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AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA URINA, OSMOLARIDADE, pH e URÉIA SOBRE O ESPERMATOZÓIDE CANINO
ISRAEL PEREIRA DOS SANTOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
MARÇO, 2007
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA URINA, OSMOLARIDADE, pH E URÉIA SOBRE O ESPERMATOZÓIDE CANINO
ISRAEL PEREIRA DOS SANTOS
Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Orientador: Profª. Isabel Candia Nunes da Cunha
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
MARÇO, 2007
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA URINA, OSMOLARIDADE, pH E URÉIA SOBRE O ESPERMATOZÓIDE CANINO
ISRAEL PEREIRA DOS SANTOS
Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Aprovada em 29 de março de 2007. Comissão examinadora:
Profº. José Frederico Straggiotti Silva (Doutor, Reprodução Animal) - UENF
Profº. Marcelo Rezende Luz (Doutor, Reprodução Animal) – UFES
Profª. Maria Luisa Celia López Alvarez (Doutora, Ciências Biológicas) - UENF
Profª. Isabel Candia Nunes da Cunha-orientadora (Doutora, Reprodução Animal)-UENF
ii
FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca do CCTA/UENF 056/2007-09-27
Santos, Israel Pereira dos
Avaliação dos efeitos doa urina, osmolaridade, pH e uréia sobre oespermatozóide canino / Israel Pereira dos Santos. 2007.
51f.
Orientador: Isabel Candia Nunes da Cunha Dissertação (Mestrado em Produção Animal) – Universidade Estadual dp
Norte Fluminense Darcy ribeiro, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias.Campos dos Goytacazes, RJ, 2007.
Bibliografia: f.47-51.
1. Sêmen 2. espermatozóide 3. Canino 4. Urina 5. Reprodução Animal I.Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciências eTecnologias Agropecuárias. II. Título.
CDD – 636.70824
ii
“Ser autêntico carioca é possuir dignidade
de existir sem ambições supérfluas. É bastar-se a si mesmo na certeza
de ser um privi legiado do destino.”
Di Cavalcanti
iii
Aos meus pais, Cláudio e Denise,
ao meu irmão Pedro,
que além de serem a minha família,
são meus maiores amigos.
DEDICO
iv
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Norte Fluminense, pelo curso de Pós-graduação
em Produção Animal.
À Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior – CAPES,
pela concessão da bolsa de estudos.
À Professora Isabel Candia Nunes da Cunha pela orientação e por
proporcionar a oportunidade de trabalhar com reprodução de carnívoros.
Ao Professor Edésio Tenório de Melo pela co-orientação, auxiliando no
planejamento do experimento.
Aos amigos Marcelo Lobo, Maurício van Tilburg e Bethania Lopes pela
companhia tanto nas longas horas de trabalho, como também nos momentos de lazer
que a cidade de Campos me proporcionou.
Aos colegas e amigos do NuARC: Amanda, Carla, Cristina, Gabriela, Kassia,
Leonardo, Letícia, Márcia e Renata pelo aprendizado tanto durante as reuniões, quanto
durante o exercício da clínica reprodutiva de pequenos animais.
A André Gimenes, Helga Fernandes Gomes e Professora Maria Clara Caldas
Bussiere pela preciosa colaboração, permitindo que seus cães participassem do
experimento.
Ao Professor Osvaldo de Almeida Resende pela revisão final do texto e ao
Silvério Jr. pela contribuição na análise dos dados.
Aos alunos, técnicos e todos os funcionários do LRMGA que contribuíram
direta ou indiretamente para o meu trabalho.
v
BIOGRAFIA
ISRAEL PEREIRA DOS SANTOS, filho de Cláudio César dos Santos e Denise
Ferreira Pereira dos Santos, carioca de coração, nasceu em 11 de agosto de 1979 na
cidade de Brasília-DF.
Concluiu o curso técnico em Agropecuária pelo Colégio Técnico da
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), em Seropédica-RJ no ano de
1997 e o curso de Medicina Veterinária pela UFRRJ em 2004. Durante a graduação foi
monitor das disciplinas Fisiologia da Reprodução e Inseminação Artificial no
Departamento de Reprodução e Avaliação Animal do Instituto de Zootecnia da UFRRJ,
além de ser Bolsista da Prefeitura do Rio de Janeiro no Instituto Municipal de Medicina
Veterinária Jorge Vaitsman.
Foi admitido em março de 2005 no Curso de Pós-graduação em Produção
Animal, Mestrado, Biotecnologia da Reprodução, da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes, submetendo-se à defesa de
dissertação para a conclusão do curso em março de 2007.
vi
CONTEÚDO LISTA DE ABREVIAÇÕES..............................................................................................vii RESUMO........................................................................................................................viii ABSTRACT………………………………………………………………………………………ix 1. INTRODUÇÃO..............................................................................................................1 2. OBJETIVOS..................................................................................................................3
Objetivo geral:.............................................................................................................................3 Objetivos específicos:.................................................................................................................3
3. REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................................4 3.1) Coleta do sêmen .................................................................................................................4 3.2) Contaminação do sêmen por urina .....................................................................................5 3.3) Efeitos da urina sobre o sêmen...........................................................................................5 3.4) Como evitar os efeitos deletérios da urina sobre o sêmen .................................................8 3.5) Urina ....................................................................................................................................5 3.6) Sêmen .................................................................................................................................9 3.7) Espermatozóides...............................................................................................................10 3.8) Membrana Plasmática.......................................................................................................11 3.9. Fatores do meio que agem sobre os espermatozóides.....................................................13 3.10) Análise do sêmen ............................................................................................................18
4. Material e Métodos......................................................................................................20 4.1. Animais: .............................................................................................................................20 4.2. Avaliações seminais ..........................................................................................................20 4.2.1. Motilidade: .........................................................................................................21 4.2.2. Morfologia espermática: ....................................................................................21 4.2.3. Integridade de membrana:.................................................................................21 4.3. Procedimentos experimentais ...........................................................................................22 Experimento I – Efeitos de diferentes osmolaridades sobre as células espermáticas.22 Experimento II - Efeitos de diferentes pH sobre as células espermáticas...................25 Experimento III - Efeitos de diferentes concentrações de uréia...................................27 4.4. Modelo estatístico..............................................................................................................29
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................30 Experimento I – Efeitos de diferentes osmolaridades sobre as células espermáticas .............30 Experimento II – Comparação dos efeitos da urina com os efeitos de soluções com diferentes pH..............................................................................................................................................35 Experimento III – Efeitos da urina comparado aos efeitos de diferentes concentrações de uréia..................................................................................................................................................40
6. CONCLUSÕES...........................................................................................................46 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................47
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LISTA DE ABREVIAÇÕES
PKA – Proteína Kinase A
CASA – Computer-assisted semen analysis
µL – microlitro
µm/s – micrômetros por segundos
mM – milimolar
mOsmol/l – miliosmóis por litro
VAP – Velocidade do trajeto
VSL – Velocidade progressiva
VCL – Velocidade curvilinear
ALH – Amplitude lateral da cabeça
BCF – Freqüência dos batimentos da cauda
STR – Retilinearidade
LIN – Linearidade
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RESUMO
SANTOS, Israel Pereira dos. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro; março de 2007; Avaliação dos efeitos da osmolaridade, pH, uréia e urina sobre
o espermatozóide canino; Professora orientadora: Professora Isabel Candia Nunes da
Cunha. Professor conselheiro: Edésio Tenório de Melo.
A obtenção e a criopreservação de gametas são importantes ferramentas para a
conservação das espécies em extinção. Durante a coleta de sêmen dos canídeos pela
eletro-ejaculação observa-se a contaminação por urina, seja pela micção ou pela
ejaculação retrógrada. O sêmen contaminado com urina é de baixa qualidade e
dificilmente pode ser usado para criopreservação. Com o objetivo de avaliar a origem
da toxicidade da urina ao espermatozóide canino foram utilizados ejaculados e
amostras de urina de 4 cães, sendo o estudo dividido em três experimentos: I -
comparação do efeito da urina com o efeito causado pela alteração de osmolaridade
que variou de 300-1000mOsmol/l, II – comparação do efeito da urina com o da variação
de pH (5-9) e III - comparação do efeito da urina com o da uréia que variou de 3,5-14
mg/100ml de NaCl (150mM). Em todos os experimentos foram avaliados: movimentos
espermáticos (método computadorizado), morfologia espermática, integridade de
membrana espermática e integridade acrossomal, imediatamente após a adição das
soluções e após 60 minutos de incubação a 37ºC. Os resultados encontrados indicaram
que a redução na motilidade espermática causada pela urina está relacionada à
hiperosmolaridade, que o pH da urina é semelhante ao do sêmen e não é um fator
prejudicial ao espermatozóide canino e que as diferentes concentrações de uréia não
influenciaram as variáveis espermáticas avaliadas.
ix
ABSTRACT
SANTOS, Israel Pereira dos. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro; March 2007; Evaluation of the effect of the osmolaridade, pH, urea and urine on
the canine spermatozoon; Orienting teacher: Teacher Isabel Candia Nunes da Cunha.
Advising professor: Edésio Tenório de Melo.
Attainment and cryopreservation of gametes are important tools for the conservation of
endangerous species. During the semen collection of canids through eletroejaculation, it
is observed contamination by urine, either by micturition during ejaculation or by the
retrograde ejaculation. The semen contaminated with urine is of low quality and usually
can not be used for cryopreservation. With the objective of evaluating the origin of the
urine toxicity to the canine spermatozoa, semen and urine samples from 4 dogs were
used. The study was divided into three experiments: I - comparison between the effect
of urine and the effect caused by the osmolarity alteration, which varied from 300 to
1000mOsmol/l, II - comparison between the effect of urine and the one of pH variation
(5-9) and III - comparison between the effect of urine and the one of the urea, which
varied from 3,5 to 14 mg/100ml of NaCl (150mM). In all experiments it was evaluated:
spermatozoa motility (computerized method), morphology, membrane integrity and
acrossomal integrity, immediately after the addition of the solutions and after incubation
at 37 ºC during 60 minutes. The results indicated that the reduction in the spermatic
motility caused by urine is related to the high osmolarity, the urine pH value similar to the
semen is not a harmful factor to the canine spermatozoon and the different urea
concentrations had no influence on the evaluated parameters.
1
1. INTRODUÇÃO
A obtenção e conservação de gametas têm sido utilizadas para reproduzir
artificialmente animais de produção, companhia e selvagens. Entre os animais
selvagens, os canídeos ocupam uma posição de grande importância por serem
predadores, estarem no topo da cadeia alimentar e poderem servir de parâmetro na
avaliação da integridade de um habitat, pois segundo Rodrigues (2005), o equilíbrio da
população de predadores de uma região indica que a fauna e a flora daquele habitat
estão em equilíbrio.
O isolamento de populações ocasionado pelo desmatamento, leva ao
acasalamento entre animais com parentesco muito próximo – endogamia. Ainda que
algumas espécies possam viver bem com uma baixa diversidade genética, a perda da
heterozigose em algumas populações pode ter conseqüências desastrosas, se
refletindo na diminuição da viabilidade espermática; desenvolvimento de doenças como
a osteocondrose, paralisia laringotraqueal, neoplasias, doenças auto-imunes e alergias
alimentares (RODRIGUES, 2005).
