aus der chirurgischen klinik und poliklinik · aus der chirurgischen klinik und poliklinik der...
TRANSCRIPT
Aus der Chirurgischen Klinik und Poliklinik
der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil - Universitätsklinik -
der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. T. A. Schildhauer
Die Interaktionen von Silber-Nanopartikeln mit humanen mesenchymalen Stammzellen
Inaugural-Dissertation zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer
Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von Julia Katharina Gorenc
aus Castrop-Rauxel 2012
Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla Referent: Prof. Dr. rer. nat. M. Köller Korreferent: Prof. Dr. med. P. Krieger Tag der Mündlichen Prüfung: 19.11.2013
3
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 5
1.1 Nanotechnologie und ihre Bedeutung für die Medizin 5
1.2 Die Rolle von Silber-Nanopartikeln 7
1.2.1 Antimikrobielle Wirkung von Silber und Silberresistenzen 10
1.2.2 Nanosilber in der Medizin 11
1.3 Zellulärer Transport von Nanopartikeln 12
1.3.1 Endozytose 13
1.3.1.1 Phagozytose 14
1.3.1.2 Pinozytose 15
1.3.2 Exozytose 16
1.4 Humane mesenchymale Stammzellen 18
1.5 Biologische Bedeutung der Zytokine IL-6, -8, -11 und VEGF 21
2 Zielsetzung der Arbeit 22
3 Material und Methoden 24
3.1 Reagenzien und Geräte 24
3.1.1 Rekombinante humane Zytokine und Antikörper 26
3.2 Synthese von Silber-Nanopartikeln 27
3.3 Zellkultur 28
3.3.1 Gewinnung primärer humaner mesenchymaler Stammzellen
(hMSC) aus Knochenmarksaspiraten 28
3.3.2 Kultivierung von hMSC 29
3.3.3 Passagieren von hMSC 30
3.3.4 Einfrieren und Auftauen von hMSC 30
3.3.5 Aussaat von hMSC 31
3.3.6 Inkubation von hMSC mit Silber-Nanopartikeln 31
3.4 Mikroskopie 32
3.4.1 Lichtmikrokopie 32
3.4.2 Fluoreszenzmikroskopie 33
3.4.3 Focussed Ion Beam-Technik und
Rasterelektronenmikroskopie (FIB/REM-Technik) 33
3.5 Durchflusszytometrie 34
3.6 Sandwich-ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 35
3.7 Atomabsorptionsspektroskopie 37
4
3.8 Immuncytochemie 38
3.8.1 Färbung des Golgi-Apparates 38
3.8.2 Färbung der Lysosomen 38
3.8.3 Färbung des Nucleus 38
3.9 Statistik 39
4 Ergebnisse 40
4.1 Aufnahme von Polyvinylpyrrolidon (PVP)- stabilisierten
Silber-Nanopartikeln (Ag-NP) durch humane mesenchymale
Stammzellen (hMSC) 40
4.2.1 Analyse der intrazellulärem Silberkinetik bei Langzeitkultivierung 41
4.2.2 Rolle der exogenen Proteine 45
4.2.3 Analyse des Zellkultur-Überstandes hinsichtlich seines
Silbergehaltes 47
4.2.4 Intrazelluläre Lokalisation der Ag-NP in hMSC 48
4.2.5 Albuminabhängige Abnahme der SSC-Intensität 49
4.2.6 Zelluläre Transportinhibition 51
4.3 Aktivierung von hMSC unter dem Einfluss von Ag-NP 52
5 Diskussion 55
5.1 Aufnahme von PVP-stabilisierten Ag-NP in hMSC 55
5.2 Ag-NP induzierte Aktivierung von hMSC 58
5.3 Das Schicksal der internalisierten Nanopartikel 61
5.3.1 Intrazelluläre Lokalisation von Nanopartikeln 61
5.3.2 Die Kinetik des aufgenommenen Silbers bei
Langzeitkultivierung 63
6 Zusammenfassung 69
7 Literaturverzeichnis 73
Danksagung
Lebenslauf
5
1 Einleitung
1.1 Nanotechnologie und ihre Bedeutung für die Medizin
Der Ausdruck Nanotechnologie beschreibt eine Reihe von Technologien, die sich
mit der Erforschung, Herstellung und Anwendung von Materialien im nanoskaligen
Bereich befassen (Jain, 2010; Lauterwasser, 2005), das bedeutet mit Strukturen,
die 80.000 Mal kleiner sind als der Durchmesser eines menschlichen Haares
(1 Nanometer = 10-9 m) (Grobe et al., 2008). Sie ist als interdisziplinäre
Wissenschaft anzusehen, die Bereiche der Physik, Chemie, Biologie,
Materialwissenschaften und der Medizin in sich vereint (Freedman, 1991; Wagner
and Zweck, 2008). Nanopartikuläre Materialien weisen im Vergleich zu Materialien
größerer Dimensionen veränderte physikalische und chemische Eigenschaften
auf. Dies ist hauptsächlich durch das vergrößerte Oberflächen-Volumen Verhältnis
bedingt, welches zu einer gesteigerten Reaktivität führt (Grainger, 2008;
Wijnhoven et al., 2009). Diese einzigartigen Charakteristika eröffnen Möglichkeiten
für die Entwicklung neuer innovativer Nanosysteme in verschiedenen Bereichen,
wie unter anderem der Elektronik, der Lebensmittelindustrie, der Medizin, der
Autoindustrie und der Oberflächenbehandlungstechnologie (Roszek et al., 2005).
Aus diesem Grund wird die Nanotechnologie als vielversprechende
Zukunftstechnologie angesehen. Sie begegnet uns z. B. in wasserabweisenden
Glasscheiben, bei denen durch nanostrukturierte Oberflächen der aus der Natur
bekannte Lotus-Effekt (Abb. 1) nachgeahmt wird, oder auch in leistungsfähigeren
Computerchips, deren Entwicklung erst durch die Herstellung immer kleinerer
Transistoren in der Nanotechnologie ermöglicht wird (Ensikat et al., 2011; Wagner
and Zweck, 2008; Hwang et al., 2009).
Abb. 1: Der Lotus-Effekt: Durch die nanostrukturierte Oberfläche des Blattes perlt das Wasser in
Form von Tropfen ab (Quelle: http://futureprospects.files.wordpress.com/2010/05/lotuseffekt.jpg)
6
Unter den vielen zukunftsträchtigen Anwendungen der Nanotechnologie nimmt der
Bereich der Medizin eine besondere Stellung ein, denn er ist im hohen Maße mit
Erwartungen und Hoffnungen verbunden (Grobe et al., 2008). Im Einzelnen
umfasst das Spektrum der medizinischen Anwendungsmöglichkeiten die
Chirurgie, die Krebsdiagnostik und –therapie, die Biodetektion von
Erkrankungsmarkern, die Pharmakotherapie, die molekulare Bildgebung, die in-
vitro Diagnostik, die Implantattechnologie und das Tissue engineering (Roszek et
al., 2005). Beispielsweise ermöglichen innovative Nano-Transportsysteme eine
effizientere Pharmakotherapie, indem sie die Wirksubstanz vor dem Abbau
schützen oder diese als sogenannte Nanocarrier spezifisch ins erkrankte Gewebe
transportieren. Unerwünschte Nebenwirkungen können so reduziert werden
(Wang et al., 2011). Einen Fortschritt in der Krebstherapie könnte das
Thermoablationsverfahren bringen. Hierbei werden Nanopartikel im Tumorgewebe
angereichert und durch ein externes Magnetfeld oder einen Laser erhitzt, um die
Tumorzellen entweder direkt abzutöten oder sie sensibler für Chemotherapeutika
zu machen (Gilstrap et al., 2011; Jain, 2010). Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet
der Nanotechnologie ist die Herstellung von Biomaterialien, die z.B. für
orthopädische oder dentale Implantate verwendet werden (Roszek, 2005). Hier
können durch nanostrukturierte Oberflächenbeschichtungen zusätzlich die
Biokompatibilität und Haltbarkeit erhöht werden (Catledge et al., 2002). In der
Diagnostik erhofft man sich große Fortschritte durch die molekulare Bildgebung,
mit der Erkrankungen bereits im präklinischen Stadium identifiziert werden
können. Im Bereich der in-vitro Diagnostik werden wiederum schnellere und
genauere molekulare Verfahren basierend auf der Nanotechnologie entwickelt wie
beispielsweise die Lab-on-chip Technologie ((Schumacher et al., 2011; Roszek et
al., 2005; Grobe et al., 2008). Viele dieser Nanosysteme befinden sich noch im
Anfangsstadium ihrer Entwicklung. Jedoch wird eine wachsende Anzahl an
innovativen Medizinprodukten bereits klinisch erprobt oder ist kommerziell
erhältlich, darunter Knochenersatzmaterialien oder Wundauflagen (Roszek, 2005).
Diese Beispiele der Anwendungsmöglichkeiten aus der Medizin spiegeln das
große Potential der Nanotechnologie wieder.
Ein Schwerpunkt der Nanotechnologie liegt in der Herstellung sogenannter
Nanopartikel. Diese sind definiert als Partikel der Größenordnung 1-100
Nanometer (Oberdorster et al., 2005b). Sie können in verschiedenen Formen, wie
z.B. Kugeln oder Röhrchen erzeugt werden, wobei die Form auch einen Einfluss
7
auf die biologischen und physikalischen Eigenschaften haben kann (Mock, 2002;
Pal et al., 2007). Aufgrund ihrer geringen Größe besitzen sie eine große
biologische Reaktivität, sowie eine hohe Mobilität in der Umwelt und im Körper
(Chen and Schluesener, 2008) Außerdem können Eigenschaften wie die
mechanische Festigkeit, das Diffusionsverhalten und das optische und
magnetische Verhalten im Vergleich zum Ausgangsmaterial verändert sein
(Gleiter, 2000). Zu den Nanopartikeln mit einer großen kommerziellen Bedeutung
gehören die Silber-Nanopartikel (Ahamed et al., 2008).
1.2 Die Rolle von Silber-Nanopartikeln (Ag-NP)
Heute nehmen immer mehr neu entwickelte Nanomaterialien Einzug in die
Medizin, um den Bedarf an optimierten Diagnostik- sowie Therapieverfahren zu
decken (Sahay et al., 2010). In Nanoform appliziertes Silber spielt in diesem
Zusammenhang eine besondere Rolle.
Silber ist ein Edelmetall mit der Nummer 47 im Periodensystem der Elemente,
einem atomaren Gewicht von 107,8 und trägt das chemische Symbol Ag
(„argentum“). Es kann in vier verschiedenen Oxidationsstufen vorkommen: Ag0,
Ag+, Ag2+ und Ag3+, wobei die ersten beiden die häufigsten sind (Wijnhoven et al.,
2009). Reines Silber ist dehn- und formbar und besitzt die höchste thermische
sowie elektrische Leitfähigkeit aller Metalle (Nordberg and Gerhardsson, 1988).
Schon seit Tausenden von Jahren nutzen die Menschen Silber für die Herstellung
von Schmuck, Münzen, Servierplatten oder Bestecken. Später wurde außerdem
Sprengstoff oder Zahnersatz unter der Verwendung von Silber gefertigt (Chen and
Schluesener, 2008). Während des 20. Jahrhunderts hat sich der Bereich der
Fotografie und Fotochemie unter Gebrauch von Silbersalzen rasant entwickelt,
jedoch verliert Silber in diesem Bereich seit der Umstellung auf die digitale
Abbildtechnik an Bedeutung (Wijnhoven et al., 2009). Von den vielfältigen
Eigenschaften des Silbers war und ist jedoch seine antimikrobielle Wirkung jene
Eigenschaft, die man sich am häufgsten zu Nutze gemacht hat. So verwendete
man im Altertum Silbergefäße, um Wasser, Wein und Milch vor Verderb zu
schützen. Auch der antike Arzt Hippokrates schrieb Silberpuder heilungsfördernde
Eigenschaften zu und nutze es zur Behandlung von Ulcera (Chen and
Schluesener, 2008). Während des 1. Weltkrieges gab es bereits silberhaltige
Wundauflagen zur Prävention und Behandlung von Wundinfektionen, was Silber
8
zum Einstieg in die moderne Medizin verhalf (Vaidyanathan et al., 2009). Einen
großen Umbruch und Erfolg feierte man in der Medizin mit der Einführung des
Penicillins in den 1940er Jahren. Dieses wurde rasch zur Standardtherapie gegen
Infektionen, wodurch die Anwendung von Silber zunächst in den Hintergrund
geriet. Weitere Antibiotikaklassen folgten und man glaubte den Kampf gegen
humanpathogene Bakterien gewonnen zu haben (Chopra, 2007; Percival et al.,
2011; Sintubin et al., 2011). Durch den übermäßigen Gebrauch von Antibiotika in
den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Bakterienstämme jedoch
Antibiotikaresistenzen entwickelt, welche die Entwicklung neuer antimikrobieller
Agenzien zur Infektionsprophylaxe und –therapie unabdingbar machen (Morones
and Elechiguerra, 2005). Heutzutage ermöglicht es die Nanotechnologie Silber in
Nanoform herzustellen. Die synthetisierten Silber-Nanopartikel (Ag-NP), auch
Nanosilber genannt, sind definiert als Partikel einer Größenordnung von ca.
1-100 nm und enthalten 20-15.000 Silberatome (Abb. 2) (Chen and Schluesener
2007). Aufgrund ihrer geringen Größe und dem daraus resultierenden hohen
Oberflächen-Volumen-Verhältnis, besitzen Ag-NP im Vergleich zu Silber in
größeren Konfigurationen eine sehr viel höhere Reaktivität. Dies führt zu einer
gesteigerten Freisetzung von Silberionen, von denen man annimmt, dass sie die
biologisch aktive Silberspezies sind (Lok et al., 2006).
Abb. 2: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von PVP-stabilisierten Ag-NP in
verschiedenen Formen: Würfel (A), Stäbchen (B) und Kugeln (C); aus Kittler et al., 2010
Die Möglichkeit Materialien mit Ag-NP zu beschichten oder diese in Materialen
einzubringen hat Silber wieder ins Interesse von Wirtschaft und Forschung
gerückt. Dabei ist es insbesondere die antimikrobielle Wirkung, die Ag-NP große
Wachstumsmärkte eröffnet. So ist Nanosilber derweil eines der am schnellsten
wachsenden Produkte in der Nanomedizin. Von den derzeit über 600
kommerzialisierten Produkten von Nanomaterialien ist Nanosilber in ca. 250
Produkten enthalten (Brett, 2006; Laban et al., 2010). Neben Wundauflagen sind
9
mittlerweile z.B. silberhaltige Operationsbestecke, Knochenimplantate wie
Osteosyntheseplatten und Prothesen sowie Katheter entwickelt worden (Chen et
al., 2006; Cohen et al., 2007; Lansdown, 2006; Lansdown, 2010; Nair and
Laurencin, 2008; Wijnhoven et al., 2009). Aber nicht nur im medizinsichen Sektor
ist ein steigender Einsatz von Silber zu verzeichnen. Große Anwendung findet
Nanosilber in Bereichen wie der Textilindustrie, in der Herstellung von elektrischen
Haushaltsgeräten und der Nahrungsmittelindustrie (Zhang et al., 2005; Furno et
al., 2004; Santoro et al., 2007; Park et al., 2009; Poon and Burd, 2004).
Nanosilber wird beispielsweise zur Geruchsinhibition in Socken und
Sportbekleidung eingearbeitet (Benn and Westerhoff, 2008) und ist als
Beschichtung in Kühlschränken oder auf Computern zu finden. Ebenso findet es
Verwendung in Kosmetikartikeln, Raumsprays, Wasserreinigern oder auch in
Lebensmittelverpackungen (Wijnhoven et al., 2009). Diese Beispiele
verdeutlichen, wie hoch die alltägliche Silberexposition für die Menschen ist. Der
steigende Gebrauch von Nanosilber gibt Anlass zur Diskussion über eine
eventuelle toxische Wirkung auf menschliche Zellen. Denn durch ihre geringe
Größe können Nanosilberpartikel in Gewebe und Zellen eindringen und mit z.B.
Proteinen interagieren. In mehreren Studien konnte bereits gezeigt werden, dass
Nanosilber über verschiedene Resorptionswege (dermal, inhalativ, digestiv) in den
menschlichen Körper aufgenommmen wird und dosisabhängig in Organen wie der
Haut, der Leber, den Nieren, dem Herzen und dem Gehirn akkumulieren kann
(Takenaka et al., 2001; Ji et al., 2007; Trop et al., 2006). Ein Beispiel für die
Folgen, die chronische Silberexposition verursachen kann, ist die sogenannte
Argyrie. Es handelt sich hierbei um ein seltenes dermatologisches Krankheitsbild,
das durch eine gräuliche Hyperpigmentierung der Haut besonders an
lichtexponierten Stellen gekennzeichnet ist. Hautbiopsien der betroffenen
Personen identifizierten akkumuliertes Silber als Ursache für diese Dyspigmention
(White et al., 2003; Chang et al., 2006).
Da anzunehmen ist, dass der Gebrauch von Nanosilber auch in Zukunft weiter
steigen wird, ist es in Anbetracht der potentiellen toxischen Wirkungen von
immenser Wichtigkeit, die biologischen Effekte von Nanosilber auf menschliche
Zellen besser zu erforschen und zu verstehen. Nur so ist es möglich eine genaue
Risikoeinschätzungen für Mensch und Umwelt zu tätigen.
10
1.2.1 Antimikrobielle Wirkung von Silber und Silberresistenzen
Nanosilber wird aufgrund seiner antimikrobiellen Eigenschaften gegenüber
Bakterien, Pilzen und Viren zunehmend im medizinischen Bereich verwendet. In
zahlreichen Studien wurde bereits gezeigt, dass Ag-NP eine antibakterielle
Wirkung auf ein breites Spektrum an Gram-positiven, sowie Gram-negativen
Bakterien besitzen (Marambio-Jones and Hoek, 2010). Hierzu zählen unter
anderem humanpathogene Keime wie Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli oder Vibrio cholera
(Morones J.R., 2005; Jung et al., 2008; Cho et al., 2005; Greulich et al. 2012). Des
Weiteren ist eine Wirksamkeit gegen schwer mit Antibiotika zu therapierende
Stämme wie den Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und den
Methicillin-resistenten Staphylococcus epidermidis (MRSE) beschrieben, die im
klinischen Alltag ein großes Problem darstellen (Alt et al., 2004a; Lara et al.,
2011). Als klinisch relevante Pilze, gegen die Silber fungizid wirkt, sind Candida
albicans und Trichophyton mentagrophytes zu nennen (Kim et al., 2008). Ebenso
zeigen einige Studien, dass Ag-NP in der Lage sind, mit Viren wie beispielsweise
dem humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) und dem Hepatitis-B Virus zu
interagieren (Lu et al., 2008; Elechiguerra et al., 2005; Lara et al., 2010). Dass
Nanosilber antimikrobiell wirkt, ist somit hinreichend belegt, jedoch sind die
genauen zellulären Mechanismen dieses Effekts noch nicht vollkommen
verstanden (Marambio-Jones and Hoek, 2010). Es ist anzunehmen, dass
Silberionen (Ag+) die biologisch aktive Silberspezies sind und von Ag-NP
kontinuierlich frei gesetzt werden (Xiu et al. 2012; Park et al., 2009). Ag+ bilden
unlösliche Komplexe mit Sulphydrylgruppen wichtiger Transportproteine in der
Zellwand von Bakterien und Pilzen und blockieren so den transmembranären
Ernergiehaushalt und Elektrolyttransport (Samuel and Guggenbichler, 2004).
Zudem interagieren freie Ag+ mit metabolischen Enzymen wie der NADH-
Dehydrogenase und inhibieren so die bakterielle Atmungskette und damit die
ATP-Synthese. Auch ist eine Bindung von Ag+ an DNA mit der Konsequenz einer
gestörten Replikation beschrieben (Yang et al., 2009). Weitere Erklärungen für die
Toxizität sind die durch Nanosilber induzierte intrazelluläre Anreicherung von
freien Sauerstoffradikalen, die zu einer Schädigung der Membranintegrität, der
Mitochondrienfunktion und der DNA führen kann. Außerdem ist eine direkte
Schädigung der Bakterienzellwand durch die Penetration von Ag-NP möglich (Kim
11
et al., 2007; Choi and Hu, 2008; Choi et al., 2008). Silber hat demzufolge
zahlreiche Angriffspunkte innerhalb der Zelle, die seine vielfältigen toxischen
Wirkungen auf verschiedene Mikroorganismen erklären.
Dennoch ist es nicht ausgeschlossen, dass diese Mikroorganismen Resistenzen
gegen Silber entwickeln. Zum Beispiel konnten Silver et al. bereits eine Plasmid-
kodierte Silberresistenz in einem Salmonellen-Stamm nachweisen (Silver, 2003).
Derzeit sind bei weitem noch nicht so viele Silberresistenzen wie
Antibiotikaresistenzen beschrieben, jedoch sollte die Gefahr der
Resistenzentwicklung in Anbetracht der weiter steigenden Verwendung von Silber
nicht außer Acht gelassen werden.
1.2.2 Nanosilber in der Medizin
In der Medizin wird Silber insbesondere wegen der steigenden Anzahl an
Antibiotikaresistenzen in verschiedenen Formen zur lokalen Infektionsprophylaxe
und –therapie eingesetzt (Gordon et al., 2010). Ein vorwiegender Einsatzbereich
ist die Wundpflege, wo silberhaltige Wundauflagen, Cremes und Salben zur
Behandlung von Brandwunden (hier häufig in Kombination mit Sulfadiazin),
chronischen Wunden, diabetischen und nicht-diabetischen Ulcera,
Hauttransplantationsstellen und Spalthautentnahmestellen eingesetzt werden (Ip
et al., 2006; Silver et al., 2006; Church et al., 2006). Des Weiteren werden
Blasenkatheter, Zentral-Venenkatheter, Hämodialysekatheter und orthopädische
Implantate mit Nanosilber imprägniert oder beschichtet, um nosokomialen
Infektionen vorzubeugen (Stevens et al., 2009; Samuel and Guggenbichler, 2004;
Gordon et al., 2010). Fremdmaterialien bergen nämlich in hohem Maße die Gefahr
einer Bakterienkolonisation mit Ausbildung eines Biofilmes. Unter einem Biofilm
versteht man einen komplexen Verband von an Oberflächen adhärenten
Mikroorganismen, die sich in einer selbst sezernierten extrazellulären Matrix aus
Polysacchariden befinden (Wijnhoven et al., 2009). Diese Matrix bietet den
Keimen eine hervorragende Verteidigung gegen das menschliche Immunsystem
sowie gegen Antibiotika. Infolgedessen ist die von ihnen ausgelöste Infektion sehr
schwer zu therapieren. Häufig ist nur das Entfernen des infizierten
Fremdmaterials als erfolgsversprechende Therapie anzusehen, um die Infektion
einzudämmen (Furno et al., 2004). Im Falle von orthopädischen Implantaten ist
dies mit belastenden Revisionsoperationen verbunden (Zhao et al., 2009). Studien
12
beweisen, dass Silber die Formation eines Biofilmes inhibieren kann und daher
zur Infektionsprophylaxe geeignet ist (Roe et al., 2008; Percival et al., 2007).
Eine weitere mögliche Applikationsform von Nanosilber in der Orthopädie ist als
Zusatz in Knochenzement. Alt et al. konnten zeigen, dass unter der Verwendung
von mit Ag-NP behandeltem Knochenzement eine gute antibakterielle Wirkung
gegen multiresistente Keime erzielt wurde, die jener von mit Gentamicin
behandeltem Knochenzement überlegen war, bei gleichzeitig geringer Toxizität
gegen humane Zellen (Alt et al., 2004a; Alt et al., 2004b). Durch die topische
Applikation von Silber zur Infektionsprophylaxe können die Nebenwirkungen einer
systemischen Antibiotikatherapie vermieden und zugleich ein breites Spektrum an
Keimen getötet werden (Becker, 1999). Weitere Medizinprodukte dieser Art
befinden sich momentan in der Entwicklung mit dem Ziel der Prävention von
iatrogenen Infektionen. Potentielle Einsatzmöglichkeiten von Nanosilber sind
Kontaktlinsen (Weisbarth RE et al., 2007), Endotrachealtuben und
Beatmunsmasken, endovaskuläre und urologische Stents, Endoskope (Wijnhoven
et al., 2009)oder OP-Textilien (Li Y et al., 2006).
1.3 Zellulärer Transport von Nanopartikeln
Der steigende Gebrauch von Nanomaterialien gibt Anlass zur Diskussion über
deren potentiell schädigende Interaktionen mit Gewebezellen (eukaryoten Zellen).
