhante à

observada durante o exercício físico (Fior et al., 1993, Lindsey et al., 1997, Cloutier

et al., 2002, Krieger et al., 1998).

Observamos que o treinamento físico moderado foi efetivo em evitar o

aumento da PAS a partir da décima primeira semana de idade, a partir da qual os

SHR sedentários apresentaram elevação significante da PAS, diferindo daquela

observada nos animais em treinamento (Figura 8). Comparativamente, nos ratos

Wistar normotensos treinados foi observada redução da PAS a partir da décima

quinta semana de idade em comparação aos animais sedentários (Figura 7). Essa

resposta cardiovascular, que ocorre tanto em humanos como em animais, está

caracterizada na literatura e é decorrente de uma hipotensão e hipersensibilidade do

barorreflexo pós-treinamento físico, associadas com a redução do tônus cardíaco-

vagal (Minami et al., 2006).

Discussão

36

Em treinamento físico realizado com animais SHR foi constatado o aumento

da atividade barorreflexa associada ao aumento da sensibilidade do barorreceptor

aórtico. Este efeito benéfico do treinamento físico pode ser mediado por aumento da

complacência arterial que age com aumento da transdução de estímulos (Ulrika et

al., 2004). Segundo Laterza et al., (2007) recentes observações em modelos animais

sugerem a redução da atividade simpática após treinamento físico, observado

também, em humanos hipertensos. Esta redução estaria associada à diminuição da

concentração central de angiotensina II ou com aumento da produção central de

óxido nítrico, por aumento da expressão da enzima óxido nítrico sintase.

Estudos confirmaram que o stress oxidativo e o tratamento com antioxidante

aumentam a sensibilidade barorreflexa em jovens saudáveis, em pacientes com

falência cardíaca e em ratos. A terapia antioxidante promove aumento da

biodisponibilidade de óxido nítrico no nodo sinus, que pode influenciar na função

barorreflexa do arco aórtico, elevando a distensão da parede aórtica, que assim,

previne a inibição do barorreceptor causado pelos radicais livres e aumentando a

resposta cardíaca. Neste sentido, o aumento das enzimas superóxido dismutase e

da catalase induzida pelo treinamento físico, poderia proporcionar aumento similar

no arco aórtico (Irigoyen et al., 2005).

De qualquer forma, não podemos excluir a possibilidade de que a redução da

atividade simpática pode ocorrer com a diminuição de sinapses excitatórias. Foi

observado que o treinamento físico crônico atenuou a arborização dendrítica em

centros cardiorespiratórios e locomotores do cérebro (Nelson et al., 2005).

A análise radioautográfica das ligações específicas para os receptores B2

mostrou marcações nos núcleos bulbares NTS, Pa5, AP, sp5 e nas camadas

Discussão

37

celulares da substância cinzenta da medula espinhal de todos os grupos, sendo que,

entre os animais sedentários, os SHR apresentaram maior densidade de ligações

específicas para o receptor B2 no NTS, Pa5, AP e Lâmina 1 (Figura 11 e12). Esses

dados são compatíveis com a descrição da literatura (Ongali et al., 2003, Cloutier et

al., 2002 e 2004). Quando comparamos os grupos treinados de cada linhagem,

observamos a diminuição dos sítios de ligação para o receptor B2 em todas as

camadas celulares da medula espinhal torácica dos SHR após 10 semanas de

treinamento (Figura 15).

Considerando que a porção torácica da medula espinhal é o sítio de ação da

resposta pressórica à BK injetada intratecalmente, sendo reportado um aumento de

sensibilidade desta resposta cardiovascular em SHR e em ratos com diabetes

induzida por estreptozotocina (Lopes et al., 1993, Cloutier et al., 2000) nossos

resultados sugerem que a diminuição dos sítios de ligação para a BK esteja

relacionada com a diminuição da PAS em SHR após o treinamento físico crônico

(Figura 8). Inversamente, trabalhos mostram que o tratamento crônico com anti-

hipertensivos inibidores da ECA ou o antagonista do receptor AT1 para angiotensina

promoveu aumento dos sítios de ligação para receptor B2 nas lâminas 1 e 2 de SHR

de 24 semanas de idade. Em animais de 16 semanas de idade o aumento foi

observado somente nos naqueles tratados com inibidores da ECA (Ongali et al.,

2003). Neste estudo, o tratamento com anti-hipertensivos teve início quando os

animais tinham oito semanas de idade, a mesma idade na qual o treinamento físico

foi iniciado em nosso estudo.

Trabalhos mostrando a ocorrência de bradicardia reflexa vagal dependente de

fibras sensoriais tipo C e de vias espino-bulbares após a injeção intratecal de BK, em

Discussão

38

ratos Wistar normotensos, corroboram a participação dos receptores B2 localizados

no corno-dorsal da medula espinhal na modulação da PA (Lopes, Couture, 1992).

Também foi observado que enquanto em ratos Wistar Kyoto normotensos a BK

promove bradicardia, em SHR ocorre um efeito bifásico ou taquicardia (Lopes,

Couture, 1992).

Em ratos Wistar, a aplicação de atropina reverteu a bradicardia observada

causando taquicardia, semelhante a uma predominância do sistema simpático sobre

o parassimpático (Lopes, Couture, 1992) sugerindo o aumento da atividade

simpática em SHR, com a inibição do barorreflexo durante a resposta cardiovascular

à BK (Nosaka, Okamoto, 1970).

Outro resultado interessante e inesperado foi o aumento dos sítios de ligação

para o receptor B2 nos núcleos bulbares NTS, Pa5, sp5 e AP dos animais

normotensos treinados (Figura 10).

