aus der iii.medizinischen klinik, klinikum bamberg, … · aus der iii.medizinischen klinik,...
TRANSCRIPT
-
Aus der III.Medizinischen Klinik, Klinikum Bamberg,
Akademisches Lehrkrankenhaus der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Chefarzt Prof.Dr.Walter Schulz
KfH Nierenzentrum Bamberg
und dem
Institut für Nephrologie und Osteologie Bamberg
Der apo(a)-Polymorphismus und Lipoprotein(a)-
Spezifitäten beim terminal Niereninsuffizienten
Experimentelle Identifizierung neuer Phänotypen
Analyse der 5-Jahres-Mortalität zur Bewertung der klinischen Relevanz
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
an der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorgelegt von
Holger Cura
aus Ebermannstadt
-
Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof.Dr.med.Dr.h.c.Jürgen Schüttler Referent: Prof.Dr.med..Walter Schulz Korreferent: Prof.Dr.med.Kai-Uwe Eckardt Tag der mündlichen Prüfung: 24.06.2010
-
Gewidmet
Meinem lieben Großvater
Ferdinand Kirchner
Geboren am 11.08.1913 Gestorben am 1.01.2007
-
Inhaltsverzeichnis
Seite
Zusammenfassung ………………………………………………….1
Summary……………………………………………….…….……..3
1. Einleitung………………………………………………..5
1.1. Kardiovaskuläres Risiko von Dialysepatienten ...............................................5
1.2. Lipoprotein (a) – ein „neuer“ Risikofaktor………………………………….. 7
1.2.1. Historie….........................................................................................................7
1.2.2. Genetik von Lipoprotein (a)….........................................................................7
1.2.3 Struktur von Lipoprotein (a)….........................................................................9
1.2.4. Mögliche Pathomechanismen………………………………………………..12
1.3. Offene Fragen im klinischen Kontext………………………………………..14
2. Materialien…………………………………………………15
2.1. ELISA………………………………………………………..……………….15
2.2. Phänotypisierung……………………………………………………………..15
2.3. Verwendete Einzelsubstanzen…….. …………………………………………16
2.4. Puffer………………………………………………………………………….16
2.5. Gele……………………………………………………………………………18
2.6. Geräte und Hilfsmittel…………………………………………………………19
2.7. Probengewinnung und –lagerung……………………………………………..20
2.7.1 Patientenkollektiv……………………………………………………………..20
2.7.2 Kontrollgruppe………………………………………………………………..20
2.8. Software……………………………………………………………………… 21
3. Methoden……………………………………………………22
3.1. ELISA………………………………………………………………………….22
3.1.1. Testprinzip..…………………………………………………………………… 22
-
3.1.2. Testdurchführung……………………………………………………………….22
3.1.3. Konzentrationsbestimmung mittels Spline-Approximation……………………24
3.2. Phänotypisierung………………………………………………………………..24
3.2.1. Testprinzip………………………………………………………………………24
3.2.2. Testdurchführung……………………………………………………………….25
3.2.2.1. Probenvorbereitung……………………………………………………………..25
3.2.2.2. SDS-PAGE….……………………………………………………………….….25
3.2.2.3. Diffusionsblot……………………………………………………………….…..28
3.2.2.4. Inkubation mit 1.Antikörper…………………………………………………….28
3.2.2.5. Inkubation mit 2.Antikörper…………………………………………………….29
3.2.2.6. Substratreaktion…………………………………………………………………29
3.2.2.7. Auswertung der Nitrozellulosemembranen……………………………………..30
3.3. Statistische Verfahren…………………………………………………………..32
4. Ergebnisse…………………………………………………....33
4.1. Statistische Basisdaten…………………………………………………………..33
4.2. Experimentelle Optimierung der Methodik……………………………………..35
4.3. Bestimmung der Lp(a)-Serumspiegel………………………………………...…37
4.3.1. Vergleich der Dialysepatienten mit den Kontrollen……………………………..37
4.3.2. Subgruppenanalyse bei den Dialysepatienten……………………………………41
4.3.3. Lp(a)-Spiegel in Abghängigkeit von Alter und Geschlecht……………………...43
4.4. Phänotypisierung von apo(a)……………………………………………………..45
4.4.1. Anpassung der Nomenklatur……………………………………………………..45
4.4.2. Isoformenanzahl…………………………………………………………………48
4.4.3. Detektierte Phänotypen………………………………………………………….50
4.4.4 Isoformenfrequenz…………………………………………………………….…52
4.5. Zusammenhänge zwischen apo(a) Phänotyp und Lp(a) Konzentration…….….54
4.5.1. Einfluß der Isoformenzahl auf die Lp(a)-Konzentration…………………………55
4.5.2. Lp(a) Spiegel in Abhängigkeit des apo(a) Molekulargewichts………………….55
4.5.3. Additiver Effekt von Isoformenzahl und Molekulargewicht
auf die Lp(a)-Konzentration……………………………………………………...58
4.5.4. Risikoabschätzung für erhöhte Lp(a)-Spiegel mit Kenntnis des Phänotyps……..60
4.6. Lp(a) nach Nierentransplantation unter Berücksichtigung
des apo(a) Phänotyps……………………………………………………………..61
-
4.7. Kaplan-Meier-Analyse einer 5-jährigen Nachbeobachtungsphase…………….63
4.7.1 Absolute Mortalität und kumulatives Überleben an der Dialyse………………..63
4.7.2 Alter……………………………………………………………………………...6
4
4.7.3 Diabetes mellitus……………………………………………………………...…65
4.7.4 Klinisch apparente Arteriosklerose…………………………………………...…66
4.7.5 Nikotinkonsum…………………………………………………………………..67
4.7.6 Lp(a)-Konzentration………………………………………………………….….68
4.7.7 Apo(a)-Molekulargewicht……………………………………………………….69
4.7.8 Risikoabschätzung…………………………………………………………….…70
5. Fallbeispiele…………………………………………………..71
6. Diskussion………………………………………………….....74
Literaturverzeichnis…………………………………………………87
Abkürzungsverzeichnis……………………………………………...97
Vorveröffentlichung………………………………………………....98
Anhang………………………………………………………………99
Danksagung………………………………………………………...110
Lebenslauf……………………………………………………….…111
-
Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele:
Dialysepatienten unterliegen einem stark erhöhten kardiovaskulären Risiko. Neben
sogenannten klassischen und dialysespezifischen Risikofaktoren, sind aus jüngerer Zeit
weitere Parameter in den Blickpunkt gerückt, die möglicherweise einen Einfluß auf die
Mortalität der Dialysepatienten haben. Einer davon ist Lipoprotein (a), ein LDL-Partikel,
an den ein dem Plasminogen ähnliches Protein, das Apolipoprotein (a), kovalent
gebunden ist. Apo(a) unterliegt einem ausgeprägten Größenpolymorphismus. In
nierengesunden Kollektiven, insbesondere innerhalb retrospektiver und
epidemiologischer Studien, zeigte sich eine enge Assoziation zwischen Lp(a)-
Konzentration, apo(a)-Molekulargewicht und Atherosklerose. Der klinische Stellenwert
von Lp(a) wird unterschiedlich gesehen, zumal es bisher wenige prospektive Daten gibt
und keine Interventionsstudien mangels effektiver bzw. praktikabler Therapieoptionen.
Methoden:
Wir untersuchten ein vergleichsweise großes Kollektiv von 251 Dialysepatienten, HD n =
210, PD n = 41, und bestimmten Lp(a) – Spiegel mittels ELISA (Immuno) unter
Berücksichtigung des apo(a)-Größenpolymorphismus. Für die apo(a)-Phänotypisierung
kam die SDS-PAGE mit anschließendem Westernblot zur Anwendung, kein hoch
auflösendes, aber robustes Verfahren zur Bestimmung der apo(a)-Phänotypen. 82
nierengesunde Patienten aus einer osteologischen Ambulanz dienten als Kontrollgruppe.
Die 251 Dialysepatienten konnten 5 Jahre nachbeobachtet werden.
Ergebnsisse:
Die Lipoprotein (a) Spiegel sowohl der Patienten wie auch der Kontrollen zeigten eine
ausgeprägte Heterogenität mit identischer Varianz und überwiegend niedrigen Lp(a)-
Konzentrationen im Sinne einer rechtsschiefen Verteilung. Dialysepatienten zeigten im
Trend zwar höhere Lp(a)-Werte bezogen auf Mittelwert und Median, jedoch nicht auf
Signifikanzniveau. Die Subgruppenanalyse identifizierte aber Diabetiker, Patienten mit
manifester Arteriosklerose und postmenopausale Frauen als Kollektiv mit signifikant
erhöhten Lp(a)-Spiegeln. Der Polymorphismus von apo(a) konnte durch die
Phänotypisierung sowohl in der Patienten-als auch in der Kontrollgruppe klar dargesetllt
werden. Es wurden insgesamt 13 verschiedene apo(a) - Isoformen und in
unterschiedlichen Kombinationen 52 verschiedene Phänotypen in der Patientengruppe
-
identifiziert. Nachvollzogen werden konnte die inverse Beziehung zwischen apo(a)-
Molekulargewicht und Lipoprotein (a) -Konzentration, insbesondere in der
Kontrollgruppe. Dialysepatienten mit hochmolekularen apo(a) - Isoformen sind deutlich
instabiler bezüglich zu erwartender Lp(a)-Spiegel . Hier scheint es bisher ungeklärte
Einflüsse zu geben, die dialysespezifisch sind.
Bei 21 im Beobachtungszeitraum transplantierten Patienten zeigte sich langfristig kein
signifikanter Einflüß auf den Lp(a)-Spiegel.
Eine Sonderrolle spielt offensichtlich eine kleine Gruppe (ca. 3 %) mit Phänotypen aus
3 und 4 Isoformen, die exzessiv hohe Lp(a)-Spiegel aufweisen. Sie müssen als besondere
Risikogruppe eingestuft werden, zeigten sie doch in der Kaplan-Meier-Analyse über 5
Jahre die geringste Überlebenszeit an der Dialyse. Prognostisch bedeutsam, das zeichnete
sich hier in in der 5-Jahres-Analyse insbesondere bei Langzeitdialysepatienten ab, ist das
apo(a)-Molekulargewicht, nicht der absolute Lp(a)-Spiegel.
Schlußfolgerung:
Im Vordergrund der zukünftigen Bemühungen sollte daher die Identifizierung von
Patienten mit niedermolekularem apo(a) stehen. Mit größeren Datensätzen könnten
bisherige Vermutungen möglicherweise besser statistisch belegt werden und zu einem
verbesserten kardiovaskulären Risikomanagement beim Dialysepatienten beitragen.
Es ist jedoch zu befürchten, daß wegen des relativ aufwändigen Verfahrens und der
mangelnden spezifischen Therapieoptionen, die Methode ausschließlich bei klinischen
Studien Anwendung findet. Eine für die breite Anwendung praktikable Vision wäre ein
qualitativer Schnelltest, der außschließlich zwischen hoch- und niedermolekularem apo(a)
unterscheiden kann.
-
Summary
Background and Aims:
The cardiovascular risk in dialysis patients is increased enormously. Recent
studies focused on new parameters beyond classical and dialysis specific factors,
probably having an decisive influence on dialysis patients´mortality. One of them
is lipoprotein (a), an LDL-particle, covalently bound to a plasminogen-like
proteine, the apolipoprotein (a). The molecule size of apolipoprotein (a) shows a
huge heterogenity, genetically determined. In groups with normal kidney
function, especially within retrospective and epidemiological studies, a strong
association between lp(a)-concentration, molecular weight of apolipoprotein (a)
and atherosclerosis could be demonstrated. Based on rare prospective and
without any interventional data material , the clinical importance of lipoprotein
(a) especially in patients with renal failure is discussed controversial.