Insbesondere Nanopartikel können aufgrund ihrer geringen Größe und hohen
Reaktivität in den menschlichen Körper eindringen und hier unerwünschte Effekte
hervorrufen (Unfried et al., 2007). Mögliche Eintrittspforten für Nanopartikel in den
menschlichen Körper sind die Inhalation, die Ingestion, die Resorption über Haut
und Schleimhäute und die Injektion (Drake and Hazelwood, 2005; Oberdorster et
al., 2005a). Auf diese Weise können die Nanopartikel in den Blutkreislauf
gelangen und sich im Körper verteilen. Beispielsweise zeigten Tang et al. in einer
in vivo Studie, dass subcutan injizierte Silber-Nanopartikel den Blutkreislauf
erreichten und in der Leber, den Nieren, der Milz, dem Gehirn und der Lunge
akkumulierten (Tang et al., 2009). Hieraus resultiert eine mögliche Quelle von
Nanopartikeltoxizität, nämlich deren Aufnahme in die Zelle, was die normale
Zellphysiologie und –funktion beeinflussen kann (Johnston et al., 2010a). Die
Aufnahme und Abgabe von Molekülen wird von der Zellmembran reguliert und
koordiniert. Kleine Moleküle wie Aminosäuren, Zucker oder Ionen können diese
13
über integrale Membranproteine, Pumpen oder Kanäle passieren. Makromoleküle,
zu denen auch Partikel zu zählen sind, müssen in einem komplexen Prozess in
Vesikeln, die sich aus der Zellmembran formen, in die Zelle transportiert werden
(Conner and Schmid, 2003). Diesen Prozess nennt man Endozytose. Der
entgegen gerichtete Vorgang, also die Ausschleusung von Stoffen, wird als
Exozytose bezeichnet. Auch dieser Vorgang beinhaltet die Fusion biologischer
Membranen.
1.3.1 Endozytose
Die Endozytose bietet der Zelle die Möglichkeit Inhaltsstoffe aus ihrer Umgebung
aufzunehmen und so mit ihrer Umgebung zu kommunizieren (Doherty and
McMahon, 2009). Insofern ist sie unabdingbar für das reibungslose Funktionieren
zahlreicher physiologischer Prozesse wie der Signaltransduktion, der
Immunantwort, der Antigenpräsentation und der Aufrechterhaltung der zellulären
Homöostase. Ferner unterliegt sie komplexen Regulationsmechanismen (Conner
and Schmid, 2003), anhand derer verschiedene Subtypen der Endozytose
charakterisiert werden. Im Allgemeinen lässt sich die Endozytose in die
Phagozytose und die Pinozytose unterteilen (Abb. 3). Die Phagozytose ist ein
Prozess, bei dem große Partikel internalisiert werden und ist wenigen
spezialisierten Zellarten vorbehalten (Rabinovitch M, 1995). Zur Pinozytose sind
alle Zellen des menschlichen Körpers fähig. Sie bezeichnet die Aufnahme kleiner,
gelöster Partikel und Flüssigkeiten und wird in vier weitere Mechanismen
unterteilt: Makropinozytose, Clathrin-abhängige Endozytose, Caveolae-abhängige
Endozytose und Clathrin-und Caveolae-unabhängige Endozytose (Zhang and
Monteiro-Riviere, 2009) (Abb. 3). Die Komplexität, mit der die Endozytose reguliert
wird, spiegelt die Wichtigkeit einer kontrollierten zellulären Stoffaufnahme für das
Funktionieren unseres Organismus wieder (Conner and Schmid, 2003).
1.3.1.1 Phagozytose
Die Phagozytose wird fast ausschließlich von spezialisierten Zellen, den
Phagozyten, vollzogen. Hierzu zählen Makrophagen, Monozyten, neutrophile
Granulozyten und dendritische Zellen. Andere Zellarten, wie Fibroblasten,
Epithelzellen und Endothelzellen weisen ebenfalls eine gewisse Phagozytose-
14
Aktivität auf, jedoch in viel geringerer Ausprägung (Hillaireau and Couvreur, 2009;
Aderem and Underhill, 1999). Der Vorgang der Phagozytose kann in der Regel in
drei Schritte unterteilt werden: Zunächst erfolgt die Markierung (Opsonierung) des
zu phagozytierenden Partikels mittels Immunglobulinen, Komponenten des
Komplementsystems, Serumproteinen u.a., welche von den Phagozyten durch
spezielle Rezeptoren erkannt werden. Aus der Bindung der Rezeptoren an die
Opsonine resultiert dann eine Anlagerung des markierten Partikels an die
Zellmembran des Phagozyten. Dieser Ligand-Rezeptor-Komplex führt schließlich
über eine Signalkaskade zu einer Umlagerung der Aktinfilamente und so zur
Ausbildung eines Phagosoms, wodurch der Partikel in die Zelle aufgenommen
wird (Sahay et al., 2010). Die Phagosomen fusionieren mit Lysosomen zu
Phagolysosomen, in denen die internalisierten Partikel letztlich abgebaut werden.
Auf diese Weise sind die Phagozyten in der Lage auch große Partikel, wie z.B.
Bakterien, Überbleibsel von toten Zellen oder intravasale Fettablagerungen zu
phagozytieren und abzubauen (Allen and Aderem, 1996). Gleichzeitig induziert die
Phagozytose eine partikel-spezifische zelluläre Antwort. Bakterien werden z.B.
durch die Freisetzung von Säuren, freien Sauerstoffradikalen und Hydrolasen,
direkt zerstört (Conner and Schmid, 2003).
1.3.1.2 Pinozytose
Die Pinozytose ist ein Prozess, bei dem die Zellen Flüssigkeiten und gelöste
Moleküle von bis zu 0,2 µm Größe aufnehmen (Hu, 2009). Sie findet in allen
eukaryoten Zellen statt und lässt sich in eine Clathrin-abhängige sowie eine
Clathrin-unabhängige Form unterteilen (Abb. 3).
Die Clathrin-abhängige Endozytose ist verantwortlich für die Aufnahme von
essentiellen Nährstoffen wie Cholesterin oder Eisen, die über Bindung an einen
spezifischen Membranrezeptor endozytiert werden (Schmid, 1997; Brodsky et al.,
2001). Des Weiteren ist sie durch die Internalisierung und den Abbau von
Rezeptoren in die „Runterregulation von Zellsignalen“ involviert und reguliert über
die Aufnahme von Membranpumpen die Zellhomöostase (Doherty and McMahon,
2009). Vermittelt wird die Clathrin-abhängige Endozytose über die Bildung
sogenannter „coated pits“ (Einbuchtungen der Zellmembran), induziert durch die
Bindung eines Liganden an seinen Transmembranzezeptor. Diese coated pits
formieren sich über die Polymerisation des im Cytosol ansässigen Proteins
15
Clathrin-1 mit Hilfe der Assemblierungsproteine AP180 und AP-2. Die Vesikel
(ca.120nm) werden vermittelt über die GTP-ase Dynamin von der
Plasmamembran abgeschnürt und ins Zellinnere transportiert, wo die Clathrinhülle
abdissoziiert. Die Vesikel werden nun frühe Endosomen genannt und fusionieren
mit Lysosomen, in deren saurem Milieu der Ligand von seinem Rezeptor
dissoziiert. Der endozytierte Vesikelinhalt wird weiteren intrazellulären
Stoffwechselprozessen zugeführt oder abgebaut, während die Rezeptoren wieder
zur Zellmembran transportiert werden (Sahay et al., 2010; Rassow et al. 2006).
Neben der Clathrin-abhängigen Endozytose sind bisher drei Clathrin-unabhängige
Endozytosemechanismen bekannt (Abb. 3), darunter die Caveolae-abhängige
Endozytose. Caveolae sind Cholesterin-und Sphingolipid reiche Einstülpungen
(60-80nm) der Zellmembran, die ihre spezifische Form und Struktur durch das
Cholesterin-bindende Protein Caveolin verliehen bekommen (Anderson, 1998;
Doherty and McMahon, 2009). Die Caveolae-abhängige Endozytose stellt den
wichtigsten Mechanismus für den transendothelialen Transport in Säugetieren dar
und erfüllt außerdem wichtige Aufgaben im Cholesterin- und
Glykosphingolipstoffwechsel (Oh et al., 2007; Doherty and McMahon, 2009). Nach
Anlagerung eines Liganden an die Membran formen sich Vesikel, die sogenannten
Caveosomen, die zum endoplasmatischen Retikulum transportiert werden ohne
mit Lysosomen zu fusionieren. Insgesamt ist dies verglichen mit der Clathrin-
abhängigen Endozytose ein langsamer Prozess, zugleich wird jedoch der
lysosomale Abbau vermieden, was sich Keime durchaus zu Nutze machen
können (Khalil et al., 2006).
Der zweite Typ der Clathrin-unabhängigen Endozytose, die Makropinozytose, ist
eine besondere Form der Endozytose. Im Gegensatz zu den bisher
beschriebenen zielgerichteten Prozessen, werden bei der Makropinozytose
unspezifisch Ausstülpungen der Zellmembran („membrane ruffling“) gebildet. Dies
erfolgt durch eine Aktivierung der Rezeptor-Tyrosinkinase durch
Wachstumsfaktoren und einer nachfolgenden Umstrukturierung des
Aktincytoskeletts (Conner and Schmid, 2003). Unter der Bildung von
Makropinosomen werden Extrazellularflüssigkeit und Nährstoffe aufgenommen.
Makropinosomen unterscheiden sich von anderen Endozytosevesikeln, so
besitzen sie keine Hülle und sind sehr variabel hinsichtlich ihrer Größe (0,5-10µm)
(Hillaireau and Couvreur, 2009). Ihr weiteres intrazelluläres Schicksal ist
zelltypabhängig. Die Makropinozytose ist in fast allen Zellen möglich und erfüllt
16
diverse Funktionen, insbesondere wenn die Aufnahme von größeren
Flüssigkeitsmengen und darin gelösten Makromolekülen erforderlich ist (Khalil et
al., 2006).
Es existieren weitere Clathrin- und Caveolae unabhängige Endozytosewege, die
aber derzeit nur unvollständig erforscht sind.
1.3.2 Exozytose
Die Exozytose ermöglicht es der Zelle, Stoffe an ihre Umgebung abzugeben und
neue Moleküle in ihre Plasmamembran einzubauen. Bei der Exozytose fusionieren
intrazelluläre Transportvesikel mit der äußeren Zellmembran und entleeren auf
diese Weise ihren Inhalt in den Extrazellularraum. Dieser hochkomplexe Prozess
ist essentiell für ein großes Spektrum an physiologischen Vorgängen, wie z.B. der
interzellulären Kommunikation, der Immunabwehr, der Regulation der
Körperhomöostase durch Hormone, oder der synaptischen Übertragung im
Nervensystem. Jede eukaryote Zelle benötigt die Exozytose für ihr Wachstum und
ihre Differenzierung, denn sie ist der einzige Mechanismus, über den Zellen
zusätzliche Moleküle in ihre Zellmembran einbringen können (Jahn, 2004). Man
unterscheidet zwei Formen der Exozytose, zum einen die konstitutive Exozytose
und zum anderen die regulierte oder stimulierte Exozytose (Jahn, 2004; Lang,
1999) (Abb. 3). Die grundlegenden Mechanismen dieser beiden Formen sind
ähnlich, jedoch unterscheiden sie sich hinsichtlich ihrer Regulation (Burgess and
Kelly, 1987). Die sekretorischen Proteine werden im Golgi-Apparat prozessiert und
über das Trans-Golgi-Netzwerk zur Zellmembran transportiert. Bei der
konstitutiven Exozytose verschmelzen die sekretorischen Vesikel dann
kontinuierlich mit der Zellmembran und entleeren ihren Inhalt, wohingegen bei der
regulierten Exozytose die Sekretvesikel im Cytosol gelagert werden. Erst stimuliert
durch einen spezifischen Reiz fusionieren sie mit der Plasmamembran. In die
regulierte Exozytose sind also second messenger involviert, häufig Ca²+, die die
Exozytose als Reaktion auf z.B. eine Rezeptoraktivierung oder
Membrandepolarisation stimulieren. Ein typisches Beispiel sind die beta-Zellen
des Pankreas, die große Mengen an Insulin enthaltenden Vesikel speichern und
diese bei Anstieg des Blutzuckers entleeren (Gerber and Sudhof, 2002; Brion et
al., 1992). Dies bedeutet aber nicht, dass die konstitutive Exozytose unreguliert
abläuft. Im Gegenteil, die Exozytoserate und der Ort der Membranfusion
17
unterliegen komplizierten Kontrollmechanismen und erfordern spezifisches
Targeting. Die regulierte Exozytose wird beispielsweise bei der Sekretion von
Hormonen und Neurotransmittern benötigt (Li and Chin, 2003; Lang, 1999). Die
konstitutive Exozytose beinhaltet alle Prozesse, bei denen Vesikel kontinuierlich
generiert, transportiert und exozytiert werden, ohne dass ein spezifischer Auslöser
von Nöten ist (Jahn, 2004). Dies ist z.B. bei Drüsenzellen der Fall.
Die molekularen Mechanismen der Exozytose waren bereits Bestandteil vieler
Forschungsarbeiten, sind aber noch nicht vollständig verstanden. Die regulierte
Exozytose umfasst in der Regel drei Schritte: Docking, Priming und Fusion.
Zunächst lagert sich das sekretorische Vesikel über einen noch nicht komplett
verstandenen Mechanismus an die Zellmembran an (es „dockt an“) und wird
gebunden. Im zweiten Schritt findet das Priming statt, eine Vorbereitung auf die
Fusion, welche wahrscheinlich mehrere Reaktionen beinhaltet. Zuletzt wird der
Vesikelinhalt durch Öffnung der Fusionspore in den Extrazellularraum entlassen.
An dem Vorgang der Membranfusion sind eine Reihe verschiedener Proteine
beteiligt, wobei den sogenannten SNAREs (N-ethylmaleimide-sensitive-factor
attachement receptor) eine Schlüsselrolle zukommt (Rickman et al., 2006; Jahn
and Grubmuller, 2002; Gerber and Sudhof, 2002). Sie befinden sich sowohl in der
Vesikelmembran (v-SNARE) als auch in der Zielmembran (t-SNARE). V- und t-
SNARE bilden einen Komplex, der zusammen mit dem kleinen G-Protein Rab
sowie den Proteinen SNAP und NSF die Fusion der Membranen herbeiführt
(Rassow et al. 2006). Die Vesikel werden in der Regel recycelt und wieder dem
Golgi-Apparat zugeführt.
Auf molekularer Ebene ist die Exozytose ein komplexes, hochreguliertes
Wechselspiel zwischen zahlreichen Molekülen, das sich im Laufe der Evolution als
erfolgreich und effektiv erwiesen hat.
18
Abb. 3: Schematische Darstellung der Transportmechanismen in einer eukaryoten Zelle (Modifiziert nach Sahay et al., 2010): Phagozytose, Makropinozytose, Clathrin- und Caveolae-abhängige Endozytose, konstitutive und regulierte Exozytose; CCV = Clathrin-coated Vesikel
1.4 Humane mesenchymale Stammzellen
Humane Stammzellen sind definiert als unspezialisierte Zellen, die die Fähigkeit
besitzen zu verschiedene Zellarten zu differenzieren. Sie erneuern sich selbst,
indem sie sich jeweils in eine unspezialisierte Tochterzelle und eine Gewebe-
spezifische Progenitorzelle replizieren. Diese sogenannte asymmetrische Teilung
bildet die Grundlage der Gewebegeneration. Als potenteste Stammzelle ist die
totipotente Zygote anzusehen. Aus dieser einen undifferenzierten Vorläuferzelle
gehen während der Ontogenese zunächst die ebenfalls undifferenzierten
embryonalen Stammzellen hervor, aus welchen dann die Zellen der drei
Keimblätter entstehen. Diese bilden Gewebe- und Organanlagen, in denen die
dort residierenden Vorläuferzellen zunächst proliferieren und schließlich zum
entsprechenden adulten Zelltyp differenzieren. Ein Teil dieser Zellen behält jedoch
auch postnatal die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und zur Bildung
gewebespezifischer Vorläuferzellen. Diese Population von Zellen wird unter dem
Begriff der adulten Stammzellen zusammengefasst (Salem and Thiemermann,
2010). Sie sind im Gegensatz zu den pluripotenten embryonalen Stammzellen
19
multipotent, also nur zur Erneuerung bestimmter Gewebe befähigt. Die adulten
Stammzellen stellen dem Organismus auf Lebzeiten ein Reservoir an
Progenitorzellen zur Regeneration von Gewebeschäden zur Verfügung. Es sind
bereits ca. 20 verschiedene Arten adulter Stammzellen identifiziert worden,
darunter die mesenchymalen Stammzellen (Abb. 4).
Abb. 4: repräsentative lichtmikroskopische Aufnahme von humanen mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung des DCE-Filter (Digital Contrast Enhancement), Vergrößerung 10-fach
Friedenstein et al. gelang es 1966 diese Zellen im Knochenmark von Mäusen zu
identifizieren (Friedenstein et al., 1966). Auch humane mesenchymale
Stammzellen (hMSC) können durch Aspiration aus dem Knochenmark gewonnen
werden. Sie stellen Progenitorzellen zur Regeneration mesenchymaler Gewebe,
wie Knochen, Knorpel, Muskeln, Bändern und Sehnen bereit (Pittenger et al.,
1999). Das Knochenmark bildet das Haupt-, jedoch nicht das einzige Reservoir an
hMSC. So konnten hMSC bereits aus zahlreichen fetalen und postnatalen
Organen und Geweben, wie beispielsweise Fettgewebe, Leber, Nieren, Lunge u.a.
isoliert werden (Schafer and Northoff, 2008). Da in dieser Arbeit ausschließlich
aus dem Knochenmark aspirierte hMSC verwendet wurden, werden die übrigen
Subpopulationen hier vernachlässigt.
Es handelt sich bei hMSC um eine heterogene Zellpopulation hinsichtlich ihrer
Morphologie, Physiologie und Oberflächenmoleküle (Bobis et al., 2006). Bisher
konnten keine spezifischen Epitop-Marker der Zelloberfläche identifiziert werden.
Zur Charakterisierung von hMSC dienen daher verschiedene Kriterien, die von der
Internationalen Gesellschaft für Zelltherapie (International Society for Cellular
20
Therapy) formuliert wurden (Horwitz et al., 2005; Dominici et al., 2006). Zum einen
besitzen sie die Fähigkeit in einer Zellkultur an Kunststoff zu adhärieren, eine
Eigenschaft, die man sich auch bei der Isolation von MSC zu Nutze macht. Des
Weiteren ist ihnen ein spezifisches Epitop-Muster zu Eigen, so sind sie positiv für
CD105, CD73 und CD90 und negativ für CD45, CD34, CD14 oder CD11b,
CD79alpha oder CD19 und HLA-DR. Besitzen sie zuletzt noch die Fähigkeit nach
entsprechender Stimulation in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten zu
differenzieren, spricht man von mesenchymalen Stammzellen. Studien zeigten
außerdem eine mögliche Differenzierung in Tendozyten (Young et al., 1998) und
Myozyten (Wakitani et al., 1994). Eine keimblätterübergreifende Reifung zu
Neuronen und Gliazellen wird ebenfalls in Studien postuliert (Keilhoff et al., 2006;
Woodbury et al., 2000). Diese Plastizität, ihr Selbsterneuerungspotential, sowie
die Tatsache, dass sie unter Zellkulturbedingungen leicht zu expandieren sind,
machen hMSC zu einem großen Hoffnungsträger in der regenerativen Medizin
und dem Sektor des tissue engineerings (Habijan et al., 2007; Caplan, 2007;
Habijan et al., 2007) Autologe Stammzelltransplantationen können einen wichtigen
Beitrag in der Therapie von z.B. Knochen- und Knorpeldefekten, chronischen
Wunden und ischämisch geschädigten Herzen leisten (Ohishi and Schipani,
2010). Der positive Effekt von hMSC auf die Geweberegenration konnte bereits in
zahleichen in vitro und in vivo Studien belegt werden (Connolly, 1995; Zimmet and
Hare, 2005; Vilquin and Rosset, 2006; Abdallah and Kassem, 2008; Bajada et al.,
2008).
Die Eigenschaften und Funktionen der Stammzellen sind unter anderem abhängig
von den Bedingungen in ihrer Umgebung. hMSC sezernieren einige typische
Mediatoren, um mit ihrer Umgebung zu kommunizieren, darunter Interleukin 6
(IL-6), Interleukin 8 (IL-8), Interleukin 11 (IL-11) und den Vascular endothelial
growth factor (VEGF) (Kim et al., 2005). Wie genau diese löslichen Faktoren die
Differenzierung der hMSC beeinflussen, ist derzeit noch Gegenstand der
Forschung.
Da sie im Knochenmark ansässig sind, kommen hMSC möglicherweise bei
orthopädischen Eingriffen in Kontakt mit (silberhaltigen) Implantaten, Prothesen
und Operationswerkzeugen. Dies und ihre gute Kultivierbarkeit machen sie zu
einer geeigneten Zellpopulation für diese Arbeit.
21
1.5 Biologische Bedeutung der Zytokine IL-6, -8, -11 und VEGF
Bei den Zytokinen handelt es sich um eine Gruppe von Peptiden, Proteinen und
Glucoproteinen, die der interzellulären Kommunikation dienen. Die 8-30 kDA
großen Moleküle beeinflussen vor allem die Zellproliferation und Differenzierung
und können autokrin, parakrin sowie endokrin wirken (Cannon, 2000). Sie
entfalten ihre Wirkung über die Bindung an spezifische membranständige
Rezeptoren, die von ihren Zielzellen exprimiert werden. Diese Bindung führt zur
Induktion intrazellulärer Signalkaskaden, über die z.B. die Genexpression
verändert werden kann (Huppelberg and Walter, 2005). Anhand ihrer Funktion
werden Zytokine in fünf Hauptgruppen unterteilt: Die Interleukine (IL), die
Interferone (IFN), die koloniestimulierenden Faktoren (CSF), die
Tumornekrosefaktoren (TNF) und die Wachstumsfaktoren (GF).
IL-6 ist ein pleiotropes Zytokin, das pro- und antiinflammatorsiche Eigenschaften
aufweist. Neben Immunzellen sezernieren auch Fibroblasten und hMSC IL-6. Es
ist ein Mediator akuter Entzündungsreaktionen und induziert sowohl Fieber als
auch die Synthese der Akute-Phase-Proteine in der Leber. Des Weiteren bewirkt
es die Differenzierung von T-Zellen zu cytotoxischen T-Zellen (Heinrich et al.,
1990; Van, 1990).
Das proinflammatorische IL-8 wird von Monozyten, Makrophagen, T-Zellen,
neutrophilen Granulozyten und Endothelzellen sezerniert (Deetjen et al. 2005a).
Es fungiert als Entzündungsmediator und rekrutiert Leukozyten durch Chemotaxis
zum Ort der Entzündung. Es wirkt insbesondere aktivierend auf neutrophile
Granulozyten, bei denen es die Expression von Adhäsionsmolekülen und die
Bildung reaktiver Sauerstoffradikale induziert (Baggiolini et al., 1994; Schroder et
al., 1988).
IL-11 wird von hMSC und Fibroblasten sezerniert und hat pleiotrope Effekte auf
zahlreiche Gewebe. Beispielsweise fördert es primäre und sekundäre
Immunreaktionen und wirkt stimulierend auf die Hämatopoese (Du and Williams,
1997; Kawashima and Takiguchi, 1992).
Der Ausdruck Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) bezeichnet eine Familie
von Proteinen, die als wichtige Signalmoleküle unabdingbar für die embryonale
und postnatale Angiogenese sind. Es sind derzeit 7 Formen des VEGF bekannt
(A-F und PIGF) (Bertuccio, 2011; Wang et al., 2010). Ihre Bildung wird durch
lokale Gewebehypoxie verstärkt (Deetjen et al. 2005b).