O núcleo do trato solitário associado à área postrema é o principal integrador

dos processos sensoriais viscerais. Estes incluem os mecanismos bulbares do

barorreflexo, reflexos quimio e cardiopulmonares e mecanismos de controle

gustatório, hepático e renal (Carey et al., 1979; De Jong et al., 1979; Urbanski,

Sapru, 1988; Robin , Barraco, 1993). As vias neuronais do barorreflexo, que são

compartilhadas com os reflexos quimio e cardio pulmonares, compreendem

conexões estruturais entre o NTS, RVLM e CVLM, as quais correspondem às áreas

pressórica e depressora, respectivamente (Feldberg, Guerzenstein, 1976; Ross et

al., 1985; McKitrick, Calaresu, 1997). Estão descritas na literatura a ocorrência de

projeções diretas do Pa5 para as porções intermédia e caudal do NTS e AP (de

Sousa Buck et al., 2001, Caous et al., 2001).

Discussão

39

O Trato espinhal do nervo trigêmio é um feixe de fibras que leva informações ao

núcleo trigeminal (Sp5), envolvido com reflexos cardiorespiratórios, sendo

observadas respostas cardiovasculares após estímulos nociceptivos oro-faciais

(Allen, Pronych, 1997). Em ratos almiscarados foi observado o aumento da

expressão da proteina C-fos após alterações cardiovasculares desencadeadas pelo

estímulo nasal com vapores de amônia (Panneton, Yavari 1995; McCulloch,

Panneton 1997). Em trabalhos realizados com ratos normotensos, após dez semanas de

treinamento físico, observou-se um aumento da resposta pressora evocada pela

ativação do quimiorreflexo. Essas alterações podem estar associadas com

mudanças no tônus simpático em indivíduos treinados, de qualquer forma é

conhecido que o exercício promove modificações em gases e metabólitos que

podem promover adaptações nos quimiorreceptores. (Harthmann et al., 2007).

Portanto, o aumento da densidade de receptor B2 no sp5 em animais normotensos e

hipertensos treinados pode estar associado à maior ativação do sistema

cardiorespiratório durante o treinamento físico

Em todos os grupos estudados, o núcleo paratrigeminal foi o que apresentou

a maior densidade de marcações. Esses dados estão de acordo com estudos

mostrando ligações para o receptor B2 em bulbo de humanos normotensos e

hipertensos (Buck et al., 2002) e também substanciam a maior resposta pressórica

observada após a injeção de BK neste núcleo em relação a outros sítios responsivos

à BK (Lindsey, 1995, Lindsey et al., 1997, Cloutier et al., 2004).

As respostas cardiovasculares dependentes da estimulação de receptores B2

observadas quando se injeta BK sobre o Pa5, NTS ou medula espinhal torácica são

caracterizadas pelo aumento da pressão arterial causada por vasoconstrição e

Discussão

40

ausência de bradicardia (Fior et al., 1993; Lindsey et al., 1997; Cloutier et al., 2002 e

2004). Estudos recentes mostram que o estímulo dos receptores B2 do Pa5

ocasionou aumento da freqüência de disparos de neurônios localizados no núcleo

reticular rostral ventral lateral de ratos (Caous et al., 2004), que é responsável pela

manutenção do tônus vaso-motor. Também foi observada a diminuição da

freqüência de disparos de neurônios baro-sensíveis do NTS após a injeção de BK

sobre o Pa5 (Lindsey et al., 1999; Couture, Lindsey, 2000). Esses dados sugerem

uma participação da BK e do receptor B2 em uma situação em que é necessária a

manutenção da PA elevada com inibição do barorreflexo. Desta forma, os resultados

aqui apresentados, mostrando o aumento da densidade de receptores B2 no NTS e

Pa5 em ratos normotensos treinados, sugerem não só a participação do sistema

calicreína-cininas na modulação da pressão arterial durante o treinamento físico,

mas também, que a estimulação constante desse sistema promoveu o aumento do

número de receptores, tornando o sistema mais eficiente.

Os resultados mostrando maior densidade de receptor B2 no NTS, Pa5, AP e

L1 de SHR sedentários comparados com os ratos Wistar normotensos já foram

descritos e amplamente discutidos na literatura (Ongali et al., 2003, Cloutier et al.,

2002 e 2004). No entanto, em animais SHR e normotensos treinados não foram

observadas diferenças na densidade de receptores B2 nesses núcleos, exceto no

NTS, indicando que em SHR a expressão dos receptores B2 está naturalmente

super estimulada, não sendo possível aumentar ainda mais a densidade desses

receptores.

Este estudo também demonstra, pela primeira vez, que o aumento da

densidade dos receptores B2, aos mesmos valores observados em SHR sedentários,

Discussão

41

no NTS, Pa5 e AP de ratos Wistar normotensos treinados não elevou a PAS em

repouso. Estes dados sugerem que esses receptores não estão envolvidos na

modulação da PA nesta condição, mas somente em uma situação que demande

aumento da PA sem atuação do barorreflexo (fuga, defesa, exercício físico, etc.).

Esses resultados fornecem fundamentos para novos estudos farmacológicos e

fisiológicos da modulação da pressão arterial em situações de estresse.

Evidencias consideráveis indicam que o estresse psicossocial (Kaplan, Nunes

2003) e outros fatores comportamentais (Gerin et al., 2000) contribuem para a

hipertensão e doenças cardiovasculares. Nestes casos, a modificação do estilo de

vida tem sido recomendada para a prevenção e tratamento destas doenças

(Chobanian et al., 2003). A ansiedade e a hostilidade estão relacionadas à redução

do barorreflexo e aumento da força de contração de baixa freqüência, refletindo a

diminuição do fluxo parassimpático para o coração, podendo aumentar a variação da

pressão arterial através da predominância simpática (Virtanen et al., 2003).