Para aumentar a variabilidade genética nas populações isoladas é necessária a
criação de bancos genéticos, que por sua vez requerem a obtenção e criopreservação
de gametas (WATSON e HOLT 2001).
Cada espécie tem sua particularidade quanto à obtenção e congelamento de
gametas. Nos canídeos é relatada a contaminação por urina, seja pela emissão de
urina junto com o sêmen (urospermia), ou pela ejaculação em direção a bexiga
(ejaculação retrógrada), que pode ocorrer tanto na monta natural, na coleta por
2
estimulação peniana ou quanto durante a eletro-ejaculação (ROMAGNOLI, 1999;
WATSON e HOLT, 2001; SILVA et al., 2004; CAZES, 2006). Com destaque para o
lobo-guará (Chrysocyon brachyurus), em que a ejaculação retrógrada ocorre com
elevada freqüência durante as coletas de sêmen por eletro-ejaculação (CUNHA e
MORATO1, comunicação pessoal).
Os protocolos utilizados para evitar os efeitos da contaminação do sêmen com
urina durante as coletas incluem: lavagem do sêmen em meio diluidor por meio da
centrifugação logo após a coleta (MAKLER et al., 1981; GRIGGERS et al., 2001), uso
de simpatomiméticos agonistas-α2 para fechar o colo da bexiga no momento da
ejaculação (ROMAGNOLI, 1999) e introdução de uma quantidade de tampão dentro da
bexiga suficiente para neutralizar o efeito deletério da urina sobre o sêmen
(BRASSESCO et al., 1988; RANIERI et al., 1995).
Os autores que trabalharam tentando solucionar o problema da contaminação
do sêmen pela urina, como Makler et al. (1981) e Tsai et al. (1990), observaram uma
drástica redução na motilidade espermática, mas não esclareceram se haviam
alterações morfológicas, lesões das membranas plasmáticas ou mitocondrial ou
qualquer outra alteração ultra-estrutural.
Há também relatos de retorno à motilidade espermática dos espermatozóides
paralisados pela urina após a correção da osmolaridade e do pH (principais fatores
responsabilizados pela redução da motilidade), com diluidores à base de leite
(GRIGGERS et al., 2001; SANTOS et al., 2005).
Quando se trabalha com animais em vias de extinção todas as amostras de
sêmen, obtidas durante o processo de eletro-ejaculação devem ser aproveitadas,
mesmo que haja contaminação por urina. Para a utilização do sêmen que foi obtido em
condições aquém do ideal é preciso neutralizar os efeitos deletérios causados pela
urina. Sendo assim, é necessário um estudo de base para entender qual o fator da
urina é o mais deletério ao espermatozóide de canídeos.
1 Cunha, I.C.N. Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal – UENF /RJ-Brasil. Morato, R.G. Pró-carnívoros/ CENAp-IBAMA / SP-Brasil.
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2. OBJETIVOS
Objetivo geral:
Avaliar os efeitos deletérios da urina sobre o espermatozóide canino, com o
intuito de dar base aos estudos de criopreservação do sêmen do lobo-guará.
Objetivos específicos: Avaliar os efeitos da osmolaridade, pH, uréia e urina, separadamente para
tentar entender os efeitos causados por cada fator da urina sobre o espermatozóide
canino.
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3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1) Coleta do sêmen
O sêmen canino pode ser obtido pelo estímulo manual do bulbo peniano,
vagina artificial ou eletro-ejaculação (JOHNSON, 2001; SILVA et al., 2004). O estímulo
manual do bulbo peniano tem destaque para os cães, pois requer um curto período de
condicionamento e não precisa de equipamentos sofisticados, usam-se apenas luvas,
funil e tubo coletor. A vagina artificial tem o inconveniente de necessitar de tamanhos
variados, devido aos diferentes tamanhos de cães, de acordo com suas raças.
A eletro-ejaculação é o método de eleição quando se trabalha com animais
selvagens, pois não é necessário o condicionamento do animal. O protocolo de eletro-
ejaculação preconizado para os canídeos é aquele descrito por Platz e Singer, em 1978
(GOODROWE et al., 1998, SILVA et al., 2004).
Apesar do sucesso na coleta de sêmen pelo método da eletro-ejaculação em
Canis rufus por Goodrowe (1998), este método tem como contra ponto a contaminação
por urina quando utilizado em outros canídeos como o cão doméstico, Canis familiaris
(OHL et al., 1994, CAZES, 2006) e no lobo-guará: Chrysocyon brachyurus (Cunha e
Morato, comunicação pessoal).
5
3.2) Contaminação do sêmen por urina
A estreita relação do sistema urinário com o sistema reprodutor permite que o
sêmen entre em contato com a urina em algumas ocasiões como resultado de
mecanismos fisiológicos, patológicos ou pela técnica de coleta de sêmen. Tanto a
micção, quanto a ejaculação retrógrada são importantes eventos que ocorrem durante o
processo de eletro-ejaculação nos canídeos (OHL et al., 1994; GOODROWE, 1998.
ROMAGNOLI, 1999; CAZES, 2006).
A contaminação por urina também ocorre no homem por causas patológicas ou
durante a eletro-ejaculação em paraplégicos. Os avanços no desenvolvimento de
técnicas para a utilização do sêmen humano contaminado com urina foram feitos a
partir dos estudos de Crich e Jequier (1978) e Makler et al. (1981) quando avaliaram
métodos de lavagem do sêmen para utilização nos processos de inseminação artificial.
3.3) Urina
A urina é formada para manter a composição dos líquidos extracelulares
constante e geralmente a maioria das substâncias que estão presentes no fluido
extracelular também está presente na urina (REECE, 1996). O volume diário da urina
de um cão adulto é 17±9mL/kg de peso corporal (LAROUTE et al., 2005).
O urobilinogênio quando oxidado é conhecido como urobilina e é o maior
responsável pela cor amarela da urina (REECE, 1996; REINE et al., 2005). O odor é
característico de cada espécie e denominado suis generis (COLES, 1986). A
consistência da urina na maioria das espécies é aquosa, mas nos eqüinos pode ser um
pouco espessa e viscosa por causa da secreção de muco pelas glândulas na pélvis
renal (REECE, 1996).
A glicose presente no filtrado glomerular é quase toda absorvida pelo túbulo
proximal. Está presente na urina principalmente nos casos patológicos como no
diabetes melito, estresse, necrose tubular ou pielonefrites (REINE e LANGSTON,2005).
O principal componente nitrogenado encontrado na urina é a uréia, uma vez
que a maioria das proteínas não atravessam o aparelho de filtração glomerular. A uréia,
formada no fígado, é relativamente não-tóxica, pequena não-iônica, produto da
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metabolização da amônia (REECE, 1996). A concentração da uréia na urina pode variar
de 7-16 mg por 100mL (KOLB, 1987).
As cetonas mais encontradas na urina dos pequenos animais são ácido
acético, acetona e ácido β-hidroxibutírico. Estas cetonas são resultantes do
metabolismo dos ácidos graxos, pobremente controlado no diabetes melito, são
encontradas nos cães com dietas ricas em proteínas e pobre em carboidratos (REINE e
LANGSTON, 2005).
A maioria dos eletrólitos encontrada no filtrado glomerular é reabsorvida ao
longo do néfron, sendo os principais Na+, K+, Ca2+, Mg2+ e fosfato. A reabsorção destes
é dependente de energia e envolve mecanismos como a bomba Na-K ATPase. A
maioria do Ca2+ está ligado à albumina, citrato ou fosfato e cerca de 25% do Mg2+ está
ligado às proteínas (REECE, 1996). Entretanto alguns destes íons são excretados e
0,17±0,082% de sódio, 8,1±3,83% de potássio, 0,26±0,127% de cloreto, 0,099±0,060%
de cálcio e 18,4±7,01% de fósforo fazem parte da composição final da urina (LAROUTE
et al., 2005).
A concentração normal de íons hidrogênio na urina é dependente do tipo de
dieta. Animais herbívoros tendem a ter uma urina alcalina, enquanto os carnívoros
tendem à acidez. Os valores normais do pH da urina dos bovinos estão entre 7,4-8,4
enquanto no cão estão entre 6-7 (COLES, 1986) ou 5-9 (REINE e LANGSTON, 2005).
A gravidade específica da urina (USG) é um parâmetro utilizado na clínica para
indicar se os rins do paciente são capazes de concentrar ou diluir o filtrado glomerular.
Os parâmetros utilizados para a medir a USG, diferente da osmolaridade, levam em
consideração a comparação entre o peso de um determinado volume de urina,
comparado com o peso de um mesmo volume de água destilada e pode ser medido
com um refratômetro. Os valores normais de USG para o cão são >1.030. Quando os
rins do cão não conseguem concentrar o filtrado glomerular, diz-se que o animal está
com isostenúria, ou seja, a osmolaridade da urina é a mesma do plasma sanguíneo.
Neste caso a USG varia entre 1.007 e 1.012 (REINE e LANGSTON, 2005). Entretanto
as gravidades específicas e a osmolaridade nem sempre podem estar relacionadas
diretamente, pois há diferenças entre animais, grau de hidratação e período do dia em
que a urina é coletada (VAN VONDEREN, 1997).
7
Quanto à osmolaridade, embora esta permaneça constante no sangue, na
urina é variável e depende do estado de hidratação e da função renal. Com a função
renal normal, a osmolaridade pode atingir 3000 mOsmol/l, como também pode estar tão
baixa quanto 50 mOsmol/l em indivíduos com poliúria e função renal anormal (COLES,
1986). Laroute et al. (2005) e Santos et al. (2005) obtiveram urina com osmolaridades
de 1241±248mOsmol/l para cães adultos da raça Beagle e 949-1273 mOsmol/l para
cães adultos da raça Rottweiler, respectivamente.
Há ainda alguns componentes que podem ser encontrados na urina do cão em
casos patológicos como, por exemplo, proteínas (em concentrações que variam de 30-
1000mg/dL, ou 1+ até 4+, respectivamente), cilindros, cristais, hemácias, bactérias
(algumas destas secretam nitritos) e leucócitos (REINE e LANGSTON, 2005).
3.4) Efeitos da urina sobre o sêmen
Desde os primeiros experimentos realizados à procura de um diluidor para o
sêmen em 1856, na tentativa de manter a fertilidade do mesmo por algum tempo in
vitro, é conhecida a ação deletéria da urina sobre os espermatozóides (PEREZ, 1994).
Crich et al. (1978) atribuíram à diferença de pH e de osmolaridade entre o
sêmen e a urina à redução da motilidade dos espermatozóides humanos. Estes autores
verificaram que mesmo após a correção do pH o contato com a urina ainda reduzia a
motilidade do sêmen, e concluíram que a elevada osmolaridade da urina poderia ser
um outro fator que alterava a motilidade do sêmen obtido pela coleta manual e pela
eletro-ejaculação.
