aula 08 - aplicações da clonagem
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APLICAÇÕES DA CLONAGEMAPLICAÇÕES DA CLONAGEM
Disciplina: Biotecnologia Farmacêutica
Produção de proteínas
Cultura em banho: cultura em grandes recipientes a partir dos quais se extraem as células ou o composto de interesse. O meio não é renovável;
Cultura contínua: cultivam-se células num fermentador onde o meio é continuamente extraído e renovado, proporcionando uma fonte contínua de produto. Este tipo de cultura tem vindo a substituir a cultura em banho.
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Organismos e Vetores
ORGANISMOS
-E.coli
-Células eucarióticas
-Animais transgênicos
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Problemas na produção de proteínas recombinantes em E.coli
Gene exógeno:
- pode conter íntrons. A bactéria não possuimaquinaria para remoção;
- pode conter sequências de terminação em E.coli;
- o viés de códons do gene pode não ser o ideal.
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Problemas na produção de proteínasrecombinantes em E.coli
E.coli:
-pode não processar proteína corretamente (alterações pós-tradução);
-pode não enovelar a proteína corretamente (ligações dissulfeto) – corpos de inclusão;
- pode degradar a proteína recombinante
VETORES PARA E.coli
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Vetores de expressão em E.coli
•Promotor: marca o local de inicio da transcrição. Éreconhecido pela subunidade σ da RNA polimerase;
•Ribossome Binding Site (RBS): pequena sequência denucleotídios complementar ao rRNA 16S (região Shine-Delgarno). Esta zona é reconhecida pelo ribossoma,favorecendo a sua ligação e o início da transcrição algunsnucleotídios a seguir;
•Terminador: local a seguir a um codão stop onde atranscrição termina. É geralmente um sequência denucleotídios capaz de, por complementaridade de bases,formar uma estrutura em forma de gancho que induz adissociação da RNA polimerase.
Vetores de expressão
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O promotor é o componente crítico de um vetor de expressão
-Controla o primeiro estágio da expressão gênica;
-Determina a frequência na qual o RNAm é sintetizado.
Quantidade de proteína
recombinante produzida
Natureza do promotor
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Regulação da expressão
•Promotores fortes e fracos
•Indução e repressão da expressão
Indução e Repressão
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IPTG= isopropiltiogalactosídeo
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CASSETES E FUSÕES GÊNICAS
Produção de proteínas porcélulas eucarióticas
ou animais transgênicos
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Produção de proteínas por células eucarióticas
•- Fungos e leveduras: Saccharomyces cerevisiae
l- Células de mamíferos
Produção de proteínas por animais vivos
Animais Transgênicos
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