aula teórica de transcritômica
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Aula Biologia Molecular Computacional
Transcritômica
Julio Sosa - Lucas Silva
03/09/2015
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..um pouco de história..
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Sequenciamento Maxam-Gilbert (1976-77)
Matthews & van Holde. Bioquímica 2da ed. 1998
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Sequenciamento Sanger (1977)
Next-Generation Sequencing Platforms. Elaine R. Mardis (2013)
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..sempre da para melhorar..
Ventagens:
- Não há necessidade de radioatividade - Um câmera no final do gel monitora as sequências- Quatro reações numa “lane”
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Novas tecnologías..
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Novas tecnologías (omics)
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R.Q. Wu et al. J DENT RES 2010;90:561-572
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O transcriptoma é o conjunto completo de transcritos (RNAs) de uma célula, e as respectivas quantidades.
Porque é importante compreender o transcriptoma ?
● Interpretar os elementos funcionais do genoma
● Revelar os constituintes moleculares de células e tecidos nos diferentes estágios de desenvolvimento
● Compreender os elementos presentes no desenvolvimento de doenças.
..o que é Transcritoma..?
http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n11s/full/nmeth.f.268.html
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● Métodos baseados em Hidridização (Microarrays)
..métodos de estudo..
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● Métodos baseados em sequenciamento tradicional (Sanger)
● Métodos baseados em sequenciamento de nova geração (Next Generation Sequencing): RNA-Seq
..métodos de estudo..
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● Métodos baseados em sequenciamento tradicional (Sanger)
● Métodos baseados em sequenciamento de nova geração (Next Generation Sequencing): RNA-Seq
..métodos de estudo..
GS FLX 454 HiSeq 2500 5500xl SOLiD(ROCHE) (ILLUMINA) (ABI)
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Diferentes tecnologias (NGS)
GS FLX 454 HiSeq 2500 5500xl SOLiD(ROCHE) (ILLUMINA) (ABI)
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GS FLX 454 HiSeq 2500 5500xl SOLiD(ROCHE) (ILLUMINA) (ABI)
Ion TORRENT Pacific Biosciences Oxford Nanopore
Diferentes tecnologias (NGS)
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Sequenciamento NGS.. em maior detalhe
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Secuenciamiento NGS.. en mayor detalle
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Secuenciamiento NGS.. en mayor detalle
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Secuenciamiento NGS.. en mayor detalle
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Secuenciamiento NGS.. en mayor detalle
Illumina
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454 (ROCHE)
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NGS no mundohttp://omicsmaps.com/
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Genômica na era NGS
Genome Research Limited
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Ventagens:
- Construção librarias para sequenciamento
* Sem clonagem in vivo, transformação, etc
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Ventagens:
- Construção livrarias para sequenciamento
* Sem clonagem in vivo, transformação, etc
- Sequenciamento “array-based”
* Maior grado de paralelismo que sequenciamento basado em capilaridade
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• de novo sequencing• Whole genome re-sequencing• Targeted sequencing• Population genomics• Diagnostics• Cancer genomics• Ancient genomes• Metagenomics• RNA sequencing• Chip-seq• Genomic Epidemiology• anything with DNA
Aplicações
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..novas tecnologias..
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..novas tecnologias.. novos desafios..!
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Image courtesy of Lincoln Stein
..novas tecnologias.. novos desafios..!
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(Pennisi, Science 2011)
..novas tecnologias.. novos desafios..!
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..novas tecnologias.. novos desafios..!
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..dos desafios.. nace uma nova area.. a Bioinformática
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Pipeline geralControle qualidade Montagem
de novoCom referência
Sequenciamento
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de novoCon referencia
Haas and Zody, 2010 Nature Biotechnology 25, 421-423
Pipeline geralControle qualidade Montagem
de novoCom referência
Sequenciamento
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de novoCon referencia
Pipeline geralControle qualidade Montagem
Sequenciamento
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de novoCon referencia
Nossa referência!!