Em experimentos in vitro, observando-se o comportamento dos
espermatozóides de humanos (MAKLER et al., 1981), de eqüinos (GRIGGERS et al.,
2001) e do cão (SANTOS et al, 2005) misturados com urina, há consenso que a
redução da motilidade pode ser revertida por até uma hora quando é adicionado um
diluidor a base de leite. Entretanto, o tempo de sobrevivência após a adição do diluidor
não é satisfatório e nestes trabalhos não foi avaliada a fertilidade do sêmen por testes
biológicos como a penetração oocitária e inseminação artificial.
8
3.5) Como evitar os efeitos deletérios da urina sobre o sêmen
Os controles da ejaculação e da micção são feitos pelo sistema nervoso
vegetativo e o fechamento do colo da bexiga é dependente da ação do sistema nervoso
simpático sobre os receptores α2-adrenérgicos (REECE, 1996). A ereção e o
relaxamento do colo da bexiga são controlados pelo sistema nervoso parassimpático e
no momento da ejaculação pode haver fluxo de sêmen em direção à bexiga (REECE,
1996; ROMAGNOLI, 1999).
Tendo conhecimento dos mecanismos que controlam a ejaculação e a micção,
foi sugerido o uso de agonistas α2-adrenérgicos para fechar o colo da bexiga e impedir
a ejaculação retrógrada no homem (BRASSESCO et al., 1988) e em cães
(ROMAGNOLI, 1999). Entretanto um dos possíveis efeitos indesejados dos agonistas
α2-adrenérgicos como a Xilazina é o bloqueio átrio-ventricular (BOOTH, 1992;
TÁRRAGA, 2002).
Quando não for possível atingir uma ejaculação antrógrada, deve-se pensar em
reduzir a toxicidade da urina sobre os espermatozóides. Crich et al. (1978) já haviam
sugerido que apenas a correção do pH da urina não é suficiente para evitar a morte dos
espermatozóides no sêmen contaminado com urina e que a osmolaridade deveria
também ser corrigida. Makler et al. (1981) também sugeriram que a reversão da
hiperosmolaridade é crucial para solucionar a toxicidade da urina.
Brassesco et al. (1988) utilizaram uma solução de Bicarbonato de Sódio via
oral em seus pacientes humanos com ejaculação retrógrada e quando a urina deles
atingia a osmolaridade 300-500 mOsmol/l e pH entre 6,5 e 8,0 o sêmen era coletado.
Com este procedimento, estes autores conseguiram sucesso em todos os casos que
trataram.
Ranieri et al. (1995) introduziram uma solução salina tamponada com 0,25 mM
de HEPES na bexiga de pacientes humanos antes da coleta de sêmen e utilizaram o
conteúdo vesical para a inseminação artificial em uma mulher que foi submetida ao
protocolo de superovulação e deste processo foi gerado apenas um bebê. Já Nikolettos
et al. (1999) utilizaram os espermatozóides de homens com ejaculação retrógrada,
encontrados na urina logo após a masturbação, centrifugação e seleção dos
espermatozóides pelo método swim-up, para fertilizar oócitos por meio da injeção
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intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) e obtiveram uma taxa de fertilização de
51,2%.
Métodos baseados apenas na lavagem do sêmen pela centrifugação seguida
da diluição do precipitado em solução específica também têm sido sugeridos. As
soluções de lavagem podem ser constituídas de solução salina tamponada, adicionada
de glicose (TSAI et al., 1990) ou podem conter albumina sérica humana (SCAMMELL et
al., 1982), sendo que a albumina pode induzir a capacitação espermática, inviabilizando
os espermatozóides ao processo de congelamento (GADELLA et al., 2001). Griggers et
al. (2001) conseguiram bons resultados quando utilizaram um diluidor à base de leite
para recuperar a motilidade dos espermatozóides eqüinos após a paralisação induzida
pela urina e o mesmo foi confirmado por Santos et al. (2005) em cães.
3.6) Sêmen
O sêmen canino é ejaculado em três frações. A primeira é composta por
algumas gotas de um líquido claro, provavelmente da próstata. Alguns cães podem
ejacular vários mililitros destas frações.
A segunda é rica em espermatozóide e seu volume varia de 0,5 a 5 ml,
dependendo do tamanho do testículo e de cada indivíduo, aparecendo esbranquiçada e
opalescente. Normalmente não se tenta separar as duas primeiras frações (JOHNSON,
2001).
A terceira fração e maior fração é o líquido prostático, podendo chegar a 30ml
(JOHNSON, 2001).
O sêmen canino pode ser manipulado em temperatura ambiente por 15 a 30
minutos sem que ocorram efeitos adversos, porém no menor tempo possível. A amostra
deve ser protegida de alterações súbitas de temperatura. As lâminas devem ser
mantidas a 37°C (JOHNSON, 2001).
O pH do sêmen canino tem variações de 6,3 a 7 no plasma seminal e até 6 a
7,4 no líquido prostático (JOHNSON, 2001).
A osmolaridade média do sêmen canino pode ser medida de acordo com a
variação do ponto crioscópico é de 300 mOsmol/L, o que equivale ao ponto de
congelamento de aproximadamente –0,55ºC (SALISBURY et al., 1978).
10
3.7) Espermatozóides
Os espermatozóides são células haplóides formadas dentro dos túbulos
seminíferos do testículo. São células complexas, transformadas e especializadas para
fertilizar o oócito. O sucesso da fertilização, quando apenas um espermatozóide entre
milhões ou bilhões depositados no trato reprodutivo da fêmea penetra o oócito,
depende não só dos fatores ligados à formação do espermatozóide. Diversos fatores
externos vão influenciar na capacidade do espermatozóide fertilizar um oócito, como o
pH, osmolaridade, viscosidade, temperatura, disponibilidade de energia e proteínas. O
que determina se estes fatores vão levar a uma alteração fisiológica reversível ou não é
a membrana plasmática, pois a comunicação entre o espermatozóide e o meio externo
é feita por mecanismos biomoleculares controlados pela membrana plasmática
(HAFEZ, 1995; GADELA et al., 2001).
As diversas espécies de mamíferos têm particularidades quanto à forma,
tamanho e composição dos espermatozóides, mas basicamente o espermatozóide é
composto de cabeça, peça intermediária e cauda. Sendo a cabeça subdividida em
região acrossomal, equatorial e pós-acrossomal. Na cabeça encontra-se o núcleo
contendo a metade do material genético necessário à formação de um novo indivíduo
na forma de cromatina condensada (HOLT, 1984; HAFEZ, 1995). A cauda tem uma
região onde se concentram as mitocôndrias, que geram energia na forma de ATP pela
quebra de monossacarídeos como a lactose, frutose e glicose que passam através da
membrana plasmática, já que durante a espermatogênese o espermatozóide perde
muitas organelas e não tem energia armazenada no citoplasma. Além das mitocôndrias,
a cauda tem nove pares de microtúbulos organizados ao redor de um par central,
denominado axonema, que impulsionam o espermatozóide pelo deslizamento entre os
microtúbulos dependente de ATP (MORTIMER, 1997).
A célula espermática canina tem 61,4±0,3µm de comprimento, tendo a cabeça
6,1±0,04µm, com largura de 3,8±0,2µm. A peça intermediária mede 10,1±0,7µm e a
cauda em torno de 50µm (DAHLBOM et al., 1997). Entretanto existem diferenças entre
indivíduos, com relação à morfometria de espermatozóides, na espécie canina
(DAHLBOM et al., 1997; PEÑA, 2004).
11
3.8) Membrana Plasmática
Segundo Henderson e Stroud (2004), as membranas celulares são essenciais
para a vida da célula. A membrana plasmática envolve a célula, define seus limites e
mantém as diferenças entre o citossol e o meio extracelular. Além da membrana
plasmática, o espermatozóide contém outras membranas celulares como a acrossomal,
nuclear e mitocondrial.
A membrana plasmática do espermatozóide ou plasmalema tem estrutura
comum àquela encontrada nas células somáticas. Em sua constituição estão os
fosfolipídios, com propriedades anfipáticas, que interagem entre si através de ligações
não-covalentes, talvez elétricas, e proteínas associadas à bicamada lipídica de forma
integral ou não. Os quatro fosfolipídios principais que predominam na membrana
plasmática são: fosfatidilcolina, esfingomielina, fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina.
Sendo que estes dois últimos estão localizadas na face interna da membrana (SINGER,
1972).
A característica anfipática dos fosfolipídios, isto é, ter uma parte que interage
com o meio aquoso e outra que não interage, forma uma camada que impede a maioria
das moléculas hidrossolúveis de penetrar no citossol. A passagem de moléculas como
a da água e íons só é possível graças aos canais específicos formados por proteínas
inseridas na membrana (DARSZON et al., 1999; HENDERSON e STROUD, 2004). A
regulação dos processos biológicos que ocorrem dentro da célula é feita pela
separação entre o citossol e o meio externo.
A organização da membrana é heterogênea no que se refere à distribuição
lateral dos lipídios. Estes, como as proteínas, também estão agrupados em
microdomínios formados pelos lipid rafts (canoas ou plataformas lipídicas). Os lipid rafts
são lipídios insolúveis em Triton X-100 a 4°C, que se encontram em regiões restritas da
membrana plasmática e tem dimensões inferiores a dez nanômetros (SIMONS e
IKONEN, 1997; VERB et al., 2003). Esta porção de lipídios resistente à ação de
detergentes, quando submetida a um processo de separação por centrifugação, flutua
por ser de baixa densidade e rica em esfingolipídios e colesterol (SIMONS, 2004). A
posição dos lipid rafts na membrana plasmática é garantida pelo citoesqueleto, pois os
12
estes lipídios podem estar trafegando livres dentro de um domínio ou ancorados a
alguma proteína (EDDIN, 2003).
Os lipid rafts como o CD-59, que é Glicosil fosfatidil inusitol (GPI) ancorado a
uma proteína de 18-25 kda, desempenha um papel de interação entre os
espermatozóides e os oócitos humanos durante a fecundação (CROSS, 2004).
Christova et al. (2004) observaram que a membrana plasmática do
espermatozóide do cão tem a permeabilidade aumentada na região acrossomal durante
o processo de maturação. A reorganização dos lipídios é o ponto chave para o aumento
da permeabilidade da membrana plasmática o que permitirá a entrada de cálcio para
participar dos processos que levam à capacitação.
As variações de pH e osmolaridade entre as diferentes regiões do epidídimo do
camundongo não foram suficientes para alterar a distribuição dos lipídios, como
observado durante os processos de resfriamento e congelamento dos
espermatozóides. Sendo assim, é possível que os lipid rafts não participem na
regulação da osmolaridade e do pH intracelular (CHRISTOVA et al.2002).
As proteínas de membrana têm capacidade de se mover através da
membrana. Mas este movimento não é aleatório, como proposto por Singer em 1972,
no modelo do mosaico fluido. As proteínas têm seu movimento restrito a determinadas
regiões ou domínios que podem ser determinados pelo citoesqueleto ou por interações
entre as proteínas de membrana (JACOBSON et al., 1995).
Recobrindo a superfície celular está o Glicocálix constituído por carboidratos
que interagem com as proteínas da membrana por ligações covalentes. Entre outras
funções, o Glicocálix protege a célula de alterações de pH do meio externo e participa
na interação do espermatozóide com o oócito (HENDERSON e STROUD, 2004).
