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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Alterações funcionais e histopatológicas induzidas pela sinvastatina
na cardiopatia chagásica em modelo canino
Autora: Karolina Ribeiro Gonçalves
Orientador: André Talvani
Co-orientador: Rosália Morais Torres
Ouro Preto, 2014
I
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Alterações funcionais e histopatológicas induzidas pela sinvastatina
na cardiopatia chagásica em modelo canino
Autora: Karolina Ribeiro Gonçalves
Orientador: André Talvani
Co-orientador: Rosália Morais Torres
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como
parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de
Mestre em Ciências Biológicas.
Área de concentração: Imunobiologia de protozoários
Ouro Preto
II
Dedicatória
III
“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina”
Cora Coralina
Aos meus pais, Ademir e Márcia, por serem
meus exemplos, por sempre confiarem em
mim, me apoiarem e me ensinarem a nunca
desistir. Aos meus irmãos por se fazerem
presentes, mesmo distantes. Aos meus
sobrinhos lindos, por trazerem alegria a
minha vida. Ao Alvaro por me ensinar a ser
paciente e sempre estar ao meu lado. Muito
obrigada! Amo vocês!!!
Agradecimentos
IV
Agradeço a Deus pela dádiva da vida e pela proteção diária. Sem sua luz com certeza não
conseguiria.
Agradeço ao meu orientador André Talvani, pela confiança, apoio e amizade, além de sua
dedicação, competência, generosidade e valiosa orientação.
Agradeço aos meus pais pelo incentivo e por sempre acreditarem em minha capacidade.
Aos meus irmãos pelas palavras de carinho e conforto e por sempre torcerem por meu
sucesso.
A toda minha família, tios. tias e primos por todo o apoio.
Agradeço ao Alvaro, amigo, namorado e pesquisador, por ser tão prestativo, carinhoso e
por estar sempre ao meu lado.
Aos meus sogros por me acolherem sempre tão bem, e me fazerem sentir parte da família.
Isso com certeza fez toda a diferença durante esta etapa.
Agradeço a Lílian Melo, pela generosidade em me ensinar como conduzir um trabalho e
compartilhar comigo todo conhecimento adquirido.
Agradeço a Terezinha por me auxiliar sempre com toda sua experiência, e sempre estar
disposta a ajudar.
Agradeço a Rosália pela disponibilidade e paciência em me ensinar.
Agradeço a Lívia, Ivo, Guilherme e Arlete por sempre estarem dispostos a ajudar e
colaborar com este projeto.
Agradeço aos companheiros de caminhada, Ana Lia, Lud, Laís e Bia pela amizade,
momentos de estudo e por tornar este processo muito mais divertido.
Agradeço a todos do Laboratório Doença de Chagas pelo apoio, conversas e risos, que
tornaram esta caminhada menos árdua.
Aos amigos de Caetanópolis e Ouro Preto, por sempre me encorajarem e torcerem pelo
meu sucesso!
Agradecimentos
V
Agradeço aos mestrandos 2012, em especial Leca, Laura, Helem, João, Vívian, Ana Maria
e Roberta pelos momentos de estudo e por sempre me ajudarem em minhas dificuldades.
Agradeço aos colegas dos outros laboratórios, pela ajuda, empréstimos de reagentes e
compartilhamento de conhecimento. Em especial à Jamile pela paciência em me ajudar
com as lâminas de picrossirius e ao Luís Fernando pela ajuda com os eletrocardiogramas.
Agradeço ao Professor George pela disponibilidade e por me ajudar com a estatística.
Agradeço a República Feijão com Arroz, meu porto seguro, família que escolhi em Ouro
Preto. Obrigada irmãs por me agüentarem, entenderem minha ausência durante a
realização deste trabalho e por todo apoio.
Agradeço também as fontes de fomento e apoio Capes e UFOP. Agradeço também a
Sanval pela doação da sinvastatina, essencial na realização deste projeto.
Índice
VI
1. Introdução
1.1- A doença de Chagas...............................................................................................1
1.2- Aspectos da cardiopatia chagásica crônica............................................................3
1.3- As estatinas............................................................................................................6
1.4- As troponinas.........................................................................................................8
1.5- O modelo canino e suas repercussões na infecção pelo Trypanosoma cruzi.........9
2. Objetivos
2.1- Objetivo Geral.......................................................................................................11
2.2- Objetivos específicos.............................................................................................11
3. Animais, Materiais e Métodos
3.1- Descrição do modelo canino...................................................................................12
3.2- Inoculação dos animais, confirmação da infecção e avaliação da parasitemia.......12
3.3- Esquema terapêutico...............................................................................................13
3.4- Quantificação da troponina I sérica........................................................................13
3.5- Avaliação eletrocardiográfica.................................................................................14
3.6- Avaliação ecocardiográfica.....................................................................................15
3.7- Necrópsia e coleta de fragmentos cardíacos...........................................................16
3.8- Quantificação dos diferentes tipos de colágeno......................................................16
3.9- Quantificação de núcleos celulares no átrio direito................................................17
3.10- Análise estatística.................................................................................................18
4. Resultados
4.1 Curva de parasitemia dos animais infectados com T. cruzi.................................19
4.2 Quantificação da troponina I sérica.........................................................................19
4.3 Efeito da sinvastatina sobre a condução elétrica cardíaca.......................................20
4.3.1 Duração da onda P............................................................................................................20
4.3.2 Duração do intervalo P-R................................................................................................21
4.3.3 Duração de QRS..............................................................................................................22
4.3.4 Alterações eletrocardiográficas detectadas............................................. 23
4.4 Efeitos da sinvastatina sobre a função cardíaca............................................26
4.4.1 Fração de Ejeção...............................................................................................................26
4.4.2 Índice de Massa do Ventrículo Esquerdo.......................................................................26
4.4.3 Tempo de Relaxamento Isovolumétrico..........................................................................27
4.4.4 Volume do átrio esquerdo................................................................................................28
4.5 Análise quantitativa do infiltrado inflamatório e da fibrose no átrio direito...........29
4.6 Análise da área das diferentes fibras colágenas encontradas no átrio direito.........32
5. Discussão.....................................................................................................................33
6. Conclusão....................................................................................................................39
7. Referências..................................................................................................................40
Resumo
VII
Resumo
A cardiopatia chagásica (CC) sustenta-se pela presença do Trypanosoma cruzi e de seus
antígenos no tecido cardíaco e na circulação, induzindo uma complexa resposta
inflamatória ocasionando fibrose miocárdica, além de alterações estruturais e funcionais ao
órgão. Estratégias farmacológicas para amenizar a inflamação na CC e a busca de
marcadores de prognóstico clínico têm se tornado focos de investigação nas últimas
décadas. Nesse contexto, os inibidores da enzima HMG-CoA redutase (estatinas) tem se
mostrado importantes fármacos reguladores da resposta inflamatória em modelo
experimental e, em paralelo, o papel da troponina I (cTnI) na interação actina-miosina nos
músculos estriados e sua liberação na corrente sanguínea também tem sido reforçado na
relação direta com lesões irreversíveis às células miocárdicas, tornando a cTnI um
importante marcador de lesão cardíaca. Neste trabalho, avaliou-se o papel terapêutico da
Sinvastatina sobre (i) a resposta inflamatória e (ii) a função cardíaca empregando-se cães,
de ambos os sexos e sem raça definida (n=5) infectados pela cepa Y do T. cruzi. Esses
animais foram tratados com 20mg/dia de Sinvastatina durante 3 meses (fase aguda) e 6
meses (fase crônica recente) e parâmetros parasitológicos, bioquímicos (cTnI),
histopatológicos (inflamação e fibrose), eletrocardiográficos (ECG) e funcionais
(ecocardiografia) avaliados nesses respectivos tempos. Nossos dados demonstraram que a
concentração sérica de cTnI em cães infectados, na fase aguda, encontrava-se elevada
quando comparado ao grupo controle e aos animais tratados com Sinvastatina. Além disso,
a Sinvastatina foi capaz de reduzir a fibrose e o infiltrado inflamatório no tecido cardíaco
de cães infectados pelo T. cruzi, refletindo na melhoria dos parâmetros de função
ventricular. Em suma, no modelo canino, que melhor mimetiza os aspectos
fisiopatológicos e clínicos observados na doença de Chagas, a cTnI mostrou-se um bom
marcador de lesão miocárdica em fase aguda e o tratamento diário com Sinvastatina uma
promissora estratégia para estabilizar/melhorar as funções cardíacas em cães infectados
pelo T. cruzi.
Palavras chaves: Trypanosoma cruzi, troponina, Sinvastatina, inflamação, cardiopatia,
fibrose
Abstract
VIII
Abstract
The chagasic cardiomyopathy (CC) is a clinical condition sustained by the presence of
Trypanosoma cruzi and its antigens in the cardiac tissue and/or blood circulation, driven a
complex inflammatory response able to induce fibroses and alternate structural and
functional parameters in this organ. Pharmacological strategies aiming reducing
inflammation in CC and the new proposes of biochemical markers with prognosis function
have been the target of clinical investigations in the last decades. In this way, the inhibitors
of HMG-CoA redutase (statins) have been shown as promising drugs capable to interfering
in the inflammatory response in experimental models and, in parallel, the regulatory role of
cardiac troponine I (cTnI) in the interaction of actin-myosin in striated muscle and its
release in blood has also been associated with irreversible lesion to myocardial cells
become cTnI a promising marker of cardiac lesion. In this study, the therapeutic role of
Sinvastatin was evaluated on (i) the inflammatory response and (ii) the cardiac function
using male and female mongrel dogs (n=5) infected with Y strain of T. cruzi. These
animals were treated with 20mg/day of Sinvastatin during 3 (acute phase) and 6 (recent
chronic phase) months and parasitological, biochemical (cTnI), histopathological
(inflammation and fibrosis), electrical (ECG) and functional (echocardiography) evaluated
in these respective times. Our data demonstrated that serum concentrations of cTnI in
infected dogs, during acute phase, were higher in those animals non-infected and infected
under Sinvastatin treatment. Beside, Sinvastatin was able to reduce fibrosis and
inflammatory infiltration in cardiac tissue in infected dogs ameliorating the ventricular
functional parameters. In summary, using the dog model that is considered the best
adequate animal model to reflect clinical findings observed in Chagas disease, the cTnI
showed be a good marker of myocardium lesion in acute phase and, the daily treatment
with Sinvastatin a promising pharmacological strategy to stabilize/ameliorate cardiac
functions in dogs infected by T. cruzi.
Key words: Trypanosoma cruzi, troponin, Sinvastatin, inflammation, cardiopathy,
fibrose.