Considerando que a resposta cardiovascular durante o exercício físico pode ser

considerada uma resposta comportamental, as alterações das densidades de

receptores B2 observadas neste trabalho dão suporte para novos estudos

farmacológicos e moleculares para elucidar a participação do sistema calicreina-

cininas na hipertensão de origem comportamental. O conhecimento desta

participação poderá ser essencial para o desenvolvimento de novas terapias.

Sumário

6. Conclusão

1. O treinamento físico em esteira promoveu diminuição dos sítios de ligação

para o receptor B2 no corno dorsal da medula espinhal de SHR, sem

alteração da densidade desse receptor em núcleos bulbares.

2. A redução dos receptores B2 no corno dorsal da medula espinhal pode

estar associada à redução da pressão arterial em SHR treinados.

3. No bulbo, a atuação da BK sobre o receptor B2 pode modular a pressão

arterial durante o exercício físico.

4. Possivelmente os receptores B2 não estão envolvidos com a modulação

central da pressão arterial em repouso.

42

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Resumo

Influência do treinamento físico em esteira sobre a densidade de receptores B2 para bradicinina, no bulbo e medula espinhal de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos. Ariadiny de Lima Caetano. Tese de Mestrado, 2008. Palavras-chaves: Bradicinina, hipertensão, exercício físico, radioautografia. Introdução: O papel fisiológico do sistema calicreína-cininas está relacionado à

participação no controle da pressão arterial. As cininas, consideradas

neuromediadores centrais, tem os seus efeitos mediados através da ativação de

dois receptores acoplados à proteína G, denominados B1 e B2. Estudos funcionais e

de ligações demonstraram que a densidade destes receptores esta aumentada no

bulbo e medula espinhal de ratos e humanos hipertensos. A BK é liberada quando

há oxigenação tecidual inadequada, em decorrência de perfusão deficiente, ou em

infecções, onde várias enzimas bacterianas podem liberar BK, diretamente de seu

precursor. A maioria das ações das cininas é mediada pelo receptor B2,

caracterizado por sua elevada afinidade pela bradicinina e por sua sensibilidade a

baixas concentrações do antagonista sintético seletivo Hoe 140. O receptor B2 está

presente no endotélio, no músculo liso e no tecido nervoso. Estudos realizados nas

últimas décadas mostram que existem poucas dúvidas quanto ao efeito benéfico do

exercício físico crônico na hipertensão arterial. Durante o exercício físico, os

músculos são estimulados, e as fibras aferentes somáticas, projetam-se até o núcleo

do trato solitário (NTS). Os neurônios dessa região são estimulados e excitam os

neurônios parassimpáticos do núcleo ambíguo e do núcleo motor do vago,

resultando num aumento da atividade vagal sobre o coração e bradicardia. Alguns

estudos sugerem uma participação dos receptores B2 bulbares na modulação da

pressão arterial (PA), preparando o organismo, do ponto de vista cardiovascular,

para uma situação comportamental como fuga, defesa ou exercício físico. Portanto,

o propósito deste estudo foi verificar se o treinamento físico influência a expressão

dos receptores B2 para cininas, no bulbo e medula espinhal torácica de ratos Wistar

normotensos e SHR.

Métodos e Resultados: Inicialmente os ratos foram adaptados e submetidos ao

teste de esforço físico para determinação do protocolo de treinamento em esteira.

Após esta fase foram criados os grupos “treinado” e “sedentário”. O treinamento de 1

hora foi realizado 5 dias por semana, durante 11 semanas e a pressão arterial

sistólica de cada grupo foi aferida semanalmente por via indireta. Ao fim do

54

Resumo

55

treinamento foram obtidos, por congelamento, cortes transversais seriados e não

fixados, do bulbo e medula espinhal de todos os animais. Através de radioautografia

para receptores B2 ([125I]-HOE-140, 200 pM, 90 min, 25ºC) foram observadas

ligações específicas nos núcleos paratrigeminal (Pa5), do trato solitário (NTS), no

trato espinhal do trigêmeo (sp5), área postrema (AP), nas lâminas 1e 2 da medula

torácica de todos os grupos. Nos animais sedentários a densidade de receptores

variou de 1,290 a 6,53 fmol/mg de proteína para o grupo Wistar e de 0,8284 a 7,40

fmol/mg de proteína para os animais SHR. Os animais WT apresentaram aumento

significante de ligações específicas para o receptor B2 na AP (81, %), no NTS (68%),

sp5 (32,61%) e no Pa5 (17 %). Nos animais SHRT, houve uma diminuição

significante nas ligações específicas para receptores B2 nas lâminas 1 (48,49%) e 2

(33,52%) da região torácica da medula espinhal.

Conclusão: O treinamento físico em esteira promoveu diminuição dos sítios de

ligação para o receptor B2 no corno dorsal da medula espinhal de SHR, sem

alteração da densidade desse receptor em núcleos bulbares. A redução pode estar

associada à redução da pressão arterial em SHR treinados. No bulbo, a atuação da

Bk sobre o receptor B2 pode modular a pressão arterial durante o exercício físico e

possivelmente os receptores B2 não estão envolvidos com a modulação central da

pressão arterial em repouso.