22
2 Zielsetzung der Arbeit
Silber-Nanopartikel gehören heute zu den Nanomaterialien mit der größten
kommerziellen Bedeutung. Aufgrund ihrer seit langem bekannten antimikrobiellen
Eigenschaften finden sie Verwendung in der Herstellung zahlreicher Konsumgüter
wie beispielsweise Textilien, Kosmetikartikel, Elektrogeräte oder Reinigungsmittel
(Wijnhoven et al., 2009). In der Medizin werden sie zur lokalen
Infektionsprophylaxe und -therapie in diverse Medizinprodukte eingearbeitet,
darunter Wundauflagen, verschiedene Katheter und orthopädische Implantate. Auf
diese Weise gelangen die Partikel in engen Kontakt mit menschlichen Geweben
(Chen and Schluesener, 2008). Da sie sehr klein sind, besteht die Möglichkeit,
dass sie weit in den Körper gelangen und dann z.B. an Proteine binden. Dies gibt
Anlass zur Diskussion, ob und inwiefern Ag-NP mit humanen Zellen interagieren
oder diese sogar schädigen. Die antimikrobielle Wirkung von Ag-NP wurde bereits
vielfach erforscht, jedoch mangelt es an umfassenden Informationen bezüglich
ihrer Interaktionen mit humanen Zellen. Dies ist in Anbetracht der vielfältigen
Anwendungen von Nanosilber und der daraus resultierenden hohen
Silberexposition aber erforderlich. Einige Forschungsgruppen haben sich bereits
mit dieser Fragestellung befasst. Greulich et al. konnten z.B. zeigen, dass Ag-NP
von humanen mesenchymalen Stammzellen und Monozyten aufgenommen
werden und intrazellulär akkumulierten (Greulich et al., 2011b; Greulich et al.,
2011a). In dieser Arbeit sollte nun in vitro das weitere Schicksal der endozytierten
Partikel erforscht werden. Hierbei galt es zu analysieren, ob die Partikel
intrazelluläre Transportmechanismen nutzen, bzw. ob sie von den Zellen wieder
exozytiert werden. Des Weiteren sollten Faktoren identifiziert werden, die die
mögliche Exozytose der Ag-NP beeinflussen. Dazu wurden verschiedene
etablierte Methoden wie die Durchflusszytometrie (FACS), die Licht- und
Fluoreszenzmikroskopie, die Atomabsorbtionsspektroskopie (AAS) und die
Focussed Ion Beam Technik (FIB) mit kombinierter Rasterelektronenmikroskopie
(REM) verwendet. Um eine silberabhängige Aktivierung der Zellen zu überprüfen,
wurde außerdem die Zytokinausschüttung mittels Enzyme-linked Immunosorbent
Assay (ELISA) analysiert. Als Zellmodell dienten humane mesenchymale
Stammzellen (hMSC). Diese sind in vitro gut zu kultivieren und zu expandieren
und spielen als undifferenzierte Progenitorzellen eine entscheidende Rolle bei der
23
Geweberegeneration. Besonders wichtig für die Fragestellung dieser Arbeit war,
dass die hMSC sich aufgrund ihres Proliferationsprofiles für die Langzeitzellkultur
eignen. Ferner kommen sie in ihrer Nische, dem Knochenmark, bei z.B.
orthopädischen Eingriffen in engen Kontakt mit silberbeschichteten Implantaten.
Da sie hier entscheidend zur Knochenheilung beitragen, ist es von klinischer
Relevanz ihre biologischen Interaktionen mit Ag-NP zu erforschen und zu
verstehen.
24
3 Material und Methoden
3.1 Reagenzien und Geräte
Tab. 1: Chemikalien und Substanzen
Chemikalien und Substanzen Hersteller/ Vertrieb
Cell Culture Freezing Medium Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
FACS-Lysing Solution Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg,
Deutschland
fötales Kälberserum (FCS;
Südamerika, Nr. 10270-106)
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Glutaraldehyd Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Golgi-Tracker BODIPY FL C5-
ceramide complexed to BSA
Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland
Histopaque 1077 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Hoechst33342 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Humanserumalbumin (HSA) Deutsches rotes Kreuz
Lysotracker Red DND-99 Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland
Phosphat buffered saline (PBS) GIBCO Invitrogen GmbH, Karlsruhe,
Deutschland
Phosphorsäure (1 M) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Propidiumjodid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Rinderserumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Streptavidin-Biotin-Meerrettich-
peroxidase Komplex
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Trypsin/ EDTA (0.25% Trypsin;
0.05% EDTA)
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Zellkulturmedium RPMI 1640 GIBCO, Invitrogen GmbH, Karlsruhe,
Deutschland
25
Tab. 2: Verbrauchsmaterialien
Material Hersteller/ Vertrieb
15 ml Falcon-Röhrchen Falcon, BD Biosciences, Heidelberg,
Deutschland
50 ml Falcon-Röhrchen Falcon, BD Biosciences, Heidelberg,
Deutschland
75 cm2 Zellkulturflaschen Falcon, BD Biosciences, Heidelberg,
Deutschland
96-Well-Mikrotiterplatte Maxisorp, Nunc GmbH & Co. KG,
Wiesbaden, Deutschland
Eppendorfreaktionsgefäße Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen,
Deutschland
FACS-Röhrchen Falcon, BD Biosciences, Heidelberg,
Deutschland
Kryogefäß Nalgene/ Nunc GmbH & Co. KG,
Wiesbaden, Deutschland
Pipetten, CellStar Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen,
Deutschland
Zellkulturplatten, 6-, 24- und 96-
Well
Falcon, BD Biosciences, Heidelberg,
Deutschland
Tab. 3: Geräte
Gerät Hersteller/ Vertrieb
96-Well-Mikrotiterplatten Reader,
MRX Revelation
DYNEX Technologies, Berlin,
Deutschland
Biofuge-Pico Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Brutschrank, HERAcell Heraeus/ Thermo Electron Corporation,
Hanau, Deutschland
Digitalkamera, F View Soft Imaging System, Münster,
Deutschland
Dualbeam-Ionenstrahlanlage,
Quanta 200 3D
FEI, Eindhoven, Niederlande
Durchflußzytometer,
FACSCalibur™
BD-Biosciences, Heidelberg, Deutschland
26
Fluoreszenzmikroskop, Olympus
BX61
Olympus GmbH, Hamburg, Deutschland
Fluoreszenzreader, FLUOstar
OPTIMA
BMG LABTECH, Offenburg, Deutschland
Inversionsmikroskop, CK2 Olympus GmbH, Hamburg, Deutschland
EDX, ISIS EDX System Oxford Instruments, Wiesbaden,
Deutschland
Inversionsmikroskop, CK2 Olympus GmbH, Hamburg, Deutschland
Kathodenzerstäubungsanlage,
Edwards Sputter Coater S150B
Edwards, West Sussex, England
Labortiefkühltruhe 6383 GFL, Burgwedel, Deutschland
Makromikroskop, Olympus
MVX10
Olympus GmbH, Hamburg, Deutschland
Zentrifuge, Megafuge 1.0R Kendro-Heraeus, Hanau, Deutschland
Mikroplatten-Reader, MRX
Revelation
Dynex Technologies, Denkendorf,
Deutschland
Mikroplatten-Wascher, AM-60 Dynex Technologies, Denkendorf,
Deutschland
Pipettierhilfe, Pipetus Akku Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt,
Deutschland
Schüttler, IKA KS 260 basic IKA Werke, Staufen, Deutschland
Sicherheitswerkbank, HeraSafe,
HS15
Kendro-Heraeus, Hanau, Deutschland
3.1.1 Rekombinante humane Zytokine und Antikörper
Für die Analyse der Zytokinfreisetzung mittels ELISA (Enzyme-linked
Immunosorbent Assay, s. 2.6) wurden die Standardkurven durch folgende
rekombinanten humanen Zytokine der Firma R & D Systems, Wiesbaden erstellt:
Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 8 (IL-8), Interleukin 11 (IL-11) und Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF).
Es wurden außerdem für den ELISA monoklonale und polyklonale biotinylierte
Antikörper gegen IL-6, IL-8, IL-11 und VEGF der Firma R & D Systems,
Wiesbaden eingesetzt, dessen Konzentrationen in Tab.4 dargestellt sind.
27
Tab. 4: Antikörper
Antikörper Konzentration
Maus-α-human IL-6 monoklonal (capture) 3 µg/ml
Ziege-α-human IL-6 polyklonal biotinyliert
(detection)
25 ng/ml
Maus-α-human IL-8 monoklonal (capture) 4 µg/ml
Ziege-α-human IL-8 polyklonal biotinyliert
(detection)
20 ng/ml
Sf21Zellen(Insecta)-α-IL-11 monoklonal
(capture)
4 µg/ml
Ziege-α-human IL-11 polyklonal biotinyliert
(detection)
100 ng/ml
Maus-α-human VEGF monoklonal (capture) 4 µg/ml
Ziege-α-human VEGF polyklonal biotinyliert
(detection)
25 ng/ml
3.2 Synthese von Silber-Nanopartikeln
Die Polyvinylpyrrolidon (PVP)- stabilisierten Silber-Nanopartikel (Ag-NP) wurden
nach der Methode von Wang (Wang, 2005) im Institut für Chemie der Universität
Essen (Prof. M. Epple) durch Reduktion mit Glucose synthetisiert. Zunächst
wurden 2 g Glucose und 1 g PVP in 40 g Wasser gelöst und auf 90°C erhitzt.
Dann wurden 0,5 g AgNO3 gelöst in 1 ml Wasser hinzugefügt. Diese Dispersion
wurde für 1 Stunde bei 90°C gehalten, bevor sie auf Raumtemperatur abgekühlt
wurde. Die Ag-NP wurden mittels 30-minütiger Ultrazentrifugation (30.000 r.p.m.)
pellettiert, in Reinstwasser gelöst und schließlich erneut ultrazentrifugiert. Auf
diese Weise wurden NO3-, überschüssige Glucose und ihre Oxidationsprodukte,
sowie überschüssiges PVP und Ag+ entfernt. Die gewonnenen Partikel wurden
dann wieder in Reinstwasser gelöst, in welchem sie auch gelagert wurden. Der
Ertrag an Ag-NP bei dieser Methode betrug ca. 5%. Die endgültige
Silberkonzentration wurde durch die Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)
(Thermo Electron Corp., M-Series) bestimmt, der hydrodynamische Durchmesser
28
und das Zeta-Potential durch dynamische Lichtstreuung (DLS) mit einem Malvern
Zetasizer Nano ZS. Der durchschnittliche Z-Wert wurde gleichzeitig als
durchschnittlicher Partikeldurchmesser angesehen. Der Polydispersitätsindex war
in jedem Fall kleiner drei, was bedeutet, dass keine Agglomerate vorlagen.
Sekundärelektronenmikrokopische (SEM) Aufnahmen (Fei Quanta 400 ESEM
instrument) der Ag-NP zeigten einen kugelförmigen metallischen Kern von 50 ±
20 nm. Der hydrodynamische Durchmesser gemessen durch die DLS betrug etwa
80 nm. Es muss hier bedacht werden, dass der hydrodynamische Durchmesser
sowohl die Polymerschicht bestehend aus PVP, als auch die Hydrathülle
beinhaltet. Dieser ist dadurch immer etwas größer als der pure metallische Kern.
Die Analytik (AAS und DLS) wurde in diesem Zusammenhang ebenfalls im Institut
für Chemie der Universität Essen durchgeführt. Es wurden Stocklösungen der
Konzentrationen 1 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,2 mg/ml
und 0,1 mg/ml durch Verdünnung mit Reinstwasser angesetzt. Die Lagerung
erfolgte bei 8°C.
3.3 Zellkultur
Sämtliche Zellkulturarbeiten wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
3.3.1 Gewinnung primärer humaner mesenchymaler Stammzellen (hMSC)
aus Knochenmarksaspiraten
In der chirurgischen Klinik des Bergmannsheils Bochum wird routinemäßig die so
genannte Spongiosaplastik, ein Verfahren, bei dem Spongiosa eines gesunden
Knochens zur Defektsanierung an anderer Stelle verwendet wird, durchgeführt. Im
Rahmen dieser Spongiosaplastik fällt regelmäßig Absaugflüssigkeit an, die ein
Gemisch verschiedener Zellpopulationen enthält. Neben mesenchymalen
Stammzellen lassen sich ebenfalls Osteoklasten und Zellen der hämatopoetischen
Zelllinie (hämatopoetische Stammzellen, Zellen der Erythropoese, der
Leukopoese und der Thrombopoese) finden. Aus der Absaugflüssigkeit wurden
primäre hMSC nach der Methode von Haynesworth et al. (Haynesworth et al.,
1992) isoliert. Man nutzt hierbei die Eigenschaft der Plastikadhärenz aus, denn im
Gegensatz zu den meisten übrigen im Knochenmark befindlichen Zellen besitzen
hMSC die Fähigkeit an Kunststoffoberflächen zu adhärieren. Durch die regelmäßig
29
durchgeführten Mediumwechsel werden nicht-adhärente Zellen, wie z.B.
Lymphozyten, Thrombozyten und Erythrozyten, aus der Zellkulturflasche entfernt.
Adhärente monozytäre Zellen werden wegen ihrer geringen Lebensdauer von
ungefähr 21 Tagen ebenfalls aus der Zellkultur heraus gewaschen. Die
Absaugflüssigkeit wurde in 9 ml EDTA Röhrchen gesammelt und 1:1 mit isotoner
Kochsalzlösung verdünnt. 20 ml Histopaque 1077 wurden vorsichtig in ein 50 ml
Falcon pipettiert, das verdünnte Aspirat wurde nun vorsichtig aufgeschichtet. Nach
einer 30-minütigen Zentrifugation bei 1800 U/min wurde die obere Phase, in der
sich das Plasma sowie die hMSC befinden, bis zur Phasengrenze abgesaugt und
in ein weiteres 50 ml Falconröhrchen überführt. Die Zellsuspension wurde 1:1 mit
RPMI/FCS verdünnt und 5 min bei 1100U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde
dekantiert, das Zellsediment in 15 ml RPMI/FCS resuspendiert und in einer
Zellkulturflasche 48 h unter Zellkulturbedingungen inkubiert. Das Zellkulturmedium
der kultivierten hMSC wurde alle 5 Tage gewechselt.
3.3.2 Kultivierung von hMSC
Die humanen mesenchymalen Stammzellen stammten von der Firma Lonza oder
wurden aus Knochemarksaspiraten im Rahmen von klinischen Spongiosaplastiken
gewonnen (s.3.2.1). Die Kultivierung der hMSC erfolgte in 75 cm³
Zellkulturflaschen im Brutschrank bei einer Temperatur von 37°C, einem
CO²-Gehalt von 5% und einer Luftfeuchtigkeit von 95%. Im Deckel der Flaschen
befindet sich eine mikroporöse Membran, welche einen Gasaustausch mit der
Umgebung ermöglicht und außerdem eine Kontamination der Zellen verhindert.
Als Zellkulturmedium wurden je Zellkulturflasche 15 ml Roswell Park Memorial
Institute medium (RPMI) 1640 mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) verwendet.
Das Zellkulturmedium zur Kultivierung der hMSC wurde bei Bedarf erneuert. Dies
war abhängig vom Proliferationsgrad, sowie vom pH-Wert des Mediums. Eine
Gelbverfärbung des Zellkulturmediums deutet auf eine Erniedrigung des
pH-Wertes hin und zog eine Erneuerung des Zellkulturmediums nach sich.
3.3.3 Passagieren von hMSC
Bei Erreichen von annähernder Konfluenz wurden die Zellen mittels Trypsinierung
von der Zellkulturflasche abgelöst und auf neue Zellkulturflaschen aufgeteilt.
30
Hierzu wurde zunächst das Zellkulturmedium dekantiert. Da die im FCS
natürlicherweise vorkommenden Proteaseinhibitoren die Aktivität des Enzyms
Trypsin hemmen, wurden die Zellen zunächst zweimal mit jeweils 10 ml Phosphat
buffered saline (PBS) gewaschen. Um die Zellen nun abzulösen, wurden 6 ml
Trypsin/EDTA (0.25% Trypsin, 0.05% EDTA) hinzugefügt. Nach einer
Inkubationszeit von 5 min bei 37 °C wurden die hMSC durch Klopfen endgültig
vom Flaschenboden abgelöst. Die vollständige Ablösung wurde mikroskopisch
anhand der Kriterien: die Zellen sind abgerundet und nicht mehr adhärent,
überprüft. Die Zellsuspension wurde dann in ein 15 ml Falcontube überführt und
auf 14 ml mit RPMI/FCS aufgefüllt, um die katalytische Aktivität des Trypsins zu
inhibieren und die Reaktion abzustoppen. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei
1100 U und Raumtemperatur wurde der Überstand dekantiert, das Pellet in 10 ml
RPMI/FCS resuspendiert und erneut 5 min bei 1100 U/min zentrifugiert. Diese
zwei Waschschritte sind nötig, um das Trypsin/EDTA Gemisch vollständig zu
entfernen. Nachdem der Überstand dekantiert worden war, wurde das Zellpellet in
1 ml RPMI/FCS gelöst und zu gleichen Teilen auf 2 mit jeweils 15 ml RPMI/FCS
gefüllte Zellkulturflaschen verteilt. Es folgte die weitere Kultivierung zu den in 3.2.1
genannten Bedingungen.
3.3.4 Einfrieren und Auftauen von hMSC
Um die Zellen einzufrieren, wurden diese zunächst wie in 3.2.3 beschrieben vom
Flaschenboden gelöst, zweimal gewaschen und das Zellpellet in 1 ml Freezing
Medium resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in ein thermostabiles 2 ml
Kryogefäß überführt und schrittweise mit Hilfe eines Kryo-Einfriergerätes über 24 h
eingefroren. Die Lagerung erfolgte letztlich in flüssigem Stickstoff bei einer
Temperatur von -196°C.
Das Auftauen der Zellen geschah bei 37°C im Wasserbad. Wenn noch ein kleiner
Eiskern vorhanden war, wurde das Kryogefäß aus dem Wasserbad entnommen
und von außen mit 70%igem Ethanol gereinigt, um das Risiko einer Kontamination
der Zellen so gering wie möglich zu halten. Die aufgetaute Zellsuspension wurde
in eine Zellkulturflasche mit 10 ml vorgewärmtem (30 min bei 37°C)
Zellkulturmedium (RPMI/FCS) pipettiert und bei den in 3.2.1 genannten
Bedingungen kultiviert. Um nicht-adhärente Zelle zu entfernen wurde nach 24 h
ein Mediumwechsel durchgeführt.
31
3.3.5 Aussaat von hMSC
Für die Versuche wurden die hMSC auf 6-well-Platten ausgesät, die Zellzahl
betrug etwa 20.000 Zellen/ml. Hierzu wurden die Zellen zunächst wie in 3.2.3
beschrieben abgelöst, mit Zellkulturmedium gewaschen und das Pellet in der
gewünschten Menge RPMI/FCS resuspendiert. Die Zellsuspension wurde nun
vorsichtig in die Kavitäten von 6-Loch-Platten pipettiert und im Brutschrank
inkubiert. Auch hier adhärieren die mesenchymalen Stammzellen auf der
Kunststoffoberfläche der Zellkulturplatten. Um nicht-adhärente Zellen zu entfernen
wurde nach 24 h ein Mediumwechsel durchgeführt.
3.3.6 Inkubation von hMSC mit Silber-Nanopartikeln
Die hMSC wurden wie in 3.3.5 beschrieben auf 6-well-Platten ausgesät und bei
Zellkulturbedingungen inkubiert. Nach 24 h wurde ein Mediumwechsel
durchgeführt und die Zellen mit Ag-NP bei Zellkulturbedingungen präinkubiert. Bei
den Experimenten zur Endozytose wurde nach der Inkubation mit Ag-NP (5 µg/ml,
24 h) eine Analyse mittels Mikroskopie und kombinierter Focussed Ion Beam
Technik/Rasterelektronenmikroskopie vorgenommen.
Für die Exozytose-Versuche wurden die hMSC im Anschluss an die Präinkubation
zweimal mit RPMI/FCS gewaschen, um überschüssige Ag-NP aus dem
Zellkulturmedium zu entfernen. Dies ist der Zeitpunkt 0 h, bezogen auf die
Exozytose. Das nun hinzugefügte, frische Zellkulturmedium wurde für einige
Versuche variiert, um den Exozytosevorgang zu studieren und beeinflussende
Variablen zu eruieren. Die Zellen wurden weiter bei Zellkulturbedingungen
inkubiert. Das Zellkulturmedium wurde bei allen Experimenten zu jedem
Messzeitpunkt erneuert.
Für die Versuche zur Zeitkinetik der Exozytose wurden die hMSC für 1 h mit
Ag-NP der Konzentrationen 20 µg/ml, 30 µg/ml und 50 µg/ml präinkubiert und
dann nach den Waschschritten weiterhin in RPMI mit 10% FCS kultiviert. Zu den
Zeitpunkten 0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 16 h und 24 h wurde jeweils 1
Platte mit Hilfe der Durchflusszytometrie (s. 3.5) ausgewertet. Für weitere
Versuche zur Zeitkinetik wurden die hMSC mit 5 µg/ml Ag-NP für 24 h präinkubiert
und weiter bei Zellkulturbedingungen in partikelfreiem Zellkulturmedium inkubiert.
Auswertungen mittels Durchflusszytometrie und Mikroskopie erfolgten zu den
32
Zeitpunkten 0 h, 24 h, 48 h und 72 h. Der Zellkultur-Überstand wurde jeweils mit
Hilfe der Atomabsorptionsspektroskopie hinsichtlich seines Silbergehaltes
untersucht.
Studien zur Proteinabhängigkeit der Exozytose wurden durchgeführt, indem die
hMSC für 24 h mit 5 µg/ml Ag-NP präinkubiert wurden und danach die
Proteinkonzentration im Zellkulturmedium variiert wurde. Dies geschah durch das
Hinzufügen verschiedener Mengen an FCS zu RPMI. Die Zellen wurden inkubiert
in reinem RPMI, RPMI mit 0,1% FCS, RPMI mit 1% FCS, RPMI mit 5% FCS und
RPMI mit 10% FCS, was auch unser gängiges Zellkulturmedium darstellt.
Auswertungen mittels Durchflusszytometer und Mikroskopie erfolgten zu den
Zeitpunkten 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, ebenso eine Analyse des Zellkultur-Überstandes
mittels AAS.
Die Versuche zur Abhängigkeit von humanem Serumalbumin (HSA) folgten dem
gleichen Protokoll, es wurde statt FCS allerdings HSA verwendet.
Um den Mechanismus der Exozytose zu untersuchen, wurden hMSC für 24 h mit
5 µg/ml Ag-NP präinkubiert und dann für 24 h mit den Inhibitoren Filipin (1 µg/ml),
Chlorpromazin (20 µM), Wortmannin (50 nM) und Nystatin (5 µM) in
RPMI/10%FCS bei Zellkulturbedingungen behandelt. Die hMSC wurden nun
mittels Durchflusszytometrie analysiert.
3.4 Mikroskopie
3.4.1 Lichtmikrokopie
Ungefärbte Zellen können im Lichtmikroskop mittels Phasenkontrast dargestellt
werden. Diese Technik beruht auf Unterschieden im Lichtbrechungsindex und der
Dicke einzelner Zellbestandteile und des sie umgebenden Mediums. Sie wurde
angewandt, um die Morphologie und den Konfluenzgrad der Zellen zu beurteilen.
Es wurde das Mikroskop Olympus BX61 und das Programm CellP verwendet. Um
eine kontrastreichere Darstellung zu erhalten wurde der DCE-Filter des
Programmes CellP verwendet.
33
3.4.2 Fluoreszenzmikroskopie
Bei der Fluoreszenzmikroskopie macht man sich zunutze, dass verschiedene
Bestandteile einer Zelle zur Fluoreszenz angeregt werden können, indem man sie
mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge bestrahlt. Dieses Phänomen bezeichnet
man als Autofluoreszenz. Verfügt die Zelle über keine autofluoreszierenden
Bestandteile, kann sie mit Hilfe verschiedener Fluorochrome gefärbt werden. Für
diese Arbeit wurden der Golgi-Apparat und die Lysosomen mir
fluoreszenzgekoppelten Antikörpern, sowie der Zellkern mit einer Hoechst-
Färbung dargestellt (s.3.9.), um die intrazelluläre Lokalisation der Silberpartikel zu
untersuchen. Dazu wurden die hMSC zunächst für 24 h mit 5µg/ml präinkubiert,
dann zweimal gewaschen und bei Zellkulturbedingungen weiter kultiviert. Die
Aufnahmen der Zellen wurden nach 0 h, 24 h, 48 h, sowie 72 h von jenen Zellen
gemacht, die mit verschiedenen Proteinkonzentrationen im Außenmedium
inkubiert wurden. Gefärbte Zellen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop
(Olympus BX61) analysiert und fotografiert (F-View). Die Auswertung erfolgte mit
Hilfe des Programmes CellP.
3.4.3 Focussed Ion Beam-Technik und Rasterelektronenmikroskopie
(FIB/REM-Technik)
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen wurden in der Fakultät für
Maschinenbau am Institut für Werkstoffe (Prof. Dr. G. Eggeler) der Ruhr-Universität
Bochum angefertigt. Dafür wurden zunächst hMSC auf 24-well Platten ausgesät
und mit Ag-NP der Konzentration 20 µg/ml inkubiert. Anschließend wurden die
Überstände abgenommen und die Zellen für 5 min in PBS inkubiert. Zur Fixierung
wurden die hMSC 15 min in 3,7% Glutaraldehyd in PBS bei Raumtemperatur
inkubiert, dann erneut mit PBS gewaschen (10 min) und in einer aufsteigenden
Ethanolreihe (50%, 70%, 100% jeweils 5 min) entwässert. Die Proben trockneten
dann für 24 h bei Raumtemperatur und wurden anschließend zur weiteren
Vorbereitung mit einer Goldschicht überzogen. Dies geschah mit Hilfe einer
Kathodenzerstäuberanlange.