Methods:
We investigated a comparatively huge collective of 251 dialysis patients, HD n=
210, PD n = 41, and determined Lp(a) levels in consideration of apo(a)
polymorphism. Lp(a) levels were measured through ELISA (Immuno), apo(a)
phenotypes were detected by an SDS PAGE and following Westernblot, not the
method of highest resolution, but reliable in use. A control group of 82 patients
without renal disorder were recruited in an osteologic outpatient department. All
251 dialysis patients were included in a five-year follow-up of clinical observation
based on file data.
Results:
Lp(a) levels in dialysis patients as well in controls showed distinctive heterogenity
with comparable variance and predominantly low lp(a) concentrations, skewed
distribution to the right side. In dialysis patients there was a trend to higher lp(a)
concentrations but not on a statistically significant level. Though the analysis of
subgroups identified diabetics, patients with apparent arteriosclerosis and women
in menopause as dialysis patients with significant elevated lp(a) levels.
-
Polymorphism of apo(a) could be described by phenotyping gene products both in
patients and controls. 13 different isoforms and in various combinations 52
different phenotypes were detected. Reproduction of the inverse relation of
apo(a)-molecular weight and lipoprotein (a) concentration was easier in control
group. Especially dialysis patients with high molecular weigth apo(a) are less
reliable with regard to expected lp(a)-level. There might exist unclear influences,
being specific for renal failure patients.
Obviously outstanding is a small subgroup (approx. 3 %) with apo(a) phenotypes
consisting of 3 and 4 low molecular weight isoforms, showing excessive high
lp(a) levels. They have to be classified as a high-risk group with shortest survival
time under dialysis treatment. In the same Kaplan-Meier analysis, but also
suspected by other authors, there is indication for the predominant influence of
apo(a) molecular weigth, less the absolute lp(a) level, on patients´ outcome.
Conclusion:
Coming efforts should concentrate on identifying dialysis patients with low
molecular apo(a). Based on larger data files present assumptions might be proofed
statistically leading to a better cardiovascular risk management in dialysis
patients. Being a complex and costly method and for lack of specific therapies,
apo(a) phenotyping is far away from laboratory routine. A practicable vision
might be a simple qick test distinguishing high and low molecular weight apo(a).
-
1. Einleitung
1.1. Kardiovaskuläres Risiko bei Dialysepatienten
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind in Industrieländern Todesursache Nummer
eins. Bei terminal niereninsuffizienten Patienten steigt das relative Risiko an
einem kardiovaskulären Ereignis zu versterben exorbitant an. Die Angaben in der
Literatur variieren stark von einem 10 – 1000 - fachem Risiko, je nachdem welche
Größe und insbesondere Alterszusammensetzung das untersuchte Kollektiv hatte.
[USRDS Annual Report, 2003]
Die Gründe für die hohe kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität sind
facettenreich und sowohl in der Einzel- wie auch Wechselwirkung untereinander
bei weitem nicht verstanden, was erfolgreiche therapeutische Bemühungen bis
dato stark limitiert. Hinzu kommt, dass Erkenntnisse und daraus abgeleitete
Maßnahmen beim Nierengesunden sich nicht ohne weiteres auf Nierenkranke
übertragen lassen.
Mögliche Ursachen beim Dialysepatienten lassen sich differenzieren in einerseits
„traditionelle“ Risikofaktoren, die bei Niereninsuffizienten in erhöhter Prävalenz
vorkommen und andererseits spezifische Risikofaktoren, die sich aus der
Niereninsuffizienz oder Dialysebehandlung selbst ergeben.
Der Dialysepatient ist meistens alt, häufiger männlich, hatte oder hat
Bluthochdruck, ist häufig Diabetiker, hat häufig eine Fettstoffwechselstörung und
bewegt sich relativ wenig oder ist gar immobil. Diese Attribute treffen für viele
Patienten zu und bestehen bereits als Hypothek, bevor man sich
dialysespezifischen Faktoren zuwendet. [Wolfe et al.,1999]
Ohne hier ins Detail gehen und eine leicht ausufernde Abhandlung
dialysespezifischer Risikofaktoren beginnen zu wollen, seien exemplarisch einige
wesentliche Punkte angeführt.
Einen großen Stellenwert nimmt sicherlich der gestörte Calcium-Phosphat-
Haushalt ein mit einer relativen Calcium-Überladung und unzureichender
Phosphatelimination. Ein Charakteristikum ist die resultierende Mediasklerose,
die zu einer prognostisch ungünstigen Gefäßsteifigkeit führt.
-
Mit der Hyperphospatämie eng vergesellschaftet ist der Hyperparathyreodismus,
der einer Calcium-Freisetzung aus dem Knochen und den Calcium-Shift in
Gefäßwand und Weichteilgewebe Vorschub leisten kann.
Häufig besteht eine erhebliche Anämie, die eine Linksherzhypertrophie mit
entsprechend fatalen Konsequenzen fördert.
Urämietoxine, aber auch Fremdoberflächen von Kathetern, Schläuchen,
Membranen sowie Pyrogene im Dialysat wirken als Trigger für entzündliche
Reaktionen und oxidativen Stress, der eine Atherosklerose begünstigt. [Wolfe et
al., 1999 Schüler A., 2008]
In den letzten Jahren vermehrt in den Mittelpunkt des Interesses gerückt sind
„neuere“ Riskofaktoren wie Homocystein und das Lipoprotein (a).
Die Erwartungen, durch medikamentöses Absenken des Homocysteins das
kardiovaskuläre Risiko zu beeinfluusen, haben sich bisher nicht erfüllt.
Ebenfalls schwierig gestaltet sich die Einschätzung des Einflusses von
Lipoprotein (a). Mehrere Arbeiten aus den letzten Jahren mit prospektiven
epidemiologischen Daten zeigen eine Assoziation zwischen hohen Lipoprotein
(a)-Spiegeln und kardiovaskulären Erkrankungen und damit verbundener erhöhter
Mortalität. Es gibt bisher allerdings keine Substanz oder Methode, mit der man
den Lipoprotein (a)-Spiegel effektiv senken und somit den Stellenwert des
vermeintlichen Riskofaktors interventionell überprüfen kann.
Die U.S. Preventive Services Task Force konnte sich nach Sichtung einschlägiger
Literatur der letzten 15 Jahre in den neuesten Empfehlungen nicht dazu
durchringen, Lipoprotein (a) bei Personen ohne positive KHK-Anamnese als
relevanten prognostischen Faktor einzustufen. [Calonge et al, 2009]
Es stellt sich allerdings die Frage, ob der in der Normalbevölkerung fraglich
bedeutsame Risikofaktor beim Dialysepatienten einen besonderen Stellenwert
einnimmt oder gar, wie manche Untersuchungen suggerieren, ein übersteigertes,
dialysespezifisches Problem darstellt.
-
1.2. Lipoprotein(a) – ein „neuer“ Risikofaktor
1.2.1. Historie
Lipoprotein (a) wurde zum ersten mal von Berg im Jahre 1963 als eine genetische
Variante des LDL (low density lipoprotein) beschrieben, um später festzustellen,
daß es sich um ein eigenständiges Lipoprotein handelte. Bald nach Entdeckung
hatte man durch qualitative Analysen festgestellt, daß erhöhte Lp(a)-
Plasmakonzentrationen einen unabhängigen Risikofaktor für KHK und
Myokardinfarkt darstellen. [Morrisett JD et al., 1987]
Im Jahr 1981 stellte Kostner et al. fest, daß bei normolipidämischen, weißen
Personen eine Lp(a)-Konzentration über 30 mg/dl das relative Risiko, einen
Herzinfarkt zu erleiden, 1,75 beträgt. Der Grenzwert von 30 mg/dl für Lipoprotein
(a) gilt bis heute und hat in den Befundbögen von Großlabors weiter Bestand.
[Kostner GM et al.,1981]
1.2.2. Genetik von Lipoprotein (a)
Schon als Lp(a) entdeckt wurde, erkannte Berg, dass es sich um ein genetisches
Merkmal handelt. Damals stand nur ein einfacher immunologischer Test zur
Verfügung, der zwischen Lp(a)-positiven und Lp(a)-negativen Individuen
unterscheiden konnte. Man nahm an, dass es sich bei Lp(a) um ein qualitatives
Merkmal handelt, das autosomal dominant vererbt wird.
Durch empfindlichere Testmethoden fand man bereits in den 70 er Jahren heraus,
dass Lp(a)-Plasmakonzentrationen in der kaukasischen Bevölkerung
kontinuierlich verteilt sind, es also ein qualitatives, nicht quantitatives Merkmal
sein muß. Die Konzentrationsverteilung ist extrem schief, wobei ein Großteil der
Bevölkerung sehr niedrige Werte aufweist. Und die Konzentrationsverteilung ist
im Unterschied zu anderen Lipoproteinen extrem breit. Die
Konzentrationsunterschiede liegen im 1000fachen Bereich (< 1,0 - > 400 mg/dl).
Unterwirft man menschliches Plasma einer reduzierenden Behandlung, gefolgt
von einer SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese und einem Immunoblot mit einem
-
Anti-Apo(a)-Antikörper, so findet man bei verschiedenen Personen
unterschiedlich große Formen von Apo(a).
Auf welche Weise die Größe der Apo(a)-Isoformen die Plasmakonzentrationen
des Lp(a)-Partikels reguliert, ist letztlich ungeklärt. Eine mögliche Ebene der
Regulation stellt die Transkription dar. Für eine signifikante Beteiligung dieser
Ebene spricht das Vorhandensein unterschiedlicher Mengen von Apo(a)-mRNA
in verschiedenen Individuen. Der Genort auf dem Chromosom 6q2.7 ist bekannt
und gekennzeichnet durch eine hohe molekulare Variabiltät, die den Lp(a)-
Spiegel zum Großteil bestimmt. [Kraft HG et al, 1996]
Lipoprotein (a) gehört zu einer Überfamilie von Proteinen, die im Laufe der Zeit
durch den Zugewinn beziehungsweise Verlust funktioneller Module in
Genduplikaten entstanden sind. Etwa ein Dutzend dieser Proteinfamilie haben mit
der Blutgerinnung zu tun, darunter Gerinnungsfaktoren VII, IX und X,
Prothrombin und das Plasminogen. Anhand von Mutmaßungen über die
Häufigkeit von Mutationen in der DNA schätzen einige Forscher, daß sich die
Sequenzen für Apoliporotein (a) und Plasminogen erst seit etwa 40 Millionen
Jahren auseinanderentwickeln. Als man bei verschiedenen Tierarten nach Apo(a)
suchte, war es nur zu finden bei Altweltaffen und Menschenaffen, nicht bei
Nagern. Lediglich bei europäischen Igeln findet sich ein dem apo(a) ähnliches
Protein. Die Tatsache, daß bei Kleinsäugern kein Lp(a) zu finden ist, erschwert es
erheblich, Effekte von apo(a) in Tiermodellen zu untersuchen. [Lawn R.M. et al.,
1992]
Durch Geschwister-Kopplungsanalyse war es möglich, den Einfluß des Apo(a)-
Genortes auf die Lp(a)-Konzentration zu quantifizieren. Es lässt sich damit
feststellen, welcher Anteil der Variation der Lp(a)-Konzentration durch den
Apo(a)-Genort bestimmt und welcher Anteil durch andere Gene oder durch
Umweltfaktoren reguliert wird. Dabei zeigte sich, dass über 90 % der Lp(a)-
Konzentration durch das Apo(a)-Gen reguliert werden.