Abstract

Influence of treadmill exercise in bradykinin B2 receptors density in the medulla and spinal cord of normotensive and spontaneously hypertensive rats. Kalicrein-kinin system is involved directly or indirectly in the control of arterial blood pressure. The physiological role of the kalikrein-kinin system is related to the participation in the arterial blood pressure. Kinins have been elected to the status of central neuromediators and their effects are mediated through the activation of two G-protein-coupled receptors, denoted B1 and B2. Functional and binding studies suggested that B1 and B2 receptors are up regulated in the medulla and spinal cord of hypertensive rats and humans. The BK is released in inadequate tissue oxygenation, resulting from a deficient perfusion, or during infections, where some bacterial enzymes can liberate BK, directly from its precursor. The majority of kinins actions are mediated by the B2 receptor, characterized for its great affinity for BK and for the selective synthetic antagonist Hoe 140. This receptor is present in the endothelium, smooth muscle and central nervous system. Studies carried out in the last few decades show no doubts concerning the beneficial effects of chronic physical exercise for regulation of arterial hypertension. During physical activity, muscles are stimulated which affects afferent somatic fibers which are projected to the nucleus of the solitary tract (NTS). Once stimulated, neurons of this region stimulate parasympathetic neurons of the ambiguous and vago-motor nuclei, leading to an increase in vagal activity , which results in bradicardia. Some studies suggest the participation of medulla B2 receptors in the modulation of the arterial pressure, preparing the organism for suitable situations as fight, escape, defense or physical exercise. The aim of this study was to verify the influence of physical training in the density of kinin B2 receptors in the medulla and spinal cord of normotensive and spontaneously hypertensive rats. For this purpose, adult male rats were adapted to treadmill and submitted to an effort test in order to determine the training protocol. After this stage, animals were divided in “trained” or “sedentary”. The training protocol was performed 1 hour per day, 5 days a week, for 10 week, and the systolic arterial pressure of all animals was indirectly determined once a week. At the end of training, animals were anesthetized and the medulla and spinal cord were extracted. Samples of these tissues were freeze-dried, cut and prepared for radioautographic (RAG) studies. RAG for B2 receptors ([125I]-HOE-140, 200 pM, 90 min, 25ºC) of all groups showed specific binding in the paratrigeminal nucleus (Pa5), solitary tract nucleus (NTS), spinal trigeminal tract (sp5), area postrema (AP), laminae 1, 2 and 3 (L1, L2 and L3) and the correspondent to laminae 4 and 5 (Ls) in the spinal cord. In the Wistar sedentary group, receptor density varied from 1.29 to 6.3 fmol/mg of tissue whereas in the SHR group this density varied from 0.82 to 7.40 fmol/mg of tissue. Trained Wistar animals presented significant increase of specific binding for the B2 receptor in AP (81 %), NTS (68%), sp5 (33 %) and Pa5 (17%). In trainded SHR, a significant reduction in specific binding for B2 receptors was observed in laminae 1 (48.5%), 2 (33.5%), 3 (27.3%) and in the corresponding area of laminae 4 and 5 (83.4%) of the thoracic region of the spinal cord. Taken together, these results showed that chronic physical training promoted reduction of binding sites for B2 receptors in the dorsal corn of the spinal cord of SHR, without alteration of density of this receptor in medullar nuclei. This reduction can be associated with the decrease of arterial blood pressure in trained SHR. Our data also suggest that in the medulla, BK action on B2 receptors can modulate the arterial pressure during physical exercise, but possibly B2 receptors are not involved with the central modulation of the arterial blood pressure during resting condition.

56

Anexos

Anexos

57

Anexo

Medida da Pressão Arterial Sistólica individual. Grupo Wistar

Wistar sedentários

Animais 1 2 3 4 5 SM Semanas 7 110 110 120 110 115 106,67 8 106,67 100 103,33 106,67 100 100 9 100 113,33 100,00 100 110 120

10 110 96,67 96,67 106,67 100 110 11 103,33 110 113,33 116,67 106,67 116,67 12 96,67 116,67 103,33 126,67 113,33 96,67 13 93,33 110 100 110 123,33 113,33 14 96,67 113,33 116,67 96,67 103,33 96,67 15 100 103,33 120 106,67 113,33 116,67 16 103,33 113,33 116,67 110 116,67 116,67 17 120 116,67 113,33 116,67 120

Wistar Treinados

Animais 1 2 3 4 5 SM Semanas 7 120 100 105 110 110 106,67 8 110 110 106,67 106,67 90 103,33 9 100 103,33 106,67 115 113,33 106,67

10 103,33 103,33 103,33 106,67 103,33 103,33 11 100 106,67 100 110 106,67 100 12 103,33 93,33 110 113,33 106,67 100 13 103,33 90 100 113,33 93,33 96,67 14 86,67 100 90 96,67 96,67 93,33 15 90 105 95 90 106,67 16 103,33 90 96,67 93,33 96,67 96,67 17 93,33 96,67 80 86,67 90 93,33

Anexo

Grupo SHR

SHR Sedentários

Animais 1 2 3 4 5 SM Semanas 7 150 143,33 135 150 143,33 150 8 156,67 163,33 166,67 150 166,67 156,67 9 153,33 160 153,33 150 153,33 163,33

10 156,67 170 163,33 163,33 170 176,67 11 166,67 170 176,67 165 170 170 12 150 173,33 146,67 166,67 166,67 170 13 166,67 166,67 193,33 163,33 173,33 180 14 160 156,67 150 160 170 163,33 15 156,67 156,67 160 150 163,33 163,33 16 163,33 170 173,33 176,67 180 173,33 17 173,33 166,67 186,67 180 183,33

SHR Treinados

Animais 1 2 3 4 5 SM Semanas 7 145 146,67 146,67 145 153,33 160 8 166,67 170 165 160 163,33 156,67 9 163,33 163,33 160 166,67 163,33 166,67

10 170 156,67 163,33 163,33 173,33 166,67 11 146,67 143,33 143,33 146,67 143,33 12 153,33 143,33 143,33 143,33 140 13 146,67 140 136,67 136,67 136,67 14 143,33 146,67 143,33 130 146,67 15 126,67 146,67 146,67 140 143,33 16 133,33 133,33 123,33 136,67 146,67 17 123,33 123,33 123,33 120 123,33

