avaliação do legiolert™ na deteção e - iberlab · 2018. 4. 26. · avaliação do...
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Avaliação do Legiolert™ na deteção e
quantificação de Legionella pneumophila em
amostras de água
Sílvia Monteiro e Ricardo Santos, Laboratório Análises, Instituto Superior Técnico
Legionella pneumophila
• Principal responsável pelos surtos de Legionella
• Bactéria saprófita, encontrada naturalmente no ambiente aquático e
em solos
Sistemas de água quente
Chuveiros
Água Fria
Instalações Termais
Aerosois
Lamas
Ar Condicionado
• Torres de Refrigeração
Aspersores
Lagos Artificiais
Parasita intracelular de
amebas: Acanthamoeba
castellanii, espécies de
Hartmannella ou de Naegleria
Biofilme
Técnicas para detecção de Legionella
Técnicas para detecção de Legionella
ISO 11731:2017
PCR em tempo real
Baseada na detecção de Legionella
em meio de cultura selectivo
Técnicas para detecção de Legionella ISO 11731:2018
PCR em tempo real
Baseada na detecção de
Legionella por amplificação de
DNA
ISO 11731:2017
• Determinação de células de Legionella
viáveis e cultiváveis
• Distinção entre serogrupos de Legionella
pneumophila
• Isolamento de colónias de Legionella
penumophila para tipagem em situações de
surto
• Técnica fastidiosa
• Tempo desde colheita até obtenção de
resultados bastante elevado
• Ocorrência de falsos negativos
• Requer bastante treino
• Amostras com elevado grau de
interferentes apresentam acrescida
dificuldade
Vantagens Desvantagens
Legionella
viáveis
Legionella
Mortas
Legionella
viáveis-não
cultiváveis
Espécies que não
crescem em
GVPC Legionella
dentro de
protozoários
ISO 11731:2017
• Determinação de células de Legionella
viáveis e cultiváveis
• Distinção entre serogrupos de Legionella
pneumophila
• Isolamento de colónias de Legionella
penumophila para tipagem em situações de
surto
• Técnica fastidiosa
• Tempo desde colheita até obtenção de
resultados bastante elevado
• Ocorrência de falsos negativos
• Requer bastante treino
• Amostras com elevado grau de
interferentes apresentam acrescida
dificuldade
Vantagens Desvantagens
PCR em tempo real
• Resposta rápida (~4h)
• Elevada sensibilidade
• Amostras com elevado grau de interferentes
não apresentam dificuldades devido a elevada
especificidade
• Detecção de Legionella independentemente do
seu estado fisiológico
• Detecção de todas as espécies de Legionella
• Discriminação entre serogrupos de Legionella
pneumophila
• Requer bastante treino e sensibilidade
• Potencial para falsos positivos
• Em situações de surto em que esta
técnica é utilizada, será de uma
maneira geral necessário cultivar as
amostras para obter colónias isoladas
• Compostos inibidores de reacção
Vantagens Desvantagens
Legionella
viáveis
Legionella
Mortas
Legionella
viáveis-não
cultiváveis
Espécies que não
crescem em
GVPC Legionella
dentro de
protozoários
PCR em tempo real
• Resposta rápida (~4h)
• Elevada sensibilidade
• Amostras com elevado grau de interferentes
não apresentam dificuldades devido a elevada
especificidade
• Detecção de Legionella independentemente do
seu estado fisiológico
• Detecção de todas as espécies de Legionella
• Discriminação entre serogrupos de Legionella
pneumophila
• Requer bastante treino e sensibilidade
• Potencial para falsos positivos
• Em situações de surto em que esta
técnica é utilizada, será de uma
maneira geral necessário cultivar as
amostras para obter colónias isoladas
• Compostos inibidores de reacção
Vantagens Desvantagens
LEGIOLERTTM
LEGIOLERTTM
