Avaliação dos genes acessórios de HIV e polimorfismos humanos no sucesso terapêutico contra AIDS

Avaliação dos genes acessórios de HIV e polimorfismos humanos no sucesso terapêutico contra AIDS

Renato S. AguiarLaboratório de Virologia Molecular

Universidade Federal do Rio de Janeiro

HIV AIDS

gp120

gp 41

matrix

envelope

CapsidViral RNA

Family: Retroviridae (Reverse Transcriptase – RT)

Genus: Lentivirus (enveloped virus with a conical capsid and slow progression)

HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS - HIV

HIV-1 GENOMA

nef

~ 9 kb5’ LTR 3’ LTR

gag

MA CA NC P6

PRO RT INT

pol

vif

vprenvSU TMvpu

tat

rev

vpr

nef

~ 9 kb

Genoma duas moléculas de vRNA (DIS)

Proteínas sintetizadas como poliproteínas precursorasProteínas essenciais: Gag, Pol e Env

Proteínas regulatórias: Tat, Rev e Nef

Proteínas acessórias: Vpr, Vpu e Vif

Receptors Fusion Uncoating

IntegrationReverse transcription

REPLICATIVE CYCLE – REPLICATIVE CYCLE – early stagesearly stages

HIV replication – Late stepsHIV replication – Late steps

Transcription Translation Env proteins

Assembly Budding

Imat

ure

Mat

ure

InfecçãoPrimária

Infeçção aguda ao HIV

Semanas

Tempo de InfecçãoTempo de InfecçãoAnos

InfecçãoOportunística

Morte

Latência Clinica

Começo dosSintomas

Cél

ula

s T

CD

4+ (

célu

las/

Cél

ula

s T

CD

4+ (

célu

las/

L)

L)

Có

pia

s de R

NA

do

HIV

(cóp

ias/mL

pla

sma)

Có

pia

s de R

NA

do

HIV

(cóp

ias/mL

pla

sma)

PATOLOAIDS PATOLOGIA

AIDSAIDS

ANTIRETROVIRALS TARGETS

Protease Inhibitors

INIBIDORES NNRT DE RT

NNRT Inhibitors

NRT Inhibitors

Fusion Inhibitors

Integrase Inhibitors

Fatores que Influenciama Falha Terapêutica

• Fatores Virais (IAS,2011)

Aderência

• Fatores do HospedeiroVariaçãoGenética

Mutaçõesde

Resistência

1o salto da RT

RNase H degrada RNA, exceto PPT

RT utiliza PPT como primer fita +

2o salto da RT

Ausência de atividade revisora

Taxa de mutação da RT: ~ 2,5 x 10-4 mut / nt / ciclo replicativo

Geração de partículas: 109 a 1010 por ciclo replicativo.

TRANSCRIPTASE REVERSA - RT

EVOLUÇÃO DE HIV

12

345

6

7

8

9

PACIENTES:

Vírus isolados de 9 pacientes coletados em diferentes datas e de diferentes compartimentos. Árvore filogenética construída a partir do gene de envelope (1.122

sequências de 822 pares de bases)

(IAS, 2011)

Mutações Virais

Dinâmica viral na resistência

Coffin JM, 1995

Camacho, R (2000)

Resistência secundária

Além da atividade da RT para a geração de diversidade de HIV, vamos adicionar a atividade

da APOBEC.

HIV-1 restriction of Apobec proteins

G→A Hypermutations

All proteins in this family have one or two CDA motifs harboring one histidine and two cysteine residues, and the glutamic acid residue that are involved in the

hydrolytic deamination of cytosine. The zinc-binding motif is highlighted.

CYTOSINE DEAMINATION DOMAIN - CTD

HYPERMUTATIONS IN HIV SAMPLES FROM PATIENTS

• high content of mutations• stop codons creation

• viral proteins inactivation• decrease of viral replication

APOBEC proteins family

• A1

• AID

• A2

•A3 (A3A – A3H)

apoB mRNA edition (colesterol transport)

Somatic hypermutation antibody gene diversification

Unknow function

Inate Immunity

Antiviral restriction (HIV, SIV, MLV, MMTV, HBV e HTLV-1)

Retroelements inhibition

If APOBEC proteins are so effecient in HIV restriction WHY

virus still replicates?

HIV-1 genes

A3GA3F

cytidine deamination(G to A transitions)

RT

DNA degradationmutant HIV

Vif

A3G, A3F

Ub SCF

RTreverse transcription

Integration

productive infection

non-productive infection

producer cells

target cells

26S

HIVVif

HIV

The mechanism of Vif-dependent APOBEC3G degradation

Vif binds APOBEC3G and forms a complex that recruits the cellular proteinselongin B and elongin C, which then mediate cullin-5 dependent ligation of ubiquitin

(Ub) to APOBEC3G and posterior degradation.