Anexo

Média da Pressão Arterial Sistólica Sedentários Treinados

Semanas Wistar SHR Wistar SHR 7 111,9±1,94 145,3±2,45 108,6±2,73 149,4±2,45 8 102,8±1,33 160,0±2,72 104,4±3,06 163,6±1,94 9 107,2±3,48 155,6±2,04 107,5±2,34 163,9±1,02 10 103,3±2,58 166,7±2,85 103,9±0,55 165,6±2,38 11 111,1±2,22 169,7±1,63 103,9±1,81 144,7±0,80 12 108,9±4,91 162,2±4,52 104,4±2,94 144,7±2,26 13 108,3±4,28 173,9±4,58 99,4±3,37 139,3±1,94 14 103,9±3,70 160,0±2,72 93,9±2,00 142,0±3,09 15 110,0±3,22 158,3±2,06 97,3±3,60 140,7±3,71 16 112,8±2,18 172,8±2,34 96,1±1,81 134,7±3,74 17 117,3±1,24 178,0±3,60 90,0±2,43 122,7±0,66

CHANGES OF KININ B2 RECEPTOR BINDING SITES AFTER EXERCISE

TRAINING IN NORMOTENSIVE AND SPONTANEOUSLY HYPERTENSIVE RATS.

Ariadiny Lima Caetano1, Tania Araujo Viel2, Maria Fernanda Queiroz Prado

Bittencourt1, Mariana Silva Araujo3, Katia De Angelis4, Hudson Sousa Buck1

1Department of Physiological Sciences, Faculdade de Ciências Médicas da Santa

Casa de São Paulo, Sao Paulo, SP, Brazil.

2School of Arts, Sciences and Humanities, Universidade de São Paulo, São Paulo,

SP, Brazil.

3Department of Biochemistry, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP,

Brazil.

4Sao Judas Tadeu University, São Paulo, SP, Brazil

Short title: Changes of kinin B2 receptors by exercise training

Word count of manuscript: 4840

Word count of abstract: 247

Total number of figures: 4

Corresponding author: Hudson Sousa Buck, PhD, R. Dr. Cesario Motta Junior, 61,

11° andar, phone/fax: +55-11-3331-2008. e-mail: [email protected]

Abstract

Cardiovascular responses elicited by the stimulation of kinin B2 receptor in the IV

cerebral ventricle, paratrigeminal nucleus or in the thoracic spinal cord are similar to

that observed during an exercise bout. Considering that the kalikrein-kinin system

could act on the cardiovascular modulation of behavioral responses and that the

exercise demands cardiovascular changes as a behavioral situation, the aim of this

work was to evaluate the influence of exercise on B2 receptor of spontaneously

hypertensive and normotensive Wistar rats. Animals were exercise trained during ten

weeks on a treadmill and the blood pressure was monitored weekly. At the end, a

decrease in systolic blood pressure was observed in both normotensive and

hypertensive trained rats. Animals were then killed and the medulla and spinal cord

were extracted for B2 receptor autoradiography. Both groups were compared to their

sedentary controls. In trained normotensive rats an increase of specific binding was

observed in the paratrigeminal nucleus (17%), spinal trigeminal tract (33%), nucleus

of the solitary tract (68%) and area postrema (81%). These changes suggest an

involvement of this receptor in central cardiovascular control during exercise or

behavioral situations. Also, chronic exercise could hyper stimulate the kalikrein-kinin

system enhancing their efficiency. In trained hypertensive animals a decrease of

receptors density was observed in laminas 1 (-48%) and 2 (-34%) of thoracic spinal

cord. These changes could be related to the exercise dependent hypotension. The

present data shows the effectiveness of exercise training in modifying central

components related to blood pressure control.

Key words: bradykinin, hypertension, blood pressure, exercise, paratrigeminal

nucleus, stress

Introduction

All components of the kallikrein-kinin system have been identified within the

central nervous system, and activation of kinin B2 receptors exerts modulatory

effects on arterial blood pressure (BP) through neuronal autonomic pathways. The

biological effects of kinins are mediated by B1 and B2 transmembrane receptors,

coupled to the G protein.1-3 The B2 receptors are constitutive, mediates most of

physiological effects of kinins and are widely distributed in the rat brain4-6 and other

animal species, including guinea-pig7, sheep8 and human.9 The B1 receptor is

generally under-expressed in healthy animals and humans and can be induced and

functionally expressed by cytokines, bacterial endotoxins and following tissue injury.2

Autoradiographic studies demonstrated increased B2 receptors binding sites

in the hypothalamus, cardiovascular medullary nuclei and spinal cord of

spontaneously hypertensive rats (SHR)10,11 and in human medulla from hypertensive

donors when compared to normotensive donors.9 In comparison to normotensive

rats, SHR showed hypersensitivity to the pressor action of bradykinin (BK) when

injected into the lateral brain ventricle12,11, fourth ventricle13,14, rostral ventrolateral

medulla15 and thoracic spinal cord.11 This hypersensitivity to BK in important centers

of autonomic control of BP is related to the higher density of B2 receptor binding

sites in the hypertensive subjects.

The arterial baroreflex plays an important role in the course of spontaneous

variation of BP. In SHR the baroreflex control of heart rate (HR) during the increase

and decrease of BP have been improved after exercise training.16,17 In addition,

exercise training recovers the baroreflex control of muscle sympathetic nerve activity

and HR in never treated hypertensive patients, leading to the decreases of BP levels

in these patients.18

During an exercise bout the cardiovascular response is characterized by

elevation of BP and HR. The absence of bradycardia suggests the inhibition or

attenuation of arterial baroreflex during the exercise.19,20 Likewise, the cardiovascular

response observed after exercise or BK injection in the IV cerebral ventricles or in

the Pa5 elicit an acute and persistent increase in the BP and absence of

bradycardia.21,11 Notwithstanding innumerous evidences indicating the involvement

of the kalikrein-kinin system with central mechanisms of BP control, they do not

substantiate the condition in which it will be actuating. Considering that the kalikrein-

kinin system could be involved in cardiovascular modulation of behavioral responses

and that the exercise demands cardiovascular changes under a behavioral situation,

the aim of this study was to evaluate the influence of exercise on kinin B2 receptor

density in SHR and normotensive Wistar rats.

