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Atténuer le virus naturel de la VHD par
mutagénèse dirigéeet à terme l'extrapoler à
l'EBHS
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Virus de la VHD
40 nm
ARN simple brin
7437 bases
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Virus pathogène de la VHDStructure déterminée aux rayons X .
• La capside que l’on voit est uniquement constituée d’une même protéine repétée plusieurs fois (VP60, 579 aminoacides).
• Le code est à l’intérieur sous la forme du brin d’ARN de 7437 b.
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VHD souche Pascal Harlaud
• 1/ Foie de lapin mort de la VHD envoyé par Pascal Harlaud.
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2/ Extraction de l’ARN viral
broyage,centrifugation,
purification
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3/ Transcription en ADN
Le code VHD est un ARN simple brin. (7437b)
Il est fragile.
Nous l’avonstraduit en ADNdouble brin, plusstable pourl’étudier et lemodifier.
ReverseTranscriptase-PCR
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4/ Lecture du code ADN
a) description du code (4 lettres A, T, C, G)
Code ADN
à
Double brin
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b) Lecture du code
Rouge = T
Noir = G
Vert = A
Bleu = C
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Code des 7437 pb de l’ADN complémentaire du virus VHD Pascal H.
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cDNA (ADN complémentaire) du virus Pascal Harlaud
F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050
BstBI BamH IBamH I AvrII
On n’a pas pu insérer le génome entier dans un plasmide,
on a donc décidé de le couper en 3 morceaux
F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050
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Coupure par des ciseaux spécifiques (enzymes)
…G G A T C C …………………..C C T A G G …………
…C C T A G G …………………..G G A T C C …………Exemple
ADN viral
Ou plasmide
…G G A T C C …………………..C C T A G G …………
…C C T A G G …………………..G G A T C C …………
…G C T A G G …………
…C C T A G C …………
Ciseaux
Plasmide
Ouvert avec
Un brin en
Moins.
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Colle…G C T A G G …………
…C C T A G C …………
Plasmide
Ouvert avec
Un brin en
Moins.
G A T C C …………………………………………..C
G……………………………………………G G A T C
Fragment
du génome
Du virus de
La VHD
Association
spontanée
…G G A T C C …………………………………………C C T A G G ……
…C C T A G G………………………………………….G G A T C C ……
Création de la
Liaison :
(ADN ligase
+ ATP)
…G G A T C C …………………………………………C C T A G G ……
…C C T A G G………………………………………….G G A T C C ……
Liaison à créer
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Litmus 28i
Multi site de clonage
promoteurT7
RNA Viral RHDV
RT-PCR
F3F1
BamHIBamHIAvrII
BstBI
4/ DigestionBstBI-BamHI
1/ Digestion du plasmide 1 par BamHI-AvrII
pF3
pF1+F3
Construction d'un cloneInfectieux de RHDV
Plasmide 1
2/ ajout de F3 préparé
par RT-PCR
3/ Ligation de plasmide 1
et F3 par ADN ligase.5/ ajout de F1 préparé
par RT-PCR
6/ Ligation de pF3 et F1
par ADN ligase.
Nous avons déjà les 2/3
du génome complet
quelques mois de travaux supplémentaires
semblent nécessaires pour pouvoir insérer
Le troisième fragment F2 et avoir le génome
complet de la VHD dans un plasmide.
F2
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Extraction du RNA viral
ReverseTranscriptase-PCR
cDNA (ADN complémentaire)
F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050
Clonage dans un plasmide
Séquençage pour confirmation des séquences
Mutagénèse dirigée
Transcription in vitro (ADN-ARN)
Transfection (cellules permissives, lapin)
BstBI BamH IBamH I
AvrII
Purification du virus VHDGénome viral complet
RNA 7437 b