aus der abteilung für humangenetik der ruhr … · dmso dimethylsulfoxid dna...

Aus der Abteilung für Humangenetik der Ruhr-Universität Bochum

Direktor: Prof. Dr. med. J. T. Epplen

Mutationen im Calpain 3-Gen

Inaugural-Dissertation zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer

Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Salma Martha Plammootil

aus Frankfurt am Main 2004

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. J.T. Epplen Korreferent: PD Dr. med. Matthias Vorgerd Tag der Mündlichen Prüfung: 07.12.2004

Für meine Eltern, Mary und Paul Plammootil

Inhaltsverzeichnis -I-

Inhalt................................................................................................................I-III Abkürzungen................................................................................................IV-VI 1. Einleitung...................................................................................................... 1

1.1 Muskeldystrophien (MD) ........................................................................ 1

1.1.1 Definition der MD ............................................................................... 1

1.1.2 Klinische Präsentation und diagnostische Kriterien der MD............... 2

1.1.3 MD – Ein Überblick ............................................................................ 3

1.1.4 Gliedergürtel-MD................................................................................ 4

1.2 Molekulare Basis der MD ....................................................................... 6

1.2.1 Aufbau des Dystrophin-assoziierten Glykoproteinkomplexes ............ 6

1.2.2 Molekularer Aufbau der Calpaine....................................................... 7

1.2.3 Das CAPN3-Gen................................................................................ 9

1.3 Pathophysiologie der Calpainopathie (LGMD2A) .............................. 10

1.3.1 CAPN3 und Zytoskelett-Stabilität ..................................................... 10

1.3.2 Der IκBα/NFκB-Apoptose-Signalweg............................................... 11

1.3.3 Die Funktion des CAPN3 im IκBα/NFκB-Apoptose-Signalweg........ 12

1.4 Genetik .................................................................................................. 14

1.4.1 Erbgang ........................................................................................... 14

1.5 Klinik...................................................................................................... 14

1.5.1 Calpainopathie: Klinisches Erscheinungsbild................................... 14

1.5.2 Diagnosemöglichkeiten der Calpainopathie ..................................... 15

1.5.3 Therapiemöglichkeiten bei MD......................................................... 17

1.6 Die Geschichte der Erkrankung: Réunion Paradox........................... 17

1.7 Zielsetzung der Arbeit .......................................................................... 18

2. Material und Methoden .............................................................................. 19

Inhaltsverzeichnis -II-

2.1 Material .................................................................................................. 19

2.1.1 Untersuchungsgruppe und DNA-Proben.......................................... 19

2.1.2 Oligonukleotide ................................................................................ 20

2.1.3 Chemikalien ..................................................................................... 22

2.1.4 Lösungen ......................................................................................... 23

2.1.5 DNA-Größenstandards .................................................................... 25

2.1.6 Radioisotope .................................................................................... 26

2.1.7 Enzyme ............................................................................................ 26

2.1.8 Kits ................................................................................................... 26

2.1.9 Röntgenfilme.................................................................................... 26

2.1.10 Sonstige Verbrauchsmaterialien .................................................... 27

2.2 Methoden............................................................................................... 28

2.2.1 DNA-Isolierung aus EDTA-Blut ........................................................ 28

2.2.2 Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration und -Reinheit 29

2.2.3 Phenol/Chloroform-Extraktion .......................................................... 29

2.2.4 Amplifikation von DNA-Abschnitten mit der Polymerase-

Kettenreaktion........................................................................................... 30

2.2.5 Spaltung von PCR-Produkten mittels Restriktionsendonukleasen... 33

2.2.6 Agarose-Gelelektrophorese ............................................................. 34

2.2.7 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) zur Analyse von SSCP.. 34

2.2.8 DNA-Isolierung aus Agarosegelen................................................... 35

2.2.9 Nichtradioaktive Sequenzanalyse .................................................... 36

2.2.10 Denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie........... 38

2.2.11 Datenbanken / Auswertung / Software........................................... 41

3. Ergebnisse.................................................................................................. 43

3.1 Mutationsanalyse im CAPN3-Gen ....................................................... 43

3.2 Molekulargenetisch diagnostizierbare Calpainopathien................... 49

3.3 Korrelation der klinischen Daten mit Mutationen im CAPN3-Gen.... 50

3.4 Vergleich der SSCP-Methode mit der DHPLC-Methode .................... 51

4. Diskussion.................................................................................................. 52

Inhaltsverzeichnis -III-

4.1 Verteilungsmuster der Mutationen ..................................................... 52

4.2 Verteilungsmuster der Sequenzvariationen....................................... 55

4.3 Mutationsanalysen und Westernblots ................................................ 56

4.4 Patienten mit lediglich einem mutierten Allel .................................... 58

4.5 Klinischer Hintergrund......................................................................... 60

4.6 Réunion Paradox .................................................................................. 61

4.7 Vergleich der SSCP- mit der DHPLC-Methode................................... 62

4.8 Ausblick................................................................................................. 63

5. Zusammenfassung .................................................................................... 67

6. Literaturverzeichnis ................................................................................... 68

Abkürzungsverzeichnis -IV-

Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ABI Applied Biosystems Incorporated A. bidest bidestilliertes Wasser abs. absolut ad auf APS Ammoniumperoxydisulfat AS Aminosäure bp Basenpaare bzw. beziehungsweise C- Carboxy- °C Grad Celsius ca. circa CAPN3 Calpain 3 cDNA complementary DNA CK Kreatinkinase cm Zentimeter d 2’-Desoxyribo- Da Dalton DD Differentialdiagnose dd 2’, 3’-Didesoxyribo- del Deletion DGC Dystophin-assoziierter Glykoproteinkomplex DHPLC denaturing high performance liquid chromatography DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure ddNTP 2’-Didesoxyribonukleosid-5’-triphosphat dup Duplikation DYSF Dysferlin EA Erstmanifestationsalter EDTA Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraessigsäure-Dinatriumsalz et al. und andere EtBr Ethidium Bromid EtOH Äthanol g Gramm HCl Salzsäure ins Insertion IVS Intron kb Kilobasenpaare l Liter LGMD limb-girdle muscular dystrophy LMDp Leiden Muscular Dystrophy pages M molar M. Musculus m milli (10-3) MD Muskeldystrophie(n) mikro (10-6) min Minute(n) Mm. Musculi

Abkürzungsverzeichnis -V-

mm Millimeter mRNA messenger RNA µg Mikrogramm N- Amino- n nano (10-9) NaAc Natrium Acetat NaCl Natrium Chlorid Nr. Nummer OD optische Dichte OMIM Online Mendelian Inheritance In Man p kurzer Arm eines Chromosoms; pico (10-12) PAA Polyacrylamid PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PCR polymerase chain reaction, Polymeraseketten-Reaktion q langer Arm eines Chromosoms RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehung pro Minute SDS Natriumdodecylsulfat SGC Sarkoglykan(e) s.o. siehe oben sog. sogenannt(e) STE Natrium-Tris-EDTA SSCP single strand conformation polymorphism Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat/EDTA Taq Thermophilus aquaticus TBE Tris-Borat/EDTA TE Tris-EDTA TEAA Triethylammonium-Kationen TEMED N,N,N’,N’-Tetramethyldiamin Tris Trishydroxymethylaminomethan UV Ultraviolettes Licht V Volt v/v volume per volume W Watt w/v weight per volume x g Vielfaches der Erdbeschleunigung Nukleobasen/Nukleotide: A Adenin/Adenosin C Cytosin/Cytidin G Guanin/Guanidin T Thymin/Thymidin U Uracil/Uridin P Purin Y Pyrimidin N beliebige(s) Nukleobase/Nukleotid

Abkürzungsverzeichnis -VI-

Aminosäuren: A Ala Alanin M Met Methionin C Cys Cystein N Asn Asparagin D Asp Asparaginsäure P Pro Prolin E Glu Glutaminsäure Q Gln Glutamin F Phe Phenylalanin R Arg Arginin G Gly Glycin S Ser Serin H His Histidin T Thr Threonin I Ile Isoleucin V Val Valin K Lys Lysin W Trp Tryptophan L Leu Leucin Y Tyr Tyrosin

Einleitung 1

1. Einleitung 1.1 Muskeldystrophien (MD) 1.1.1 Definition der MD

Unter Muskeldystrophie (MD) versteht man eine erblich bedingte

Muskelerkrankung, die mit einem fortschreitenden Untergang der

Skelettmuskulatur und deren Ersatz durch Bindegewebe einhergeht.

Kennzeichnend für Patienten mit MD ist zunehmende, bestimmte

Körperregionen bevorzugende, meist symmetrisch ausgebildete

Muskelschwäche. Es sind mehr als 30 verschiedene Formen von MD bekannt.

Die einzelnen Formen unterscheiden sich hinsichtlich des Vererbungsmodus,

der bevorzugten Körperregionen (Abb. 1.1), des Erkrankungsalters und des

Verlaufs. Genetisch grenzten Walton und Nattrass (1954) in ihrem

ursprünglichen Klassifikationsschema den X-chromosomal-rezessiven, den

autosomal-rezessiven und den autosomal-dominanten Typ voneinander ab

(Tab. 1.1).

Abbildung 1.1. Verteilung der vorherrschenden Muskelschwäche in verschiedenen Muskeldystrophien: (a) Duchenne- und Becker-Typ, (b) Emery-Dreifuss Typ, (c) Gliedergürtel-Typ, (d) Fazioskapulohumeraler Typ, (e) distaler Typ, (f) okulopharyngealer Typ (modifiziert nach The muscular dystrophies, Emery, 1998)

Einleitung 2

Tabelle 1.1. Klassifikation der Muskeldystrophien (MD) nach Walton and Nattrass (1954)

Vererbungsmodus Name der MD

X-chromosomal-rezessiv MD Typ Duchenne

MD Typ Becker

Emery-Dreifuss MD

Autosomal-rezessiv die meisten Gliedergürtel-MD

Skapulohumerale MD

MD der Kindheit

Kongenitale MD

Autosomal-dominant Fazioskapulohumerale MD

Myotone MD

Okuläre/Okulopharyngeale MD

1.1.2 Klinische Präsentation und diagnostische Kriterien der MD

Der Begriff MD wurde erstmals 1891 von Erb in einem historischen Kontext

verwendet. Alle bisher beschriebenen MD sind erbliche Erkrankungen der

willkürlichen (quergestreiften) Muskulatur, die mit fortschreitender Nekrose der

betroffenen Muskeln einhergehen (Gardner-Medwin et al., 1980).

Charakteristisch ist, daß von Anfang an nur bestimmte Muskelgruppen von den

Veränderungen betroffen sind. Zusammen mit der Progressionsrate und dem

Vererbungsmodus ergeben sie eine Basis für die Klassifikation der MD (Tab.

1.1). Alle Formen gehen mit Muskelschwäche ohne Anzeichen von

Sensibilitätsstörungen einher. Der Zeitpunkt des Auftretens und die

Progressionsrate, letztere beeinflußbar durch Infekte, konsumierende Prozesse

oder psychische Belastungen (Gleixner et al., 1999), variieren stark zwischen

den einzelnen Formen. Neben klinischen Symptomen wie z.B. Schwäche,

Myalgien und Krämpfen findet man Hinweise auf das Vorliegen dieser

Erkrankung in der Erhöhung der Serumenzyme Kreatinkinase (CK) und

Aldolase. Weitere Möglichkeiten der Diagnostik sind durch die

Elektromyographie oder die Biopsie gegeben. Bei der ersteren findet man

verkürzte, kleine, polyphasische Potentiale, was eine Differentialdiagnose (DD)

Einleitung 3

gegenüber motorischen Neuropathien und Vorderhornprozessen ermöglicht, bei

denen die Potentiale verlängert und größer sind (Lin et al., 1999). Die Biopsie

stellt das Ausgangsmaterial für histologische und immunhistochemische

Untersuchungen oder das Immunoblotting (z.B. Westernblot) dar. Das

Muskelgewebe wird nach Möglichkeit durch eine Feinnadelbiopsie gewonnen

(Emery, 1998). Die Histologie der Gewebeschnitte sichert die Diagnose einer

MD durch den Nachweis von allgemeinen Kriterien, wie z.B. Nekrosen,

Kaliberschwankungen und eventuell mesenchymal-lipomatösen Umbau der

Muskelfasern (Gleixner et al., 1999). Bei der Immunhistochemie wird das

Vorhandensein und die Verteilung der Proteine in der Zelle bzw. im Gewebe

untersucht, was durch spezifische Antikörper möglich ist. Aus Gewebeextrakten

wird beim Westernblot das Molekulargewicht der Proteine bestimmt, was

wiederum mittels Antikörpern möglich ist, allerdings nach vorher durchgeführter

Gelelektrophorese. Beide Verfahren erlauben eine DD zwischen den einzelnen

MD.

Zusätzlich kann man durch bildgebende Verfahren, wie Computertomographie

oder Magnetresonanztomographie, versuchen, selektive Atrophien der

Muskulatur nachzuweisen.

1.1.3 MD – Ein Überblick

MD werden unterschiedlich klassifiziert (Tab. 1.1). Unter den X-chromosomal-

rezessiven Formen ist die MD vom Typ Duchenne (DMD) die häufigste Form.

Die Jungen fallen im frühen Kindesalter durch Watschelgang auf, ausgelöst

durch proximale Atrophie zunächst der unteren Extremitätenmuskulatur. Später

manifestiert sich auch eine aufsteigende Atrophie zum Schultergürtel hin

(Abb. 1.1). Daneben beobachtet man eine Pseudohypertrophie der

Wadenmuskulatur, welche durch den fibrotischen Umbau der betroffenen

Muskulatur zu erklären ist. Die Erkrankung verläuft schnell progredient, die

Kinder sind meist ab dem 12. Lebensjahr rollstuhlpflichtig. Die Ursache ist eine

Mutation im DMD-Gen, die das Fehlen des Proteins Dystrophin, einem

Bestandteil des Dystrophin-assoziierten Glykoproteinkomplex (DGC), zur Folge

hat.

Einleitung 4

Die MD vom Typ Becker dagegen verläuft milder. Der Verlust der Gehfähigkeit

tritt, aufgrund der langsameren Progredienz, erst um das 30.-50. Lebensjahr

auf. Hier führt eine Mutation in dem DMD-Gen lediglich zu einer reduzierten

oder veränderten Dystrophinproduktion.

Die Fazioskapulohumerale MD ist die häufigste Variante der insgesamt seltener

vorkommenden autosomal-dominanten MD. Im Gegensatz zu anderen Formen

ist hier u.a. auch die Gesichtsmuskulatur betroffen (Abb. 1.1). Die Patienten

zeigen eine Facies myopathica, d.h. sie fallen durch einen schlaffen und müden

Gesichtsausdruck auf und zeigen zudem eine Schwäche im

Schultergürtelbereich (Scapula alata). Unter den autosomal-rezessiven MD sind

die Gliedergürtel-MD (limb-girdle muscular dystrophy, LGMD) die häufigste

Form.

1.1.4 Gliedergürtel-MD Gliedergürtel-MD sind eine Gruppe neuromuskulärer Erkrankungen mit großer

klinischer Variabilität. Der Begriff LGMD wurde von Walton und Natrass 1954

geprägt, die sich ihrerseits auf Beschreibungen von Erb (1884), Leyden (1875)

und Möbius (1879) Ende des 19. Jahrhunderts stützten. Beide Geschlechter

sind gleich häufig betroffen und die Erkrankung manifestiert sich üblicherweise

in den ersten drei Lebensjahrzehnten. Vorwiegend betroffene Muskelgruppen

sind Schulter-, Beckengürtel- und Rumpfmuskeln, jedoch ohne

Gesichtsmuskelbeteiligung (Abb. 1.1). Auch eine Pseudohypertrophie der

Wadenmuskeln ist unüblich (Urtasun et al., 1998). Die fortschreitende

Schwäche geht einher mit einer symmetrischen Atrophie der Muskulatur und

einem nekrotisch-regenerierenden Muster im histopathologischen Korrelat

(Baghdiguian et al., 2001). In den letzten Jahren wurde diese Gruppe von

Erkrankungen aufgrund von neuen histopathologischen Techniken und

genetischen Grundlagen neu klassifiziert. Sie wurden in autosomal-dominante

(LGMD1) und autosomal-rezessive (LGMD2) Syndrome unterteilt.

Die autosomal-dominanten Syndrome sind relativ selten, bisher wurden vier

Loci identifiziert (LGMD1A-D). Eine Zuordnung zu einem bestimmten Protein

konnte bisher allerdings nur bei LGMD1A-C erfolgen. Bei der LGMD1A werden

Einleitung 5

Mutationen im Myotilin-Gen als ursächlich für das Krankheitsbild angesehen,

bei der LGMD1B Mutationen im Lamin A/C-Gen und für die LGMD1C

Mutationen im Caveolin 3-Gen (Bushby, 1999, Gamez et al., 2001). Unter den

autosomal-rezessiven Syndromen sind neun Formen der LGMD-Erkrankung

voneinander unterscheidbar (Weilbach et al., 1999, Brockington et al., 2001).

Die Unterteilung ist in Tab. 1.2 beschrieben.

Die meisten molekularen Pathogenitätsmechanismen dieser bisher

identifizierten MD betreffen ursächlich Strukturkomponenten des Muskels, die

zu einem Großteil Bestandteile des Dystrophin-assoziierten

Glykoproteinkomplex (DGC) darstellen.

Tabelle 1.2. Einteilung der autosomal-rezessiven LGMD-Erkrankungen.

Erkrankung Gen Lokalisation auf

Chromosomenebene (OMIM Nummer)

LGMD2A Calpain 3 (CAPN3) 15q15.1-q21.1 (253600)

LGMD2B Dysferlin (DYSF) 2p13.3-p13.1 (253601)

LGMD2C γ-Sarkoglykan (SGCG) 13q12 (253700)

LGMD2D α-Sarkoglykan (SGCA) 17q12-q21.33 (608099)

LGMD2E β-Sarkoglykan (SGCB) 4q12 (604286)

LGMD2F δ-Sarkoglykan (SGCD) 5q33-q34 (601287)

LGMD2G Telethonin (TCAP) 17q11-q12 (601954)

LGMD2H Tripartite-motif containing gene 32 (TRIM32)

9q31-q34.1 (254110)

LGMD2I Fukutin-related protein gene (FKRP)

19q-13.3 (607155)

Einleitung 6

1.2 Molekulare Basis der MD 1.2.1 Aufbau des Dystrophin-assoziierten Glykoproteinkomplexes

Die Zusammensetzung der verschiedenen Komponenten des Dystrophin-

assoziierten Glykoproteinkomplex (DGC) ist gewebespezifisch und sehr

detailliert an der Muskelzellmembran untersucht. Der DGC der Muskelzelle

bildet eine transmembrane Verbindung zwischen dem Zytoskelett und der

extrazellulären Matrix (Campbell and Kahl, 1989). Die beteiligten Proteine sind

Dystrophin, verschiedene Dystroglykane, Sarkoglykane, Syntrophin, Merosin,

Sarkospan, Syntrobrevin sowie weitere, zum Teil noch nicht genau untersuchte

Proteine (Abb. 1.2).

Abbildung 1.2. Schematische Darstellung des DGC an der Muskelzellmembran (modifiziert nach Blake et al., 2002).

Das intrazelluläre Dystrophin steht auf der N-terminalen Seite in Verbindung mit

F-Aktin und über dieses auch mit weiteren Anteilen des Zytoskeletts. Die erste

Hälfte des C-Terminus des Dystrophins, die auch als Dystroglykan-Binde (D)-

extrazelluläre Matrix

Sarkolemma

Dystrophin

zytoplasmatischerKomplex

Aktin

Syntrophine

Laminin 2

Sarkoglykan-Komplex

Sarkospan

+ζ

Dystrobrevin

Einleitung 7

Domäne bezeichnet wird und sich durch einen hohen Cystein-Gehalt

auszeichnet, bindet an das β-Dystroglykan. Dieses verankert γ-Sarkoglykan,

welches mit α−, β−, δ-, ε-, und ζ-Sarkoglykan einen eigenen integralen Komplex

in der Muskelmembran bildet (Wheeler et al., 2002). α1-, β1- und β2-

Syntrophine, ebenfalls untereinander verknüpft, binden am C-terminalen

Bereich des Dystrophins (Peters et al., 1997), wo auch Dystrobrevin andockt.

Die Laminin-2-Untereinheit von Merosin bindet an das α-Dystroglykan, das mit

dem β-Dystroglykan verbunden ist. Somit bilden die Dystroglykane eine

transmembranäre Verbindung zwischen Laminin-2 und Dystrophin.