Die Focussed Ion Beam (FIB) Anlange ist ein duales System bestehend aus einer
Elektronenstrahlsäule für die Rasterelektronenmikroskopie und einer
Ionenstrahlsäule zur Strukturierung der Proben. An der Ionenstrahlsäule befindet
34
sich eine Flüssigmetallquelle (Gallium), die den Ionenstrahl erzeugt. Die emittierten
Galliumionen werden im elektrischen Feld beschleunigt und treffen aufgrund ihrer
Masse mit hoher kinetischer Energie auf die Probenoberfläche. Auf diese Weise
werden sowohl Teile der Probe abgetragen, als auch Sekundärelektronen emittiert.
Es konnten so Querschnitte der adhärenten hMSC erzeugt und
sekundärelektronenmikroskopische (SEM) Bilder aufgenommen werden. Die SEM-
Aufnahmen wurden durch eine Elementenanalyse (energy-disperse X-ray
spectroscopy, EDX) ergänzt.
3.5 Durchflusszytometrie (fluorescence-activated-cell-sorter)
Die Durchflusszytometrie ermöglicht eine simultane und quantitative Analyse
verschiedener Eigenschaften einer Zelle. Da die Zellen in einer Suspension
vorliegen müssen, um sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie zu analysieren,
wurden die hMSC zunächst mittels Trypsinierung und mechanischem Titruieren
von der 6-well Platte abgelöst und in FACS-Röhrchen überführt. Nach
zweimaligem Zentrifugieren (1100 U, 5 min, RT) wurde das Zellsediment in 500 µl
RPMI/FCS resuspendiert und schließlich im FACS (fluorescence-activated-cell-
sorter) analysiert. Entscheidendes Merkmal dieser Messmethode ist es, dass die
Zellen in einem laminaren Flüssigkeitsstrom einzeln an einem Laser vorbeigeführt
werden und so hinsichtlich ihrer Größe, Granularität, Struktur und
Oberflächeneigenschaften charakterisiert werden können. Wenn das
monochromatische Licht des Lasers auf die im Probenstrom befindlichen Zellen
trifft, wird es gestreut. Die nach vorn abgelenkten Strahlen werden als
Forwardscatter bezeichnet und stellen ein Maß für die Größe der Zelle dar. Das in
einem 90°-Winkel abgestrahlte Seitwärtsstreulicht nennt man Sidescatter und ist
ein Maß für die Granularität der Zelle.
35
Abb. 5: Schematische und vereinfachte Darstellung der Funktionsweise eines Durchflusszytometers
Des Weiteren können durch eine Kopplung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern
zusätzlich sowohl intra- als auch extrazelluläre Epitope der Zellen markiert
werden. Ebenfalls möglich ist die Detektion toter Zellen durch entsprechende
Färbung der Zellen mit 7-Aminoactinomycin (7-AAD). Das verwendete
Durchflusszytometer ist mit einem Argon-Laser (λex = 488 nm) ausgestattet und
kann bis zu 4 Fluoreszenzen gleichzeitig anregen und detektieren. Auf die
Verwendung von Fluorochromen wurde in dieser Arbeit jedoch verzichtet, da die
Sidescatter-Intensität hinsichtlich der Fragestellung den wichtigsten
Messparameter darstellt. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe des Programms
CELLQuest Pro ausgewertet und graphisch dargestellt.
3.6 Sandwich-ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
Beim Sandwich-ELISA handelt es sich um ein immunologisches
Nachweisverfahren, bei dem Antikörper eingesetzt werden, um ein bestimmtes
Antigen zu detektieren. Diese Antikörper (Primär- bzw. Capture- und Sekundär-
bzw. Detection-Antikörper) binden dabei spezifisch an unterschiedliche Epitope
des gleichen Zielproteins und bilden somit einen Antikörper-Antigen-Antikörper-
Komplex. Dieser Komplex bindet das Enzym Streptavidin-Peroxidase, welches
dann in einer Farbreaktion des Substrat 3,3’;3,5’ Tetramethylbenzidin (TMB)
36
umsetzt. Die Umsetzung des Substrates und damit die Intensität der Färbung ist
proportional zur Bindung des enzymkonjugierten Detection-Antikörpers an das
Zielprotein.
Für die Analyse wurden die Überstände von hMSC, welche mit Ag-NP präinkubiert
worden waren, gesammelt, abzentrifugiert und bis zur weiteren Verwendung bei -
20°C gelagert. Es sollte analysiert werden, ob und wie die Inkubation von hMSC
mit Ag-NP deren Zytokinfreisetzung beeinflusst.
Im Rahmen dieser Studie wurde die Freisetzung der vier Antigene IL-6, IL-8, IL-11
und VEGF analysiert. Dazu wurde pro Antigen eine 96-Well-Mikrotiterplatte über
Nacht bei Raumtemperatur mit den in D-PBS aufgenommenen monoklonalen
Primärantikörpern IL-6 (3 µg/ml), IL-8 (4 µg/ml), IL-11 (4 µg/ml) und VEGF (4
µg/ml) beschichtet, wobei 100 µl pro Kavität eingesetzt wurden.
Am nächsten Tag wurden die Platten dreimal mit Waschpuffer (1xPBS, 500 µl
Tween 20) gewaschen. Um unspezifische Bindungen der Antikörper abzusättigen,
wurde in jede Kavität 200 µl Blockingpuffer (0,4 g Bovine Serum Albumin, 40 ml D-
PBS) gegeben und 45 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert.
Nach erneutem dreimaligen Waschen mit Waschpuffer wurden je 100 µl der
jeweiligen Standards bzw. Proben (die gesammelten Überstände der hMSC) in die
Kavitäten pipettiert und 75 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert.
Befinden sich die gesuchten Antigene, also die Interleukine und VEGF, in der
Probe, werden diese nun von dem Primärantikörper gebunden.
Nachdem die überschüssige Probenlösung durch dreimaliges Waschen entfernt
worden war, wurden 100 µl des sekundären polyklonalen biotinylierten Antikörpers
(25 ng/ml gelöst in Waschpuffer) in die Kavitäten pipettiert und 75 min bei
Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Dieser zweite Antikörper ist über
kovalente Bindung mit Biotin markiert und bindet ebenfalls an das Antigen, so
dass sich dieses wie bei einem Sandwich zwischen den Antikörpern befindet.
Darauf folgten drei weitere Waschschritte mit Waschpuffer.
Danach wurden die Proben 20 min mit Streptavidin-Peroxidase inkubiert und
wieder gewaschen (dreifach, Waschpuffer). Bei der nun folgenden Applikation des
Substrat TMB wird dieses durch die Peroxidase in einer Farbreaktion umgesetzt.
Die Platten wurden hierzu im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde durch die
Zugabe von 100 µl 1M Phosphorsäure abgestoppt. Anhand der Standardkurve
können die untersuchten Antigene quantitativ bestimmt werden. Die
37
photometrische Auswertung erfolgte im ELISA-Reader mit Hilfe des Programmes
MRX Revelation.
3.7 Atomabsorptionsspektroskopie
Die Messungen mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) wurden im Institut für
Prävention und Arbeitsmedizin der Deutschen Gesetzlichen Unfallversicherung
(IPA), Abteilung Toxikologie, vorgenommen. Der Überstand der zuvor mit Ag-NP
präinkubierten hMSC sollte hinsichtlich seines Silbergehaltes analysiert werden.
Bei der Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) handelt es sich um eine quantitative
analytische Methode, bei der die Fähigkeit der Atome Licht zu absorbieren
ausgenutzt wird. Die zu analysierende Probe wird zunächst mit Hilfe eines
Graphitofens oder einer Flamme atomisiert. Danach wird der Probe Energie
zugeführt, indem sie mit Licht verschiedener Intensitäten und Wellenlängen, das
durch eine Hohlkathodenlampe erzeugt wird, angestrahlt wird. Auf diese Weise
werden die Elektronen in einen angeregten, instabilen Zustand überführt. Wenn
die Elektronen dann zu ihrem Grundzustand zurückkehren, wird Energie in Form
von Licht einer bestimmten Wellenlänge freigesetzt. Die Energiedifferenz
zwischen eingestrahltem und austretendem Licht kann detektiert und zur
Stoffbestimmung eines Elements in der Probe herangezogen werden, da jedes
chemische Element ein spezifisches Linienspektrum aufweist. Die Anzahl der
atomisierten und angeregten Teilchen ist direkt proportional zur Konzentration der
Probe. Daher kann mit Hilfe der Absorption (Extinktion) des emittierten Lichts die
Konzentration der Atome in der Probe über das Lambert-Beersche Gesetz direkt
berechnet werden.
Abb. 6: Lambert-Beer-Gesetz
38
3.8 Immuncytochemie
Um die Lokalisation endozytierter Ag-NP innerhalb einer Zelle genauer
charakterisieren zu können, wurden adhärente hMSC nach einer 24-stündigen
Präinkubation mit 5 µg/ml Silbernanopartikeln nach 0, 24, 48 und 72 h
immuncytochemisch analysiert.
Hierzu wurden der Golgi-Apparat und die Lysosomen mit spezifischen
fluoreszenzgekoppelten Antikörpern gefärbt. Der Zellkern wurde durch eine
Hoechst- Färbung dargestellt.
3.8.1 Färbung des Golgi-Apparates
Für die Färbung des Golgi-Apparates wurde BODIPY FL C5-ceramide complexed
to BSA verwendet. Die Zellen wurden zunächst zweimal mit eiskaltem RPMI
gewaschen, bevor sie für 30 min bei 4 °C im Dunkeln mit 5 µM des Antikörpers
gelöst in RPMI inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurden die Zellen erneut
zweifach mit eiskaltem RPMI gewaschen.
3.8.2 Färbung der Lysosomen
Nach der Anfärbung des Golgi-Apparates (s. 3.9.1) wurden die Lysosomen mit
LysoTracker Red DND-99 angefärbt. Dazu wurden die Zellen 30 min mit 50 nM
Lyso-Tracker gelöst in RPMI bei 37°C im Dunkeln inkubiert und danach zweimal
mit RPMI gewaschen.
3.8.3 Färbung des Nucleus
Der Zellkern wurde mit einer Hoechst-Färbung dargestellt. Hoechst ist ein
Fluoreszenzfarbstoff, der sich bevorzugt der DNA anlagert und somit gut zur
Darstellung des Zellkerns geeignet ist. Die Zellen wurden 5 min bei
Raumtemperatur im Dunkeln mit 162 µM Hoechst33342 gelöst in RPMI inkubiert
und anschließend zweifach mit RPMI gewaschen. Die Auswertung und
Dokumentation erfolgte mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops (OlympusBX61 mit
F-View Kamera).
39
3.9 Statistik
Zur statistischen Auswertung aller Messdaten wurde das Programm SigmaStat
2.03 verwendet. Bei gegebener Normalverteilung und Varianzgleichheit wurde bei
einem Vergleich von mehreren Gruppen die One Way (ein Faktor, z.B.
Zeitabhängigkeit), bzw. die Two Way ANOVA (zwei Faktoren, z.B. Zeit- und
Proteinabhängigkeit) angewandt. Zum paarweisen Vergleich wurde hierbei
anschließend der Tukey Test durchgeführt. Wurden nur zwei Gruppen miteinander
verglichen, wurde unter der Voraussetzung der Normalverteilung der t-Test und
bei einer nicht normalen Verteilung der u-Test verwendet.
40
4. Ergebnisse
4.1 Aufnahme von Polyvinylpyrrolidon (PVP)-stabilisierten Silber-
Nanopartikel (Ag-NP) durch humane mesenchymale Stammzellen (hMSC)
Zur Untersuchung der Aufnahme von monodispersen Ag-NP in hMSC wurden die
subkonfluent gewachsenen Zellen unter Zellkulturbedingungen mit einer
subtoxischen Konzentration von PVP-stabilisierten Ag-NP für 24 h inkubiert.
Danach wurden sie hinsichtlich ihres intrazellulären Silbergehaltes untersucht. Die
lichtmikroskopische Analyse dieser Zellen unter Einsatz des Digital Contrast
Enhancements (DCE-Filters) zeigte im Gegensatz zu unbehandelten Zellen
(Abb. 7A) intrazelluläre Silberagglomerate in der perinukleären Region (Abb. 7B).
Mit Hilfe der fokussierten Ionenstrahltechnik (FIB) wurden Querschnitte von
einzelnen Zellen erzeugt, welche dann mittels Rasterelektronenmikroskopie
(REM) analysiert wurden. Auf diese Weise konnte bestätigt werden, dass die
Agglomerate sich tatsächlich intrazellulär befanden. Die Abb. 7C zeigt eine REM-
Aufnahme einer hMSC, die zuvor 24 h mit 20 µg/ml Ag-NP inkubiert worden war.
Es ließen sich intrazelluläre Agglomerate nachweisen (Abb. 7C, gekennzeichnet
durch weißen Pfeil), die mittels Elementenanalyse (EDX) als Silber identifiziert
werden konnten (Abb. 6D). Silber wurde nur in mit Ag-NP präinkubierten hMSC
nachgewiesen, unbehandelte Zellen enthalten im Vergleich nur Elemente wie
Kohlenstoff, Sauerstoff, Gallium, Schwefel und Chlor. Das Auftreten von Gallium
ist durch den Einsatz der FIB-Methode bedingt, hierbei wird Gallium als
Ionenquelle verwendet (s.3.4.3).
41
Abb. 7: Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen (A, B), sowie eine FIB/REM Aufnahme (C) mit korrespondierender Elementenanalyse (D) von hMSC: Im Gegensatz zur nicht behandelten Kontrolle (A) erkennt man bei der mit Ag-NP inkubierten Probe (B) lichtmikroskopisch, sowie in der FIB/REM Aufnahme (C) deutlich intrazelluläre Silberagglomerate (weiße Pfeile); Zellkerne (schwarzer Pfeil) wurden mittels Hoechst-Färbung angefärbt. Die Elementenanalyse (D) identifiziert die in Abb. C erkennbaren Elektronen reflektierenden Strukturen als Silber (grauer Pfeil)
4.2.1 Analyse der intrazellulären Silberkinetik nach Langzeitkultivierung
Um zu analysieren, was mit den aufgenommenen Ag-NP bei weiterer Kultivierung
der hMSC geschieht, wurden diese für 1h mit 20 µg/ml, 30 µg/ml und 50 µg/ml
Ag-NP präinkubiert (NP-Beladung). Im Anschluss wurden die Zellen gewaschen
und in partikelfreiem Zellkulturmedium kultiviert. Zu verschiedenen Zeitpunkten
erfolgte die Analyse der Zellen mittels Durchflusszytometrie (Abb. 8). Hierbei gilt
die gemessene Sidescatter-Intensität (SSC-Intensität) als ein Maß für die
Granularität einer Zelle, das heißt, je höher die Partikelaufnahme ist, desto höher
ist auch die SSC-Intensität. Die SSC-Intensität korreliert also positiv mit dem
Vorliegen intrazellulärer Ag-NP-Agglomerate. Da außerdem größere Nanopartikel
höhere SSC-Signale entstehen lassen als kleine (Daten nicht gezeigt), wurde
42
darauf geachtet, dass immer Ag-NP des gleichen Durchmessers verwendet
wurden.
In Abb. 8 ist zu erkennen, dass die ermittelte SSC-Intensität von mit Ag-NP
beladenen Zellen nach einer weiteren Inkubationszeit von 24 h abnimmt,
verglichen mit den Zellen, die lediglich mit Ag-NP präinkubiert wurden (Zeitpunkt
0 h). Dieses Phänomen trat unabhängig von der verwendeten Ag-NP
Konzentration auf und ist repräsentativ in Abb. 7 für eine Ag-NP Konzentration von
20 µg/ml dargestellt.
Abb. 8: Zeitabhängige Abnahme der Granularität von zuvor mit Ag-NP (20 µg/ml) für 24 h
präinkubierten hMSC bei Kultivierung in partikelfreiem Zellkulturmedium ermittelt durch SSC-Intensitätsanalyse. Die Werte repräsentieren Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten (n=3). Fehlerindikator: Standardabweichung, *p<0,05
Wir konnten des Weiteren in einer anderen Versuchsreihe zeigen, dass der
intrazelluläre Silbergehalt bei einer Inkubationszeit von bis zu 72 h sukzessive
weiter abnahm und sich dem Kontrollwert annäherte (Abb. 9 und 10). Es wurde
aufgrund der längeren Präinkubationsperiode von 24 h bei diesem Experiment
eine geringere Ag-NP Konzentration (5 µg/ml) gewählt, um das Risiko einer
akkumulierenden Silbertoxizität zu vermeiden, welche die Ergebnisse beeinflussen
43
würde. [Greulich et al. 2009, 114]. Nach verschiedenen Inkubationszeitpunkten
(0 h, 24 h, 48 h und 72 h) erfolgte eine Analyse mittels Lichtmikroskopie sowie
Durchflusszytometrie. Die Untersuchung mit Hilfe der Lichtmikroskopie offenbarte,
dass sich der intrazelluläre Gehalt von Silberagglomeraten in hMSC mit längerer
Kultivierungsdauer verringerte (Abb. 9).
Abb. 9: Abnahme der intrazellulären Silberagglomerate von mit Ag-NP vorbehandelten hMSC
unter Kultivierung in Ag-NP-freiem Zellkulturmedium. A zeigt eine lichtmikroskopische Abbildung einer hMSC nach NP-Beladung (Zeitpunkt 0 h). B stellt eine Zelle lichtmikroskopisch dar, die für weitere 72 h in Ag-NP-freiem Zellkulturmedium inkubiert wurde, Weißer Pfeil: intrazelluläre Silberagglomerate, schwarzer Pfeil: mittels Hoechst angefärbter Zellkern
Der entsprechende intrazelluläre Silbergehalt wurde mit Hilfe der
Durchflusszytometrie durch die Ermittlung der SSC-Intensität zudem quantifiziert.
Hier bestätigte sich auch quantitativ eine Abnahme der intrazellulären Menge an
Ag-NP (Abb. 10). Das repräsentative Histogramm (A), sowie das aus den
Messwerten der SSC-Intensitätsanalyse erstellte Balkendiagramm (B) belegen,
dass sich die Granularität nach 24 h, 48 h und 72 h Inkubation in Ag-NP-freiem
Zellkulturmedium sukzessive der unbehandelten Kontrolle annäherte. Bei dem im
Abb. 10A gezeigten Histogramm handelt es sich um eine einfache
Häufigkeitsverteilung bei der die SSC-Intensität (x-Achse) gegen die Anzahl der
Zellzahl (y-Achse) aufgetragen ist.
Anhand der ermittelten Werte ließ sich berechnen, dass nach 72 h Inkubation im
Durchschnitt 73% der zuvor aufgenommenen Ag-NP von hMSC wieder frei
gesetzt worden waren.
44
Abb. 10: Mittels Durchflusszytometrie quantitativ ermittelte SSC-Intensität, dargestellt als
repräsentatives Histogramm (A), sowie zusammenfassend als Balkendiagramm unter Angabe der Standardabweichung (B), die One-Way ANOVA bestätigt eine Signifikanz für die zeitabhängige Abnahme der Granularität p<0,001, n=7; ***p<0,001, **p<0,01; *p<0,05
Zusätzlich wurden zu allen Zeitpunkte Zellzählungen mit Hilfe der
Durchflusszytometrie durchgeführt, welche gezeigt haben, dass die Zellzahl
zwischen den verschiedenen Inkubationszeitpunkten bis 72 h konstant bleibt.
Daraus kann geschlossen werden, dass es sich bei der Abnahme der
45
Granularitätssignale bis zu einem Zeitpunkt von 72 h nach Präinkubation um einen
zellteilungsunabhängigen Prozess handelt.
4.2.2 Rolle der exogenen Proteine
Um den Einfluss exogener Proteine auf die mögliche Exozytose untersuchen zu
können, wurden die hMSC nach der NP-Beladung in partikelfreiem
Zellkulturmedium, in dem der Proteingehalt variiert wurde, für bis zu 72 h kultiviert.
Der Proteingehalt des Zellkulturmediums wurde eingestellt, indem der Anteil an
fötalem Kälberserum (0%, 0,1%, 1%, 5%, 10%) variiert wurde. Nach 24 h, 48 h
und 72 h wurden die hMSC mit Hilfe der Durchflusszytometrie und der
Lichtmikroskopie auf ihren intrazellulären Ag-NP-Gehalt untersucht. Die
Lichtmikroskopie offenbarte einen deutlichen Unterschied bezüglich des
intrazellulären Silbergehalts zwischen Zellen, die in reinem RPMI (Abb. 12 A) und
jenen, die in RPMI/10% fötalem Kälberserum (FCS) (Abb. 12 B) kultiviert wurden.
Insbesondere nach einer Inkubationsdauer von 72 h war zu erkennen, dass in den
in RPMI inkubierten Zellen noch deutlich mehr Ag-NP Agglomerate vorhanden
waren (Abb. 12).
Abb. 12: Abnahme der intrazellulären Silberagglomerate in Abhängigkeit der FCS Konzentration im Zellkulturmedium. A und B zeigen repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen von hMSC, die nach einer 24-stündigen Präinkubation mit Ag-NP für weitere 72 h in reinem RPMI (A) oder in RPMI/10% FCS (B) inkubiert wurden. Weißer Pfeil: intrazelluläre Silberagglomerate, schwarzer Pfeil: mittels Hoechst angefärbter Zellkern.
Dies wurde durch die quantitative Analyse mit der Durchflusszytometrie bestätigt
(Abb. 13). Die Analyse zeigte, dass die SSC-Intensität der Zellen bei Kultivierung
ohne exogene Proteine, also in reinem RPMI, nur sehr gering abnahm.
Vergleichbar verhielt es sich bei denjenigen Zellen, die in RPMI mit einem Anteil
46
an FCS von 0,1% inkubiert wurden. Ab einem FCS-Anteil von 1% war die
Tendenz einer Abnahme der SSC-Intensität zu erkennen. Eine signifikante
zeitabhängige Abnahme der Granularität zeigte sich ab einem FCS-Anteil von 5%
im Zellkulturmedium. Dieser Effekt war bei einem Anteil von 10% noch stärker
ausgeprägt. (Abb. 13 B).
Abb. 13: Mittels Durchflusszytometrie quantitativ ermittelte SSC-Intensität in Abhängigkeit der FCS-Konzentration als repräsentatives Histogramm (A) und zusammenfassend als Balkendiagramm unter Angabe der Standardabweichung (B).Es zeigt sich eine signifikant stärkere Abnahme der SSC-Intensität in der Anwesenheit von mindestens 5% FCS (D), Die Two-Way ANOVA bestätigt eine signifikante Proteinabhängigkeit p<0,001, n=4; **p<0,01; *p<0,05
47
4.2.3 Analyse des Zellkultur-Überstandes hinsichtlich seines Silbergehaltes
Mit Hilfe der Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) (s. 3.7) wurde im Rahmen der
in 4.2.2 und 4.2.1 beschriebenen Experimente der Zellkultur-Überstand der hMSC
zu jedem Messzeitpunkt hinsichtlich seines Silbergehaltes analysiert. Diese
analytische Methode ermöglichte es, Silber im Zellkulturmedium nachzuweisen
(Abb. 14). Dieses im Überstand nachgewiesene Silber war also entweder von den
Zellen exozytiert worden, oder hatte an der Oberfläche der hMSC gebunden. Es
konnte deutlich gezeigt werden, dass Silber zum einen von den hMSC
aufgenommen wurde (Abb. 13 Vergleich Startpunkt mit 0 h) und nach
Langzeitkultivierung auch zum Teil wieder frei gesetzt wurde. Außerdem war zu
erkennen, dass unter Langzeitkultivierung in RPMI/10% FCS nach 24 und 72 h
signifikant höhere Silberkonzentrationen im Zellkultur-Überstand nachgewiesen
werden konnten als bei Kultivierung in reinem RPMI. Dies bestätigt die mittels
Lichtmikroskopie und Durchflusszytometrie erzielten Ergebnisse hinsichtlich des
Einflusses der exogenen Proteine auf die Menge des ausgeschleusten Silbers.