NO ENTANTO, se existirem mutações em vif que diminuam sua atividade mas não com perda de

função o genoma viral pode ser hipermutado por APOBEC gerando diversidade e resistência aos

antiretrovirais.

They show that naturally occurring HIV-1 Vif point mutants with suboptimal anti-APOBEC3G activity induce the appearance of proviruses with lamivudine (3TC) drug resistance-associated mutations before any drug exposure

Using a subtype B standard, 11 samples profile hypermutation  P <0.09, 7 samples showed hypermutation profile of P <0.05. Mutation M36I, L63P, L89M, I93L at the protease, K103N, M184V at the RT more frequently.

640 samples of individuals with treatment failure, using RT and protease inhibitor from clinical follow-up in the Brazilian program National Network of HIV-1 genotyping (RT e PRO)

The levels of hypermutations of each sequence were evaluated using the software: www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html.

We found other vif polymorphism with high frequency between amino  acids 33-39, and 122-128

Dra. Mariza MorgadoDra. Caroline Passaes

“Avaliação da atuação das proteínas APOBEC na integrase de pacientes

controladores”

Long Term Non Progressors

Controladores de elite (EC) Controladores virêmicos (VC)

● Pacientes com carga viral indetectável (<50 cópias/ml).

● Apresentam contagem alta de células T CD4+.

● Apresentam contagem baixa de células T CD8+.

● Pacientes com carga viral detectável (<2000 cópias/ml).

● Apresentam contagem alta de células T CD4+.

● Apresentam contagem baixa de células T CD8+.

Tabela 1: Características clínicas dos pacientes controladores do HIV

NA – não analisados

Analisar integrase e o vif de um mesmo controlador

NL43-Luc ΔIN

+ PCR da integrase

+ A3G+ NL43-Luc ΔVif

Funcional INFuncional Vif

Transfectar em 293T

Transfectar em 293T

amplificação dessa região

● DNAg

● primers externos

● primers internos

hipermutadosIN de paciente EC13

Analisar integrase e o vif de um mesmo controlador

NL43-Luc ΔIN

+ PCR da integrase

+ A3G+ NL43-Luc ΔVif

Funcional INFuncional Vif

Transfectar em 293T

Transfectar em 293T

amplificação dessa região

● DNAg

● primers externos

● primers internos

Fatores que Influenciama Falha Terapêutica

Mutações• Fatores Virais de (IAS,2011)

Resistência

Aderência

• Fatores do HospedeiroVariaçãoGenética

VARIAÇÃO GENÉTICA

Mecanismos de Entrada

HOSPEDEIRO

Drogas

Mecanismos de Entrada

HOSPEDEIRO

Drogas

Mutação

Mecanismos de Efluxo

HOSPEDEIRO

Efluxode

Drogas

Droga

Mecanismos de Efluxo

HOSPEDEIRO

Efluxode

Drogas

Droga

Mutação

Variações Genéticas - Polimorfismos

Single-Nucleotide Polymorphism – SNP

Genes SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3 e ABCB1

CROMOSSOMO

6

6q25.3

SLC22A3

SLC22A2

SLC22A1

SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3

Transportadores de Cátions OrgânicosOCT-1, OCT-2, OCT-3

7q21.12

CROMOSSOMO

7

ABCB1

ABCB1Proteína Associada à Resistência a Múltiplas Drogas

Glicoproteína P

Objetivo Geral

Caracterizar a associação entre os polimorfismos de base única (SNPs) dos

genes relacionados ao transporte de antirretrovirais com a falha terapêutica na população de pacientes HIV+ da região sul

do Brasil

• Caracterizar a frequência dos SNPs e dos haplótipos dos genes SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3 e ABCB1 na população de pacientes HIV+ da região sul do Brasil;

• Caracterizar a associação dos SNPs dos genes SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3 e ABCB1 com a falha terapêutica;

• Caracterizar o impacto dos SNPs associados com a falha terapêutica em ensaios funcionais.

