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SABRINA DE CASTRO BRASIL

AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA DA INFLUÊNCIA DA OSTEOPOROSE NA EVOLUÇÃO DE LESÕES

PERIRRADICULARES EM RATAS

2013

2011

ii

SABRINA DE CASTRO BRASIL

AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA DA INFLUÊNCIA DA OSTEOPOROSE NA EVOLUÇÃO DE LESÕES PERIRRADICULARES EM RATAS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Estácio de Sá visando a obtenção do grau de Mestre em Odontologia (Endodontia).

Orientadoras:

Prof.ª Dra. Luciana Armada Dias

Prof.ª Dra. Rachel Moreira Moraes dos Santos

UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ

RIO DE JANEIRO

2013

iii

Dedicatória À Deus, que me conduz e fortalece a cada dia. Ao meu amado filho Rafael, que mesmo sem entender direito o que estava acontecendo, me renovou a cada dia desta trajetória com muito amor e alegria. À minha mãe Celi, por ter vivido cada fase de forma companheira e por ter sido tão ajudadora em todo tempo. À minha irmã Paula pelo incentivo, amizade, apoio e por ser um exemplo profissional em minha vida.

iv

AGRADECIMENTOS

À Prof.ª Dra. Luciana Armada Dias, a quem tenho grande respeito e admiração, pela orientação, amizade, incentivo e por ter acreditado em mim para a realização deste trabalho. Sua competência e dedicação foram e sempre serão motivadores essenciais em minha vida. À Prof.ª Dra. Rachel Moreira dos Santos Morais pela orientação, paciência, apoio, amizade, e por ter me recebido com tanto carinho nas instalações da Universidade Federal Fluminense. Sua humildade, seriedade e habilidade foram e serão inspiradores. Obrigada por me ajudar a acreditar que seria possível. Ao coordenador do PPGO, Prof. Dr. José Freitas Siqueira Júnior, a quem tenho a honra de ter conhecido e a gratidão por ter depositado confiança em mim para a execução deste trabalho. Aos meus pais pelo apoio emocional em todo o tempo, por me incentivarem durante toda a minha trajetória profissional e por terem me ensinado valores indispensáveis para a execução de tarefas aparentemente impossíveis. Ao meu filho Rafael pela compreensão, carinho e amor, que funcionaram como combustível para a conclusão desta etapa da minha vida. À minha irmã Paula, pelo apoio emocional, amizade, pelas palavras de incentivo e motivação. Ao Luciano, meu companheiro e amigo pelo incansável apoio emocional e profissional. Aos brilhantes professores que compõem o PPGO da UNESA, pois todos contribuíram grandemente em minha vida com seus ensinamentos. Ao Prof. Dr. Flávio Ferreira Alves, por ter acreditado em mim e me incentivado a ingressar no PPGO. Agradeço por sua contagiante motivação e dedicação. Aos professores Prof. Dr. Fábio Vidal, pelas brilhantes considerações na etapa de qualificação, ao Prof. Dr. José Cláudio Provenzano pelo incentivo e palavras motivadoras e a Prof. Dra. Mônica Schultz Neves, a quem tenho grande carinho, gratidão e admiração por sua excelência clínica. Ao Prof. Dr. Fábio Ramôa Pires, pelas brilhantes considerações na qualificação, pela contribuição para a realização da análise morfológica e nas etapas de inclusão e cortes histológicos.

v

À equipe técnica do laboratório de Patologia da UERJ pelo auxílio nas etapas de inclusão, cortes histológicos e confecção das lâminas. Ao Renan de Souza Lima, médico veterinário, pela parceria no trato com os animais em todo o experimento, principalmente nas etapas de ovariectomia, desenvolvimento de lesão perirradicular e sacrifício. À secretária Angélica Pedrosa pelo imenso carinho, apoio e amizade. À minha ASB e amiga Rosilene Santos pela compreensão, amizade e parceria. Às minhas amigas de trabalho, Dras. Benícia Bizzo, Priscila Nielle e Danielle Torres pelo incentivo, paciência, carinho e acima de tudo pela grande amizade. À equipe da Universidade Federal Fluminense, em especial a técnica Arlete pela presteza e auxílio nas etapas de descalcificação e inclusão, a aluna de iniciação científica Roberta pelo auxílio com os animais e companhia nas leituras de lâminas durante a citologia e ao bioterista Redinei pelo auxílio no cuidado com os animais. À equipe técnica do laboratório de Patologia da UERJ pelo auxílio nas etapas de inclusão, cortes histológicos e confecção das lâminas. À equipe da Clínica CIROD Radiologia Oral, que permitiram a realização das radiografias digitais em todas as fases experimentais. Aos colegas de turma Adirson Jorge e Helena Baruffaldi pelo carinho e amizade em todo o decorrer do curso, e aos demais colegas do Mestrado e Doutorado pela amizade e companheirismo em especial Natasha Ajuz, Camila Arão, Fábio Barcelos, Cintia Bueno e Renata Val.

vi

ÍNDICE

Página

RESUMO..............................................................................................................

vii

ABSTRACT...........................................................................................................

viii

LISTA DE FIGURAS.............................................................................................

ix

LISTA DE TABELAS.............................................................................................

xi

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS................................................................

xii

1. INTRODUÇÃO..........................................................................................

01

2. REVISÃO DE LITERATURA.....................................................................

03

3. JUSTIFICATIVA........................................................................................

27

4. HIPÓTESE................................................................................................

28

5. PROPOSIÇÃO..........................................................................................

29

6. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................

30

7. RESULTADOS..........................................................................................

35

8. DISCUSSÃO.............................................................................................

43

9. CONCLUSÕES.........................................................................................

50

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................

51

11. ANEXO.....................................................................................................

62

vii

RESUMO

Objetivo: Avaliar os efeitos da osteoporose na evolução da lesão

perirradicular.

Métodos: Foram utilizadas ratas Wistar (n=24), isogênicas e virgens, com 3

meses de idade, previamente avaliadas por citologia vaginal. Metade dos

animais foi ovariectomizada (OVX) e a outra metade foi pseudo-operada (C).

Após 150 dias de castração foi estimulado o desenvolvimento de lesão

perirradicular através da exposição pulpar dos primeiros molares inferiores

esquerdos. A massa corporal foi verificada semanalmente. Ao final dos

períodos experimentais (21 e 40 dias de lesão) os animais foram sacrificados, o

sangue foi coletado para análise de fosfatase alcalina, cálcio e fósforo e as

mandíbulas foram excisadas e radiografadas.

Resultados: A deficiência estrogênica resultou em ganho de massa corporal

significantemente maior (p < 0.01) em OVX 40 dias quando comparado ao C 40

dias. Esta diferença não foi observada no experimento de 21 dias. Os níveis

séricos de cálcio, fósforo e fosfatase alcalina não apresentaram diferenças

estatisticamente significativas entre OVX e C (21 e 40 dias). As lesões

perirradiculares avaliadas radiograficamente foram significativamente maiores

no grupo OVX 40 quando comparado a C 40 (p<0.05) e a C 21 (p< 0.001).

Conclusões: Através deste estudo foi possível verificar que a osteoporose

atuou como modificador da doença, pois influenciou na evolução da lesão

perirradicular, principalmente em períodos crônicos.

Palavras-chaves: lesão perirradicular; osteoporose; mandíbula.

viii

ABSTRACT

Aim: Evaluate the effects of osteoporosis in the evolution of apical periodontitis.

Methods: Wistar rats (n = 24),isogenic and virgins, 3 months old, previously

assessed by vaginal cytology were used. Half of the animals were

ovariectomized (OVX) and the other half pseudo-operated (C). 150 days after

castration was induced development of apical periodontitis by pulp exposure of

their mandibular left first molars. Body weight was checked weekly. At the end

of the experimental periods (21 and 40 days of injury) the animals were

sacrificed, blood was collected for analysis of alkaline phosphatase, calcium

and phosphorus and the jaws were excised and radiographed.

Results: Estrogen - deficient state resulted in significantly greater gain in body

mass (p <0.01), OVX at 40 days compared to C 40 days. This difference was

not observed in the experiment of 21 days. Serum calcium, phosphorus and

alkaline phosphatase showed no statistically significant differences between

OVX and C (21 and 40 days). The periradicular lesions evaluated

radiographically were significantly higher in the OVX group compared to 40 C

40 (p <0.05), and C 21 (p <0.001).

Conclusions: The findings from this study showed that osteoporosis acted as

a modifier of the disease, as influenced the evolution of apical periodontitis,

especially in chronic periods.

Key-words: apical periodontitis, osteoporosis; jaw.

ix

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1: Dano tecidual direto e indireto causado por bactérias ao exercerem sua patogenicidade..................................................................

11

Figura 2: Funções do RANK, RANKL e OPG na osteoclastogênese em condições homeostáticas e inflamatórias..................................................