Abb. 14: Mittels AAS ermittelte Silberkonzentrationen im Zellkulturmedium zu verschiedenen
Inkubationszeitpunkten in reinem RPMI und RPMI/10% FCS unter Angabe der Standardabweichung. n=5; *p<0,05
48
4.2.4 Intrazelluläre Lokalisation der Ag-NP in hMSC
Zu allen Messzeitpunkten (0 h, 24 h, 48 h und 72 h) des in 4.2.1 beschriebenen
Versuches wurden verschiedene Zellorganellen von hMSC wie in 3.9 beschrieben
angefärbt und unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet, um die Ag-NP
Agglomerate intrazellulär zu lokalisieren. Wie man in Abb. 15 sehen kann, nahm
die Menge der intrazellulären Ag-NP Agglomerate mit längerer Kultivierungsdauer
progredient ab. Des Weiteren war zu erkennen, dass sich die Silberagglomerate
zunächst perinukleär in Lysosomen ansammelten (Abb. 15 A-C). Die
Kolokalisation in Endo-Lysomen lysosomalen Strukturen blieb mit zunehmender
Kultivierungsdauer bestehen, jedoch verschwand die spezifische perinukleäre
Anordnung der Agglomerate (Abb. 15 J-L). Im Golgi-Apparat (grün) und im
Zellkern (blau) ließen sich zu keinem Zeitpunkt Partikelagglomerate nachweisen
49
Abb. 15: Intrazelluläre Lokalisation der Ag-NP in hMSC 0 h (A-C), 24 h (D-F), 48 h (G-I) und 72 h
(J-L) nach Präinkubation mit Ag-NP. Es ist jeweils eine lichtmikroskopische Aufnahme (A, D, G, J), das dazu gehörige fluoreszenzmikroskopische Bild (B, E, H, K) und eine Übereinanderlagerung (C, F, I, L) gezeigt. Schwarzer Pfeil: intrazelluläre Silberagglomerate
4.2.5 Albuminabhängige Abnahme der SSC-Intensität
Bei fetalem Kälberserum (FCS) handelt es sich um ein Gemisch aus vielen
verschiedenen Proteinen, wie z.B. Albumin. Es wurde nun untersucht, ob das
Albumin als spezifischer Faktor einen Einfluss auf den intrazellulären Gehalt an
Partikelagglomeraten hat. Albumin ist das häufigste im Blutplasma vorkommende
Protein und vor allem für die Aufrechterhaltung des kolloidosmotischen Druckes
verantwortlich (Deetjen et al. 2005c). Die Hypothese war, dass Albumin als
Trägermolekül fungiert und den Partikeln den Weg durch die Zelle erleichtert. Es
wurde dazu statt FCS Humanserumalbumin (HSA) im Zellkulturmedium verwendet
und das Versuchsprotokoll aus 4.2.2 befolgt. Es zeigte sich, dass Albumin in
keiner angewandten Konzentration (0,1%, 1%, 5%, 10%) eine Abnahme der
50
Granularität begünstigte (Abb. 16). Wie in Abb. 16 zu erkennen führte die
Verwendung von HSA im Zellkulturmedium zu keiner signifikanten Abnahme der
SSC-Intensität, ähnlich wie bei einer Kultivierung in reinem RPMI. Abb. 16 B zeigt
einen Vergleich zwischen hMSC die in reinem RPMI, RPMI/10% FCS oder
RPMI/0,1% HSA kultiviert wurden, dabei entspricht 0,1% HSA dem Albuminanteil,
der sich auch in RPMI/10% FCS befindet. Unter Kultivierung der Zellen mit
RPMI/10% FCS ist die SSC-Intensität im Vergleich zur Kultivierung in RPMI und
RPMI/0,1% HSA signifikant erniedrigt.
Abb. 16: Einfluss verschiedener Konzentrationen von Humanserumalbumin auf die Exozytose von
Ag-NP aus hMSC ermittelt durch Durchflusszytometrie unter Angabe der Standardabweichung (A).B zeigt einen Vergleich zwischen hMSC die in reinem RPMI, RPMI/10% FCS oder RPMI/0,1% HSA kultiviert wurden (**p< 0,01, n=4)
51
4.2.6 Zelluläre Transportinhibition
Da bereits von Greulich et al. (Greulich et al., 2011b) gezeigt werden konnte, dass
Ag-NP von hMSC via Clathrin-vermittelter Endozytose und Makropinozytose
aufgenommen werden, lag es nah, dass diese auch auf diesem Weg wieder von
Zellen ausgeschleust werden können. Um diesen Mechanismus untersuchen zu
können, wurden hMSC nach NP-Beladung mit 4 verschiedenen
Transportinhibitoren behandelt: Chlorpromazin, einem Inhibitor des Clathrin-
vermittelten Weges, Filipin und Nystatin, beides Caveolaeinhibitoren, sowie
Wortmannin, einem Inhibitor der Makropinozytose. Chlorpromazin ist ein
Phenothaizinderivat und inhibiert die Assemblierung der Clathrin-Proteine zur
Triskelion-Struktur und somit die Bildung von Endosomen. Nystatin bindet mit
seiner lipophilen Region z.B. an Cholesterin in der Zellmembran eukaryoter Zellen
und inhibiert so die Calveolae-vermittelte Endozytose. Filipin bindet ebenfalls an
Cholesterin und hemmt den Calveolae-vermittelten Weg. Bei Wortmannin handelt
es sich um ein Mykotoxin, das irreversibel an die ATP-Bindestelle der
Phosphatidylinositol-3-Kinase bindet und so den endosomalen Transfer stört, für
den das Produkt dieses Enzyms unabkömmlich ist. Die optimalen
Inhibitorkonzentrationen wurden experimentell ermittelt, es wurden die höchsten
Konzentrationen, die die Zellviabilität nicht beeinflussten, gewählt (Daten nicht
gezeigt). Die hMSC wurden mit Ag-NP beladen, im Anschluss mit den Inhibitoren
für weitere 24 h inkubiert und die SSC-Intensität mittels Durchflusszytometrie
ermittelt. Im Vergleich zu reinem RPMI/10% FCS ist nach 24 h eine signifikant
höhere Granularität der Zellen bei Verwendung von Chlorpromazin nachweisbar
(Abb. 17). Innerhalb von 24 h, verglichen mit einer Probe ohne Inhibitor, ist keine
Abnahme der SSC-Intensität zu verzeichnen. Dies lässt darauf schließen, dass die
Abgabe der internalisierten Ag-NP durch die Zugabe von Chlorpromazin gehemmt
werden kann und folglich zumindest teilweise Clathrin-abhängig geschieht. Die
Zellen, die mit Wortmannin behandelt wurden, zeigen ebenfalls die Tendenz zu
einer geringeren Abnahme der SSC-Intensität als jene, die in RPMI/10% FCS
inkubiert wurden, jedoch ist dieser Unterscheid statistisch nicht signifikant. Die
Inhibitoren Filipin und Nystatin hingegen zeigten keinen Einfluss auf den Ag-NP
Gehalt der hMSC.
52
Abb. 17: Exozytosemechanismen von Ag-NP aus hMSC. Dargestellt ist die SSC-Intensität von mit Ag-NP für 24 h präinkubierten hMSC nach Behandlung mit verschiedenen Inhibitoren für 24 h in % zur mit Ag-NP präinkubierten Probe zum Zeitpunkt 0 h: *p<0,05, n=5.
4.3 Aktivierung von hMSC unter dem Einfluss von Ag-NP
HMSC sezernieren eine Palette typischer Zytokine, darunter IL-6, IL-8, IL-11 und
VEGF. Die Zytokinfreisetzung wurde als Marker für die Aktivierung der Zellen
benutzt. Die hMSC wurden mit einer subtoxischen Konzentration von Ag-NP
präinkubiert und für weitere 72 h in partikelfreiem Zellkulturmedium inkubiert. Nach
jeweils 24 h wurde das Zellkulturmedium erneuert und eine Probe des
Überstandes zur Ermittlung der Zytokinkonzentration entnommen. Es wurde also
jeweils die Zytokinfreistzung innerhalb eines Zeitintervalls von 24 h ermittelt. Die
Zytokinfreisetzung wurde mittels ELISA (s. 2.6) bestimmt. Es konnte nach der
Inkubation von hMSC mit Ag-NP ein differenzielles Zytokinmuster detektiert
werden. Abb. 18 zeigt deutlich, dass die IL-8 Sekretion der hMSC unter dem
Einfluss von Ag-NP signifikant erhöht ist. Mit längerer Inkubationsdauer nimmt die
IL-8 Freisetzung wieder ab, ist jedoch bei Kultivierung in RPMI/ 10% FCS nach
72 h im Vergleich zur Kontrolle immer noch erhöht. Die IL-8 Freisetzung korreliert
hier also mit dem intrazellulären Silbergehalt: Je höher der intrazelluläre
Silbergehalt ist, desto höher ist auch die IL-8 Sekretion der Zellen.
53
Abb. 18: IL-8 Freisetzung von hMSC nach Präinkubation mit 5 µg/ml Ag-NP und weiterer Kultivierung in partikelfreiem Medium (RPMI/10% FCS): Die One-Way-Anova bestätigt eine signifikante zeitabhängige Abnahme der IL-8 Freisetzung p=0,016; t-Test: *p<0,05; **p<0,01; n=4.
Als Fehlerindikator ist die Standardabweichung angegeben.
Bei der Analyse der IL-6 Sekretion konnte nach Präinkubation mit Ag-NP eine
Abnahme der Freisetzung beobachtet werden (Abb. 19). Nach 24 h ist erneut ein
signifikanter Abfall der IL-6 Freisetzung zu erkennen (Abb. 19), im weiteren
Verlauf (48 und 72 h) bleibt die IL-6 Freisetzung konstant niedrig (Abb. 19).
54
Abb. 19: IL-6 Freisetzung von hMSC nach Präinkubation mit 5µg/ml Ag-NP und weiterer
Kultivierung in partikelfreiem Medium (RPMI/ 10% FCS): Die One-Way-Anova bestätigt eine signifikante zeitabhängige Abnahme der IL-8 Freisetzung p<0,001; t-Test: *p<0,05; **p<0,01; n=4. Als Fehlerindikator ist die Standardabweichung angegeben
Die Analyse der Zytokine IL-11 und VEGF ergab unter dem Einfluss von
Nanosilber keine signifikanten Veränderung im Vergleich zur Kontrolle.
55
5 Diskussion
In dieser Studie wurden die Interaktionen von Silber-Nanopartikeln (Ag-NP) mit
humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) untersucht. Dazu wurde die
Aufnahme der Ag-NP, ihre intrazellulären Transportwege, ihre Exozytose sowie
die Zell-spezifische Aktivierung nach Nanosilberbehandlung unter der
Verwendung verschiedener Methoden analysiert.
5.1 Aufnahme von PVP- stabilisierten Ag-NP in hMSC
Die Aufnahme von Nanopartikeln in eukaryotische Zellen stellt einen
entscheidenden Faktor hinsichtlich ihrer biologischen Effekte auf die Zellen dar.
Reguliert wird die Endozytose von Faktoren der Plasmamembran, über welche
unter Ausbildung von membranumschlossenen Vesikeln verschiedene Stoffe
aufgenommen werden können (Conner and Schmid, 2003). In dieser Studie wurde
die Aufnahme von monodispersen Ag-NP mit einem hydrodynamischen
Durchmesser von ca. 80 nm in hMSC mit Hilfe der Licht- und
Fluoreszenzmikroskopie sowie der FIB/REM-Technik untersucht. Es konnte
gezeigt werden, dass die Ag-NP von den hMSC aufgenommen wurden und
intrazellulär als Agglomerate erschienen (Abb. 7). Die Formation dieser
intrazellulären Cluster konnte auch von Yen et al. (Yen et al., 2009) beobachtet
werden. Eine frühere Studie belegt, dass die Ag-NP unter der Verwendung von
10% FCS im Zellkulturmedium stabil sind und nicht agglomerieren (Kittler et al.,
2010). Folglich muss es sich bei der intrazellulären Agglomeration um einen
Prozess handeln, der sich erst nach der Aufnahme der Partikel vollzieht. Die
molekularen Mechanismen der Partikelagglomeration sind noch nicht bekannt. Es
liegt jedoch nahe, dass ein Einschließen der Nanopartikel in Vesikel in diesen
Prozess involviert ist, wie es von Yen et al. und Harush-Frenkel et al. postuliert
wird (Yen et al., 2009; Harush-Frenkel et al., 2007). Greulich et al. konnten
außerdem zeigen, dass Ag-NP von hMSC über die Clathrin-abhängige
Endozytose und Makropinozytose aufgenommen werden (Greulich et al., 2011b).
Dies lässt ebenfalls darauf schließen, dass die Partikel intrazellulär entsprechend
diesem Aufnahmemechanismus in Vesikeln wie frühen und späten Endosomen
oder Lysosomen vorliegen und sich dort zu Agglomeraten zusammenschließen.
56
Möglicherweise ist die Agglomeration der Nanopartikel durch den niedrigen
pH-Wert in diesen Organellen bedingt, wie es auch von Zhang et al. bei der
Agglomeration von Quantum Dots beobachtet wurde (Zhang and Monteiro-Riviere,
2009).
Der direkte Beweis für die Aufnahme der Ag-NP wurde hier durch die FIB/REM-
Technik (s.2.4.3) erzielt, mit der die intrazellulären Silberagglomerate als
elektronenreflektierende Strukturen sichtbar gemacht werden konnten. Pelka et al.
gelang es unter Verwendung der gleichen Methode bereits die Aufnahme von
Platin-Nanopartikel in Coloncarcinomzellen nachzuweisen (Pelka et al., 2009). Die
FIB/REM-Technik ist somit eine geeignete Methode, um metallische Nanopartikel
intrazellulär zu detektieren. Sie ermöglicht zudem die Erzeugung und Analyse
einer präzisen, glatten Querschnittsfläche von Zellen ohne großen mechanischen
Stress zu verursachen. (Leser et al., 2009; Heymann et al., 2009; Raffa et al.,
2008).
Zahlreiche Studien bezüglich der Interaktionen von Nanopartikeln mit Zellen
lassen darauf schließen, dass die Aufnahme (-rate) der Partikel sowohl
zelltypabhängig als auch partikelabhängig ist (Johnston et al., 2010a; Zambaux et
al., 2000; Chithrani, 2010; Kato et al., 2003). So belegt eine Studie von Greulich et
al., dass Ag-NP vorwiegend von Monozyten endozytiert wurden, jedoch in
Lymphozyten nicht als Agglomerate nachzuweisen waren (Greulich et al., 2011a).
Vergleichbare Ergebnisse mit diesen Zelltypen erzielten Busch et al. unter der
Verwendung von Wolframkarbid-Nanopartikeln (Busch et al., 2011). Des Weiteren
ließ sich zeigen, dass Epithelzellen des Respirationstraktes (HBE) PLGA-
(polyactic-co-glycolic acid) Nanopartikel viel schneller und in höherem Maß
internalisieren als Epithelzellen des Darmtraktes (Caco-2) (Cartiera et al., 2009).
Auch dieses zeigt, dass die Endozytoserate zwischen verschiedenen Zellarten
variiert. Beispielsweise nehmen Makrophagen ungefähr 3% ihrer Zellmembran pro
Minute auf, während Fibroblasten nur etwas weniger als 1% pro Minute
endozytieren (Alberts et al., 2002). Neben dem Zelltyp spielt die Beschaffenheit
der Nanopartikel eine ebenso wichtige Rolle hinsichtlich ihrer Aufnahme. So kann
sie durch die Größe, die Form, die Oberfläche oder die Ladung der Nanopartikel
beeinflusst werden (Rejman et al., 2004; Mailander and Landfester, 2009; Chung
et al., 2007). Es konnte gezeigt werden, dass 20 nm große Polystyrol-Nanopartikel
von Leberzellen rasch internalisiert wurden, wohingehen Polystyrol-Partikel von
200 nm Größe lediglich auf der Zelloberfläche zu lokalisieren waren (Johnston et
57
al., 2010b). Ferner ist die Aufnahme sphärischer Nanopartikel häufig stärker
ausgeprägt als jene von Stabförmigen. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass
stabförmige Nanopartikel in ihrer longitudinalen Ausprägung eine größere Fläche
der Zellmembran besetzen und so weniger Rezeptoren für die Endozytose
verfügbar sind (Chithrani, 2010). Auch die Oberflächenladung der Partikel kann
Einfluss auf die Aufnahmerate und den Aufnahmemechanismus haben (Dausend
et al., 2008). Laut Chitrani und Chan werden positiv geladene Nanopartikel stärker
endozytiert als neutrale oder negativ geladene Partikel (Chithrani and Chan,
2007). Das hier zur Stabilisierung verwendete Polymer PVP auf den Ag-NP ist
prinzipiell neutral, jedoch wurde ein leicht negatives zeta-Potential (-17mV)
gemessen.
Neuen Studien zufolge ist es jedoch nicht die Beschaffenheit des Nanopartikels
allein, die die biologischen Einflüsse und Interaktionen determiniert. Vielmehr geht
man heute davon aus, dass Nanopartikel und ihre assoziierten Proteine die
biologisch aktive Einheit darstellen (Lynch et al., 2007; Treuel et al., 2010). Bei
Kontakt mit biologischen Medien bindet sofort eine Vielzahl verschiedenster
Proteine an die Partikeloberfläche, es kommt zur Ausbildung einer so genannten
Proteincorona (Treuel et al., 2012). Es wird angenommen, dass die Proteinhülle
aus zwei Schichten besteht (Abb. 20): Einer inneren, „harten“ Schicht, in der wenig
Proteinaustausch statt findet und einer äußeren „weichen“ Schicht, die sich
ständig ändert und im Austausch mit zahlreichen freien Proteinen steht (Walczyk
et al., 2010; Lynch et al., 2007). Diese Proteincorona ist es vermutlich, die zu
einem großen Teil die biologische Identität des Nanopartikels definiert, da die
Proteine von z.B. Rezeptoren erkannt werden und Signalkaskaden aktivieren oder
die Rezeptor-vermittelte Endozytose induzieren können (Cedervall et al., 2007;
Monopoli et al., 2011; Kreuter et al., 2002). Beispielsweise zeigten Deng et al.
kürzlich, dass Fibrinogen in der Corona von Gold-Nanopartikeln über mehrere
Reaktionen zur Freisetzung von Zytokinen aus THP1-Zellen führte (Deng et al.,
2011). Einige Bindungen der Proteine sind so fest, dass sie auch nach
Transportprozessen wie der Endozytose an den Nanopartikeln haften bleiben und
dann weitere intrazelluläre Interaktionen wie Transportmechnismen beeinflussen
können (Cedervall et al., 2007).
58
Abb. 20: Schematische Darstellung der möglichen Interaktionen zwischen Nanopartikel-Protein-Komplex und einer Zelle (A); Aufbau des Nanopartikel-Protein-Komplexes (B): Nanopartikelkern mit ihn umgebender Proteincorona bestehend aus einer äußeren Schicht, die im Austausch (rote Pfeile) mit löslichen Proteinen des umgebenden Mediums steht (links) und einer inneren Schicht mit fest gebundenen Proteinen (rechts); (Quelle: Walczyk et al. 2009)
Neben Proteinen wie Albumin, Immunglobulinen oder Apolipoproteinen wurden
bereits andere Moleküle, wie Cholesterol, Triglyceride, Phospholipide oder
Kohlenhydrate in Nanopartikelcoronen identifiziert (Hellstrand et al., 2009). Die
genaue Charakterisierung der Corona ist wichtig, um die biologischen
Interaktionen von NP mit eukaryoten Zellen zu verstehen
5.2 Ag-NP induzierte Aktivierung von hMSC
Um die Aktivierung von hMSC unter dem Einfluss von Ag-NP zu analysieren,
wurde die Freisetzung der hMSC typischen Zytokine IL-6, IL-8, IL-11 und VEGF
(vascular endothelial growth factor) herangezogen. Dazu wurde der Überstand
von mit Ag-NP inkubierten hMSC mittels ELISA untersucht. Es konnte deutlich
gezeigt werden, dass die Freisetzung des proinflammatorischen Zytokins IL-8 in
hMSC unter dem Einfluss von Ag-NP erhöht ist, wohingegen die IL-6 Sekretion
runterreguliert wird (Abb. 18, 19). Ähnliche Resultate erzielten Greulich et al. 2009
(Greulich et al., 2009). Kürzlich wurde zudem gezeigt, dass neutrophile
Granulozyten durch Silber-beschichtete Polyester Gefäßprothesen in vitro aktiviert
werden können und mit der Freisetzung von IL-8 und Leukotrien B4 antworten
(Tautenhahn et al., 2008). Studien belegen, dass wichtige Aspekte des
biologischen Verhaltens von Ag-NP wie die Zelltoxizität und die antimikrobiellen
Eigenschaften eng mit der ionischen Aktivität von Nanosilber verknüpft sind (Juan
et al., 2010; Kawata et al., 2009). Die Partikel selbst fungieren als „Trojanisches
Pferd“ und transportieren die Silberionen in die Zelle (Limbach et al., 2007; Park et
al., 2009). Es wird angenommen, dass unter anderem Silberionen, die erhöhte
IL-8 Sekretion in Zellen induzieren (Johnston et al., 2010a). Interessanterweise
59
konnte in hMSC eine erhöhte IL-8 Freisetzung auch nach einer Behandlung mit
Nickelionen beobachtet werden (Habijan et al., 2007). Fritz et al. erfassten ein
verändertes Zytokinmuster einschließlich hoher IL-8 Sekretion bei Osteoblasten
nach Behandlung mit Titanpartikeln (Fritz et al., 2002). Die Induktion dieses
Zytokins ist somit vermutlich keine spezifische Antwort auf die Silberionen,
sondern ein Effekt, der durch Metallionen im Allgemeinen ausgelöst wird (Wagner
et al., 1998). Ye et al. erklärten die erhöhte IL-8 Sekretion von A549 Zellen nach
Behandlung mit Karbon-Nanoröhrchen durch die Induktion von oxidativem Stress
und anschließender Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-ĸB (Ye et al., 2009).
Dieser ist ein Redox-sensitiver Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle in
verschiedenen zellulären Prozessen wie Inflammation, Zellproliferation und
Apoptose spielt und in diesem Zusammenhang die Expression zahlreicher
Proteine, u. a. IL-8, reguliert (Gloire et al., 2006). Diese Hypothese könnte auch für
Silber-Nanopartikel zutreffen (Abb. 21). Zahlreiche Studien belegen bereits, dass
Silber in Zellen oxidativen Stress verursachen kann (Foldbjerg et al., 2010;
Yoshimaru et al., 2006; Carlson et al., 2008). Es ist bekannt, dass Ag-NP in
Abhängigkeit verschiedener Faktoren Silberionen freisetzen (Liu et al., 2010). Die
Ag-NP wurden in dieser Arbeit nach ihrer Aufnahme vor allem in lysosomalen
Strukturen lokalisiert. In diesen Organellen kann der pH-Wert auf bis zu 4,5 sinken
(Asokan and Cho, 2002; Zhang and Monteiro-Riviere, 2009). Eine Arbeit von Liu
und Hurt lässt vermuten, dass die Freisetzung von Silberionen aus Ag-NP durch
einen niedrigen pH-Wert erhöht wird (Liu and Hurt, 2010). Diese freien Ionen
können nun zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wie
Wasserstoffperoxid (H2O2), Hydroxylradikalen (-OH) oder Superoxidanionen (O2-)
führen (AshaRani et al., 2009; Foldbjerg et al., 2009). In die Metallionen induzierte
Generierung von ROS sollen Fenton-ähnliche Reaktionen involviert sein, wie es
von Liochev und Ercal et al. beschrieben wurde (Liochev, 1999; Ercal et al., 2001).
Des Weiteren binden Silberionen an Sulfhydrylgruppen, die häufig als funktionelle
Gruppe in Antioxidantien wie Glutathion vorkommen. Die Erschöpfung der
antioxidativen Kapazitäten erhöht somit ebenfalls den oxidativen Stress (Valko et
al., 2006). Reaktive Sauerstoffradikale fungieren als second messenger und
bewirken u. a. die Translokation des Redox-sensitiven Transkriptionsfaktors
NF-ĸB in den Zellkern, wo dieser die Transkription inflammatorischer Gene, wie
jener für IL-8, induziert (Ghosh and Hayden, 2008; Gloire et al., 2006).
60
Abb. 21: Hypothese zum molekularen Mechanismus der Ag-NP induzierten IL-8 Freisetzung
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die IL-8 Freisetzung von mit Ag-NP
beladenen hMSC nach längerer Inkubationsdauer (24 h, 48 h und 72 h)
progredient abnahm und sich wieder den Kontrollwerten annäherte. Zudem
verringerte sich der intrazelluläre Silbergehalt zeitabhängig. Dies deutet darauf
hin, dass die IL-8 Sekretion in direkter Korrelation zum intrazellulären Silbergehalt
steht: Je mehr Silber intrazellulär vorhanden ist, desto höher ist auch die IL-8
Sekretion.
Die Studienlage erlaubt es derzeit noch nicht, die hier detektierte Verringerung der
IL-6 Freisetzung auf molekularer Ebene zu erklären. Des Weiteren ist die Literatur
diesbezüglich nicht eindeutig. Einige Studien postulieren eine erhöhte IL-6
Sekretion nach NP-Behandlung in Folge von oxidativem Stress (Fritz et al., 2002;
Schmalz et al., 2000; Wagner et al., 1998). In dieser Arbeit war die IL-6
Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle deutlich vermindert. Carlson et al. konnten
nach der Behandlung von Alveolarmakrophagen mit Ag-NP ebenfalls nur wenig
oder kein IL-6 im Überstand der Zellkultur detektieren (Carlson et al., 2008). An
dieser Stelle sind weitere Untersuchungen notwendig. Interessanterweise nimmt
die IL-6 Freisetzung noch einmal signifikant nach einer weiteren Inkubationszeit
von 24 h ab. Eine mögliche Erklärung ist die Überstimulation der Zellen durch die
Silberionen, was in einer Zellparalyse resultieren könnte.