Es werden verschiedene Funktionen für den Dystrophinkomplex postuliert, wie

z.B. mechanischer Schutz der Muskelmembran während des

Kontraktionsvorganges oder Regulierung der Muskelmembranpermeabilität,

insbesondere für Kalzium (Michalak and Opas, 1997). Auch wenn die genaue

Funktion noch nicht in allen Einzelheiten bekannt ist, wird zunehmend klar, daß

ein genetisch bedingter Ausfall eines der Komplexproteine zu einer Dystrophie

führen kann, wie z.B. zu einer primären Dystrophinopathie, Sarkoglykanopathie

oder Merosinopathie (Yoshida et al., 1997). Eine primäre Störung eines der

Proteine führt verständlicherweise zur sekundären Veränderung weiterer

Komplexanteile und folglich zur Beeinträchtigung der ganzen Einheit (Brown et

al., 1997).

Das Besondere an der Pathogenese der LGMD2A (Calpainopathie) liegt darin,

daß nicht der Defekt eines Strukturproteins, sondern der Defekt einer Protease

zu funktionellen Einbußen der Muskelaktivität führt.

1.2.2 Molekularer Aufbau der Calpaine

Calpaine (Kalziumionen-abhängige, Papain-ähnliche Cysteinproteasen) oder

auch Kalzium(Ca2+)-aktivierte neutrale Proteasen (CAPN, CANP), sind nicht-

lysosomale intrazelluläre Cystein-Proteasen. Derzeit sind etwa 15 verschiedene

Calpaine bekannt, die entweder ubiquitär oder gewebsspezifisch verbreitet sind.

Sie setzen sich aus Heterodimeren zusammen, bestehend aus einer großen

und einer kleinen Untereinheit (Abb. 1.3).

Einleitung 8

Abbildung 1.3. Schematische Darstellung einiger Mitglieder der Calpain Familie (modifiziert nach http://www.nature.com/nrm/journal/v3/n4/slideshow/nrm779_bx2.html).

Die kleine Untereinheit besteht aus einer N-terminalen glycinreichen

hydrophoben Region (Domäne V) und einer Ca2+-bindenden Domäne (Domäne

IV’ oder VI), ähnlich der Domäne IV der großen Untereinheit (Ono et al., 1998).

Die große Untereinheit kann in vier Domänen unterteilt werden. Domäne I hat

regulatorische Funktion und Domäne II zeigt Ähnlichkeit mit anderen Cystein-

Proteasen. Domäne III enthält eine Kalzium-regulierte Phospholipid

Bindungsstelle (Tompa et al., 2001), strukturell ähnlich der sogenannten C2-

Domäne, welche schon im Zusammenhang mit anderen Proteinkinasen

beschrieben wurde (Fanin et al., 2003, Fukuda and Mikoshiba, 2001). Domäne

IV enthält fünf EF-Hand-Strukturen, die potentielle Kalzium-Bindestellen sind.

Die muskelspezifische Variation dieser Enzyme, das CAPN3 (p94, nCL-1),

Einleitung 9

besteht nur aus einem 94 kDa Monomer, ohne eine kleine Untereinheit (Jia et

al., 2001). Es ist durch drei spezifische funktionelle Insertionssequenzen

gekennzeichnet (Abb. 1.3). Die NS-Sequenz befindet sich am N-Terminus (AS

1-61), die IS1-Sequenz in der proteolytischen Domäne II (AS 267-329) und die

IS2-Sequenz zwischen der Domäne III und IV (AS 578-653), sie enthält als

Besonderheit eine nukleäre Translokationssequenz (AS 595-600) und eine

Titin- (Connectin-) Bindungsstelle (Herasse et al., 1999). Connectin, seinerseits

ein gigantisches Muskelprotein welches sich von der M- bis zur Z-Scheibe eines

Muskelsarkomers ausdehnt, hat mindestens zwei Bindungsstellen für CAPN3,

eine ist entlang der N2A-Region, die andere an der extremen C-terminalen M-

is7-Region (Kinbara et al., 1997; Ono et al., 1999). Unter den hauptsächlichen

biochemischen Funktionen des CAPN3 werden neben der Titin-Bindung die

autokatalytische Aktivität, α-Fodrin Proteolyse (Fanin et al., 2003) und

Involvierung in Apoptosemechanismen diskutiert (Baghdiguian et al., 2001).

1.2.3 Das CAPN3-Gen Das CAPN3-Gen ist auf Chromosom 15q15.1-q21.1 lokalisiert (Abb.1.4). Es

umfaßt 24 Exons und umspannt eine genomische Region von ungefähr 53

Kilobasen (kb). Das Transkript umfaßt 3,5 kb (2466 bp) und wird in ein 94 kDa

großes Protein translatiert, weshalb es den Namen p94 erhielt.

Außergewöhnlich ist, daß das Gen viele kleinere Exons aufweist. Zehn Exons

haben eine Länge von 58-86 bp, wobei Exon 12 (12 bp), 15 (18 bp) und 14 (37

bp) noch kleiner sind. Die meisten Introns, bis auf Intron 18 und 20, die unter

100 bp groß sind, variieren zwischen 0,2 – 2,6 kb. Intron 1 ist 24,3 kb groß und

nimmt damit fast die Hälfte des Gens ein (www.dmd.nl/capn3_home.html,

Leiden Muscular Dystrophy pages).

Abbildung 1.4. Schematisierte Darstellung des Chromosom 15. Schwarz markiert die Lokalisation des CAPN3-Gens

Einleitung 10

Daneben existieren verschiedene alternative Spleißvariationn der CAPN3-RNA,

welche sich aus unterschiedlichen Kombinationen der 24 Exons

zusammensetzen. Ein durch alternatives Spleißen entferntes Exon 6 (p94∆6)

beeinträchtigt zwar die autolytische, aber nicht die enzymatische Aktivität der

Protease (Herasse et al., 1999). Daneben zeigte sich, daß p94∆6, eine Isoform,

die auch embryologisch exprimiert wird, histologisch mit regenerierenden oder

sich entwickelnden Muskel einhergeht (Spencer et al., 2002). Dieser unreife

Muskel resultiert wahrscheinlich aus einem Defekt der Myoblastenfusion oder

der Reifung nach der Fusion. p94∆6+15 entsteht ebenfalls durch alternatives

Spleißen in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC, De Tullio et al.,

2003). Eine weitere Spleißvariation ist Lp82, eine linsenspezifische Form der

Calpaine (Ma et al., 1998). Sie entsteht durch Deletion der IS1 und IS2

Regionen und einem veränderten Exon 1, welches möglicherweise auf einen

linsenspezifischen Promoter im CAPN3-Gen zurückzuführen ist. 1.3 Pathophysiologie der Calpainopathie (LGMD2A) 1.3.1 CAPN3 und Zytoskelett-Stabilität

Aufgrund der hohen autolytischen Aktivität des CAPN3 ist es schwer, das

Protein zu analysieren. Bisher identifizierte Substrate sind u.a. die

Myotoninproteinkinase, Fodrin, Filamin C und Titin (Sorimachi et al., 1997,

Taveau et al., 2003). Außerdem bindet p94 an die Z-Scheiben der Myofibrillen,

was die Anfälligkeit des Sarkolemms unter Muskelaktivität erklärt (Ono et al.,

1998). Weiterhin wird angenommen, daß CAPN3 zur Degradierung der

Myofibrillen oder des Aktin-Zytoskeletts führt und damit zur Auflösung seiner

Integrität. Taveau et al. (2003) postulieren, daß CAPN3 als ein Regulator des

Zytoskeletts im Muskels agiert. Die Beobachtung, daß p94, durch indirekte oder

direkte proteolytische Degradierung, die Regulierung von ubiquitären Calpainen

und Calpastatin unterliegt (Ono et al., 2004), stützt diese Aussage.

Einleitung 11

1.3.2 Der IκBα/NFκB-Apoptose-Signalweg

NF(nuclear factor)κB ist ein Transkriptionsfaktor aus der Familie der Rel-

Proteine, dem u.a. die Regulation unterliegt von zahlreichen Genen des

Immunsystems, wie diejenigen, die für das Überleben der Zelle notwendig sind

(cell survival proteins). NFκB setzt sich aus einem Heterodimer mit zwei

Untereinheiten (p65 und p50) zusammen (Baghdiguian et al., 2001), die jeweils

einen gemeinsamen charakteristischen Bestandteil aufweisen (Ghosh et al.,

1998). Am N-Terminus befindet sich eine 300 Aminosäurenlange, konservierte

Region, die Rel Homologie Domäne (RHD). Diese Region ist verantwortlich für

die DNA-Bindung, Dimerisierung und Interaktion mit Mitgliedern der IκB-

Familie. Außerdem enthält sie die nukleäre Lokalisationssequenz (Rodriguez et

al., 1999). Üblicherweise befindet sich NFκB in inaktiver Form im Zytoplasma

und ist an seinen spezifischen Inhibitor IκBα gebunden. Durch diese Bindung

wird die Translokation von NFκB in den Nukleus verhindert, da die nukleäre

Translokationssequenz durch IκBα maskiert wird.

Die Aktivierung von NFκB ist eine Grundlage für die Immunantwort und die

Kontrolle über das Überleben der Zelle. Durch seine Translokation in den

Nukleus ermöglicht er die Transkription von anti-apoptotischen Proteinen, wie

zum Beispiel hILP und FLIP (human IAP-like Protein, flice inhibitory protein).

Diese Proteine hemmen den Kaspase-Signalweg, der zur Apoptose der Zelle

führt. Durch Zelltod-Signale von benachbarten zytotoxischen T-Lymphozyten,

kann der Kaspase-Signalweg ausgelöst werden. Die von den T-Zellen u.a.

sezernierten Perforine (Membranolytische Einheit), Granzym B (eine Serin-

Protease) oder auch Zytokine (Botenstoffe), können mit der Oberfläche der

Muskelzelle interagieren. Die Perforine z.B. sind in der Lage als

Tunnelmoleküle zu fungieren und können so auf verschiedene Weise zur

Apoptose führen (Spencer et al., 1997). Unter normalen Bedingungen kann die

Muskelzelle diese Zelltod-Signale mit verschiedenen Mechanismen abfangen,

mit dem Resultat, daß anti-apoptotische Proteine gebildet werden. Unter diesen

Mechanismen ist der IκBα/NFκB-Signalweg einer der wichtigsten, sowohl im

Muskelsystem als auch in einigen anderen Zellsystemen.

Einleitung 12

1.3.3 Die Funktion des CAPN3 im IκBα/NFκB-Apoptose-Signalweg

Um diesen Signalweg zu aktivieren, muß IκBα zunächst phosphoryliert und

hydrolytisch gespalten werden, wodurch NFκB frei wird (Han et al., 1999). Die

Degradation von IκBα kann entweder durch ein im Zytoplasma vorhandenes

lysosomales System oder durch einen Proteasom-Komplex erfolgen (Tanaka et

al., 2001, Baghdiguian et al., 2001). Diese Zellsysteme sind aber nur zu einer

limitierten Proteolyse und damit zu einer limitierten Aktivierung von NFκB in der

Lage. Üblicherweise wird die Degradation durch das Kalzium-aktivierte Calpain

3 (auch Calpain 1 und 2, ubiquitär verbreitet, Bushby, 1995) reguliert. Auf diese

Weise aktiviertes NFκB regt nun im Nukleus zur Transkription von cell survival-

Proteinen an. Darunter sind, hILP und FLIP, aber auch neu synthetisiertes IκBα

(NS-IκBα) (Rodriguez et al., 1999). In nicht gebundener Form transloziert NS-

IκBα in den Nukleus, bindet dort an NFκB und blockiert damit seine Aktivität.

Durch diese negative Rückkopplung wird der ursprüngliche Zustand der Zelle

bald wieder erreicht und sie wird somit erneut anfällig für den Zelltod. CANP3

kann, dank seiner nukleären Translokationssequenz NS-IκBα von NFκB lösen.

Dieser Mechanismus verleiht den vielkernigen Muskelzellen eine ungewöhnlich

hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber der Apoptose (Abb. 1.5).

Bei einem Mangel an CAPN3, wie es bei der LGMD2A der Fall ist, ist nur noch

eine limitierte Aktivierung von NFκB durch das lysosomale System, den

Proteasom-Komplex und den ubiquitär vorhandenen Calpainen 1 und 2 (Han et

al., 1999) möglich. Dies führt zu einer wesentlich verminderten Transkription

und Translation von anti-apoptotischen Proteinen und von NS-IκBα (Abb. 1.6).

Die Konzentration von NS-IκBα reicht aber aus, um die Aktivität von NFκB im

Nukleus zu blockieren und zusätzlich im Nukleus zu akkumulieren. Dies führt

letztlich dazu, daß keine anti-apoptotischen Proteine mehr gebildet werden und

somit der Kaspase-Signalweg zur Apoptose der Zelle führt (Reuther and

Baldwin, 1999). Auf diese Weise führt der Defekt einer Protease zu einer

Funktionsstörung der Muskelaktivität.

Einleitung 13

Abbildung 1.5. Regulationsmechanismen der gesunden Muskelzelle zum Schutz vor Apoptose (modifiziert nach Baghdiguian et al., 2001). Apoptot., apoptotische; CAPN, Calpain; Degr./Degrad., Degradierung; LS, Lysosomales System; zytotox., zytotoxischer.

Abbildung 1.6. Gestörtes Regulationsverhalten der Zelle bei LGMD2A (modifiziert nach Baghdiguian et al., 2001). ; Akkum., Akkumulation; apoptot., apoptotische; Degr., Degradierung; LS, Lysosomales System; zytotox., zytotoxischer.

zytotox.T-Lymphozyt

NF Bκ

LS

CAPN 1+2

limitierteNF B

Aktivierungκ

Überlebender Zelle

anti-apoptot. Proteine

Zytokine

zytotox.T-Lymphozyt

NF Bκ

NF BAktivierung

κLS

CAPN 1+2

Proteasom

KaspaseSignalweg

Einleitung 14

1.4 Genetik 1.4.1 Erbgang Die Calpainopathie (LGMD2A) wird autosomal-rezessiv vererbt, das heißt beide

Eltern müssen in der Regel heterozygot für das Erbleiden sein, damit statistisch

bei 25% der Kinder eine Erkrankung auftritt. Es gibt prinzipiell zwei mögliche

Genotypen der erkrankten Kinder. Zum einen können diese Kinder homozygot

für eine bestimmte Mutation sein, d.h. sie haben auf beiden Allelen jeweils die

gleiche Mutation. Zum anderen können sie aber auch auf jedem Allel eine

andere Mutation haben, sie sind dann compound heterozygot. 50% der

Nachkommen solcher Paare besitzen heterozygote Genotypen und sie sind

somit Konduktor bzw. Konduktorin. Die restlichen 25% der Kinder tragen keine

Mutation. Charakteristisch für die LGMD2A ist auch, daß beide Geschlechter

gleich häufig betroffen sind.

1.5 Klinik

1.5.1 Calpainopathie: Klinisches Erscheinungsbild Das Erstmanifestationsalter variiert von 2 bis 45 Jahren, wobei es meistens im

Bereich von 8 bis 15 Jahren liegt (Pollitt et al., 2001). Die Patienten zeigen im

allgemeinen eine symmetrische Schwäche der Muskulatur, die mehr proximal

als distal betont ist und mit einer moderat erhöhten CK einhergeht. Die Atrophie

der Muskulatur steht im Vordergrund, daher ist eine Hypertrophie im Bereich

der Wadenmuskeln eher seltener zu beobachten. Die am stärksten betroffenen

Muskeln sind der M. gluteus maximus und die Hüft-Adduktoren. Eine Schwäche

im Bereich des Beckengürtels ist schon früh zu beobachten, wobei allerdings

die Hüft-Abduktoren im Krankheitsverlauf relativ lange verschont bleiben. Die

genannten Faktoren zusammen mit einer Schwäche der Bauchmuskulatur (M.

rectus abdominis) führen zu einer charakteristischen lordotischen Haltung

dieser Patienten (Bushby, 1999). Eine Engelsflügel-Haltung (Scapula alata), mit

Seitwärtsgleiten der Schulterblätter beim Anheben der Arme bzw. Abstehen von

der Thoraxwand im periskapularen Bereich ist üblicherweise vorhanden,

ausgelöst durch die betroffenen Mm. latissimus dorsi und serratus magnus.

Einleitung 15

Außerdem kann eine schwere respiratorische Beteiligung und eine milde

mentale Retardierung vorliegen. Kontrakturen durch muskuläre Insuffizienz im

Bereich der Achillessehne können ein früher Hinweis auf die Erkrankung sein,

generell sind Kontrakturen besonders bei fortschreitender Krankheit regelmäßig

vorhanden. Gesichts- und Augenmuskeln sind meist ausgespart (Abb.1.1),

ebenso die Nackenmuskulatur (Bushby, 1999, Lopate, 2001).

Rollstuhlabhängigkeit besteht üblicherweise erst 11-28 Jahre nach

Erstmanifestation. Der Krankheitsverlauf ist vergleichsweise mild, doch es sind

auch schwere Verläufe bekannt (Bushby, 1999). Desweiteren beobachtet man

auch intrafamiliäre Unterschiede im klinischen Erscheinungsbild der Patienten,

gemessen an dem Alter, bei dem der Verlust der Gehfähigkeit oder erste

Symptome eintraten (Richard et al., 1997, Penisson-Besnier, 1997).

1.5.2 Diagnosemöglichkeiten der Calpainopathie Wichtig ist die Anamnese und Familienanamnese, die im günstigsten Fall eine

gezielte Untersuchung erlaubt. Bei negativer Familienanamnese müssen

andere Kriterien zur Diagnostik herangezogen werden. Erste Hinweise auf das

Vorliegen einer MD vom Gliedergürteltyp können eine eher proximal betonte

Schwäche der Muskulatur ohne Gesichtsmuskelbeteiligung und eine erhöhte

CK sein, wobei die CK im frühen Stadium der Erkrankung höher ist, als bei

Rollstuhlpflichtigkeit. Dann kann sie annähernd normale Werte erreichen

(Urtasun et al., 1998). Das Erstmanifestationsalter (EA) kann Aufschluß darüber

geben, ob es sich möglicherweise um eine Dystrophinopathie (EA <10 Jahre)

oder aber z.B. um eine Calpainopathie (EA >10 Jahre) handelt. Dieses

Kriterium kann allerdings nur grob richtungsweisend sein, genauere Aussagen

sind nur durch eine Muskelbiopsie mit anschließender histopathologischer und

immunhistochemischer Untersuchung möglich. Abschließend bleibt noch die

Möglichkeit der molekulargenetischen Analyse. Abbildung 1.7 zeigt ein

planvolles diagnostisches Vorgehen bei der Verdachtsdiagnose einer

autosomal-rezessiven Gliedergürtel-MD.

Einleitung 16

Abbildung 1.7. Fließdiagramm zur Strategie der Mutationsanalyse bei autosomal-rezessiven Gliedergürtel-Muskeldystrophien mit Hilfe der Immunhistochemie (modifiziert nach Pogue et al., 2001). Abkürzungen: CAPN3, Calpain 3; DYSF, Dysferlin; SGC, Sarkoglykan(e).

Muskelbiopsat eines Patienten mit unbekannter

Erkrankung

Immunhistochemische Analyse der Biopsie

Dystrophin normal

Erniedrigtes Dystrophin

Achtung! Dystrophin kann auch bei SCG

vermindert sein

CAPN3 vermindert oder

fehlend

DYSF vermindert oder

fehlend Abnormes SGC Profil

Wenn keine Dystrophin-

Mutation, SGC bedenken

Achtung! CAPN3 kann in

Dysferlinopathien vermindert sein

Untersuchung des DYSF notwendig

Mutationsunter-suchung im DYSF Gen

Alle Proteine variabel oder

SGCα besonders niedrig

SGCγ fehlend, anderen Proteine

variabel

Alle Proteine

vemindert

Gezielte Untersuchung

SGCα

Gezielte Untersuchung

SGCγ

Gezielte Untersuchung SGCβ, dann

SGCδ

Wenn keine Mutation gefunden wird, Untersuchung der anderen SGC, z.B.

SGCβ, SGCζ

Einleitung 17

1.5.3 Therapiemöglichkeiten bei MD

Bisher gibt es leider noch kein einziges Medikament, das auf lange Zeit

gesehen die Krankheit aufhalten kann. Zur Verlangsamung der

Progressionsrate können zu Beginn Steroide eingesetzt werden, deren Wirkung

aber nur begrenzt ist (Wong and Christohper, 2002). Da also zur Zeit noch

keine kausale Therapie möglich ist, beschränken sich die Möglichkeiten auf

eine rein symptomatische Therapie. Dort ist in erster Linie die

Krankengymnastik zu erwähnen. Zur Kräftigung der Muskulatur eignen sich

isometrische Spannungsübungen und zur Vorbeugung von Gelenkkontrakturen

passives Durchbewegen. Daneben gibt es noch operative Maßnahmen, wie

z.B. Sehnenverlängerungen oder frühzeitige Stabilisierung der Wirbelsäule bei

progredienter Skoliose. Zusätzlich ist die Aufklärung über spezielle Hilfsmittel

sinnvoll, da sie die Lebensqualität der Patienten erheblich steigern können.