• Novo sistema para quantificação de Legionella pneumophila em
amostras de água potáveis e não potáveis
LEGIOLERTTM
• Baseado na detecção de uma enzima que indica a presença de Legionella
pneumophila através da utilização do substrato presente no reagente
Legiolert
LEGIOLERTTM
Reacção positiva para Legionella pneumophila
Reacção negativa para Legionella pneumophila
LEGIOLERTTM
• Fácil e rápido de executar – similar ao Colilert
• Resultados obtidos em 7 dias (para concluir negatividade das
amostras)
Detecta Legionella pneumophila: todos os serogrupos
Objectivo do estudo
Comparação entre LegiolertTM, ISO 11731:2018
e PCR em tempo real em amostras de água
potável e não potável
Métodos
Métodos
ISO 11731:2017: inoculação de amostra direta, tratamento ácido e calor em BCYE e GVPC
+
BCYE com cisteína
BCYE sem cisteína
Serogrupo
PCR: Concentração amostra + pretratamento viabilidade + extracção
Amplificação e detecção por PCR
Quantificação e Serogrupo
LEGIOLERTTM
Métodos – LegiolertTM Água Potável
100 mL amostra de água
Determinar dureza da água
Adicionar reagente
Legiolert à amostra de água
100mL Legiolert
+ amostra
100 mL amostra de água
Adicionar 0.33 ou 1mL suplemento
dureza
10
0 m
L
Contar @ 7 dia
=
Resultado
confirmado
Verter para Quanti-
Tray, selar, e
incubar a 39°C
Métodos – LegiolertTM Água não Potável
Contar @ 7 dia
=
Resultados
confirmado
Verter para Quanti-
Tray, selar, e
incubar a 37°C
100mL diluente estéril
Adicionar reagente Legiolert a
100 mL diluente estéril
Misturar 2 mL amostra com 2 mL
pretratamento; esperar 60 s
Pretratamento
Legiolert
Amostra de água
Adicionar 2 mL amostra de
água tratada
100mL Legiolert
+ Amostra
Resultados
Resultados
• Total de 177 amostras de água analisadas: 165 amostras de água potável e 12 amostras de água não potável
22
17
6
0
5
10
15
20
25
Legiolert PCR Cultura
% A
mos
tras
Positiva
s
Método
Percentagem Amostras Positivas
Resultados
Resultados – 1L volume
1L Legiolert
Total 177 Positivo Negativo
ISO 11731:2017 Positivo 11 1
Negativo 28 137
Legiolert
PCR Positivo 16 14
Negativo 23 124
ISO 11731:2017
PCR Positivo 12 18
Negativo 0 147
Resultados
28
44
28 28
0
10
20
30
40
50
Legiolert,
PCR e Cultura
Legiolert e
PCR
Legiolert e
Cultura
PCR e Cultura
% A
mos
tras
Pos
itiv
as
Métodos
Percentagem Amostras Positivas
Resultados
Teste de McNemar
Legiolert
Total 177 Positivo Negativo
ISO 11731:2017 X2-Valor 23,310 ρ = 1.0 x 10-6 (dif.)
Legiolert
PCR X2-Valor 1,73 ρ = 0.188 (n. dif.)
ISO 11731:2017
PCR X2-Valor - ρ = 8.0 x 10-6 (dif.)
Resultados
• Correlação quantitativa entre LegiolertTM e Cultura
(correlação Spearmans r = 0.377, n=53) • Correlação quantitativa forte entre PCR e Cultura
(correlação Spearmans r = 0.616, n=53)
Resultados
R = 0.379
Resultados
R2 = 0.617
Conclusões
Conclusões
• Detecção robusta de Legionella pneumophila, com baixa
interferência
• Não é necessária confirmação extra: positivo = confirmado
• Poucos falsos negativos
• Baixa subjectividade e baixa incerteza na contagem
• Range de contagem alargado, com poucos resultados
superiores ao limite máximo de contagem – não sendo,
portanto, necessário fazer novo teste da amostra
Conclusões
• Teste fácil de executar, reacção colorimétrica como
Colilert
• Aplicável a águas potáveis e não potáveis
• Técnica com elevado nível de reprodutibilidade e
repetibilidade
• No caso de investigações epidemiológicas, os poços podem
ser furados para isolamento de colónias
I just can't go with the flow anymore. I've been
thinking about joining a biofilm.