Dennoch konnte die Aktivierung der hMSC nach Behandlung mit subtoxisch
konzentrierten Ag-NP hier deutlich anhand eines veränderten Zytokinmusters
61
gezeigt werden. Ob und inwiefern die Aktivierung der Zellen und insbesondere die
gesteigerte Sekretion des proinflammatorischen IL-8 einen entscheidenden
Einfluss auf die Bioverträglichkeit von Nanosilber hat, muss in weiteren in vitro und
in vivo Studien näher analysiert werden. Es kann aber nicht ausgeschlossen
werden, dass Ag-NP vermittelt über IL-8 eine Entzündungsreaktion auslösen
können.
5.3 Das Schicksal der internalisierten Nanopartikel
Der weitere intrazelluläre Verbleib der aufgenommenen Partikel ist von großer
Bedeutung für die biologischen Effekte von Nanopartikeln und somit auch für die
Risikoabwägung bei einem Einsatz von Nanopartikeln in der Medizin. Es ist
bekannt, dass kleine Moleküle wie die Nanopartikel durch den Prozess der
Endozytose internalisiert werden (Sahay et al., 2010). Bei den meisten
Aufnahmewegen, darunter der angenommene Aufnahmeweg der Ag-NP, werden
die Nanopartikel von der Zellmembran umschlossen und in Vesikel verpackt (Hu,
2009). Über mehrere Schritte reifen diese zu späten Endosomen und dann zu
Lysosomen heran, ein Prozess, der mit einem intravesikulären Abfall des
pH-Wertes verbunden ist. Infolgedessen werden einige Partikel vermutlich in den
Lysosomen abgebaut, wohingegen andere dem Abbau entgehen und aus den
Lysosomen emigieren können. Diese Nanopartikel können somit in der Lage sein
zu anderen Zellorganellen, wie z.B. dem Golgi-Apparat oder dem Zellkern, zu
gelangen (Nam et al., 2009). Auch wäre es möglich, dass die Nanopartikel wieder
aus der Zelle heraus transportiert werden (Panyam and Labhasetwar, 2003).
Hieraus ergeben sich viele Interaktions- und Transportmöglichkeiten für die
Nanopartikel. In dieser Studie wurde der intrazelluläre Verbleib von
internalisierten Ag-NP unter Verwendung verschiedener Methoden hinsichtlich der
intrazellulären Lokalisation der Nanopartikel sowie ihrer Exozytose untersucht.
5.3.1 Intrazelluläre Lokalisation von Nanopartikeln
Die licht- und fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von hMSC nach
24-stündiger Inkubation mit Ag-NP zeigte intrazelluläre Silberagglomerate, die
hauptsächlich mit späten endolysosomalen Strukturen kolokalisiert waren. Es
zeigte sich außerdem eine auffällige perinukleäre Anordnung der
62
Silberagglomerate. Sowohl im Zellkern als auch im Golgi-Apparat wurden
allerdings keine Ag-NP Cluster entdeckt. Eine frühere Studie mit hMSC und
Ag-NP der gleichen Größe konnte ebenfalls keine Ag-NP im Endoplasmatischen
Retikulum der Zellen nachweisen (Greulich et al., 2011b). Eine Kolokalisation von
internalisierten Nanopartikeln mit Lysosomen und Endosomen wurde auch von
anderen Arbeitsgruppen für verschiedene Nanopartikel und Zelltypen gezeigt
(Zhang and Monteiro-Riviere, 2009; Salvati et al., 2011). Beispielsweise
beschrieben Mailänder und Landfester die Kolokalisation von verschiedenen
Nanopartikeln mit endolysosomalen Strukturen in Stammzellen und HeLa-Zellen
(Zervixkarzinomzellen) (Mailander and Landfester, 2009). In diesen Zellen wurden
ebenfalls keine Nanopartikel im Zytoplasma, im Zellkern, im Golgi-Apparat oder in
Mitochondrien entdeckt. Laut Fröhlich et al. ist der Eintritt von Nanopartikeln in
andere Zellorganellen größenabhängig (Frohlich et al., 2009). Untersuchungen zur
Aufnahme von Gold-Nanopartikeln in den Zellkern von humanen Fibroblasten
belegten, dass 5 nm große Partikel in den Zellkern gelangen konnten, während
Partikel von 30 nm Größe nur im Cytosol zu finden waren (Berry et al., 2007). Dies
deutet darauf hin, dass der Eintritt in den Zellkern gegebenenfalls durch die
Kernporen limitiert wird, deren zentraler Transporter nur die Passage von Partikeln
bis zu einer Größe von 9 nm zulässt (Beck et al., 2004). Die Größenrestriktion des
Endoplasmatischen Retikulums beträgt ca. 13 nm laut Chang et al. (Chang et al.,
2008). Folglich war ein Vorkommen der ca. 80 nm großen Ag-NP in diesen
Organellen unwahrscheinlich. Cartiera et al. postulieren außerdem, dass die
intrazelluläre Verteilung der Nanopartikel sich zeitabhängig ändern kann: PLGA-
Nanopartikel (polylactic-co-glycolic acid) traten nach ca. 2h in OK-Zellen (renale
Tubuluszellen) kolokalisiert mit Endosomen auf und waren nach einer weiteren
Inkubationszeit von 4-24 h auch in anderen Kompartimenten zu finden (Cartiera
et al., 2009). Dies konnte hier nicht eindeutig bestätigt werden, selbst nach einer
Inkubationszeit von 72 h. Es konnte aber gezeigt werden, dass die Menge der
intrazellulären Silberagglomerate zeitabhängig abnahm und die spezifische
perinukleäre Anordnung der Agglomerate mit längerer Inkubationsdauer
verschwand. Dies deutet auf eine intrazelluläre Verarbeitung der Ag-NP hin.
63
5.3.2 Die Kinetik des aufgenommenen Silbers bei Langzeitkulzivierung
Die Exozytose von Nanopartikeln aus Zellen stellt, wie auch die Endozytose, einen
wichtigen Mechanismus dar, über den die Partikel mit den Zellen in Interaktion
treten können. Beispielsweise können Exozytose-Vorgänge zu einer weiteren
Ausbreitung der Partikel im Gewebe führen. In dieser Arbeit wurde unter
Verwendung verschiedener Methoden die Kinetik von zuvor endozytierten Ag-NP
aus hMSC untersucht. Zur Analyse dieses Prozesses wurde u. a. die
Durchflusszytometrie verwendet. Diese Methode wurde bereits von Stringer et al.
und Suzuki et al. zur Analyse der Nanopartikel-Aufnahme in Zellen angewandt
(Stringer et al., 1995; Suzuki et al., 2007). Die Autoren beobachteten, dass der
intrazelluläre Gehalt an metallischen Nanopartikeln mit Hilfe der Sidescatter-
Intensität (SSC-Intensität) detektiert werden konnte. Die SSC-Intensität war
erhöht, bedingt durch die stärkere Laserreflektion von intrazellulären Strukturen
wie z.B. internalisierten, metallischen Nanopartikeln. HMSC selbst besitzen eine
geringe SSC-Intensität. Die intrazelluläre Agglomeration von Ag-NP führte zu einer
konzentrationsabhängigen Laserreflektion und somit zu einem erhöhten SSC-
Signal (Greulich et al., 2011b). In dieser Arbeit konnte deutlich gezeigt werden,
dass die Aufnahme von Ag-NP zu einer erhöhten SSC-Intensität führte, die sich
mit weiterer Inkubationszeit in partikelfreiem Zellkulturmedium sukzessive dem
Kontrollwert der hMSC annäherte. Lichtmikroskopisch zeigte sich ebenfalls klar
eine Abnahme der intrazellulären Silberagglomerate. Des Weiteren ließ sich
mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) elementares Silber im Zellkultur-
Überstand der gewaschenen hMSC nachweisen. Dies lässt vermuten, dass die
Ag-NP nach ihrer Aufnahme wieder aus den Zellen heraustransportiert wurden.
Noch lässt die Studienlage hinsichtlich der Exozytose von Nanopartikeln keine
umfassende Charakterisierung zu, da sich die meisten Publikationen mit der
Aufnahme und Toxizität der Nanopartikeln befassen. Dennoch gibt es bereits
einige Arbeitsgruppen, die ebenfalls die Exozytose von zuvor internalisierten
Nanopartikeln aus humanen Zellen beobachtet und analysiert haben (Panyam and
Labhasetwar, 2003; Chithrani and Chan, 2007; Dombu et al., 2010; Jiang et al.,
2010; Jin et al., 2008; Jin et al., 2009). So wurde von Panyam und Labhasetwar
für Polyactid-co-Glycolid-Nanopartikel eine Exozytoserate von ca. 65% erfasst
(Panyam and Labhasetwar, 2003). Im Rahmen der hier durchgeführten
Experimente ergab sich rechnerisch eine Abnahme des intrazellulären
64
Silbergehaltes um 73%. Es ist anzunehmen, dass eine mögliche Exozytose von
Nanopartikeln, genau wie die Endozytose, kein eindimensionaler Prozess ist
(Chithrani, 2010), so handelt es sich laut der aktuellen Literatur um einen
energieabhängigen Prozess (Panyam and Labhasetwar, 2003; Chithrani and
Chan, 2007). Jiang et al. konnten zeigen, dass internalisierte Quantum Dots aktiv
über das Mikrotubulisystem zunächst in die perinukleäre Region und schließlich
wieder zur Zellperipherie transportiert wurden, wo sie dann exozytiert wurden
(Jiang et al., 2010). Des Weiteren ist die Exozytose wahrscheinlich abhängig vom
Zelltyp, sowie von der Beschaffenheit der verwendeten Nanopartikel. So
beobachteten Chithrani und Chan einen Zusammenhang zwischen der
Exozytoserate und der Größe von Gold-Nanopartikeln: Kleine Gold-Nanopartikel
(14 nm) wurden schneller und zu einer höheren Rate exozytiert als jene eines
größeren Durchmessers (74 oder 100 nm). In derselben Publikation zeigte sich
zudem, dass stäbchenförmige Nanopartikel im Vergleich zu Sphärischen vermehrt
ausgeschleust wurden (Chithrani and Chan, 2007). Laut einiger Arbeiten trat eine
Exozytose direkt in den ersten 30 min nach Erneuern des Zellkulturmediums auf
(Panyam and Labhasetwar, 2003; Chithrani and Chan, 2007; Jiang et al., 2010). In
unserer Studie ließ sich erst nach 24 h Kultivierung in Partikel-freien
Zellkulturmedium eine signifikante Abnahme der SSC-Intensität feststellen. Dies
ist vermutlich eine Variation, die durch die verwendete Zellpopulation und
Nanopartikel bedingt ist, bedenkt man die bereits beschriebenen Variationen, die
für verschiedene Zelltypen und Nanopartikel bei der Endozytose beobachtet
wurden. Hier wären für eine genauere Beurteilung vergleichende Untersuchungen
wichtig, in denen die Exozytose ebenfalls mit hMSC und Ag-NP analysiert wird.
Diese liegen aber unseres Wissens zu diesem Zeitpunkt noch nicht vor.
Beispielsweise handelt es sich bei den von Jiang et al. verwendeten HeLa-Zellen
um Zervixkarzinomzellen, die aufgrund ihrer malignen Entartung ein anderes
Proliferationsprofil aufweisen als die mesenchymalen Stammzellen und sich
schlechter für die Langzeitinkubation eignen. Die Arbeitsgruppe Ferrati et al.
untersuchte den Zellkultur-Überstand von zuvor mit Nanopartikeln inkubierten
HMVEC (human microvascular endothelial cells) über einen Zeitraum von einem
bis zu sieben Tagen und konnte so exozytierte Partikel detektieren (Ferrati et al.,
2010). Es ist folglich anzunehmen, dass die Zeitdynamik der Exozytose stark
zwischen verschiedenen Zelltypen variiert. In Anbetracht des oben beschriebenen
Ergebnisses wurde hier die Silberkinetik für 72 h verfolgt und so eine progrediente
65
Abnahme der SSC-Intensität festgestellt. Aufgrund ihres Proliferationsprofils
eignen sich die hMSC für die Langzeitinkubation, da sie etwa 3-4 Tage benötigen,
um ihren Zellzyklus einmal zu durchlaufen. Eine Kultivierung für einen noch
längeren Zeitraum erschien uns aufgrund einer möglichen Beeinflussung der
Ergebnisse durch die Zellproliferation nicht sinnvoll. Diesbezüglich wurde kürzlich
von Kim et al. postuliert, dass die Abnahme des intrazellulären Gehaltes an
Nanopartiklen nicht durch Exozytose, sondern auch durch Zellteilung bedingt sei,
da die Nanopartikel während des Zellzyklus auf die beiden Tochterzellen aufgeteilt
würden (Kim et al., 2011). Dieses Phänomen trifft hier wahrscheinlich weniger zu,
weil die Zellzählungen mittels Durchflusszytometrie bis zu einem Zeitpunkt von
72 h eine weitestgehend konstante Zellzahl ergaben (Daten nicht gezeigt).
Außerdem wurde mit Hilfe der AAS Silber im Zellkultur-Überstand nachgewiesen,
welches nur durch einen Exozytosevorgang dorthin gelangt ist, da das Medium
regelmäßig erneuert wurde. Allerdings kann nicht komplett ausgeschlossen
werden, dass sich einzelne Zellen geteilt und ihren Inhalt inklusive Ag-NP auf ihre
Tochterzellen aufgeteilt haben. Dies spielt aber in Anbetracht der Gesamtzellzahl
hier wahrscheinlich nur eine untergeordnete Rolle und erklärt nicht das volle
Ausmaß der SSC-Intensitätsabnahme. Dennoch kann der Zellzyklus großen
Einfluss auf die Stoffwechsellage inklusive der Endo- und Exozytoserate einer
Zelle nehmen, ein Phänomen, das im Hinblick auf Nanopartikel-Biokompatibilität
zukünftig noch analysiert werden muss.
Interessanterweise wurde die Exozytose in dieser Studie nahezu vollständig
inhibiert, wenn das Zellkulturmedium serumfrei war, das heißt bei einer Inkubation
in reinem RPMI. Dieses Phänomen konnte auch von Panyam und Labhasetwar
beobachtet werden (Panyam and Labhasetwar, 2003). Exogene Proteine stellen
offensichtlich einen entscheidenden Faktor bei dem Prozess der Exozytose dar.
Diese Autoren beschrieben außerdem, dass die Exozytose durch das Hinzufügen
von Albumin in Form von BSA (bovine serum albumine) zum serumfreien
Zellkulturmedium wieder induziert werden konnte (Panyam and Labhasetwar,
2003). Ein möglicher Erklärungsansatz hierfür ist, dass BSA von den Zellen
endozytiert wird und die BSA enthaltenden Endosomen mit den zellulären
Exozytosewegen interagieren, wie es von Tomoda et al. beschrieben wurde
(Tomoda et al., 1989). Dieses Ergebnis wurde hier nicht bestätigt, das Albumin
begünstigte in keiner dargebotenen Konzentrationen eine die Abnahme des
intrazellulären Silbergehaltes im Vergleich zu reinem RPMI. Anhand dieser
66
Ergebnisse lässt sich vermuten, dass die Exozytose nicht durch ein spezifisches
Protein induziert wird, sondern, dass andere oder die Gesamtheit der im Serum
befindlichen Proteine und Wachstumsfaktoren diesen Vorgang beeinflussen.
Um den Mechanismus der Exozytose näher zu analysieren, wurden verschiedene
Inhibitoren eingesetzt, die sich in Studien zur Endozytose als wirksam erwiesen
haben. Dombu et al. gelang es bereits unter der Verwendung von Filipin die
Exozytose von Maltodextrin-Nanopartikeln nahezu vollständig zu inhibieren
(Dombu et al., 2010). Dies ließ annehmen, dass auch Caveolae bzw. Cholesterol
in den Exozytosevorgang involviert sind. In dieser Studie blieb Filipin wirkungslos,
jedoch konnte die Exozytose durch Chlorpromazin gehemmt werden. Dabei
handelt es sich eigentlich um einen Hemmstoff des Clathrin-abhängigen
Prozesses bei der Endozytose. Es ist daher anzunehmen, dass vesikuläre
Transportprozesse beteiligt sind. Eventuell werden Ag-NP zusammen mit den
Clathrinmolekülen zur Zellmembran zurück transportiert. Ein möglicher zellulärer
Transportmechanismus von Nanopartikeln wurde kürzlich von Serda et al.
vorgeschlagen: In dieser Arbeit wurden die intrazellulären Lokalisationen von mit
Eisenoxid-Nanopartikeln gecoateten Siliconpartikeln in Makrophagen über einen
Zeitraum von sieben Tagen verfolgt. Die Eisenoxid-Nanopartikel lösten sich in
Endosomen von den Siliconpartikeln ab und wurden von der Zelle in eigene
Vesikel, die sogenannten multi-vesicular bodies (MVB) verpackt. Auf diese Weise
konnten die Partikel dem lysosomalen Abbau entgehen. Die MVBs wurden
mitsamt der Nanopartikel zur Zellmembran transportiert, wo diese in den
Extrazellularraum entlassen wurden. Es wird vermutet, dass die MVB ähnlich wie
Exosomen, mit der Zellmembran fusionieren und so die Nanopartikel exozytiert
werden (Serda et al., 2010). Dies ist ein Transportweg, der ebenso für die Ag-NP
zutreffen kann. Um dies mit Sicherheit sagen zu können, bedarf es aber noch
weiterer Studien. Der sogenannate „endo-lysosomal escape“ wurde auch bereits
von Panyam et al. für Polyactid-co-Glycolid-Nanopartikel beschrieben (Panyam et
al., 2002).
Neben der Exozytose könnte die bereits in 4.2 beschriebene pH-abhängige Ag-NP
Auflösung durch Ionenfreisetzung zu der SSC-Abnahme und
Agglomeratverkleinerung beitragen. Silberionen können nämlich weder mittels
Durchflusszytometrie detektiert, noch im Lichtmikroskop gesehen werden. Die
AAS ermöglicht ebenso keine Unterscheidung zwischen Silberionen und
nanopartikulärem Silber. Die Ionenfreisetzung, die zur Auflösung der Ag-NP
67
beiträgt, spielt in diesem Zusammenhang wahrscheinlich nur eine untergeordnete
Rolle, da hierdurch nicht der beobachtete Unterschied zwischen serumfreien und
serumenthaltenden Zellkulturmedium erklärt werden kann. Denn der pH-Wert der
Lysosomen wird in der Regel durch diese Variation des Außenmediums nicht
beeinflusst.
Abschließend ist festzustellen, dass die endozytierten Ag-NP von den hMSC
weiter prozessiert und transportiert werden, wobei viele Interaktions- und
Einflussmöglichkeiten bestehen. Hier wurde beobachtet, dass ein großer Teil der
detektierten, endozytierten Partikel verschwindet. Diese Abnahme des
intrazellulären Silbergehaltes ist wahrscheinlich durch einen Exozytosevorgang
bedingt. Die Ionenfreisetzung aus Ag-NP und die Zellteilung können ebenfalls eine
Rolle spielen, nach aktueller Datenlage aber vermutlich nur eine untergeordnete
Rolle (Abb. 22). In weiteren Studien zu klärende Fragen wären, in welcher Form
die endozytierten Ag-NP die Zelle verlassen (nanopartikulär, agglomeriert), ob
ausgeschleustes Silber von benachbarten Zellen erneut endozytiert wird und
inwiefern Zellzyklus und Ionenfreisetzung Einfluss auf den „Silber-Stoffwechsel“
nehmen. Abbildung 20 fasst die möglichen Wege der aufgenommenen Ag-NP
nochmals zusammen.
68
Abb. 22: Schematische Darstellung der möglichen Silberkinetik nach Aufnahme der Ag-NP
Es handelt sich insgesamt um einen multifaktoriellen Prozess, dessen Einfluss auf
Toxizität und Biokompatibilität von Ag-NP weiter zu analysieren ist. Denn in
Anbetracht der wachsenden Zahl an Antibiotika-resistenten Keimen sind neue
antimikrobielle Ansätze wie Nanosilber erforderlich. Gleichzeitig ist die
umfassende Erforschung der Biokompatibilität unabdingbar für eine sichere
Nanosilberapplikation. Dazu ist eine interdisziplinäre Herangehensweise
erforderlich wie es in dieser Studie geschehen ist.
69
6 Zusammenfassung
Nanopartikel sind definiert als Partikel der physikalischen Größenordnung
1-100 nm. Es wird derzeit davon ausgegangen, dass der industrielle Gebrauch
von Nanopartikeln in Zukunft weiter steigen wird. Silber-Nanopartikel (Ag-NP)
gehören heute zu den Nanomaterialien mit der größten kommerziellen Bedeutung,
da sie aufgrund ihrer antimikrobiellen Eigenschaften Verwendung in der
Herstellung zahlreicher Konsumgüter finden. Dazu gehören beispielsweise
Textilien, Kosmetikartikel, Elektrogeräte oder Reinigungsmittel. Auch in der
Medizin besitzen sie in Anbetracht der steigenden Zahl an Antibiotika-resistenten
Keimen einen besonderen Stellenwert. Silberverbindungen werden zunehmend
zur lokalen Infektionsprophylaxe und –therapie in Medizinprodukte wie
Wundauflagen, Katheter oder Knochenersatz-Biomaterialien (z.B. silberhaltige
Calciumphosphat-Zemente) eingearbeitet. Je nach Beschichtungstechnik bei der
Fertigung eines Biomaterials oder während einer Biomaterialresorption, kann es
zu einem engen Kontakt zwischen Ag-NP und humanen Gewebszellen kommen.
Obwohl die antibakteriellen und antifungalen Eigenschaften der Ag-NP vielfach
belegt sind, fehlen umfassende Informationen bezüglich ihrer potentiellen Wirkung
auf humane Zellen. In dieser Dissertation wurden daher die Interaktion von Ag-NP
mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) in vitro untersucht. Der Fokus
lag in der Analyse der Aufnahme der Ag-NP, ihrer intrazellulären Verteilung und
weiteren Kinetik, sowie der silberinduzierten Aktivierung der Zellen. Dazu wurden
verschiedene biologische und analytische Methoden wie die Licht- und
Fluoreszenzmikroskopie, die kombinierte fokussierte Ionenstrahltechnik/
Rasterelektronenmikroskopie (FIB/REM), die energiedispersive
Röntgenspektroskopie (EDX), die Durchflusszytometrie, die
Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) und der Enzyme-linked immunosorbent
Assay (ELISA) angewendet. Die verwendeten sphärischen, monodispersen Ag-NP
mit einem hydrodynamischen Durchmesser von ca. 80 nm wurden durch
Reduktion mit Glucose hergestellt und durch das Polymer Polyvinylpyrrolidon
stabilisiert.
In dieser Dissertation konnte mit Hilfe der Licht- und Fluoreszenzmikroskopie, der
AAS sowie der FIB/REM-Technik gezeigt werden, dass die Ag-NP von hMSC
rasch aufgenommen wurden und intrazellulär in der perinukleären Region
agglomerierten. Eine spezifische Färbung intrazellulärer Strukturen der hMSC
70
mittels Fluoreszenzfarbstoffen offenbarte, dass die Silberagglomerate primär mit
endolysosomalen Strukturen assoziiert waren. Weder im Zellkern noch im
Golgi-Apparat hingegen ließen sich Ag-NP nachweisen. Diese spezifische
Kolokalisation blieb auch über einen Inkubationszeitraum von bis zu 72 h
bestehen, jedoch war die perinukleäre Anordnung aufgehoben. Des Weiteren war
zu beobachten, dass der intrazelluläre Silbergehalt bei weiterer Inkubation in
partikelfreiem Zellkulturmedium (24 h, 48 h, 72 h) progredient abnahm. Dies ließ
sich quantitativ mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestätigen. Mittels AAS konnte
im Zellüberstand der in partikelfreiem Medium kultivierten Zellen Silber detektiert
werden, was annehmen lässt, dass die zuvor aufgenommenen Ag-NP von den
hMSC unter anderem wieder exozytiert wurden. Interessanterweise wurde dieser
Vorgang in serumfreiem Zellkulturmedium nahezu vollständig inhibiert. Die
Proteine Albumin und Transferrin allein hatten hingegen keinen Einfluss auf den
Verlauf. Der Prozess der Exozytose ließ sich außerdem durch Chlorpromazin
hemmen, einem Inhibitor der intrazellulären Clathrin-abhängigen
Transportprozesse. Dies deutet auf eine aktive Prozessierung der
aufgenommenen Ag-NP hin.