Proteínas descobertas recentemente também têm o papel de proteger o
espermatozóide no epidídimo e no trato genital feminino. A forma como estas proteínas
se ligam à membrana plasmática após a espermiação é desconhecida, mas supõe-se
que haja interações iônicas, ou sejam integradas à membrana após proteólise (GATTI
et al., 2004).
13
3.9) Fatores do meio que agem sobre os espermatozóides a) Osmolaridade
A osmose é o processo de difusão do solvente através de uma membrana
semipermeável a partir de uma solução de maior concentração para uma de menor
concentração de solvente (REECE, 1996). A concentração do solvente como a água é
relativa à concentração do soluto. Quando duas soluções com concentrações diferentes
de solutos estão separadas por uma membrana biológica, que impeça a passagem do
soluto, a água se moverá para o lado com a maior quantidade de soluto, por causa da
pressão osmótica (SHAW, 1975).
A importância da manutenção da osmolaridade está relacionada à regulação
do volume celular, que mantém a funcionalidade da célula e porque as biomoléculas
polares das células vivas existem e reagem fundamentalmente em um ambiente aquoso
(RODWELL, 2004). A existência da vida na Terra depende criticamente da capacidade
da água dissolver uma notável gama de moléculas polares, que servem de fonte de
energia, catalisadores e portadores de informação. No entanto a excelência da água
como solvente gera um problema, porque enfraquece as interações entre moléculas
polares. Os sistemas biológicos resolveram esse problema criando micro-ambientes
livres de água onde as interações polares têm força específica máxima (STRYER,
1996).
Do ponto de vista fisiológico, a quantidade de água dentro da célula irá manter
o equilíbrio homeostático, regulando o tamanho da célula e as reações físico-químicas
que ocorrem no meio intracelular. Uma solução isotônica é aquela que tem a mesma
pressão osmótica do plasma sanguíneo, isto é, 300 mOsmol/l. A homeostasia é a
manutenção da quantidade de água necessária à manutenção dos processos
fisiológicos dentro de certos limites (REECE, 1996).
A osmolaridade é a medida do número de partículas em uma solução e tem
como unidade de medida o Osmol (mais comumente utilizado na fração de 1/1000
como mOsmol/l para os processos biológicos). O prefixo os é usado para indicar que
houve uma hidrólise de uma solução molar. Quando trabalhamos com moléculas que
não se dissociam (como a glicose), 1 mol é igual a 1 Osmol. Quando trabalhamos com
14
uma molécula totalmente dissociável, como o NaCl, multiplicamos o número de mols
pelo número de partículas (ex. 1 mol de NaCl tem 2 Osmol). Em um terceiro caso, dos
solutos que se dissociam parcialmente, é necessário saber o coeficiente de dissociação
de cada elemento químico para chegar a osmolaridade final daquela solução. Uma
solução de um molar é aquela feita com o mesmo peso molecular do reagente.
Exemplo: uma solução de 1 molar de NaCl tem 58,44g de NaCl dissolvidos em 1 litro de
água (HENEINE, 2000).
Para medir a osmolaridade de uma solução utiliza-se a propriedade coligativa,
ou seja, alteração do ponto de ebulição, abaixamento da pressão de vapor ou
abaixamento do ponto de congelamento. Destas, a mais usada é o abaixamento do
ponto de congelamento. Uma solução de 1 Osmol, tem o ponto de congelamento
1,858°C menor que uma solução de água livre de soluto, ou seja, uma solução de 300
mOsmol/l tem o ponto de congelamento 0,56°C menor que a água (REECE, 1996).
No trânsito do espermatozóide pelos túbulos seminíferos, epidídimo e
chegando à uretra onde a mistura com as secreções das glândulas acessórias forma o
sêmen, há uma redução na osmolaridade, tirando o espermatozóide do seu estado de
quiescência e ativando a motilidade. A osmolaridade do plasma seminal (± 300
mOsmol/l) continua a reduzir quando o espermatozóide chega ao trato reprodutivo da
fêmea, onde há influxo de Ca2+ e a remoção dos agentes que impedem a capacitação
depositados sobre a superfície do espermatozóide (ROSSATO et al., 2002).
As alterações de osmolaridade do meio fazem a água passar através da
membrana de maneira passiva sempre no sentido hipertônico. A entrada e saída de
água aumentam ou diminuem o volume celular causando alterações morfológicas no
espermatozóide como o inchaço e enrolamento da cauda. O controle de íons dentro da
célula é importante para a manutenção da homeostase e é feito por canais iônicos às
custas de gasto de energia pela bomba Na/K ATPase (DARSZON et al., 1999,
MEYERS, 2005).
Makler et al. (1981) e Griggers et al. (2001) concordam que meios
hiperosmóticos são menos agressivos à funcionalidade do espermatozóide que os
hiposmóticos, talvez pela alteração de volume que a entrada ou a saída de água
causam na célula.
15
A velocidade com que a água passa através da membrana ou a condutividade
hidráulica podem ser fundamentais para entender a capacidade da célula resistir às
alterações de osmolaridade (MEYERS, 2005).
O conhecimento da relação do espermatozóide de cada espécie com as
variações de osmolaridade é fundamental para a elaboração de um diluidor adequado
aos processos de resfriamento e congelamento de sêmen em todas as espécies
(MEYERS, 2005).
Os limites de tolerância de osmolaridade foram determinados para o carneiro,
camundongo, homem e cavalo. No eqüino, por exemplo, sabe-se que alterações de
100mOsmol/l partindo de condições isosmóticas não causam alterações significativas
na motilidade e viabilidade espermáticas (MEYERS, 2005). As alterações ocorridas em
condições de hiperosmolaridade são facilmente revertidas quando o espermatozóide é
colocado em solução isosmótica ± 300 mOsmol/l (MAKLER et al., 1981; GRIGGERS et
al. 2001).
b) pH
A disponibilidade de prótons intra e extracelulares dadas pelo potencial
hidrogeniônico (pH) agem dentro e fora da membrana plasmática, já que existem
interações moleculares que podem ser alteradas por um próton livre ou um radical
hidroxila (HENDERSON e STROUD, 2004). A membrana plasmática regula o pH
interno por um transporte de Na+, Cl-, e HCO3- dependente de ATP. O pH 6,6 já havia
sido determinado como o melhor para a manutenção da motilidade do espermatozóide
canino, em 1963 (FOOTE; LEONARD, 1963). A margem de variação de pH que o
espermatozóide suporta é estreita, mas o efeito de uma solução levemente ácida sobre
a motilidade do espermatozóide, é mais facilmente revertido quando o pH é corrigido
em relação aos efeitos do pH básico (MARKLER et al., 1981; GRIGGERS et al., 2001).
O efeito imediato observado quando o sêmen é colocado em um meio com o pH
inadequado é a perda da motilidade. Os meios com o pH básico podem induzir a
capacitação espermática, pois o HCO3- ativa a adenilato ciclase e inicia uma seqüência
de eventos como o efluxo de colesterol, alteração da permeabilidade da membrana,
influxo de Ca2+ e reação acrossômica (GADELLA et al., 2001).
16
c) Energia
Durante o processo de formação do espermatozóide há perda de muitas
organelas, mas permanecem no citoplasma enzimas necessárias para a ativação de
mecanismos fisiológicos como a frutólise, gerando ATP. O açúcar mais utilizado na
nutrição das espermátides pela célula de Sertoli é a lactose, mas no plasma seminal, o
monossacarídeo responsável por fornecer energia aos espermatozóides na maioria das
espécies domésticas é a frutose, pois este é o principal açúcar animal. A quebra da
frutose para a obtenção de ATP gera ácido lático e piruvato na ausência de oxigênio.
Em ambientes aeróbicos as mitocôndrias podem utilizar o ácido lático e o piruvato para
gerar ATP, tendo como sub-produto CO2 e água (HAFEZ, 1995).
As células precisam de nutrientes externos para a sua sobrevivência. Nas
células somáticas, estes nutrientes são transportados pela corrente sanguínea e
chegam à célula em questão por interações celulares. O espermatozóide não é
diferente quanto à dependência do meio externo para a sua sobrevivência e os
nutrientes estão disponíveis no plasma seminal (HAFEZ, 1995).
Rigau et al. (2001) demonstraram a importância das hexoses na manutenção
da motilidade do espermatozóide canino, quando compararam a motilidade do
espermatozóide em um meio com o outro sem açúcar. A linearidade do movimento
espermático, que está correlacionada com a capacidade fertilizante do espermatozóide,
foi maior nos meios enriquecidos com frutose que naqueles enriquecidos com glicose.
As concentrações de frutose, glicose, manose e sorbitol também foram determinadas
pelo Cobas Bio Autoanalyzer nas 3 frações do ejaculado do cão (Tabela 1).
17
Tabela 1. Concentações de hexoses nas frações separadas do plasma seminal.
Hexose Primeira fração Segunda fração Terceira fração
Frutose (mM¹) 0,01±0,01 0,06±0,01 0,00±0,00
Glicose (mM¹) 0,01±0,01 0,01±0,01 0,04±0,01
Manose (mM¹) 0,00±0,00 0,01±0,01 0,01±0,01
Sorbitol (mM¹) 0,01±0,01 0,01±0,01 0,01±0,01
*os resultados são as médias de 25 ejaculados, onde as três frações do sêmen foram coletadas em tubos separados por estímulo manual do pênis. **adaptados de RIGAL et al. 2001. ¹ milimolar d) Viscosidade
A resistência mecânica que o meio oferece ao deslocamento do
espermatozóide influencia na velocidade e requer um gasto maior de energia, quanto
maior for a viscosidade. Para aumentar a viscosidade do meio, alguns autores
utilizaram carboximetilcelulose, metilcelulose ou gema de ovo e concluíram que a
viscosidade diminui a velocidade média dos espermatozóides, mas não altera a
linearidade (HIRAIS et al.,1997).
e) Oxigênio
Os espermatozóides de mamíferos estão sujeitos ao estresse oxidativo, por
causa do alto nível de ácidos graxos e baixa concentração de anti-oxidantes naturais
que se encarregam da defesa. O espermatozóide irá entrar em contato com radicais
livres durante sua passagem até chegar ao oócito, pois células brancas, como os
neutrófilos no plasma seminal, liberam radicais livres chamados “espécies reativas ao
oxigênio” (ROS), que a princípio destruiriam agentes patogênicos, mas também agem
sobre os espermatozóides. O ataque oxidativo resulta em duas alterações: a primeira é
benéfica, pois uma média oxidação ativa a PKA levando a uma cascata de reações que
resulta na capacitação espermática, tornando o espermatozóide pronto para a fertilizar
18
o oócito. E a segunda, que é deletéria, pela excessiva peroxidação, resulta na
deteriorização do espermatozóide (GADELLA et al., 2001).
3.10) Análise do sêmen A fertilidade do sêmen pode ser avaliada por métodos que indiquem se há
alguma alteração morfológica ou funcional da célula espermática. As análises que
indicam a fertilidade do sêmen incluem as alterações da motilidade, morfologia,
integridade da membrana plasmática e integridade de acrossoma (PEÑA, 2004).