16

Figura 3: Modificadores da doença........................................................... 17

Figura 4: Fotomicrografia de lâminas de esfregaço vaginal de ratas controle, nas diferentes fases o Ciclo Estral, coradas pelo método tricômico de Shoor.....................................................................................

26

Figura 5: Citologia vaginal.........................................................................

31

Figura 6: Desenvolvimento de lesão perirradicular...................................

32

Figura 7: Valor de massa corporal inicial (g).............................................

36

Figura 8: Valor de massa corporal final (g)...............................................

36

Figura 9: Valor de Δ (massa corporal final-massa corporal inicial)...........

37

Figura 10: Análise comparativa dos níveis séricos de cálcio....................

38

Figura 11: Análise comparativa dos níveis de fósforo..............................

39

Figura 12: Análise comparativa dos níveis de fosfatase alcalina..............

40

Figura 13: Análise comparativa do tamanho de lesões perirradiculares entre os grupos experimentais...................................................................

42

Figura 14: Radiografias de mandíbulas....................................................

42

x

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1: Mediadores Químicos da inflamação e seus efeitos.................

10

Tabela 2: Valores de massa corporal inicial (g)........................................

35

Tabela 3: Médias das concentrações séricas de cálcio (mg/dl) por grupo..........................................................................................................

38

Tabela 4: Médias das concentrações séricas de fósforo (mg/dl) por grupo..........................................................................................................

39

Tabela 5: Médias das concentrações séricas de fosfatase alcalina (U/L) por grupo....................................................................................................

40

Tabela 6: Médias dos tamanhos das lesões perirradiculares...................

41

xi

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

C controle

°C graus Celsius

dl decilitro

FcyR receptor celular de superfície gama

Fcy receptor de superfície

FcyRIIIa receptor celular de superfície gama IIIa

FSH hormônio folículo estimulante

IFN-γ interferon Gama

HIV vírus da imunodeficiência humana

Ig imunoglobulina

IL-1 interleucina-1

IL-1α interleucina-1 alfa

IL 1-β interleucina-1 beta

IL-6 interleucina-6

IL-11 interleucina-11

IL-17 interleucina-17

LH hormônio luteinizante

M-CSF fator estimulante de colônia de macrófago

mg miligrama

Mmol milimol

OPG osteoprotegerina

xii

OVX ovariectomizado

PAF fator de agregação plaquetária

PTH paratormônio

PG prostaglandina

RANK receptor activator of NF Kappa

RANKL receptor activator of NF-kB ligand

TNF fator de necrose tumoral

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

TNF-β fator de necrose tumoral beta

Toll toll-like receptors

U/L unidade por litro

Δ delta

1

1. INTRODUÇÃO

A lesão perirradicular é uma doença inflamatória de etiologia microbiana

causada primariamente pela infecção do sistema de canais radiculares

(SIQUEIRA, 2011). Embora fatores de ordem física e química possam induzir

ao aparecimento de uma lesão perirradicular, vários estudos indicam que

apenas os agentes microbianos são responsáveis pela progressão e

manutenção da inflamação perirradicular (KAKEHASHI, et al.,1965; MÖLLER,

1966; SUNDQVIST,1976; MÖLLER et al., 1981). A ocorrência da doença

perirradicular está associada às respostas inflamatória e imunológica do

hospedeiro com o intuito de conter o avanço da infecção endodôntica (LOPES

& SIQUEIRA, 2010).

Diversos mediadores químicos, como por exemplo, interleucinas (IL) 6,

11, 17 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), são liberados aos tecidos

perirradiculares em casos de infecção. Ao atingirem níveis críticos, estes

estimularão células do estroma e osteoblastos a expressarem receptor

activator of NF-kB ligand (RANKL), e diminuir a produção de osteoprotegerina

(OPG), promovendo a diferenciação e ativação dos osteoclastos, responsáveis

pela reabsorção óssea e consequente crescimento da lesão perirradicular

(TAKAYANAGI, 2005a e 2005b).

No entanto, os hospedeiros podem apresentar diferentes respostas

à infecção perirradicular e ao mesmo tipo de tratamento endodôntico. Tal fato

ocorre, pois alguns indivíduos apresentam condições que podem influenciar na

http://mail-attachment.googleusercontent.com/attachment/?ui=2&ik=3254b28024&view=att&th=13c9632b869425f7&attid=0.1&disp=vah&realattid=f_hcc6yqs61&safe=1&zw&saduie=AG9B_P9Rfax6l_zAwqr6_AqNZxKz&sadet=1359730561601&sads=ui3myeDzGmxjb-IMckJXWU6-jEo

2

susceptibilidade da doença (SEGURA-EGEA et al., 2005; ROSANIA et al.,

2009). Estas condições podem ser referidas como modificadores da doença,

desde que não sejam sua causa, mas possam influenciar no desenvolvimento,

diagnóstico, severidade ou resposta ao tratamento (SIQUEIRA, 2011).

A osteoporose representa uma das osteopatias mais comuns, e

caracteriza-se pela redução da massa óssea e deterioração do tecido ósseo,

conduzindo a um aumento da fragilidade óssea e a um consequente aumento

do risco de fratura (AMADEI et al., 2006). Quando o metabolismo ósseo está

em condições normais, existe um equilíbrio entre a formação e a reabsorção

ósseas. Porém, tanto no hipogonadismo como na senescência, há um

desequilíbrio na remodelação óssea que resulta em redução de massa óssea,

caracterizando assim um quadro de osteoporose (JHONSON et al., 2002).

As alterações no metabolismo ósseo levam a um aumento da

reabsorção óssea e a uma diminuição na possibilidade de reparo. É provável

que esta condição exerça influência sobre a evolução das lesões

perirradiculares, que são processos inflamatórios que resultam em destruição

do osso alveolar ao redor do ápice dentário. Porém, não existem relatos na

literatura sobre a osteoporose como modificador da doença perirradicular.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Infecções Endodônticas

Em condições fisiológicas assépticas, os tecidos e órgãos internos de

mamíferos encontram-se livres de microrganismos. Esta situação é mantida

pela ação de barreiras naturais, representadas por fatores mecânicos, químicos

e biológicos, que isolam o interior do organismo, impedindo assim, o contato

com microrganismos ambientais e com os componentes da própria microbiota

anfibiôntica (SIQUEIRA & DANTAS, 2000). Portanto, a exposição da dentina

coloca a polpa em risco de infecção como consequência da permeabilidade da

dentinária normal inerente a estrutura tubular (COHEN, 2011).

As principais alterações patológicas que acometem a polpa e os tecidos

perirradiculares são de natureza inflamatória e etiologia infecciosa. Estudos

clásssicos indicam que agentes microbianos são os principais responsáveis

pela progressão e manutenção da inflamação perirradicular (KAKEHASHI, et

al.,1965; MÖLLER, 1966; SUNDQVIST,1976; MÖLLER et al., 1981).

Quando os microrganismos que colonizam o sistema de canais

radiculares conseguem alcançar os tecidos perirradiculares via forame apical,

ou via forames laterais, instala-se um processo inflamatório na região com o

intuito de tentar evitar que a infecção se dissemine pelo osso e pelos tecidos

moles. Na maioria das vezes, há um equilíbrio entre as defesas do hospedeiro

e a agressão causada pelos patógenos endodônticos, originando uma lesão

perirradicular crônica. Porém, quando a agressão microbiana aos tecidos for

4

muito intensa, um abscesso perirradicular agudo poderá se desenvolver na

região, podendo a infecção alcançar outras áreas da região da cabeça e do

pescoço (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2008).

A inflamação é a principal resposta da polpa e dos tecidos

perirradiculares a uma gama de estímulos que causam injúria tecidual. A

intensidade da resposta inflamatória irá variar conforme o tipo de agressão e,

principalmente, a sua intensidade. Uma vez que a agressão rompe a

integridade tecidual, a resposta inflamatória localiza e prepara os tecidos

alterados para a reparação da região afetada. Na persistência do estímulo

agressor, as próprias respostas de defesa do hospedeiro, específicas ou

inespecíficas, podem gerar o dano tecidual. No caso de doenças pulpares e

perirradiculares, a destruição tecidual causada pelas defesas do hospedeiro em

resposta a uma agressão persistente parece ser mais significativa do que os

próprios efeitos diretos proporcionados pelos microrganismos (LOPES &

SIQUEIRA, 2010), e é caracterizada por alterações vasculares,

extravasamento e migração de neutrófilos e monócitos ao local da agressão

(SIQUEIRA, 2011).

Na infecção endodôntica, os microrganismos penetram no sistema de

canais radiculares além do alcance das defesas do hospedeiro e de antibióticos

sistêmicos. A falta de suprimento sanguíneo ativo na polpa necrosada ou

dentes despolpados (tratados) impede o transporte de células/moléculas de

defesa e antibióticos sistêmicos ao sítio infectado. Tal fato difere a infecção

endodôntica de infecções que ocorrem em outros locais do corpo humano

(CHÁVES de PAZ, 2007; JUNGERMANN et al., 2011).