Dazu gehören z.B. Hilfen für Toiletten- und Badbenutzung, die Bereitstellung

eines Rollstuhls und eventuell das Anpassen eines Korsetts zur Unterstützung

der Wirbelsäule (Gleixner et al., 1999). Zur muskelaufbauenden Therapie

können noch Vitamin E und Kreatinmonohydrat verordnet werden (Walter et al.,

2000; Backman and Henriksson, 1990).

1.6 Die Geschichte der Erkrankung: Réunion Paradox Das CAPN3-Gen konnte erstmals durch Untersuchungen in einer kleinen

geographisch isolierten Population von der Insel La Réunion dem Chromosom

15q zugeordnet werden (Beckmann et al, 1991). Auf der Basis von

genealogischen Untersuchungen betrachtete man die LGMD

Familienstammbäume als eine Großfamilie mit vielen blutsverwandten

Verbindungen, die ursprünglich alle von einem einzigen gemeinsamen

Vorfahren abstammen (Beckmann, 1996). Daher ging man davon aus, daß die

Patienten aus einer genetisch homogenen, isolierten Population stammen.

Diese Annahme war die Basis für die Aufnahme der genetischen

Untersuchungen der erkrankten Patienten. Man erwartete, daß diese Patienten

alle dieselbe LGMD2A-Mutation tragen, die von dem Vorfahren stammt, der

Einleitung 18

ungefähr um 1670 auf die Insel einwanderte (Richard et al., 1996).

Unerwarteterweise konnten aber sechs verschiedene Mutationen dargestellt

werden, was zu der Bezeichnung „Réunion Paradox“ führte. Es gab

verschiedene Erklärungsversuche, u.a. daß die bisher als monogen vererbbar

betrachtete Krankheit in Wirklichkeit auf einem digenischen Vererbungsmodus

beruht, wie er von Kajiwara et al. (1994) für die ophthalmologische Erkrankung

Retinitis pigmentosa beschrieben wurde. Dann würde ein bisher noch nicht

identifiziertes modulierendes Gen darüber entscheiden, ob eine CAPN3-

Mutation zu einem LGMD2A Phänotyp führt oder nicht. Zur Klärung dieses

Phänomens bedarf es noch weiterer Untersuchungen.

1.7 Zielsetzung der Arbeit Das Ziel der Arbeit bestand in der molekulargenetischen Untersuchung des

CAPN3-Gens bei einem Kollektiv von 34 Patienten, bei denen klinisch und/oder

immunhistochemisch der Verdacht auf eine Calpainopathie geäußert wurde.

Dazu war folgende Vorgehensweise erforderlich:

1) Präparation der Patienten- und Kontroll-DNA;

2) Etablierung der Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Bedingungen für die

verschiedenen Oligonukleotid-Systeme (24 Exons);

3) Suche nach Restriktionsenzymen zur Herstellung geeigneter

Fragmentlängen der PCR-Produkte;

4) Durchführung der PCR-Reaktionen;

5) Darstellung von Mutationen bzw. Polymorphismen mittels single strand

conformation polymorphism- (SSCP-) Methode und/oder denaturing high

performance liquid chromatography- (DHPLC-) Methode;

6) DNA-Sequenzanalyse der jeweiligen DNA-Fragmente bei Auffälligkeiten

in den SSCP- bzw. DHPLC-Verfahren.

Material und Methoden 19

2. Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Untersuchungsgruppe und DNA-Proben

Zur molekulargenetischen Untersuchung des CAPN3-Gens standen insgesamt

34 Patienten, die vorwiegend aus dem kaukasischen Raum stammen, zur

Verfügung (Tab. 2.1). Zum großen Teil wurden die Blutproben von der

Neurologischen Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital aus

der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. med. Wilhelm Mortier und der Neurologischen

Klinik Bergmannsheil aus der Arbeitsgruppe von Dr. med. Matthias Vorgerd zur

Verfügung gestellt. Zusätzlich wurden von vier Patienten Blutproben von

Angehörigen geschickt. Aus allen erhaltenen Blutproben wurde daraufhin DNA

nach den unten beschriebenen Methoden isoliert.

Tabelle 2.1. Patientenkollektiv (* = Familienangehörige von Indexpatienten)

Patienten-Nummer Geschlecht Geburtsdatum Familienangehörige

7 w 02.03.1953 14 w 10.03.1953 15 m 01.05.1979 32 19 w 18.10.1985 88, 89 20 m 13.01.1996 21 w 11.05.1947 22 w 19.10.1989 23 m 05.12.1997 24 m 29.08.1985 25 w 02.11.1992 26 w 19.04.1985 27 w 28.03.1995 28 w 13.08.1981 29 m 17.02.1971 30 30 w 25.04.1976 29 31 m 10.08.1949 80 32 m 01.01.1986 15 33 w 15.01.1985 39 34 w 18.01.1968 36 w 03.06.1981 37 w 01.11.1964 38 w 02.11.1978 39* w 31.10.1979 33 40 w 08.10.1977 41 m 27.10.1961 43 m 21.08.1941 46 w 23.05.1996 126 49 m 12.02.1983


Fortsetzung Tabelle 2.1. Patientenkollektiv

Patienten-Nummer Geschlecht Geburtsdatum Familienangehörige

55 m 14.08.1960 57 w 28.12.1993 68 m 09.10.1969 75 w 22.11.1985 130, 131 76 m 29.05.1949 80* w 07.02.1922 31 88* m 25.10.1961 19, 89 89* w 26.01.1961 19, 88 118 w 06.08.1962 126* m 10.10.1997 46 130* w 12.12.1950 75, 131 131* m 06.05.1948 75, 130

2.1.2 Oligonukleotide

Für die Polymerase-Kettereaktion (PCR) werden als Startermoleküle

einzelsträngige Desoxyribo-Oligonukleotide (Primer) von einer durch-

schnittlichen Länge von 18-24 bp benötigt. Die in dieser Arbeit benutzten

Oligonukleotide wurden in einer Konzentration von 100 pmol/µl von der Firma

Metabion bezogen.

Die Primerpaare (Tab. 2.2) wurden, soweit sie nicht aus der Literatur

übernommen werden konnten (Richard et al., 1995), mit dem Programm

Primer-Express™ 1.5a entworfen. Die Bindungsstellen für die Oligonukleotide

zur Amplifikation von genomischer DNA wurden nach Möglichkeit so gewählt,

daß die Untersuchung sowohl der kodierenden Sequenz als auch der

intronischen spleißaktiven Stellen möglich war.


Tabelle 2.2. Oligonukleotidpaare zur Amplifikation der genomischen CAPN3-DNA

Bezeichnung Sequenz (5'→3') Amplifizierte Region

Amplikongröße (bp) Referenz

CAPN3-P1-F AGT GTG CAG GTA GAG ACA GGG AT Promotor 413 eigene Daten

CAPN3-P1-R GAA CCT GGC TAG GGA CAT TTC 5’ UTR

CAPN3-P2-F AGC AGT TCT CAG CTT CTT TCC 542 eigene Daten

CAPN3-P2-R AGA TGC GCT AAT GAC GGT C

CAPN3-Ex1-F CTT TCC TTG AAG GTA GCT GTA T Exon 1 438 Richard (1995)

CAPN3-Ex1-R GAG GTG CTG AGT GAG AGG AC

CAPN3-Ex2-F ACT CCG TCT CAA AAA AAT ACC T Exon 2 239 Richard (1995)

CAPN3-Ex2-R ATT GTC CCT TTA CCT CCT GG

CAPN3-Ex3-F TGG AAG TAG GAG AGT GGG CA Exon 3 354 Richard (1995)

CAPN3-Ex3-R GGG TAG ATG GGT GGG AAG TT

CAPN3-Ex4-F GAG GAA TGT GGA GGA AGG AC Exon 4 292 Richard (1995)

CAPN3-Ex4-R TTC CTG TGA GTG AGG TCT CG

CAPN3-Ex5-F GGA ACT CTG TGA CCC CAA AT Exon 5 325 Richard (1995)

CAPN3-Ex5-R TCC TCA AAC AAA ACA TTC GC

CAPN3-Ex6-F GTT CCC TAC ATT CTC CAT CG Exon 6 315 Richard (1995)

CAPN3-Ex6-R GTT ATT TCA ACC CAG ACC CTT

CAPN3-Ex7-F AAT GGG TTC TCT GGT TAC TGC Exon 7 333 Richard (1995)

CAPN3-Ex7-R AGC ACG AAA AGC AAA GAT AAA

CAPN3-Ex8-F GTA AGA GAT TTG CCC CCC AG Exon 8 321 Richard (1995)

CAPN3-Ex8-R TCT GCG GAT CAT TGG TTT TG

CAPN3-Ex9-F CCT TCC CTT CTT CCT GCT TC Exon 9 173 Richard (1995)

CAPN3-Ex9-R CTC TCT TCC CCA CCC TTA CC

CAPN3-Ex10-F CCT CCT CAC CTG CTC CCA TA Exon 10 251 Richard (1995)

CAPN3-Ex10-R TTT TTC GGC TTA GAC CCT CC

CAPN3-Ex11-F TGT GGG GAA TAG AAA TAA ATG G Exon 11 355 Richard (1995)

CAPN3-Ex11-R CCA GGA GCT CTG TGG GTC A

CAPN3-Ex12-F GGC TCC TCA TC TCA TTC ACA Exon 12 312 Richard (1995)

CAPN3-Ex12-R GTG GAG GAG GGT GAG TGT GC

CAPN3-Ex13-F TGT GGC AGG ACA GGA CGT TC Exon 13 337 Richard (1995)

CAPN3-Ex13-R TTC AAC CTC TGG AGT GGG CC

CAPN3-Ex14-F CTC CTG CTT GCT TCT GGT GA Exon 14 204 eigene Daten

CAPN3-Ex14-R CCC AGA CTC CCA TTC CCT C

CAPN3-Ex16-F CCG CCT ATT CCT TTC CTC TT Exon 16 331 Richard (1995)

CAPN3-Ex16-R GAC AAA CTC CTG GGA AGC CT

CAPN3-Ex17-F CAG GCC TGT GCA CCT CTG Exon 17 255 eigene Daten

CAPN3-Ex17-R CCC TGG CTC CAC CAA AGT

CAPN3-Ex18-F CAT AAA TAG CAC CGA CAG GGA Exon 18 258 Richard (1995)

CAPN3-Ex18-R GGG ATG GAG AAG AGT GAG GA


Fortsetzung Tabelle 2.2. Oligonukleotide

Bezeichung Sequenz (5’→3’) Amplifizierte Region

Amplikongröße (bp) Referenz

CAPN3-Ex19-F TCC TCA CTC TTC TCC ATC CC Exon 19 159 Richard (1995)

CAPN3-Ex19-R ACC CTG TAT GTT GCC TTG G

CAPN3-Ex20-F GGG GAT TTT GCT GTG TGC TG Exon 20-21 333 Richard (1995)

CAPN3-Ex20-R ATT CCT GCT CCC ACC GTC TC

CAPN3-Ex22-F CAC AGA GTG TCC GAG AGG CA Exon 22 282 Richard (1995)

CAPN3-Ex22-R GGA GAT TAT CAG GTG AGA TGC C

CAPN3-Ex23-F CAG AGT GTC CGA GAG GCA GGG Exon 22-23 608 Richard (1995)

CAPN3-Ex23-R CGT TGA CCC CTC CAC CTT GA

CAPN3-Ex24-F TTG CCC CGT AAG ATT CCT AGG Exon 24 155 eigene Daten

CAPN3-Ex24-R TGA AAT CCT GAG TGA TCC TGC A

2.1.3 Chemikalien

Aceton (Merck); Acetonitril (Baker); Acrylamid (Fluka); Äthanol (Riedel); AG-

801-x8 (Biorad); Agarose (Gibco); Ammoniumpersulfat = APS (Baker);

Borsäure (Baker); Bromphenolblau (Merck); Chloroform (Merck);

Dichlordimethylsilan (Merck); Desoxyribonukleotid-Triphosphate / dNTP (MBI):

dATP, dCTP, dGTP, dTTP; Dimethylsulfoxid = DMSO (Sigma); Ethidiumbromid

(Sigma); Ethylen-N,N,N’,N’-Tetraessigsäure-Dinatriumsalz = EDTA (Merck);

Ficoll® 400 (Pharmacia); Formaldehyd (Baker); Formamid (Baker); Glycerin

(Riedel); Harnstoff (Baker); Isoamylalkohol (Riedel); Isopropanol (Riedel);

Magnesiumchlorid = MgCl2 (Merck); Mineralöl (Sigma); N,N,N’,N’-

Tetramethylethylendiamin = TEMED (Riedel); N,N,N-Methylenbisacrylamid

(Fluka); Natriumacetat = NaAc (Riedel); Natriumchlorid = NaCl (Riedel);

Natriumdodecylsulfat = SDS (Biomol); Natriumhydroxid = NaOH (Riedel);

Nonidet P40 = NP 40 (Fluka); Phenol (Riedel); Polyoxy-ethylen(20)-

sorbitanmonolaurat = Tween 20 (Sigma); Salzsäure = HCl (Baker);

Triethylammonium-Kationen = TEAA (Transgenomic); Trishydroxymethyl-

aminomethan = Tris (Biomol); Xylencyanol FF (Biorad); Xylol (Baker)


2.1.4 Lösungen

Es wurde immer bidestilliertes Wasser verwendet, und die Lösungen wurden

nach Bedarf autoklaviert.

Agarosegel-Ladepuffer 0,25% Bromphenolblau

0,25% Xylencyanol FF

15% Ficoll® 400

APS-Lösung: 10% (w/v) (NH4)2S2O8

DHPLC-Lösungen:

Puffer A: 5% 2 M TEAA

0,025% Acetonitril

94,975% HPLC-Wasser

Puffer B: 5% 2 M TEAA

25% Acetonitril

70% HPLC-Wasser

Säulen-Wasch-Puffer: 75% Acetonitril

25% HPLC-Wasser

Nadel-Wasch-Puffer: 8% Acetonitril

92% HPLC-Wasser

Detergenzien: 0,1% NP 40

10% SDS

Ethidiumbromid-Lösung: 0.5% (w/v) Ethidiumbromid

Ficoll-Lösung: 5 g Ficoll® 400

500 ml A. bidest


PAA-Stammlösung (40% (w/v)): 38% (w/v) Acrylamid

2% (w/v) Bisacrylamid

99% (w/v) Acrylamid


PAA-Stammlösung (30% (w/v)): 29% (w/v) Acrylamid


Oligonukleotid-Primer: 10 pM/µl in H2O

PBS-Puffer (Stammlösung): 8 g NaCl; 0,2 g KCl

1,44 g Na2HpO4;

0,24 g KH2PO4;

800 ml A. bidest

mit HCl auf pH 7,4

ad A. bidest auf 1 l

autoklavieren für 20 min

PCR-Lösungen:

GC-Puffer: 160 mM (NH4)2SO4

670 mM Tris/HCl (pH 8,8)

0,1% Tween-20

MgCl2-Lösung: 50 mM MgCl2

dNTP-Lösung: je 2 mM dATP, dCTP, dGTP,

dTTP in H2O

Proteinase K-Puffer: 20 mM Tris/HCl (pH 7,4)

4 mM EDTA

100 mM NaCl


Silanisierungslösung: 5% (v/v) Dichlordimethylsilan

in Chloroform

SSCP-Ladepuffer: 0,02% Bromphenolblau

0,02% Xylencyanol FF

10 mM NaOH

20 mM EDTA/AG-801-x8

deionisiertes Formamid

STE-Puffer (TEN) pH 8,0: 10 mM Tris/HCl (pH 8,0)

1 mM EDTA

0,1 M NaCl

TAE-Gelelektrophorese-Laufpuffer (1x): 0,04 M Tris-Acetat

0,001 M EDTA

TBE-Gelelektrophorese-Laufpuffer (1x): 89 mM Tris

89 mM Borsäure

2 mM EDTA

TE-Puffer (1x) pH 8,0: 10 mM Tris/HCl (pH 8,0)

10 mM EDTA

2.1.5 DNA-Größenstandards

GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder Plus, ready-to-use (MBI Fermentas)

Fragmentlängen (bp): 3000, 2000, 1500, 1200, 1031, 900, 800, 700,

600, 500, 400, 300, 200, 100

pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker (MBI Fermentas)

Fragmentlängen (bp): 501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110,

67, 34, 26


2.1.6 Radioisotope

[α32P]dATP (370 MBq/ml, 10 mCi/ml; > 6000 Ci/mmol, ca. 220 TBq/mmol)

[α32P]dCTP (370 MBq/ml, 10 mCi/ml; >3000 Ci/mmol, ca. 110 TBq/mmol)

(alle Hartmann)

2.1.7 Enzyme

Thermo Sequenase II DNA polymerase (Amersham)

BioTherm Taq-DNA-Polymerase (Genecraft)

Thermolase (MB Enzymes GmbH)

HotStarTaq™DNAPolymerase (Qiagen)

Proteinase K (Merck)

Restriktionsendonukleasen

Bsp1407I, BsurI, MvaI (MBI)

HinfI, NlaIII, TaqI (NEB)

2.1.8 Kits

DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham)

GFX™PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham)

2.1.9 Röntgenfilme

Hyperfilm™ MP (Amersham)


2.1.10 Sonstige Verbrauchsmaterialien

GB002-Papier (Schleicher & Schuell)

Formamid Loading Dye für Sequenziergele (Amersham)

Mikrotiter-Platten und -Deckel (Thermowell Costar)

Reagiergefäße (500 µl, 1500 µl, 2000 µl) (Sarstedt)

Vacutainer SST-Glas (Beckton Dickinson)


2.2 Methoden Aus den zur Verfügung gestellten Blutproben wurde DNA isoliert und ihre

Konzentration und Reinheit bestimmt, um dann anschließend bestimmte DNA-

Abschnitte mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren. Diese

PCR-Produkte wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

untersucht (Exon 1-12, 14-16, 18 und 19) und Proben mit auffälligem

elektrophoretischem Verhalten mit der nichtradioaktiven Sequenzanalyse nach

Sanger et al. (1977) sequenziert. Um die Sensitivität der Mutationssuche zu

steigern, wurden Exons 1-24 und Bereiche des Promotors ergänzend und

vergleichend mittels der DHPLC-Methode (denaturierende

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) dargestellt.

2.2.1 DNA-Isolierung aus EDTA-Blut Aus den Blutproben wurden je 2-5 ml eingesetzt und mit bidestilliertem Wasser

auf ein Volumen von 45 ml gebracht. Anschließend wurden das Blut durch

intensives Schütteln hämolysiert. Durch eine 15minütige Zentrifugation bei

3.300 x g und 4°C wurden die kernhaltigen Leukozyten sedimentiert, das

entstandene Sediment zwecks Lyse der Zellmembran in 20-30 ml 0,1%igem

NP40 resuspendiert und schließlich die so freigewordenen Zellkerne wie oben

beschrieben abzentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes wurden die

Kernmembranen durch Aufnahme in 3 ml TEN und 200 µl 10%igem SDS

aufgebrochen, dann die freigewordenen Proteine durch Zugabe von 100 µl

Proteinase K (10 mg/ml) bei 55°C über Nacht verdaut und nach einstündiger

Inkubation bei 4°C durch Zugabe von 1ml gesättigter NaCl-Lösung ausgesalzt.

Das Präzipitat wurde durch abermalige 15minütige Zentrifugation bei 3.300 x g

und 4°C sedimentiert und der Überstand in 8 ml Äthanol (abs.) aufgenommen.

Nach weiteren 15 Minuten konnte dann die ausgefällte DNA in 70%igen Äthanol

überführt und danach abzentrifugiert werden. Anschließend wurde sie

getrocknet, in 200 µl TE-Puffer aufgenommen und schließlich über Nacht durch

Inkubation bei 37°C gelöst.


2.2.2 Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration und -Reinheit Der Nukleinsäuregehalt und die Reinheit einer Probe können durch eine

spektralphotometrische Messung im UV-Bereich bestimmt werden. Hierbei wird

die Absorption bei 260 nm und 280 nm gemessen. Die optische Dichte einer

Nukleinsäurelösung bei 260 nm (OD260) ist ein Maß für die Konzentration an

Nukleotiden. Die OD280 gibt Hinweise über die Verunreinigung mit Proteinen.