Lis ta de Figuras
IX
Lista de figuras
Figura 1: Curva de parasitemia..................................................................................19
Figura 2: Nível da troponina I sérica (ng/mL)...........................................................20
Figura 3: Duração da onda P (s)................................................................................21
Figura 4: Duração do intervalo PR (s).......................................................................22
Figura 5: Duração do complexo QRS (s)...................................................................23
Figura 6: Traçados eletrocardiográficos....................................................................25
Figura 7: Fração de ejeção (%)..................................................................................26
Figura 8: Índice de massa do ventrículo esquerdo (g/m2).........................................27
Figura 9: Tempo de relaxamento isovolumétrico (m/s)............................................28
Figura 10: Volume do átrio esquerdo (mL)...............................................................29
Figura 11: Análise quantitativa do infiltrado inflamatório no átrio direito.................30
Figura 12: Análise quantitativa da área de fibrose no átrio direito............................31
Figura 13: Área das fibras colágenas tipo I e III........................................................32
Figura 14: Correlações positivas................................................................................33
Lista de Tabelas
X
Lista de tabelas
Tabela 1: Tabela de alterações eletrocardiográficas qualitativas apresentadas em cães
infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados ou não com sinvastatina (20mg). Animais
não infectados foram utilizados como parâmetros de normalidade. A avaliação foi
realizada no 3o e no 6
o mês após a inoculação....................................................................24
Lis ta de Siglas
XI
BAV Bloqueio átrio-ventricular
BRE Bloqueio do ramo esquerdo
BNP Peptídeo natriurético tipo B
CCC Cardiopatia Chagásica Crônica
CC Cardiopatia Chagásica
CK-MB Creatina kinase
CEUA Comitê de Ética em Pesquisa Animal
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
CRP Proteína C-reativa
cTnI Troponina cardíaca tipo I
cTnT Troponina cardíaca tipo T
DC Débito cardíaco
DTU Discrete Typing Units
ECG Eletrocardiograma
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FPP Farnesilpirofosfato
GGPP Geranilgeranilpirofosfato
HBAE Hemi bloqueio anterior esquerdo
H&E Hematoxilina e eosina
HMG-CoA b-hidroxi-b-metil-glutaril-CoA
IC Insuficiência Cardíaca
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular-1
IFN-γ Interferon gama
IgA Imunoglobulina A
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IL-10 Interleucina 10
IMVE Índice de massa do ventrículo esquerdo
LFA-1 Antígeno associado à função linfocitária 1
MPI Meses pós infecção
TNF-α Fator de Necrose Tumoral alfa
TnC Troponina C
TnI Troponina I
TnT Troponina T
TRIV Tempo de relaxamento isovolumétrico
VE Ventrículo esquerdo
WHO World Health Organization
Int rodução
- 1 -
1- Introdução
1.1 A doença de Chagas
A doença de Chagas é uma zoonose cujo agente etiológico é o protozoário flagelado
Trypanosoma cruzi, sendo descoberta e descrita pelo médico sanitarista brasileiro Carlos
Justiniano Ribeiro Chagas, na cidade de Lassance/MG (Chagas, 1909). No mundo há
aproximadamente 10 milhões de pessoas infectadas por este parasito com pelo menos 25
milhões de indivíduos sob risco de infecção (WHO, 2010). A transmissão do T. cruzi
ocorre, usualmente, através do contato de excretas contaminadas de vetores hemípteras
hematófagos da família Reduviidae, conhecidos popularmente como barbeiros, com a
mucosa ou pele lesionada do homem (Schofield,1994). Mas também pode ser transmitida
pelas vias oral, congênita, transfusão sanguínea, transplante de órgãos sólidos, além de
acidentes de laboratório.
A doença de Chagas apresenta fases clínicas (aguda e crônica) bem distintas. A fase
aguda inicia-se após cerca de 7 a 10 dias de incubação do parasito e, geralmente, é
manifesta-se de forma assintomática ou oligossintomática tendo como principais
características clínicas febre, apatia, edema nos membros inferiores ou na face,
hepatoesplenomegalia, infarto ganglionar generalizado e taquicardia, além da elevada
parasitemia circulante (Andrade, 1958). Esta fase também apresenta curso clínico de curta
duração e reações inflamatórias nos tecidos parasitados que são principalmente os
músculos, incluindo o músculo estriado esquelético e o músculo estriado cardíaco (Coura e
Dias, 2009).
Após a fase aguda da infecção inicia-se a fase crônica, onde a presença do parasito
circulante é escassa e não detectada por métodos de avaliação parasitológica
convencionais. Nesta fase, alguns indivíduos apresentam manifestações ou “formas
clínicas” características e enquanto outros permanecem assintomáticos por tempo
indeterminado. Essa diferença levou às subclassificações: forma crônica (i) indeterminada,
(ii) cardíaca, (iii) digestiva ou (iv) mista. A forma crônica indeterminada pode ser
encontrada em aproximadamente 60 a 70% dos indivíduos infectados, os quais apresentam
sorologia positiva para o T. cruzi, porém assintomáticos com ausência de modificações
anatômicas e fisiológicas cardíacas e digestórias (Coura, 2007).
Introdução
- 2 -
Aqueles indivíduos apresentando a forma clínica digestiva (10-15%) (Rassi Jr e cols.,
2010) apresentam alterações na secreção, na motilidade, na absorção e, nos casos mais
graves, os chamados “megaesôfago” e “megacolon”. As alterações que ocorrem nessa
forma resultam, principalmente, do comprometimento do sistema nervoso entérico, em
particular do plexo mientérico de Auerbach e Meissner (Tafuri & Brener, 1967). As células
nervosas desse plexo sofrem fenômenos degenerativos em meio ao processo inflamatório
causado pelo T. cruzi (Koeberle, 1961; Andrade & Andrade, 1966) e, como consequência,
surgem incoordenações motoras, retenção de alimentos no esôfago, hipertrofia muscular e
conseqüente dilatação muscular levando a formação dos “megas”.
Por outro lado, a forma cardíaca é reconhecida como mais grave e frequente
manifestação das formas crônicas sintomáticas da doença de Chagas (Rassi e cols., 2010).
Desenvolve-se em cerca de 20-30% dos indivíduos e normalmente leva a anormalidades do
sistema de condução que afetam a funcionalidade levando o indivíduo ao óbito, aneurismas
apicais, insuficiência cardíaca, tromboembolismo e morte súbita (Marin-Neto,1999; Rassi
Jr e cols.,2000). A cardiopatia chagásica crônica apresenta como característica principal
um caráter progressivo e fibrosante. Progressivo devido aos crescentes eventos
inflamatórios que ocorrem no coração decorrentes da presença do parasito ou de seus
elementos antigênicos. E fibrosante devido à morte de cardiomiócitos durante esse
processo inflamatório e posterior substituição do mesmo por fibras colágenas. Apesar de se
conhecer tais característica pertinentes à cardiopatia chagásica (CC), pouco se sabe sobre
os mecanismos imunopatológicos que promovem as lesões nos tecidos nessa fase da
doença. A morte súbita cardíaca é responsável por quase dois terços de todas as mortes na
doença de Chagas cardíaca, seguida de insuficiência cardíaca refratária (25% - 30%) e
tromboembolismo (10% - 15%) (Rassi Jr e cols., 2001). A morte súbita pode ocorrer
mesmo em pacientes previamente assintomáticos e é geralmente associada com taquicardia
ventricular e fibrilação ou, mais raramente, com bloqueio atrioventricular total ou
disfunção do nódulo sinusal (Rassi Jr e cols., 2012).
Introdução
- 3 -
1.2 Aspectos da cardiopatia chagásica crônica
A maioria das manifestações clínicas que ocorrem na doença de Chagas deve-se a
ação da resposta imune do hospedeiro contra a presença do parasito, como mencionado
anteriormente. A presença do T. cruzi ou de suas moléculas antigênicas, ativa a resposta
imune favorecendo o recrutamento celular para o sítio do estímulo. Esse processo é
necessário para a redução da carga parasitária no sangue e no tecido e, segundo Marinho e
colaboradores em 1999, essa carga parasitária da fase aguda parece ser essencial na
determinação do perfil da resposta imune durante a fase crônica da infecção.
A dificuldade em se detectar o parasito no miocárdio levou a formulação de teorias
auto-imunes para explicar o desenvolvimento das lesões inflamatórias miocárdicas durante
a fase crônica da doença. Tal resposta auto-imune poderia ser desencadeada por auto-
anticorpos ou por linfócitos T auto-reativos derivados de mimetismo molecular a alguns
antígenos do T. cruzi, homólogos à proteínas do coração do hospedeiro, ou mesmo pela
ativação bystander não envolvendo antígenos do parasito, sendo induzido apenas por
antígenos provenientes de lesões teciduais (Kierszenbaum, 1999; Leon e cols., 2001;
Cunha-Neto e cols.,2011).
Em contrapartida, outros trabalhos apontam para uma participação ativa do parasito
na patogênese da cardiopatia chagásica crônica. Como exemplo, temos que o T. cruzi é
frequentemente achado tanto em animais como em humanos cronicamente infectados
(Viotti e cols., 2006). Também foi comprovado a evidência da presença do parasito no
sangue por Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), mesmo quando o T. cruzi não era
encontrado ao microscópio, em animais e humanos durante a fase crônica (Gutierrez e
cols., 2009).
O mecanismo exato pelo qual o parasitismo desencadeia as lesões teciduais durante
a fase crônica não é bem estabelecido. Acredita-se que a persistência do parasito seja um
ativador da infiltração linfocitária no miocárdio, determinando graves alterações na
estrutura do coração, provocadas pela infiltração das células inflamatórias tanto nas
miofibrilas especializadas do sistema de condução quanto no miocárdio contrátil (Zhang e
Tarleton,1999). A notável plasticidade do parasito, alternando entre tripomastigotas
altamente móveis e a forma replicativa amastigota intracelular, parece desempenhar uma
papel central para assegurar a sobrevivência do T. cruzi, apesar da presença do sistema
imune (Fernandes e Andrews, 2013).
Introdução
- 4 -
A destruição progressiva das fibras cardíacas e a intensa fibrose substituindo os
cardiomiócitos lesionados levando à diminuição da massa muscular miocárdica e à
hipertrofia dos cardiomiócitos remanescentes, além da interrupção de fascículos e fibras
miocárdicos predispõem o paciente cardiopata chagásico a arritmias e à insuficiência
cardíaca (IC) (Bogliolo, 1976). O exame macroscópico do coração de pacientes que
morreram de insuficiência cardíaca secundária à doença de Chagas revela crescimento
biventricular com aneurismas apicais ocasionais e trombos murais. Histologicamente, o
tecido era caracterizado por fibrose intersticial difusa, infiltração linfocítica e miocitólise,
os quais ocorrem na ausência aparente de parasitas, no entanto foi verificado a presença do
DNA do parasito no foco inflamatório (Zhang e Tarleton, 1999). Denervação cardíaca
(principalmente parassimpática) e anormalidades na microvasculatura coronariana também
contribuem na patogênese das lesões crônicas (Marin-Neto, 2007).