5

Quanto à localização, as infecções endodônticas podem ser

classificadas em intrarradicular e extrarradicular A infecção intrarradicular

ocorre quando microrganismos colonizam o sistema de canais radiculares, e

pode ser classificada como primária, secundária ou persistente (SIQUEIRA,

2011).

A infecção primária é causada por microrganismos que inicialmente

invadem e colonizam o tecido pulpar necrótico. Já a secundária é causada por

microrganismos que não estavam presentes durante a infecção primária, mas

invadiram o canal radicular algum tempo após intervenção profissional. A

infecção persistente ocorre quando microrganismos envolvidos na primária e

secundária resistiram aos procedimentos antimicrobianos e à escassez de

nutrientes em canais tratados (RÔÇAS et al., 2011).

A persistência das infecções crônicas está geralmente relacionada à

organização comunitária dos biofilmes e à inacessibilidade às defesas do

hospediro, devido à localização anatômica da infecção (COHEN, 2011). O

biofilme pode ser definido como uma comunidade microbiana multicelular

séssil, caracterizada por células que estão firmemente ligadas a uma superficie

e aderidas em matriz polimérica extracelular, usualmente, polissacarídeos

(DUGGAN & SEDGLEY, 2007; SIQUEIRA, 2011). As células localizadas mais

profundamente no biofilme são expostas às condições ambientais que diferem

daqueles na superfície, incluindo diminuição da tensão de oxigênio. Isto resulta

em uma alteração fenotípica em termos de taxa de crescimento e transcrição

de genes, que podem facilitar certas características de sobrevivência e

virulência. A lenta taxa metabólica de microorganismos em biofilmes, bem

6

como a matriz extracelular do biofilme pode impedir a eficácia de muitos

antimicrobianos (DUGGAN & SEDGLEY, 2007).

A infecção extrarradicular é caracterizada pela invasão microbiana do

tecido perirradicular inflamado como uma sequela da infecção intrarradicular.

Teoricamente, essas infecções podem ser dependentes ou independentes da

infecção intrarradicular, embora a última apresente controvérsias (RICUCCI &

SIQUEIRA, 2008).

As lesões perirradiculares constituem uma resposta inflamatória e imune

contra patógenos bacterianos que infectam e destroem a polpa dental, em

consequência da formação de cáries dentárias e traumas. Este processo

inflamatório resulta em destruição do osso alveolar ao redor do ápice radicular

(FUMISHIGE et al., 2009).

2.2. Defesa Tecidual contra Infecções Endodônticas

A resposta imune à penetração e proliferação bacteriana nos tecidos é

dividida em imunidade inata e imunidade adaptativa. A imunidade inata é a

primeira linha de defesa, e a resposta imune adaptativa é a mais sofisticada e

efetiva em termos de reconhecimento e prevenção à reinfecção (SIQUEIRA,

2011).

2.2.1. Resposta Imune Inata

A imunidade inata é uma defesa inicial, ativada imediatamente após a

invasão de bactérias nos tecidos. Esta resposta pode ser dividida em fase pré-

inflamatória primariamente, onde macrófagos residentes e sistema

7

complemento tentam eliminar bactérias, e resposta inflamatória aguda. Os

principais mecanismos da resposta inata contra bactérias são ativação do

sistema complemento, fagocitose e a resposta inflamatória (SIQUEIRA, 2011).

ITO et al. (2013) descrevem a resposta inata como uma rápida proteção

contra patógenos, a qual, com o tempo, pode ativar e iniciar a resposta imune

adaptativa através de receptores Toll-like receptors (Toll), que também

desempenham papel importante no reconhecimento de componentes

microbianos.

Quando da persistência da agressão bacteriana, não eliminada pela

defesa inata não induzida, um dano tecidual é gerado, o que induz o

desenvolvimento da resposta inflamatória aguda (SIQUEIRA & DANTAS,

2000).

A destruição tecidual e a inflamação observadas na lesão perirradicular

estão associadas ao tecido de granulação, que contém células inflamatórias

como linfócitos T e B, plasmócitos e inúmeras células como

monócitos/macrófagos. Estas células produzem uma gama de mediadores

químicos envolvidos no processo inflamatório (ABBAS et al., 2007) .

Alterações vasculares são induzidas pela variedade de mediadores

químicos liberados em resposta ao reconhecimento de microrganismos e ao

dano tecidual. No local onde ocorreu a injúria, ocorrem alterações no calibre

vascular, com o consequente aumento do fluxo sanguíneo; alterações

estruturais nos componentes da microcirculação, acarretando em aumento da

permeabilidade vascular e na saída de células e moléculas dos vasos para os

8

tecidos; migração de células de defesa (leucócitos) e acúmulo no espaço

extravascular (SILVERTHORN, 2003).

2.2.2. Resposta Imune Adaptativa

A imunidade adaptativa é iniciada quando ocorre falha na eliminição da

infecção pela imunidade inata (SIQUEIRA, 2011). Trata-se de uma resposta

antígeno específica, e serve para aprimorar os mecanismos de proteção da

imunidade inata inespecífica (HAHN & LIEWEHR, 2007).

A resposta imunológica adaptativa é dividida em dois tipos básicos:

imunidade humoral, mediada por anticorpos, moléculas responsáveis pelo

reconhecimento específico de partículas estranhas, e imunidade celular,

mediada por linfócitos T. A imunidade adaptativa inclui receptores específicos

nos linfócitos T e B, além dos seus produtos os quais incluem as quimiocinas,

citocinas inflamatórias e anticorpos. Quimiocinas inflamatórias dirigem o tráfico

de células do sistema imunológico, e as citocinas induzidas durante a ativação

das células T promovem a regulação de respostas imunes e inflamatórias

(HAHN & LIEWEHR, 2007; LOPES & SIQUEIRA, 2010).

O maior componente de defesa envolvido na inflamação crônica,

portanto, é a resposta imune adaptativa, que pode ser dividida em três fases:

reconhecimento de antígenos, ativação de linfócitos e fase efetora (SIQUEIRA,

2011).

9

2.3. Mediadores Químicos Envolvidos na Evolução das Lesões

Perirradiculares

Os mediadores químicos endógenos da inflamação são substâncias

responsáveis pela indução, controle e amplificação dos eventos vasculares e

celulares da inflamação. Podem ser vasoativos, causando vasodilatação e

aumento da permeabilidade vascular, e quimiotáticos para células

inflamatórias, atraindo-as para o local da lesão tecidual. Estas substâncias

agem como opsoninas, destroem bactérias, causam dano tecidual e dor

(SILVERTHORN, 2003).

A origem dos mediadores químicos ocorre basicamente de duas formas:

através do plasma (intravascular) e de células. Mediadores derivados do

plasma estão presentes em suas formas precursoras, e podem ser ativados,

usualmente, por uma série de clivagens proteolíticas. A ativação normalmente

ocorre após danos aos vasos sanguíneos ou extravasamento do plasma aos

tecidos. Mediadores químicos derivados do plasma incluem bradicinina e os

sistemas complemento, fibrinolítico e o de coagulação. Mediadores derivados

de células podem ser encontrados em estágio de pré-formação intracelular ou

podem ser imediatamente produzidos por células de defesa em resposta a

estímulos. Exemplos destes mediadores incluem histamina, metabólitos do

ácido aracdônico (prostraglandinas e leucotrienos) enzimas lisossomais,

metaloproteinases de matriz, e citocinas dentre outros (Tabela 1) (SIQUEIRA,

2011).

10

Tabela 1: Mediadores Químicos da inflamação e seus efeitos

MEDIADOR

EFEITO

Prostaglandinas, Histamina, Óxido Nítrico

Neuropeptídeos

Vasodilatação

Histamina, C3a e C5a, Bradicinina,

Leucotrienos C4, D4 e E4, Fator de

agregação plaquetária, Neuropeptídeos

Aumento da permeabilidade vascular

Quimiocinas, C5a, Leucotrienos B4, Fator

de agragação plaquetária, Fibrinopeptídeos

Quimiotaxia

Enzimas lisossomais, Matriz

metaloproteinases, Óxido Nítrico, Citocinas,

Prostaglandinas

Dano Tecidual

IL-1 e TNF, Prostaglandinas

Febre

Bradicinina, Prostaglandinas

Dor

*Adaptada de: SIQUEIRA, 2011.

Citocinas pró-inflamatórias e pró-reabsortivas desempenham papel

fundamental na reabsorção óssea associada à lesão perirradicular (Figura 1).