Die Extinktion sollte bestimmte Grenzwerte nicht über- bzw. unterschreiten, da

sonst keine lineare Abhängigkeit der Absorption bei 260nm zur

Nukleinsäurekonzentration gegeben ist. Eine optische Dichte von 1 entspricht

bei 260 nm 50 µg/ml dsDNA. Der Quotient OD260/OD280 sollte zwischen 1,7 und

2,0 liegen. Die Absorption der Proben wurde an einem Eppendorf

BioPhotometer in Eppendorf Küvetten gemessen.

Berechnung von Nukleinsäurekonzentrationen bzw. Verunreinigungen:

Konzentration: DNA [ng/µl] = OD (260 nm) x Verdünnungfaktor x 50 µg Verunreinigung: 1) Proteine, Polysaccharide: OD (260 nm) / OD (280 nm) 2) Salze: OD (260 nm) / OD (230 nm)

2.2.3 Phenol/Chloroform-Extraktion

Sofern der Reinheitsgrad (DNA/Protein-Verhältnis) der nach dem unter 2.2.1

beschriebenen Verfahren gewonnenen DNA nicht ausreichend war, wurde die

DNA-Lösung einer Phenol/Chloroform-Extraktion unterzogen, um eventuell

vorhandene Inhibitoren der Polymerase-Kettenreaktion zu entfernen. Hierzu

wurde die DNA-Lösung mit TE-Puffer auf ein Volumen von 2 ml verdünnt, in

einem SST-Glas mit identischem Volumen Phenol/Chloroform versetzt und das

Gemisch durch 10minütiges Schütteln emulgiert. Nach 10minütiger

Zentrifugation bei 1800 x g war die wässrige, DNA-haltige von der organischen

Phase getrennt, das restliche Phenol wurde durch Zugabe von 2 ml

Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und die wässrige Phase dem SST-Glas

entnommen. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M NaAc (pH


4,5) und 2,5 Volumen Äthanol (abs.) gefällt, abzentrifugiert, mit 70%igem

Äthanol gewaschen, getrocknet und in 200 µl TE-Puffer aufgenommen.

2.2.4 Amplifikation von DNA-Abschnitten mit der Polymerase-Kettenreaktion

- Ansatz für eine PCR (10 µl):

genomische DNA 50 – 300 ng

Primer (Vorwärts) 0,4 µM

Primer (Rückwärts) 0,4 µM

dNTP 2 mM

GC-Puffer 1x

MgCl2 0,75 - 2,25 mM

Taq-DNA-Polymerase 0,5 units

- gegebenenfalls:

DMSO 5 -10% (v/v)

Formamid 2% (v/v)

- Ansatz für eine radioaktive PCR: 0,037 MBq[α-32P]dCTP/dATP

zusätzlich

Um eine hohe Spezifität der PCRs zu erreichen, wurde mit geringen MgCl2-

Konzentrationen (0,75 – 2,50 mM) gearbeitet. Auf den Einsatz von PCR-

Stringentien, wie Formamid oder DMSO, wurde, wenn möglich, verzichtet. Die

Schmelztemperatur für die Oligonukleotide wurde anhand der Formel TM = 4°C

x (G+C) + 2°C x (A+T) berechnet. Bei einer experimentell ermittelten optimalen

spezifischen Annealing-Temperatur ϑs wurden 30 – 35 PCR-Zyklen

durchgeführt. in denen sich das in den vorhergehenden wenigen Zyklen

entstandene Produkt nahezu exponentiell vermehrte (Saiki et al., 1988). Die zu

wählende Anzahl der Zyklen war dabei abhängig vom Auftreten unspezifischer


Nebenbanden. Das in der Arbeit verwendete Programmprofil für die

Amplifikation der DNA zeigen die Tabellen 2.3 und 2.4.

Tabelle 2.3. PCR-Programm für Amplifikation von DNA mit BioTherm Taq-DNA-Polymerase / Thermolase

Zyklen Temperatur Dauer Reaktion 1x 94°C 4 min Denaturierung

94°C 10 sec Denaturierung

30 - 35x ϑs 10 sec Primer-Anlagerung

72°C 10 sec Extension

1x 72°C 5 min Extension

1x 4°C bis zur Entnahme Abkühlung

Tabelle 2.4. PCR-Programm für die PCR mit HotStarTaq

Zyklen Temperatur Dauer Reaktion 1x 95°C 15 min Initiale Aktivierung

94°C 10 sec Denaturierung

30 - 35x ϑs 10 sec Primer-Anlagerung

72°C 10 sec Extension

1x 72°C 10 min Extension

1x 4°C bis zur Entnahme Abkühlung

Die Reaktionen wurden in Thermowell™ 96-Loch-Platten in einer Perkin Elmer

9600-PCR-Maschine (PE Biosystems) durchgeführt.


Tabelle 2.5. Optimale PCR-Bedingungen

PCR-System (Exon)

MgCl2 [mM] DMSO Formamid Annealing-Temperatur

[°C] Promotor 1 0,75 - - 58

Promotor 2 0,75 - - 53

1 0,75 5% - 55

2 2,25 - 2% 55

3 2,25 10% 57

4 1,25 - 2% 57

5 1,25 - - 53

6 1,25 - - 55

7 0,75 5% - 51

8 1,75 - - 55

9 1,25 - - 57

10 2,25 5% - 57

11 0,75 5% - 55

12 0,75 5% - 59

13 0,75 5% - 59

14 1,25 10% - 58

15 1,25 - 2% 57

16 0,75 - 2% 55

17 0,75 - 2% 57

18 1,25 5% - 57

19 1,25 5% - 55

20-21 2,25 10% - 57

22 1,25 5% - 59

22-23 1,25 - 2% 59

24 1,25 - 2% 59


2.2.5 Spaltung von PCR-Produkten mittels Restriktionsendonukleasen Für die unter 2.2.7 beschriebene SSCP-Gelanalyse sollten die PCR-Produkte

eine Länge von 250 bp möglichst nicht überschreiten, da mit zunehmender

Größe der Produkte die Sensitivität der Methode abnimmt (Jäckel et al., 1998;

Hayashi, 1992; Sheffield et al., 1993). War ein Produkt größer als 250 bp, so

wurde es mittels Restriktionsendonukleasen vom Typ II möglichst asymmetrisch

geschnitten (Tab. 2.6). Die Bedingungen für Reaktionsmedium,

Inkubationstemperatur und -zeit wurden nach Angaben des Herstellers gewählt.

Inkubationsansatz für die Restriktion:

PCR-Produkt 10 µl

Enzym 2 units

Puffer 1x

Aqua bidest ad 25 µl

Tabelle 2.6. Benutzte Restriktionsendonukleasen

PCR-System Restriktionsenzymverdau

Exon Enzym Fragmentlängen (bp)

1 TaqI 225 + 213

3 NlaIII 204 + 150

5 Bsp1407I 150 + 177

6 MvaI 150 + 90 + 75

7 BsuRI 150 + 108 + 75

8 HinfI 246 + 75

11 HinfI 234 + 150

12 HinfI 256 + 75

16 HinfI 181 + 150

Die Exons 2, 4, 9, 10, 15, 18 und 19 wurden unverdaut analysiert.


2.2.6 Agarose-Gelelektrophorese Die PCR-Produkte wurden je nach Größe auf 1-1,5%igen (w/v) Agarosegelen

mit 1xTBE oder 1xTAE als Puffer elektrophoretisch aufgetrennt. Zwecks

Kontrolle der Laufgeschwindigkeit der aufgetragenen DNA-Proben wurden dem

Ladepuffer Bromphenolblau und Xylenxyanol zugesetzt. Zur Anfärbung der

Fragmente enthielt das Gel 1% (v/v) 10 mg/ml Ethidiumbromid. Je nach

Gelgröße variierte die angelegte Spannung zwischen 80-200 V. Nach

Beendigung des Gellaufs wurden die Fragmente unter UV-Licht (260 nm)

analysiert. Gegebenenfalls konnten zusätzlich Photographien angefertigt

werden. Die Abschätzung der DNA-Längen und -Mengen erfolgte anhand des

Vergleichs mit den im Gel aufgetragenen Größenstandards.

2.2.7 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) zur Analyse von SSCP Anders als bei Agarosegelen können mit Polyacrylamid-(PAA)-Gelen DNA-

Fragmente, die kleiner als 250 bp sind, sequenzspezifisch durch

Elektrophorese sehr hoch aufgelöst werden. Hierbei werden denaturierte PCR-

Produkte in einem nicht denaturierenden PAA-Gel aufgetrennt, wobei

Unterschiede im Laufverhalten der Einzelstränge auf Konformationsänderungen

in der Sekundärstruktur zurückzuführen sind, die auf Sequenzabweichungen

beruhen (SSCP, single strand conformation polymorphism, Spinardi et al.,

1991).

Die Gele wurden nach Vorschriften von Sambrook et al. (1989) erstellt, die

Auftrennung erfolgte in vertikalen Elektrophorese-Systemen (BaseAce

Sequencer, Stratagene; SQ3 Sequencer, Hoefer™).

Für die PAGE-Analyse wurden die radioaktiv-markierten PCR-Ansätze 1:1 bis

1:2,5 mit SSCP-Ladepuffer verdünnt, der zur Abschätzung der

Laufgeschwindigkeit verschiedene Farbstoffe enthielt. Anschließend wurden die

PCR-Ansätze 5 Minuten bei 95°C denaturiert und sofort auf Eis gekühlt, um

eine Renaturierung zu Doppelsträngen weitgehend zu verhindern. Dann wurden

je Ansatz 2,5 µl auf ein PAA-Gel aufgetragen. Nach Beendigung eines Laufes,

der 3-7 Stunden dauern konnte, wurde ein Gel auf GB002-Papier gezogen, auf


einem Gel Dryer Model 583 (Biorad) bei 80°C unter Vakuum getrocknet und

schließlich das Ergebnis durch Autoradiographie dokumentiert, wobei die

Expositionsdauer zwischen 1-7 Tagen variierte.

Alle Systeme liefen unter zwei verschiedenen Gelzusammensetzungen

(Bedingung I und IV), die jeweils eine andere Umgebungstemperatur und

elektrische Leistung benötigten (Tab. 2.7).

Tabelle 2.7. Gelzusammensetzungen und Laufbedingungen

Bedingung I Bedingung IV

40% PAA [%(w/v)] 15 (2:38) 12,5 (1:99)

Glycerin [%(w/v)] 10 10

10x TBE [%(w/v)] 5 10

Elektr. Leistung [W] 55 35

Temperatur [°C] 4 Raumtemperatur

2.2.8 DNA-Isolierung aus Agarosegelen

Zur effizienten Aufreinigung von spezifischen PCR-Produkten wurden

Bandenelutionen aus einem 1,5%igen (w/v) Agarosegel mit TAE-Puffer

durchgeführt. Damit erreichte man, daß eventuelle Nebenprodukte und

Primermoleküle vom PCR-Produkt getrennt wurden. Dazu wurden 70-80 µl

PCR-Produkt auf das Gel mit EtBr aufgetragen, elektrophoretisch aufgetrennt

und auf einem UV-Transilluminator mit dem Skalpell ausgeschnitten. Die

Isolierung der DNA aus der Agarose erfolgte mit Hilfe des GFX™PCR DNA and

Gel Band Purification Kit (Amersham) nach den Empfehlungen des Herstellers.

Das eluierte und getrocknete PCR-Produkt wurde in 30 µl sterilem Aqua bidest

aufgenommen. Zur Überprüfung der Qualität des PCR-Produktes wurden 3 µl

auf ein EtBr-haltiges Agarosegel aufgetragen und anhand eines aufgetragenen

Markers bekannter Quantität wurde die Menge abgeschätzt.


2.2.9 Nichtradioaktive Sequenzanalyse

Die nichtradioaktive Sequenzanalyse von PCR-Produkten erfolgte mit einem

ABI PRISM™ 377 DNA-Sequencer (PE Applied Biosystems). Die Apparatur

besteht aus einem Elektrophorese-Modul und einer Analyseeinheit (Power

Macintosh G3, ABI Prism™ 377-96 DNA Sequencer Collection Program). Für

die Sequenzierung nach dem Kettenabbruch- oder Didesoxynukleotidverfahren

nach Sanger et al. (1977) wird das zu analysierende DNA-Fragment in eine

einzelsträngige Form überführt. Durch den Einsatz eines bestimmten

Mischverhältnisses aus Desoxynukleotiden und fluoreszenzmarkierten

Didesoxynukleotiden, einer hitzestabilen DNA-Polymerase und spezifischen

Sequenzierprimern kommt es statistisch zu einem Kettenabbruch an jeder Base

des Fragments. Für die direkte Sequenzierung hat sich das cycle sequencing

als effiziente Methode erwiesen.

Sequenzierreaktion (cycle sequencing):

Als Matrizen für die Sequenzierreaktion dienten nichtradioaktive PCR-Produkte,

die durch Gelextraktion von Nebenprodukten und Primermolekülen (siehe 2.2.7)

gereinigt wurden. Die Zielsequenz wurde folglich linear und nicht exponentiell

vermehrt, so daß eine genügend große Menge an DNA-Matrize in die Reakton

eingesetzt werden mußte, um in 25 Reaktionzyklen ausreichende Mengen an

fluoreszenzmarkierten Einzelstrangbrüchen zu erzielen. Die entstehenden

einzelsträngigen Produkte werden aufgrund unterschiedlicher Längen

aufgetrennt und können anhand des spezifischen Emissionslichtes der vier

verschiedenen fluoreszenzmarkierten Terminationsnukleotide, das durch einen

Laser angeregt wird, unterschieden werden.

Ansatz für eine Sequenzierreaktion: 4 µl Sequencing reagent premix (s.u.)

0,5 µl Primer (10 pmol/µl)

gereinigtes PCR-Produkt (s.u.)

auf 10 µl mit sterilem A. bidest


Sequencing reagent premix beinhaltet:

dNTP-Mix: DiDesoxy A (fluoreszenz-markiertes ddATP)

DiDesoxy C (fluoreszenz-markiertes ddCTP)

DiDesoxy G (fluoreszenz-markiertes ddGTP)

DiDesoxy T (fluoreszenz-markiertes ddTTP)

Thermo Sequenase II DNA Polymerase

Berechnung der optimalen Menge der Zielsequenz (ng):

Menge der Zielsequenz (ng) = Totale Länge der DNA (in bp) x 0,1

Für die Sequenzanalyse optimiertes Primerpaar:

CAPN3-Ex10 (Vorwärts): 5’-AAGTGACAGCGTTTGCCCTAA-3’

CAPN3-Ex10 (Rückwärts): 5’-AGGCTTCTTCTGCCCTGGAACT-3’

Die Reaktionsansätze wurden unter sterilen Bedingungen pipettiert und in einer

PCR-Maschine (Perkin Elmer 9600) nach folgendem Programm inkubiert:

Tabelle 2.8. cycle sequencing-Programm

Programm Temperatur Dauer Reaktion cycle sequencing: 95°C 20sec Denaturierung

25 Zyklen 50°C 15sec Primer-Anlagerung

60°C 60sec Extension mit Kettenabbrüchen

Lagerung 4°C bis zur Entnahme Abkühlung

Nachfolgend wurden die einzelsträngigen markierten Fragmente mit 1/10

Volumen NaAc pH 4,6 in 95% EtOH gefällt und abzentrifugiert (15 min /

14000 rpm) und der Überstand verworfen. Nach einem Waschgang mit 70 %

EtOH und Zentrifugation (1 min / 14000 rpm) wurde das Präzipitat für 2–5 min

an der Luft getrocknet. Das getrocknete Präzipitat wurde in 4 µl Formamid-

Ladepuffer aufgenommen und, um ein komplette Resuspension zu

gewährleisten, für 10-20 sec gevortext.


Sequenzier-Gelelektrophorese

Die aufgereinigten fluoreszenzmarkierten Reaktionsprodukte des cycle

sequencing wurden in einem hochreinen, stark denaturierenden PAA-Gel (4,5%

PAA 29:1, 6 M Harnstoff, 0,83x TBE, 0,6% (v/v) 10%iges APS, 0,04% (v/v)

TEMED) entsprechend ihrer Sequenzlänge auf dem ABI PRISM™ 377 DNA-

Sequencer (PE Applied Biosystems) aufgetrennt. Die durch das Laserlicht am

unteren Ende der Elektrophoresekammer angeregten Fluoreszenzmoeleküle

der markierten ddNTPs werden durch ein Photoelement erfaßt, das die

verschiedenen emittierten, monochromatischen Lichtsignale erkennt. Die Daten

werden während der Elektrophorese an den Computer übermittelt und nach

Abschluß des Gellaufs automatisch analysiert und optimiert.

2.2.10 Denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography) beruht auf dem

Prinzip der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, die bei erhöhter

Temperatur (ca. 55 bis 68°C) durchgeführt wird (Schwarzer, 2000). Es ist ein

automatisiertes Verfahren zur Mutationsdarstellung, das es ermöglicht,

Mutationen in digitalisierter Form durch ein charakteristisches Muster

darzustellen. Die Analyse wurde durchgeführt mit Hilfe des Transgenomic

WAVE® Nucleic Acid Fragment Analysis System, wie es von Kuklin et al. (1998)

beschrieben wurde. Zu Beginn dieser Methode steht die PCR-Amplifikation der

Zielsequenz. Um homozygote Mutationen aufspüren zu können, mischt man die

Amplifikate von Patienten und Kontroll-DNA. Nach einem Denaturierung-

/Renaturierungs-Prozeß, der im wesentlichen Erhitzen und Abkühlen der

vermischten DNA beinhaltet, hybridisieren die Wildtyp DNA- und die Mutanten

DNA-Fragmente (Xiao and Oefner, 2001). Es entstehen Homo- und

Heteroduplizes (Abb. 2.1), die unterschiedliche Schmelzkurven-Profilmuster

während der DHPLC-Analyse zeigen.


Abbildung 2.1. Bildung von Hetero- und Homoduplizes durch Hybridisierung

Die Trennung der Hetero- von den Homoduplizes erfolgt auf Grund der

physikalischen Veränderungen der Doppelstrang-DNA bei der

Heteroduplexbildung (Oefner and Underhill, 1995). Die hydrophobe, neutrale

Säulenmatrix (DNASep® Cartridge) besteht aus Polystyren-Divinylbenzol und

kann über das Triethylammonium-Kation (TEAA) des Eluentensystems an die

negativ geladene DNA binden. TEAA weist hierbei die Eigenschaften eines

Brückenmoleküls auf: die Alkylgruppen binden an die hydrophobe Oberfläche

der Polymermatrix, während die hydrophilen Ammonium-Kationen an die

negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA binden. Die DNA wurde durch

einen linearen Acetonitril Gradienten in 0,1 mM TEAA Puffer von der Säule

eluiert. Dieser Gradient entsteht durch das Mischen von Puffer A (0,1 mM

TEAA) und Puffer B (0,1 mM TEAA, 25% (v/v) Acetonitril). Die Temperatur des

Ofens, die entscheidend ist für die optimale Trennung der Heteroduplizes von

partiell denaturierter DNA, wurde über ein Schmelzkurven-Profil der

Zielsequenz ermittelt (Wavemaker Software 4.1., Transgenomic). Bei Ermittlung

von mehreren Schmelzdomänen mußte das DNA-Fragment bei verschiedenen

Temperaturen analysiert werden. Tabelle 2.9 zeigt die in dieser Arbeit

verwendeten Temperaturen.

A T G C A C G T A T G C

erhitzen+

abkühlen>

++ +

Wildtyp Mutant


Tabelle 2.9 Temperaturwahl zur DHPLC-Analyse

Untersuchte Region (Exon) Temperatur [°C]

Promotor 1 56,0 + 55,0

Promotor 2 58,0 + 60,0

1 59,0 + 63,0

2 57,0 + 60,0

3 61,0 + 62,5

4 61,0

5 61,7

6 60,6 + 62,0

7 62,5 + 63,5

8 62,0

9 60,5 + 63,0

10 59,0 + 65,0

11 62,0

12 58,0 + 62,5

13 62,5 + 64,0

14 60,5 + 62,5

15 57,5 + 61,0

16 62,0

17 57,0 + 61,5

18 62,0

19 63,5 + 65,0

20 + 21 60,0 + 63,0

22 61,5

23 58,5 + 61,0

24 62,0

Die von der Säulenmatrix eluierte DNA wurde von einem UV-Detektor bei

260 nm Absorption gemessen.


2.2.11 Datenbanken / Auswertung / Software

Zur Literaturrecherche, der DNA-Analyse und der Suche nach bereits

veröffentlichten Sequenzen und deren Vergleich mit den eigenen wurden

folgende Software bzw. folgende Dienste im WorldWideWeb in Anspruch

genommen:

SeqMan II DNA:

Programm zur Analyse von DNA-Sequenzierungen, das unter anderem eine

Möglichkeit eines Alignments der Elektropherogramme mit der Wildtyp-Sequenz

bietet.