[Kraft HG and Utermann G, 1995]
-
1.2.3. Struktur von Lipoprotein (a)
Lipide wie Cholesterol oder Triglyceride sind im Plasma unlöslich. Sie müssen im
zirkulierenden Blutfluß von sogenannnten Lipoproteinen zu den verschiedenen
Gewebezellen transportiert werden zur Energiegewinnung, Fettspeicherung,
Hormonproduktion oder Gallensaftbildung. Lipoproteine bestehen aus teils
veresterten, teils nicht verestertem Cholesterol, Triglyceriden, Phospholipiden
und Protein. Der Proteinanteil in einem Lipoprotein wird als Apolipoprotein oder
auch Apoprotein bezeichnet. Apoproteine dienen meist als Cofaktor für Enzyme
und als Liganden an Rezeptoren.
Lipoproteine werden in fünf Hauptklassen eingeteilt:
Chylomikronen sind sehr große Partikel, die mit der Nahrung im Darm
aufgenommene Fette transportieren
VLDL (very low densitiy lipoprotein) transportieren endogene, also in der
Leber synthetisierte Triglyceride, und zu einem geringeren Anteil
Cholesterin
IDL (Intermediate density lipoprotein) transportiert Cholesterolester und
Triglyceride
LDL (low density lipoprotein) transportiert Cholesterinester
HDL (high density lipoprotein) transportiert Cholesterinester
[Rosenson Robert S, 2009]
Lipoprotein (a) kann als ein LDL-Partikel betrachtet werden, das zusätzlich zu
Apo B 100 ein weiteres Apolipoprotein, nämlich Apolipoprotein (a) enthält.
Apo(a) ist über eine Disulfidbrücke an ApoB gebunden. Apolipoprotein(a) ist ein
Glycoprotein und bestimmt entscheidend die unterschiedlichen
physikochemischen Eigenschaften im Vergleich zum LDL.
-
Abb.1: Skizzenhafte Darstellung der Struktur von Lipoprotein (a). An dem zentral
gelegenen LDL-Partikel sind kovalent gebunden die Apoliporoteine B 100 und Apo(a),
dessen Kettenlänge durch die Anzahl der Kringle IV-Wiederholungen bestimmt wird.
(Abbildung aus M.Helmhold, V.W.Armstrong, Risikofaktor Lp(a) )
Durch cDNA-Sequenzierung konnte Lawn et al. 1987 feststellen, daß
Apoliprotein (a) zu den sogenannten kringelhaltigen Proteinen gehört.
Kringel sind Proteinmotive, die durch drei intramolekulare Disulfidbrücken zu
einer charakteristischen Figur geformt werden, die an ein dänisches brezelartiges
Gebäck gleichen namens erinnert. Ebenfalls zu den kringelhaltigen Proteinen
gehört das Plasminogen, zu dem eine ausgeprägte Homologie besteht. Der vierte
von insgesamt fünf Kringeln des Plasminogens findet sich beim Apolipoprotein
(a) in vielfachen tandemartigen Wiederholungen. Bei Kringel IV handelt es sich
um die fibrinbindende Domäne des Plasminogens.
Diese strukturelle Verwandtschaft führte zur Vermutung, beim Lipoprotein (a)
könnte es sich um das lange gesuchte Bindeglied zwischen thrombolytischem und
atherogenen System handeln. [Brunner C et al., 1993, Mc Lean JW et al., 1987]
-
Abb. 2 : Strukturvergleich von Apo (a) mit Plasminogen. Kringel IV des Plasminogens
findet sich homolog im Apo (a) in variabler Wiederholung.
(Abbildung aus M.Helmhold, V.W.Armstrong, Risikofaktor Lp(a))
Die Aminosäuresequenz von Apolipoprotein (a) bietet einige verlockende
Deutungsmöglichkeiten für die normale physiologische Rolle des Proteins. Eine
recht attraktive Spekulation besagt, daß Lipoprotein (a) bei der Heilung verletzter
Blutgefäße hilft. Wenn ein Gefäß zerrissen oder durchbohrt ist, stoppen
fibrinreiche Gerinnsel die Blutung zunächst provisorisch. Für die eigentliche
Heilung müssen jedoch Zellen nachwachsen, die Cholesterin als Bestandteil ihrer
Membran benötigen. Als plasminogen-ähnliches Protein, das an cholesterin-
transportierendes LDL gebunden ist, könnte Apo(a) bei der Wundheilung
förderlich sein. Wenn es die Fähigkeit zur Fibrinbindung beibehalten hätte, wäre
es imstande , das Cholesterin genau zur rechten Zeit am richtigen Ort abzuliefern.
Experimentell ist die Affinität von apo(a) zum Fibrin jedoch deutlich schwächer
als beim Plasminogen.
Die vorteilhaften Eigenschaften standen wahrscheinlich im Vordergrund, als
unsere Primatenvorfahren weitaus geringere Mengen an Cholesterin im Blut
hatten als der moderne Mensch und der Tod durch Herzinfarkt bei
-
Lebenserwartungen unter 40 Jahren keine Rolle gespielt hatte bezüglich natürliche
Auslese. Neben der unklaren physiologischen Rolle entfacht die strukturelle
Ähnlichkeit zum Plasminogen weitaus mehr eine Diskussion über mögliche
Pathomechanismen bei der Entstehung der Arteriosklerose.
[Lawn R.M. et al, 1992, 1997]
1.2.4. Mögliche Pathomechanismen
Die strukturelle Verwandtschaft mit Plasminogen legt eine Interaktion der
Fibrinolyse nahe mit kompetitiver Hemmung von Plasminogen an
Bindungsstellen von Molekülen und Zelloberflächen
[Loscalzo et al., 1999, Harpel et al.1989]
Lipoprotein (a) hemmt die Thrombolyse und verhindert somit die Aktivierung von
TGF-ß, einem Hemmstoff der Zellproliferation in der Gefäßwand.
[Loscalzo et al., 1999, Graininger et al., 1994]
Lp(a) steigert die Expression von interzellulärem Adhäsions-Molekül 1, was zur
Rekrutierung von Monozyten an der Gefäßwand und Bindung an Makrophagen
führt. Dies fördert Schaumzellbildung und Einschleusen von Lp(a) in
atherosklerotischen Plaques.
[Zioncheck et al., 1991, Poon et al., 1997]
Der VLDL-Rezeptor auf den Makrophagen wird in atherosklerotischen Läsionen
präsentiert, kann Lp(a) binden und den Abbau von Lp(a) durch Endozytose
beeinflussen. Bei Patienten mit instabiler KHK werden größere Mengen Lp(a) in
plaque-ständigen Makrophagen gefunden.
[Argraves et al., 2009]
-
Lp(a) bindet an das Endothel und Bestandteilen der extrazellulären Matrix, hemmt
die vasodilatatorische Kapazität und fördert zumindest teilweise die endotheliale
Dysfunktion
[Schachinger et al., 1997]
Abb. 3 : Schematische Übersicht beispielhafter möglicher Pathomechanismen von
Lipoprotein (a). Lp(a) kann theoretisch auf mehrere Weisen Erkrankungen der Gefäße
fördern. So konkurriert es möglicherweise mit dem Plasminogen um Bindungsstellen an
Thromben und Plasminogen-Aktivatoren und behindert dadurch die Thrombolyse. Ferner
können Reste alter Thromben in der Arterienwand und Lipoprotein (a), das sich an die
extrazelluläre Matrix gebunden hat, den Zellen der Gefäßwand das Signal zu
übermäßigem Wachstum geben. Schließlich werden Makrophagen , die zu viel Lp(a)
aufnehmen, zu Schaumzellen, die Wachstumsfaktoren freisetzen und dadurch das
Fortschreiten der Arteriosklerose fördern.
(Abbildung nach R.M. Lawn, Spektrum der Wissenschaft, Sonderdruck, 1992)
-
1.3. Offene Fragen im klinischen Kontext
Die pathogenetischen Überlegungen basieren zum Großteil auf theoretischen
Modellen und in vitro-Daten. Die Einschätzung von Lipoprotein (a) als
kardiovaskulärer Risikofaktor in der Normalbevölkerung beruht ausschließlich
auf epidemiologischen Daten. Für die spezielle Patientengruppe der
Dialysepatienten liegen diesbezüglich wenige Untersuchungen vor mit
vergleichsweise geringen Fallzahlen.
Es gab in einigen Arbeiten lediglich Hinweise, dass Dialysepatienten zu höheren
Lp(a)-Spiegeln neigen und hier eine mögliche, weitere Ursache für das hohe
kardiovaskuläre Risiko zu suchen ist. [Kronenberg F. et al, 1995, Kimak E. et al,
2002, Longenecker JC et al, 2005]
Um in der Frage der klinischen Bedeutung von Lipoprotein (a) weiterzukommen,
müssen Lp(a)-Konzentrationen systematisch gemessen werden, und darf wegen
des starken genetischen Einflusses der apo(a)-Größenpolymorphismus nicht
unberücksichtigt bleiben. Dafür ist eine Auftrennung der Isoformen mittels
Elektophorese notwendig. Die aufwendige, sogenannte Phänotypisierung mittels
Westernblot ist bis heute keine Routinemethode in Großlabors.
Um entsprechende Daten zu bekommen, musste zunächst an unserem Institut für
Nephrologie und Osteologie in Bamberg die Infrastruktur geschaffen und eine
praktikable Messmethodik entwickelt werden.
Es sollte herausgefunden werden, ob und welche Dialysepatienten höhere Lp(a)-
Spiegel haben und welche Rolle der Apo(a)-Größenpolymorphismus dabei spielt.
Ziel sollte es auch sein, einschätzen zu können, welche klinische Relevanz beim
Dialysepatienten von diesem Risikofaktor ausgeht.
Wenn bedeutsam, sollte die Methode es ermöglichen, entsprechende
Risikopatienten in Zukunft zu identifizieren.
-
2. Materialien
2.1. ELISA
Immunozym® Test-Kit, hergestellt von Immuno AG, Wien
Bestehend aus:
Puffer-Konzentrat 10fach konzentriert: Tris/HCl, pH 8, detergenshaltig
mit Stabilisatorprotein
5 Kalibratoren (Standards): lyophilsisiertes Humanserum
Kontrollseren „low level“ und „high level“ zur Richtigkeitskeitskontrolle,
Lyophilisiertes Humanserum
Konjugat Anti-Apo(a)-Fab-Peroxidase: polyklonale, monovalente Fab-
Fragmente vom Schaf, lyophilisiert
Substrat (Chromogen): Tetramethylbenzidin (TMB) in Ethanol/DMSO
Substratpuffer: Acetatpuffer, pH 5,0 mit Wasserstoffperoxid
Stopplösung: Schwefelsäure 2 mol/l
2.2. Phänotypisierung
„Lp(a) Phenotyping“- Reagenziensatz zur Phänotypisierung von Lp(a), hergestellt
von Immuno AG, Wien
Bestehend aus:
Anti Human Lp(a) Antikörper vom Schaf, lyophilisiert
Lp(a) Isoform Standard vom Menschen, lyophilisiert
Anti Schaf IgG (Fc)-alkalische Phosphatase-Konjugat vom Kaninchen,
lyophilisiert
Lp(a) Probenpuffer: 0,06 mol TRIS/HCl, pH 8,6, SDS 6%, Glycerin 5%,
Bromphenolblau 0,002%
Phosphataseentwickler 5-Bromo-4-chloro-3-indoxylphosphat,
Nitroblautetrazolium
-
2.3. Verwendete Einzelsubstanzen:
Mercaptoäthanol
TRIS (Trishydroxymethyl-aminomethan)
HCl
Nitroblautetrazolium
5-Bromo-4-chloro-3-indoxylphosphat
alle von Merck, Darmstadt:
Rinderalbumin 99 % , kristallin
von Genaxxon Bioscience, Ulm
Der im Phänotypisierungs-Kit enthaltene Phosphataseentwickler wurde teilweise
selbst hergestellt.