Mecanismos pró-inflamatórios devem ser bem controlados de modo a prevenir

a destruição tecidual excessiva. O equilíbrio entre citocinas pró-inflamatórias e

anti-inflamatórias controla a extensão da resposta do hospedeiro e a

estimulação antigênica durante o processo inflamatório crônico (MORSANI et

al., 2011).

11

Figura 1: Dano tecidual direto e indireto causado por bactérias ao exercerem sua patogenicidade (Adaptada de: SIQUEIRA, 2011).

É possível verificar que em resposta a infecção endodôntica, diversos

mediadores químicos, como as citocinas IL-1β, IL-6, IL-11, IL-17 e TNF-α são

liberados aos tecidos perirradiculares. Esses mediadores são essenciais

durante o processo de formação da lesão perirradicular. Ao atingirem níveis

críticos vão estimular células do estroma e osteoblastos a expressar RANKL, e

diminuir a produção de OPG, o que acaba estimulando a osteoclastogênese

(TAKAYANAGI, 2005a e 2005b).

A IL-1 é um regulador chave de defesa a infecções microbianas, e o

maior modulador de catabolismo de matriz extracelular e reabsorção óssea.

Existem basicamente duas formas de IL-1: α e β. IL 1-β é 15 vezes mais potente

que a IL-1α e mil vezes mais que TNF em induzir reabsorção (LOPES &

SIQUEIRA, 2010). Macrófagos são os principais produtores de IL -1. Células

12

endoteliais e algumas epiteliais também podem produzir essa citocina

(SIQUEIRA, 2011). A IL-1 pode induzir a expressão de TNF e IL-6, outras

citocinas envolvidas no processo inflamatório (COIL, 2004).

O TNF pode existir nas formas α e β. TNF-α é um polipeptídeo

sintetizado predominantemente por macrófagos e linfócitos T, estes últimos em

menor quantidade. TNF-β, também conhecido como linfotoxina, é uma

glicoproteína produzida exclusivamente por linfócitos T ativados. Ambas as

moléculas induzem a formação de osteoclastos a partir dos precursores e

estimulam a função de osteoclastos maduros. Seus efeitos sobre os

osteoclastos também são indiretos, sendo mediados por osteoblastos. Além

disso, TNF também inibe a neoformação óssea (LOPES & SIQUEIRA, 2010).

HENRIQUES et al. (2011) encontraram níveis significantes de TNF-α em

lesões perirradiculares refratárias em dentes com tratamento endodôntico,

quando comparadas a dentes saudáveis. Como é um potente mediador das

respostas imunológicas, aguda e crônica, o TNF-α tem a capacidade de

aumentar a reabsorção óssea.

A IL-6 é uma citocina sintetizada por macrófagos, células endoteliais,

fibroblastos e outras células. É sintetizada por osteoblastos em resposta a

outros agentes envolvidos na reabsorção como o paratormônio (PTH),

prostaglandina (PG) e IL-1. A IL-6 pode estimular a formação de osteoclastos a

partir de precursores hematopoiéticos (LOPES & SIQUEIRA, 2010).

As PGs são derivadas da metabolização do ácido aracdônico pela

enzima cicloxigenase, e induzem a síntese de colagenase por osteoblastos,

favorecendo o início da reabsorção. Tem sido demonstrado que PGs estimulam

13

a reabsorção de osso, fato este comprovado pela constatação de que

indometacina e flurbiprofeno, inibidores da síntese de PGs, inibiam a

reabsorção óssea. Contudo, é inteiramente possível que os efeitos mediados

por PGs sejam indiretos e estejam relacionados à sensibilização das células

ósseas à ação de outros mediadores químicos. As PGs têm sido envolvidas

nos processos de reabsorção associados às doenças inflamatórias, como

periodontites, artrite reumatóide e lesões perirradiculares (SIQUEIRA &

DANTAS, 2000).

A IL-11, produzida por células do estroma da medula óssea e por

osteoblastos, pode promover a proliferação e diferenciação dos precursores

hematopoiéticos dos osteoclastos. Evidências sugerem que a IL-11 seja um

fator essencial para o desenvolvimento de osteoclastos, o que depende da

adesão intercelular (contato célula-célula) entre os precursores do osteoclasto

e as células do estroma da medula ou dos osteoblastos (TAKAYANAGI, 2005a

e 2005b).

A IL-17 atua principalmente em células endoteliais estromais e epiteliais,

bem como no subconjunto de monócitos para induzir a secreção de

mediadores pró-inflamatórios. Esta citocina está associada tanto na fase ativa

e reabsortiva, quanto na fase crônica da lesão periapical. A correlação positiva

entre Interferon gama (IFN-γ) e IL-17 foi demonstrada em culturas de lesões

periapicais, sugerindo que ambas as citocinas são importantes para a

exacerbação da inflamação (HENRIQUES, 2011).

O fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF) é um

polipeptídeo produzido por macrófagos, células endoteliais, osteoblastos e

14

fibroblastos. A sua produção por osteoblastos pode ser induzida por IL-1 e

TNF, sugerindo que M-CSF pode servir na comunicação do sinal reabsortivo do

osteoblasto para osteoclasto e estimula a proliferação dos precursores de

osteoclasto (SIQUEIRA & DANTAS, 2000).

2.3.1. Reabsorção Óssea

O processo de perda óssea é regulado por fatores físicos como

estímulos mecânicos, e por inúmeros polipeptídeos, como hormônios e

citocinas que atuam no aumento na ativação de substâncias que induzam o

aumento da atividade osteoclástica (GRIMAUDI et al., 2003).

Osteoclastos são células que possuem a função de degradação de

matriz óssea (YANG, 2007). Segundo LOPES & SIQUEIRA (2010), são tipos

celulares gigantes multinucleadas, oriundas da mesma linhagem de células

precursoras dos monócitos/macrófagos, cuja diferenciação é primariamente

regulada por M-CSF, ligante do receptor para ativação do RANKL e OPG. A

diferenciação do precursor em osteoclasto requer a presença de células do

estroma da medula óssea ou osteoblastos, as quais expressam as duas

moléculas essenciais para a promoção da osteoclastogênese – M-CSF e

RANKL (SIQUEIRA, 2011).

A diferenciação e ativação de osteoclastos são dirigidas pela interação

de Receptor Activator NF Kappa (RANK) com o ligante RANKL, e regulada pela

OPG. ZHANG & PENG (2005) relataram a identificação de RANKL e seu

receptor RANK como uma proteína essencial na ativação de osteoclastos, cuja

diferenciação pode ser responsável pela reabsorção óssea periradicular.

15

RANKL é expressa principalmente na membrana de osteoblastos ou células do

estroma, e participa de cada fase da osteoclastogênese enquanto o RANK é o

receptor presente na superfície de pré- osteoclastos.

A OPG é uma proteína que regula a densidade óssea e que pode agir

localmente ou sistematicamente na inibição da maturação de osteoclastos.

OPG é um receptor que se liga e inibe a ligação de RANKL ao seu receptor

RANK e, por isso, protege o tecido dental mineralizado de reabsorção. A

detecção de OPG em macrófagos, linfócitos e células do plasma, sustenta a

afirmação da presença desta citocina na regulação das respostas imune e

inflamatórias (KUTZ, 2001).

Em condições homeostáticas, níveis de RANKL e OPG encontram-se

em equilíbrio, regulando a origem de osteoclastos responsáveis pela

reabsorção. Em contrapartida, uma super expressão de RANKL pode ser

observada em condições inflamatórias, principalmente como resultado da

presença de células inflamatórias, resultando em desequilíbrio entre

RANKL/OPG, levando a uma excessiva atividade osteoclástica e

consequentemente à reabsorção óssea patológica (Figura 2) (MENEZES et al.,

2008).

16

Figura 2: Funções de RANK, RANKL e OPG na osteoclastogênese em condições homeostáticas e inflamatórias. (Adaptada de: MENEZES et al., 2008).

2.4. Modificadores da Doença

Embora existam protocolos altamente eficazes à erradicação da doença,

diferentes respostas à infecção podem ocorrer ao mesmo tipo de tratamento

endodôntico, quando estes apresentam fatores que, embora não sejam a

causa, possam influenciar na susceptibilidade, desenvolvimento ou severidade

da doença, principalmente por deficiências na resposta do sistema imunológico

(Figura 3). Tal fato pode esclarecer o surgimento de sintomatologia dolorosa

em casos assintomáticos, a cura tardia de algumas lesões, e explicam por que

canais bem tratados podem resultar em fracasso. Os modificadores da doença

17

com potencial de influenciar a lesão perirradicular incluem condições

sistêmicas (diabetes e infecções virais), genética (polimorfismo genético), e

hábitos adquiridos (fumo) (SIQUEIRA, 2011).

LESÃO PERIRRADICULAR

Bactéria

Resposta Inflamatória& Imunológica

Tecido Conjuntivoe/ou

Destruição Óssea

AnticorposS. ComplementoFagócitos

Sinais Clínicos& Sintomas da

DoençaProstaglandinasRANKL

CitocinasMMPs

Componentes EstruturaisBacterianos e seus Produtos

Siqueira, 2011.