Ferner induzierten Ag-NP in subletalen Konzentrationen eine Aktivierung der
hMSC, welche durch ein verändertes Zytokinprofil in Form von einer erhöhten
IL-8- und einer verringerten IL-6-Sekretion gekennzeichnet war. Insbesondere die
Freisetzung des proinflammatorischen IL-8 der Zellen korrelierte mit der
intrazellulären Silberkonzentration. Aktuelle Studien lassen vermuten, dass dieses
Phänomen durch die Ag-NP induzierte Generierung freier Sauerstoffradikale
bedingt ist. Ob diese IL-8 Sekretion eine entzündliche Gewebsreaktion hervorrufen
kann, muss weiter analysiert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Ag-NP vielfältige Wechselwirkungen mit
humanen Zellen eingehen können. Die Interaktion der Nanopartikel mit
Biomolekülen hat außerdem einen starken Einfluss auf deren physikochemischen
Zustand und deren biologische Wirkung. Ob von diesen Wechselwirkungen ein
Gefahrenpotential für den menschlichen Körper ausgeht, ist in weiteren in vitro
und in vivo Studien zu eruieren. Es ist noch nicht zufriedenstellend geklärt, ob
endozytierte Ag-NP wichtige intrazelluläre Signalwege und Funktionen
beeinflussen. Der Exozytosevorgang kann des Weiteren zu einer
Gewebsausbreitung der ursprünglich lokal applizierten Ag-NP führen. Ob die
silberinduzierte Erhöhung der IL-8 Sekretion zu einer Entzündungsreaktion im
71
Gewebe führen kann, muss ebenfalls geklärt werden. Es ist unumstritten, dass
Ag-NP einen vielversprechenden Ansatz in der Infektionsprophylaxe darstellen,
dennoch sollte ihr Gebrauch in Anbetracht der potentiell schädlichen Wirkungen
auf humane Zellen immer gewissenhaft und in Maßen erfolgen, bevor ihre
Biokompatilibität nicht vollständig charakterisiert ist.
72
7 Literaturverzeichnis
Abdallah, B. M., Kassem, M. (2008). Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15(2), 109-116
Aderem, A. and Underhill, D. M. (1999). Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu.Rev.Immunol. 17, 593-623
Ahamed, M., Karns, M., Goodson, M., Rowe, J., Hussain, S. M., Schlager, J. J., and Hong, Y. (2008). DNA damage response to different surface chemistry of silver nanoparticles in mammalian cells. Toxicol.Appl.Pharmacol. 233(3), 404-410
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., and Walter, P. (2002). Molecular biology of the cell. 4th ed. New York. Garland Science 124
Allen, L. A. and Aderem, A. (1996). Mechanisms of phagocytosis. Curr.Opin.Immunol. 8(1), 36-40
Alt, V., Bechert, T., Steinrucke, P., Wagener, M., Seidel, P., Dingeldein, E., Domann, E., and Schnettler, R. (2004a). An in vitro assessment of the antibacterial properties and cytotoxicity of nanoparticulate silver bone cement. Biomaterials. 25, 4383-4391
Alt, V., Bechert, T., Steinrucke, P., Wagener, M., Seidel, P., Dingeldein, E., Scheddin, D., Domann, E., and Schnettler, R. (2004b). Nanoparticulate silver. A new antimicrobial substance for bone cement. Orthopade. 33, 885-892
Anderson, R. G. (1998). The caveolae membrane system. Annu.Rev.Biochem. 67, 199-225
AshaRani, P. V., Low Kah, M. G., Hande, M. P., Valiyaveettil,S. (2009). Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells. ACS Nano. 3, 279-290
Asokan, A. and Cho, M. J. (2002). Exploitation of intracellular pH gradients in the cellular delivery of macromolecules. J.Pharm.Sci. 91(4), 903-913
Baggiolini, M., Dewald, B., and Moser, B. (1994). Interleukin-8 and related chemotactic cytokines--CXC and CC chemokines. Adv.Immunol. 55, 97-179
Bajada, S., Mazakova, I., Richardson, J.B., and Ashammakhi, N. (2008). Updates on stem cells and their applications in regenerative medicine. J.Tissue Eng Regen.Med. 2(4), 169-183
Beck, M., Förster, F., Ecke, M., Plitzko., J. M., Melchior, F., Gerisch, G., Baumeister, W., and Medalia, O. (2004). Nuclear pore complex structure and dynamics revealed by cryoelectron tomography. Science 306, 1387-1390
Becker, R. O. (1999). Silver ions in the treatment of local infections. Met.Based.Drugs. 6, 311-314
73
Benn, T. M. and Westerhoff, P. (2008). Nanoparticle silver released into water from commercially available sock fabrics. Environ.Sci.Technol. 42(11), 4133-4139
Berry, C. C., de la Fuente, J. M., Mullin, M., Chu, S. W., and Curtis, A. S. (2007). Nuclear localization of HIV-1 tat functionalized gold nanoparticles. IEEE Trans.Nanobioscience. 6(4), 262-269
Bertuccio, C. A. (2011). Relevance of VEGF and nephrin expression in glomerular diseases. J.Signal.Transduct. 2011, 21-30
Bobis, S., Jarocha, D., and Majka, M. (2006). Mesenchymal stem cells: characteristics and clinical applications. Folia Histochem.Cytobiol. 44, 215-230
Brett, D. W. (2006). A discussion of silver as an antimicrobial agent: alleviating the confusion. Ostomy.Wound.Manage. 52(1), 34-41
Brion, C., Miller, S. G., and Moore, H. P. (1992). Regulated and constitutive secretion. Differential effects of protein synthesis arrest on transport of glycosaminoglycan chains to the two secretory pathways. J.Biol.Chem. 267(3), 1477-1483
Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., and Wakeham, D. E. (2001). Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles. Annu.Rev.Cell Dev.Biol. 17, 517-568
Burgess, T. L. and Kelly, R. B. (1987). Constitutive and regulated secretion of proteins. Annu.Rev.Cell Biol. 3, 243-293
Busch, W., Bastian, S., Trahorsch, U., Iwe, M., Kuehnel, D., Meißner, T., Spriger, A., Gelinsky, M., Vogel, W., Richter, V., Ikonomidou, C., Potthoff, A., Lehmann, I., and Schirmer, K. (2011). Internalisation of engineered nanoparticles into mammalian cells in vitro: influence of cell type and particle properties. J Nanopart Res. 13, 293-310 Cannon, J. G. (2000). Inflammatory Cytokines in Nonpathological States. News Physiol Sci. 15, 298-303
Caplan, A. I. (2007). Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J.Cell Physiol. 213(2), 341-347
Carlson, C., Hussain, S. M., Schrand, A. M., Braydich-Stolle, L. K., Hess, K. L., Jones, R. L., and Schlager, J. J. (2008). Unique cellular interaction of silver nanoparticles: size-dependent generation of reactive oxygen species. J.Phys.Chem.B. 112, 13608-13619
Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., and Saltzman, W. M. (2009). The uptake and intracellular fate of PLGA nanoparticles in epithelial cells. Biomaterials 30(14), 2790-2798
Catledge, S. A., Fries, M. D., Vohra, Y. K., Lacefield, W. R., Lemons, J. E., Woodard, S., and Venugopalan, R. (2002). Nanostructured ceramics for biomedical implants. J.Nanosci.Nanotechnol. 2(3-4), 293-312
74
Cedervall, T., Lynch, I., Lindman, S., Berggard, T., Thulin, E., Nilsson, H., Dawson, K. A., and Linse, S. (2007). Understanding the nanoparticle-protein corona using methods to quantify exchange rates and affinities of proteins for nanoparticles. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 104, 2050-2055
Chang, A. L., Khosravi, V., and Egbert, B. (2006). A case of argyria after colloidal silver ingestion. J.Cutan.Pathol. 33(12), 809-811
Chang, M. Y., Shiau, A. L., Chen, Y. H., Chang, C. J., Chen, H. H., and Wu, C. L. (2008). Increased apoptotic potential and dose-enhancing effect of gold nanoparticles in combination with single-dose clinical electron beams on tumor-bearing mice. Cancer Sci. 99(7), 1479-1484
Chen, J., Han, C. M., Lin, X. W., Tang, Z. J., and Su, S. J. (2006). [Effect of silver nanoparticle dressing on second degree burn wound]. Zhonghua Wai Ke.Za Zhi. 44(1), 50-52
Chen, X. and Schluesener, H. J. (2008). Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol.Lett. 176(1), 1-12
Chithrani, B. D. and Chan, W. C. (2007). Elucidating the mechanism of cellular uptake and removal of protein-coated gold nanoparticles of different sizes and shapes. Nano.Lett. 7(6), 1542-1550
Chithrani, D. B. (2010). Intracellular uptake, transport, and processing of gold nanostructures. Mol.Membr.Biol. 27(7), 299-311
Cho, V., Park, E., Osaka, J. T., and Park, S. G. (2005). The study of antimicrobial activity and preservative effects of nanosilver ingredient. Electrochimica Acta 51, 956-960
Choi, O., Deng, K. K., Kim, N. J., Ross, L., Surampalli, R. Y., and Hu, Z. (2008). The inhibitory effects of silver nanoparticles, silver ions, and silver chloride colloids on microbial growth. Water Res. 42, 3066-3074
Choi, O. and Hu, Z. (2008). Size dependent and reactive oxygen species related nanosilver toxicity to nitrifying bacteria. Environ.Sci.Technol. 42, 4583-4588
Chopra, I. (2007). The increasing use of silver-based products as antimicrobial agents: a useful development or a cause for concern? J.Antimicrob.Chemother. 59, 587-590
Chung, T. H., Wu, S. H., Yao, M., Lu, C. W., Lin, Y. S., Hung, Y., Mou, C. Y., Chen, Y. C., and Huang, D. M. (2007). The effect of surface charge on the uptake and biological function of mesoporous silica nanoparticles in 3T3-L1 cells and human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 28(19), 2959-2966
Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., and Lindsay, R. (2006). Burn wound infections. Clin.Microbiol.Rev. 19(2), 403-434
Cohen, M. S., Stern, J. M., Vanni, A. J., Kelley, R. S., Baumgart, E., Field, D., Libertino, J. A., and Summerhayes, I. C. (2007). In vitro analysis of a nanocrystalline silver-coated surgical mesh. Surg.Infect.(Larchmt.) 8(3), 397-403
75
Conner, S. D. and Schmid, S.L. (2003). Regulated portals of entry into the cell. Nature 422(6927), 37-44
Connolly, J. F. (1995). Injectable bone marrow preparations to stimulate osteogenic repair. Clin.Orthop.Relat Res. 313, 8-18
Dausend, J., Musyanovych, A., Dass, M., Walther, P., Schrezenmeier, H., Landfester, K., and Mailander, V. (2008). Uptake mechanism of oppositely charged fluorescent nanoparticles in HeLa cells. Macromol.Biosci. 8(12), 1135-1143
Deetjen, P., Speckmann, E.-J., Hescheler, J. (2005a). Physiologie. Elsevier Urban Fischer Verlag München, Jena 388-389
Deetjen, P., Speckmann, E.-J., Hescheler, J. (2005b). Physiologie. Elsevier Urban Fischer Verlag München, Jena 375
Deetjen, P., Speckmann, E.-J., Hescheler, J. (2005c). Physiologie. Elsevier Urban Fischer Verlag München, Jena 347
Deng, Z. J., Liang, M., Monteiro, M., Toth, I., and Minchin, R. F. (2011). Nanoparticle-induced unfolding of fibrinogen promotes Mac-1 receptor activation and inflammation. Nat.Nanotechnol. 6(1), 39-44
Doherty, G. J. and McMahon, H. T. (2009). Mechanisms of endocytosis. Annu.Rev.Biochem. 78, 857-902
Dombu, C. Y., Kroubi, M., Zibouche, R., Matran, R., and Betbeder, D. (2010). Characterization of endocytosis and exocytosis of cationic nanoparticles in airway epithelium cells. Nanotechnology. 21(35), 355-362
Dominici, M., Le, B. K., Mueller, I., Slaper-Cortenbach, I., Marini, F., Krause, D., Deans, R., Keating, A., Prockop, D., and Horwitz, E. (2006). Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8(4), 315-317
Drake, P. L. and Hazelwood, K. J. (2005). Exposure-related health effects of silver and silver compounds: a review 9. Ann.Occup.Hyg. 49(7), 575-585 Du, X. and Williams, D. A. (1997). Interleukin-11: review of molecular, cell biology, and clinical use. Blood 89(11), 3897-3908
Elechiguerra, J. L., Burt, J. L., Morones, J. R., Camacho-Bragado, A., Gao, X., Lara H. H., and Yacaman, M. J. (2005). Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. J.Nanobiotechnology. 3(6), 1-10
Ensikat, H. J., Ditsche-Kuru, P., Neinhuis, C., and Barthlott, W. (2011). Superhydrophobicity in perfection: the outstanding properties of the lotus leaf. Beilstein.J.Nanotechnol. 2, 152-161
Ercal, N., Gurer-Orhan, H., and Burns, N. (2001). Toxic metals and oxidative stress part I: mechanisms involved in metal-induced oxidative damage. Curr.Top.Med.Chem. 1, 529-539
76
Ferrati, S., Mack, A., Chiappini, C., Liu, X., Bean, A.J., Ferrari, M., and Serda, R. E. (2010). Intracellular trafficking of silicon particles and logic-embedded vectors. Nanoscale. 2(8), 1512-1520
Foldbjerg, R., Dang, D. A., and Autrup, H. (2010). Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in the human lung cancer cell line, A549. Arch.Toxicol. 85(7), 743-750
Foldbjerg, R., Olesen, P., Hougaard, M., Dang, D. A., Hoffmann, H. J., and Autrup, H. (2009). PVP-coated silver nanoparticles and silver ions induce reactive oxygen species, apoptosis and necrosis in THP-1 monocytes. Toxicol.Lett. 190(2), 156-162
Freedman, D. H. (1991). Exploiting the nanotechnology of life. Science 254(5036), 1308-1310
Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., and Petrakova, K. V. (1966). Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J.Embryol.Exp.Morphol. 16(3), 381-390
Fritz, E. A., Glant, T. T., Vermes, C., Jacobs, J. J., and Roebuck, K. A. (2002). Titanium particles induce the immediate early stress responsive chemokines IL-8 and MCP-1 in osteoblasts. J.Orthop.Res. 20, 490-498
Frohlich, E., Samberger, C., Kueznik, T., Absenger, M., Roblegg, E., Zimmer, A., and Pieber, T. R. (2009). Cytotoxicity of nanoparticles independent from oxidative stress. J.Toxicol.Sci. 34(4), 363-375
Furno, F., Morley, K. S., Wong, B., Sharp, B. L., Arnold, P. L., Howdle, S. M., Bayston, R., Brown, P. D., Winship, P. D., and Reid, H. J. (2004). Silver nanoparticles and polymeric medical devices: a new approach to prevention of infection? J.Antimicrob.Chemother. 54, 1019-1024
Futureprospects (2011). (Zugriff vom 03.02.2012) http://futureprospects.files.wordpress.com/2010/05/lotuseffekt.jpg
Gerber, S. H. and Sudhof, T. C. (2002). Molecular determinants of regulated exocytosis. Diabetes 51 Suppl 1, 3-11
Ghosh, S. and Hayden, M. S. (2008). New regulators of NF-kappaB in inflammation. Nat.Rev.Immunol. 8, 837-848
Gilstrap, K., Hu, X., Lu, X., and He, X. (2011). Nanotechnology for energy-based cancer therapies. Am.J.Cancer Res. 1(4), 508-520
Gleiter, H. (2000). Nanostructured materials: basic concepts and microstructure. Acta Biomater. 48, 1-29
Gloire, G., Legrand-Poels, S., and Piette, J. (2006). NF-kappaB activation by reactive oxygen species: fifteen years later. Biochem.Pharmacol. 72, 1493-1505
Gordon, O., Vig, S. T., Brunetto, P. S., Villaruz, A. E., Sturdevant, D. E., Otto, M., Landmann, R., and Fromm, K. M. (2010). Silver coordination polymers for prevention of implant infection: thiol interaction, impact on respiratory chain
77
enzymes, and hydroxyl radical induction.1. Antimicrob.Agents Chemother. 54(10), 4208-4218 Grainger, C. (2008). Nanobiomaterials and Nanoanalysis: Opportunities for Improving the Science to Benefit Biomedical Technologies. Advanced materials 20, 36-43
Greulich, C., Braun, D., Peetsch, A., Diensorf, J., Siebers, B., Epple, M., Köller, M. (2012). The toxic effect of silver ions and silver nanaoparticles towards bacteria and human cells occurs in the same concentration range. RSC Advances 2, 6981-6987
Greulich, C., Diendorf ,J., Gessmann, J., Simon, T., Habijan, T., Eggeler, G., Schildhauer, T. A., Epple, M., and Köller, M. (2011a). Cell type-specific responses of peripheral blood mononuclear cells to silver nanoparticles. Acta Biomater. 7(9), 3505-3514
Greulich, C., Diendorf, J., Simon, T., Eggeler, G., Epple, M., and Köller, M. (2011b). Uptake and intracellular distribution of silver nanoparticles in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 7(1), 347-354
Greulich, C., Kittler, S., Epple, M., Muhr, G., and Köller, M. (2009). Studies on the biocompatibility and the interaction of silver nanoparticles with human mesenchymal stem cells (hMSCs). Langenbecks Arch.Surg. 394(3), 495-502
Grobe, A., Schneider, C., Rekic, M, and Schetula, V. (2008). Nanomedizin - Chancen und Risiken. Stabsabteilung der Friedrich-Ebert-Stiftung 5-55 Habijan, T., Bremm, O., Esenwein, S., Muhr, G., and Köller, M. (2007). Influence of nickel ions on human multipotent mesenchymal stromal cells (hMSCs). Mat.-wiss.u.Werkstofftech. 38, 1-6
Harush-Frenkel, O., Debotton, N., Benita, S., and Altschuler, Y. (2007). Targeting of nanoparticles to the clathrin-mediated endocytic pathway. Biochem.Biophys.Res.Commun. 353, 26-32
Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., and Caplan, A. I. (1992). Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone 13(1), 81-88
Heinrich, P. C., Castell, J. V., and Andus, T. (1990). Interleukin-6 and the acute phase response. Biochem.J. 265(3), 621-636
Hellstrand, E., Lynch, I., Andersson, A., Drakenberg, T., Dahlback, B., Dawson, K. A., Linse, S., and Cedervall, T. (2009). Complete high-density lipoproteins in nanoparticle corona. FEBS J. 276, 3372-3381
Heymann, J. A., Shi, D., Kim, S., Bliss, D., Milne, J. L., and Subramaniam, S. (2009). 3D imaging of mammalian cells with ion-abrasion scanning electron microscopy. J.Struct.Biol. 166(1), 1-7
Hillaireau, H. and Couvreur, P. (2009). Nanocarriers' entry into the cell: relevance to drug delivery. Cell Mol.Life Sci. 66(17), 2873-2896
78
Horwitz, E. M., Le, B. K., Dominici, M., Mueller, I., Slaper-Cortenbach, I., Marini, F. C., Deans, R. J., Krause, D. S., and Keating, A. (2005). Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 7(5), 393-395
Hu, L. M. Z. G. C. (2009). Colloidal particles for cellular uptake and delivery. J. Mater. Chem. 19(20), 3108-3115
Huppelsberg, J., Walter, K. (2005). Kurzlehrbuch Pysiologie. Georg Thieme Verlag Stuttgart 34-35
Hwang, J., Hong, S. H., Lee, H. (2009). Mimicking the nanostructure of bamboo leaves (backside) for hydrophobicity using polydimethylsiloxane moulding and nano-imprint lithography. J.Nanosci.Nanotechnol. 9(6), 3644-3647
Ip, M., Lui, S. L., Poon, V. K., Lung, I., Burd, A. (2006). Antimicrobial activities of silver dressings: an in vitro comparison. J.Med.Microbiol. 55, 59-63
Jahn, R. (2004). Principles of exocytosis and membrane fusion. Ann.N.Y.Acad.Sci. 1014, 170-178
Jahn, R., Grubmuller, H. (2002). Membrane fusion. Curr.Opin.Cell Biol. 14(4), 488-495
Jain, K. K. (2010). Advances in the field of nanooncology. BMC.Med. 8, 83-94
Ji, J. H., Jung, J. H., Kim, S. S., Yoon, J. U., Park, J. D., Choi, B. S., Chung, Y. H., Kwon, I. H., Jeong, J., Han, B. S., Shin, J. H., Sung, J. H., Song, K. S., Yu, I. J. (2007). Twenty-eight-day inhalation toxicity study of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats. Inhal.Toxicol. 19(10), 857-871
Jiang, X., Rocker, C., Hafner, M., Brandholt, S., Dorlich, R.M., Nienhaus, G. U. (2010). Endo- and Exocytosis of Zwitterionic Quantum Dot Nanoparticles by Live HeLa Cells. ACS Nano. 4(11), 6787-6797
Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. (2009). Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. ACS Nano. 3(1), 149-158
Jin, H., Heller, D. A., Strano, M. S. (2008). Single-particle tracking of endocytosis and exocytosis of single-walled carbon nanotubes in NIH-3T3 cells. Nano.Lett. 8(6), 1577-1585
Johnston, H. J., Hutchison, G., Christensen, F. M., Peters, S., Hankin, S., Stone, V. (2010a). A review of the in vivo and in vitro toxicity of silver and gold particulates: particle attributes and biological mechanisms responsible for the observed toxicity. Crit Rev.Toxicol. 40(4), 328-346
Johnston, H. J., Semmler-Behnke, M., Brown, D. M., Kreyling, W., Tran, L., Stone, V. (2010b). Evaluating the uptake and intracellular fate of polystyrene nanoparticles by primary and hepatocyte cell lines in vitro. Toxicol.Appl.Pharmacol. 242, 66-78
79
Juan, L., Zhimin, Z., Anchun, M., Lei, L., Jingchao, Z. (2010). Deposition of silver nanoparticles on titanium surface for antibacterial effect. Int.J.Nanomedicine. 5, 261-267
Jung, W. K., Koo, H. C., Kim, K. W., Shin, S., Kim, S. H., Park, Y. H. (2008). Antibacterial activity and mechanism of action of the silver ion in Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Appl.Environ.Microbiol. 74, 2171-2178
Kato, T., Yashiro, T., Murata, Y., Herbert, D. C., Oshikawa, K., Bando, M., Ohno, S., Sugiyama, Y. (2003). Evidence that exogenous substances can be phagocytized by alveolar epithelial cells and transported into blood capillaries. Cell Tissue Res. 311(1), 47-51
Kawashima, I. Takiguchi, Y. (1992). Interleukin-11: a novel stroma-derived cytokine. Prog Growth Factor Res 4, 191-206
Kawata, K., Osawa, M., Okabe, S. (2009). In vitro toxicity of silver nanoparticles at noncytotoxic doses to HepG2 human hepatoma cells. Environ.Sci.Technol. 43, 6046-6051
Keilhoff, G., Goihl, A., Langnase, K., Fansa, H., Wolf, G. (2006). Transdifferentiation of mesenchymal stem cells into Schwann cell-like myelinating cells. Eur.J.Cell Biol. 85(1), 11-24
Khalil, I. A., Kogure, K., Akita, H., Harashima, H. (2006). Uptake pathways and subsequent intracellular trafficking in nonviral gene delivery. Pharmacol.Rev. 58(1), 32-45
Kim, D. H., Yoo, K. H., Choi, K. S., Choi, J., Choi, S. Y., Yang, S. E., Yang, Y. S., Im, H. J., Kim, K. H., Jung, H. L., Sung, K. W., Koo, H. H. (2005). Gene expression profile of cytokine and growth factor during differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cell. Cytokine 31(2), 119-126
Kim, J. A., Aberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. (2011). Role of cell cycle on the cellular uptake and dilution of nanoparticles in a cell population. Nat.Nanotechnol. 7(1), 62-68
Kim, J. S., Kuk, E., Yu, K. N., Kim, J. H., Park, S. J., Lee, H. J., Kim, S. H., Park, Y. K., Park, Y. H., Hwang, C. Y., Kim, Y. K., Lee, Y. S., Jeong, D. H., Cho, M. H. (2007). Antimicrobial effects of silver nanoparticles. Nanomedicine. 3, 95-101
Kim, K. J., Sung, W. S., Moon, S. K., Choi, J. S., Kim, J. G., Lee, D. G. (2008). Antifungal effect of silver nanoparticles on dermatophytes. J.Microbiol.Biotechnol. 18, 1482-1484