PrimerExpress™ 1.5a:

Programm für das Primerdesign.

http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.html

Online Mendelian Inheritance in Man –Datenbank des National Center for

Biotchnology Information.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi

PubMed - Literatursammlung des National Center for Biotechnology

Information.

http://ncbi.nml.mih.gov/blast.cgi?Jform=1

Blast-Search – National Center for Biotechnology Information. Dieses

Programm bietet die Möglichkeit, eigene gefundene Sequenzen mit denen in

der Datenbank zu vergleichen. Die Sequenzen werden dabei in einem

aufgelisteten Alignment herausgegeben.

http://www.dmd.nl

Leiden Muscular Dystrophy Pages© (LMDp) – umfassender Überblick über MD

inklusive Mutationsdatenbank, mit weiteren Links zu entsprechenden Seiten im

Internet.


http://www.hgmd.org

HGMD®, Human Genome Mutation Database, Stenson et al., 2003 –

Suchindex für bereits veröffentlichte Mutationen.

http://genome.cse.ucsc.edu/

Human Genome Working Draft, USCE - enthält u.a. Referenzsequenzen für

das menschliche Genom.

Ergebnisse 43

3. Ergebnisse 3.1 Mutationsanalyse im CAPN3-Gen

Insgesamt wurden in den 34 untersuchten Indexpatienten acht pathogene

Mutationen nachgewiesen. Davon trat die 550delA-Mutation (184fsX36) im

Exon 4 am häufigsten auf (fünf Patienten). Weiterhin konnten 19

Sequenzabweichungen und vier derzeit nicht exakt klassifizierbare

Nukleotidveränderungen dargestellt werden. Die CAPN3-Sequenzvariationen

sind in Tab. 3.1 aufgelistet und ihre genaue Lokalisation in Abb. 3.1

wiedergegeben.

Abbildung 3.1. Schematische Darstellung der Mutationsverteilung am CAPN3-Gen und an den CAPN3-Proteindomänen. Pathogene Mutationen wurden oberhalb, Sequenzvariationen unterhalb dargestellt. Spleißstellenmutationen sind kursiv, Sequenzvariationen mit noch nicht bekannter pathophysiologischer Bedeutung mit einem Fragezeichen (?), Nukleotide mit kleinen und AS mit großen Buchstaben gekennzeichnet. Del, Deletion; dup, Duplikation; ins, Insertion.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

-52t>g-26c>g -51g>a

-56delg-56insg-56-52delg-56-53delg

F165L

550dela598-612delttctggagtgctctg

G214S

Mutationen

Sequenzvariationen

I II IS1 III IVIS2

CAPN3-Proteindomänen

-104g>c-322a>c

-408t>c-719a>t

-763c>g

Ergebnisse 44

Es ergaben sich vier verschiedene pathogene missense Mutationen:

Phe165Leu (Abb. 3.2), Gly214Ser, Trp398Ser und Arg490Trp. Nur letztere ließ

sich in homozygotem Zustand nachweisen.

Abbildung 3.2: Elektropherogramm mit Basenaustausch von C>G (Pfeil), heterozygoter Zustand (obere Sequenz = Referenz, untere Sequenz = Patient).

Daneben zeigten sich zwei frame shift Mutationen 550delA, 598-

612delTTCTGGAGTGCTCTG (Abb.3.3) und eine inframe Mutation 2313-

2316delAGAC. Die Sequenzvariation 550delA konnte sowohl in heterozygoter

(Abb. 3.4) als auch in homozygoter (Abb. 3.5) Form dargestellt werden.

Abbildung 3.3. Elektropherogramm mit 598-612delTTCTGGAGTGCTCTG (Pfeile), heterozygoter Zustand (obere Sequenz, Referenz; beide untere Sequenzen, Patient).

Abbildung 3.4. Elektropherogramm mit 550delA (Pfeil), heterozygoter Zustand (obere Sequenz, Patient; untere Sequenz, Referenz).

Ergebnisse 45

Abbildung 3.5. Elektropherogramm mit 550delA (Pfeil), homozygoter Zustand (obere Sequenz, Patient; untere Sequenz, Referenz). Abbildung 3.6. Ausschnitt aus einer SSCP-Analyse für Exon 4. Patient Nr. 31 (598-612delTTCTGGAGTGCTCTG, heterozygoter Zustand) und Patientin Nr. 33 (550delA, homozygoter Zustand) zeigen andere Bandenmuster als die übrigen Patienten

28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

Ergebnisse 46

In Intron 4 fand sich eine Spleißstellenmutation 632+1G>A, die nur auf einem

Allel nachgewiesen werden konnte (Abb. 3.7).

Abbildung 3.7. Elektropherogramm mit 632+1G>A (Pfeil), heterozygoter Zustand (obere Sequenz, Referenz; untere Sequenz, Patient).

Außerdem fanden sich insgesamt 19 verschiedene Nukleotidabweichungen,

welche über die gesamte Länge des CAPN3-Gens verteilt waren. Bei vier

Sequenzvariation (Cys328Cys, Pro345Leu, 2115+1_2115+2dupGT [Abb. 3.8]

und Ala798Glu) konnte die Frage der Pathogenität noch nicht hinreichend

beantwortet werden.

Abbildung 3.8. Elektropherogramm mit 2115+1_2115+2dupGT (Pfeil), heterozygoter Zustand (obere Sequenz, Referenz; beide untere Sequenzen, Patient).

Ergebnisse 47

Abbildung 3.9. Auszug aus einer DHPLC-Analyse. Man erkennt die unterschiedlichen Kurven für Patient Nr. 49 (2115+1_2115+2dupGT) und die der anderen Patienten.

Abbildung 3.10. Auszug aus einer DHPLC-Analyse. Patient Nr. 31 (598-612del15bp), Patient Nr. 19 (550delA, heterozygot) und Patient Nr. 24 (550delA, heterozygot) zeigen andere Kurven als die Kontrolle.

Kontrolle

Patient Nr. 49

Patient Nr. 15

Patient Nr. 24

Kontrolle

Patient Nr. 31

Patient Nr. 19

Patient Nr. 24

Ergebnisse 48

Tabelle 3.1. Die im CAPN3-Gen identifizierten Mutationen und Sequenzvariationen (IVS, Intron; *, Familienangehörige von Indexpatienten).

Exon/ Intron

Sequenz- variation

AS-Austausch

Patienten (Homozygot)

Mutation (M)/ Variation (V) Referenz

Promotor -763C>G - 37 V -

Promotor -719A>T - 20, 23, 27, 28 V -

Promotor -408T>C - 20, 23, 27, 28 V Richard et al. (1995)

Promotor -322A>C - 22, 40 V -

Promotor -104G>C - 14, 21, 37 V -

2 TGC→TGT Cys106Cys 39* V Richard et al. (1999)

IVS2 380-52T>G - 68 V -

3 TTC→TTG Phe165Leu 68 M -

3 TTC→TTT Phe165Phe 22 V Richard et al. (1999)

4 550delA 184fsX36 19, 24, 26, 68, 89*, (33) M LMDp

4 598-612delTTCT GGAGTGCTCTG ∆200-204 31 M Häffner et al.

(1998) IVS4 632+1G>A - 75, 131* M -

5 GGT→AGT Gly214Ser 57 M LMDp

5 GCA→ACA Ala236Thr 20, 27, 28 (43) V Richard et al.

(1999)

7 TGC→TGT Cys328Cys 22 V? Richard et al. (1999)

8 CCG→CTG Pro345Leu 15, 32 M? -

9 TGG→TCG Trp398Ser 75, 130* M -

IVS9 1194-26C>G - 15, 39 (32) V Richard et al.

(1999)

11 CGG→TGG Arg490Trp 19, 88* (46, 126*) M Richard et al.

(1995) IVS13 1746-20C>G - 25, 31, 80* V LMDp

IVS15 1801-51G>A - 28, 46 V -

IVS19 2115+1_+2dupGT - 49 V? LMDp

22 2313-2316delAGAC 771fsX2 57 M Richard et al. (1995)

IVS22 2380+12delA - 29, 30, 31, 48 V Richard et al. (1999)

IVS22 2381-129G>A - 76 V -

IVS22 2381-79T>C - 118, 76 V -

23 GCA→GAA Ala798Glu 118 M? Richard et al. (1999)

IVS23 2440-56delG - 31, 80* V -

IVS23 2440-56insG - 76 V -

IVS23 2440-56_-52delG - 15, 32 V -

IVS23 2440-56_-53delG - 15, 32 V -

Ergebnisse 49

3.2 Molekulargenetisch diagnostizierbare Calpainopathien Aufgrund der molekulargenetischen Untersuchungen wurde bei insgesamt

sieben Patienten (sechs nicht verwandte) eine Calpainopathie diagnostiziert

(Tab. 3.1). Bei vier Patienten wurden zwei Mutationen im heterozygotem

Zustand identifiziert. Sie sind somit compound heterozygot für diese

Erkrankung. Im einzelnen traf dies für die Patientin Nr. 19 ([550delA] +

[Arg490Trp]; HGMD®, Stenson et al., 2003), die Patientin Nr.57 ([Gly214Ser] +

[2313-2316delAGAC]; HGMD®), den Patient Nr. 68 ([Phe165Leu] + [550delA];

HGMD®) sowie die Patientin Nr.75 ([IVS4+1G>A] + [Trp398Ser]; HGMD®) zu.

Die compound-Heterozygotie wurde durch Untersuchung der elterlichen DNA

formal bei den Patienten Nr. 19 (Nr. 88 [Arg490Trp]; Nr. 89 [550delA]) und Nr.

75 (Nr. 130 [Trp398Ser]; Nr. 131 [IVS4+1G>A]) bestätigt. Bei der Patientin

Nr.33 (550delA), der Patientin Nr.46 (Arg490Trp) und bei ihrem Bruder (Nr. 126,

Arg490Trp) wurden die Mutationen im homozygoten Zustand nachgewiesen.

Bei weiteren acht Patienten war jeweils nur eine heterozygote Sequenzvariation

auf einem Allel dargestellbar (Tab. 3.1). Das sind Patienten Nr. 15 (Pro345Leu),

Nr. 22 (Cys328Cys), Nr. 24 (550delA), Nr. 26 (550delA), Nr.31 (598-612del200-

204), Nr. 32 (Pro345Leu), Nr. 49 (2115+1_2115+2dupGT) und Nr. 118

(Ala798Glu). Da zur Diagnose einer Calpainopathie aber entweder eine

Mutation im homozygoten Zustand oder aber zwei Mutationen im heterozygoten

Zustand notwendig sind, konnte zu diesem Zeitpunkt molekulargenetisch keine

eindeutige Aussage getroffen werden.

Ergebnisse 50

3.3 Korrelation der klinischen Daten mit Mutationen im CAPN3-Gen

Es lagen von 16 Patienten Ergebnisse von Westernblot-Analysen sowie von

einigen Patienten das Erstmanifestationsalter (EA) und die CK-Werte vor. Die

Westernblot-Analysen wurden in der Neurologischen Klinik für Kinder- und

Jugendmedizin im St. Josef-Hospital durchgeführt. Tab. 3.2 gibt einen Überblick

über die Ergebnisse der Mutationsdarstellung im Verhältnis zum Westernblot,

des EA und der CK-Werte.

Tabelle 3.2. Vergleich der Mutationsanalysen mit Westernblot-Ergebnissen und/oder Kreatinkinase(CK)-Werten bzw. Erstmanifestationsalter (EA) bei den Patienten, für die die Werte zum Zeitpunkt der Untersuchung vorlagen.

Weitere Erläuterungen der Zeichen: +++, normale Expression; ++, Expression gut darstellbar; +, Expression darstellbar; (+), Expression minimal nachweisbar; -, Expression nicht nachweisbar; /, Daten liegen nicht vor; ∅, keine Mutation darstellbar.

Patienten Nr.

Sequenz-abweichung Westernblot Banden CK

(U/L) EA

(Jahre) homozygotA AK Calp3d/2C4 AK Calp3c/12A2 heterozygotB 94 kD 30 kD 94 kD 60 kD

15 Pro345Leu B / / / / / 4

19 550delA B+ Arg490Trp B / / / / 152 10

20 ∅ / / + (+) / / 22 ∅ ++ (+) ++ (+) / / 23 ∅ + + + + / / 24 550delA B (+) - (+) (+) 3000 3 25 ∅ - - / / / / 26 550delA B - - - - 1030 8 27 ∅ ++ (+) ++ (+) / / 28 ∅ - - - - / / 29 ∅ - - - - / /

31 598-612del

TTCTGGAGT GCTCTG B

+ - + (+) / /

32 Pro345Leu B (+) - (+) (+) / 10 33 550delA A / / - - 4300 2 36 ∅ ++ (+) ++ (+) / / 46 Arg490Trp A / / +++ - 1640 5

49 2115+1_2115+2dupGT B - - / / 5000 2

57 2313-2316

delAGAC B + Gly214Ser B

+ (+) + (+) 600 Noch kein EA

68 550delA B + Phe165Leu B / / / / 397 25

118 Ala798Glu B / / / / / 20

Ergebnisse 51

3.4 Vergleich der SSCP-Methode mit der DHPLC-Methode

Es wurden 16 Exons sowohl mit SSCP- als auch mit der DHPLC-Methode

untersucht. Es ergaben sich bei drei Exons Abweichungen in der Detektion von

Sequenzänderungen, bei denen die DHPLC-Methode jeweils der SSCP-

Methode überlegen war. So konnten im Exon 7 eine Punktmutation

(Cys328Cys), im Intron 15 ein Einzelbasen-Austausch-Polymorphismus (1801-

51G>A) und im Intron 19 eine Duplikation von 2 bp (2115+1_2115+2dupGT) mit

der SSCP-Methode nicht dargestellt werden.

Diskussion 52

4. Diskussion 4.1 Verteilungsmuster der Mutationen

Das weite Spektrum der Mutationen, die relative Größe des CAPN3-Gens und

die Tatsache, daß die meisten Mutationen gleichmäßig über alle Exons verteilt

sind (Abb. 3.1, Tab. 3.1), erschweren die molekulargenetischen Diagnosen der

Calpainopathie. Muskelbiopsien, die mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern

mittels Westernblot auf das Vorhandensein von Calpainen untersucht werden,

können einen ersten Hinweis auf das Vorliegen einer LGMD2A liefern. Der sog.

Goldstandard in der Diagnosesicherung liegt allerdings in der Darstellung einer

Mutation im CAPN3-Gen. Demzufolge müssen alle 24 Exons untersucht

werden, es sei denn, man hat Hinweise auf eine familiär vorkommende

Mutation, was in der vorliegenden Arbeit nicht der Fall war. Es ergaben sich

mehrere Sequenzvariationen, die bisher noch nicht veröffentlicht wurden (Tab.

3.1). Das sind im einzelnen drei AS-Austausche (Phe165Leu, Pro345Leu und

Trp398Ser) und eine Spleißstellen-Variation (632+1G>A).

Von den missense Mutationen ist eine Mutation (Arg490Trp) in der Domäne III

lokalisiert, welche eine Phosholipid-Bindungsstelle aufweist. Desweiteren stellt

Domäne III eine Verbindung zwischen der Kalzium-bindenden (IV) und der

katalytischen Domäne (II) her. Ono et al. (1998) wiesen nach, daß R490W nur

in Gegenwart von Kalzium eine effiziente autolytische Aktivität zeigt. Dies

impliziert, daß CAPN3 in vivo ohne oder mit sehr geringer Kalziumkonzentration

aktiv ist. Interessanterweise wird diese Änderung der Kalzium-Sensitivität durch

eine Mutation der Domäne III ausgelöst, und nicht der Domäne IV.

Drei missense Mutationen (Phe165Leu; Gly214Ser, Trp398Ser), eine frameshift

und eine inframe Mutation (550delA; 598-612delTTCTGGAGTGCTCTG) liegen

in der Domäne II, welche für die proteolytische Funktion zuständig ist. Alle drei

ausgetauschten AS sind in den bisher bekannten Calpainen konserviert

(Richard et al., 1995), was auf eine wichtige Funktion ihrerseits hinweisen kann.

Die Variation 550delA führt bei Codon 219 zum Abbruch der Proteintranslation

und damit zu einem verkürzten, funktionsunfähigen Protein. Die 15bp-Deletion

ist innerhalb der IS1-Region lokalisiert, die drei autolytische Einheiten beinhaltet

und somit Substratspezifität koordiniert (Kinbara et al., 1998).

Diskussion 53

Die Spleißstellenmutation (632+1G>A) ist ebenfalls in der Domäne II lokalisiert,

ihr Effekt müßte auf RNA-Ebene überprüft werden. Häffner et al. (1998)

beschreiben z.B., daß die Mutation 801+1G>A ein Auslassen von Exon 5 und

Richard et al. (1995) zeigten, daß 946-1G>A ein Auslassen von Exon 7 bewirkt.

Die Mutation 2313-2316delAGAC liegt in der Domäne IV, welche für Kalzium-

Bindung und Homodimerisierung verantwortlich ist (Kinbara et al., 1998). Die

Deletion führt zu einem leicht verkürzten, funktionslosen Protein. Daneben kann

CAPN3 nicht mehr an die Titin-Bindestelle M-is7 andocken, da hierzu das

gesamte Protein notwendig ist. Was dies physiologisch genauer zu bedeuten

hat, ist nicht bekannt und muß noch untersucht werden.

Daneben ergaben sich hier vier Sequenzvariationen (Cys328Cys, Pro345Leu,

2115+1_2115+2dupGT und Ala798Trp), die nicht als sicher pathogen

eingeordnet werden konnten. Cys328Cys (984C>T) befindet sich in der IS1-

Sequenz der Domäne II. Obwohl es sich hierbei um eine synonyme

Codonveränderung handelt, wird sie von Richard et al. (1999) als eine mögliche

Spleißstellenmutation diskutiert. Die Autoren beziehen sich auf die

Beobachtung, daß Gly624Gly (GGC>GGT) zu einer neuen Spleißstelle führt,

bei der die letzten Basen von Exon 16 deletieren (Richard and Beckmann,

1995). Die Variation Cys328Cys wurde in drei nicht verwandten LGMD2-

Familien unterschiedlicher geographischer Herkunft beobachtet, aber nicht in

>100 Kontrollindividuen. Da bei zwei dieser Familien jeweils nur ein pathogenes

Allel des CAPN3-Gens identifiziert werden konnte, schlußfolgerten sie, daß

diese Sequenzabweichung eine potentielle Spleißstelle darstellt. Erst

Untersuchungen auf RNA-bzw. Protein-Ebene können Aufschluß über die

tatsächlichen Auswirkungen dieser Sequenzvariation geben. Patient Nr. 22

wies, außer dieser potentiellen Mutation, nur den Polymorphismus Phe165Phe

auf, welcher mit einer Frequenz von 0.01 auch in Kontrollindividuen

nachgewiesen wurde. Somit würde diese Spleißstellenmutation nicht

ausschlaggebend für die Diagnose einer LGMD2A sein, da sie im

heterozygoten Zustand vorlag. Der AS-Austausch Pro345Leu befindet sich in

Domäne II, allerdings zeigte sich bei dem Vergleich der humanen CAPN3-AS-

Sequenz mit anderen Säugetierarten, daß diese an der Stelle ein Leucin

aufweisen (Richard et al., 1995). Da Prolin (Ringform) und Leucin (Kettenform)

sich strukturell unterscheiden, ist eine funktionelle Beeinträchtigung des

Diskussion 54

Proteins nicht sicher auszuschließen. Zudem sind in unmittelbarer Umgebung

(drei AS) der Vergleichssequenzen zwei weitere AS verändert, ein Umstand

welcher in einer unterschiedlichen räumlichen Struktur resultieren könnte.

Weiterhin ist die Lokalisation zu berücksichtigen. Der AS-Austausch liegt mitten

zwischen zwei AS einer sogenannten katalytischen Triade, welche aus Cystein

(129), Histidin (334) und Asparagin (358) besteht. Sie ist für andere Cystein-

Proteasen charakteristisch (Goll et al., 2003), allerdings wird die Triade im

CAPN3 durch die IS1-Sequenz voneinander getrennt. Man müßte experimentell

überprüfen, ob das mutante CAPN3-Protein noch in der Lage ist, Substrate

(z.B. Fodrin) proteolytisch zu spalten. Dann erst läßt sich die Frage der

Pathogenität beantworten. Die Sequenzvariante 2115+1_2115+2dupGT

befindet sich in Intron 19. Es wird eine fragliche Spleißstellenmutation diskutiert,

da sie im Zusammenhang mit einer missense Mutation (Leu138Pro)

beschrieben wurde (LMDp) und somit eine compound-Heterozygotie bestünde.