A IC é frequentemente uma manifestação tardia da doença de Chagas. Esta falha é
geralmente biventricular com predomínio de falha do lado direito em estágios avançados,
com edema periférico, hepatomegalia e ascite. A IC de etiologia chagásica é associada
com maior mortalidade do que outras decorrentes de outras etiologias, como embolias
sistêmicas e pulmonares (Freitas, 2005). Devido à esse comprometimento da
funcionalidade cardíaca, observa-se sinais de déficit cardíaco e aumento da pressão
intracardíaca (Davies e cols., 2001; Tanowitz e cols., 2009). Na cardiopatia chagásica
crônica é comum a presença de lesão vorticilar ou aneurisma de ponta, que nada mais é
que o adelgaçamento e hipotrofia do miocárdio na região apical, levando a um quadro com
presença de arritmias e fenômenos tromboembólicos.
Na clínica da doença de Chagas, o eletrocardiograma (ECG) ainda é o meio mais
prático para a detecção, avaliação e acompanhamento da cardiopatia chagásica devido ao
acometimento do sistema de condução (Guimarães, 1985; Gonçalves, 2011). As alterações
ao ECG mais comuns são bloqueio de ramo direito, bloqueio fascicular anterior esquerdo,
batimentos ventriculares prematuros, mudanças ST-T, ondas Q anormais e baixa voltagem
de QRS. A combinação de bloqueio do ramo direito e bloqueio fascicular anterior
esquerdo é muito típico na doença de Chagas, como a taquicardia ventricular sustentada
que parece resultar de um circuito de reentrada intramiocárdica ou subepicárdico que
geralmente está localizado na parede inferior, póstero-lateral do ventrículo esquerdo (Rassi
Jr e cols.,1995).
Introdução
- 5 -
Já o ecocardiograma fornece dados da morfologia e dinâmica/funcionalidade
cardíaca, sendo este uma técnica não invasiva na avaliação da cardiopatia chagásica
crônica. Ela permite o reconhecimento da disfunção sistólica e diastólica do ventrículo
esquerdo, o envolvimento do ventrículo direito, disfunção de contratilidade e também os
aneurismas apicais (Biolo e cols., 2010). É uma técnica mais sensível que o ECG, uma vez
que em um estudo com 505 pacientes com ECG normal e com média de fração de ejeção
do ventrículo esquerdo de 67%, 13% apresentavam lesões segmentares e 0,8% tinham
disfunção sistólica (Acquatella., 2007). Infelizmente ainda é uma técnica de alto custo
para submeter todos os pacientes com doença de Chagas, por isso é desejável o
desenvolvimento métodos de triagem para indicar quais os pacientes que deverão ser
submetidos a essa avaliação (Biolo e cols., 2010).
A cardiopatia chagásica crônica é um problema de saúde pública e é de grande
interesse que mais estudos sejam realizados na tentativa de combatê-la. As quimioterapias
anti-T. cruzi atuais baseiam-se em nitroimidazóis ou agentes nitrofuranos como o
benzonidazol (Rochagan®, Rodanil
®, Roche
®) e o nifurtimox (Lampit
®) (Coura e de
Castro, 2002; Guedes e cols., 2006). Porém estes tratamentos ainda são insatisfatórios, pois
sua atividade antiparasitária na fase crônica é baixa (Lauria-Pires e cols., 2000). Vários
especialistas sugerem o tratamento etiológico durante a fase crônica, embora ele não
consiga exterminar o parasita, o fármaco consegue impedir a progressão clínica da doença
(Garcia e cols., 2005; Bustamante e cols., 2007). No entanto, outros estudos concluíram
que o tratamento específico falhou na prevenção da progressão da doença ou de suas
complicações (Lauria-Pires e cols., 2000; Caldas e cols., 2008)
É interessante, pois, avaliar a resposta imune como geradora das lesões cardíacas na
fase crônica considerando que o parasito pode ainda estar presente e desencadeando o
processo inflamatório que culmina nas formas crônicas sintomáticas características. Nesse
contexto algumas estratégias terapêuticas têm sido propostas ao longo dos últimos anos
com fármacos já “utilizados” na rotina clínica da cardiopatia chagásica e doenças
associadas como, por exemplo, os beta-bloqueadores, os inibidores da enzima conversora
da angiotensina, a amiodarona e as estatinas (Botoni e cols., 2007; Melo e cols., 2011).
Introdução
- 6 -
1.3 As estatinas
As estatinas são inibidores seletivos e competitivos da 3-hidroxi-3-metil-glutaril-
coenzima-A redutase (HMG-CoA redutase), responsável pela conversão da HMG-CoA a
mevalonato, que é um precursor do colesterol (Liao, 2002). Elas diminuem os níveis
plasmáticos de colesterol e lipoproteínas através da inibição da enzima HMG-CoA
redutase e da síntese de colesterol no fígado, aumentando o número de receptores de LDL
na superfície do hepatócitos, com consequente aumento da absorção e do catabolismo do
LDL.
Existe uma variada gama de estatinas e elas diferem entre si quanto à
lipossolubilidade e tempo de meia-vida, levando a diferentes potenciais de inibição da
HMG-CoA redutase (Illingworth e Tobert, 2001). Estatinas como a sinvastatina,
fluvastatina e atorvastatina são lipofílicas e capazes de penetrar passivamente nas
membranas celulares, exercendo efeito em uma grande variedade de tecidos, incluindo
células endoteliais e musculares (Manson e cols., 2005). Já a lovastatina, pravastatina e
rosuvastatina, são hidrofílicas e não atravessam passivamente a membrana celular, logo
elas atuam principalmente a nível hepático onde existe um sistema de transporte de ânions
orgânicos que permite às estatinas hidrofílicas entrarem nos hepatócitos (Manson e cols.,
2005).
Através da inibição da síntese do mevalonato, as estatinas reduzem não só a síntese
de colesterol, mas também a síntese de importantes intermediários isoprenóides como o
farnesilpirofosfato (FPP) e o geranilgeranilpirofosfato (GGPP). Estes intermediários
servem como importantes fixadores lipídicos de membrana para várias proteínas, incluindo
as subunidades-γ das proteínas G e para pequenas GTPases como Ras e Rho que são
importantes na sinalização pós traducional, crescimento e diferenciação celular. A
isoprenilação protéica facilita a ligação covalente, a localização subcelular e o tráfego
intracelular destas proteínas relacionadas à membrana e relevantes nas vias de sinalização
celular (Liao, 2005). Deste modo, a inibição da isoprenilação de FPP e GGPP resulta em
acúmulo de Rho e Ras citoplasmáticos, levando a mudanças no citoesqueleto que alteram a
estabilidade da membrana e o tráfego através da mesma. Assim, é capaz de afetar a
sinalização inter e intracelular e, por fim, a própria transcrição gênica. Aparentemente, a
inibição da isoprenilação da Rho e, conseqüentemente, a não ativação de seu alvo, a Rho-
quinase, parece ser o principal mecanismo mediador de outros efeitos colesterol-
independente observados para as estatinas (Manson, 2005). Esta ação sobre a
Introdução
- 7 -
isoprenilação de alguns compostos vem sendo chamada de efeitos pleiotrópicos das
estatinas e têm sido associados a diversos mecanismos como melhoria ou restauração da
função endotelial, aumento da estabilidade de placas ateroscleróticas, diminuição do
estresse oxidativo e inflamação, além da inibição da resposta trombogênica na parede
vascular (Liao, 2002).
Muitos estudos in vitro, em modelos animais e alguns em pacientes com doença
cardiovascular, mostraram a habilidade das estatinas de diminuir os níveis de citocinas
inflamatórias, de inibir a interação de leucócitos com as células endoteliais e de inibir a
quimiotaxia de leucócitos para tecidos inflamados (Node e cols., 2003; Mozaffarian e cols.,
2005; Tousoulis e cols., 2005; Sola e cols., 2006). Evidências indicam que citocinas
inflamatórias podem influenciar a contratilidade do coração, induzir hipertrofia do músculo
cardíaco e promover apoptose ou fibrose, contribuindo com o processo de remodelamento
do miocárdio (Sasayama e cols., 1999; Dama˚s e cols., 2001; Mann, 2002).
O processo inflamatório é considerado um dos fatores mais importantes em ambas
as fases da doença de Chagas em humanos e em modelos experimentais (Lannes-Vieira e
cols., 2009; Talvani e Teixeira, 2011). Por isso torna-se imprescindível o
desenvolvimento de pesquisas de fármacos que minimizem estes processos inflamatórios.
Como já foi explicitado, as estatinas possuem efeitos na diminuição da inflamação. Um
estudo realizado em nosso laboratório, uma dose diária de sinvastatina foi capaz de reduzir
os níveis séricos de citocinas pró- inflamatórias IFN-γ e TNF-α, mas não a regulatória IL-
10 e não houve melhora em parâmetros clínicos como fração de ejeção do ventrículo
esquerdo e diâmetro diastólico do ventrículo, em cães infectados experimentalmente com o
T. cruzi durante a fase crônica da infecção (Melo e cols., 2011). Resultados similares
foram encontrados em experimento com camundongos infectados experimentalmente com
o parasito, e foi constatado em níveis séricos e em sobrenadante de tecido cardíaco, que
citocinas inflamatórias e quimiocinas, as quais são essenciais no controle da infecção pelo
parasito e recrutamento leucocitário para o foco inflamatório, (IFN-γ, TNF-α, CCL2 e
CCL5) foram reduzidas após o tratamento diário com a sinvastatina (Silva e cols., 2012).
Uma importante estratégia para demonstrar as ações das estatinas sobre a resposta
imune é utilização de “marcadores biológicos da inflamação” ou “BIOMARCADORES”.
O National Institutes of Health Biomarkers Definitions Working Group definiu
biomarcador como uma característica objetivamente mensurável e avaliada como indicador
de um processo fisiológico, patológico ou uma resposta do organismo a uma intervenção
Introdução
- 8 -
terapêutica. Um bom biomarcador deve ter alta sensibilidade e especificidade, deve
auxiliar no diagnóstico de uma patologia de curso agudo ou crônico, deve permitir a
estratificação de risco de pacientes e a monitoração da progressão de uma patologia
(Morrow e cols., 2007). Como vimos nos estudos acima, as citocinas e quimiocinas são
amplamente empregados como marcadores ou padrões de avaliação de tratamento. Em
estudos de doenças cardiovasculares têm-se empregado diversos marcadores como:
peptídeo natriurético tipo B (BNP), que é utilizado em diagnóstico de emergência de falha
cardíaca e no prognóstico de pacientes com síndrome aguda coronariana; proteína C-
reativa (CRP), que é um importante indicador de prognóstico de risco cardiovascular e
síndrome aguda coronariana; Creatina kinase (CK-MB), que é utilizada no diagnóstico
precoce de infarte agudo do miocárdio (Tang e Kang., 2006; Qureshia e cols., 2012).
Existem também as troponinas, que são reconhecidamente empregadas na clínica médica
como marcador de degeneração cardíaca. Dessa forma, o estudo deste biomarcador
durante a infecção pelo T. cruzi seria interessante para se avaliar a ação da sinvastatina
sobre a lesão causada pela inflamação.