Zusammensetzung des Phosphataseentwicklers:
45 ml 0,1 mol TRIS-HCl, pH9,5
100 ul 2 mol MgCl2 (x 6 H2O)
5 ml 0,1 mol Nitroblautetrazolium in TRIS/HCl, pH 9,5
500 ul 0,1 mol 5 5-Bromo-4-chloro-3-indoxylphosphat, Na-Salz) in TRIS-
HCl, pH 9,5
2.4. Puffer
Die elektrophoretische Trennung von Substanzgemischen erfolgt bei einem genau
eingestellten pH-Wert und bei konstanter Ionenstärke des Puffers. Die Ionenstärke
des Puffers wird möglichst niedrig gewählt, dann sind der Anteil der Probeionen
am Gesamtstrom und damit ihre Wanderungsgeschwindigkeit genügend hoch. Die
Pufferionen werden während der Elektrophorese ebenfalls – wie die Probeionen-
durch das Gel transportiert: negativ geladenen zur Anode, positiv geladene zur
Kathode.
-
TBS-Puffer:
20 mmol/l TRIS/HCl 7,5
0,5 mol/l NaCl
Blockierpuffer:
TBS-Puffer + 3% Rinderalbumin
Waschpuffer:
TBS-Puffer + 1 % Rinderalbumin
Diffusionspuffer:
25 mmol/l TRIS
0,2 mol/l Glycin
20 % Methanol
Für die Aufrechterhaltung konstanter pH- und Pufferbedingungen müssen die
Volumina der Elektrodenpuffer-Vorräte genügend groß sein. Für die horizontalen
Trennsysteme wurden kommerziell erhältliche Gel-Pufferstreifen verwendet.
PhastGel® Pufferstreifen, hergestellt von Pharmacia, Uppsala, Schweden:
Gel Material 3% Agarose IEF, Puffer 0,20 M Tricin, 0,20 M TRIS, 0,55 % SDS,
Maße 10 x 41 x 6 mm
-
2.5. Gele
Gele wurden nicht selbst gegossen, sondern für das Elektrophoresesystem
PhastSystem® kommerziell erhältliche Mini-Gele mit Porengröße 4 – 15
verwendet:
PhastGel®: Polyacrylamidgel 4-15,
hergestellt von Pharmacia, Uppsala, Schweden
Puffer 112mM Acetat, 112 mM TRIS, pH 6,4, Maße 43 x 50 x 0,45 mm
Abb. 4 : Gele mit je nach Anwendung unterschiedlicher Porengröße sind kommerziell
erhältlich. Das Gel ist hauchdünn (0,45 mm) auf einer Kunsstoffplatte aufgetragen,
Luftdicht verpackt und gekühlt ist es mehrere Monate haltbar und steht im Labor
jederzeit zur Verfügung. Aufwändiges Gießen entfällt, die Qualität der Auftrennung
bleibt konstant.
-
2.6. Geräte und Hilfsmittel
PhastSystem®, Elektrophoreseeinheit von Pharmacia, Uppsala, Schweden
Abb. 5 : Elektrophoreseeinheit Phastsystem ®. Links erkennt man die horizontale
Trennkammer, die Platz für zwei Mikrogele bietet. Die Gele werden auf die konstant
temperierten weißen Flächen gelegt. Die gewünschten Untersuchungsbedingungen
können über die Menüsteuerung (in der Mitte) eingegeben werden. Für automatisierte
Direktfärbungen, die wir nicht benötigten, ist eine Färbekammer (rechts) vorgesehen.
MicroReader®, ELISA Auswertephotometer von MSE, Münster
pH-Meter, zumTitrieren der Pufferlösungen von PCE, Meschede
Trockenschrank von Thermo Scientific, Karlsruhe
Scanner ScanLide200 von Canon Inc, Japan
Pipetten von Eppendorf, Wesseling-Berzdorf
-
Petrischalen, Messzylinder, Reagenzgläser von Schott, Mainz
Küvetten von Sarstedt, Nürnbrecht
Nitrozellulose von Hofer, USA
Parafilm M von Brand, Wertheim
2.7. Probengewinnung und Lagerung
2.7.1. Patientenkollektiv
Zur Probengewinnung wurden 251 Patienten aus 3 verschiedenen Dialysezentren
rekrutiert. Das Blut wurde im Dialyezentrum vor Dialysebeginn im Rahmen der
Routinekontrollen abgenommen, zentrifugiert und das erhaltene Serum
tiefgefroren. Nach Transport in das Institut für Nephrologie und Osteologie in
Bamberg wurden die Proben bei – 21 °C gelagert . Die Rekrutierungsphase
erstreckte sich über 12 Monate.
In der Nachbeobachtungsphase über 5 Jahre wurden darüber hinaus Serumproben
bei inzwischen transplantierten Patienten gewonnen, die sofort bearbeitet wurden.
2.7.2. Kontrollgruppe
Als Kontrollgruppe wurden Patienten aus der osteologischen Ambulanz im
Klinikum Bamberg ausgewählt. Einschlusskriterien waren ein normales Serum-
Kreatinin sowie das Nicht-Vorhandensein einer diabetischen Stoffwechsellage.
Im Zeitraum von 12 Monaten konnten 82 Patienten rekrutiert werden.
Die Seren wurden im gefrorenen Zustand ins Institut für Nephrologie und
Osteologie transportiert und bei – 21 °C gelagert.
-
2.8. Software
Die Konzentrationsberechnung von Lp(a) erfolgte rechnergestützt mit
SYNELISA® von Elias Medizintechnik, Freiburg, Deutschland
Datenauswertung sowie sämtliche statistische Testverfahren wurden durchgeführt
mit SPSS ®, Version 16.0 Advanced von SPSS, Chicago, USA
Literaturrecherche und Archivierung wurde erleichtert durch
REFERENCE MANAGER ®, Professional Edition Version 11, von Thomson ISI
Research Software, New York, USA
Textverarbeitung erfolgte mit WORD® , Version 2002, von Microsoft,
Redmond, USA
-
3. Methoden
3.1. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
3.1.1.Testprinzip
Immunozym® Lp(a) ist ein Einschritt-ELISA nach dem Sandwich-Prinzip.
Vertiefungen der ELISA-Teststreifen sind mit monospezifischen, polyklonalen
Antikörpern gegen Apo(a) beschichtet. Verdünnte Proben werden zusammen mit
dem Konjugat inkubiert. Das Konjugat besteht aus einem monospezifischen,
gegen Apo(a) gerichteten Fab-Fragment, das mit Peroxidase gekoppelt ist (Anti-
Apo(a)-Peroxidase-Konjugat). Während der Inkubationszeit werden Lp(a)-
Partikel und freies Apo(a) an die Festphase gebunden und gleichzeitig durch das
Konjugat markiert. Unspezifische Probenbestandteile und ungebundenes
Konjugat werden in einem Waschschritt entfernt. Im zweiten Inkubationsschritt
erfolgt die Substratreaktion, die durch anschließende Zugabe von Schwefelsäure
gestoppt wird. Die jetzt entstandene Farbentwicklung ist der Lp(a)-Konzentration
der Probe direkt proportional. Bei einer Wellenlänge von 450 nm wird die
Extinktion in einem ELISA-Reader (Vertikalphotometer) gemessen. Über eine
Bezugskurve wird die Lp(a)-Konzentration in der Probe quantitativ bestimmt.
3.1.2. Testdurchführung
Vor Beginn werden alle Testkomponenten auf Raumtemperatur gebracht (ca. 23
°C). Aus dem Puffer-Konzentrat wird durch Verdünnung mit Aqua dest. im
Verhältnis 1:9 der Arbeitspuffer hergestellt. Der Arbeitspuffer wird anschließend
benötigt, um die mitgelieferten Kalibratoren und Kontrollproben zu
rekonstituieren. Jeweils 200 ul Pufferlösung wird mit den Kontroll- und
Kalibrator-Lösungen 15 min. inkubiert und anschließend vermischt.
Kalibratoren, Kontrollen und Patientenproben müssen jetzt weiter verdünnt
werden. 5000 ul Arbeitspuffer wird vorgelegt und 10 ul Probe, Kontrolle und
Kalibrator dazupipettiert (1:500) und gemischt.
-
Als nächstes wird die Konjugat-Stammlösung hergestellt. 1,3 ml Arbeitspuffer
werden 15 min.mit dem lyophilisierten Konjugat rekonstituiert. Die im Test
verwendete Konjugatlösung ist eine mit Arbeitspuffer verdünnte Stammlösung im
Verhältnis 1:10.
Im Testkit enthalten sind Teststreifen mit jeweils 8 Testvertiefungen, die
beschichtet sind mit affinitätsgereinigtem, monospezifischen, polyklonalen Anti-
Apo(a)-Antikörper vom Schaf.
In diese Testvertiefungen wird nun 100 ul Konjugat-Lösung vorpipettiert. Pro 8er
Teststreifen werden 100 ul der 2 verdünnten Kalibratoren, der verdünnten
Kontrollen und verdünnten Patientenproben zügig dazupipettiert. Die Teststreifen
werden mit der mitgelieferten Klebefolie abgedeckt. Bei Raumtemperatur
inkubieren die Ansätze 120 min.
Die Vertiefungen werden anschließend mit jeweils 2 x 200 ul Arbeitspuffer
ausgewaschen. Nach dem letzten Waschvorgang werden die Vertiefungen
leergesaugt und durch Klopfen auf saugfähigem Papier getrocknet.
Im nächsten Schritt wird die Substratreaktion eingeleitet durch Hinzupipettieren
von 200 ul Substratlösung in die Testvertiefungen. Der Teststreifen wird erneut
mit Folie abgeklebt. Die Inkubationszeit beträgt jetzt bei Raumtemperatur nur 30
min. Die Komplexbildung wird abgebrochen durch Zugabe von jeweils 50 ul
Stopplösung (Schwefelsäure 2 mol/l).
Die jetzt entstandene Trübung kann genutzt werden zur
Konzentrationsbestimmung mit einem Photometer. Die Messung erfolgt innerhalb
von 10 min. nach Stoppen der Reaktion mit einem Vertikalphotometer
(MicroReader®) bei 450 nm Wellenlänge.
Da die ermittelte optische Dichte direkt proportional zur Lp(a)-Konzentration der
mitgelaufenen Kalibratoren ist, können die Lp(a)-Serumspiegel der
Patientenproben über die ermittelte Standardgerade berechnet werden.
-
3.1.3. Konzentrationsbestimmung mittels Spline-Approximation
Die Konzentrationsbestimungen erfolgen softwaregestützt über eine sog. Spline-
Approximation. Dabei handelt es sich um ein mathematisches Verfahren, bei dem
über mindestens 4 bekannte Punkte einer Kurve der Kurvenverlauf
annäherungsweise bestimmt werden kann. In unserem speziellen Fall, wird über
bekannte Lp(a) – Konzentrationen in Standardlösungen die Lp(a)-Konzentration
der Probe ermittelt. Die Messung der Standardlösung dient dabei auch der
Qualitätskontrolle der Messung insgesamt.