A motilidade e vigor são avaliados pela estimação visual com microscópio nos
aumentos de 100x ou 400x, onde o resultado da motilidade é dado pela percentagem
de células móveis (0-100%) e o vigor é classificado de 0-5, de acordo com a
intensidade do movimento dos espermatozóides (CBRA, 1998). Outro modo de avaliar
a motilidade é pelo método computadorizado e este tem a vantagem sobre os descritos
anteriormente por descrever os padrões de movimento (ELLINGTON et al., 1993;
IGUER-OUADA e VERSTEGEN, 2001).
A morfologia do espermatozóide pode ser alterada pela manipulação do sêmen
nos processos como a criopreservação (OÉTTLE, 1986) e as alterações de
osmolaridade, influenciam no volume do espermatozóide, levando ao enrolamento da
cauda quando o espermatozóide é colocado em uma solução hiposmótica (KUMI-
DIAKA, 1993).
As alterações da membrana plasmática podem ser avaliadas por corantes
vitais, sondas fluorescentes, pelo teste hiposmótico (PEÑA, 2004) ou por observação
de alterações ultra-estruturais sob microscopia eletrônica (PLUMMER e WATSON,
1988). A Eosina Amarela, um corante vital, na concentração final de 0,5% permite
diferenciar as células com a membrana plasmática íntegra (não coradas) daquelas com
a membrana lesada (coradas em vermelho), como descrito por VERHEYEN et al.
(1997).
O acrossoma é um importante componente do espermatozóide, pois carrega
enzimas necessárias ao processo de penetração durante a fecundação do oócito. A
integridade acrossomal pode ser avaliada com técnicas de coloração como o Giemsa, e
recentemente o uso de lectinas conjugadas com o isotiocianato de fluoresceína permitiu
19
o melhor contraste para a avaliação da integridade acrossomal. O PSA (Pisum
sativum), que é uma das lectinas utilizadas permite classificar em três categorias:
íntegro, lesado e semilesado (RIJSSELAERE et al., 2005).
20
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1) Animais
Foram utilizados ejaculados de quatro cães (2 da raça Pastor Canadense, 1
Cocker Spaniel e um mestiço), com idade entre 3-5 anos e saudáveis residentes em
criatórios particulares. As coletas foram realizadas por meio de estimulo manual do
pênis (JOHNSON, 2001). As segundas e terceiras frações dos ejaculados foram
coletadas em tubos separados. Amostras de urina foram obtidas pela micção
espontânea dos cães, com auxílio de funil e tubos para centrífuga de 15,0ml, após as
coletas de sêmen.
4.2) Avaliações seminais
Os ejaculados foram avaliados no sub-setor de tecnologia de sêmen do
Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal. O tempo entre a coleta o
início das avaliações foi sempre inferior a 30 minutos.
Foram realizadas avaliações macro e microscópicas do sêmen imediatamente
após a exposição do sêmen ao meio a ser testado e após incubação de 60 minutos em
banho-Maria a 37°C, em todos os experimentos propostos: Experimento I: comparação
dos efeitos da urina com o efeitos de soluções com diferentes osmolaridades;
Experimento II: comparação dos efeitos da urina com os efeitos de soluções com
diferentes pH; Experimento III: comparação dos efeitos da urina com os efeitos
21
causados por diferentes concentrações de uréia. Para a obtenção do plasma seminal a
terceira fração do ejaculado foi centrifugada a 800 x g por 10 minutos.
4.2.1) Motilidade
As avaliações da motilidade foram feitas pelo método computadorizado
utilizando o equipamento Hamilton Thorne Research IVOS 10 (CASA). Para as leituras
foram colocados 5µL de sêmen dentro da câmara com 20µm de altura, que
permaneceu aquecida a 38ºC durante toda a leitura. Foi utilizado o setup para sêmen
de cão descrito por Iguer-Ouada e Verstegen (2001). Para descrever os movimentos
dos espermatozóides, o computador foi programado para captar 30 imagens
seqüenciais e foram anotados os valores referentes a Motilidade (%); Motilidade
Progressiva (%); Velocidade do Trajeto (VAP, µm/s); Velocidade Progressiva (VSL,
µm/s); Velocidade Curvilinear (VCL, µm/s); Amplitude Lateral da Cabeça (ALH, µm);
Freqüência de Batimentos (BCF, Hz); Retilinearidade (STR, %) e Linearidade (LIN, %). 4.2.2) Morfologia espermática
Após 60 minutos de contato do sêmen com as diferentes soluções
(osmolaridade, pH, uréia e urina), foi acrescentada uma solução de formalina + solução
de NaCl (com osmolaridade correspondente à amostra da qual o sêmen foi retirado) na
proporção de 1:10, com o objetivo de fixar os espermatozóides. Logo após a fixação,
foram avaliados 200 espermatozóides por lâmina, no aumento de 1000x (JOHSON,
2001) em microscópio com contraste de fase, modelo Nikon Eclipse 80i. As alterações
morfológicas foram classificadas como maiores ou menores, conforme o padrão
adotado pelo CBRA (1998).
4.2.3) Integridade de membrana
A integridade de membrana foi testada com uma solução do corante vital
Eosina Amarela, suspensão de 1% em solução salina (com osmolaridade
correspondente à amostra da qual o sêmen foi retirado). Uma gota de sêmen foi
22
misturada à uma gota do corante e após 1 minuto foi confeccionado um esfregaço onde
foram contadas 200 células. Foram considerados com a membrana íntegra, os
espermatozóides que não foram corados e com a membrana lesada, aqueles corados
em vermelho (VERHEYEN et al., 1997).
4.2.4) Avaliação da integridade de acrossoma
Para integridade de acrossoma foram utilizadas as sondas fluorescentes FITC-
PSA (Pisum Sativum agglutinin) e o Iodeto de Propídio e avaliadas 200 células, sob
microscopia de epifluorescência e classificadas como possuindo: acrossoma intacto,
acrossoma lesado e acrossoma balloon (semilesado) como descrito por Goodrowe et al.
(2001).
4.3) Procedimentos experimentais
Imediatamente após o contato dos espermatozóides com as diferentes
soluções foi avaliada a motilidade. Após 60 minutos de incubação, foram avaliadas as
variáveis de motilidade, integridade de membrana, integridade de acrossoma e
morfologia espermática.
Experimento I – Efeitos de diferentes osmolaridades sobre as células espermáticas
Foram utilizados ejaculados de 03 cães num total de 07 ejaculados (02 cães da raça
Pastor Canadense dos quais foram coletados três ejaculados de cada um e 01 cão
mestiço apenas um ejaculado). De cada ejaculado foram retiradas 05 alíquotas de
100µL nas quais foram acrescidas de 900µL as soluções de diferentes osmolaridades,
em minitubos para centrífuga, perfazendo os grupos:
• GCONT - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de plasma seminal
• G300 - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de 150mM
de NaCl (≅ 300 mOsmol/l);
23
• G600 - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de 300mM
de NaCl (≅ 600 mOsmol/l);
• G1000 - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de 500mM
de NaCl (≅ 1000 mOsmol/l);
• GU - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de urina autóloga.
O Experimento I está representado por um diagrama na Figura 1.
24
Figura 1 – Diagrama do experimento I - Efeitos de diferentes osmolaridades sobre os espermatozóides caninos
GCONT
100µL de sêmen
+
900µL de
Plasma Seminal
G 300
100µL de
sêmen
+
900µL de
300mOsmol/l de NaCl
G 600
100µL de
sêmen
+
900µL de
600mOsmol/l de NaCl
G 1000
100µL de
sêmen
+
900µL de
1000mOsmol/l de NaCl
G U
100µL de
sêmen
+
900µL de
Urina autóloga
2,0 ml de sêmen (2ª fração)
Avaliado: 1. motilidade (CASA) 2. integridade de membrana 3. integridade de acrossoma 4. morfologia
Avaliou-se 1. motilidade* 2. integridade de membrana* 3. integridade de acrossoma* 4. morfologia* ** a motilidade foi avaliada imediatamente após o contato do sêmen com assoluções e após 60 minutos de incubação nas respectivas soluções, foramavaliadas: motilidade, integridade de membrana, integridade de acrossomae morfologia.
25
Experimento II - Efeitos de diferentes pH sobre as células espermáticas
Foram utilizados 05 ejaculados de 03 cães diferentes (02 pastores canadenses e 01
mestiço). Foram coletados dois ejaculados de dois cães e apenas um ejaculado de um
cão. De cada ejaculado retiraram-se 07 alíquotas de 100µL as quais foram acrescidas
900µL de soluções de NaCl 300mOsmol/l com 05 diferentes pH, obtidos pela adição de
NaOH 0,1N ou HCl 0,1N divididos em 07 grupos:
• GCONT - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de plasma seminal;
• GA1 - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL uma solução de NaCl
300mOsmol/l e pH 5;
• GA2 - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de uma solução de
NaCl 300mOsmol/l e pH 6;
• GN - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de NaCl
300mOsmol/l e pH 7;
• GB1 - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de NaCl
300mOsmol/l e pH 8;
• GB2 - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de NaCl
300mOsmol/l e pH 9;
• GU - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de urina autóloga.
O Experimento II está representado no diagrama da Figura 2.
26
Figura 2. Diagrama do experimento II - Efeitos de diferentes pH sobre os
espermatozóides caninos.
Avaliado: 1. motilidade* 2. integridade de membrana* 3. integridade de acrossoma* 4. morfologia* ** a motilidade foi avaliada imediatamente após o contato do sêmen com assoluções e após 60 minutos de incubação nas respectivas soluções, foramavaliadas: motilidade, integridade de membrana, integridade de acrossomae morfologia.
2,0 ml de sêmen (2ª fração)
GA1
100µL de sêmen
+
900µL de
300mOsmol/l de NaCl,
pH 5
GA2
100µL de sêmen
+
900µL de
300mOsmol/l de NaCl
pH 6
Avaliado: 1. motilidade (CASA) 2. integridade de membrana 3. morfologia 4. morfometria
GN
100µL de sêmen
+
900µL de
300mOsmol/l de NaCl
pH 7
GB1
100µL de sêmen
+
900µL de
300mOsmol/l de NaCl
pH 8
GB2
100µL de sêmen
+
900µL de
300mOsmol/l de NaCl
pH 9
G U
100µL de sêmen
+
900µL de
Urina autóloga
GCONT
100µL de sêmen
+
900µL de
Plasma Seminal
27
Experimento III - Efeitos de diferentes concentrações de uréia sobre as células
espermáticas
Foram utilizados ejaculados de 03 cães diferentes (01 Cocker Spaniel, 01
Pastor Canadense e 01 mestiço). Foram coletados 04 ejaculados no total sendo que de
um cão foram coletados dois ejaculados e dos outros cães apenas um ejaculado de
cada. De cada ejaculado foram retiradas 05 alíquotas de 100µL nas quais foram
acrescidas 900µL de soluções de NaCl 300mOsmol/l com diferentes concentrações de
uréia, divididos em 04 grupos:
• GCONT - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de plasma seminal;
• GR1 - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL uma solução de NaCl
300mOsmol/l e 3,5mg de uréia por 100ml;
• GR2 - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de uma solução de
NaCl 300mOsmol/l e 7,0mg de uréia por 100ml;
• GR3 - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de NaCl
300mOsmol/l de 10,5 mg de uréia por 100ml;
• GR4 - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de NaCl
300mOsmol/l e 14,0 mg de uréia por 100ml;
• GU- 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de urina autóloga.