1.4 As troponinas
As troponinas cardíacas são biomarcadores de alta sensibilidade e especificidade
para a degeneração do miocárdio no homem e têm sido consideradas como padrão ouro de
diagnóstico e prognóstico associado a esta patologia (Antman, 2002; Sarko & Pollack,
2002). Essas proteínas contráteis (Troponinas C,I e T) formam um complexo que se liga
ao filamento de actina e medeiam a ativação e inativação, em presença de cálcio, da
contração muscular esquelética e cardíaca. A troponina C (TnC) é idêntica tanto no
músculo esquelético como cardíaco, mas os genes codificadores das troponinas I (TnI) e T
(TnT), nos diferentes músculos, são diferentes. A troponina I tem afinidade pela actina,
enquanto a troponina C tem afinidade pelos íons cálcio e a troponina T tem afinidade pela
tropomiosina (Oyama e Sisson, 2004).
As troponinas estão presentes nos músculos, entretanto são liberadas para corrente
sanguínea quando há lesão tissular e a conseqüente ruptura da fibra (O’Brien, 2006), logo a
detecção de altas concentrações de cTnI ou cTnT na circulação é visto como um indicador
específico da lesão do miocárdio e necrose (Morrow, 2001; Fishbein e cols., 2003). Esta
relação é demonstrada em cães com oclusão da artéria coronária experimental em que a
Introdução
- 9 -
concentração de cTnI na circulação é proporcional à extensão da injúria cardíaca
(Ricchiuti, 1998).
O-Brien, em 2006, demonstrou que o aumento sérico de cTnI em animais não
humanos, correlacionava-se com disfunções cardíacas, como hipertrofia ventricular,
taquicardia, contração ventricular prematura e dispnéia associada à insuficiência cardíaca.
Devido a esta associação, seria importante a proposta de avaliação da dosagem deste
biomarcador em doenças de acometimento cardíaco, como é o caso da doença de Chagas.
Em 2003, foi avaliada a concentração de troponina I em soro de pacientes positivos para o
T. cruzi sendo o valor médio para os pacientes chagásicos de 0,46ng/dl e 0.027ng/dl para,
indivíduos sadios. Os pacientes que estavam na forma cardíaca apresentaram níveis mais
altos (0,60ng/dl) em relação aos pacientes na forma indeterminada (0,25ng/dl) (Aras e
cols., 2003). Já em outro estudo, altos níveis de autoanticorpos contra troponina T foram
encontrados em pacientes na forma indeterminada e na forma cardíaca da doença de
Chagas (Nunes e cols., 2013). Nesse estudo também foi demonstrado que em pacientes
com autoanticorpos anti-troponina T a fração de ejeção estava diminuída, evidenciando
uma disfunção cardíaca.
1.5 O modelo canino e suas repercussões na infecção pelo Trypanosoma cruzi
A estreita homologia da isoforma cardíaca cTnI entre as espécies de mamíferos
permite rápida e precisa medição das concentrações de troponina em cães utilizando
imunoensaios desenvolvido para humanos (O’Brien e cols., 1997, Fredericks e cols.,
2001). Os genes da troponina I de gatos e cães foram codificados apresentando homologia
de 96% e 95%, respectivamente, em relação ao mesmo gene do homem (Rishniw e cols.,
2004). O cão tem sido apresentando como o modelo animal mais adequado para se estudar
aspectos clínicos da cardiopatia chagásica por apresentar manifestações clínicas muito
similiares àquelas observadas em seres humanos. Logo, seria interessante estudar os efeitos
da sinvastatina na cardiopatia chagásica crônica, mensurada pela troponina, no modelo cão.
O modelo cão permite o estudo da evolução natural e outros aspectos clínicos
observados na infecção pelo T. cruzi, além de ser um animal de fácil aquisição, manuseio e
manutenção (Lana e cols.,1992).
Lana e cols em 1988 encontrou em autópsia feita em cães infectados
experimentalmente pelo T. cruzi: epicardite, miocardite crônica produtiva fibrosante, com
Introdução
- 10 -
presença às vezes de granulomas periganglionite, ganglionite, perineurite e neurite, com
possível despopulação neuronal, quadro muito semelhante ao encontrado em seres
humanos infectados. Andrade e cols em 1997 observaram que alterações no
eletrocardiograma estavam presentes em 80% dos cães durante a fase aguda da infecção e
entre os animais sobreviventes foi observada a normalização do ECG, caracterizando a
forma indeterminada da doença de Chagas, bem como acontece em humanos. Guedes e
cols em 2009 mostrou que os beagles deste estudo apresentaram parasitemia, produção de
anticorpos (IgA, IgM e IgG) e alterações eletrocardiográficas, além de ter observado
miocardite crônica difusa, fibrose e produção de citocinas similares aos encontrados em
pacientes chagásicos. O cão torna-se um modelo ainda mais viável, uma vez que já foi
demonstrado que ele apresenta resposta imune à fase aguda e crônica muito similar àquela
encontrada em humanos, além de apresentar um quadro clínico e patológico semelhantes
(Laranja & Andrade, 1980; Lana e cols., 1992; Guedes e cols., 2009).
Diante do exposto, o cão se apresenta como um modelo ideal dentro dos requisitos
estabelecidos pelo Comitê de Doença de Chagas do Programa Especial de Treinamento e
Pesquisa de Doenças Parasitárias da Organização Mundial de Saúde (WHO, 1984) por:
1. Permitir o isolamento do parasito ao longo da infecção;
2. Apresentar reações sorológicas positivas indicativas da persistência da infecção;
3. Apresentar manifestações clínicas da doença de Chagas crônica;
4. Desenvolver miocardite, miosite e outras alterações patológicas que caracterizam a
doença;
5. Induzir resposta imune contra tecido do hospedeiro.
Portanto, diante de um modelo experimental que reproduza as fases da infecção
chagásica tal como no humano, podemos então, comprovar se de fato as estatinas exercem
um papel protetor ao funcionamento cardíaco nesses animais infectados pelo T. cruzi e, se
tais efeitos podem ser mensuráveis através de biomarcadores utilizados na clínica médica
como, por exemplo, a troponina estimulando, assim, estudos futuros em pacientes
chagásicos.
Objet ivos
- 11 -
2. Objetivos
2.1 Objetivo geral
Avaliar o papel da troponina I associada às alterações funcionais e histopatológicas
cardíaca em cães infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados com sinvastatina.
2.2 Objetivos específicos
(i) Avaliar a concentração da troponina I sérica como marcador de lesão
durante a fase aguda e crônica da infecção experimental pelo T. cruzi;
(ii) Avaliar o processo inflamatório cardíaco e os diferentes tipos de colágenos
de cães infectados com T. cruzi nas fases aguda e crônica, tratados ou não
com sinvastatina durante 6 meses;
(iii) Avaliar as alterações elétricas (ECG) e funcionais (ecocardiografia)
cardíacas de cães infectados com T. cruzi nas fases aguda e crônica, tratados
ou não com sinvastatina durante 6 meses;
Animais, materiais e métodos
- 12 -
3- Animais, material e métodos.
3.1 Descrição do modelo canino
Para esse estudo foram utilizados 15 cães, sem raça definida e de ambos os sexos,
mantidos no canil do Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro
Preto. Todos os animais foram alimentados durante o estudo com ração comercial para
cães, água ad libitum sendo os mesmos, previamente, tratados com anti-helmínticos e
vacinados contra doenças infecciosas.
A distribuição dos animais empregados nesse estudo procedeu da seguinte forma: 5
não foram infectados pelo T. cruzi (grupo controle) e os outros 10 cães foram inoculados
com a cepa Y do T. cruzi, sendo que 5 foram tratados diariamente com 20mg de
sinvastatina e os outros 5 apenas com o veículo utilizado para diluir o fármaco.
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os princípios éticos de
experimentação animal, pré-estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de Experimentação
Animal (COBEA) e também foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal
(CEUA) da Universidade Federal de Ouro Preto (número 2009/28).
3.2 Inoculação dos animais e avaliação da parasitemia
Aos quatro meses de idade, dois grupos de 5 cães foram inoculados com 2.000
formas tripomastigotas sanguíneas/Kg corporal, via intraperitoneal. Os parasitos foram
obtidos do sangue de camundongos Swiss infectados com a cepa Y do T. cruzi e mantidos
pela equipe do laboratório de doença de Chagas da UFOP no CCA da UFOP.
A partir do 1º dia de inoculação foi coletado, diariamente, 5l de sangue da veia
marginal da orelha dos cães para a confirmação da infecção e contagem dos parasitos,
através da análise microscópica do sangue à fresco. A quantificação dos parasitos foi
realizada de acordo com a técnica descrita por Brener (1962) até o 15º dia de infecção.
Animais, materiais e métodos
- 13 -
3.3 Esquema terapêutico
O tratamento com a sinvastatina foi iniciado no dia da infecção e realizado
diariamente, ao final da tarde, com comprimidos contendo 20 mg de Sinvastatina (Sanval
Ltda, S.P.), administrados individualmente por via oral. Como forma de auxiliar e
assegurar a deglutição do medicamento foi administrado água, por meio de uma seringa
concomitantemente com o comprimido. A dose foi estabelecida em função da dose
humana, empregada não para a reversão da hipercolesterolemia primária, mas para
prevenção de danos cardiovasculares (Rosendo e cols., 2007) sendo o cálculo realizado de
acordo com o peso dos animais. A biodisponibilidade do fármaco varia com o peso, mas
os animais selecionados para o estudo apresentavam medidas de comprimento e peso,
semelhantes.
3.4 Quantificação de Troponina I sérica
Para quantificação da troponina I sérica foram coletados 10 mL de sangue de cada
animal, através da veia femural. O sangue foi coletado em tubos falcon de 15mL. As
amostras foram, imediatamente após a coleta, centrifugadas a 3000rpm durante 10
minutos. O sobrenadante (soro) foi armazenado em tubos da marca eppendorf de 0,5 mL à
-80ºC para posterior análise. As coletas sanguíneas dos animais foram feitas antes da
inoculação dos parasitos, aos 3 e 6 meses de infecção.
Foram utilizados cartuchos i- STAT®
cTnI utilizando como analisador o clínico
portátil i- STAT®1. De forma geral, o cartucho de teste i- STAT
® utiliza o método de
ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) em dois locais. Os anticorpos específicos
para a troponina cardíaca I humana estão localizados num sensor eletroquímico fabricado
num chip de silicone. Em outro local do chip de silicone do sensor encontra-se também
depositado um conjugado enzimático de fosfatase alcalina/anticorpo específico de uma
porção separada da molécula de cTnI. Assim, a amostra de soro entra em contato com os
sensores, permitindo a dissolução do conjugado enzimático na amostra alvo. A cTnI na
amostra fixa-se com a fosfatase alcalina, sendo arrastada para a superfície do sensor
eletroquímico durante um período de incubação de, aproximadamente, sete minutos.