3.2. Phänotypisierung
3.2.1. Testprinzip
Lp(a) ist eine Plasmafraktion, die LDL und eines, möglicherweise zwei Kopien
eines hoch glykosilierten Antigens Apo(a) enthält, das an Apo B 100 durch
Dislfidbrücken gebunden ist. Nach Reduktion der Plasmaproben und damit Lösen
der Disulfidbrücke werden die Lp(a)-Isoformen entsprechend ihrem
Molekulargewicht in einem 4-15 % Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt.
Die so getrennten Proteine werden auf Nitrozellulosemembranen transferiert.
Nach Blockieren der freien Reaktionsstellen wird als 1.Antikörper ein
polyklonaler Anti Lp(a) Antikörper vom Schaf an die jeweiligen Apo(a)
Isoformen gebunden. Nach Auswaschen des überschüssigen 1.Antikörpers wird
als 2.Antikörper ein Anti Schaf IgG, welches mit alkalischer Phosphatase
konjugiert ist, an den 1.Antikörper gebunden und anschließend mit Substrat
behandelt, bis die Banden sichtbar werden.
-
3.2.2. Testdurchführung
3.2.2.1. Probenvorbereitung
Der Lp(a) Probenpuffer wird auf Raumtemperatur gebracht. Durch gelegentliches
Schütteln wird das SDS aufgelöst. Es wird ein Standardansatz hergestellt aus 10
ul Serumprobe bzw. Standardlösung, 85 ul Probenpuffer und 5 ul
Mercaptoäthanol. Zur Reduktion der Proben inkubiert man den Reaktionsansatz in
den verschlossenen Küvetten für 10 min. bei Raumtemeperatur.
3.2.2.2. Elektrophorese
Für die elektrophoretische Auftrennung der Lp(a)-Isoformen steht die
Elektrophoreseeinheit PhastSystem® von Pharmacia zur Verfügung. Für dieses
System sind kommerziell erhältliche SDS-Agarose-Gelplatten erhältlich in
unterschiedlichen Graduierungen, je nach Einsatzgebiet. Für Lipoprotein (a) wird
der Typ 4-15 benötigt. Die Gele sind auf quadratischen Kunststoffrägern in einer
45 mm dünnen Schicht aufgetragen und werden luftdicht verpackt, gekühlt
geliefert.
Die Elektrophorese läuft unter Standarbedingungen ab und am Gerät über
entsprechende Menüführung eingestellt werden:
Umax = 250 V
Imax = 10 mA
Pmax = 3 W
Temperatur + 15 °C
Laufzeit ca. 70 min., nach Erreichen von 200 VAh
Das Gerät gibt ein akustisches Signal, wenn der Boden der Trennkammer, auf
den die Gele aufgelegt werden, die erforderlichen 15 °C erreicht hat . Erst dann
kann die Elektrophorese in Gang gesetzt werden. Eine versehentliche
Denaturierung der stark thermolabilen Proteine wird so sicher verhindert.
-
In speziellen Aussparungen an der Kathoden- und Anodenseite werden die
ebenfalls gekühlten Pufferblöcke eingebracht.
Nach erfolgreicher Gerätevorbereitung müssen die Proben auf das Gel
aufgetragen werden. Hierfür werden vom Hersteller entsprechende Utensilien zur
Verfügung gestellt, die den Vorgang vereinfachen und Fehlerquellen weitgehend
minimieren.
Auf einer Kunststoffschablone mit 8 Vertiefungen wird ein Paraffinfilm geprägt,
der die Kontur der Schablone annimmt. In die Vertiefungen des Films werden 2 ul
der in 3.2.2.1. beschriebenen Probenansätze hineinpipettiert. Da die
Identifizierung der Isoformen später nur über einen mitgelaufenen Standard
erfolgen kann , läßt man 3 Standards mitlaufen in Nachbarschaft zu den
Patientenproben. In die 8 Vertiefungen werden die Proben und Standards nach
folgendem Muster hineinpipettiert:
1 2 3 4 5 6 7 8
Patient Standard Patient Patient Standard Patient Standard Patient
Für die Übertagung der Proben stehen kleine Kunsstoffapplikatoren zur
Verfügung, die an der Unterseite Zähnchen haben im Abstand der mit den Proben
gefüllten Vertiefungen. Der Applikator wird über den Proben ausgerichtet und die
Oberfläche vorsichtig berührt. Die Kapillaren des Probenapplikators füllen sich.
Anschließend wird der Applikator an der Elektrophoreseeinheit an der
Anodenseite über eine Führungschiene vertikal eingeschoben. So ist ein optimale
Ausrichtung und Kontakt zur Geloberfläche gewährleistet.
-
Abb. 6 : Für den exakten Auftrag der Proben stehen Kunsstoffapplikatoren zur
Verfügung, deren Zähnchen an der Unterseite in vorpipettierte Vetriefungen eingetaucht
werden. Eine klar definierte Menge der Probenlösung bleibt hängen und wird durch
Kapillarkräfte angesaugt. Die Applikatoren können vertikal in die Trennkammer
eingeschoben werden und haben Kontakt zur Geloberfläche, in die die Probenlösung
dann diffundieren kann.
Der Deckel der Trennkammer wird geschlossen und der Elektrophoresevorgang
gestartet.
Nach etwa 70 min. sind die 200 VAh erreicht und kann der Vorgang beendet
werden.
Was jetzt folgt, ist der diffizilere Schritt der Übertragung auf eine
Nitrozellulosemembran, das sog. Blotting.
Hier gab es zwei methodische Alternativen: Erstens das sog. Elektroblotting, bei
dem nach horizontaler Auftrennung die Proteinübertragung auf die
Nitrozellulosemembran durch eine Plattenelektrode in vertikaler Richtung erfolgt.
Diese Methode hatten wir zunächst favorisiert, da wir uns eine höhere
„Proteinausbeute“ und somit qualitativ bessere Ergebnisse erhofften.
In mehreren Versuchsreihen kam es zu starken Artefaktbildungen mit verzerrten
und verschobenen Bandenmustern. Die Ergebnisse waren nicht brauchbar und die
Methode wurde verlassen.
-
Zuverlässiger funktionierte das sogenannte Diffusionsblotting, bei dem eine
Nitrozellulosemembran auf das Gel aufgelegt und in einer feuchten Kammer bei
ca. 75 °C inkubiert wird.
3.2.2.3. Diffusionsblot
Nach erfolgter Elektrophorese wird eine Nitrozellulosemembran kurz in
Diffusionspuffer eingetaucht und auf das Gel aufgelegt. Es stehen kommerzielle
verschließbare Plastikschachteln zu Verfügung, in die das „Sandwich“
hineingelegt werden kann. Die Gele bzw. die Membranen trockneten zu stark und
die Übertragungsergebnisse waren nicht zufriedenstellend. Bessere Erfahrungen
haben wir mit Petrischalen gemacht, die wir mit handelsüblicher Frischhaltefolie
luftdicht verschlossen haben. Gibt man noch einige Tropfen Diffusionspuffer
hinzu, hat man eine perfekte feuchte Kammer und ein Austrocknen wird sicher
verhindert.
Die Prozedur sollte 45 – 50 Minuten bei 75 °C im Trockenschrank durchgeführt
werden. Danach muß die Nitrozellulosemembran 1 Stunde mit Blockierpuffer
behandelt werden.
3.2.2.4. Inkubation mit 1.Antikörper
Das Fläschchen mit dem Antikörper gegen humanes Lp(a) wurde nach
Anweisung rekonstituiert. Das erhaltene Lyophilsat muß in Waschpuffer im
Verhältnis 1 : 500 verdünnt werden. Für eine Membran empfiehlt es sich 40 ul
Antikörperlösung mit 20 ml Waschpuffer in einer Petrischale zu vermischen. Aus
Kostengründen hatten wir eine Versuchsreihe mit halber Antikörpermenge
gestartet, die jedoch insbesondere bei Proben mit geringer Lp(a)-Konzentration zu
unbrauchbaren Ergebnissen führte.
Die Membran wird in die mit Antikörperlösung befüllte Petrischale gelegt und auf
dem Probenmischer ca. 1 Tag lang inkubiert. Nach Herstellerangabe liegt die
minmale Inkubatioszeit bei 2 Stunden. Für eine optimale Qualität lohnt es aber,
sich bei diesem Schritt Zeit zu nehmen.
-
Am Folgetag wird die Membran in einer neuen Petrischale mit je 20 ml
Waschpuffer für 2 mal 10 Minuten gewaschen. Die restlichen freien Antikörper
sind damit entfernt.
.
3.2.2.5. Inkubation mit 2.Antikörper
Der am Lp(a) haftende 1.Antikörper vom Schaf muß jetzt markiert werden durch
einen 2.Antikörper. Die rekonstituierte Lösung mit dem Anti Schaf IgG (Fc), an
den auch die alkalische Phosphatase für die spätere Farbreaktion gebunden ist,
wird wie im Schritt zuvor zunächst mit Waschpuffer auf 1 : 500 ml verdünnt. Dies
entspricht, wie oben, 40 ul Antikörperlösung in 20 ml Waschpuffer. In dieser
Lösung wird die Nitrozellulosemembran für 1 Stunde inkubiert. Es folgt ein
Waschgang über 10 Minuten mit Waschpufferlösung. Bevor die Membran
entwickelt werden kann, wird sie äqulibriert mit TRIS-Puffer bei einem pH von
9,5.
3.2.2.6. Substratreaktion
Im Bestimmungs-Kit des Herstellers werden 10 Fläschchen des
Phosphataseentwicklers mitgeliefert. Nach Aufbrauchen der Entwicklerlösung
war stets Antikörperlösung übrig, die weitere Probenbestimmungen möglich
machten. Wir gingen dazu über, die Entwicklerlösung auch selbst herzustellen
(siehe dazu Punkt 2.1.).
Der pulverisierte Phosphataseentwickler wird im Fläschchen nach Vorschrift mit
2 ml Aqua dest. rekonstituiert und anschließend mit Aqua dest. auf insgesamt 20
ml verdünnt. Wie bereits beim 1.Antikörper, lohnt es sich auch hier nicht, aus
Kostengründen Material zu sparen und es mit niedrigeren Konzentrationen zu
probieren. Mehr Phosphataseentwickler bringt eine bessere Absättigung der
Bindungsstellen und somit bessere Färbeergebnisse. In der Regel reichen 15 – 30
min. Bad in der Lösung, bis Banden sichtbar werden. Nach fast zwei Tagen Arbeit
ist dies der entscheidende Moment, der zeigt, ob man korrekt gearbeitet hat.
-
Die Membranen werden in reichlich Aqua dest. 3 mal für je 5 – 10 min.
gewaschen und anschließend an der Luft getrocknet. Zum Schutz und zur
Archivierung werden sie in verglaste Diarähmchen eingespannt.
3.2.2.7. Auswertung der Nitrozellulosemembranen
Die mitgelieferten Standards sind der Anhaltspunkt für die qualitative Beurteilung
der entwickelten Nitrozellulosemembran. Alle 5 Standardbanden müssen sichtbar
sein. Wünschenswert und eine Auswertung erleichtert es, wenn die Banden
weitgehend parallel ausgerichtet sind. Die ermittelten Banden können so den
Standards zugeordnet werden. Grundlage für die Auswertung bildet die
Nomenklatur nach G.Utermann. Banden die in der Position von Apo B 100 zu
Liegen kommen werden als B bezeichnet.. Formen, die auf Grund ihres größeren
Molekulargewichts verzögert wandern, liegen kathodenwärts und werden mit S1,
S2, S3, S4 usw. bezeichnet (S für „slow“). Niedermolekulare Formen, die leichter
als die der entsprechenden B-Bande sind, kommen anodenwärts zu liegen und
werden als F1, F2 usw. bezeichnet ( F für „fast“).