Mudançasno meio

Composição e Virulência

Figura 3: Modificadores da doença (Adaptada de: Siqueira, 2011).

O diabetes mellitus é uma desordem metabólica caracterizada por

concentrações anormalmente altas de glicose no sangue, causadas por

secreção de insulina inadequada e células-alvo com reações anormais ou

ambas as situações. Esta doença pode se apresentar de duas formas distintas:

Tipo 1, que é uma condição auto imune, causada pela deficiência de insulina

pela destruição das células beta de Langerhans, e Tipo 2, a mais comum,

caracterizada por um comprometimento metabólico e alteração nos níveis de

insulina no sangue, apresentando-se de forma mais elevada que o normal

(SILVERTHORN, 2003). A doença afeta muitas funções do sistema imune, e

18

está associada ao comprometimento da cicatrização. As complicações orais

mais frequentes de portadores de diabetes mellitus não controlada podem

incluir: xerostomia, infecções, dificuldade na cicatrização, aumento da

incidência e severidade de cáries, candidíase, gengivite e doença periodontal

(SEGURA-EGEA et al., 2005).

A influência do diabetes no desenvolvimento, curso e resposta ao

tratamento de lesões perirradiculares tem sido comprovada (SIQUEIRA, 2011).

Um estudo realizado por ARMADA–DIAS et al., (2006), revelou que ratos

diabéticos Tipo 1 apresentaram lesões perirradiculares significativamente

maiores e com exsudato inflamatório quando comparados com os ratos

normais, e que ratos diabéticos podem ser mais propensos a desenvolver

lesões perirradiculares extensas, possivelmente devido à diminuição da

capacidade de defesa contra patógenos microbianos. SEGURA-EGEA et al.

(2005) e MAROTTA et al. (2012) verificaram que lesões perirradiculares foram

significantemente maiores em dentes de indivíduos portadores de diabetes

Tipo 2, sugerindo que o diabetes mellitus pode se manifestar como um

modificador da doença perirradicular.

Outra condição reconhecida como modificador da doença perirradicular

é o polimorfismo genético. Trata-se de uma variação genética na sequência de

bases nucleotídicas, ou na estrutura cromossômica que ocorre com uma

frequência maior que 1% na população. O tipo mais comum de polimorfismo é

o que envolve um único nucleotídeo, chamado de polimorfismo de nucleotídeo

único ou polimorfismo de transição, onde, durante a replicação, ocorre a

substituição de um nucleotídeo por outro, ocorrendo a troca de um único par de

19

base, podendo ainda assim afetar a estrutura e a função de um gene,

consequentemente afetando a expressão de proteína (KINANE & HART, 2003).

Polimorfismos em genes relacionados com a inflamação, como por

exemplo, nos genes receptor celular de superfície gama (FcyR), podem levar

ao aumento ou a inibição de eventos mediados por FcyR e consequentemente,

podem influenciar a susceptibilidade e/ou gravidade das doenças inflamatórias.

Os receptores Fcy presentes na superfície expressa nos leucócitos para a

região constante de imunoglobulina G (IgG), se ligam a bactérias ou produtos

bacterianos solúveis e funcionam como uma opsonina, favorecendo a

fagocitose pelos neutrófilos via Fcy ou internalização pelas células

apresentadoras de antígeno, incluindo macrófagos e células B (SIQUEIRA,

2011).

Um estudo realizado por SÁ et al. (2007) relacionou polimorfismo com

sintomatologia, sugerindo que fatores genéticos podem influenciar no

desenvolvimento de abscessos perirradiculares agudos. SIQUEIRA (2011)

investigou a associação do polimorfismo genético do receptor FcyRIIIa com

periodontite apical pós-tratamento e concluíram que o polimorfismo no receptor

FcyRIIIa não influencia a resposta do tratamento endodôntico em dentes com

periodontite apical.

Supostamente, a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana

adquirida (HIV) também pode ser considerada como um fator modificador da

lesão perirradicular. Considera-se que as células T, que exercem importante

papel no desenvolvimento, progressão e cura da lesão perirradicular pela

ativação de macrófagos, células B e outros tipos celulares, sejam a célula –

20

alvo do HIV, é razoável afirmar que pacientes portadores do HIV possam

apresentar dificuldade em elaborar uma resposta imune contra bactérias

invasoras do tecido perirradicular (SIQUEIRA, 2011). Porém, ainda não existem

estudos que comprovem esta suposição.

Embora ainda existam controvérsias a respeito da relação entre o fumo

e a lesão perirradicular, alguns autores consideram este hábito um potencial

fator de risco à doença, além de considerarem que esta associação pode

exercer papel relevante no curso da doença (KIRKEVANG & WENZEL, 2003;

SIQUEIRA, 2011).

LÓPEZ et al. (2012) concluíram em estudo que, após analisar sexo,

idade, número de dentes, estado endodôntico, qualidade da obturação e

estado diabético como co-variáveis, a presença de lesões perirradiculares está

fortemente associada ao tabagismo.

Outras condições como stress, infecção por herpes-vírus e osteoporose

tem sido sugeridas como possíveis modificadores da lesão perirradicular,

porém estudos ainda precisam ser realizados (SIQUEIRA, 2011).

2.5. Osteoporose

O osso é um tecido que desempenha papel importante na homeostasia

mineral, na reserva de elementos hematopoiéticos e no suporte para

movimentos (SIQUEIRA & DANTAS, 2009). É uma estrutura dinâmica,

continuamente renovada e reconstruída através da remodelação. A

remodelação óssea é definida como um processo de aposição fisiológico e

contínuo no qual há reabsorção do osso antigo e substituição por osso

21

recentemente formado. Esse evento continua por toda a vida adulta, sendo

responsável pela renovação do esqueleto e manutenção da integridade

anatômica e estrutural. É influenciada por diversos fatores, como mecanismos

regulatórios intracelulares, hormonais, além de fatores locais e externos.

Alterações na remodelação óssea podem resultar em diferentes distúrbios,

entre eles a osteoporose (AMADEI et al., 2006).

A osteoporose é uma doença do metabolismo ósseo, caracterizada por

redução da massa e deterioração na arquitetura do esqueleto (BRAUNWALD

et.al., 2005; LANE, 2005). É considerada uma “doença silenciosa” até o

momento em que ocorre a fratura (GASS & DAWSON-HUGHES, 2006).

Quando o metabolismo ósseo está em condições normais, existe um

equilíbrio entre a formação e a reabsorção. Porém, tanto no hipogonadismo

como na senescência ocorre um desequilíbrio na remodelação óssea que

resulta em redução de massa óssea, caracterizando assim um quadro de

osteoporose (JHONSON et al., 2002).

Esta doença pode ser primária (tipos: I – pós-menopausa e II – senil) ou

secundária. A osteoporose tipo I, pós-menopausa, é o tipo mais comum desta

condição e está associada à deficiência de estrógeno. A perda da função do

ovário altera significativamente a homeostase óssea e aumenta a perda de

tecido ósseo. Este tipo de osteoporose afeta o osso trabecular, promovendo o

imenso risco às mulheres pós-menopausa (HORAN &TIMMINS, 2009).

Os esteroides sexuais possuem efeitos no desenvolvimento e maturação

do esqueleto, como crescimento da placa de maturação e fechamento durante

o crescimento longitudinal, regulação diferencial do metabolismo de ossos

22

cortical e trabecular, estimulam o pico de massa óssea e inibem a perda óssea

(LIBOUBAN et al., 2002). A ação estrogênica anti-reabsortiva está relacionada

à sua capacidade de regular fatores modeladores da osteoclastogênese e não

de uma ação direta no osteoclasto (MANOLAGAS, 2000; VANDERSCHUEREN

et al., 2004).

O aumento da liberação das citocinas no estado de hipoestrogenismo

acelera a reabsorção óssea. Alguns estudos sugerem a participação de IL-1,

IL-6 e TNF na perda óssea, já que seus níveis se encontraram aumentados em

camundongos ovariectomizados e mulheres pós-menopausa; acreditando

haver um aumento da secreção, pelos osteoblastos ou pelas células do

estroma da medula óssea, capazes de estimular a osteoclastogênese e o

consequente aumento da reabsorção óssea. Inversamente, a terapia de

reposição hormonal suprime as citocinas, prevenindo a perda óssea

(GRIZ, 2000; RAMALHO et al., 2000).