Procede-se à lavagem dos sensores para retirar a amostra, assim como o conjugado
enzimático em excesso. No fluído de lavagem encontra-se um substrato para a enzima de
fosfatase alcalina. A enzima ligada ao complexo tipo “sandwich” de
anticorpo/antígeno/anticorpo cinde o substrato liberando um produto detectável
Animais, materiais e métodos
- 14 -
eletroquimicamente. O sensor eletroquímico mede este produto enzimático que é
proporcional à concentração de cTnI presente na amostra. Para cada análise, foram
utilizados 16µL de soro. O teste apresenta resultados no intervalo de 0,00 a 50ng/mL.
Cada cartucho i- STAT®
cTnI contém uma entrada para amostras, sensores para
detectar cTnI e todos os reagentes necessários para a realização do teste. Em seguida é
apresentada uma lista dos ingredientes reativos:
Ingredientes reativos Origem biológica Composição %
Conjugado de fosfatase
alcalina/anticorpo
IgG caprina: Intestino
bovino
0,005µg
IgG IgG caprina: IgG murina 4 µg
Fosfato aminofenil de sódio N/A 700 µg
heparina Intestino porcino 0,4 IU
3.5 Avaliação eletrocardiográfica
O eletrocardiógrafo utilizado nesta avaliação foi o modelo ECG 06, ECAFIX-
FUNBEC, São Paulo- Brasil. Para este processo, os cães foram anestesiados com 0,5
mL/Kg de peso corporal do anestésico Tiopental sódico (0,03 g/mL de solução salina
0,9%) via endovenosa e foram posicionados em decúbito lateral direito, com os membros
mantidos em ângulos direitos em relação ao corpo e paralelamente um ao outro, sobre uma
superfície isolante elétrica (Ettinger & Suter, 1970).
A padronização foi de 1mV/cm e velocidade de 50mm/seg. Os eletrodos foram
adaptados em agulhas 13 x 0,38mm que foram introduzidas na pele dos animais durante o
exame. As derivações registradas foram as periféricas (DI, DII, DIII, aVL e aVF) e as
precordiais (V10, CV5RL ,CV6RL e CV6LU). As leituras e interpretações foram feitas
por um especialista que não conhecia a situação dos cães. Essas avaliações foram
realizadas antes da infecção (4 meses de idade), 3 meses pós infecção (7 meses de idade) e
6 meses pós infecção (10 meses de idade).
Animais, materiais e métodos
- 15 -
3.6 Avaliação ecocardiográfica
Os animais foram anestesiados com 0,5 mL/Kg corporal de Tiopental sódico (0,03
g/mL de solução salina 0,9%) por via endovenosa e logo após posicionados em decúbito
lateral direito, com os membros mantidos em ângulo de 90º em relação ao corpo, sobre
uma superfície isolante elétrica.
A avaliação ecodopplercardiográfica foi realizada de forma sistematizada, por um
só examinador experiente, utilizando-se aparelhagem de ecocardiografia portátil Cypress
dotada dos modos Unidimensional, Bidimensional, Doppler pulsado, contínuo,
mapeamento de fluxo em cores e adaptado para obtenção do Doppler tecidual. Utilizou-se
transdutor multifreqüencial de 3,0-3,5 MHZ, com registro eletrocardiográfico simultâneo.
Utilizou-se a técnica convencional de exame, já estabelecida na literatura (Sahn e
cols.,1978; Feingenbaum, 1994), empregando-se as diversas modalidades do exame
ecocardiográfico acima descritas. Os cortes ecocardiográficos foram realizados com o
paciente posicionado em decúbito lateral esquerdo, inicialmente na posição paraesternal,
onde foram obtidos os cortes longitudinais do ventrículo esquerdo e cortes transversais ao
nível da valva mitral e músculos papilares e, em seqüência, na posição apical, onde foram
obtidos os cortes de quatro, duas e cinco câmaras (Oh e cols., 2006).
Através da análise combinada das técnicas Unidimensional, Bidimensional e
Doppler foram avaliadas as dimensões cardíacas, a funções sistólica e diastólica ventricular
esquerda e a contratilidade global e segmentar do VE. Ao longo da sistemática do exame,
procurou-se identificar a presença de trombos, aneurismas, regurgitações valvares,
hipertensão pulmonar e alterações pericárdicas.
As medidas ao Unidimensional foram guiadas pela imagem ao Bidimensional e
realizadas no pico da onda R, identificado através do registro eletrocardiográfico
simultâneo de uma derivação. Foram seguidas as recomendações da Sociedade Americana
de ecocardiografia para obtenção das medidas ecocardiográficas. Foram mensurados os
diâmetros diastólicos da raiz de aorta, do átrio esquerdo e do ventrículo esquerdo, a
espessura diastólica do septo interventricular; a espessura diastólica da parede posterior do
ventrículo esquerdo e o diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo. A partir dessas medidas
e utilizando-se o sistema de cálculos automáticos do equipamento, foram calculados os
parâmetros ecocardiográficos de avaliação da função sistólica ventricular esquerda ao
Unidimensional fração de ejeção do ventrículo esquerdo pela fórmula de Teichholz e cols.
Animais, materiais e métodos
- 16 -
(1976) e o percentual de encurtamento sistólico. A massa ventricular esquerda foi
calculada segundo recomendações da American Society of Echocardiography.
A avaliação ao Bidimensional envolveu a mensuração dos volumes sistólico e
diastólico finais do ventrículo esquerdo nos cortes apicais de duas e quatro câmaras,
utilizando-se a fórmula de Simpson biplanar para cálculo da fração de ejeção (Wyatt e
cols., 1980). Qualitativamente, foram também avaliadas, ao Bidimensional, ao Doppler e
ao color Doppler, a morfologia e movimentação das valvas cardíacas, o grau de
regurgitação valvar, a morfologia e dimensões das câmaras cardíacas, a espessura e textura
miocárdicas. Avaliou-se, ainda, qualitativamente, a contratilidade global e segmentar das
paredes do ventrículo esquerdo utilizando-se o modelo de subdivisão do ventrículo
esquerdo em 16 segmentos, segundo proposto pela American Society of Echocardiography
nas projeções paraesternal e apical (Oh e cols., 2006), presença de trombos, aneurismas e
alterações pericárdicas. Sempre que possível obteve-se uma estimativa da pressão sistólica
em artéria pulmonar através da mensuração da velocidade máxima da regurgitação
tricúspide.
3.7 Necrópsia e coleta de fragmentos cardíacos
Os cães foram eutanasiados e, a seguir, necropsiados por um patologista
experiente, aos seis meses de infecção. Assim, o coração foi removido para análise
microscópica. Em seguida, foram feitos cortes da parede atrial direita de todos os cães. Os
fragmentos obtidos foram armazenados em formol 10% tamponado (temperatura
ambiente) para análises histopatológicas. No processo de fixação esses fragmentos são
primeiramente desidratados em concentrações crescentes de álcool etílico por 30 minutos
em cada concentração (70%, 80%, 90% e 100%). Depois esses tecidos são diafanizados
em dois banhos de xilol de 10 minutos cada. E a última etapa de fixação é a inclusão em
parafina também em dois banhos de 10 minutos cada para assegurar que todo xilol foi
removido.
3.8 Quantificação dos diferentes tipos de colágeno
Para a avaliação dos diferentes tipos de colágenos presentes no átrio direito, foi
utilizada a coloração de picrosirius red, um composto aniônico que distingue a espessura e
densidade das fibras de colágeno pela coloração emitida sob a luz polarizada. Enquanto as
fibras finas dissociadas típicas do colágeno tipo III são esverdeadas, as fibras mais grossas
Animais, materiais e métodos
- 17 -
fortemente associadas do colágeno tipo I emitem cores com comprimento de ondas
maiores, como vermelho e amarelo (Kesler e cols., 2000).
A área de colágeno foi quantificada por meio da análise (analisador de imagens
Leica Qwin V3) de 20 imagens aleatórias das lâminas de fragmentos (5µm) do átrio direito.
Essas imagens foram vizualizadas na objetiva de 10x e digitalizadas através da
microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application Suite versão 2.4.0R1).
(i) Técnica do picrosirius red
Cortes seriados dos fragmentos cardíacos de cada cão foram desparafinizados em
imersões de xilol, hidratados em soluções alcoólicas de concentrações decrescentes e
lavados em água corrente. Em seguida, os cortes foram corados pelo picrosirius red por
60 minutos, lavados em água corrente e corados pela hematoxilina por 1 minuto e 30
segundos e novamente lavados em água corrente. Após esse processo, as lâminas foram
para estufa para secagem e depois montadas com Entellan.
3.9 Quantificação de núcleos celulares no átrio direito
Os núcleos celulares foram quantificados em 20 imagens (campos) aleatórias que
foram coradas pela técnica de hematoxilina e eosina. As imagens visualizadas pela objetiva
de 40x foram digitalizadas através de microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application
Suite, versão 2.4.0R1) e processadas por meio do programa analisador de imagens Leica
Qwin V3. A miocardite foi determinada pela média do número de núcleos celulares
presentes nas imagens dos animais controles não infectados mais dois desvios padrões,
assim, os cães infectados com o T. cruzi com valores da quantificação de núcleos
celulares acima desta média foram considerados com inflamação cardíaca.
(i) Técnica de Hematoxilina & Eosina (H&E)
Para análise e quantificação do infiltrado inflamatório, fragmentos do tecido
cardíaco foram corados pela H&E. Cortes seriados da parede atrial direita de cada cão
infectado foram desparafinizados em imersões em xilol, hidratados em soluções alcoólicas
de concentrações decrescentes e lavados em água corrente e em tampão fosfato
(PBS). Em seguida, os cortes foram corados pela hematoxilina, lavados em água corrente
e diferenciados rapidamente em álcool acidulado e corados pela Eosina. Após o último
Animais, materiais e métodos
- 18 -
processo de lavagem em água corrente, foram levados até a estufa para secagem.
Posteriormente colocados em banho de xilol e, então, montadas as lâminas com auxílio de
Entellan.
3.10 Análise Estatística
Para os dados (quantificáveis) entre os grupos de animais estudados, utilizou-se o
teste não paramétrico de Kruskal-Wallis com intervalo de confiança de 95%. As análise
foram realizadas no GraphPad prism versão 5.
Resultados
- 19 -
4- Resultados
4.1 Curva de parasitemia dos animais infectados com T. cruzi
A parasitemia dos animais foi avaliada diariamente pelo exame de sangue a fresco.
Não foram observadas diferenças no o período pré-patente (3 a 4 dias) entre os grupos
infectados tratados ou não com a Sinvastatina. No entanto, observou-se (Fig. 1) que os cães
infectados sem tratamento apresentaram pico de parasitemia no 13° dia, enquanto aqueles
infectados e tratados diariamente com sinvastatina (20mg) apresentaram antecipação do
pico, sendo este no 8° dia pós infecção.
0 5 10 150
1
2
3
4
5
T.cruzi
T. cruzi + Sinvastatina
**
*
Dias pós infecção
Parasi
tos/
0.1
ml
de s
an
gu
e
(x1
03)
Figura 1: Curva de parasitemia de cães infectados com 2.000 formas tripomastigotas
sanguíneas/kg de peso da cepa Y do Trypanosoma cruzi via intraperitoneal. Os círculos
cinza representam animais infectados sem tratamento e os círculos em negrito os animais
infectados tratados com sinvastatina. * p<0.05 realizado entre os animais em cada dia da
parasitemia pelo test t-student.