-
+
_
Abb. 7: Die Abbildung zeigt den Phänotyp der mitlaufenden Standardlösung mit den
Isoformen S4, S3, S2, S1 und F. Die langsamste Isoform S 4 („slow“) kommt
kathodennah (-) zur Darstellung, die schnellste, sog. F-Bande („fast“) wandert am
weitesten anodenwärts (+). Die Banden der Standardlösung bilden die Referenzpunkte für
die Bestimmung der apo(a)-isoformen in den Proben
Die Auswertung erfolgt rein visuell und qualitativ. Ein Problem ist die kleine
Größe der Membranen von etwa 4 cm und entsprechend kurze Wanderstrecke der
Banden von max. 8 mm. Abfotografieren und Abscannen der entwickelten
Bandenmuster mit entsprechenden Vergrößerungs- und
Nachbearbeitungsmöglichkeiten erleichtert die Arbeit.
Neben der rein qualitativen Auswertung versuchten wir eine quantitative
Bestimmung aus der Dichte bzw. Fläche der Bande abzuleiten. Hierzu musste die
Nitrozellulosemembran transparent gemacht werden um mit Durchlicht-Scanning
arbeiten zu können, wie man es von anderen Elektrophoresemethoden kennt. Die
Nitrozellulosemembran wird dabei mit einigen Tropfen Polymerlösung zwischen
-
zwei passend geschnittene PVC-Folien gelegt. Dieses Sandwich wird mit einer
UV-Lampe für wenige Sekunden bestrahlt, was die Polymerisation einleitet. Die
Membran wurde transparent, allerdings litt die Qualität der Proteinbanden
deutlich unter dieser Methode, sodaß wir Durchlicht-Scanning nicht weiter
anwendeten .
3.3. Statistische Verfahren
Die Datenauswertung erfolgte softwaregestützt.
Daten unverbundener Stichproben wurden geprüft mit dem Mann-Whitney U-test
und Chi-Quadrat-test. Verbundene Stichproben wurden geprüft mit dem
Wilcoxon-Test. Korrelationen wurden berechnet mit dem bivariaten Test nach
Pearson. Es wurden Überlebensanalysen nach Kaplan-Meier durchgeführt sowie
ein multivariates Rechenmodell angewandt mittels Cox - Regressionsanalyse.
-
4. Ergebnisse
4.1.Statistische Basisdaten
In die Untersuchung eingegangen sind 251 Dialysepatienten aus 2 ambulanten
Dialyseeinrichtungen und 1 Kliniksdialyse. Als Kontrollgruppe fungierten 82
nierengesunde Nicht-Diabetiker aus einer osteologisch/rheumatologisch
orientierten Kliniksambulanz.
Die Geschlechterverteilung war in der Kontrollgruppe ausgewogen (43 Frauen vs.
39 Männer, entsprechend 52,4 % vs. 47,6 %), in der Dialysegruppe waren die
Männer in der Überzahl (165 Männer vs. 86 Frauen . bzw. 65,7 % vs. 34,3 % ),
repräsentativ für die Situation bei terminal Niereninsuffizienten im allgemeinen.
Das mittlere Alter lag in der Patientengruppe bei etwa 57 Jahren, in der
Kontrollgruppe bei etwa 55 Jahren.
In der folgenden Übersicht sind die Daten zu Alters- und Geschlechtverteilung
nochmals detailliert dargestellt.
Dialysepatienten Kontrollen
165 Männer 86 Frauen 39 Männer 43 Frauen
27 – 89 Jahre 24 – 83 Jahre 18 – 77 Jahre 28 – 77 Jahre
56,71 (57,0)
2 Jahre 57,2 (61,0) Jahre 50,4 (56,0) Jahre 61,4 (64,0) Jahre
1Mittelwert, 2 Median
Tabelle 1: Basisdaten über Alters- und Geschlechterverteilung in der Patienten- und
Kontrollgruppe
Die Gruppe der terminal Niereninsuffizienten bestand aus 210 Hämodialyse-
(83,7 %) und 41 Peritonealdialysepatienten (16,3 %). Die Spanne der
Behandlungsdauer betrug 1 Monat bis etwa 17 Jahre, im Mittel waren die
Patienten zum Zeitpunkt der Blutentnahme 3 Jahre an der Dialyse.
-
Bei den zugrunde liegenden Grunderkrankungen machten die chronischen
Glomerulonephritiden etwa ein Drittel des Patientengutes aus. Die diabetische
Nephropathie war mit rund 20 % Anteil vergleichsweise gering vertreten.
Zusammen mit den anderen Erkrankungen ergab sich ein heterogenes
Patientengut, vergleichbar mit dem anderer Dialyseeinrichtungen.
Aufgrund des Metabolismus und Struktur von Lipoprotein (a) spielen
Komorbiditäten möglicherweise eine Rolle. Nach Aktenlage wurden Diabetiker
und Leberzirrhotiker identifiziert. Von Interesse waren insbesondere auch
Patienten mit bereits klinisch manifester Arteriosklerose. Als Kriterium galten
hier ein durchgemachter Herzinfarkt oder Schlaganfall, aber auch bereits
bestehende, hämodynamisch relevante duplexsonographische und
angiographische Befunde an Carotiden, Coronarien und Beinarterien.
Behandlungsart:
Hämodialyse 83,7 % (n = 210)
Peritonealdialyse 16,3 % (n = 41)
Mittlere Behandlungsdauer (Spannbreite) 36 Monate (1 – 201)
Grunderkrankungen :
Chronische Glomerulonephritis 34,7 % (n = 87)
Diabetische Nephropathie 19,5 % (n = 49)
Chronisch interstitielle Nephritis 12,0 % (n = 30)
Refluxnephropathie 5,6 % (n = 14)
Zystische Nierendegeneration 7,2 % (n = 18)
Hypertensiv-vaskuläre Genese 6,0 % (n = 15)
Z.n. Akutem Nierenversagen 2,8 % (n = 7)
Malignom 1,6 % (n = 4)
Unklare Ursache 10,8 % (n = 27)
Komorbiditäten: ja nein
Diabetes mellitus 20,3 % (n = 51) 79,7 % (n = 200)
Klinisch manifeste Arteriosklerose1 42,2 % (n = 106) 57,8 % (n = 145)
Leberzirrhose 11,9 % (n = 30) 88,1 % (n = 221)
Tabelle 2: Kinische Basisdaten der Patientengruppe.
1) erfaßt wurden alle durch Akutereignisse oder angiographisch gesicherten Gefäßschäden wie KHK, pAVK und Carotisstenose
-
4.2. Experimentelle Optimierung der Methodik
Mit zunehemendem Interesse an der Bestimmung von Lipoprotein (a)-Spiegeln,
stieg auch das Angebot an kommerziell erhältlichen Untersuchungs-Kits. Am
Institut für Nephrologie und Osteologie verfügten wir bereits über einen
Nephelometer, mit dem u.a. verschiedene tubuläre Proteine schnell und einfach
bestimmt werden konnten. Es lag nahe , dieses automatisierte Verfahren auch für
die Lp(a)-bestimmung zu nutzen.
Die Firma Immuno hatte zum Zeitpunkt unseres Untersuchungsbeginns zwei
interessante Bestimmungs-Kits auf den Markt gebracht. Einerseits den
Reagenziensatz Immunoleia® zur nephelometrischen Bestimmung mittels
Immunpräzipitation und andererseits Immunozym®, ein sogenannter Einschritt-
ELISA nach dem Sandwich-Prinzip.
In einer Testreihe aus 50 zufällig ausgewählten Dialysepatienten führten wir
Mehrfachmessungen durch zum Vergleich der Methoden untereinander und
Überprüfung der Präzision innerhalb der Methode.
Immunozym® ist in der Lage, auch sehr niedrige Lp(a)-Konzentrationen unter 5
mg/dl zu messen. Die Nachweisgrenze von Immunoleia® lag aufgrund der
mitgelieferten Standards bereits bei 12,1 mg/dl. 60 % Patienten lagen unter
diesem Wert, sind einer exakten Bestimmung so nicht mehr zugänglich.
Es wurden Wiederholungsmessungen durchgeführt, nachdem die Proben erneut
eingefroren und aufgetaut worden waren. Bei beiden Untersuchungsmethoden
zeigte sich bedingt durch die Thermolabilität des Lipoproteins erwartungsgemäß
ein Trend zu niedrigeren Meßwerten im 2.Testlauf. Beim Immunozym® waren
64 % der Meßwerte niedriger als beim ersten Durchgang, die maximale
Abweichung betrug 34 %, die durchschnittliche – 12 % . 26 % lagen beim zweiten
mal höher, die maximale Abweichung betrug 41 %, die mittlere + 14 %. Beim
Immunoleia® konnten in der Wiederholungsmessung Werte unter 12,1 mg/dl
allesamt bestätigt werden. Die 30 Patienten mit höheren Lp(a)-Spiegeln hatten in
83 % der Fälle niedrigere Meßwerte im 2.Durchgang, maximale Abweichung –
24 %, mittlere – 11 %.
-
Bei beiden Meßmethoden wird klar, daß es sich nicht um eine absolute Methode
handelt, da es teils erhebliche Abweichungen in den Meßwerten gibt. Die
Präzision bei mehrfach verwendeten Proben ist schlecht. Die Entscheidung, den
ELISA zu verwenden, begründete sich dadurch, häufig auftretende niedrige
Lp(a)-Spiegel genau zu erfassen. Der ELISA efordert allerdings mehr manuelles
Arbeiten und unterliegt einer gewissen Lernkurve. Durch Übungseffekte konnte
die Genauigkeit der Methode aber deutlich verbessert werden, wie der Abgleich
mit den mitgelieferten Standards später zeigte. Der Thermolabilität gerecht
wurden wir, indem wir Proben nur quantitativ bestimmten, wenn sie erstmalig
aufgetaut wurden. Die Abweichungen zum Standard überschritten in den
Meßreihen nie mehr als 10 %
Aber auch die qualitative Bestimmung (Phänotypisierung) hielt Fallstricke bereit.
Alternativ zum letztlich verwendeten Diffusionsblot (siehe 3.2.2.3) kam ein
Elektroblotverfahren versuchsweise zum Einsatz, bei dem die Proteinübertragung
durch Anlegen einer Spannung an Plattenelektroden unterstützt wird. Von der
Theorie her sollte die Proteinausbeute dadurch verbessert werden. In unseren
Versuchsreihen zeigten sich jedoch gehäuft Artefakte mit duplizierten oder
verzogenen Bandenmustern, die eine Auswertung unmöglich machten.
Problematisch erwies sich auch das hier notwendige Entfernen des Gels vom
Kunststoffträger mit einem dünnen Draht. Das während der Elektrophorese
gekühlte Gel wird relativ spröde und reißt leicht ein. Die Ausfallquote war schon
rein wirtschaftlich nicht zu vertreten, weitere Experimente in dieser Richtung
wurden nicht fortgeführt.
Mit dem Diffusionsblot umgeht man diese Probleme, da das Gel selbst auf dem
Kunsstoffträger liegen bleiben kann. Die Blotting-Resultate waren jedoch nicht
von Anfang an überzeugend. Wir identifizierten mehrere Gründe und konnten
durch Modifizierung des Verfahrens die Ergebnisse deutlich verbessern.