Um estudo realizado por KRIBBS et al. (1983), analisou a relação entre

osteopenia esquelética e alterações dentárias em 30 mulheres pós-

menopáusicas com diagnóstico confirmado da osteoporose. Os resultados

demonstraram que a osteopenia esquelética exerce influência sobre condições

orais. Os autores afirmam que a massa óssea do rebordo alveolar e sua

densidade mostram uma relação significativa com o cálcio total do corpo, e que

quaisquer medidas terapêuticas que controlam ou têm efeito sobre a

osteoporose, podem, por conseguinte, exercer influência sobre a densidade do

rebordo residual.

23

A osteoporose tipo II ocorre após 65 anos de idade, afetando a

população idosa de homens e mulheres na proporção de 1:3, e se traduz por

uma perda mais lenta de osso trabecular e cortical e por fraturas de fêmur

proximal, úmero e vértebras. As fraturas de fêmur proximal são as que trazem

maior morbidade e mortalidade, e em 95% dos casos sofrem correções

cirúrgicas (KRAHE, 2003; WIREN, 2005).

A osteoporose secundária ocorre como consequência de processos

patológicos (artrite reumatóide, hipertireoidismo, hiperparatireoidismo e

mieloma múltiplo) e outras condições, tais como alcoolismo, imobilização,

terapia crônica com heparina, uso de anticonvulsivantes e hipervitaminose A

(MANOLAGAS, 2000).

2.6. Modelo experimental da perda óssea por hipogonadismo

A castração em ratos é o modelo utilizado com maior frequência para o

estudo de eventos associados à osteopenia, pois mimetiza perda óssea por

hipogonadismo (LIBOUBAN et al., 2002; IWAMOTO et al., 2004; BORST &

CONOVER, 2006).

Os principais mecanismos biológicos responsáveis pelo ganho e perda

óssea durante o crescimento normal e a vida adulta são os mesmos em seres

humanos e ratos. Sabe-se também que ratos e humanos respondem

similarmente à terapia hormonal. Por isso, murinos são ideais para a avaliação

do agente terapêutico para a prevenção da osteoporose (OLIVERA et al., 2003;

FITTS et al., 2004)

24

Antes de realizar a castração em fêmeas, é importante acompanhar as

modificações na citologia vaginal para verificar se as ratas estão apresentando

funcionamento normal ovariano. Roedores de laboratório, como camundongos,

ratos e hamsters, são espécies poliestrais, em que o estro ocorre regularmente

a cada 4-5 dias (MARCONDES et al., 2002).

A concentração sérica dos hormônios sexuais apresenta variações ao

longo do ciclo estral, decorrentes de modificações morfo-funcionais dos

ovários, induzidas pelas gonadotrofinas hipofisárias, hormônio luteinizante (LH)

e hormônio folículo estimulante (FSH). As variações hormonais cíclicas

repercutem na morfologia e funcionalidade dos órgãos do aparelho reprodutor.

No epitélio vaginal ocorrem alterações decorrentes da ação de estrogênio e de

progesterona, que podem ser avaliadas à microscopia de luz (TEBAR et al.,

1995).

Em ratas, podem-se evidenciar quatro etapas que, normalmente, se

sucedem a cada quatro ou cinco dias e que possuem relações com a

concentração de hormônio gonadal presente. Estas fases são denominadas:

proestro; estro; metaestro e diestro (MARCONDES et al., 2002).

O proestro (Figura 4A) tem duração aproximada de doze horas. É o

período pré-ovulatório, no qual ocorre aumento exponencial do folículo

ovariano. Na manhã de proestro, a concentração sérica de estradiol é máxima

promovendo na tarde do proestro o pico de LH, que é responsável pela

ovulação e que é sucedido por um pico de secreção de progesterona (KALRA

& KALRA, 1974). Caracteriza esta fase, ao esfregaço vaginal, por células

redondas de tamanho pequeno e nucleadas.

25

A fase seguinte, denominada de estro (Figura 4B), tem duração

aproximada de vinte quatro horas, quando ocorre a maturação final do folículo

de Graaf e ovulação. Os níveis séricos de estradiol, progesterona e LH são

baixos (KALRA & KALRA, 1974). Ao esfregaço vaginal, foram observadas

células queratinizadas anucleadas e ausência de leucócitos. Este é o período

de receptibilidade sexual (BERALDO, 1972; FEDER, 1981; RODRIGUES,

1992).

O período consecutivo, metaestro (Figura 4C), dura de vinte quatro a

trinta e seis horas. Ocorre, aí, o crescimento do corpo lúteo que passa a

secretar níveis séricos crescentes de estradiol e progesterona, com queda

brusca do estradiol sérico, ao final da fase (KALRA & KALRA, 1974). A análise

microscópica do epitélio vaginal revela três tipos celulares: células nucleadas,

células queratinizadas e leucócitos (BERALDO, 1972; FEDER, 1981;

RODRIGUES, 1992).

O diestro (Figura 4D), que dura em torno de vinte e quatro horas, pode

se estender a quarenta e oito horas em algumas ratas. Caracteriza-se pela

involução do corpo lúteo e nova fase de proliferação folicular, que ocorre caso

o óvulo não seja fecundado. O estradiol sérico está baixo, porém ascendente;

progesterona e LH apresentam concentração sérica baixa (KALRA & KALRA,

1974). A citologia vaginal mostra células nucleadas, mas a característica desta

fase é a predominância de leucócitos (BERALDO, 1972; FEDER, 1981;

RODRIGUES, 1992).

26

Figura 4: Fotomicrografia de lâminas de esfregaço vaginal de ratas controle, nas diferentes fases do Ciclo Estral, coradas pelo método tricômico de Shoor (40x). Fases do Ciclo Estral: 4A: Proestro, 4B: Estro, 4C: Metaestro, 4D: Diestro.

4D 4C

4B 4A

27

3. JUSTIFICATIVA

A redução na capacidade de remodelação e de reparação do tecido em

pacientes com osteoporose tem sido comprovada ao longo dos anos. Porém,

não existem estudos que investiguem a provável influência da osteoporose na

evolução da lesão perirradicular.

28

4. HIPÓTESE

A lesão perirradicular é um processo inflamatório que resulta em

destruição do osso alveolar ao redor do ápice dentário. Alterações no

metabolismo ósseo, características da osteoporose, levam a um aumento da

reabsorção óssea e a uma diminuição na possibilidade de reparo. Espera-se

através deste estudo, verificar a influência da osteoporose na evolução de

lesões perirradiculares.

29

5. PROPOSIÇÃO

5.1. Objetivo Geral

Avaliar os efeitos da osteoporose na evolução da lesão perirradicular.

5.2. Objetivos Específicos

Determinar o tamanho de lesões perirradiculares através de análise

radiográfica.

Comparar as imagens radiográficas de animais controles e castrados

com lesões perirradiculares de 21 e 40 dias.

30

6. MATERIAIS E MÉTODOS

6.1. Parecer Ético

O projeto de pesquisa está de acordo com Princípios Éticos da

Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

(COBEA) e obteve aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa Animal (CEPA),

sob o número de protocolo 00134/09.

6.2. Seleção da Amostra

Para realização deste estudo foram utilizadas ratas adultas (n= 24), da

linhagem Wistar, isogênicas e virgens, com 3 meses de idade, mantidas em

gaiolas, com temperatura ambiente controlada (25 a 27C), umidade constante

e ciclo claro/escuro de 12 horas (6:00h às 18:00h), sendo a água e ração

(Nuvilab, Sogorb Indústria e Comércio LTDA, SP, Brasil) fornecidas ad libitum.

Os animais foram mantidos no biotério do departamento de Fisiofarmacologia

do Instituto Biomédico da Universidade Federal Fluminense (UFF).

Antes de dar início a cada experimento, as fêmeas foram avaliadas,

diariamente, por duas semanas consecutivas através de citologia vaginal e

somente as ratas com ciclos regulares foram incluídas no estudo.

6.2.1. Determinação das Fases do Ciclo Estral

Coletas diárias de esfregaço vaginal (Figura 5) foram realizadas entre

9:00 e 10:00 horas, com a finalidade de selecionar os animais que

31

apresentassem ciclo estral regular. A coleta do fluido vaginal foi realizada com

auxílio de ponteira plástica contendo solução de cloreto de sódio a 0.9%, que

foi depositado em lâminas de vidro e analisado à fresco em microscópio óptico

(Leica DM500, Heerbrugg, Suécia) com objetiva 10x, sendo classificadas de

acordo com as proporções dos tipos celulares encontrados em cada fase do

ciclo estral (MARCONDES, 2002).

Figura 5: Citologia vaginal. A: coleta de esfregaço vaginal. B: Análise a fresco de fluido

coletado.

6.3. Castração

Após esta etapa de avaliação, metade das ratas foram submetidas à

remoção bilateral dos ovários (ovariectomia), sob anestesia com Tiopental,

(Thiopentax, Cristália, São Paulo, Brasil) (0,1ml /100 g peso corporal), enquanto

as ratas restantes, grupo controle, sofreram apenas estresse cirúrgico (pseudo-

operadas).