4.2 Quantificação da troponina I sérica
Quanto à quantificação sérica da troponina I, observou-se elevação nos níves
séricos nos animais em fase aguda da infecção (Fig 2). O tratamento com doses diárias de
sinvastatina propiciou uma redução da produção da troponina I durante a mesma fase, em
relação ao grupo de animais infectado e não tratado (p= 0,0195).
Aos seis meses de infecção, considerada fase crônica recente, os níveis séricos
da troponina I em todos os grupos voltam ao estado basal em torno de 0,02ng/mL.
Resultados
- 20 -
0.00
0.05
0.100.2
0.3
0.4
T.cruzi T.cruzi + sinvastatinaNão infectado
Mês 0 Mês 3 Mês 6
Tro
po
nin
a I
(n
g/m
L)
*
Figura 2: Nível sérico da troponina cardíaca I determinado por cartuchos i- STAT®
cTnI e
mensurados antes e durante as fases aguda e crônica recente da infecção pelo Trypanosoma
cruzi. As cores das barras no gráfico, como indicadas, representam animais não infectados
(brancas), infectados (cinza) e infectados tratados com sinvastatina (preto), sendo o *
indicativo de diferença estatística p<0.05 em relação aos demais grupos.
4.3 Efeito da sinvastatina sobre a condução elétrica cardíaca
4.3.1 Duração da onda P
A análise comparativa da duração da onda P indica alterações atriais e,
indiretamente, sobrecarga ventricular esquerda. Na figura 3 é observada a ausência de
anormalidades na duração da onda P, bem como entre as medianas (0.03 e 0.04 segundos)
dos grupos nos diferentes tempos de infecção.
Resultados
- 21 -
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
Não infectado T.cruzi T.cruzi + sinvastatina
mês 0 mês 6mês 3
Du
ração
on
da P
(s)
Figura 3: Duração da onda P (s) em cães sem raça definida, infectados pelo Trypanosoma
cruzi e tratados com Sinvastatina (cinza escuro) ou sem tratamento (cinza claro). Animais
não infectados foram utilizados como grupo controle (branco). A avaliação foi realizada
antes da infecção (mês 0), no 3o e no 6
o mês após a inoculação. Não foram encontradas
diferenças estatísticas entre os grupos p>0.05.
4.3.2 Duração do intervalo P-R
O intervalo PR reflete o tempo de condução elétrica pelo nodo átrio ventricular. Na
figura 4 observa-se que antes da infecção todos os grupos apresentavam-se semelhantes.
No entanto, durante a fase aguda houve diferença entre os grupos infectados e aquele não
infectado, não havendo diferenças associadas à sinvastatina. Durante a fase crônica esse
parâmetro permaneceu inalterado em relação ao mês 0 em todos os grupos experimentais.
Resultados
- 22 -
0.05
0.10
0.15
mês 0 mês 6mês 3
a,b
a,b
a,b
a
b a,b a,b
a,b a,b
Não infectado T.cruzi T.cruzi + sinvastatina
Du
ração
iP
R (
s)
Figura 4: Duração do intervalo P-R de cães sem raça definida infectados com o
Trypanosoma cruzi. Esses animais foram tratados (cinza escuro) ou não (cinza claro) com
sinvastatina (20mg) e os animais não infectados utilizados como controle encontram-se
representados pelos boxes brancos. A avaliação foi realizada antes da infecção (mês 0), no
3o e no 6
o mês após a inoculação. Letras diferentes significam diferença estatística p<0.05.
4.3.3 Duração de QRS
A duração do complexo QRS pode indicar o aumento ventricular, bloqueios dos
ramos direito e esquerdo do feixe de His, além de contrações ventriculares prematuras. Na
figura 5 observa-se que durante o mês 0 todos os animais apresentaram a duração de QRS
similares. Aqueles cães tratados com sinvastatina tiveram aumento deste parâmetro no 3º
mês em relação ao período anterior à infecção (mês 0). No mês 6 houve diferença entre os
grupos infectados e o grupo sem infecção sendo, no entanto, equivalentes aos valores
observados com a fase aguda (3 meses).
Resultados
- 23 -
0.00
0.05
0.10
0.15
a
a,d a
a
a,b,c,d
b,c,d
a
c,d
d
mês 0 mês 6mês 3
Não infectado T.cruzi T.cruzi + sinvastatina
Du
ração
QR
S (
s)
Figura 5: Duração de QRS de cães sem raça definida infectados pelo Trypanosoma cruzi e
tratados (cinza escuro) ou não (cinza claro) com sinvastatina (20mg). Animais não
infectados foram utilizados como controle (branco). A avaliação foi realizada antes da
infecção (mês 0), no 3o e no 6
o mês após a inoculação e letras diferentes significam
diferença estatística p<0.05.
4.3.4 Alterações eletrocardiográficas detectadas
As alterações qualitativas detectadas ao ECG nos animais infectados pelo T. cruzi e
infectados e tratados com Sinvastatina encontram-se representadas na Tabela 1. Aos 3
meses pós infecção (MPI) foram observadas alterações ao ECG em 20% dos cães
infectados pelo parasito (1/5 animais) e de 40% nos cães infectados e tratados com
sinvastatina (2/5animais). A evolução da infecção foi demonstrada pelo aumento do
número de animais que apresentaram alterações ao ECG realizado nos 6 MPI naqueles
cães infectados apenas, uma vez que aos 3 MPI apenas 1 animal apresentava alteração e
aos 6 MPI este número subiu para 3 animais. No entanto, no grupo infectado e tratado com
a Sinvastatina, o número de cães com alterações qualitativas ao ECG permaneceu
inalterado, todavia é importante salientar que houve regressão em 1 cão que aos 3 MPI
apresentava bloqueio do ramo esquerdo de 3° grau e ao final do estudos apresentava
bloqueio do ramo esquerdo de 2° grau.
Resultados
- 24 -
Tabela 1: Tabela de alterações eletrocardiográficas qualitativas apresentadas em cães
infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados ou não com sinvastatina (20mg). Animais
não infectados foram utilizados como parâmetros de normalidade. A avaliação foi
realizada no 3o e no 6
o mês após a inoculação.
Infectados Infectados +
sinvastatina
Alterações de ECG Normais 3 MPI 6 MPI 3 MPI 6 MPI
BRE- 1° grau 0/5 1/5 1/5 0/5 0/5
BRE- 2° grau 0/5 0/5 0/5 0/5 1/5
BRE- 3°grau 0/5 0/5 0/5 2/5 1/5
HBAE 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5
BA-V 1° grau 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5
ECG anormal/cão 0/5 1/5 3/5 2/5 2/5
(0%) (20%) (60%) (40%) (40%)
MPI: meses pós infecção, BRE: bloqueio do ramo esquerdo, HBAE: hemi-bloqueio anterior
esquerdo, BA-V: bloqueio átrio-ventricular.
Na figura 6 estão mostrados traçados eletrocardiográficos representativos de
alterações encontradas. As figuras 6A, B e C mostram um traçado eletrocardiográfico de
cães infectados (sendo em C tratado com sinvastatina) com aumento na duração do
complexo QRS. O impulso ventricular esquerdo é retardado, de modo que o ventrículo
direito se despolariza antes, dando-se a seguir a despolarização do ventrículo esquerdo,
caracterizando bloqueio do ramo esquerdo, porém em graus diferentes (6A- 1° grau, 6B- 2°
grau e 6C- 3°grau). A figura 6D mostra um traçado eletrocardiográfico de um cão
infectado pela cepa Y com aumento do intervalo PR, caracterizando bloqueio
atrioventricular de 1°grau (BAV 1°grau).
Resultados
- 25 -
Figura 6: Traçados eletrocardiográficos obtidos de cães infectados com 2.000
tripomastigotas/kg da cepa Y do T. cruzi. (A) Bloqueio ramo esquerdo 1° grau (B)
Bloqueio ramo esquerdo 2° grau (C) Bloqueio ramo esquerdo 3° grau (D) Bloqueio átrio
ventricular 1° grau (F).
A
D
C
B
Resultados
- 26 -
4.4 Efeitos da sinvastatina sobre a função cardíaca
4.4.1 Fração de Ejeção
A medida da fração de ejeção (FE) é de grande relevância na avaliação da função
sistólica ventricular esquerda. Na Figura 7, avaliação realizada pelo método de discos de
Simpson, a FE mostrou-se inalterada ao mês 0 e também ao mês 3 entre todos os grupos
experimentais. Durante a fase crônica recente da infecção (mês 6) foi observada uma queda
nesse parâmetro nos animais infectados e naqueles infectados tratados com Sinvastatina,
mas não havendo diferenças entre esses dois grupos (p>0,05).
50
60
70
80
90
Não infectado T.cruzi T.cruzi + sinvastatina
mês 0 mês 3 mês 6
Fração
de e
jeção
(%
)
aa
a a a a
bb
a,b
Figura 7: Fração de ejeção ventricular em cães sem raça infectados pelo Trypanosoma
cruzi e tratados (cinza escuro) ou não (cinza claro) com sinvastatina (20mg). Animais não
infectados foram utilizados como parâmetros de normalidade (branco). A avaliação foi
realizada antes da infecção (mês 0), no 3o e no 6
o mês após a inoculação e letras diferentes
significam diferença estatística p<0.05.
4.4.2 Índice de Massa do Ventrículo Esquerdo
O índice de massa do ventrículo esquerdo (IMVE) reflete uma dilatação cardíaca,
possivelmente associada a um grau de hipertrofia e fibrose. Na Figura 8 podemos observar
que no mês 0 não houve diferença entre os grupos avaliados. Durante a fase aguda da
infecção (mês 3) observamos redução deste parâmetro no grupo de animais infectados, em
Resultados
- 27 -
relação ao grupo infectado tratado (p= 0,0159). Já no 6º mês, observamos novamente
ausência de diferença entre os grupos. De modo geral, o grupo infectado permaneceu sem
alterações significativas no decorrer da infecção. O grupo que recebeu tratamento com
Sinvastatina apresentou aumento deste parâmetro na transição do mês 0 para o meses 3,
não sendo encontrada diferença entre os meses 3 e 6.
0
100
200
300
T.cruzi + sinvastatinaT.cruziNão infectado
mês 0 mês 6mês 3
a,b,c
a,b,c
ba,b,c
b,c
a
a,c
a,b,c
a,b,c
índ
ice d
e m
ass
a V
E (
g/m
2)
Figura 8: Índice de massa do ventrículo esquerdo mensurado por ecocardiografia em cães
sem raça infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados (cinza escuro) ou não (cinza claro)
com sinvastatina (20mg). Animais não infectados foram utilizados como parâmetros de
normalidade (branco). A avaliação foi realizada no mês 0 (antes da infecção), no 3o e no 6
o
mês após a inoculação e letras diferentes significam diferença estatística p<0.05.