Pipeline geralControle qualidade Montagem
Sequenciamento
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Pipeline geralControle qualidade Montagem
de novoCom referência
Sequenciamento
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..quais são suas aplicações..?
Pipeline geralControle qualidade Montagem
de novoCom referência
Sequenciamento
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- Identificação sitios splicing- Anotação ncRNAs- Análise expressão diferencial- Enriquecimiento gênico
RNA
Pipeline generalControl calidad Montaje
de novo Con referencia
- Identificação SNPs- CNVs- Indels
Secuenciamiento
DNA
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- Identificação sitios splicing- Anotação ncRNAs- Análise expressão diferencial- Enriquecimiento gênico
RNA
Pipeline generalControl calidad Montaje
de novo Con referencia
- Identificação SNPs- CNVs- Indels
Secuenciamiento
DNA RB1 ZFP57
SMAD4 TP53 BRCA1
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- Identificação sitios splicing- Anotação ncRNAs- Análise expressão diferencial- Enriquecimiento gênico
RNA
Pipeline generalControl calidad Montaje
de novo Con referencia
- Identificação SNPs- CNVs- Indels
Secuenciamiento
DNA RB1 ZFP57
SMAD4 TP53 BRCA1
![Page 44: Aula teórica de transcritômica](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022020108/5871fc9f1a28abf5128b5a9f/html5/thumbnails/44.jpg)
- Identificação sitios splicing- Anotação ncRNAs- Análise expressão diferencial- Enriquecimiento gênico
RNA
Pipeline generalControl calidad Montaje
de novo Con referencia
- Identificação SNPs- CNVs- Indels
Secuenciamiento
DNA RB1 ZFP57
SMAD4 TP53 BRCA1
Biomarcadores molecularesDiagnósticoTerapia!!!
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- Identificação sitios splicing- Anotação ncRNAs- Análise expressão diferencial- Enriquecimiento gênico
RNA
Pipeline generalControl calidad Montaje
de novo Con referencia
- Identificação SNPs- CNVs- Indels
Secuenciamiento
DNABiomarcadores molecularesDiagnósticoTerapia!!!
![Page 46: Aula teórica de transcritômica](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022020108/5871fc9f1a28abf5128b5a9f/html5/thumbnails/46.jpg)
BIOINFORMÁTICA
RNA-SEQ Workflow.. ¿cadê a bioinformática?
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..desde as sequências..
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..como vem as sequências..?Formato FASTQ
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Controle qualidade
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Controle qualidade
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Como encontrar genes diferencialmente expressos?
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BWT-Burrows-Wheler Transform
-ORDENAÇÃO-APENAS 2X MAIS MEMÓRIA
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Mapping
•Bowtie or Maq mapping identify transcribed known or novel exons•Longer (e,g. 100bp)paired-end libraries are better
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Estrutura dos genes
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CHR1.FASTA
Onde é o início do gene mesmo?
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E o gene? Onde está?
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GENE TRANSFER FORMAT (GTF)
Um gene no triste mundo real!
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Montando genes utilizando dados de transcriptoma
cufflinks
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pont
os in
tere
ssan
tes
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Checando genes diferencialmente expressosTratamento gene A 10 FPKMControle gene A 1 FPKM
log2(tratamento/controle)
10 vezes maior! log2 = 3.32
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UP
DOWN
Método simples! retirar valores que cruzam um cut-off X
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Assumindo que o experimento de rna-seq segue uma normal. A probabilidade de uma medida divergir em mais que um desvio padrão é de mais de 68%! Isso em um caso IDEAL( ou um Chinês pipetando)
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Distribuicao de poisson para "pobres" mortais
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Poisson (média e desvio simétricos)
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Variação em duas replicatas
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microarray!
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DEseq2 (ajustando variáveis (m, s) )
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genesdiferencialmenteexpressos
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Antes eu tinha um gene! E agora tenho 1000….
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