Methods.

Animal Care and Exercise Training Protocol.

Sixteen male Wistar rats and 12 SHR (180-200 g body weight, 7 weeks of

age) provided from The National Institute of Pharmacology, Universidade Federal de

Sao Paulo, were kept in controlled room temperature (22 - 24°C) and humidity (55 -

65%), with food and water ad libitum in a 12 hours light/dark cycle. The rats were

disposed in sedentary normotensive (n=8, SN), exercise trained normotensive (n=8,

TN), sedentary hypertensive (n=6, SH), and exercise trained hypertensive (n=6, TH)

group. Sedentary and trained rats were adapted to a motor treadmill (10min/d;

5m/min) for 1 week. After then, all animals were submitted to a maximal treadmill

test22,23 to determine aerobic capacity and exercise-training intensity, (1) at

beginning of the experiment, and (2) in the eighth week of the training protocol.

Exercise training began when the animals reach 8 weeks of age and was performed

on the treadmill at low-moderate intensity (≈ 50% to 70% maximal running speed) for

1 hour a day, 5 days per week for 10 weeks, with a gradual increase in speed from 5

to 20 m/min.24,16,17 The sedentary rats were handled every day to become habituated

to the experimental procedures.

All care procedures were strictly performed according to the guidelines for

animal experimentation as stipulated in the Guide for the Care and Use of

Laboratory Animals (National Institute of Health Publication number 86 23,

Bethesda, MD) and The Ethics Committee on Experimental Research from the

Faculdade de Ciencias Medicas da Santa Casa de Sao Paulo.

Measurement of Systolic Arterial Pressure.

Systolic arterial blood pressure (SAP) values were measured once a week, in

the morning, in warmed trained and sedentary conscious rats by indirect method,

using tail cuff sphygmomanometer (W.A. Baum Co., USA) as described elsewhere.25

The first measurement was obtained in the seventh week of age, one week before

the beginning of exercise training.

Peptide iodination.

The peptide HPP-HOE 140 (3–4 hydroxyphenyl-propionyl-DArg[Hyp3,Thi5,D-

Tic7,Oic8]-BK) was developed from the selective B2 antagonist HOE 140.26 It was

synthesized in the laboratory of D. Regoli (Department of Pharmacology, Université

de Sherbrooke). Iodination of HPP-HOE-140, was performed according to a method

previously described with some modifications.27 Briefly, 5 :g of peptide were

incubated in 0.05M phosphate buffer for 30 s in the presence of 0.5 mCi (18.5 MBq)

of Na125I (Amersham Biosciences, GE Healthcare, Uppsala, Sweden) and 220 nmol

of chloramine T in a total volume of 55 :L at room temperature. The reaction was

interrupted by 20 :L of 13 mM sodium metabisulfite. The monoiodinated peptide was

then immediately purified by gel filtration on a Sephadex G25 column (13 mL)

equilibrated in 0.5% bovine serum albumin in 0.1 M acetic acid. The specific activity

of the iodinated peptides corresponded to 2.000 counts/min/fmol or 1,212 Ci/mmol.

Tissue preparation for autoradiography.

At the end of tenth week of exercise training (18 weeks of age) the rats were

euthanized by asphyxia with CO2 inhalation and the brain stem and the segments T8

to T11 from spinal cords were immediately removed and frozen in 2-methylbutane at

-45 to -55 ºC with dry ice, then stored at -80 ºC. Serial sections of the tissues (20 :m)

were cut on a cryostat chamber (-18 to -20 °C, Microm HM 505 N, Francheville,

France), thaw mounted on gelatin coated slides, desiccated for 5 min at room

temperature and kept at -80 °C until use.

Autoradiography for B2 kinin receptor.

The method used was based on a previously described procedure.5 Briefly,

incubations were conducted for 90 min at room temperature using 200 pM [125I]HPP

Hoe-140 B2 receptor antagonist. Non specific binding was assessed using 2 :M of

the unlabelled peptide. At the end of incubation period, slides were transferred

sequentially through four rinses of 4 min each in 25 mM PIPES buffer at 4°C and

rapidly dipped into cold distilled water to remove excess salts. Sections were air

dried and juxtaposed against Hyperfilm MP (double coated, 24 x 30 cm, Amersham

Biosciences GE Healthcare, Uppsala, Sweden) for 72 h (room temperature), along

with autoradiographic [125I] micro scales (20 :m, Amersham Biosciences GE

Healthcare). The films were developed in D 19 Kodak developer and fixed in Kodak

Ektaflo solution. After autoradiographic experiments, the slices were fixed (5 min) in

4.0% buffered paraformaldehyde and stained by haematoxylin and eosin for

anatomical localization of the structures. The histological analysis was done using a

Nikon Eclipse E600 light microscope (Kanagawa, Japan).

Quantification of receptor binding sites

The autoradiograms were quantified densitometrically using the MCID image

analysis system (Interfoccus Europe, UK). For each specimen, kinin B2 receptors

binding sites were measured on 6-12 sections. The specific binding was determined

by superposing, and then subtracting, the non-specific binding from the total binding

from similar adjacent sections. The non-specific binding was less than 5% of the total

binding.

Statistical Analysis

Data are reported as means ± SEM. A two-way analysis of variance test

followed by Bonferroni post-test was used to compare values from the exercise test

and the levels of systolic arterial pressure between the sedentary and exercise

trained normotensive rats and SHR. Differences between B2 densities were

assessed using Student t-test for non-paired comparisons. Only probability values

(P) less than 0.05 were considered statistically significant.

Results.