4.4.3 Tempo de Relaxamento Isovolumétrico
O tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV) é uma medida obtida pela
ecocardiografia e expressa algumas alterações patológicas na função cardíaca diastólica.
Na Figura 9 observamos ausência de diferença entre todos os grupos experimentais no
decorrer dos tempos de infecção. No entanto, dentro do grupo tratado com sinvastatina
houve um aumento deste parâmetro na progressão dos animais para a fase aguda da
infecção, não havendo essa progressão durante a fase crônica recente (6 meses).
Resultados
- 28 -
40
60
80
100
120
a,b a,ba
a,b
a,b
b
a,b
Não infectado T.cruzi T.cruzi + sinvastatina
a,b a,b
mês 0 mês 6mês 3
TR
IV (
m/s
)
Figura 9: Tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV) mensurado por ecocardiografia
em cães infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados (cinza claro) ou não (cinza escuro)
com sinvastatina (20mg). Animais não infectados foram utilizados como parâmetros de
normalidade (branco). A avaliação foi realizada antes da infecção (mês 0), no 3o e no 6
o
mês após a inoculação e letras diferentes significam diferença estatística p<0.05.
4.4.4 Volume do átrio esquerdo
A medida do Volume do Átrio Esquerdo, mais correlacionada à avaliação da
função diastólica do VE, foi realizada pelo método uniplanar de Simpson, ao final da
sístole, na projeção apical de quatro câmaras. Na Fig. 10 pode-se observar que não foram
encontradas diferenças estatísticas entre os grupos estudados em nenhum dos tempos de
infecção.
Resultados
29
5
10
15
20
Não infectado T.cruzi T.cruzi + sinvastatina
mês 0 mês 3 mês 6
Vo
lum
e A
E (
mL
)
Figura 10: Volume do átrio esquerdo mensurado por ecocardiografia em cães infectados
pelo Trypanosoma cruzi e tratados (cinza claro) ou não (cinza escuro) com sinvastatina
(20mg). Animais não infectados foram utilizados como parâmetros de normalidade
(branco). A avaliação foi realizada antes da infecção (mês 0), no 3o e no 6
o mês após a
inoculação. Não houve diferença estatística entre os grupos estudados.
4.5 Análise quantitativa do infiltrado inflamatório e da fibrose no átrio direito
O átrio direito é considerado a região onde a miocardite chagásica canina processa-
se com maior intensidade (Caliari e cols., 2002). Na avaliação microscópica do átrio
direito os animais infectados pelo T. cruzi sem tratamento com Sinvastatina apresentaram
maiores índices de infiltrado inflamatório do que aqueles cães infectados e tratados, como
representado através das fotomicrografias coradas com hematoxilina & eosina
apresentadas na figura 11.
De modo diferente, a área fibrose do átrio direito do grupo de animais infectados
foi maior do que a área encontrada nos animais infectados submetidos ao tratamento, como
apresentado pelas fotomicrografias da figura 12.
Resultados
30
0
100
200
300
T.cruzi + sinvastatinaT.cruzi
a
b
c
Não infectado
Nú
cle
os/7
49
31
m2
Figura 11: Sinvastatina reduz o infiltrado inflamatório no átrio direito. Representação
quantitativa de células inflamatórias no átrio direito de cães infectados e infectados
tratados com sinvastatina 20mg. Fotomicrografias de fragmentos do átrio direito de
animais não infectados (A), infectados (B) e infectados tratados (C). Coloração:
Hematoxilina & Eosina. Barra=10 micrômetros. Letras diferentes significam diferença
estatística p<0.05.
Resultados
31
0
20000
40000
60000
80000
T.cruzi T.cruzi + sinvastatinaNão infectado
a
b
bÁ
rea d
e f
ibro
se
/14
31
40
5
m2
Figura 12: Representação quantitativa de área de colágeno no átrio direito de cães
infectados e infectados tratados com sinvastatina 20mg . Fotomicrografias de fragmentos
do átrio direito de animais não infectados (D), infectados (E) e infectados tratados (F).
Coloração: picrossirius red. Barra=10 micrômetros. Letras diferentes significam diferença
estatística p<0.05.
D F E
Resultados
32
4.6 Análise da área das diferentes fibras colágenas encontradas no átrio direito
Foram encontradas três cores representativas para as fibras colágenas: (i) fibras
finas dissociadas típicas do colágeno tipo III e representadas pela cor verde, (ii) fibras mais
espessas associadas ao colágeno tipo I e emitem cores com comprimento de ondas maiores,
como vermelho e amarelo sob a luz polarizada (Kesler et al., 2000). Na figura 13 pode–se
observar que o grupo infectado apresentou maior área de colágeno tipo I e o grupo não
infectado apresentou maior área de colágeno tipo III em relação aos outros dois grupos
estudados.
0
20000
40000
60000
80000
Colágeno tipo IIIColágeno tipo I
Não infectado Infectado Infectado
tratado
Áre
a d
e c
olá
ge
no
I e
III
/14
31
40
5
m2
Figura 13: Área de fibras de colágeno presente no átrio direito de cães sem raça definida
infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados ou não com sinvastatina. Animais não
infectados foram utilizados como parâmetros de normalidade. A avaliação foi realizada aos
seis meses de infecção.
Discussão
33
5- Discussão
A busca por modelos experimentais para o estudo da patogênese da infecção pelo
Trypanosoma cruzi perpassa os 100 anos da primeira publicação sobre a descoberta da
doença causada pelo ainda denominado Schizotrypanum cruzi, pelo Dr. Carlos Justiniano
das Chagas em 1909 (Chagas, 1909). É considerado um bom modelo experimental aquele
capaz de reproduzir eventos clínicos/patológicos observados em indivíduos chagásicos,
além de permitir o isolamento do parasito no decorrer de toda infecção. Ainda, um bom
modelo de estudo para a infecção pelo T. cruzi deveria reproduzir as fases da doença
humana, além de algumas particularidades clínicas como a cardiopatia chagásica
fibrosante, os eventos da resposta imune e ainda ser passível de estudo de possíveis agentes
terapêuticos contra o parasito. Nesse sentido, o modelo utilizado no presente estudo, o cão,
tem sido proposto como um excelente modelo experimental por permitir a monitorização
das diferentes formas clínicas da infecção tanto aquelas presentes na fase aguda quanto
aquelas particulares da fase crônica (Andrade & Andrade, 1980; Lana e cols., 1988; Tafuri
e cols.,1988; Bahia e cols., 2002). Além disso, nosso grupo ainda demonstrou que este
modelo apresenta índices similares de cura aos observados em seres humanos em ambas as
fases da infecção (Guedes e cols., 2002).
Em consonância com o que se observa na doença de Chagas humana, a infecção
pelo T. cruzi em cães, também apresenta um substrato inflamatório decisivo para a
definição do curso clínico das manifestações cardíacas. A resposta imune aparece, nesse
caso, como essencial para a destruição do parasito, mas a responsável indireta pela
destruição celular e deposição, posterior, de colágeno e processo de fibrose no tecido
muscular cardíaco (Zhang e Tarleton, 1999). Não bastasse esse indicativo da resposta
imune conduzindo as lesões cardíacas durante a infecção pelo parasito, outras variáveis
também exercem importante papel no desenvolvimento das alterações clínicas: (i) a
genética do parasito – sabe-se que as diferentes cepas e Discrete Typing Units apresentam
tropismos diferentes e são capazes de desencadear intensidades diferenciadas da resposta
inflamatória no hospedeiro mamífero (Macedo e Pena, 1998; Guedes e cols., 2009;
Fernandes e Andrews, 2013); a genética do hospedeiro – da mesma forma que o parasito,
tem-se mostrado que a espécie animal infectada pelo T. cruzi reflete diretamente na
resposta inflamatória, na eliminação do parasito e no desenvolvimento de alterações
elétricas ou funcionais cardíacas (Andrade, 1999; Freitas e cols., 2009; Caradonna e cols.,
Discussão
34
2013); (iii) a carga parasitária – outro fator decisivo no processo de desenvolvimento das
alterações patológicas e clínicas na infecção pelo T. cruzi é o número de parasitos que
rompe as barreiras de proteção do hospedeiro e o invade. Sabe-se, por exemplo, que a
maioria dos estudos experimentais onde se trabalham com infecções variando de 102, 10
3,
104 formas tripomastigotas/hospedeiro apresenta respostas inflamatórias e danos teciduais
diferenciados (Marinho e cols., 1999; Borges e cols., 2012). Nesse sentido, o curso
fisiopatológico do hospedeiro mamífero passa a sofrer uma interferência exógena e, da
mesma forma, refletir em uma resposta clínica amenizada, exacerbada ou protetora.
Seguindo o ponto das interações farmacológicas, o presente estudo propôs avaliar,
utilizando o modelo cão, avaliar a interferência do grupo farmacológico das estatinas no
desenvolvimento inflamatório e funcional cardíacos na infecção pelo T. cruzi. As estatinas
vêm sendo alvo de diversos estudos, pois além de sua ação primária de fármaco
hipocolesterolêmico, têm também apresentado efeitos denominados pleiotrópicos, sendo
eles a melhoria da função endotelial, a diminuição da migração e proliferação das células
musculares lisas vasculares, a atenuação da remodelagem vascular e miocárdica e a
diminuição da inflamação vascular e da oxidação (Liao e Takemoto, 2001; Node e
cols.,2003; Calabro e Yeh, 2005; Laufs e Liao, 2005; Adam e Laufs, 2008, 2014). Há
alguns anos nosso grupo tem avaliado o uso de doses baixas de sinvastatina em modelo
camundongos e cães infectados pelo T. cruzi, observando nesses animais redução dos
níveis séricos de citocinas inflamatórias (IFN-γ,TNF-α) e quimiocinas (CCL2 e CCL5),
redução do processo inflamatório e na função cardíaca (Melo e cols., 2011; Silva e cols.,
2012).
No presente estudo trabalhamos com a dose de 20mg de sinvastatina/dia e com a
mesma cepa Y do T. cruzi utilizada por Melo e cols. (2011). Observou-se um pico de
parasitos circulantes no 8º dia pós-infecção, sendo maior nos animais tratados com
sinvastatina. Outros autores mostraram picos de parasitemia, com a mesma cepa do T.
cruzi, no 15º dia pós-infecção utilizando cães da raça Beagle. Neste estudo os animais não
apresentavam raça definido, reforçando a importância da genética do hospedeiro mamífero
para o curso da infecção pelo T. cruzi (Guedes e cols., 2007). Quanto ao pico mais elevado
em associação com a sinvastatina, é plausível imaginar que o tratamento com a sinvastatina
iniciada 24 horas após a infecção tenha alterado, em parte, a resposta imune desses animais
prejudicando o controle da replicação desses protozoários nos primeiros dias de infecção.