5A 5B

32

6.4. Desenvolvimento de Lesão Perirradicular

Noventa dias após a cirurgia, todos os animais foram anestesiados com

Tiopental (0,1ml /100g peso corporal), e o esmalte e a dentina dos primeiros

molares inferiores esquerdos foram desgastados com broca carbide esférica de

½ (KG Sorensen, São Paulo, Brasil) com motor de baixa rotação (Dentec, CS

421, Brasil). A abertura foi realizada na fóssula mesial da superfície oclusal até

a exposição pulpar (Figura 6).

Figura 6: Desenvolvimento de lesão perirradicular. A: Determinação da área de trabalho. B: Exposição pulpar.

Desta forma, 4 grupos experimentais foram formados:

Grupo Controle com lesão de 21 dias (C 21 dias): n=6

Grupo Ovariectomizado com lesão de 21 dias (OVX 21 dias): n=6

Grupo Controle com lesão de 40 dias (C 40 dias): n=6

Grupo Ovariectomizado com lesão de 40 dias (OVX 40 dias): n=6

6A 6B

33

Ao final de cada período experimental (21 e 40 dias após

desenvolvimento da lesão), os animais foram sacrificados por exsanguinação,

sob anestesia com Tiopental (0,2 ml/100 g peso corporal), e removidos sangue

e mandíbula.

6.5. Avaliação Biométrica

A massa corporal dos animais foi verificada desde o inicio do

experimento ate o dia do sacrifício. A pesagem foi realizada semanalmente

com auxílio de uma balança digital (Mettler Toledo, Marte As 1000, SP, Brasil).

6.6. Avaliação Bioquímica

O sangue dos animais foi coletado por punção cardíaca e centrifugado

em centrífuga (RDE, MC 28, RJ, Brasil). Após a obtenção do soro, foram

analisadas as concentrações de cálcio (calcio arsenazo III, K051), fósforo

(phosphorus, K020) e fosfatase alcalina (phosphatase alkaline 019) através de

testes colorimétricos da marca Bioclin (Quibasa, Belo Horizonte, Brasil) em

espectofotômetro (Bioespectro, SP-22, PR, Brasil).

6.7. Avaliação Radiográfica

As hemi-mandíbulas esquerdas foram lavadas e imersas em solução

salina. Após este processo, as tomadas radiográficas foram realizadas em

Aparelho Radiográfico Digital (Modelo Radioesfera – Siemens – SP, Brasil).

As áreas das lesões perirradiculares presentes nos ápices das raízes

mesiais dos primeiros molares da mandíbula esquerda foram mensuradas nas

34

radiografias através do software Image J (National Institute of Mental Health,

Bethesda, USA).

6.8. Análise Estatística

A análise comparativa dos dados obtidos foi realizada através de testes

não paramétricos Kruskal-Wallis e Dunn´s Multiple Comparison utilizando o

programa GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, Inc, California, USA). A

significância estatística considerada foi p<0.05.

35

7. RESULTADOS

7.1. Avaliação Biométrica

Os valores numéricos das médias de massa corporal inicial e final, assim

como os valores das médias das diferenças entre massa corporal final e inicial

(∆) nos grupos C e OVX são apresentados na Tabela 2. Não houve diferença

significativa entre a massa inicial dos animais do estudo (Figura 7). Foi possível

observar que os grupos OVX apresentaram a massa corporal final e o ∆

superiores em todos os períodos experimentais (C 21 dias: ganho 13.5%, OVX

21 dias: ganho 23.4%, C 40 dias: ganho 4.3%, OVX 40 dias: ganho 31.4%)

quando comparados com os grupos C. Porém, esses dados apenas foram

estatisticamente significativos quando comparados OVX e C 40 dias, ou seja,

com 191 dias de castração (Figuras 8 e 9).

Tabela 2: Valores de massa corporal inicial (g).

Grupo

Massa corporal

inicial (g)

Massa corporal

final (g) ∆ (g)

C 21 dias 269.2 21.18 289.2 32.05 31.8 28.51

OVX 21 dias 260.2 18.40 321.0 21.87 60.8 12.24

C 40 dias 261.6 29.29 275.2 25.58 13.6 30.67

OVX 40 dias 263.3 27.07 344.7 25.01 81.4 28.59

* Os resultados são expressos por média DPM. ∆= massa corporal final- massa corporal inicial.

36

Figura 7: Valores de massa corporal inicial em todos os grupos experimentais expressos em

(g).

Figura 8: Valores de massa corporal final de todos os grupos experimentais expressos em (g).

* OVX 40 vs C 21 p < 0.05, # OVX 40 vs C 40 p< 0.01.

C 21 OVX 21 C 40 OVX 400

100

200

300

Massa c

orp

oral

(g)

C 21 OVX 21 C 40 OVX 400

100

200

300

400

Massa c

orp

ora

l (g

)

*#

37

Figura 9: Valores de Δ (Massa corporal final-Massa corporal inicial) de todos os grupos experimentais expressos em (g). * OVX 40 vs C 21 p < 0.05, # OVX 40 vs C 40 p< 0.01.

7.2. Avaliação Bioquímica

7.2.1. Concentrações Séricas de Cálcio

Os valores numéricos das médias das concentrações séricas de cálcio

nos grupos C e OVX podem ser observados na Tabela 3. Os níveis séricos de

cálcio foram semelhantes nos grupos C e OVX de 21 dias. Em 40 dias os

níveis do grupo C foram maiores quando comparados ao OVX, mas esta

diferença não foi estatisticamente significativa (Figura 10).

C 21 OVX 21 C 40 OVX 400

25

50

75

100

(

g)

*#

38

Tabela 3: Médias das concentrações séricas de cálcio (mg/dl) por grupo.

Grupo

Cálcio (mg/dl) Desvio padrão

C 21 dias 2.063 0.5630

OVX 21 dias 1.960 0.7301

C 40 dias 2.725 1.740

OVX 40 dias 2.560 0.3209

Figura 10: Análise comparativa dos níveis séricos de cálcio (mg/dl).

C 21 OVX 21 C 40 OVX 400.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

Cálc

io m

g/d

l

39

7.2.2. Concentrações Séricas de Fósforo

Os valores numéricos das médias das concentrações séricas de fósforo

nos grupos C e OVX podem ser observados na Tabela 4. Os níveis séricos de

fósforo foram menores nos grupos OVX de todos os períodos experimentais

quando comparados aos grupos C. Porém, esta diferença não foi

estatisticamente significativa (Figura 11).

Tabela 4: Médias das concentrações séricas de fósforo (mg/dl) por grupo.

Grupo

Fósforo (mg/dl) Desvio padrão

C 21 dias 4.823 1.680

OVX 21 dias 3.939 0.5008

C 40 dias 4.450 1.566

OVX 40 dias 3.193 0.5617

Figura 11: Análise comparativa dos níveis de fósforo (mg/dl).

C 21 OVX 21 C 40 OVX 400

1

2

3

4

5

6

Fó

sfo

ro m

g/d

l

40

7.2.3. Concentrações Séricas de Fosfatase Alcalina

Os valores numéricos das médias das concentrações séricas de

fosfatase alcalina nos grupos C e OVX podem ser observados na Tabela 5. Os

níveis séricos de fosfatase alcalina foram maiores nos grupos OVX de todos os

períodos experimentais quando comparados aos grupos C. Porém, esta

diferença não foi estatisticamente significativa (Figura 12).

Tabela 5: Médias das concentrações séricas de fosfatase alcalina (U/L) por grupo.

Grupo

Fosfatase alcalina (U/L)

Desvio padrão

C 21 dias 21.87 6.654

OVX 21 dias 25.60 4.011

C 40 dias 21.23 5.900

OVX 40 dias 23.60 7.184

Figura 12: Análise comparativa dos níveis de fosfatase alcalina (U/L).

C 21 OVX 21 C 40 OVX 400

10

20

30

Fo

sfa

tase a

lcali

na U

/L

41

7.3. Avaliação Radiográfica

Os valores numéricos das médias dos tamanhos das lesões

perirradiculares nos grupos C e OVX podem ser observados na Tabela 6. As

lesões perirradiculares foram maiores nos grupos OVX de todos os períodos

experimentais quando comparados aos grupos C. Porém, esta diferença foi

estatisticamente significativa nas comparações OVX 40 dias x C 21 dias e OVX

40 dias x C 40 dias (Figura 13). Algumas das imagens obtidas através de

radiografia podem ser observadas na Figura 14.

Tabela 6: Tamanho das lesões perirradiculares (pixel).

Grupo

Tamanho da lesão (pixel)

Desvio padrão

C 21 dias 268.5 40.98

OVX 21 dias 353.7 49.31

C 40 dias 304.8 36.98

OVX 40 dias 548.4 141.7

42

Figura 13: Análise comparativa do tamanho de lesões perirradiculares entre os grupos experimentais. ). * OVX 40 vs C 21 p < 0.05, # OVX 40 vs C 40 p< 0.01.