Exercise capacity

Aerobic physical performance was evaluated by the response to the maximal

treadmill test. At the beginning of the experiment, the aerobic physical performance

was similar between groups (SN: 21.7 ± 1.7; TN: 20.0 ± 3.3; SH: 25.0 ± 3.3; TH: 26.6

± 1.6 m/min). However, the animals submitted to exercise training showed an

increase in the maximum speed of running when compared to the first measurement

after four (SN: 20.0 ± 3.3 vs. TN: 33.3 ± 1.7; SH: 23.3 ± 3.3 vs. TH: 43.3 ± 1.7

m/min) and ten weeks (SN: 20.0 ± 1.7 vs. TN: 38.3 ± 1.7; SH: 28.3 ± 3.3 vs. TH:

46.7 ± 1.7 m/min) of exercise training as well as when compared to their respectively

sedentary groups. The increase in maximum speed of running in trained groups,

previously associated with an increase in maximal oxygen consumption22,23, showed

the efficacy of the exercise training applied in this study.

Systolic arterial blood pressure.

The initial SAP at seventh week of age was higher in hypertensive groups as

compared to normotensive groups. In the fifteenth week of age (after seven weeks of

exercise training) the TN group showed a significant decrease in SAP reaching the

lowest level in the seventeenth week in relation to SN group (90 ± 2 and 117 ± 1

mmHg, respectively; Figure 1). When compared to their sedentary controls, the TH

group showed a significant decrease in SAP that began in the eleventh week of age

(after four weeks of exercise training) and persisted until the last experimental week.

At that moment the sedentary and trained SHR showed a SAP of 178±4 and 128±1

mmHg, respectively (Figure 1).

Localization and quantification of kinin B2 receptor.

Sedentary and exercise trained normotensive rats.

Densitometric analysis of the autoradiograms from medulla and thoracic

spinal cord of SN rats showed specific binding sites for the B2 antagonist in the

paratrigeminal nucleus (Pa5, 6.5 ± 0.9 fmol/mg), spinal trigeminal tract (sp5, 3.6 ±

0.5 fmol/mg), nucleus of the solitary tract (NTS, 1.8 ± 0.9 fmol/mg), area postrema

(AP, 1.9 ± 0.7 fmol/mg) (Figures 2a and 3a-c), laminas 1 (L1, 2.4 ± 0.9 fmol/mg) and

2 (L2, 1.6 ± 0.5 fmol/mg) of thoracic spinal cord (Figures 2a and 4a-c). Very low

labeling was observed in the deeper laminas of the spinal cord. The TN group

showed significant increase of specific binding sites in the Pa5 (17%), sp5 (33%),

NTS (68%) and AP (81%) as compared to SN group (Figures 2a and 3d-f).

Sedentary and exercise trained hypertensive rats.

The SH rats showed specific binding sites in the Pa5 (7.4 ± 0.9 fmol/mg), sp5 (3.9 ±

0.9 fmol/mg), NTS (3.3 ± 1.3 fmol/mg), AP (4.2 ± 0.9 fmol/mg), L1 (4.6 ± 1.0

fmol/mg) and L2 (2.2 ± 0.6 fmol/mg) (Figures 2b and 3g-i). When compared to the

SH group a significant decrease was observed in the L1 (-48%) and L2 (-34%) of TH

group (Figures 2b and 4d-f). The exercise training did not change the B2 receptor

density in medullary nuclei of TH group (Figures 2b and 3j-l).

Comparing the lineages.

In SHR, the pattern of B2 receptor distribution was similar to that observed in

normotensive Wistar rats, although values in several structures were significantly

higher in SHR. When comparing the SH to the SN groups, a significant increase of

specific binding sites was observed in the Pa5 (13%), NTS (86%), AP (110%) and L1

(91%) of hypertensive animals. At the end of exercise training program, an increase

of B2 receptor binding sites occurs in Pa5, SP5 and AP of TN, showing no significant

differences between TN and TH groups.

Discussion.

This work shows for the first time that the increase of B2 receptor binding sites in the

NTS, AP, Pa5 and sp5 from TN, reaching values similar to that found in SHR, are

not associated to a consequent increase in basal SAP. These data corroborate

recent findings showing that the infusion of B2 antagonists in the lateral ventricle of

young and adult SHR did not alter the basal BP.11 The NTS, as well as the AP, are

extensively described in the literature to be associated with central cardiovascular

regulatory mechanisms, including baroreflex, quimio- and cardiopulmonary

reflexes28-31 and regulation of central sympathetic outflow.32 The NTS, the major site

of termination of baroreceptor and cardiopulmonary afferent neurons, projects to the

ventrolateral medulla which contains neurons projecting to preganglionic sympathetic

neurons in the thoracic spinal cord.33,34 Direct projections from the Pa5 to the

intermedial and caudal portions of the NTS and Amb nuclei were shown by

retrograde and anterograde neuronal tracers.35,36 The sp5, is a bundle of fibers

conveying information to the spinal trigeminal nucleus which is involved in

cardiorespiratory reflexes. In rats, cardiovascular response after oro-facial

nociceptive stimulus was shown to be mediated in the dorsomedial Sp5C.37 In

muskrats, an increased Fos protein expression was observed in the Sp5I and Sp5C

after cardiovascular changes elicited by nasal stimulation with ammonia vapours.38,39