Auch hier können nur Untersuchungen auf RNA- oder Protein-Ebene die

funktionelle Bedeutung der Sequenzabweichungen abklären. Patient Nr. 49

wies außer dieser Sequenzabweichung allerdings keine weitere Mutation auf,

so daß die Variation, da sie im heterozygoten Zustand vorlag, die Diagnose

einer LGMD2A allein nicht untermauern könnte. Die letzte fragliche Variation

Ala798Glu liegt in der Domäne IV. Trotz eines AS-Austauschs gehen Richard et

al. (1999) davon aus, daß es sich um einen Polymorphismus handelt, da die

geänderte AS in anderen Mitgliedern der Calpainfamilie an entsprechender

Stelle vorkommt. Dies bedeutet ihrer Meinung nach, daß die Funktion des

Proteins wahrscheinlich nicht beeinträchtigt ist. Allerdings ist es dennoch

fraglich, ob dieser Austausch Relevanz besitzt, da diese Aminosäure innerhalb

der CAPN3-Sequenz verschiedener Säugetiere konserviert ist. Unterschiedliche

AS finden sich bei Mitgliedern der Calpainfamilie, das Glutamat selbst taucht

erst in Calpainen von Nicht-Säugetieren auf. Nur experimentell kann geklärt

werden, ob der AS-Austausch pathogen ist. Da er in der Kalzium-bindenden

Domäne liegt, könnte man eventuell das Verhalten der Mutante im Vergleich

zum Wildtyp unter verschiedenen Kalziumkonzentrationen untersuchen. Patient

Nr. 118 zeigte neben dieser Sequenzabweichung nur die Variation 2381-

79T>C, bei welcher es sich aber höchstwahrscheinlich um einen

Polymorphismus handelt, so daß auch bei einem pathogenen AS-Austausch,

Diskussion 55

da er in heterozygoten Zustand vorlag, noch keine Diagnose für eine LGMD2A

gestellt werden kann.

4.2 Verteilungsmuster der Sequenzvariationen

Beim zahlenmäßigen Vergleich der hier ermittelten Mutationen mit den nicht

pathogenen Sequenzvariationen liegt der größte Anteil bei letzteren. Auch hier

ergaben sich einige bisher noch nicht veröffentlichte Abweichungen, das sind

im einzelnen vier Nukleotidabweichungen im Promotorbereich (-104G>C, -

322A>C, -719A>T, -763C>G) und acht intronische Variationen (380-52T>G,

1801-51G>A, 2381-129G>A, 2381-79T>C, 2440-56delG, 2440-56insG, 2440-

56_2440-52delG, 2440-56_2440-53delG). Um herauszufinden, ob es sich

hierbei um neutrale Polymorphismen oder pathogene Mutationen handelt,

müßte man Kontrollen auf diese Sequenzabweichungen hin untersuchen. Wenn

man diese Variationen nicht in den Kontrollen fände, folgte im nächsten Schritt

die Untersuchung auf eventuelle Pathogenität. Mutationen im Promotorbereich

könnten z.B. dazu führen, daß die Regulation der Expression des Proteins

verändert wird. Bei den intronischen Variationen besteht die Möglichkeit, daß

sich eventuell neue kryptische Spleißstellen gebildet haben. Zur Klärung dieser

Fragestellung sind weiterführende und intensive Untersuchungen auf RNA-

bzw. Protein-Ebene notwendig.

Drei der Variationen (Cys106Cys; Phe165Phe und Ala236Thr) liegen in der

Domäne II. Eine dieser Variationen ist ein von Richard et al. (1999)

beschriebener Polymorphismus, der mit einem AS-Austausch einhergeht

(Ala236Thr). Er konnte mit einer Frequenz von 0,1 auch in einer

Kontrollpopulation nachgewiesen werden. Außerdem ist ein Threonin-Rest an

dieser Stelle der CAPN3-AS-Sequenz bei anderen Säugern und auch in der

CAPN1-Sequenz vorhanden. Dies deutet darauf hin, daß der AS-Austausch

keine größeren Einbußen der Proteinfunktion hervorruft. Allerdings stellt sich

die Frage, ob ein homozygoter Austausch der AS, wie es bei einem Patienten

(Nr. 43) der Fall war, nicht doch krankheitsverursachende Konsequenzen nach

sich zieht. Der bisherige Krankheitsverlauf des betroffenen Patienten ist sehr

mild. Bei dem jetzt 62jährigen Patienten besteht seit dem 50. Lebensjahr eine

Diskussion 56

progrediente Schwäche der Extremitätenmuskulatur, vornehmlich im Schulter-

und Beckengürtelbereich. Die Muskelbiopsie ergab ein Bild mit Veränderungen,

die am ehesten einer Gliedergürtel-MD zuzuordnen sind, und die CK ist mit 397

U/L erhöht. Da bisher keine Aussagen zu dem Polymorphismus in homozygoter

Ausprägung vorliegen, läßt sich die Pathogenität dieser Sequenzabweichung in

dem vorliegenden Fall nicht mit Sicherheit ausschließen.

4.3 Mutationsanalysen und Westernblots Von den 16 der insgesamt 34 untersuchten Patienten liegen die Ergebnisse der

Westernblot-Untersuchungen vor (Tab. 3.2). Es wurden zwei verschiedene

monoklonale Antikörper benutzt, Calp3d/2C4 und Calp3c/12A2. Der Antikörper

Calp3d/2C4 bindet an ein Epitop innerhalb der AS 1-19 in Exon 1 und führt zu

einer Einzelbande bei 94 kDa (Gesamtprotein) sowie einer klar abgrenzbaren

zusätzlichen Bande bei 30 kDa. Der andere Antikörper bindet an ein Epitop

innerhalb der AS 355-370 in Exon 8 und liefert ebenfalls eine Bande bei

94 kDa. Zusätzlich ist noch eine Bande bei 60 kDa sichtbar (Anderson et al.,

1998). Die Bedeutung der Unterbanden ist noch unklar. Man vermutet, daß die

zusätzlichen Banden durch Autolyse innerhalb der IS1-Sequenzen auftreten

(Kinbara et al., 1998). Bei drei Patienten (Nr. 25, Nr. 28 und Nr. 29) fehlten im

Westernblot sämtliche Banden, es ließen sich aber keine Mutationen

nachweisen. Es besteht die Möglichkeit, daß die Mutationen mit den hier

vorliegenden Methoden nicht dargestellt werden konnten, da sie z.B. in

regulatorischen Sequenzen lokalisiert sind. Es ist aber auch durchaus möglich,

daß es sich hierbei um eine sekundäre Reduktion handelt. Es ist erwiesen, daß

die IS2-Sequenz des CAPN3-Proteins eine Bindestelle für Titin besitzt. Titin ist

ein großes filiamentöses Protein, das sich zwischen die M-und Z-Scheiben der

Muskelsarkomere spannt (Sorimachi et al., 1995). Haravuori et al. (2001)

fanden heraus, daß bei der tibialen Muskeldystrophie Mutationen im Titin-Gen

ursächlich für das Krankheitsbild sind. Ferner bemerkten sie einen nahezu

kompletten Verlust des CAPN3-Proteins und kamen zu dem Schluß, daß dies

ein sekundärer Verlust aufgrund des Fehlens von Titins sei. Um dies

abschließend klären zu können, müßten die jeweils beteiligten Proteine

Diskussion 57

nachträglich untersucht werden. Eine andere Möglichkeit wäre, daß das CAPN3

einer rapiden Autolyse unterliegt, wie es von Sorimachi et al. (1993)

beschrieben wird. Neuere Untersuchungen haben allerdings gezeigt, daß das

Protein sehr stabil im intakten Muskel ist. Auch Verweildauern von bis zu acht

Stunden bei Raumtemperatur bewirkten nur eine geringe Abnahme der

Bandenintensität (Anderson et al., 1998; Spencer et al., 1997). Kinbara et al.

(1998) fanden heraus, daß die NaCl-Konzentration einen Einfluß auf das

autolytische Verhalten des CAPN3 hat. Bei hohen Konzentrationen ließ sich die

Degradation der Protease als schneller beobachten als im Vergleich mit

niedrigen. Also empfiehlt es sich, bei der Isolierung von CAPN3 möglichst mit

salzfreien Lösungen zu arbeiten.

Bei weiteren drei Patienten (Nr. 23, Nr. 27 und Nr. 36) war die Expression von

CAPN3 im Verhältnis zur Norm vermindert, ohne das eine Mutation

nachweisbar war. Dies könnte damit zusammenhängen, daß bei einigen

Patienten mit primärer Dysferlinopathie (LGMD2B) eine sekundäre

Verminderung der CAPN3 Expression beobachtet wird (Anderson et al., 2000).

Diese sekundäre Verminderung ist allerdings bei weitem nicht so gravierend

wie die jeweilige Dysferlin-Verminderung (Pogue et al., 2001). Hier müßten

ebenfalls weitere Untersuchungen angestrebt werden, um endgültige Aussagen

treffen zu können.

Bei der Patientin Nr. 57 ([2313-2316delAGAC] + [Gly214Ser]) ließ sich die

94 kDa Bande nachweisen, was darauf hindeutet, daß das Protein zwar

gebildet wird, die Funktion aber aufgehoben ist.

Trotz einer homozygoten Mutation (Arg490Trp) bei der Patientin Nr. 46 war die

94 kDa Bande in vollem Ausmaß nachweisbar, nur die 30 kDa Bande fehlte.

Dies ist ein Hinweis dafür, daß auch den Unterbanden eine erhebliche

Bedeutung beigemessen werden muß. Es scheint, daß missense-Mutationen

manchmal die Gesamtmenge des Proteins nicht vermindern (Chae et al., 2001).

In einer ihrer Studien beobachteten Minami et al. (1999) zwei Patienten mit der

gleichen homozygoten missense Mutation R461C im CAPN3-Gen, in deren

Westernblot-Analysen die Ergebnisse von „minimal nachweisbar“ bis „nahezu

normale“ Expression reichten. Talim et al. (2001) entdeckten einen Patienten

mit zwei missense Mutationen ([G496R]+[S606L]) aber einem völlig

unauffälligen Westernblot. Alle Banden, einschließlich der Unterbanden,

Diskussion 58

präsentierten sich bei allen benutzten CAPN3-Antikörpern in gleichem Maße

wie bei der Kontrolle. Diese Ergebnisse zeigen, daß es noch weiterer Studien

bedarf, um eine geeignete Methode für das Auffinden von missense-Mutationen

im Immunoblotting zu etablieren.

Bei den Patienten Nr. 26 (550delA) und Nr. 49 (2115+1_2115+2dupGT) fehlten

im Westernblot sämtliche getesteten Banden, bei Patient Nr. 24 (550delA),

Patient Nr. 31 (598-612delTTCTGGAGTGCTCTG) und Patient Nr. 32

(Pro345Leu) hingegen waren sie im Verhältnis zur Norm deutlich vermindert.

Die Westernblot-Ergebnisse weisen also daraufhin, daß es sich bei diesen

Patienten um LGMD2A-Erkrankte handelt.

4.4 Patienten mit lediglich einem mutierten Allel

Auffällig ist, daß bei drei Patienten mit einer gesicherten und bei fünf Patienten

mit einer fraglichen Mutation nur ein betroffenes Allel dargestellt werden konnte.

Es gibt mehrere mögliche Gründe, wie z.B. die Mutationsart, eine eventuell

vorliegende Hemizygotie oder methodische Aspekte.

Zum einen könnten Mutationen vorliegen, die mit den hier angewandten

Methoden nicht darstellbar sind. Dazu gehören große Deletionen, Mutationen,

die weit im Inneren des Introns liegen und nicht untersuchte Bereiche, wie z.B.

der Enhancer oder weitere regulatorische Einheiten (Pollitt et al., 2001, Pogue

et al., 2001). Da für das CAPN3-Gen der Promotor noch nicht definiert ist, wäre

es möglich, daß hier noch nicht der gesamte Promotor in die Untersuchungen

einbezogen wurde. Untersuchungen auf RNA-Ebene könnten Aufschluß geben.

Zum anderen wäre eine Hemizygotie denkbar, d.h. Patienten, die auf DNA-

Ebene heterozygot für eine Mutation sind, zeigen auf RNA-Ebene diese

Mutation im homozygoten Zustand (Chou et al., 1999). Das bedeutet, daß nur

die Genkopie eines Elternteils exprimiert wird. Abb. 4.1 zeigt eine

Restriktionsanalyse, bei der auf cDNA-Ebene nur das mutierte Allel der Mutter

nachweisbar ist. Das Allel des Vaters der Patientin ist nur auf DNA-Ebene

sichtbar.

Diskussion 59

Abbildung 4.1. Restriktionsanalyse, die eine fehlende Expression des CAPN3-Allels des Vaters auf cDNA-Ebene zeigt (modifiziert nach Chou et al., 1999).

Es kann damit vermutet werden, daß eine unentdeckte Mutation auf einem Allel

die Expression der RNA verhindert (Chou et al., 1999).

Außerdem stellt sich die Frage, ob die Sensitivität der Methoden zur

Mutationsdarstellung ausreichend war. Bei der SSCP-Methode wurde in

früheren Untersuchungen festgestellt, daß einige Faktoren die Sensitivität

erheblich beeinflussen können (Salazar et al., 2002). Dazu gehört zum einen

die Wahl der Temperatur, was bei der Multitemperatur SSCP-Methode

ausgenutzt wird. Dort verändert man während der Elektrophorese die

Geltemperatur und erreicht damit eine wesentliche Steigerung der Sensitivität

(Kaczanowski et al., 2001). Zum anderen können eine unterschiedliche

Wattzahl, der pH-Wert, die Länge der DNA-Fragmente und die

Gelzusammensetzung eine Rolle spielen (Leren et al., 1993, Teschauer et al.,

1996, Salazar et al., 2002). Da nur 16 Exons mit der SSCP-, aber alle Exons

zusätzlich mit der DHPLC-Methode untersucht wurden, muß auch die

Sensitivität dieser Methode in Frage gestellt werden. Obwohl Taliani et al.,

(2001) bei der Untersuchung auf unbekannte Protein C-Genmutationen eine

sehr hohe Sensitivität und Spezifität feststellen konnten, gibt es spezielle

Aspekte, die beachtet werden müssen. Das sind zum einen das Primer-Design,

das PCR-Protokoll, der Auftrennungsgradient und die Auftrennungstemperatur.

Die ersten beiden Punkte betreffen die Herstellung der PCR und die letzten

beiden Punkte die Analyse der Proben (Taylor et al., 1998). Bei Auswahl der

Vater Schwester Schwester Mutter PatientinDNA

PatientincDNA

un-geschnitten

geschnitten

Diskussion 60

falschen Temperatur oder eines nicht ausreichenden Temperaturbereiches wird

die Mutationsdetektion deutlich eingeschränkt. Bei Auffälligkeiten entweder in

der SSCP- oder DHPLC-Methode wurde anschließend sequenziert. Bei der

Sequenzierung ist die Sensitivität sehr hoch. Schwierigkeiten ergeben sich aber

vor allem an solchen Stellen, an denen mehrere gleiche Nukleotide

hintereinander auftreten oder aber in der Primerregion. Zusammenfassend

betrachtet ist es also durchaus möglich, daß die zweite Mutation hier nicht

gefunden wurde. Alternativ könnte es sein, daß die Ursache der

Muskelerkrankung in einem anderen Gen liegt, und die bereits gefundene

Mutation eine untergeordnete Rolle spielt. Diese Hypothese bietet sich vor

allem bei den Patienten mit nur einer nicht genau klassifizierbaren

Sequenzvariation an. Da hierbei die Pathogenität nicht eindeutig verifiziert ist,

könnte man annehmen, daß es sich um nicht krankheitsverursachende

Variationen handelt. Damit richtete sich der Blickpunkt auf andere MD, mit

eventuell sekundärer CAPN3-Reduktion.

4.5 Klinischer Hintergrund

Betrachtet man die klinischen Informationen von sechs molekulargenetisch

gesichert diagnostizierten Patienten, so ergibt sich ein variables Bild der

Krankheitsausprägung. Die Serum CK-Werte reichen von 152 bis 4300 U/L, der

mittlere Wert liegt bei 1620 U/L. Das Erstmanifestationsalter der Patienten

reicht von 2-25 Jahren, der gemittelte Wert liegt bei 10,5 Jahren. Die

Erkrankung manifestiert sich in dieser vorhandenen Patientengruppe

vornehmlich in der ersten Lebensdekade. Wie erwartet, ist das Verhältnis von

betroffenen Männern zu Frauen ausgeglichen. Die hier erhobenen Daten

decken sich weitgehend mit den in der Literatur bekannten Angaben. Ein

interessanter Aspekt wäre sicherlich die Erstellung von Genotyp-Phänotyp

Korrelationen, die sowohl histologische, als auch klinische/neurologische

Befunde miteinschließen. Dazu sind allerdings sorgfältige, longitudinale Studien

notwendig, die an einer möglichst großen Gruppe von Patienten durchgeführt

werden müssen, so daß mit den vorliegenden begrenzten Daten leider keine

wirklich sinnvolle Aussage möglich ist.

Diskussion 61

4.6 Réunion Paradox

Die variable Expressivität bzw. unvollständige Penetranz dieser Erkrankung ließ

vormals u.a. die Frage eines digenischen Erbgangs (Kajiwara et al., 1994)

aufkommen. Diese Hypothese wurde auch von der Beobachtung gestützt, daß

verschiedene Mutationen in einer Population auftraten, von der man zuvor

ausgegangen war, daß sie von einem Gründervater abstammt (Kapitel 1.6). Es

gab verschiedene Erklärungsversuche für das Réunion Paradox. Die hohe

Prävalenz z.B., könnte durch genetischen Drift einer isolierten Population erklärt

werden. Allerdings spricht die Tatsache dagegen, daß mehrere verschiedene

Allele identifiziert werden konnten. Zum anderen vermutete man, daß

heterozygote Individuen einen selektiven Vorteil aufweisen, wie z.B. bei der

Sichelzellanämie (Aidoo et al., 2002). Dort weisen heterozygote

Mutationsträger, also gesunde Individuen einen Schutz vor besonders

schweren Malariaverläufen auf. Jedoch scheint dies im vorliegenden Fall

unwahrscheinlich, da die Zeitspanne, in welcher sich dieser selektive Druck

durchgesetzt hätte, zu kurz wäre (maximal 325 Jahre). Die digenische

Hypothese scheint daher primär näher liegend zu sein.

Dieses zweite Gen könnte entweder mitochondrialen oder nukleären Ursprungs

sein (Pratt et al., 1997). Da beide Loci nicht gekoppelt sind, erwartet man, daß

in einigen Familien asymptomatische Träger vorkommen, d.h. es gibt Individuen

mit pathogenen Mutationen aber keinen klinischen Symptomen (d.h. die CK ist

normal). Aufgrund der niedrigen Prävalenz der LGMD-Erkrankungen, ist es

sicherlich nicht einfach, asymptomatische Träger von CAPN3-Mutationen zu

entdecken. Generell ist dies aber schon bei anderen Krankheiten beobachtet

worden, wie z.B. bei Morbus Hirschsprung (Mulligan et al., 1994) oder bei

spinaler Muskelatrophie (Cobben et al., 1995, Wang et al., 1996). Pratt et al.

(1997) untersuchten unter jener Fragestellung die Population der Amish

Familien aus Nord Indiana, USA, bei denen ebenfalls eine hohe Prävalenz der

LGMD2A aufgetreten ist. In den untersuchten Familien wurde nur eine Mutation

(Arg769Gln) gefunden, die bei den betroffenen Patienten im homozygoten

Zustand vorlag. Unter dem Aspekt der digenischen Hypothese wurden 580

DNA-Proben dieser Bevölkerungsgruppe auf die Mutation Arg769Gln

untersucht, mit dem Ziel phänotypisch normale Patienten zu finden, die

Diskussion 62

homozygot für diese Mutation sind. Dies war nicht der Fall, was gegen ein

modulierendes Gen in dieser Bevölkerungsgruppe spricht. Ebenso zeigten die

mitochondrialen Untersuchungen, daß ein mitochondrialer genetischer

Hintergrund bei dieser Erkrankung eher unwahrscheinlich ist. Dennoch

schließen die Ergebnisse das Vorhandensein eines zweiten nukleären Locus in

der Amish Population nicht aus. Ähnliche Untersuchungen in der Bevölkerung

von La Réunion könnten die Frage eines digenischen Modells eventuell lösen.

4.7 Vergleich der SSCP- mit der DHPLC-Methode

Beim Vergleich zwischen den beiden oben genannten Methoden wurden bei

insgesamt drei (von 16) Exons Abweichungen festgestellt, wobei die DHPLC-

der SSCP-Methode überlegen war. Es ergaben sich allerdings bei beiden

Methoden einige abweichende Banden- bzw. Kurvenmuster, die erst mit der

anschließenden Sequenzierung richtig gestellt werden konnten.