28
Figura 3. Diagrama do Experimento III - Efeitos de diferentes concentrações de uréia sobre os espermatozóides caninos.
Avaliado: 1. motilidade* 2. integridade de membrana* 3. integridade de acrossoma* 4. morfologia* * a motilidade foi avaliada imediatamente após o contato do sêmen com assoluções e após 60 minutos de incubação nas respectivas soluções, foramavaliadas: motilidade, integridade de membrana, integridade de acrossomae morfologia. ** a uréia foi diluída em 100ml de NaCl 150mM
2,0 ml de sêmen (2ª fração)
GR2
100µL de sêmen
+
900µL de NaCl
300mOsmol/l +
3,5mg de uréia**
GR3
100µL de sêmen
+
900µL de NaCl
300mOsmol/l +
7,0 mg de uréia**
Avaliado: 1. motilidade 2. integridade de membrana 3. integridade de acrossoma 4. morfologia
GR4
100µL de sêmen
+
900µL de NaCl
300mOsmol/l +
10,5 mg de uréia**
GR5
100µL de sêmen
+
900µL de NaCl
300mOsmol/l +
14,0 mg de uréia**
G U
100µL de sêmen
+
900µL de
Urina
G U
100µL de sêmen
+
900µL de
Plasma Seminal
GR1
100µL de sêmen
+
900µL de NaCl
300mOsmol/l
29
4.4) Modelo estatístico
Os efeitos causados pelas soluções utilizadas nos 3 experimentos
(osmolaridade, pH e uréia) foram comparados por um teste de médias.
Hipótese: nem todos os agentes (pH, osmolaridade ou uréia) têm o mesmo
efeito ou algum efeito sobre o sêmen semelhante ao da urina.
Delineamento: Foi utilizado o Delineamento de Blocos Casualizados, sendo os
tratamentos cada um dos gradientes utilizados e cada ejaculado considerado um bloco.
Depois realizada a análise de variância, os tratamentos que mostraram diferença
significativa, sendo α=0,05, foram comparados pelo teste de Tukey ao nível de
significância de 5%. Todos os dados foram processados pelo programa SAEG versão
9.0 – DEMO da Universidade Federal de Viçosa.
30
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Experimento I – Efeitos de diferentes osmolaridades sobre as células espermáticas
O efeito causado pela urina sobre a motilidade foi semelhante aquele
observado nas soluções de 600 e 1000mOsmol/l, em todos as variáveis de motilidade
avaliados pelo CASA, imediatamente após o contato do sêmen com as soluções, com
exceção do ALH e LIN onde a urina também teve resultados semelhantes a outras
soluções como a controle NaCl 300mOsmol/l (Tabela 2).
Após 1 hora de incubação a 37°C em banho-maria, a motilidade espermática
foi reduzida a zero tanto nos espermatozóides que entraram em contato com a urina,
quanto naqueles que estavam em soluções hipertônicas (600 e 1000mOsmol/l)
conforme observado na Tabela 2.
31
Tabela 2 – Valores médios e desvios padrões das variáveis indicativas de qualidade do movimento espermático imediatamente após o contato do sêmen canino com urina e com soluções de diferentes osmolaridades e após a incubação por 1h a 370C nas mesmas soluções.
Momento avaliado Imediatamente após a exposição Após 1h de incubação
Soluções
Variáveis1 Controle 300
mOsmol/l 600
mOsmol/l 1000
mOsmol/l Urina Controle 300 mOsmol/l
600 mOsmol/l
1000 mOsmol/l Urina
MT (%) 83±5ª 75±14ª 11±18b 0b 15±32b 71±19a 72±10a 0b 0b 0b
MP (%) 60±13ª 39±16b 0c 0c 4±11c 34±15a 23±13a 0b 0b 0b
VAP (µm/s) 104,1±24,9a 80,1±20,0a 18,4±18,4b 0b 14,4±27,0b 70,0±23,7 a 58,8±20,6 a 0b 0b 0b
VSL (µm/s) 95,7±22,9a 69,7±20,3a 13,77±13,55b 0b 12,7±24,1b 64,1±23,9 a 46,4±14,5 a 0b 0b 0b
VCL (µm/s) 131,1±27,2a 119,8±28,5a 33,5±33,4b 0b 23,2±40,2b 91,7±21,9 a 106,6±39,3 a 0b 0b 0b ALH (µm) 4,9±1,2a,b 5,9±1,3a 4,9±5,5a,b 0c 1,0±2,6b,c 4,7±1,2 b 7,4±0,9 a 0c 0c 0c BCF (Hz) 24±3a 24±3a 17±17a 0b 10±15a,b 29,3±2,8 a 19,2±9,6 a 0b 0b 0b STR (%) 90±1a 85±7a 44±42b 0c 14±34b,c 87±6 a 79±6 a 0b 0b 0b LIN (%) 70±6a 58±13a,b 26±26c 0c 29±34b,c 66±12 a 47±7 b 0c 0c 0c
Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha e em um mesmo momento indicam diferença estatística com 5% de significância 1 MT= motilidade total; MP = motilidade progressiva; VAP= Velocidade do trajeto; VSL = Velocidade progressiva; VCL = Velocidade curvilinear; ALH = Amplitude lateral da cabeça; BCF = Freqüência dos batimentos da cauda; STR = Retilinearidade; LIN = Linearidade.
32
Os resultados de motilidade observados tanto imediatamente após o começo
dos tratamentos, quanto após 1 hora de incubação a 37°C, indicam que a redução da
motilidade espermática no sêmen contaminado experimentalmente com a urina foi
causada pela alta osmolaridade encontrada na urina.
Observa-se que as variáveis de motilidade foram iguais nos grupos das
soluções de NaCl 600mOsmol/l, NaCl 1000mOsmol/l e grupo urina, os quais têm a
osmolaridade acima do fisiológico (300 mOsmol/l). Os resultados do presente trabalho
corroboram com aqueles encontrados por Crich et al. (1978) quando observaram uma
motilidade média de 10% após 5 minutos e de 0% após 20 minutos de contato do
sêmen humano com uma solução de urina com água e osmolaridade de 548 mOsmol/l.
Makler et al. (1981) também observaram a redução da motilidade dos espermatozóides
humanos que foram tratados com soluções de osmolaridade acima do fisiológico. Tanto
Crich et al.(1978), quanto Makler et al. (1981) concordam que um dos fatores que levam
à redução da motilidade espermática quando o sêmen é contaminado por urina é a
hiperosmolaridade.
A redução da motilidade também foi observada no sêmen contaminado por
urina. Griggers et al. (2001), encontraram resultados de motilidade em soluções de 668
mOsmol/l igual a zero tanto imediatamente após o começo do tratamento, quanto após
uma hora de incubação do sêmen em uma solução de urina e água com esta
osmolaridade.
A grande variação dos valores de motilidade observada entre as amostras
contaminadas com urina, levando a um alto desvio padrão (Tabela 2), encontrado neste
trabalho se deve a um resultado inesperado, pois o sêmen de um mesmo cão
apresentou a motilidade de 68% em uma coleta e de 0% em outras coletas. Resultados
semelhantes foram encontrados por Nikolettos et al. (1999) que trabalharam com
sêmen humano e tiveram uma média de 9% de motilidade inicial com variações de 0-
34% e desvio padrão de 10% em 16 pacientes, com ejaculação retrógrada. A
osmolaridade da urina autóloga pode apresentar variação até em um mesmo dia,
dependendo do grau de hidratação, alimentação e até estresse do animal (COLES,
1986), sendo assim, pode-se aqui especular que os resultados diferentes para um
mesmo cão se devem à variação na composição da urina autóloga em diferentes
repetições para o mesmo cão.
33
Os resultados da morfologia espermática demonstram que não houve diferença
entre os grupos. Tanto a urina como a elevação da osmolaridade não provocou
alterações morfológicas das células espermáticas (Tabela 3). Crich (1978), Makler et al.
(1981) e Griggers et al. (2001), que trabalharam com o mesmo tema, não avaliaram as
alterações morfológica dos espermatozóides.
Tabela 3 – Valores médios e desvios padrões das porcentagens de espermatozóides caninos apresentando membrana plasmática integra, acrossoma íntegro e morfologia normal após 1 hora de incubação do sêmen canino com urina e com soluções com diferentes osmolaridades.
Soluções Variáveis1
Controle 300 mOsmol/l
600 mOsmol/l
1000 mOsmol/l Urina
MPI (%) 91±8 a 56±26a,b 55±22a,b 36±30 a,b 0c AI (%) 98±18a 47±54a,b 38±44a,b 39,5±48a,b 0b
MN (%) 87±6 a 84±14 a 83±14 a 80±12 a 81±14 a Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha e em um mesmo momento indicam diferença estatística com 5% de significância; 1 MPI = Membrana plasmática íntegra, AI = Acrossoma íntegro, MN = Morfologia normal.
As porcentagens médias de espermatozóides com membrana plasmática
íntegra nos tratamentos com osmolaridade de 600 e 1000 mOsmol/l foram semelhantes
àquelas encontradas para o controle, demonstrando que as altas osmolaridades não
causaram lesões de membrana com a mesma intensidade que a urina. A semelhança
entre resultados dos tratamentos em soluções hiperosmóticas encontrados no presente
trabalho estão de acordo com os resultados de Pommer et al. (2002) que encontraram
99,47% de espermatozóides com a membrana plasmática íntegra em meio TALP de
osmolaridade 600mOsmol/l e 96,96% para o meio TALP com osmolaridade de 900
mOsmol/l. A porcentagem de espermatozóides íntegros encontrados por Pommer et al.
(2002) em eqüinos foram bem maiores que os resultados encontrados em nossos
experimentos, mas o tempo de incubação foi de apenas 10 minutos em uma solução
tamponada, onde a proteção sobre a membrana é maior e o tempo de incubação foi
bem menor que o utilizado neste experimento. Rutlant et al. (2003), trabalhando com
sêmen de macaco Rhesus, em soluções com osmolaridade semelhante ao presente
trabalho, obtiveram resultados semelhantes aos de Pommer et al. (2002) quanto à
34
integridade de membrana do espermatozóide em soluções com 600 e 900 mOsmol/l,
mas também trabalharam com TALP e o tempo de incubação foi de apenas 10 minutos.
Quanto à integridade de acrossoma, o efeito causado pela urina foi agrupado
como sendo semelhante aquele causado pelas diferentes soluções de NaCl (diferentes
osmolaridades), mas a média de espermatozóides com acrossoma intacto no grupo da
urina é zero e somente foi semelhante aos outros grupos, em virtude dos desvios
padrões terem sido muito altos. Sendo assim não é possível afirmar que o efeito da
urina sobre a integridade acrossomal é semelhante ao causados pelas soluções de
NaCl utilizadas no experimento (Tabela 3).