Objetivos Específicos

Amostras – Projeto sul (2008)

Curitiba, Porto Alegre – 350

Pacientes em Tratamento

120 117

CONTROLESucesso

terapêutico desde a 1ª linha de

tratamento, com acompanhamento de pelo menos 6

meses

CASOFalha

terapêutica na 1ª linha de

tratamento

Variáveis Demográficas

Controle Caso Valor p

♂

♀

76 (63,33%)

43 (35,83%)

68 (58,12%)

47 (40,17%)>0,05*

PR

RS

70 (58,33%)

50 (41,67%)

74 (63,25%)

43 (36,75%)>0,05*

Idade 38,84 ±10,12 34,50 ±10,04 <0,05**

Me Idade 38 (21-68) 33 (9-61) -

*Teste Chi2; **Teste Mann-Whitney

Diluição das amostras para 50ng/L

Qiaamp DNA Mini and Blood Mini Handbook

NanoPhotometer™ Pearl

Spectrophotometer

Preparação das Amostras

SNaPshot®

SLC22A1

Amplificação de 7 fragmentos que contêm os 10 SNPs por MULTIPLEX®

10 SNPs tipados – informação de 21 SNPs

Padronização

Multiplex®

C- 177 251 273 433 492 534 583

100bp

1kbplus

100

200

300

400

500

100

200

300

400

500

TESTE PRIMERS

Reação de SNaPshot®

CTCCAACACGACATCGCCGCA

TGCCCTTTTCTTCTTTGCTGTTTGC

TGATTGCTTATTTATTTATTTTAACTCCAA

MULTIPLEXSNAPSHOT

PolimorfismoAncestral

TGATTGCTTATTTATTTATTTTAACTCCAA G

Purificação com SAP e ExoIPurificação SAP

AT

CG

H

H

H

H

H

H

H

H

24bp

OpenArray®

SLC22A2

12 SNPs tipados – informação de 38 SNPs

SLC22A3

4 SNPs tipados – informação de 11 SNPs

ABCB1

16 SNPs tipados – informação de 86 SNPs

Total de Marcadores

156

Ensaio TaqMan®

Média/Larga EscalaTotal de genótipos/amostras por lâmina – 3072/96

AA

AG

GG

96amostras

RESULTADOS

Open Arrayrs1045642

AA

AG

GG

384amostras

GeneMapper

(SNaPshot)

TaqManGenotyper

(OpenArray)

R

Equilíbriode HW

Desequilíbriode Ligação

Regressão Logística(com ou sem ajuste)

Correção paracomparações

múltiplas(Bonferroni, FDR)

ResultadosEstudo de Desequilíbrio de Ligação

SLC22

A1

SLC22

A2

SLC22

A3

Medida de associação – r2

Resultados

Tabela de p Valorrs9282564 0.65301 rs3842 0.04544 rs17588242 0.64928

rs17327624 0.95093 rs1867351 0.23927 rs10945657 0.30444

rs1202172 0.72461 rs683369 0.40158 rs315978 0.91938

rs10280623 0.76100 rs628031 0.33814 rs316003 0.37963

rs1202170 0.03931 rs35167514 0.00050 rs316002 0.62532

rs1128503 0.04411 rs1382785 0.89969 rs3103352 0.58021

rs2235035 0.09278 rs622591 0.03768 rs2292334 0.27222

rs6961419 0.03394 rs316019 0.94504 rs2048327 0.19087

rs11760837 0.43903 rs2279463 0.60016 rs1810126 0.08060

rs1045642 0.63961 rs315996 0.66321 rs3088442 0.28258

rs35167514 – 420del (A)SLC22A1 (éxon)

Genótipo N frequência Modelo de Regressão Logística

Modelo de Regressão Logística com Correção (Idade, Sexo,

Região)

Casos Controles OR (p value) IC 95% OR (p value) IC 95%

AA 47 (46,5) 76 (73,1) Referência Referência Referência Referência

A_ 51 (50,5) 27 (26,0) 3,05 1,69-5,52 3,17 1,71-5,86

__ 3 (3,0) 1 (1,0) 4,85 0,49-48,01 5,27 0,50-55,92

101 104 0,0005 0,0004965

>1 = Risco de Falha

OR

<1 = Proteção

Resultados

Estudo de Associação

FRAMESHIFT

0.0001261

Perspectivas

• Análise multivariada das 237 amostras tipadas considerando ancestralidade e tratamento;

• Analisar o desfecho mutação de resistência para os SNPs que se mostraram associados;

• Confirmar a associação encontrada por sequenciamento;

• Validar os SNPs significativos em testes funcionais.

• Amilcar Tanuri - UFRJ

• Rodrigo Brindeiro – UFRJ

• Cynthia Chester - UFRJ

• Mariza Morgado – Fiocruz

• Carolina Passaes - Fiocruz

• Juliana Dias - UFRJ

• Veronica Bichara

Agradecimentos

UFRJ-Brazil

contact: santana@biologia.ufrj.br

Secretaria de Vigilância em

Saúde