Zusammenfassend bleibt zu sagen, daß die DHPLC- der SSCP-Methode

vorzuziehen ist. Das gilt nicht nur aufgrund der sich hier gezeigten höheren

Sensitivität. Wenn man die Protokolle für beide Analysen vergleicht, so kann

man erkennen, daß die DHPLC-Methode mit weniger Aufwand verbunden ist

(Tab.4.1). Das liegt vor allem daran, daß keine radioaktiv markierten dNTP

benötigt werden, was den Arbeitsaufwand erheblich reduziert. Demzufolge kann

man das Ergebnis wesentlich schneller begutachten. Ein Nachteil ist allerdings,

daß die DHPLC-Methode wesentlich teurer ist als die SSCP-Methode.

Diskussion 63

Tabelle 4.1. Auszüge aus den SSCP- und DHPLC-Protokollen im Vergleich.

SSCP-Methode DHPLC-Methode

1. Amplifikation der Exons mittels PCR mit radioaktiv-markierten Nukleotiden 1. Amplifikation der Exons mittels PCR.

2. Anschließend Restriktionsenzymverdau (falls notwendig) für ca. 3 Stunden

2. Vermischen der Wildtyp-DNA mit der Mutanten-DNA

3. Gießen von 2 PAA-Gelen, Gel-Polymerisierung für mindestens 1 Stunde

3. Denaturierungs- und Renaturierungs-schritt für 20 min in einer PCR-Maschine

4. Denaturierung der PCR-Produkte auf einem Heizblock und Lagerung auf Eis

4. PCR-Platte in den Autosampler des WAVE-Gerätes stellen

5. Auftragen von je 2,5µl auf jedes Gel 5. Optimale Software-Einstellungen wählen

6. Elektrophorese der Gele für 2-8 Stunden

6. Analyse der Proben starten (<7,4min pro Analyse). Automatische Injektion und elektronische Datenabspeicherung.

7. Trocknung der Gele für ca. 35 Minuten

8. Exposition des Gels auf einem Röntgenfilm für 1-5 Tage.

4.8 Ausblick

Ein genaueres Verständnis der Funktion des DGC, oder hier im speziellen des

CAPN3, könnte bei der Entwicklung von rationalen Therapiestrategien von MD

hilfreich sein. Neben dem Wissen über primäre genetische Defekte gibt es eine

ganze Reihe von Fragen, die noch unbeantwortet bleiben. Warum z.B. liefern

die Gliedergürtel-MD mit so vielen unterschiedlichen genetischen Ursachen ein

relativ einheitliches Krankheitsbild? Und warum gibt es innerhalb desselben

Krankheitsbildes eine so variable Expression? Daß ein und dieselbe Mutation

einen völlig unterschiedlichen Krankheitsverlauf auslöst, erschwert das

kausalpathogenetische Verständnis der Erkrankung zum jetzigen Zeitpunkt

ungemein.

Das Auffinden von neuen Patienten mit eventuell neuen Mutationen hilft dabei,

das jeweilige Krankheitsbild genauer zu klassifizieren. Mit diesen neu

Diskussion 64

gewonnenen Erkenntnissen gelingt es vielleicht, feine Unterschiede

herauszuarbeiten, die dann auch eine schnellere klinische Zuordnung erlauben.

Die bisherigen Bemühungen um neue Therapiestrategien fand im wesentlichen

auf drei Ebenen statt: Gentherapie, Zelltherapie und pharmakologische

Therapie. Bei der Gentherapie versucht man mit Hilfe von Vektoren, die cDNA

des betroffenen Gens in die Zellen hineinzuschleusen. Die Vektoren sind

zumeist Adeno- oder Adeno-assoziierte-Viren. Die Problematik hierbei besteht

u.a. darin, daß eine Immunreaktion gegen die Kapsidproteine des Virus und

gegen das Transgen stattfindet (Skuk et al., 2002). Die Zelltherapie beinhaltet

die Implantation von Spenderzellen in einen Wirtsorganismus. Für die

Behandlung von Muskelerkrankungen benutzt man Satellitenzellen als

myogene Spenderzellen, da sie Stammzellen für den Skelettmuskel darstellen.

Das Prinzip besteht darin, die Vorläuferzellen durch Injektion in den Muskel

einzubringen. Diese Myoblasten Transplantation hat schon erste Erfolge

gezeigt, wie Dystrophin- bzw. Dysferlin-positive Muskelfasern in Dystrophin-

/Dysferlin-negativen Knockout Mäusen beweisen (Patridge et al., 1989, Leriche-

Guérin et al., 2002). Diese Ergebnisse zeigen, daß es durchaus denkbar ist,

CAPN3 in die Zelle einzubringen und damit die Muskelhomöostase

wiederherzustellen. Der limitierende Faktor hierbei ist allerdings die

Notwendigkeit zur langfristigen Immunsuppression, wobei im wesentlichen eine

Immuntoleranz angestrebt wird. Es gibt erste Erfolge mit Antikörpern, welche

die Überlebenszeit der Myoblasten verlängern, aber keine langfristige Toleranz

erzeugen konnten (Camirand et al., 2002). Sampaolesi et al. (2003)

entwickelten eine andere Methode der Zelltherapie an α-Sarkoglykan

defizienten Mäusen. Sie arbeiteten mit Mesoangioblasten, das sind den

Gefäßen zugehörige Stammzellen, welche aus juvenilen dystrophischen

Mäusen isloliert wurden. Nach Übertragung eines lentiviralen Vektors, welcher

α−Sarkoglykan exprimiert, wurden die Zellen in die Fermoralarterie injiziert.

Man beobachtete, daß die Muskeln, welche durch die Kapillarversorgung

erreicht wurden und inflammatorische Signale aussendeten, ähnlich einem mit

Wildtyp-Mesoangioblasten therapierten Muskel wiederhergestellt wurden. Diese

Erkenntnisse sind eine vielversprechende Annäherung auf mögliche

Therapiestrategien. Bemerkenswert ist, daß die Immunreaktion bei dieser

Diskussion 65

Methode deutlich geringer ausfällt als bei der Myoblasten-Transplantation. Auch

das CAPN3 könnte auf diese Weise in die Muskelzellen eingebracht werden

und damit den Verlauf der MD verbessern. Allerdings ist es noch nicht

gelungen, Mesoangioblasten von den eigenen Gefäßen des Patienten zu

isolieren, sondern nur von fetalen Gefäßen. Dieses Problem muß u.a. erst

gelöst werden, bevor man eine klinische Studie beginnen kann. Auf

pharmakologischer Ebene sind die Steroide Prednison und Deflazacort in der

symptomatischen Therapie der MD vom Typ Duchenne eingehend untersucht

worden (Bonifati et al., 2001). Es zeigte sich, daß sie den dystrophischen

Prozeß der Muskeln verlangsamen können und somit die Gehfähigkeit länger

erhalten bleibt als ohne Therapie. Dies gelingt jedoch nur für eine begrenzte

Zeit. Ein positiver Effekt bei den LGMD-Erkrankungen wurde bisher nur für die

LGMD2D beschrieben (Angelini et al., 1998). Therapeutische Ansätze gibt es

also nur wenige, daher ist es von großer Bedeutung, die genauen Funktionen

des CAPN3-Proteins kennenzulernen, um damit neue therapeutische Ansätze

finden zu können. Wenn man z.B. herausfände, daß das CAPN3-Protein

Funktionen ausübt, die andere Proteine übernehmen können, könnte man

versuchen, diese heraufzuregulieren, um damit die Funktionseinbußen

auszugleichen. Oder man fände ein Substrat welches ohne CAPN3

hochreguliert und damit toxisch für die Zelle wird. Dann könnte man auf dieser

Ebene eingreifen. Allerdings wird bei dem heutigen Kenntnisstand schon

deutlich, daß das CAPN3-Protein eine sehr komplexe Funktion im

Muskelzellstoffwechsel einnimmt, und somit in zahlreiche

Regulationsmechanismen eingegriffen werden müßte, um die Funktionen des

Proteins zu ersetzen bzw. auszugleichen.

Auch wenn noch keine effizienten Therapiemöglichkeiten existieren, ist es

dennoch wichtig, die Diagnose einer MD mit verschiedenen Methoden zu

sichern. Im Hinblick auf eine humangenetische Beratung z.B., spielt die

jeweilige Diagnose eine entscheidende Rolle, da eine mild verlaufende Form

der MD andere Konsequenzen mit sich bringen kann als eine schwer

verlaufende Form. Restagno et al. (1996) berichten von einem Ehepaar, die

beide heterozygot für die Mutation 550delA getestet wurden, ihr 13-Wochen

alter Fetus sich jedoch als homozygot für diese Sequenzvariation erwies. Es

folgte eine Beratung der Eltern, in der man ihnen erklärte, daß ihr Kind

Diskussion 66

höchstwahrscheinlich ähnlich den anderen betroffenen Familienmitgliedern

erkranken würde. Außerdem wies man darauf hin, daß in anderen Populationen

(Insel La Réunion) der Erbgang nicht so eindeutig erscheint. Nach der Beratung

entschlossen sich die Eltern, die Schwangerschaft zu beenden. Da die

Kenntnisse über diese Erkrankung noch nicht vollständig sind und auch noch

nicht genügend Genotyp-Phänotyp Korrelationen existieren, ist es schwer, eine

adäquate genetische Beratung durchzuführen. Zusätzlich ist es ratsam, sich

genau zu überlegen, ob bzw. bei welchen Erkrankungen man eine

vorgeburtliche Diagnostik anbietet.

Ein Ansatzpunkt für weiterführende Untersuchungen mit dem hier vorliegenden

Patientenkollektiv ist sicherlich, die Patienten mit nur einer Mutation hinsichtlich

größerer Deletionen oder stummen Allelen, auf RNA-Ebene zu überprüfen. Bei

den fraglichen Spleißstellenmutationen müßten ebenfalls Untersuchungen auf

RNA-Ebene angestrebt werden, um ihr Spleißverhalten gegebenenfalls zu

bestätigen. Desweiteren ist es sinnvoll, die Promotorregion umfassender weiter

5’-wärts zu analysieren, da seine genaue Position noch nicht bekannt ist. Mittels

dieser Ergebnisse könnte man eventuell abschließend bei den Patienten mit nur

einer Mutation eine gesicherte Diagnose ermitteln.

Zusammenfassung 67

5. Zusammenfassung

Die MD bilden eine Gruppe von genetischen Erkrankungen, die mit einem

fortschreitenden Untergang der Skelettmuskulatur und deren Ersatz durch

Bindegewebe einhergehen. Sie werden abhängig vom klinischen

Erscheinungsbild, Verteilung/Ausprägung der Muskelschwäche und dem

Vererbungsmodus klassifiziert. Zu ihnen zählen u.a. die Dystrophien vom

Gliedergürteltyp (limb-girdle muscular dystrophies, LGMD) und im speziellen,

die autosomal-rezessiv vererbte Calpainopathie (LGMD2A), für welche in der

vorliegenden Arbeit eine Reihe von Patienten untersucht wurden.

Um die klinisch/immunhistochemisch gestellte Diagnose der Calpainopathie zu

überprüfen bzw. molekulargenetisch zu sichern, wurden in der vorliegenden

Arbeit bei 34 Patienten auf DNA-Ebene untersucht. Es wurden alle 24 Exons

und Anteile des Promotors mittels DHPLC- und teilweise zusätzlich mittels

SSCP-Methode analysiert.

Es konnte bei sieben (sechs nicht verwandten) Patienten molekulargenetisch

die Diagnose einer LGMD2A gesichert werden, bei drei weiteren Patienten ließ

sich nur eine im heterozygoten Zustand vorliegende Mutation aufdecken.

Möglicherweise konnte hier eine zweite Mutation mit den benutzten Methoden

nicht dargestellt werden. Derzeit nicht exakt klassifizierbare Variationen ließen

sich bei weiteren fünf Patienten nachweisen, deren Pathogenität daher noch

weiter überprüft werden muß. Anhand der teilweise vorhandenen

Proteinexpressions-Analysen mittels Westernblot stellte man bei einigen

Patienten fest, daß sie trotz fehlender CANP3-Proteinexpression keine

Mutationen aufwiesen. Hier muß man eine sekundäre Reduktion von CANP3-

Protein, aber auch eine fehlende Analyse von regulatorischen Einheiten des

Gens diskutieren.

Insgesamt zeigte sich, daß die Mutationen im CANP3-Gen relativ gleichmäßig

über das gesamte Gen verteilt sind, was ein gezieltes Aufsuchen von

Mutationen erschwert. Im Hinblick auf die Methodik erwies sich die DHPLC-

Methode als sensitiver, und das Ergebnis ist wesentlich schneller darstellbar.

Es bleibt abzuwarten, ob bei den Patienten mit nur einer Mutation durch

fortgeführte Untersuchungen auf RNA-Ebene eine zweite Mutation dargestellt

werden kann.

Literaturverzeichnis 68

6. Literaturverzeichnis

Aidoo, M., Terlouw, D.J., Kolczak, M.S., McElroy, P.D., ter Kuile, F.O., Kariuki, S., Nahlen, B.L., Lal, A.A., Udhayakumar, V. (2002). Protective effects of the sickle cell gene against malaria morbidity and mortality. Lancet 359, 1311-1312. Anderson, L.V., Harrison, R.M., Pogue, R., Vafiadaki, E., Pollitt, C., Davison, K., Moss, J.A., Keers, S., Pyle, A., Shaw, P.J., Mahjneh, I., Argov, Z., Greenberg, C.R., Wrogemann, K., Bertorini, T., Goebel, H.H., Beckmann, J.S., Bashir, R., Bushby, K.M. (2000). Secondary reduction in calpain 3 expression in patients with limb girdle muscular dystrophy type 2B and Miyoshi myopathy (primary dysferlinopathies). Neuromuscul Disord 10, 553-559. Anderson, L.V.B., Davison, K., Moss, J.A., Richard, I., Fardeau, M., Tomè, F.M.S., Hübner, C., Lasa, A., Colomer, J., Beckmann, J.S. (1998). Characterization of Monoclonal Antibodies to Calpain 3 and Protein Expression in Muscle from Patients with Limb-Girdle Muscular Dystrophy Type 2A. Am J Pathol 153, 1169-1179. Backman, E. and Henriksson, K.G. (1990). Effect of sodium selenite and vitamin E treatment in myotonic dystrophy. J Intern Med 228, 577-581. Baghdiguian, S., Martin, M., Richard, I., Pons, F., Astier, C., Bourg, N., Hay, R.T., Chemaly, R., Halaby, G., Loiselet, J., Anderson, V.B., De Munain, A.L., Fardeau, M., Mangeat, P., Beckmann, J.S., Lefranc, G. (1999). Calpain 3 defiency is associated with myonuclear apoptosis and profound pertubation of the IκBα/NF-κB pathway in limb-girdle muscular dystrophy typ 2A. Nat Med 5, 503-511. Baghdiguian, S., Richard, I., Martin, M., Coopman, P., Beckmann, J.S., Mangeat, P., Lefranc, G. (2001). Pathophysiology of limb girdle muscular dystrophy type 2A: hypothesis and new insights into the IκBα/NF-κB survival pathway in skeletal muscle. J Mol Med 79, 254-261. Beckmanm, J.S., Richard, I., Hillaire, D., Broux, O., Antignac, C., Bois, E., Cann, H., Cottingham, R.W. Jr., Feingold, N., Feingold, J., et al. (1991). A gene for limb-girdle muscular dystrophy maps to chromosom 15 by linkage analysis. CR Acad Sci III 312, 141-148. Beckmann, J.S. (1996). The Réunion Paradox and the Digenic Model. Am J Hum Genet 59, 1400-1402. Blake, D.J., Weir, A., Newey, S.E., Davies, K.E. (2002). Function and Genetics of Dystrophin and Dystrophin-Related Proteins in Muscle. Physiol Rev 82, 291-329.


Brockington, M., Yuva, Y., Prandini, P., Brown, S.C., Torelli, S., Benson, M.A., Herrmann, R., Anderson, L.V., Bashir, R., Burgunder, J.M., Fallet, S., Romero, N., Fardeau, M., Straub, V., Storey, G., Pollitt, C., Richard, I., Sewry, C.A., Bushby, K., Voit, T., Blake, D.J., Muntoni, F. (2001). Mutations in the fukutin-related protein gene (FKRP) identify limb girdle muscular dystrophy 2I as a milder allelic variant of congenital muscular dystrophy MDC1C. Hum Mol Genet 10, 2851-2859. Brown, R.H. Jr. (1997). Dystrophin-associated proteins and the muscular dystrophies. Annu Rev Med 48, 457-466. Bushby, K. (1996). Understanding the heterogeneity of the limb-girdle muscular dystrophies. Biochem Soc Trans 24, 489-496. Bushby, K.M.D. (1997). The Limb-Girdle Muscular Dystrophies. Diagnostic Criteria for Neuromuscular Disorders. 2nd Edition. Edited by Emery, A.E.H. Royal Society of Medicine Press, London, 17-22. Bushby, K.M.D. (1999). Invited Review, Making sense of the limb-girdle muscular dystrophies. Brain 122, 1403-1420. Bushby, K.M.D. (1999). The limb-girdle muscular dystrophies - multiple genes, multiple mechanisms. Hum Mol Genet 8, Review 1875-1882. Bushby, K. (2001). The limb-girdle msucular dystrophies. Gene Table. Eur J Paediatr Neurol 5, 213-214. Campbell, K.P. and Kahl, S. (1989). Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature 338, 259-262. Cardozo, A.K., Kruhoffer, M., Leeman, R., Orntoft, T., Eizirik, D.L. (2001). Identification of novel cytolkine-induced genes in pancreatic [beta]-cells by high-density oligonucleotide arrays. (Rapid Publication). Diabetes, www.diabetes.org/diabetes (Zugriff vom 10.01.2004). Chae, J., Minami, N., Jin, Y., Nakagawa, M., Murayama, K., Igarashi, F., Nonaka, I. (2001). Calpain 3 gene mutations: genetic and clinico-pathologic findings in limb-girdle muscular dystrophy. Neuromuscul Disord 11, 547-555. Chou, F.L., Angelini, C., Daentl, D., Garcia, C., Greco, C., Hausmanowa-Petrusewicz, I., Fidzianska, A., Wessel, H., Hoffman, E.P. (1999). Calpain III mutation analysis of a heterogeneous limb-girdle muscular dystrophy population. Neurology 52, 1015-1020. Cobben, J.M., van der Steege, G., Grootscholten, P., de Visser, M., Scheffer, H., Buys, C.H.C.M. (1995). Deletions of the survival motor neuron gene in unaffected siblingsof patients with spinal muscular atrophy. Am J Hum Genet 58, 805-808.


De Tullio, R., Stifanese, R., Salamino, F., Pontremoli, S., Melloni, E. (2003). Characterization of a new p94-like calpain form in human lymphocytes. Biochem J 375, 689-696. Emery, A.E.H. (1998). The muscular dystrophies. BMJ 317, 991-995. Fanin, M., Nascimbeni, A.C.., Fulizio, L., Trevisan, C.P., Meznaric-Petrusa, M., Angelini. C. (2003). Loss of Calpain-3 Autocatalytic Activity in LGMD2A Patients with Normal Protein Expression. Am J Pathol 163, 1929-1936. Fukuda, M. and Mikoshiba, K. (2001). Correspondence. Tac2-N, an atypical C-type tandem C2 protein localized in the nucleus. FEBS Letters 503, 217-218. Gamez, J., Navarro, C., Andreu, A.L., Fernandez, J.M., Palenzuela, L., Tejeira, S., Fernandez-Hojas, R., Schwartz, S., Karadimas, C., DiMauro, S., Hirano, M., Cervera, C. (2001). Autosomal dominant limb-girdle muscular dystrophy: a large kindred with evidence for anticipation. Neurology 56, 450-454. Gardner-Medwin, D. (1980). Clinical Features and Classification of Muscular Dystrophies. Br Med Bull 36, 109-115. Ghosh, S., May, M.J., Kopp, E.B. (1998). NF-κB and Rel proteins: Evoulutionary Conserved Mediators of Immune Responses. Annu Rev Immunol 16, 225-260. Gleixner, C., Müller, M., Wirth, S. (1999). Neurologie und Psychatrie für Studium und Praxis: unter Berücksichtigung des Gegenstandskataloges und der mündlichen Examina in den Ärztlichen Prüfungen 2000/01. 241-265. Goll, D.E., Thompson, V.F., Li, H., Wie, W., Cong, J. (2003). The Calpain System. Physiol Rev 83, 730-831. Häffner, K., Speer, A., Hübner, C., Voit, T., Oexle, K. (1998). A small in-frame deletion within the protease domain of muscle-specific calpain, p94 causes early-onset limb-girdle muscular dystrophy. Hum Mutat Suppl 1, 298-300. Han, Y., Weinman, S., Boldogh, I., Walker, R.K., Brasier, A.R. (1999). Tumor necrosis factor-alpha-inducible IkappaBalpha proteolysis mediated by cytosolic m-clapain. A mechanism parallel to the ubiquitin-proteasome pathway for nuclear factor-kappab activation. J Biol Chem 274, 787-794. Haravuori, H., Vihola, A., Straub, V., Auranen, M., Richard, I., Marchand, S., Voit, T., Labeit, S., Somer, H., Peltonen, L., Beckmann, J.S., Udd, B. (2001). Secondary calpain3 deficiency in 2q-linked muscular dystrophy: titin is the candidate gene. Neurology 56, 869-877. Hayashi, K. (1992). PCR-SSCP: a method for detection of mutations. Genet Anal Tech Appl 9, 73-79.