Os valores encontrados para o grupo controle e o grupo em solução de
300mOsmol/l vem confirmar que a osmolaridade do sêmen tem um valor próximo de
300mOsmol/l, embora no presente experimento os valores da osmolaridade não
tenham sido aferidos a cada repetição pela falta de um osmômetro. Em um estudo
preliminar, onde foi possível medir a osmolaridade do sêmen e da urina de três cães, os
valores da osmolaridade do plasma seminal variaram de 243-302 mOsmol/l e da urina
de 934-1273 mOsmol/l (SANTOS et al., 2005) e ainda outros dados da literatura
afirmam que a osmolaridade média do sêmen do cão é de 300mOsmol/l (JOHNSON,
2001) e da urina é de 50-1000mOsmol/l (COLES, 1986).
35
Experimento II – Comparação dos efeitos da urina com os efeitos de soluções com diferentes pH sobre as células espermáticas
Os valores médios de pH encontrados nas amostras de sêmen e urina
utilizadas durante todos os 3 experimentos deste trabalho (Tabela 4) sugerem que não
há diferença significativa de pH entre a urina e o sêmen canino. O pH médio do sêmen
foi 6,5±0,3 e da urina 6,9±0,3 e coincidem com os descritos por Coles (1986) que
afirmou que a urina do cão tem valores de pH entre 6-7.
Os valores médios de pH do líquido seminal dos cães que participaram deste
experimento foi 6,5±0,3 e também estão de acordo com Johnson (2001), onde foi
relatado que o pH sêmen canino tem variações de 6,3 a 7 no plasma seminal até 6 a
7,4 no líquido prostático.
Comparando os resultados encontrados nos diferentes pH, em que o sêmen foi
submetido desde 5-9, não é possível afirmar que o pH da urina seja o responsável
pelas alterações de motilidade espermáticas encontradas quando colocamos o sêmen
em contato com a urina (Tabela 4).
36
Tabela 4 - Valores médios e desvios padrões de variáveis indicativas da qualidade do movimento espermático imediatamente após contato do sêmen canino com urina e com soluções de NaCl 300mOsmol/l e diferentes pH.
Soluções Variáveis1
Controle pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 Urina
MT (%) 79±12a 67±20 a 71±15 a 85±11 a 79±10 a 82±11 a 4±7b
MP (%) 62±21a 49±21a 43±21a,b 52±25a 51±23a 52±32a 0b
VAP (µm/s) 103,8±25,4 a 86±24,9 a 73,9±22,3 a,b 82,6±40,2 a 89,0±26,3 a 93,2±44,5 a 17,1±26,8 b
VSL (µm/s) 105,9±24,3a 87,7±24,4a 67,5±21,1a,b 77,2±38a 75,1±34,0a,b 75,5±39,6a,b 15,3±24,9b
VCL (µm/s) 135,3±31,0 a 108,5±24,7 a 105,0±27,0 a 124,6±32,4 a 112,7±23,8 a 112,9±37,9 a 26,2±37,4 b
ALH (µm) 4,4±1,1 a 5,1±0,5 a 4,9±0,8 a 5,5±1,0 a 5,0±1,2 a 5,3±0,6 a 3,9±5,6 a BCF (Hz) 24,0±5,1 a 24,0±3,3 a 26,0±3,8 a 23,2±2,1 a 23,1±4,6 a 23,1±3,0 a 13,3±19,3 a STR (%) 92±1 a 90±2 a 89±1 a 87±4 a 86±11 a 88±5 a 21±42 b LIN (%) 75±3 a 66±6 a 62±6 a 60±13 a 64±16 a 64±11 a 13±24 b
Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística com 5% de significância 1 MT= Motilidade Total; MP= Motilidade Progressiva; VAP= Velocidade do trajeto; VSL = Velocidade progressiva; VCL = Velocidade curvilinear; ALH = Amplitude lateral da cabeça; BCF = Freqüência dos batimentos da cauda; STR = Retilinearidade; LIN = Linearidade;
37
As únicas variáveis que estiveram próximas às encontradas nas amostras que
tiveram contato com urina foram VAP e VSL no pH 6 (Tabela 4), mas esta semelhança
entre os resultados aconteceu por causa do alto desvio padrão em torno da média das
amostras utilizadas. Makler et al. (1981), trabalhando com sêmen humano em um
gradiente de pH que variou de 5,5-9,5, não encontraram diferença entre os tratamentos
imediatamente após o contato do sêmen com a urina. Para eqüinos, o pH encontrado
no plasma seminal influenciou a motilidade dos espermatozóides no gradiente de pH e
também foi observado que o espermatozóide eqüino suporta apenas uma estreita faixa
de pH de 7,4 - 7,9, excedendo esta faixa, a motilidade do espermatozóide eqüino é
reduzida drasticamente (GRIGGERS et al., 2001). Nossos resultados indicam que para
o cão há maior tolerância quanto à variação do pH que para os eqüinos e que a
motilidade do espermatozóide canino está mais próximo ao do ser humano para esta
característica.
38
Tabela 5 – Valores médios e desvios padrões de variáveis indicativas da qualidade do movimento espermático após 1 hora de incubação do sêmen canino com urina e com soluções de NaCl 300mOsmol/l e diferentes pH.
Soluções Variáveis1 Controle pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 Urina
MT (%) 62,2±35,9 a 44,6±40,9 a 53,6±30,7 a 63,4±21,0 a 46,6±25,7 a 33,4±35,8 a 0 b
MP (%) 32,4±23,5 a 16,2±14,8 a,b 7,2±6,7 a,b 26,0±7,9 a,b 14,4±17,3 a,b 16,0±17,2 a,b 0 b
VAP (µm/s) 55,0±36,8 a 49,7±5,0 a 37,9±11,8 a 44,3±12,5 a 47,0±11,9 a 48,9±13,7 a 0 b VSL (µm/s) 50,8±35,3 a 39,1±5,0 a 28,6±5,6 a,b 35,9±11,1 a 37,9±14,1 a 38,1±13,8 a 0 b
VCL (µm/s) 73,7±46,2 a 91,6±11,9 a 72,8±26,0 a,b 82,0±21,9 a 85,1±19,1 a 87,6±22,9 a 0 b
ALH (µm) 3,4±2,2 b 6,8±0,8 a 6,4±1,3 a 6,8±0,4 a 6,1±1,4 a 7,6±1,3 a 0 c BCF (Hz) 25,3±14,4 a 24,0±5,3 a 30,9±7,3 a 26,4±6,3 a 30,6±6,5 a 25,6±5,2 a 0 b STR (%) 71±29 a 79±4 a 78±10 a 81±6 a 80±6 a 79±6 a 0 b LIN (%) 51±30 a 44±7 a 42±7 a 44±6 a 46±7 a 45±5 a 0 b
Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística com 5% de significância 1 MT= Motilidade Total; MP= Motilidade Progressiva; VAP= Velocidade do trajeto; VSL = Velocidade progressiva; VCL = Velocidade curvilinear; ALH = Amplitude lateral da cabeça; BCF = Freqüência dos batimentos da cauda; STR = Retilinearidade; LIN = Linearidade;
39
Os valores da motilidade após 1 hora de incubação encontrados para a urina
foram todos iguais a zero (Tabela 5). A semelhança estatística entre as variáveis de
motilidade progressiva aconteceu pelo alto desvio padrão, o que indica que estes
resultados aconteceram por fatores não controláveis e por isso não se pode afirmar que
a urina teve efeito igual a nenhum dos tratamentos aqui propostos. Makler et al. (1981)
encontraram redução de 30% na velocidade dos espermatozóides humanos incubados
em pH alcalino por 2h.
Tabela 6 – Valores médios e os desvios padrões das porcentagens de espermatozóides caninos apresentando membrana plasmática integra, acrossoma íntegro e morfologia normal após 1 hora de incubação com urina e com soluções de NaCl 300mOsmol/l e diferentes pH
Soluções Variáveis1 Controle pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 Urina
MPI (%) 93±12 a 90±22 b 84±47 b 51±28 b 50±13 b 60±23 a,b 0 c
AI (%) 96±5 a 95±2 a 92±7 a 88±5 a 92±10 a 96±1 a 35±36 a
MN (%) 92±0 a 86±4 a 94±1 a 91±5 a 69±42 a 93±1 a 93±5 a
Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística com 5% de significância 1 MPI= Membrana plasmática íntegra; AI= Acrossoma íntegro; MN= Morfologia normal.
Os valores encontrados para a integridade de membrana, avaliados com o
corante vital Eosina Amarela mostram que a urina induziu a lesão da membrana
plasmática de uma maneira mais intensa que as soluções com diferentes pH. Quando
se trata da urina não estamos avaliando o efeito do pH isoladamente, mas de todos os
fatores da urina que agem sobre a membrana plasmática, incluindo a alta
osmolaridade. Nenhum dos autores que avaliaram o efeito do pH sobre o
espermatozóide verificaram a integridade da membrana (CRICH et al., 1978, MAKLER
et al., 1981 e GRIGGERS et al., 2001).
A pouca diferença entre as porcentagens de espermatozóides com membrana
plasmática integra e a manutenção da morfologia espermática em pH aparentemente
40
nocivos (5, 6, 8 e 9) pode ser explicada pela proteção que o Glicocálix exerce sobre a
membrana plasmática, como proposto por Henderson e Stroud (2004).
As porcentagens de espermatozóides apresentando acrossoma integro não foi
diferente para as diferentes soluções utilizadas, discordando do proposto por Gadela et
al. (2001), quando os autores se referem a influencia do pH alcalino sobre a
capacitação espermática. Em seu experimento os autores utilizam o Bicarbonato de
Sódio para produzir soluções com pH alcalino e neste foram utilizadas soluções de
300mOsmol/l de NaCl com pH alcalino produzido adicionando-se Hidróxido de Sódio
(NaOH 0,1N), provavelmente não somente o pH alcalino induza a capacitação
espermática, como também a ação do Bicarbonato de Sódio sobre a Adenilato Ciclase
que leva a ativação de uma cascata de eventos que resulta na capacitação.
Experimento III – Efeitos da urina comparado aos efeitos de diferentes concentrações de uréia sobre as células espermáticas
A motilidade espermática não foi alterada quando se adicionou uréia a uma
solução de NaCl 300mOsmol/l, no tempo zero, como demonstrado na Tabela 7.
41
Tabela 7 - Valores médios e desvios padrões de variáveis indicativas da qualidade do movimento espermático imediatamente após contato do sêmen canino com urina e em soluções com diferentes concentrações de uréia (mg/100ml de NaCl 300mOsmol/l).