Das Milieu in der Blottingkammer darf nicht zu trocken sein. Die kommerziell
erhältlichen Kunststoffkassetten schließen oft nicht optimal. Mit herkömmlicher
Cellophan-Haushaltsfolie verschlossene Petrischalen waren die bessere
Alternative.
-
Um zusätzliche Feuchtigkeit in die Blottingkammer zu bekommen, gibt man ein
bis zwei Tropfen Diffusionspuffer hinzu. Die Nitrozellulosemembran sollte dann
auf ein kleines quadratisches Podest gelegt werden, damit es nicht im Puffer
schwimmt, sonst kann es zu unerwünschten Verdünnungseffekten kommen.
Bei Verwendung der Reagenzien zahlt sich Großzügigkeit aus. Ausreichende
Antikörpermenge und eine ausreichende Inkubationszeit ist zu beachten. Die in
der Literatur vorgeschlagenen 2 Stunden sind als Minimalanforderung zu sehen,
gemessen an den Resultaten erscheint uns der Zeitraum zu kurz, besser ist
Inkubieren des 1.Antikörpers über Nacht. Darüberhinaus sollte reichlich
Phosphataseentwickler verwendet werden, den man in beliebiger Menge leicht
selbst herstellen kann. Dadurch erfolgt eine bessere Substratabsätigung. Dies führt
einerseits zu brillianteren Ergebnissen, was die Auswertung erleichtert, und
bringt eine Verbesserung der Sensitivität des Verfahrens.
Hatten wir anfangs Probleme, Phänotypen bei Patienten mit Lp(a) < 10 mg/dl
darzustellen, konnten wir durch methodische Optimierung die Nachweisgrenze
auf etwa 5 mg/dl senken.
4.3. Bestimmung der Lp(a) Serumspiegel
4.3.1. Vergleich der Dialysepatienten mit den Kontrollen
Aus oben erläuterten Gründen wurden zunächst rein quantitativ die Lipoprotein
(a) – Spiegel aus den 251 Patienten – und 82 Kontrollproben bestimmt. Zur
Anwendung kam das in Punkt 3.1 beschriebene ELISA-Verfahren. Die Trübung
der Probenlösung führt zu einer der Lp(a)-Konzentration proportionalen
Extinktion.
Aus der photometrisch ermittelten Extinktion der Standardlösungen wurden
softwaregestützt die Lp(a)-Konzentrationen der Patientenproben berechnet.
Mathematisch geschieht dies über eine sog. Spline-Approximation, bei der über
bekannte Punkte einer Kurve die restlichen Punkte der Kurve annäherungsweise
bestimmt werden können.
-
Standardlösungen enthalten bekannte Lp(a)-Konzentrationen. Die Bestimmung
dieser dient somit auch der Qualitätskontrolle der Meßmethodik.
Abb. 8 : Datenblatt zur Ermittlung des Zusammehangs zwischen photometrisch
ermittelter Extinktion (Y-Achse) und Lp(a)- Konzentration (x-Achse). Aus den
Meßpunkten der Standardlösungen wird der Kurvenverlauf annäherungsweise bestimmt.
Die Abweichungen der eigenen Messungen lagen bei 3,5 – 10,3 %.
-
Abb. 9 : Datenblatt, das exemplarisch das Resultat einer Meßreihe mit insgesamt 43
Patienten zeigt. Aus den Extinktionen der Standardlösungen (gesamte Spalte 1 und Spalte
2 feld A und B) mit bekannter Lp(a)-Konzentration werden die Lp(a) Konzentrationen
softwaregestützt berechnet und angezeigt (im Feld Patientennummer, darunter Extinktion,
darunter Lp(a)-Konzentration)
In beiden Gruppen fiel eine hohe Variabilität der Lp(a)-Konzentrationen auf
ohne Unterschied im erreichbaren Maximum.
In der Patientenprobe lagen die Messwerte zwischen 0 – 118,4 mg/dl, in der
Kontrollgruppe zwischen 0 – 119,5 mg/dl.
Beiden gemeinsam ist die schiefe Verteilung mit starker Tendenz zu niedrigeren
Lp(a) – Konzentrationen. 75 % der Messwerte in der Patientengruppe liegen unter
37,0 mg/dl vs. 32,85 mg/dl bei den Kontrollen. Die als Grenzwert angesehenen
30 mg/dl werden in der Patientengruppe lediglich in 31,5 % der Fälle überboten,
in der Kontrolle immerhin noch in 25,6 % der Fälle.
-
Der Mittelwert bei den Dialysepatienten lag bei 25,55 mg/dl vs. 22,28 mg/dl, der
Median bei 13,05 mg/dl vs. 8,15 mg/dl. Der Unterschied erreicht kein
Signifikanzniveau. (p = 0,32).
Dialysepatienten Kontrollen
N 251 82
Mittelwert 25,55 mg/dl 22,28 mg/dl
Median 13,05 mg/dl 8,15 mg/dl
Standardabweichung 27,46 mg/dl 25,05 mg/dl
Varianz 754,18 627,54
Schiefe 1,44 1,559
Kurtosis 1,29 2,01
Minimum 0 mg/dl 0 mg/dl
Maximum 118,4 mg/dl 119,5 mg/dl
Percentile25 5,18 mg/dl 5,88 mg/dl
Percentile 50 13,05 mg/dl 8,15 mg/dl
Percentile 75 37,00 mg/dl 32,85 mg/dl
Tabelle 3: Lp(a)-Konzentrationen bei Dialysepatienten und Kontrollen: Statistische
Basisdaten. Die Kontrollgruppe unterscheidet sich im Mittelwert nur wenig von der
Patientengruppe. Auch die Variabilität und Verteilung der Meßwerte sind im Grundsatz
vergleichbar. Ein Trend zu höheren Lp(a)-Spiegeln in der Patientengruppe ist dennoch
erkennbar
Graphik 1: Prozentuale Verteilung der Lp(a)-Konzentrationen (in mg/dl) bei Patienten
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0110,0
Lp(a) Konzentration
0%
5%
10%
15%
20%
25%
Pro
zen
t
-
Graphik 2 : Prozentuale Verteilung der Lp(a)-Konzentrationen (in mg/dl) bei den
Kontrollen
Bei beiden Kollektiven (Patienten, siehe Graphik 1 und Kontrollen) zeigt sich die schiefe
Verteilung mit klarer Tendenz zu niedrigeren Lp(a)-Spiegeln.
4.3.2. Subgruppenanalyse
Von besonderem Interesse war die Frage, ob sich innerhalb der Patientengruppe
Subgruppen herauskristallisieren, die durch erhöhte Lipoprotein (a) –Spiegel
auffallen.
Vor dem Hintergrund der entsprechenden Grunderkrankung unterscheiden sich
lediglich die Diabetiker im Niveau des Lp(a) – Spiegels signifikant vom Rest der
Patienten (Mittelwert 35,33 mg/dl vs. 24,51 mg/dl, p = 0,02*).
Patienten mit anderen nephrologischen Grunderkrankungen, insbesondere
Glomerulonephritiden, unterscheiden sich nicht wesentlich von den Kontrollen.
Eine bereits klinisch relevant gewordene Arteriosklerose korrespondiert mit
erhöhten Lipoprotein (a) –Spiegeln, im Mittel 30,08 mg/dl im Vergleich zu
22,25 mg/dl bei klinisch unauffälligen Patienten (p = 0,03* ).
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0110,0
Lp(a) - Konzentration
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
Pro
zen
t
-
Betrachtet man Diabetiker ohne dokumentierte Gefäßkomplikationen (n = 29),
unterscheiden sich diese aber nicht vom Normalkollektiv .
(Mw 22,0 mg/dl vs 22,3 mg/dl)
Patienten mit bestehendem Leberparenchymschaden ( n = 30 ) haben mit einem
Mittelwert von 18,48 mg/dl tendentiell den niedrigsten Lipoprotein (a) – Spiegel,
wenn auch nicht auf Signifikanzniveau (p = 0,13) .
Beim Vergleich der Dialyseverfahren zeigen sich tendentiell höhere Werte bei der
Peritonealdialyse (Mw 31,37 mg/dl) im Vergleich zur Hämodialyse (24,42 mg/dl),
p = 0,14.
Etwa die Hälfte des Patientenkollektivs dialysierte zum Zeitpunkt der
Probengewinnung länger als drei Jahre. Veränderungen der Lipoprotein (a) –
Spiegel in Abhängigkeit der Behandlungsdauer waren nicht abzuleiten.
Subgruppe Mittelwert SD Median Signifikanzniveau p < 0,05
Kontrolle (n = 82) 22,28 27,46 13,05 Grundkrankheit Chron. Glomerulonephritis (n = 87) 21,43 24,26 12,10
Diabetes mellitus (n = 49) 35,33* 35,30 21,15 vs. Kontrolle
andere (n = 115) 24,51 25,10 13,05
Dialyseverfahren Hämodialyse (n = 210) 24,42 26,55 11,76 P = 0,11 vs PD.
Peritonealdialyse (n = 41) 31,37 31,44 20,38 P = 0,09 vs Kontrolle
Behandlungsdauer. ≤ 36 months
(n = 125)
27,91 30,70 13,87
Behandlungsdauer. > 36 months
(n = 126)
23,21 23,72 12,10
Komorbiditäten Apparente Arteriosklerose (n = 106) 30,08 * 29,18 18,09 vs Kontrolle
Leberzirrhose (n = 30) 18,48 20,21 7,27 P = 0,14 vs übrige Patienten
Tabelle 4: Übersicht über Lp(a)-Spiegel als Subgruppenanalyse. Lediglich Diabetiker
und Patienten mit manifester Arteriosklerose unterscheiden sich im Lp(a)-Niveau
signifikant von der Kontrollgruppe. Peritonealdialysepatienten scheinen im Vergleich zu
HD-Patienten zu höheren Lp(a)-Spiegeln zu tendieren
-
4.3.3. Lp(a) – Spiegel in Abhängigkeit von Alter und Geschlecht
Im Gesamtkollektiv haben Frauen signifikant höhere Lp(a) –Spiegel als Männer,
Mittelwert 28,6 mg/dl vs. 22,3 mg/dl, p = 0,03. In der Patientengruppe sind es die
über 55-jährigen Frauen, die den höchsten Mittelwert aufweisen (35,07 mg/dl, p <
0,005 vs. männliche Pat.) , und die sich auch deutlich von jüngeren Patientinnen
unterscheiden. Diese Altersabhängigkeit kann in der Kontrollgruppe nicht
nachgewiesen werden.
Dialyse Kontrolle
m w m w
Mw Median Mw Median Mw Median Mw median
Gesamt 22,74 11,49 30,95 18,40 20,42 8,4 23,97 8,1
[ n = 165 ] [n = 86 ] [ n = 39 ] [ n = 43 ]
≤ 55 y 24,97 13,68 23,98 12,15 21,76 7,5 29,37 21,95
[ n = 66 ] [ n = 32 ] [ n = 19 ] [ n = 10 ]
> 55 y 21,25 9,9 35,07** 20,79 19,14 9,2 23,97 7,1
[ n = 99 ] [ n = 54 ] [ n = 20 ] [ n = 33 ]
Tabelle 5: Lp (a) – Konzentrationen (Mittelwerte und Mediane) in Abhängigkeit
von Alter und Geschlecht. Insbesondere Dialysepatientinnen jenseits der 55 weisen
erhöhte Lp(a)-Werte auf.