Herasse, M., Ono, Y., Fourgerousse, F., Kimura, E., Stockholm, D., Beley, C., Montarras, D., Pinset, C., Sorimachi, H., Suzuki, K., Beckmann, J.S., Richard, I. (1999). Expression and Functional Characteristics of Calpain 3 Isoforms Generated through Tissue-Specific Transcriptional and Posttranscriptional Events. Mol Cell Biol 19, 4047-4055.

Jaeckel, S., Epplen, J.T., Kauth, M., Miterski, B., Tschentscher, F., Epplen, C. (1998). Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism or how to detect reliably and efficiently each sequence variation in many samples and many genes. Electrophoresis 19, 3055-3061.

Jia, Z., Petrounevitch, V., Wong, A., Moldoveanu, T., Davies, P.L., Elce, J.S., Beckmann, J.S. (2001). Mutations in Calpain 3 Associated with Limb Girdle Muscular Dystrophy: Analysis by Molecular Modeling and by Mutation in m-Calpain. Biophys J 80, 2590-2596. Kaczanowski, R., Trzeciak, L., Kuchareczyk, K. (2001). Multitemperature single-strand conformation Polymorphism. Electrophoresis 22, 3539-3545. Kajiwara, K., Berson, E.L., Dryja, T.P. (1994). Digenic retinitis pigmentosa due to mutations at the unlinked peripherin/RDS and ROM1 loci. Science 264, 1604-1608. Kinbara, K., Sorimachi, H., Ishiura, S., Suzuki, K. (1997). Muscle-specific calpain, p94, interacts with the extreme C-terminal region of connectin, a unique region flanked by two immunoglobulin C2 motifs. Arch Biochem Biophys 342, 99-107. Kinbara, K., Ishiura, S., Tomioka, S., Sorimachi, H., Jeong, S.-Y., Amano, S., Kawasaki, H., Kolmerer, B., Kimura, S., Labeit, S., Suzuki, K. (1998). Purification of native p94, a muscle-specific calpain, and characterization of its autolysis. Biochem J 335, 589-596. Knippers, R. (2001). Molekulare Genetik. Georg Thieme Verlag Stuttgart Kuklin, A., Munson, K., Gjerde, D., Haefele, R., Taylor, P. (1998). Detection of single nucleotide polymorphisms with the WAVE DNA fragment analysis system. Genet Test 1, 201-206. Kumanoto, T., Hidetsugu, U., Watanabe, S., Yoshioka, K., Mike, T., Goll, D., Ando, M., Tsuda, T. (1995). Immunohistochemical study of calpain and ist endogenous inhibitor in the skeletal muscle of muscular dystophy. Acta neuropathologica 89, 399-403. Leren, T.P., Solberg, K., Rodningen, O.K., Ose, L., Tonstad, S., Berg, K. (1993). Evaluation of running conditions for SSCP analysis: application of SSCP for detection of point mutations in the LDL receptor gene. PCR Methods Appl 3, 159-162.


Lin, S., Liechti-Gallati, S., Burgunder, J.M. (1999). Neue Erkenntnisse bei den Muskeldystrophien: aktualisierter Abklärungsplan. Schweiz Med Wochenschr 129, 1141-1151. Lombardi, A.M., Sartori, M.T., Cabrio, L., Fadin, M., Zanon, E., Girolami, A. (2003). Severe prekallikrein (Fletcher factor) deficiency due to a compound heterozygosis (383Trp stop codon and Cys529Tyr). Thromb Haemost 90, 1040-1045. Lopate G. (2001). Limb-Girdle Muscular Dystrophy. EMedicine J 2, http://www.emedicine.com/neuro/topic189.htm (Zugriff vom 08.04.2002) Ma, H., Fukiage, C., Azuma, M., Shearer, T.R. (1998). Cloning and expression of mRNA for calpain Lp82 from rat lens: splice variant of p94. Invest Ophthalmol Vis Sci 39, 454-461. Michalak, M. and Opas, M. (1997). Functions of dystrophin and dystrophin associated proteins. Curr Opin Neurol 10, 436-442. Minami, N., Nishino, I., Kobayashi, O., Ikezoe, K., Goto, Y., Nonaka, I. (1999). Mutations of calpain 3 gene in Patients with sporadic limb-girdle muscular dystrophy in Japan. J Neurol Sci 171, 31-37. Mortier, W. (1994). Muskel- und Nervenerkrankungen im Kindesalter. Georg Thieme Verlag Stuttgart. Mulligan, L.M., Eng, C., Attié, T., Lyonnet, S., Marsh, D.J., Hyland, V.J., Robinson, B.G., et al. (1994). Diverse phenotypes associated with exon 10 mutations of the Ret proto-oncogene. Hum Mol Genet 3, 2163-2167. Oefner, P.J. and Underhill, P.A. (1995). Comparative DNA sequencing by denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC). Am J Hum Genet 57, 1547. Ono, Y., Shimada, H., Sorimachi, H., Richard, I., Saido, T.C., Beckmann, J.S., Ishiura, S., Suzuki, K. (1998). Functional Defects of a Muscle-specific Calpain, p94, Caused by Mutations Associated with Limb-Girdle Muscular Dystrophy Type 2A. J Biol Chem 273, 17073-17078. Ono, Y., Sorimachi, H., Suzuki, K. (1999). New Aspect of the Research on Limb-Girdle Muscular Dystrophy 2A: A Molecular Biologic and Biochemical Approach to Pathology. Trends Cardiovasc Med 9, 114-118. Ono, Y., Kakinuma, K., Torii, F., Irie, A., Nakagawa, K., Labeit, S., Abe, K., Suzuki, K., Sorimachi, H. (2004). Possible Regulation of the Conventional Calpain System by Skeletal Muscle-specific Calpain, p94/Calpain 3. J Biol Chem 279, 2761-2771.


Penisson-Besnier, I., Richard, I., Dubas, F., Beckmann, J.S., Fardeau, M. (1998). Pseudometabolic expression and phenotypic variability of calpain deficiency in two siblings. Muscle Nerve 21, 1078-1080. Peters, M.F., Adams, M.E., Froehner, S.C. (1997). Differential association of syntrophin pairs with the dystrophin complex. J Cell Biol 138, 81-93. Pogue, R., Anderson, L.V.B., Pyle, A., Sewry, C., Pollitt, C., Johnson, M.A., Davison, K., Moss, J.A., Mercuri, E., Muntoni, F., Bushby, K.M.D. (2001). Strategy for mutation analysis in the autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophies. Neuromuscul Disord 11, 80-87. Pollitt, C., Anderson, L.V.B., Pogue, R., Davison, K., Pyle, A., Bushby, K.M.D. (2001). The phenotype of calpainopathy: diagnosis based on multidisciplinary approach. Neuromuscul Disord 11, 287-296. Pratt, V.M., Jackson, C.E, Wallace, D.C., Gurley, D.S., Feit, A., Feldman, G.L. (1997). DNA Studies of Limb-Girdle Muscular Dystrophy Type 2A in the Amish Exclude a Modifying Mitochondrial Gene and Show No Evidence for a Modifying Nuclear Gene. Am J Hum Genet 61, 231-233. Restagno, G., Romero, N., Richard, I., Beckmann, J.S., Pagliano, M., Ferrone, M., Carbonara, A., Merlini, L. (1996). Prenatal diagnosis of limb-girdle muscular dystrophy type 2A. Neuromuscul Disord 6, 173-176. Reuther, J.Y., Baldwin, A.S. Jr. (1999). Apoptosis promotes a caspase-induced amino-terminal truncation of IkappaBalpha that functions as a stable inhibitor of NF-kappaB. J Biol Chem 274, 20664-20670. Richard, I. and Beckmann, J.S. (1995). How neutral are synonymous codon mutations? Nature Genetics 10, 259. Richard, I., Broux, O., Allamand, V., Fourgerousse, F., Chiannikulchai, N., Bourg, N., Brenguier, L., Devaud, C., Pasturaud, P., Roudaut, C., Hillaire, D., Passos-Bueno, M.R., Zatz, M., Tischfield, J.A., Fardeau, M., Jackson, C.E., Cohen, D., Beckmann, J.S. (1995). Mutations in the Proteolytic Enzyme Calpain 3 Cause Limb-Girdle Dystrophy Type 2A. Cell 81, 27-40. Richard, I., Brenguier, L., Dinçer, P., Roudaut, C., Bady, B., Burgunder, J.M., Chemaly, R., Garcia, C.A., Halaby, G., Jackson, C.E., Kurnit, D.M., Lefranc, G., Legum, C., Loiselet, J., Merlini, L., Nivelon-Chevallier, A., Ollagnon-Roman, E., Restagno, G., Topaloglu, H., Beckmann, J.S. (1997). Multiple Independent Molecular Etiology for Limb-Girdle Muscular Dystrophy Type 2A Patients from Various Geographical Origins. Am J Hum Genet 60, 1128-1138.


Richard, I., Roudaut, C., Saenz, A., Pogue, R., Grimbergen, E.M.A., Anderson, L.V.B., Beley, C., Cobo, A.M., de Dieogo, C., Eymard, B. (1999). Gallano P, Ginjaar HB, Lasa A, Pollitt C, Topaloglu H, Urtizberea JA, de Visser M, van der Kooi, A, Bushby K, Bakker E, Lopez de munain A, Fardeau M, Beckmann JS. Calpainopathie – A Survey of Mutations and Polymorphisms. Am J Hum Genet 64, 1524-1540. Richard, I., Roudaut, C., Marchand, S., Baghdiguian, S., Herasse, M., Stockholm, D., Ono, Y., Suel, L., Bourg, N., Sorimachi, H., Lefranc, G., Fardeau, M., Sebille, A., Beckmann, J.S. (2000). Loss of calpain 3 proteolytic activity leads to muscular dystrophy and to apoptosis-associated IκBα/NF-κB pathway pertubation in mice. J Cell Biol 151, 1583-1590. Rodriguez, M.S., Thompson, J., Hay, R.T., Dargemont, C. (1999). Nuclear Retention of IκBα Protects it from Signal-induced Degradation and Inhibits Nuclear Factor κB Transcriptional Activation. J Biol Chem 274, 9108-9115. Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B., Erlich, H.A. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-491. Salazar, L.A., Hirata, M.H., Hirata, R.D. (2002). Increasing the sensitivity of single-strand conformation polymorphism analysis of the LDLR gene mutations in brazilian patients with familial hypercholesterolemia. Clin Chem Lab Med 40, 441-445. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R. (1977). DNA-sequencing with chain-termination inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74, 5463-5467. Schwarzer, S. (2000). DHPLC spürt DNA-Mutationen auf. LaborPraxis 10, 28-30. Sheffield, V.C., Beck, J.S., Kwitek, A.E., Sandstrom, D.W., Stone, E.M. (1993). The sensitivity of single-strand conformation polymorphism analysis for the detection of single base substitutions. Genomics 16, 325-332. Sorimachi, H., Kinbara, K., Kimura, S., Takahashi, M., Ishiura, S., Sasagawa, N., Sorimachi, N., Shimada, H., Tagawa, K., Maruyama, K., Suzuki, K. (1995). Muscle-specific Calpain, p94, Responsible for Limb Girdle Muscular Dystrophy Type 2A, Associates with Connectin through IS2, a p94-specific Sequence. J Biol Chem 270, 31158-31162. Sorimachi, H., Toyama-Sorimachi, N., Saido, T.C., Kawasaki, H., Sugita, H., Miyasaka, M., Arahata, K., Ishiura, S., Suzuki, K. (1993). Muscle-specific calpain, p94, is degraded by autolysis immediately after translation, resulting in disappearance from muscle. J Biol Chem 268, 10593-10605.


Sorimachi, H., Ishiura, S., Suzuki, K. (1997). Structure and physiological function of calpains. Review Article. Biochem J 328, 721-732. Spencer, M.J., Tidball, J.G., Anderson, L.V., Bushby, K.M., Harris, J.B., Passos-Bueno, M.R., Somer, H., Vainzof, M., Zatz, M. (1997). Absence of calpain 3 in a form of limb-girdle muscular dystrophy (LGMD 2A). J Neurol Sci 146, 173-178. Spencer, M.J., Walsh, C.M., Dorshkind, K.A., Rodriguez, E.M., Tidball, J.G. (1997). Myonuclear Apoptosis in Dystrophic mdx Muscle Occurs by Perforin-mediated Cytotoxicity. J Clin Invest 99, 2745-2751. Spencer, M.J., Guyon, J.R., Sorimachi, H., Potts, A., Richard, I., Herasse, M., Chamberlain, J., Dalkilic, I., Kunkel, L.M., Beckmann, J.S. (2002). Stable expression of calpain 3 from a muscle transgene in vivo: Immature muscle in transgenic mice suggests a role for calpain 3 muscle maturation. PNAS 99, 8874-8879. Stenson, P.D., Ball, E.V., Mort, M., Phillips, A.D., Shiel, J.A., Thomas, N.S., Abeysinghe, S., Krawczak, M., Cooper, D.N. (2003). Human Gene Mutation Database (HGMD®) Human Mutation 21, 577-581. Taliani, M.R., Roberts, S.C., Dukek, B.A., Pruthi, R., Nichols, W.L., Heit, J.A. (2001). Sensitivity and Specificity of Denaturing High-Pressure Liquid Chromatography for Unknown Protein C Gene Mutations. Genet Test 5, 39-44. Talim, B., Ognibene, A., Mattioli, E., Richard, I., Anderson, L.V.B., Merlini, L. (2001). Normal calpain expression in genetically confirmed limb-girdle muscular dystrophy type 2A. Neurology 56, 392-393. Tanaka, K., Kawakami, T., Tateishi, K., Yahiroda, H., Chiba, T. (2001). Control of IkappaBalpha proteolysis by the ubiquitin-proteasome pathway. Biochimie 83, 351-356. Taveau, M., Bourg, N., Sillon, G., Roudaut, C., Bartoli, M., Richard, I. (2003). Calpain 3 Is Activated through Autolysis within the Actie Site and Lyses Sarcomeric and Sarcolemmal Components. Mol Cell Biol 23, 9127-9135. Taylor, P., Munson, K., Gjerde, D. (1999). Detection of Mutations and Polymorphisms on the WAVE® Nuleic Acid Fragmet Analysis System. Transgenomic, Inc. Application Note 101 Teschauer, W., Mussack, T., Braun, A., Waldner, H., Fink, E. (1996). Conditions for single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis with broad applicability: a study on the effects of acrylamide, buffer and glyderol concentrations in SSCP analysis of exons of the p53 gene. Eur J Clin Chem Clin Biochem 34, 125-131.


Trapani, J.A., Jans, D.A., Jans, P.J., Smyth, M.J., Browne, K.A., Sutton, V.R. (1998). Efficient nuclear targeting of granzyme B and the nuclear consequences of apoptosis induced by granzyme B and perforin are caspase-dependent, but cell death is caspase-independent. J Biol Chem 273, 27934-27938. Urtasun, M., Sáenz, A., Roundaut, C., Poza, J.J., Urtizberea, J.A., Cobo, A.M., Richard, I., Garcia Bragado, F., Leturcq, F., Kaplan, J.C., Marti Masso, J.F., Beckmann, J.S., Lopez de Munain, A. (1998). Limb-girdle muscular dystrophy in Guipúzcoa (Basque Country, Spain). Brain 121, 1735-1747. Walter, M.C., Lochmuller, H., Reilich, P., Klopstock, T., Huber, R., Hartrard, M., Hennig, M., Pongratz, D., Muller-Felber, W. (2000). Creatine monohydrate in muscular dystrophies: A double-blind placebo-controlled clinical study. Neurology 54, 1848-1850. Walton, J.N. and Nattrass F.J. (1954). On the classification, natural history and treatment of the myopathies. Brain 77, 169-231. Wang, C., Xu, J., Carter, T.A., Ross, B.M., Dominski, M.K., Bellcross, C.A., Penchaszadeh, G.K., et al. (1996). Characterization of survival motor neuron (SMNT) gene deletions in asymptomatic carriers of spinal muscular dystrophy. Hum Mol Genet 5, 359-365. Weilbach, F.X., Kreß, W., Straßburg, H.M., Müller, C.R., Gold, R. (1999). Aktuelle Diagnostik bei Muskeldystrophien. Springer Verlag. Nervenarzt 70, 89-100. Wheeler, M.T., Zarnegar, S., McNally, E.M. (2002). Zeta-sarcoglycan, a novel component of the sarcoglycan complex, is reduced in muscular dystrophy. Hum Molec Genet 11, 2147-2154. Wong, B.L. and Christopher, C. (2002). Corticosteroids in duchenne muscular dystrophy: a reappraisal. J Child Neurol 17, 183-190. Xiao, W. and Oefner, P.J. (2001). Denaturing high-performance liquid chromatography: A review. Hum Mutat 17, 439-474. Yoshida, M., Noguchi, S., Wakabayashi, E., Piluso, G., Piluso, G., Belstio, A., Nigro, V., Ozawa, E. (1997). The fourth component of the sarcoglycan complex. FEBS Lett 403, 143-148.

7. Danksagung

Mein Dank gilt...

... Herrn Prof. Dr. med. Jörg T. Epplen für die Bereitstellung des interessanten

Themas, seine uneingeschränkte Unterstützung und umfassende Beratung

... Herrn Prof. Dr. med. Wilhelm Mortier, Frau Dr. med. Ulrike Schara und Herrn

Dr. med. Matthias Vorgerd für das freundliche zur Verfügung stellen der

Patientengruppe

... Herrn Dr. med. Martin Gencik, Herrn Dipl.-Biol. Peter Jagiello und Frau Dipl.-

Biol. Larissa Arning für die ausgezeichnete Betreuung im Verlauf dieser

Arbeit sowohl in praktischen als auch in theoretischen Fragen und für die

ständige Diskussionsbereitschaft

... Frau Dr. rer. nat. Gabriele Dekomien für die ständige Diskussionsbereitschaft

und kritischen Anmerkungen zur vorliegenden Arbeit

... der gesamten Arbeitsgruppe, Dr. med. Martin Gencik, MUDr. Alexandra

Gencikova, Dr. med. Stefan Wieczorek, Dipl.-Biol. Peter Jagiello, Dipl.-Biol.

Larissa Arning, Ingrid Alheite und Yvonne Klenk für die moralische

Unterstützung

... dem gesamten Humangenetischen Team, das sich jederzeit hilfsbereit und

diskussionsbereit zeigte

... ganz besonders meinen Eltern, Mary und Paul Plammootil, und meiner

Schwester, Suma Plammootil, für die Ermöglichung meines bisherigen

Werdegangs und ihre stetige Unterstützung

8. Lebenslauf

Name, Vorname Plammootil, Salma Martha

Geburtsdatum/-ort 13. Februar 1979 in Frankfurt am Main

Adresse Goldammerweg 26, 58455 Witten

Schulausbildung 1985 - 1988 Breddeschule Witten, Grundschule

1988 - 1997 Ruhr-Gymnasium Witten

1997 Allgemeine Hochschulreife

Studium 10/1997 - 5/2004 Studium der Humanmedizin an der

Ruhr-Universität Bochum (RUB)

8/1999 Ärztliche Vorprüfung

2/2000 Famulatur in der Gastroenterologie (EVK Witten)

8/2000 erstes Staatsexamen

9/2000 Famulatur in der Abteilung für Humangenetik (RUB)

3/2001 Famulatur in der Allgemeinmedizin (Praxis Dr. med.

V. Krüger, Dortmund)

9/2002 Famulatur in der Inneren Medizin (St. Martha’s

Hospital, Bangalore, India)

3/2003 zweites Staatsexamen

4/2003 – 3/2004 Praktisches Jahr

Chirurgie Tertial im Sane Guruji Arogya Kendra

Hospital, Pune, Indien; Innere Tertial im St. John’s

Medical College Hospital, Bangalore, Indien;

Anästhesie Tertial in der Augusta-Krankenanstalt-

Bochum

5/2004 voraussichtlich drittes Staatsexamen

Auszeichnungen 2/2002 Promotionsstipendium der medizinischen Fakultät

(RUB)

aus der abteilung für humangenetik der ruhr … · dmso dimethylsulfoxid dna...

Documents