Discussão
35
Esse aspecto, se confirmado, torna-se questionável, pois uma resposta imune eficaz é
necessária para o controle do parasito, mas persistente passa a destruir as células do
próprio hospedeiro gerando os quadros clínicos conhecidos. Por essa razão, foram
avaliados três tempos distintos nesse estudo: uma fase inicial, uma fase intermediária e
uma fase final (crônica recente) em função dos diferentes parâmetros bioquímicos,
histopatológicos e clínicos desses animais infectados pelo T. cruzi.
Além do efeito direto nos parasitos circulantes, nesse estudo verificou-se, também,
que o uso diário de sinvastatina por seis meses preveniu a miocardite no átrio direito. Esse
achado histopatológico pode ser justificado pela propriedade da sinvastatina em inibir a
interação da LFA-1 (antígeno associado à função linfocitária 1), cujo papel relaciona-se
com a ativação e movimentação linfocitária, além de inibir também a molécula de adesão
intercelular-1(ICAM-1),inibindo parte do processo de recrutamento celular para os tecidos
(Pruefer e cols.,1999; Weitz-Schmidt e cols., 2001; Silveira e cols.,2013). Apesar da
redução da miocardite atrial, a sinvastatina não foi eficaz em diminuir a área de fibrose no
átrio direito. Martin e cols.(2005) mostraram, em culturas de fibroblastos humanos e de
ratos, que a atorvastatina reduzia a síntese de colágeno, a expressão RNAm do pro-
peptídeo aminoterminal do pró-colágeno tipo-1 e a expressão genética do peptídeo pró-
fibrótico do fator de crescimento do tecido conectivo. Da mesma forma, em outro estudo
avaliando hipertrofia cardíaca em ratos, o tratamento com pitavastatina reduziu a expressão
de genes hipertróficos e pró-fibróticos, além de reduzir a deposição de colágeno e da
fibrose intersticial (Saka e cols., 2006). Talvez a discordância dos nossos achados deva-se
a duas hipóteses: (i) o tipo de estatina utilizada, uma vez que diferentes enzimas estão
envolvidas no metabolismo das diferentes estatinas, levando a um único perfil de interação
droga-droga (Davignon, 2012) e (ii) o tempo de avaliação de 6 meses pós-infecção ter sido
suficiente para expressar a realidade da inflamação nesse sítio, mas insuficiente para
diferenciar o depósito de colágeno no átrio direito. Estudos anteriores em nosso grupo,
utilizando a mesma cepa do T. cruzi (cepa Y) em animais de raças distintas sob tratamento
com sinvastatina demonstrou redução no colágeno no ventrículo esquerdo após 6 meses de
infecção (Melo e cols., 2011).
Mesmo sem obter diferenças entre os grupos tratados e não tratados om
sinvastatina, optou-se por avaliar os tipos de colágeno utilizando a coloração picrossirius
red. Junqueira e cols. (1978) observaram que este tipo de coloração sob luz polarizada, as
Discussão
36
fibras colágenas mais espessas aparecem amarela ou amarela- vermelho (tipo I) enquanto
as fibras finas (tipo III) são verdes. Colágeno I e o colágeno III são componentes essenciais
do miocárdio mantendo a sua integridade estrutural e funcional. Por causa de suas
propriedades físicas diferentes, a alteração da razão colágeno I/III pode, portanto, ter um
impacto importante sobre a função diastólica e sistólica do coração. O colágeno III forma
uma rede elástica capaz de armazenar energia cinética como um elástico, enquanto o
colágeno I representa uma proteína fibrilar rígida fornecendo resistência à tração
(Pauschinger e cols., 1999). Portanto, os níveis de colágeno I poderia impor aumento na
rigidez do miocárdio (Lapiere e cols., 1977), fato observado em nosso estudo com
predominância do colágeno tipo I em todos os grupos infectados.
Com o aperfeiçoamento das estratégias para antecipar um diagnóstico e/ou realizar
o prognóstico clínico nos indivíduos chagásicos, tem havido uma redução nos índice de
óbitos entre esse grupo por receberem atenção e cuidados terapêuticos preventivos
(Gontijo e cols., 1996; Dias e Coura, 1997). Um importante marcador, utilizado na rotina
clínica, é a troponina cardíaca. As troponinas cardíacas são biomarcadores de alta
sensibilidade e especificidade para a degeneração do miocárdio em seres humanos e têm
sido consideradas como padrão ouro de diagnóstico e prognóstico associado a esta
patologia (Antman, 2002; Sarko e Pollack, 2002). Neste estudo foi observada sua elevação
sérica da troponina I em cães em fase aguda da infecção, sendo o tratamento com doses
diárias de sinvastatina capaz de preveni-la. A intensa destruição de fibras cardíacas descrita
para a fase aguda da infecção deve-se ao à acentuada miocardite, consequência da
multiplicação do T. cruzi e do infiltrado de células inflamatórias nas miofibrilas
especializadas do sistema de condução e no miocárdio contrátil. Nesses locais são
observadas áreas de destruição de fibras cardíacas parasitadas com liberação de formas
tripomastigotas, amastigotas e restos celulares, além de inúmeros fatores solúveis que são
altamente imunogênicos (Tafuri, 1979; Zhang e Tarleton, 1999). O tratamento com a
sinvastatina foi eficaz ao prevenir a destruição de cardiomiócitos durante a fase aguda da
infecção. Esta ação pode ter sido desencadeada pelos efeitos pleiotrópicos do fármaco que
estão associados com a inibição da síntese de citocinas inflamatórias, redução no
remodelamento ventricular e consequentemente redução da destruição das fibras cardíacas
(Elrod e Lefer 2005; Greer e cols., 2006; Devaraj e cols., 2007; Yeganeh e cols., 2014). No
entanto, o uso de biomarcadores inflamatórios para diagnóstico e prognóstico para a
Discussão
37
infecção pelo T. cruzi será utilizado como complemento às duas estratégias de avaliação
clínicas essenciais ao manejo do paciente chagásico: a eletrocardiografia e a
ecocardiografia.
A avaliação eletrocardiográfica é um exame de rotina e de baixo custo que nos
mostra uma variedade de anormalidades como arritmias cardíacas, alargamento e
hipertrofia de câmaras cardíacas, dentre outras (Tilley e cols., 2002; Nascimento e cols.,
2012). As alterações mais comuns encontradas ao ECG em humanos ou animais
experimentalmente infectados pelo T. cruzi são bloqueio completo do ramo direito,
bloqueio fascicular anterior esquerdo, arritmias ventriculares complexas, bloqueios átrio-
ventriculares e taquicardia sinusal (Pellegrino e cols., 1947, Laranja e cols., 1949, Lana e
cols., 1992, Rassi Jr e cols., 2009). O bloqueio do ramo esquerdo está presente em apenas 5
a 10% dos casos, mas é frequente em cardiopatias de outras etiologias (Almeida, 2004) e,
no presente estudo, foi a alteração mais encontrada (3/15 cães). Observamos, ainda,
alterações de duração do intervalo PR, que é indicativo de bloqueios no nodo átrio
ventricular, devido substituição de células cardíacas nessa região por fibras colágenas,
dificultando e tornando lento o processo de condução de estímulos nervosos por essa área.
E também foi observado um aumento no complexo QRS que é indicativo de bloqueios nos
ramos direito e esquerdo, devido a um atraso na despolarização de um dos ventrículos.
Muitos estudos clínicos e experimentais já demonstraram anormalidades ao ECG em
modelo murino e em infecção humana com aumento no intervalo PR (Postan e cols., 1987;
Garcia e cols.,2005; Williams-Blangero e cols.,2007) e na duração de QRS (Bustamante e
cols., 2002;Williams-Blangero e cols., 2007; Eickhoff e cols., 2010).
Finalmente, de acordo com o último Consenso Brasileiro em Doença de Chagas
(2005) o ecocardiograma, como mencionado anteriormente, apresenta-se como um exame
essencial para avaliação da função miocárdica, pois fornece dados da morfologia e
dinâmica/funcionalidade cardíaca e por ser um método de grande acurácia, não invasivo,
reprodutível e de fácil execução. A identificação de disfunção sistólica do ventrículo
esquerdo, correlacionada à variável fração de ejeção mensurada ao ecocardiograma, é de
extrema relevância pelo fato deste se constituir o mais forte preditor de morbidade e
mortalidade na doença de Chagas (Carrasco e cols., 1994; Viotti e cols., 2005; Nunes e
cols. 2008; Ribeiro e cols., 2008). Neste estudo, investigamos nos animais os seguintes
parâmetros: (i) a fração de ejeção para avaliar a função sistólica do ventrículo esquerdo,
Discussão
38
(ii) o índice de massa do ventrículo esquerdo para avaliação das dimensões ventriculares,
(iii) o tempo de relaxamento isovolumétrico e (iv) o volume do átrio esquerdo para se
avaliar a função diastólica VE. Bestetti e cols, em estudo com pacientes chagásicos,
definiram a presença de disfunção ventricular esquerda quando a fração de ejeção se
encontrava abaixo de 55%, o que foi evidenciado em 44 dos 74 indivíduos avaliados
(Bestetti e cols., 2011). Os animais deste estudo (infectados e infectados tratados)
mantiveram cerca de 60% de sua capacidade de ejeção, condição considerada normal para
os parâmetros funcionais cardíacos (Buckberg e cols., 2008).
Foi demonstrado, pelo nosso grupo, que a cepa Y apresenta intensa miocardite e
fibrose em cães com 24 meses de infecção, sendo mais patogênica que a cepa Berenice-78
(Guedes e cols., 2009). Outro estudo também do grupo demonstrou, em cães infectados
com a cepa Berenice-78, alterações na função cardíaca em animais infectados apenas aos
18 meses de infecção (Santos e cols., 2012). Esses dados estão de acordo com a evolução
clínica descrita para a cardiopatia chagásica – uma miocardite com processo inflamatório
clinicamente silencioso na fase aguda, mas que aumenta com o avançar da fase crônica, na
qual são evidenciados mecanismos patogênicos de hipoperfusão miocárdica contribuindo
com a característica disfunção do ventrículo esquerdo (Andrade e cols., 1997; Marin-Neto
e cols., 2007).
Em suma, nosso achados apontam para a sinvastatina como um importante alvo
terapêutico a ser melhor avaliado no modelo canino e, futuramente, em seres humanos.
Esse fármaco pode ser proposto como estratégia profilática para o remodelamento cardíaco
induzido pela infeção pelo T. cruzi, principalmente pela sinvastatina ser capaz de diminuir
a lesão cardíaca e consequentemente os níveis séricos de troponina I e minimizar algumas
alterações eletrofuncionais cardíacas. Essa proposta é apenas a ponta de um grande iceberg
considerando a complexidade da fisiopatologia da infecção pelo T.cruzi.
Conclusão
39
6- Conclusão
A sinvastatina foi eficaz em minimizar a miocardite causada pela infecção do
Trypanosoma cruzi no átrio direito, e consequentemente os níveis de troponina sérica na
fase aguda e promover regressão de um parâmetro eletrofuncional, sendo por isso,
potencial alvo de investigação terapêutica profilática na cardiopatia chagásica.
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