Soluções
Variáveis1 Controle 0 3,5 7 10,5 14 Urina
MT (%) 78±12a 81±7 a 83±5 a 74±16 a 76±15 a 73±11 a 0 b
MP (%) 65±9 a 55±10 a 52±22 a 52±13 a 54±14 a 55±10 a 0 b
VAP (µm/s) 113,7±14,5 a 76,3±8,9 b 83,5±11,7 a,b 83,7±11,8 a,b 81,2±23,1 b 80,6±11,5 b 0 c
VSL (µm/s) 108,4±12,3 a 73,5±14,4 b 65,6±19,5 b 77,9±10,1 a,b 74,2±16,6 b 78,1±20,5 a,b 0 c
VCL (µm/s) 133,4±16,3 a 121,0±19,2 a 117,0±10,7 a 114,0±20,4 a 113,4±21,8 a 112,5±23,3 a 0 b
ALH (µm) 3,5±0,7 a 5,3±1,7 a 5,9±2,7 a 4,6±1,2 a 4,6±1,2 a 4,2±1,4 a 0 b BCF (Hz) 32,7±5,2 a 25,5±6,4 a 26,4±7,7 a 28,1±5,0 a 29,2±4,7 a 27,2±4,4 a 0 b STR (%) 94±1 a 86±9 a 84±11 a 90±5 a 89±3 a 90±4 a 0 b LIN (%) 79±3 a 60±15 a 56±18 a 67±10 a 65±10 a 68±12 a 0 b
Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística com 5% de significância 1 MT= Motilidade Total; MP= Motilidade Progressiva; VAP= Velocidade do trajeto; VSL = Velocidade progressiva; VCL = Velocidade curvilinear; ALH = Amplitude lateral da cabeça; BCF = Freqüência dos batimentos da cauda; STR = Retilinearidade; LIN = Linearidade;
42
A motilidade total após 1 hora não diferiu entre os grupos com solução
salina e uréia e o grupo controle e para a motilidade progressiva. Nenhum dos
grupos diferiram estatisticamente do grupo da urina para a motilidade progressiva,
entretanto a motilidade no grupo da urina foi sempre zero, como demonstrado na
Tabela 8.
43
Tabela 8 – Valores médios e os desvios padrões de variáveis indicativas da qualidade do movimento espermático após 1 hora de incubação a 37°C do sêmen canino com urina em soluções com diferentes concentrações de uréia (mg/100ml de NaCL 150mM).
Soluções
Variáveis1 Controle 0 3,5 7 10,5 14 Urina
MT (%) 82±6a 73 ±15 a 81±11 a 78±14 a 75±9 a 67±32 a 0 b
MP (%) 59±24 a 35±31 a 42±27 a 41±29 a 35±26 a 47±26 a 0 a
VAP (µm/s) 95,5±33,0 a 60,7±31,1 a,b 64,9±25,9 a,b 70,2±35,5 a,b 59,0±28,2 a,b 68,2±25,1 a,b 0 b
VSL (µm/s) 89,9±32,4 a 50,9±31,0 a,b 54,0±24,6 a,b 59,4±35,6 a,b 50,3±27,3 a,b 58,8±25,3 a,b 0 b
VCL (µm/s) 118,1±30,8 a 100,5±38,5 a 115,5±33,0 a 114,2±48,1 a 86,6±48,9 a 112,7±30,1 a 0 b
ALH (µm) 4,5±1,6 b 6,7±0,6 a 7,0±1,0 a 6,3±0,5 a,b 6,6±0,9 a 5,9±0,6 a,b 0 c BCF (Hz) 31,5±4,8 a 25,7±4,3 a 25,4±4,4 a 26,4±5,0 a 26,5±2,1 a 26,6±5,4 a 0 b STR (%) 91±3 a 83±8 a 80±7 a 82±6 a 82±6 a 83±6 a 0 b LIN (%) 68±12 a 52±10 b 45±11 b 53±9 a,b 48±9 b 50±10 a,b 0 c
Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística com 5% de significância 1 MT= Motilidade Total; MP= Motilidade Progressiva; VAP= Velocidade do trajeto; VSL = Velocidade progressiva; VCL = Velocidade curvilinear; ALH = Amplitude lateral da cabeça; BCF = Freqüência dos batimentos da cauda; STR = Retilinearidade; LIN = Linearidade;
44
Para as variáveis de velocidade VAP e VSL, o grupo da urina foi
estaticamente igual aos grupos que foram tratados com a uréia, mas isto é explicado
pelo alto desvio padrão em torno da média encontrada nas amostras obtida, devido
a fatores não controláveis. Entretanto os grupos que receberam 3,5/7/10,5/14 mg de
uréia não diferiram estatisticamente do grupo que foi submetido à solução de
150mM de NaCl, ou seja, a uréia não influenciou a viabilidade dos espermatozóides.
A confirmação que a uréia não teve qualquer efeito sobre os espermatozóides é
dada pelas outras variáveis de motilidade que não foram diferentes entre o grupo
que não recebeu uréia e os outros. Os resultados do efeito da uréia sobre o
espermatozóide canino indicam que, diferentemente do que acontece com o
espermatozóide humano, a uréia não auxilia nos processos de capacitação
espermática, proposta por Rosseli et al. (1987), quando foi observado o aumento do
número de espermatozóides humanos encontrados dentro dos oócitos de hamsters
desnudados pela adição de uréia ao meio de fertilização in vitro.
Os resultados de integridade de membrana, integridade de acrossoma e
morfologia espermática, também não foram diferentes entre os grupos que
receberam uréia e o grupo que foi submetido apenas à solução de NaCl de
300mOsmol/l . E estão demonstrados na Tabela 9, observando que há um alto
desvio padrão encontrado para as amostras, devido a fatores não controláveis.
Tabela 9 – Valores médios e os desvios padrões das porcentagens de espermatozóides caninos apresentando membrana plasmática integra, acrossoma íntegro e morfologia normal após 1 hora de incubação em soluções com diferentes concentrações de uréia (mg/100ml de NaCL 300mOsmol/l)
Soluções
Variáveis1 Controle 0 3,5 7 10,5 14 Urina
MPI (%) 67±35 a 34±28 a 30±30 a 37±35 a 31±37 a 33±38 a 1±2 a AI (%) 96±4 a 89±2 a,b 91±5 a,b 81±26 a,b 83±18 a,b 90±5 a,b 45±42 b MN (%) 83±4 a 85±4 a 88±3 a 90±2 a 87±3 a 86±4 a 93±1 a
Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística com 5% de significância. 1 MPI= Membrana plasmática íntegra; AI= Acrossoma íntegro; MN= Morfologia normal.
Em resumo, pode-se dizer que as diferentes osmolaridades nas soluções
com diferentes concentrações de NaCl, revelaram que o efeito causado pela urina
45
está relacionado às altas osmolaridades encontradas nas amostras de urina dos
cães que participaram do Experimento I. Quando se compara os resultados
encontrados para o sêmen canino com aqueles encontrados para o sêmen humano
(CRICH et al., 1979, MAKLER et al., 1981), para o sêmen eqüino (GRIGGERS et al.,
2001, POMMER et al., 2003) e para o macaco Rhesus (RUTLANT et al., 2003), há
um consenso que a motilidade espermática é reduzida quando em contato com a
urina, pois a osmolaridade da urina geralmente encontra-se acima dos valores
fisiológicos do sêmen. Quanto ao pH, os espermatozóides caninos suportaram uma
ampla faixa de variação de pH, diferindo dos resultados encontrados para o sêmen
humano, eqüino e do macaco Rhesus, que permitiram estreitas faixas de variação
de pH. Os resultados encontrados quando os espermatozóides foram submetidos a
diferentes pH são importantes, mas não houve diferença significativa entre o pH do
sêmen canino e da urina, como encontramos também no nosso trabalho preliminar
(SANTOS et al., 2005) e segundo o padrão da espécie também não há diferença
entre o pH destes dois líquidos corporais (JOHNSON, 2001).
As diferentes concentrações de uréia não ajudaram a esclarecer o efeito da
urina sobre o sêmen, pois não detectamos quaisquer alterações significativas nos
espermatozóides submetidos às soluções que tiveram concentrações de uréia
variando de 3,5-14mg de uréia por 100 ml. Estes resultados encontrados no
concordam com Reece (1996) que diz ser a uréia relativamente não tóxica.
Os resultados da integridade de membrana e integridade de acrossoma
baixos encontrados em espermatozóides expostos à ação da urina podem ser
explicados pela interação dos fatores estudados ou pela ação de outros
componentes da urina que não foram avaliados no presente trabalho.
46
6. CONCLUSÕES
O efeito da urina sobre a motilidade espermática foi semelhante aquele
observado quando submetemos o sêmen canino a soluções de 600 e 1000mOsmol/l
de NaCl, onde foram observadas drásticas reduções da motilidade logo após o
contato dos espermatozóides com as soluções hiperosmóticas ou com a urina.
As soluções de 600 e 1000 mOsmol/l de NaCl, assim como a urina, não
causaram a alterações morfológicas nos espermatozóides.
O espermatozóide canino demonstrou ser pouco sensível às variações de
pH nas soluções que variaram de 5-9.
Não houve diferença entre o pH do sêmen e da urina nos cães deste
trabalho.
A uréia nas concentrações utilizadas, não causou qualquer efeito deletério
sobre o espermatozóide canino.
O trabalho conseguiu esclarecer o efeito da osmolaridade, pH e
concentração de Uréia sobre o espermatozóide canino, mas o efeito deletério da
urina sobre a membrana plasmática foi mais intenso que qualquer outro destes
fatores isoladamente. São necessários mais estudos sobre o tema, pois existem as
interações entre os fatores estudados e ainda encontramos na urina outros íons que
agem sobre as interações moleculares.
47
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BOOTH, N.H. (1992). Analgésicos não-narcóticos. In: Booth, N.H.; McDonald, L.E. Farmacologia e terapêutica veterinária. 6ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. p. 997. BRASSESCO, M., VISCASILLAS, P., BURREL, L., CALAF, J., RAJMIL, O., SERRA, J.M.P., FARGAS, F.M. (1988) Sperm recuperation and cervical insemination in retrograde ejaculation. Fertility and Sterility, 5:923-924. CAZES, L. B. Avaliação da eficiência de métodos de recuperação de gameta masculino em cão doméstico. 2006. p. 82. Dissertação (Mestrado em Produção Animal) - Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes. CBRA: COLÉGIO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL. Manual para exame andrológico e avaliação de sêmen animal. 2.ed. Belo Horizonte: CBRA, 1998. 49p. CHRISTOVA, Y.T., JAMES, P.S., COOPER, T.G., JONES, R. (2002) Lipid diffusion in the plasma membrane of mouse spermatozoa. Changes during epididymal maturation, effects of pH, osmotic pressure and knockout of the c-ros gene. J. Androl., 23 (3), 384–392. CRICH, J.P., JEQUIER, A.M. (1978) Infertility in men with retrograde ejaculation: the action of urine on sperm motility, a simple method for achieving antegrade ejaculation. Fertility and Sterility, 5:572-576. COLES, E.H. (1986) Renal Function Tests. In: Autor Veterinary Clinical Pathology. Ed. Philadelphia. pp. 178-179. CROSS, N.L., Reorganization of Lipid Rafts During Capacitation of Human Sperm. Biology of Reproduction 71, 1367–1373 (2004) DAHLBOM, M., ANDERSSON, M., VIERULA, M., ALANKO, M. (1997) Morphometry of normal and teratozoospermic canine sperm heads using an image analyzer: work in progress. Theriogenology, 48:687-698. DARSZON, A., LABARCA, P., NISHIGAKI, T., ESPINOSA, F. (1999) Ions Channels in Sperm Physiology. Physiological Reviews, 79(2):481-510. EDDIN, M. (2003) The state of lipid raft: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 32:257–83.
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