-
Graphik 3: Lp(a) in Abhängigkeit von Alter und Geschlecht bei Dialysepatienten
Graphik 4: Lp(a) in Abhängigkeit von Alter und Geschlecht bei Kontrollen
5630 10857N =
alt (> 55 J)jung (< 55 J)
Lp
(a)
Ko
nze
ntr
atio
n in
mg
/dl
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
m
w
3310 2019N =
alt (> 55 J)jung (< 55 J)
Lp
(a)
Ko
nze
ntr
atio
n in
mg
/dl
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
m
w
-
4.4. . Phänotypisierung von Apo(a)
4.4.1. Anpassung der Nomenklatur
Nach erfolgreicher elektrophoretischer Auftrennung, Westernblot und
Farbreaktion erhält man im Idealfall scharf abgegrenzte Proteinbanden, die sich
leicht den mitgelaufenen Standards zuordnen lassen.
Neben den 5 Standards F, S1, S2, S3 und S4 ließen sich in unseren Proben und
mit unseren Verfahren noch 7 weitere Zwischenformen identifizieren. Insgesamt
konnten 12 verschiedene apo(a) - Isoformen detektiert werden. Patienten- und
Kontrollgruppe zeichneten sich durch eine vergleichbare Heterogenität aus.
Lediglich die Zwischenform S4-S5 und die schnelle F2 Bande waren in der
Kontrollgruppe nicht zu finden bei allerdings wesentlich geringerer Fallzahl.
In der Nomenklatur nach Utermann, welche die Grundlage für die von uns
verwendeten Standards darstellt, ist eine Bezeichnung für Zwischenformen nicht
vorgesehen, sodaß man mit Kompromißbezeichnungen wie eben erwähnt arbeiten
muß. Für statistische Betrachtungen und graphische Darstellungen bietet sich ein
zumindest ordinalskaliertes System an. Der theoretische Hintergrund über den
Aufbau von apo(a) kommt einem hier entgegen. Es besteht ein linearer
Zusammenhang zwischen Anzahl der Kringle IV-Wiederholungen, dem
Molekulargewicht und der Wanderungsgeschwindigkeit von apo (a).
In Anlehnung an die Arbeitsgruppe um Kamboh, denen es gelang, bis zu 26
verschiedene Isoformen zu identifizieren, werden die Isoformen mit steigender
Wanderungsgeschwindigkeit bzw. abnehmender Masse von 1 – 26
durchnumeriert. [Kamboh et al, 1991]
In dessen Arbeitsgruppe war es Craig, der darauf hinwies, daß das
Molekulargewicht von apo(a) nicht absolut zu bestimmen ist, da es Einflußgrößen
wie dem Glycosilierungsgrad, unterliegt.
Unser Versuch, unterschiedliche Nomenklatursysteme kompatibel darzustellen
basiert auf dieser Arbeit aus dem Jahr 1993. Die theoretische Masse von apo(a)
liegt mit 12 – 37 Kringle IV repeats bei lediglich 186 – 503 kDa. Über cDNA
Sequenzanalyse war eine theoretische Molekularmasse von 250 kDa für 17
-
Kringle IV repeats errechnet worden. Ein Kringle IV wird mit 12,7 kD geschätzt,
woraus sich die anderen Isoformen theoretisch errechnen lassen. Die tatsächliche
Masse liegt aber höher. Dies weiß man durch SDS-PAGE von apo(a) mit
Haptoglobin 2-2 Polymere als mitlaufenden Standard. Die Erklärung für diese
Diskrepanz liegt im Glycosilierungsgrad, der etwa 28 % beträgt und zum
Gesamtgewicht erheblich beiträgt. Die berechnete Molekularmasse von apo(a)
liegt nach Berücksichtigung dieser Faktoren bei 238 kDa für 12 Kringle IV-
repeats und 643 kDa für 37 kringle IV repeats. [Craig et al, 1993]
Mit diesen Eckdaten versuchten wir unsere eigenen Isoformen auf Grundlage der
Utermann-Klassifikation in ein praktikablerers lineares System zu übertragen,
dessen bewußt, daß es Schätzunegn sind und Überlappungen im Einzelfall auch
Fehlbeurteilungen nach sich ziehen können Die hier verwendeten
Molekulargewichtsbereiche mögen deshalb nur als Orientierung dienen, um
Vergleichbarkeit mit anderen Arbeiten zu erzielen.
Im weiteren werden wir auch das lineare System mit Isoformen 1 – 12 verwenden.
Isoformen 1 – 6 sind langsam wandernde Isoformen mit hohem Molekulargewicht
(high molecular weight, hmw), Isoformen 7 – 12 sind schnell wandernd und
haben ein niedriges Molekulargewicht (low molecular weight, lmw).
-
Utermann
(modifiziert)
Kamboh
(modifiziert)
Anzahl Kringle IV
(Schätzung)
Molekulargewicht
(Schätzung)
F3 13 12-13 238,0 kD – 254,2 kD
F2 12 14-15 270,4 kD – 286,6 kD
11 16-17 302,8 kD – 319,0 kD F1
B 10 18-19 335,2 kD – 351,4 kD
S1 9 20-21 367,6 kD – 383,8 kD
S1-2 8 22-23 400,0 kD – 416,2 kD
S2 7 24-25 432,4 kD – 448,6kD
S2-3 6 26-27 464,8 kD – 481,0 kD
S3 5 28-29 497,2 kD – 513,4 kD
S3-4 4 30-31 529,6 kD – 545,8 kD
S4 3 32-33 562,0 kD – 578,2 kD
S4-5 2 34-35 594,4 kD – 610,6 kD
S5 1 36-37 626,8 kD – 643,0 kD
Tabelle 6: Darstellung der Isoformen mit dem Versuch sie in unterschiedliche
Nomenklaturen einzuordnen. Grundlage stellt die Nomenklatur nach Utermann aus dem
Jahr 1989 dar (linke Spalte). Eine andere Möglichkeit ist das chronologische
Durchnummerieren von der langsamsten gefundenen Isoform kathodennah bis zur
schnellsten (anodennah), wie es Kamboh 1992 publizierte. Die Anzahl der Kringle IV-
Wiederholungen und die Angaben des Molekulargewichts basieren auf theoretischen
Überlegungen und stellen Schätzwerte dar. Insbesondere der unterschiedlich hohe
Glycosilierungsgrad läßt das Molekulargewicht erheblich variieren.
-
4.4.2. Isoformenanzahl
Wie in Punkt 3.3. beschrieben, erhält man nach Elektrophorese, Westernblot und
Färbereaktion ein Bandenmuster auf der Nitrozellulosemembran, das unter
Abgleich mit dem mitgelaufenen Standard manuell ausgewertet wird.
Es erfolgt eine Zuordnung der auf den Patientenspuren identifizierbaren Banden
zu den Standardbanden mit bekannter Molekülgröße. Die Zuordnung ist häufig
nicht eindeutig. In den folgenden Beispielen wird deutlich, dass Zwischenformen
auftreten, die in ihrer Wandergeschwindigkeit keiner Standardbande entsprechen.
Man hätte die fraglichen Banden der am nächsten gelegenen Standardbande
zuordnen können. Uns erschien es aber sinnvoll, Zwischenformen einzuführen
und entsprechend ihrer Position zu benennen, z.B. S 3-4 für eine Isoform
zwischen S 3 und S 4.
In den Proben lassen sich in 48,6 % (Patienten) bzw. 50 % (Kontrollen) eine
Isoform nachweisen, zwei Proteinbanden finden sich in 40,6 bzw. 41,5 % der
Fälle. Patienten und Kontrollen verhalten sich diesbezüglich identisch.
Bei Lp(a)-Konzentrationen unter 5 mg/dl wurde die Darstellung von Isoformen
problematisch, in 8,8 % bzw. 7,3 % der Proben gelang kein Nachweis.
Gemessen an der bisher veröffentlichten Literatur waren wir überrascht 8
Membranen bei den Patienten und 3 Membranen bei den Kontrollen zu finden, in
denen deutlich und gut abgrenzbar 3 und 4 Isoformen zur Darstellung kamen.
Dies hatte sich auch bei Wiederholungsmessungen bestätigt.
-
Beispiel 1:
P S P S
Beispiel 2:
P S P P S P S P
Beispiel 3:
P S P P S P S P
Abb.10: Dargestellt sind entwickelte Nitrozellulosemembranen mit dektierten Bandenmustern von Patienten (P) - und Standardseren (S). Man erkennt die
unterschiedliche Zahl von Isoformen, meist eine oder zwei , in Einzelfällen auch
mehrere, wie auf Spur 3 in Beispiel 1. Die Zuordnung der Banden ist nicht immer
eindeutig. Eine klare Zwischenform stellt Spur 8 in Beispiel 2 dar. Die Bande liegt
zwischen S3 und S4 und wird dementsprechend als S3-4 bezeichnet. Inhomogenitäten im
elektrischen Feld während der Elektrophorese sowie Verziehungen beim Blotting
beeinträchtigen die Qualität der Bandendarstellung wie die „Wellenform“ auf Spur 1 und
2 im Beispiel 1zeigt.
-
4.4.3.Detektierte Phänotypen
Die Darstellung der Banden entspricht der Expression des dazugehörigen Gens
und dem daraus synthetisierten Protein. Wir beschreiben hier Proteinmuster, das
als Phänotyp der dazu korrespondierenden Allele (Genotyp) bezeichnet wird.
In unserer Untersuchung konnten wir 53 Phänotypvarianten differenzieren. Diese
Vielfältigkeit war insbesondere in der wesentlich größeren Patientengruppe zu
sehen. In den Kontrollen waren es immerhin noch 28 verschiedene
Kombinationen aus Isoformen .
Wie oben bereits erwähnt, mißlang eine Phänotypisierung im Sinne eines
Bandennachweises in 8,8 % der Fälle bei den Patienten und in 7,3 % der Fälle bei
den Kontrollen. Allerdings ist zu berücksichtigen , dass in diesen Gruppen nur in
5 bzw. 3 Fällen auch in der quantitativen Bestimmung (ELISA) kein Nachweis
gelang, es sich wahrscheinlich nur bei 2 % bzw. 3,6 % der Probanden um
„echte“ Nullallele handelt. In den anderen Fällen scheint die Methode an Grenzen
zu stoßen. Diese Proben ohne Bandennachweis wiesen im ELISA Lp(a)-
Konzentrationen unter 5 mg/dl auf.
Darüberhinaus traten in einzelnen Fällen Phänotypen mit drei und vier
Proteinbanden auf. Diese Phänotypen sind gekennzeichnet durch eine heterogene
Zusammensetzung, in der stets hoch – und niedermolekulare Isoformen zu finden
sind. Die Hälfte der gefundenen Phänotypen (27 von 54) besteht aus derartigen
Kombinationen, nur in 12 Fällen liegen rein hochmolekulare und in 11 rein
niedermolekulare Varianten vor.
Trotz aller Vielfalt und je nach Größe der untersuchten Population nahezu
unendlich erscheinender Kombinationsmöglichkeiten, lassen sich schließlich
80 % der Proben auf nur noch 18 verschiedene Phänotypen reduzieren.
-
Dialysepatienten Kontrollen
Phänotyp Apo(a)Klasse 1 Häufigkeit [%] kumulativ [%] Häufigkeit [%] kumulativ [%]
5 hmw 9,2 9,2 15,9 15,9
3 hmw 14,7 23,9 12,2 28,1
4 hmw 12,7 36,6 13,4 41,5
N Kein Nachwei