Another component of trigeminal system is the Pa5, a diffuse collection of cell bodies

present in a segment of the dorsal spinal trigeminal tract concurring, in rostrocaudal

extent, to the pars interpolaris of the spinal trigeminal nucleus. The Pa5 was the

most densely labeled structure and the highness densities of B2 receptor binding

sites was observed in hypertensive rats and in normotensive trained rats. This is in

agreement with the greater pressor response to BK injected in the Pa5.21 Recently,

evidences based on simultaneous multi-unit neuronal recording showed increase of

neuronal discharge in the rat rostroventrolateral reticular nucleus after after

stimulation of the Pa540 and barosensitive neurons in the Pa5, suggesting that, like

the NTS, this nucleus can act as a terminal for primary afferent in the medullary-

baroreflex or cardiorespiratory-reflex pathways.41 The central BP control comprises

also structures as the dorsal hippocampus42, medial prefrontal cortex43, dorsal

periaqueductal gray44 and lateral septal area45, areas notably involved in behavioral

responses. Among them we can remark the lateral septal area, which shows pressor

responses to BK46 and modulates the baroreflex in unanesthetized rats.45

Considering these findings and the similarity between the cardiovascular

response elicited by BK injected in medullary structures or exercise19-21,11, the

increase of B2 receptor binding sites in trained Wistar rats indicates an involvement

of this receptor in central cardiovascular control of BP during exercise or behavioral

situation as fight and escape. Also, our data suggests that the chronic exercise could

hyper stimulate the kalikrein-kinin system leading to an increase in the B2 receptors

density, probably to enhance the efficiency of the system. We conjecture that in

hypertensive trained rats, as the receptor expression is naturally augmented due to

his genetic features, the maximum expression of receptors was already reached

making the exercise training ineffective in modifying the receptor’s density.

Furthermore, the increased number of medullary B2 receptor in SHR could influence

the better performance of the SHR in the test of aerobic resistance.

Changes in the B2 receptors binding in trained SHR were restrict to the L1

and L2 of thoracic spinal cord where the receptor density was reduced to the same

concentration observed in normotensive rats, associated to a markedly reduction in

the SAP. Conversely, hypotension induced by ACEI or AT1 antagonists in SHR

elicited an increase in B2 receptor density at the same regions indicating that this

change is unlikely secondary to arterial hypertension because it was further

increased in adult SHR, which had undergone a chronic antihypertensive therapy.5

Inasmuch as the stimulation of B2 receptors in the thoracic spinal cord evoke

pressoric response, the decrease of density of this receptor could contribute to the

exercise dependent hypotension, showing the effectiveness of exercise training in

modifying central components related to BP control.

Perspectives.

Considerable evidence indicates that psychosocial stress47 and other behavioral

factors48 have contributed to hypertension and cardiovascular disease, being

recommended lifestyle modifications for prevention and treatment of this diseases.49

Anxiety and hostility are related to reduced baroreflex sensitivity and increased low-

frequency power of blood pressure variation (BPV), reflecting a decrease in

parasympathetic outflow to the heart which may increase BPV, through an increased

sympathetic predominance.50 Once changes in the kinin B2 receptors in

cardiovascular responses due to exercise training could be considered a behavioral

situation, our data give support to new pharmacological and molecular studies to

elucidate their participation in hypertension originated from behavioral disorders,

which can be essential information for new therapies.

Sources of Funding.

This work was supported by Fundo de Amparo a Pesquisa na Faculdade de

Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo. A.L. Caetano holds a MSc

studentship from CAPES.

Disclosures.

None.

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7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

60

80

100

120

140

160

180

200SNTN

SHTH

**

*****

aaa

Age (weeks)

Sist

olic

Art

eria

l Pre

ssur

e(m

mHg

)

Figure 1: Systolic arterial blood pressure variation of sedentary (SN) and trained

wistar rats, (TN) and sedentary (SH) and trained (TH) spontaneously

hypertensive rats during the exercise training period. * Different from SH

(Ρ<0.001); a Different from SN (Ρ<0.05).

Wistar

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

NTS APPa5 L2L1sp5

***

*

****

Exercise-trainedSedentary

[125 I]H

PP- H

OE

140

spec

ific

bidi

ng (f

mol

/mg)

A)

SHR

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0SedentaryExercise-trained

NTS L2L1sp5APPa5

***

* [125 I]H

PP-H

oe 1

40sp

ecifi

c bi

ding

(fm

ol/m

g)

B)

Figure 2: Specific binding of [125I]HPP-Hoe-140 to B2 bradykinin receptors in

medulla and thoracic spinal cord of wistar rats, sedentary (SN) and trained (TN)

(panel a) and spontaneously hypertensive rats, sedentary (SH) and trained (TH)

(panel b). Data are expressed as means ± S.E.M. Statistical differences are

represented by * (Ρ<0.05). Abbreviation: NTS, nucleus of the solitary tract; AP,

area postrema; Pa5, paratrigeminal nucleus; sp5, spinal trigeminal tract; L1 and

L2, laminas 1 and 2 from thoracic spinal cord.

Figure 3: Pseudocolor photomicrographs of autoradiograms representing

anatomical distribution of total binding sites for B2 receptor in medulla of wistar

rats, sedentary (a, b, c) and trained (d, e, f) and spontaneously hypertensive

rats, sedentary (g, h, i) and trained (j, k, l). High level binding of the antagonist

to the B2 receptor is shown in green/yellow, according to the scale. Non-

specific binding sites are represented in c, f, I and l. Structures identification

were based sections stained with haematoxylin and eosin. The antero-posterior

levels are approximately –2.30 mm (a), -2.58 (c) and –4.16 mm with reference

to the lambda (51Paxinos and Watson, 1998). Abbreviations are listed in the

legend of figure 2.

Figure 4: Pseudocolor photomicrographs of autoradiograms representing

anatomical distribution of total binding sites for B2 receptor in thoracic spinal

cord of wistar rats, sedentary (a, c) and trained (b, c) and spontaneously

hypertensive rats, sedentary (d) and trained (e, f). High level binding of the

antagonist to the B2 receptor is shown in green, according to the scale. Non-

specific binding sites are represented in c, and f. Panel g represents a

schematic draw from T10 section of spinal cord, adapted from Paxinos and

Watson.51 Structures identification was based on sections stained with

haematoxylin and eosin. The antero-posterior levels are between T7 and T9.51

Abbreviations: gr, nucleus gracilis; L1, L2, L3, laminas 1 to 3.

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