Kittler, S., Greulich, C., Gebauer, J. S., Diendorf, J., Treuel, L., Ruiz, L., Gonzales-Calbet, J. M., Vallet-Regi, M., Zeller, A., Köller, M., Epple,M. (2010). The influence of proteins on the dispersability and cell-biological activity of silver nanoparticlesJ. Mater. Chem. J.Mater.Chem 20, 512-518
Kreuter, J., Shamenkov, D., Petrov, V., Ramge, P., Cychutek, K., Koch-Brandt, C., Alyautdin, R. (2002). Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier. J.Drug Target 10(4), 317-325
80
Laban, G., Nies, L. F., Turco, R. F., Bickham, J. W., Sepulveda, M. S. (2010). The effects of silver nanoparticles on fathead minnow (Pimephales promelas) embryos. Ecotoxicology. 19, 185-195
Lang, J. (1999). Molecular mechanisms and regulation of insulin exocytosis as a paradigm of endocrine secretion. Eur.J.Biochem. 259(1-2), 3-17
Lansdown, A. B. (2006). Silver in health care: antimicrobial effects and safety in use. Curr.Probl.Dermatol. 33, 17-34
Lansdown, A. B. (2010). A harmacological and toxicological profile of silver as an antimicrobial agent in medical devices. Adv.Pharmacol.Sci. 2010, 1-16
Lara, H. H., Garza-Trevino, E. N., Turrent, L. I., Singh,D.K. (2011). Silver Nanoparticles are broad-spectrum bactericidal and virucidal Compounds 1. J Nanobiotechnology. 9(1), 30-38
Lara, H. H., Ixtepan-Turrent, L., Garza-Trevino, E. N., Rodriguez-Padilla, C. (2010). PVP-coated silver nanoparticles block the transmission of cell-free and cell-associated HIV-1 in human cervical culture. 3. J Nanobiotechnology. 8, 15-26 Lauterwasser, C. (2005) Small sizes that matter: Opportunities and risks of Nanotechnologies. The OECD International Futures Programme; Allianz AG 2-44 Leser, V., Drobne, D., Pipan, Z., Milani, M., Tatti, F. (2009). Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation. J.Microsc. 233, 309-319 Li, Y., Leung, P., Pao, L., Long, Q. W., Newton, E. (2006). Antimicrobial effect of surgical masks coated with nanoparticles. J HospInfect 62, 58-63
Li, L. Chin, L. S. (2003). The molecular machinery of synaptic vesicle exocytosis. Cell Mol.Life Sci. 60(5), 942-960
Limbach, L. K., Wick, P., Manser, P., Grass, R. N., Bruinink, A., Stark, W. J. (2007). Exposure of engineered nanoparticles to human lung epithelial cells: influence of chemical composition and catalytic activity on oxidative stress. Environ.Sci.Technol. 41, 4158-4163
Liochev, S. I. (1999). The mechanism of "Fenton-like" reactions and their importance for biological systems. A biologist's view. Met.Ions.Biol.Syst. 36, 1-39
Liu, J. Hurt, R. H. (2010). Ion Release Kinetics and Particle Persistence in Aqueous Nano-Silver Colloids. Environ.Sci.Technol. 44(6), 2169-2175
Liu, J., Sonshine, D. A., Shervani, S., Hurt, R. H. (2010). Controlled release of biologically active silver from nanosilver surfaces. ACS Nano. 4(11), 6903-6913
Lok, C. N., Ho, C. M., Chen, R., He, Q. Y., Yu, W. Y., Sun, H., Tam, P. K., Chiu, J. F., Che, C. M. (2006). Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J.Proteome.Res. 5, 916-924
81
Lu, L., Sun, R. W., Chen, R., Hui, C. K., Ho, C. M., Luk, J. M., Lau, G. K., Che, C. M. (2008). Silver nanoparticles inhibit hepatitis B virus replication 30. Antivir.Ther. 13(2), 253-262
Lynch, I., Cedervall, T., Lundqvist, M., Cabaleiro-Lago, C., Linse, S., Dawson, K. A. (2007). The nanoparticle-protein complex as a biological entity; a complex fluids and surface science challenge for the 21st century. Adv.Colloid Interface Sci. 134-135, 167-174
Mailander, V. Landfester, K. (2009). Interaction of Nanoparticles with Cells. Biomacromolecules. 10(9), 2379.2400
Marambio-Jones, C. Hoek, E. M. V. (2010). A review of the antibacterial effects of silver nanomaterials and potential implications for human health and the environment 3. Journal of Nanoparticle Research 12(5), 1531-1551 Mock, B. (2002). Shape effects in plasmon resonance of individual colloidal silver nanoparticles. Journal of Chemical Physics 116, 6755
Monopoli, M. P., Bombelli, F. B., Dawson, K. A. (2011). Nanobiotechnology: nanoparticle coronas take shape. Nat.Nanotechnol. 6(1), 11-12
Morones, J. R., Elechiguerra, J. L. (2005). The bactericidal effect of silver naoparticles. Nanotechnology 16, 2346-2353. Nair, L. S. Laurencin, C. T. (2008). Nanofibers and nanoparticles for orthopaedic surgery applications. J.Bone Joint Surg.Am. 90, 128-131 Nam, H. Y., Kwon, S. M., Chung, H., Lee, S. Y., Kwon, S. H., Jeon, H., Kim, Y., Park, J. H., Kim, J., Her, S., Oh, Y. K., Kwon, I. C., Kim, K., Jeong, S. Y. (2009). Cellular uptake mechanism and intracellular fate of hydrophobically modified glycol chitosan nanoparticles. J.Control Release. 135, 259-267
Nordberg, G. Gerhardsson, L. (1988). Silver. In: Seiler HG, Sigel H, Sigel A, editors. Handbook on toxicity of inorganic compounds. New York: Marcel Dekker, 619-624
Oberdorster, G., Maynard ,A., Donaldson, K., Castranova, V., Fitzpatrick, J., Ausman, K., Carter,J ., Karn, B., Kreyling, W., Lai, D., Olin, S., Monteiro-Riviere, N., Warheit, D., Yang, H. (2005a). Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Part Fibre.Toxicol. 2, 8-43
Oberdorster, G., Oberdorster, E., Oberdorster, J. (2005b). Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles. Environ.Health Perspect. 113(7), 823-839
Oh, P., Borgstrom, P., Witkiewicz, H., Li, Y., Borgstrom, B. J., Chrastina, A., Iwata, K., Zinn, K. R., Baldwin, R., Testa, J. E., Schnitzer, J. E. (2007). Live dynamic imaging of caveolae pumping targeted antibody rapidly and specifically across endothelium in the lung. Nat.Biotechnol. 25(3), 327-337
82
Ohishi, M. Schipani, E. (2010). Bone marrow mesenchymal stem cells. J.Cell Biochem. 109(2), 277-282
Pal, S., Tak, Y. K., Song, J. M. (2007). Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the Gram-negative bacterium Escherichia coli. Appl.Environ.Microbiol. 73, 1712-1720
Panyam, J., Labhasetwar, V. (2003). Dynamics of endocytosis and exocytosis of poly (D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles in vascular smooth muscle cells. Pharm.Res. 20(2), 212-220
Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar,V. (2002). Rapid endo-lysosomal escape of poly (DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. FASEB J. 16, 1217-1226
Park, E. J., Yi, J., Kim, Y., Choi, K., Park, K. (2009). Silver nanoparticles induce cytotoxicity by a Trojan-horse type mechanism. Toxicol.In Vitro. 24(3), 872-878
Pelka, J., Gehrke, H., Esselen, M., Turk, M., Crone, M., Brase, S., Muller, T., Blank, H., Send, W., Zibat, V., Brenner, P., Schneider, R., Gerthsen, D., Marko, D. (2009). Cellular uptake of platinum nanoparticles in human colon carcinoma cells and their impact on cellular redox systems and DNA integrity. Chem.Res.Toxico. 22(4), 649-659
Percival, S. L., Bowler, P. G., Dolman, J. (2007). Antimicrobial activity of silver-containing dressings on wound microorganisms using an in vitro biofilm model. Int.Wound.J. 4(2), 186-191
Percival, S. L., Slone, W., Linton, S., Okel, T., Corum, L., Thomas, J. G. (2011). The antimicrobial efficacy of a silver alginate dressing against a broad spectrum of clinically relevant wound isolates. Int.Wound.J. 8(3), 237-243
Pittenger, M. F., Mackay, A. M., Beck, S. C., Jaiswal, R. K., Douglas, R., Mosca, J. D., Moorman, M. A., Simonetti, D. W., Craig,S., Marshak, D. R. (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284(5411), 143-147
Poon, V. K. Burd, A. (2004). In vitro cytotoxity of silver: implication for clinical wound care. Burns. 30, 140-147
Rabinovitch, M (1995). Profesional and non-professional phagocytes: an introduction. Trends Cell Biol 5, 85-87
Raffa, V., Vittorio, O., Pensabene, V., Menciassi, A., Dario, P. (2008). FIB-nanostructured surfaces and investigation of Bio/nonbio interactions at the nanoscale. IEEE Trans.Nanobioscience. 7, 1-10
Rassow, J., Hauser, K., Netzker, R., Deutzmann, R. (2006). Duale Reihe Biochemie. Georg Thieme Verlag Stuttgart 355-358
Rejman, J., Oberle, V., Zuhorn, I. S., Hoekstra, D. (2004). Size-dependent internalization of particles via the pathways of clathrin- and caveolae-mediated endocytosis. Biochem.J. 377(Pt 1), 159-169
83
Rickman, C., Jimenez, J. L., Graham, M. E., Archer, D. A., Soloviev, M., Burgoyne, R. D., Davletov, B. (2006). Conserved prefusion protein assembly in regulated exocytosis. Mol.Biol.Cell 17(1), 283-294
Roe, D., Karandikar, B., Bonn-Savage, N., Gibbins, B., Roullet, J. B. (2008). Antimicrobial surface functionalization of plastic catheters by silver nanoparticles. J.Antimicrob.Chemother. 61(4), 869-876
Roszek, B., de Jong, W. H., and Geertsma, R. E. (2005). Nanotechnology in medical applications: state-of-the-art in materials and devices. Department of Pharmaceutical Affairs and Medical Technology of the Dutch Ministry of Health, Welfare and Sports 7-143 Sahay, G., Alakhova, D. Y., Kabanov, A. V. (2010). Endocytosis of nanomedicines. J.Control Release. 145(3), 182-195
Salem, H. K. Thiemermann, C. (2010). Mesenchymal stromal cells: current understanding and clinical status. Stem Cells 28(3), 585-596
Salvati, A., Aberg, C., Dos, S. T., Varela, J., Pinto, P., Lynch, I., Dawson, K. A. (2011). Experimental and theoretical comparison of intracellular import of polymeric nanoparticles and small molecules: toward models of uptake kinetics. Nanomedicine 7(6), 818-826
Samuel, U. Guggenbichler, J. P. (2004). Prevention of catheter-related infections: the potential of a new nano-silver impregnated catheter. Int.J.Antimicrob.Agents. 23, 75-78.
Santoro, C. M., Duchsherer, N. L., Grainger, D. W. (2007). Antimicrobial efficacy and ocular cell toxicity from silver nanoparticles. Nanobiotechnology. 3(2), 55-65
Schafer, R. Northoff, H. (2008). Characteristics of Mesenchymal Stem Cells - New Stars in Regenerative Medicine or Unrecognized Old Fellows in Autologous Regeneration? Transfus.Med.Hemother. 35(3), 154-159
Schmalz, G., Schweikl, H., Hiller, K. A. (2000). Release of prostaglandin E2, IL-6 and IL-8 from human oral epithelial culture models after exposure to compounds of dental materials. Eur.J.Oral Sci. 108, 442-448
Schmid, S. L. (1997). Clathrin-coated vesicle formation and protein sorting: an integrated process. Annu.Rev.Biochem. 66, 511-548
Schroder, J. M., Mrowietz, U., Christophers, E. (1988). Purification and partial biologic characterization of a human lymphocyte-derived peptide with potent neutrophil-stimulating activity. J.Immunol. 140(10), 3534-3540
Schumacher, S., Nestler, J., Otto, T., Wegener, M., Ehrentreich-Forster, E., Michel, D., Wunderlich, K., Palzer, S., Sohn, K., Weber, A., Burgard, M., Grzesiak, A., Teichert, A., Brandenburg, A., Koger, B., Albers, J., Nebling, E., Bier, F. F. (2011). Highly-integrated lab-on-chip system for point-of-care multiparameter analysis. Lab Chip 12(3), 464-473
84
Serda, R. E., Mack, A., van de Ven, A.L., Ferrati, S., Dunner Jr., K., Godin, B., Chiappini, C., Landry, M., Brousseau, L., Liu, X., Bean, A. J., Ferrari, M. (2010). Logic-embedded vectors for intracellular partitioning, endosomal escape, and exocytosis of nanoparticles. Small 6(23), 2691-2700
Silver, S. (2003). Bacterial silver resistance: molecular biology and uses and misuses of silver compounds. FEMS Microbiol.Rev. 27, 341-353
Silver, S., Phung, l. T., Silver, G. (2006). Silver as biocides in burn and wound dressings and bacterial resistance to silver compounds. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 627-634
Sintubin, L., De, G. B., Van Der Meeren, P., Pycke, B. F., Verstraete, W., Boon, N. (2011). The antibacterial activity of biogenic silver and its mode of action. Appl.Microbiol.Biotechnol. 91(1), 153-162
Stevens, K. N., Crespo-Biel, O., van den Bosch, E. E., Dias, A. A., Knetsch, M. L., Aldenhoff, Y. B., V, Maessen, J. G., Stobberingh, E. E., Koole, L. H. (2009). The relationship between the antimicrobial effect of catheter coatings containing silver nanoparticles and the coagulation of contacting blood. Biomaterials. 30(22), 3682-3690
Stringer, B., Imrich, A., Kobzik, L. (1995). Flow cytometric assay of lung macrophage uptake of environmental particulates. Cytometry. 20(1), 23-32
Suzuki, H., Toyooka, T., Ibuki, Y. (2007). Simple and easy method to evaluate uptake potential of nanoparticles in mammalian cells using a flow cytometric light scatter analysis. Environ.Sci.Technol. 41(8), 3018-3024
Takenaka, S., Karg, E., Roth, C., Schulz, H., Ziesenis, A., Heinzmann, U., Schramel, P., Heyder, J. (2001). Pulmonary and systemic distribution of inhaled ultrafine silver particles in rats. Environ.Health Perspect. 109 Suppl 4, 547-551
Tang, J., Xiong, L., Wang, S., Wang, J., Liu, L., Li, J., Yuan, F., Xi, T. (2009). Distribution, translocation and accumulation of silver nanoparticles in rats. J.Nanosci.Nanotechnol. 9(8), 4924-4932
Tautenhahn, J., Meyer, F., Buerger, T., Schmidt, U., Lippert, H., Koenig, W., Koenig, B. (2008). Interactions of neutrophils with silver-coated vascular polyester grafts. Langenbecks Arch.Surg., 395(2), 143-149
Tomoda, H., Kishimoto, Y., Lee, Y. C. (1989). Temperature effect on endocytosis and exocytosis by rabbit alveolar macrophages. J.Biol.Chem. 264(26), 15445-15450
Treuel, L., Malissek, M., Gebauer, J. S., Zellner, R. (2010). The influence of surface composition of nanoparticles on their interactions with serum albumin. Chemphyschem. 11(14), 3093-3099
Treuel, L., Malissek, M., Grass, S., Diendorf, J., Mahl, D., Meyer-Zaika, W., Epple, M. (2012). Quantifying the influende of polymer coatings on the serum albumin corona formation around silver and gold nanoparticles. J Nanopart Res 14, 1102-1114
85
Trop, M., Novak, M., Rodl, S., Hellbom, B., Kroell, W., Goessler, W. (2006). Silver-coated dressing acticoat caused raised liver enzymes and argyria-like symptoms in burn patient. J.Trauma. 60, 648-652
Unfried, K., Albrecht, C., Klotz, L. O., Von moikrcz, A., Grether-Beck, S., and Schins, R. P. (2007). Cellular target to nanoparticles target structures and mechanisms. Informa Healthcare 1, 52-71
Vaidyanathan, R., Kalishwaralal, K., Gopalram, S., Gurunathan, S. (2009). Nanosilver--the burgeoning therapeutic molecule and its green synthesis. Biotechnol.Adv. 27(6), 924-937
Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. (2006). Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem.Biol.Interact. 160, 1-40
Van, S. J. (1990). Interleukin-6: an overview. Annu.Rev.Immunol. 8, 253-278
Vilquin, J. T. Rosset, P. (2006). Mesenchymal stem cells in bone and cartilage repair: current status. Regen.Med. 1(4), 589-604
Wagner, M., Klein, C. L., van Kooten, T. G., Kirkpatrick, C. J. (1998). Mechanisms of cell activation by heavy metal ions. J.Biomed.Mater.Res. 42, 443-452
Wagner, V. and Zweck, A. Nanomedizin - Innovationspotentiale in Hessen für Medizintechnik und Pharmazeutische Industrie. 2008. HA Hessen-Agentur GmbH, Landesminesterium für Wirtschaft, Verkehr und Landesentwicklung 3-44 Wakitani, S., Goto, T., Pineda, S. J., Young, R. G., Mansour, J. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M. (1994). Mesenchymal cell-based repair of large, full-thickness defects of articular cartilage. J.Bone Joint Surg.Am. 76(4), 579-592 Walczyk, D., Bombelli, F. B., Monopoli, M. P., Lynch, I., Dawson, K. A. (2010). What the cell "sees" in bionanoscience. J.Am.Chem.Soc. 132(16), 5761-5768
Wang, H., Qiao, X, Chen, J, and Ding, S. (2005).Preparation of silver nanoparticles by chemical reduction method. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 256, 111-115 Wang, J., Byrne, J. D., Napier, M. E., DeSimone, J. M. (2011). More effective nanomedicines through particle design. Small 7(14), 1919-1931 Wang, Z. G., Puri, T. S., Quigg, R. J. (2010). Characterization of novel VEGF (vascular endothelial growth factor)-C splicing isoforms from mouse. Biochem.J. 428(3), 347-354
Weisbarth, R. E.,Gabriel, M.M., George, M., Rappon, J., Miller, M., Chalmers, R., Winterton, L. (2007). Creating antimicrobial surfaces and materials for contact lenses and lens cases. Eyeand Contact Lens 33, 426-429
86
White, J. M., Powell, A. M., Brady, K., Russell-Jones, R. (2003). Severe generalized argyria secondary to ingestion of colloidal silver protein. Clin.Exp.Dermatol. 28(3), 254-256
Wijnhoven, S., Peijnenburg, W., Herberts, C., Hagens, W., Oomen, A., Heugens, E., Roszek, B., Bisschops, J., Gosens, I., van de Meent, D., Dekkers, S., deJong, W., van Zijverden, M., Sips, A., Geertsma, R. (2009). Nano-silver – a review of available data and knowledge gaps in human and environmental risk assessment. Nanotechnology 3, 109-138
Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. (2000). Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J.Neurosci.Res. 61(4), 364-370
Xiu, Z., Zhang, Q., Puppala, H. L., V. L., Alvarez, P. J. J. (2012). Negligible Particle-Specific Antibacterial Activity of Silver. Nanoparticles. Nano Lett. 12(8), 4271-4275 Yang, W., Shen, C., Ji, Q., An, H., Wang, J., Liu, Q., Zhang, Z. (2009). Food storage material silver nanoparticles interfere with DNA replication fidelity and bind with DNA. Nanotechnology. 20, 85102
Ye, S. F., Wu, Y. H., Hou, Z. Q., Zhang, Q. Q. (2009). ROS and NF-kappaB are involved in upregulation of IL-8 in A549 cells exposed to multi-walled carbon nanotubes. Biochem.Biophys.Res.Commun. 379, 643-648
Yen, H. J., Hsu, S. H., Tsai, C. L. (2009). Cytotoxicity and Immunological Response of Gold and Silver Nanoparticles of Different Sizes. Small. 5(13), 1553-1561
Yoshimaru, T., Suzuki, Y., Inoue, T., Niide, O., Ra, C. (2006). Silver activates mast cells through reactive oxygen species production and a thiol-sensitive store-independent Ca2+ influx. Free Radic.Biol.Med. 40, 1949-1959
Young, R. G., Butler, D. L., Weber, W., Caplan, A. I., Gordon, S .L., Fink, D. J. (1998). Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair. J.Orthop.Res. 16(4), 406-413
Zambaux, M. F., Faivre-Fiorina, B., Bonneau, F., Marchal, S., Merlin, J. L., Dellacherie, E., Labrude, P., Vigneron, C. (2000). Involvement of neutrophilic granulocytes in the uptake of biodegradable non-stealth and stealth nanoparticles in guinea pig. Biomaterials. 21, 975-980
Zhang, F. Q., She, W. J., Fu, Y. F. (2005). Comparison of the cytotoxicity in vitro among six types of nano-silver base inorganic antibacterial agents. Zhonghua Kou Qiang.Yi.Xue.Za Zhi. 40(6), 504-507
Zhang, L. W. Monteiro-Riviere, N. A. (2009). Mechanisms of quantum dot nanoparticle cellular uptake. Toxicol.Sci. 110, 138-155
Zhao, L., Chu, P. K., Zhang, Y., Wu, Z. (2009). Antibacterial coatings on titanium implants. J.Biomed.Mater.Res B Appl.Biomater. 91(1), 470-480
87
Zimmet, J. M. Hare, J. M. (2005). Emerging role for bone marrow derived mesenchymal stem cells in myocardial regenerative therapy. Basic Res.Cardiol. 100(6), 471-481.
Danksagung
Zunächst möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Manfred Köller für die Bereitstellung
des Themas und die Betreuung meiner Arbeit in allen Belangen bedanken. Nur
durch seine ständige Bereitschaft für wissenschaftliche Diskussion sowie sein
Vertrauen hat er mir die Arbeit, so wie sie ist, ermöglicht. Ich danke Herrn Köller
außerdem für die uneingeschränkte Bereitstellung aller Mittel sowie die
Möglichkeit der Teilnahme an einer Tagungsreise, die wichtige Anregungen
geliefert hat.
Mein großer Dank gilt Frau Dr. Christina Greulich für die stetige Unterstützung,
Hilfestellung und Motivation bei der Anfertigung dieser Dissertation. Sowohl
während der Arbeit im Labor als auch beim Schreiben der Dissertation hat sie mir
immer geduldig mit Rat und Tat zur Seite gestanden und mir viele wichtige
Ratschläge mit auf den Weg gegeben. Ich bedanke mich außerdem für die tolle
Einarbeitung im Labor, die es mir erst ermöglicht hat die Experimente
selbstständig durchzuführen.
Ein herzliches Dankeschön geht an die Mitarbeiter der Chirurgischen Forschung
für die angenehme und kollegiale Atmosphäre. Danke an Tim Habijan für wertvolle
Tipps in vielen technischen und nicht-technischen Belangen. Bei Frau Elvira Peter,
Michaela Zaik, Simone Höhler-Wefers und Christiane Cronau möchte ich mich für
die Unterstützung im Labor bedanken.
Mein besonderer Dank geht auch an das Institut für Anorganische Chemie der
Universität Essen (AK Prof. Dr. Epple), ohne deren Bereitstellung der Nanopartikel
diese Arbeit niemals möglich gewesen wäre.
Zudem bedanke ich mich beim Institut für Prävention und Arbeitsmedizin der
Deutschen Gesetzlichen Unfallversicherung (IPA), Abteilung Toxikologie für die
Auswertung meiner Proben mittels Atomabsorptionsspektroskopie und bei Tobias
Simon für die Unterstützung bei der FIB/REM-Technik.
Mein großer Dank gilt zuletzt meinen Eltern, Otto und Roswitha, meinem Bruder
Guido und meinem Freund Nico für die liebevolle Unterstützung und Motivation
während und außerhalb des Studiums.
Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name: Julia Katharina Gorenc
Geburtsdatum/- ort: 11.04.1987 in Castrop-Rauxel
Schulausbildung:
08/1993-06/1997 Grundschule an der Vellwigstraße
08/1997-06/2006 Otto-Hahn-Gymnasium Herne, Abschluss: Abitur
Universitäre Ausbildung:
10/2006-08/2008 Studium der Humanmedizin an der Ruhr- Universität
Bochum
08/2008 Erwerb des 1. Abschnittes der ärztlichen Prüfung
(Physikum) mit der Note gut (2,0)
09/2008 -07/2009 Studium der Humanmedizin an der Université Louis
Pasteur, Strasbourg
seit 10/2009 Fortführung des Studiums an der Ruhr- Universität
Bochum (Examen voraussichtlich 04/2013)
Sonstiges:
08/2009-12/2011 Tätigkeit in der chirurgischen Abteilung des
Evangelischen Krankenhauses Herne (Prof. Kemen
und Prof. Eickhoff) als studentische Hilfskraft
2003-2008 Tätigkeit als Rettungsschwimmerin sowie
Schwimmlehrerin beim SC Wiking Herne
Fremdsprachen Englisch, Französisch, Latein