Figura 14: Radiografias de mandíbulas. A: C 21 dias, B: C 21 dias, C: C 40 dias, D: OVX 40 dias. As setas indicam as lesões perirradiculares nas raízes mesiais dos primeiros molares esquerdos.

C21 OVX21 C40 OVX40 0

300

600

Tam

an

ho

da l

esão

(p

ixel)

A B

C D

*#

43

8. DISCUSSÃO

A osteoporose é uma condição sistêmica que gera alterações no

metabolismo ósseo, o que sugere possíveis influências sobre as lesões

perirradiculares, que também são caracterizadas por perda óssea patológica.

SIQUEIRA & RÔÇAS (2008) e GARNER et al. (2009) comprovam que as

condições sistêmicas podem exercer papel relevante na cura, tratamento e

prognóstico das lesões perirradiculares.

Alterações no metabolismo ósseo, provenientes da deficiência de

esteróides sexuais em mulheres no período pós-menopausa, constituem a

principal causa da osteoporose (HORAN & TIMMINS, 2009). KALU (1991)

definiu o modelo animal de perda óssea pós-menopausa como um animal vivo,

o qual a perda óssea espontânea ou induzida devido à deficiência hormonal

ovariana pode ser estudada, e em que as características da perda de massa

óssea e suas sequelas se assemelham aos encontrados em mulheres na pós-

menopausa em um ou mais aspectos. Portanto, para a realização do presente

trabalho foi adotado o modelo de ovariectomia para o desenvolvimento da

osteoporose em ratas adultas.

Antes do procedimento cirúrgico, foi realizada uma avaliação prévia do

ciclo estral que, de acordo com MARTINS et al. (2005), é considerada

importante para verificar variações que ocorrem durante o ciclo reprodutivo dos

animais. De acordo com GOLDMAN et al. (2007), a avaliação do ciclo estral em

roedores de laboratório pode ser uma medida útil da integridade reprodutiva do

eixo hipotalâmico - pituitário - ovariano, e pode ser considerado uma forma de

44

assegurar que os animais exibem padrões anormais de ciclagem. Neste

estudo, a análise microscópica diária do material coletado, em concordância

com os estudos prévios (GOLDMAN et al., 2007; WESTWOOD, 2008), revelou

alterações na padronização do fluido vaginal por diferentes tipos celulares

observados durante o ciclo reprodutivo. Cinco animais que apresentavam ciclos

irregulares foram descartados e somente aqueles com ciclos regulares foram

incluídos no estudo.

Após a seleção da amostra, a ovariectomia foi realizada em metade dos

animais. JEFFCOAT et al. (2000) afirmaram que a castração pode influenciar a

densidade óssea alveolar, da mesma maneira que pode influenciar na massa

óssea observada em outras estruturas ósseas corporais. Em ratas, os efeitos

sistêmicos da deficiência estrogênica surgem após aproximadamente 30 dias

(KALU,1991; ARMADA et al., 2006). Realizamos a indução da lesão

perirradicular em animais com 150 dias de castração, que de acordo com

ARMADA (2009), possuem alterações ósseas características da osteoporose

mais significativas. A metodologia utilizada para a indução da lesão

perirradicular seguiu os mesmos parâmetros de estudos anteriores (ARMADA–

DIAS et al., 2006; YANG et al., 2009; LIU et al., 2012). A reabsorção óssea

perirradicular, induzida pela exposição pulpar, foi observada em todos os

grupos experimentais através da análise radiográfica.

Além da avaliação do tecido ósseo através de radiografia, também

realizamos as avaliações biométrica e bioquímica para acompanhar os efeitos

sistêmicos da deficiência estrogênica.

45

De acordo com a literatura, a deficiência hormonal característica do

período pós-menopausa está relacionada às mudanças adversas no peso, na

composição corpórea e na distribuição de gordura no corpo feminino. Esse

aumento de peso se faz com o aumento de tecido adiposo e diminuição da

massa magra (KIRCHENGAST et al., 1999). No presente estudo foi observado

ganho de massa corporal significativamente maior em OVX em relação a C em

ratas de 40 dias (190 dias de castração). Porém, não foi verificada diferença

estatisticamente significativa na massa corporal entre os grupos OVX e C de 21

dias (171 dias de castração) corroborando com o estudo de ARMADA (2009),

em ratas aos 150 dias de castração. Para VASCONCELLOS et al. (2004) o

aumento na massa corporal em deficiência estrogênica pode não ocorrer

devido ao ganho ponderal, ou seja, animais ovariectomizados apresentam

aumento de tecido adiposo mas sofrem perda óssea.

A osteoporose se caracteriza por alterações do metabolismo ósseo e,

por esta razão, neste estudo foram avaliadas as dosagens séricas de cálcio e

fósforo (componentes do tecido ósseo) e da fosfatase alcalina (marcador da

atividade osteoblástica). As concentrações séricas de cálcio e fósforo se

mantiveram constantes entre os grupos, confirmando dados encontrados na

literatura (NETTO et al., 2006; ARMADA, 2009). Segundo TAKADA et al.

(1997), somente em circunstâncias extremas, como desnutrição ou

hiperparatireoidismo, estes íons sofrem alterações. Os níveis séricos de

fosfatase alcalina também não apresentaram diferença estatisticamente

significativa apesar de apresentarem valores esperados aos grupos de estudo,

ou seja, maiores em OVX e menores em C. Esses resultados diferem de

46

NETTO et al. (2006) que ao avaliarem o metabolismo ósseo em ratas Wistar

castradas encontraram médias estatisticamente maiores para atividade sérica

da fosfatase alcalina quando comparadas às controles. Porém, os autores

realizaram esta avaliação apenas com 60 dias de castração. YOSHIKUBO et

al. (2005) também descrevem um aumento da atividade da fosfatase alcalina

na osteomalácia ou outras condições onde o metabolismo ósseo está

aumentado.

No presente estudo, não houve diferença estatisticamente significativa

entre o tamanho das lesões de animais OVX e C com 21 dias. São poucos os

estudos (GUILLES, et al., 1997; XIONG et al., 2007; LIU et al., 2010) de

avaliação da influencia da osteoporose na evolução de lesões perirradiculares

em 21 dias e a comparação entre os resultados é dificultada pela diferença

existente entre as metodologias.

GUILLES et al. (1997) realizaram castração de ratas Sprague-Dawley

com 3 meses. Após 3 semanas da cirurgia foi realizada a indução de lesões

perirradiculares nos canais distais dos primeiros molares mandibulares

esquerdos através de instrumentação com limas endodônticas, seguida da

inserção de fatores de reabsorção óssea (IL-1 ou lipopolissacarídeo do

Campylobacter Rectus 314) e selamento dentário. Esse procedimento foi

repetido por 3 dias. Foram realizadas radiografias e foi verificado aumento

significativo de lesões perirradiculares em OVX quando comparado com os

controles.

XIONG et al. (2007) realizaram experimento com ratas Sprague-Dawley

(n=40) com 3 meses. Metade dos animais foi castrada e 3 semanas após a

47

cirurgia foi realizada a indução de lesões perirradiculares com exposição

pulpar. Foram formados 4 grupos experimentais: normais, controles com lesão,

OVX com lesão, OVX com lesão recebendo terapia com alendronato. O

período experimental foi de 21 dias de lesão. Foram realizadas radiografias e

foi verificado aumento significativo de lesões perirradiculares em OVX quando

comparado com os grupos OVX com alendronato e controle.

LIU et al. (2010) realizaram castração de ratas Sprague-Dawley (n=24)

com 3 meses. Após 1 semana da cirurgia foi realizada a indução de lesões

perirradiculares com a exposição pulpar. O período experimental foi de 21 dias

de lesão. Os resultados demonstraram perda óssea significativa no grupo OVX

quando comparado ao Controle.

Em nosso estudo também foi realizado um periodo experimental crônico

de lesão. Através da análise radiográfica, foi possível verificar que essas lesões

perirradiculares em períodos mais crônicos (40 dias) em animais do grupo OVX

foram significativamente maiores em relação ao grupo C 21 dias e C 40 dias.

Esse resultado demonstra que a presença de osteoporose modificou a

evolução da doença perirradicular. Não existem na literatura estudos com

tempo de lesão semelhante.

48

9. CONCLUSÕES

Através deste estudo foi possível verificar que a osteoporose atuou

como modificador da doença, pois influenciou na evolução da lesão

perirradicular, principalmente em períodos crônicos. Estes achados sugerem a

importância da utilização de protocolos antimicrobianos mais eficazes para

portadores desta doença, embora estudos em humanos ainda precisem ser

realizados.

49

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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11. ANEXO

avaliaÇÃo radiogrÁfica da influÊncia da...

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