1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Eritromisin merupakan salah satu antibiotika pilihan utama yang penting,

terutama bagi pasien yang sensitif serta resisten terhadap turunan penisilin

(Siswandono, 1995).

Eritromisin dapat diproduksi melalui fermentasi memakai Streptomyces sp.

(Karp, 2005). Saat ini, produksi skala industri menggunakan bakteri jenis

Saccharopolyspora erythraea. Proses produksi antibiotik biasanya menggunakan

sistem kultur pertumbuhan biakan/sel bakteri ( Martin & Bushell, 1996).

Biosintesis eritromisin melalui prekursor propionil KoA dan metilmalonil

KoA yang berkondensasi membentuk aglikon eritronolid, lalu mengadakan ikatan

dengan gula deoksi (Corcoran, 1981 ;O’Hagan, 1991). Di dalam mikroba terjadi

interkonversi antara kedua turunan KoA tersebut, sehingga zat-zat yang

biotransformasinya ataupun hasil uraiannya yang dapat menghasilkan zat tersebut

akan meningkatkan produksi eritromisin (Retnaningtyas, 2003).

Peningkatan produksi antibiotik dapat dilakukan dengan pendekatan secara

fisiologis dan biokemis melalui optimasi media fermentasi yang dapat berupa

pemberian prekusor, penambahan induser atau inhibitor enzim dan optimasi kondisi

fermentasi, misalnya dengan pengaturan pH, agitasi dan aerasi. Pendekatan secara

genetis dan biokemis dengan pemuliaan galur baik melalui mutasi acak maupun

2

rekayasa genetik juga dilakukan untuk meningkatkan produksi antibiotik (Omura

& Tanaka, 1984).

Media produksi eritromisin terdiri dari komponen yang kompleks antara lain,

sumber karbon, nitrogen, fosfat dan trace element (Martin & Demain, 1980). Hasil

fermentasi sangat tergantung pada komposisi media. Dalam proses fermentasi

eritromisin, sumber karbon memiliki kadar yang lebih besar dari komponen lainnya

dan berperan besar dalam menentukan hasil metabolit sekunder (El enshasy et al.,

2008).

Pada situs resmi Merck paa tanggal 22 April 2013 tercatat harga D(+)-

Glukosa monohidrat standar untuk media fermentasi, yaitu Rp 570.000/kg

sedangkan sukrosa Rp 1.090.000/kg. Kedua bahan tersebut paling sering digunakan

dalam proses produksi eritromisin. Harga bahan media yang mahal mempengaruhi

biaya produksi sehingga harga eritromisinpun menjadi mahal. Salah satu cara untuk

menekan biaya produksi adalah dengan mengganti sumber karbon dengan bahan

subtitusi yang lebih murah.

Bahan substitusi sumber karbon yang dapat digunakan adalah air tajin, limbah

pembuatan susu (milk whey), selulosa (Najafpou & Shan, 2003), gula beet, dan

bekatul (Retnaningtyas, 2003). Selain itu, penggantian sumber karbon bisa

menggunakan bahan lainnya antara lain dengan memanfaatkan limbah gula tebu

(molasses). Selain mengandung sukrosa 33,4 % dan gula invert 21,2 % (

Fardiaz, 1988) serta banyak kandungan lain seperti vitamin, mineral, protein dan

asam amino yang sangat bermanfaat dalam pertumbuhan mikroba, molasses dapat

diperoleh di pasaran dengan mudah dan murah yakni sekitar Rp 7.000/kg (Mono,

3

2013). Molasses dapat digunakan untuk pembuatan media fermentasi

Saccharomyces cereviciae dalam produksi α glukan (Kusmiyati, 2011), produksi

eritromisin dari Saccharopolyspora erythraea ( El enshasy et al., 2008) dan

produksi magnamisin dari Streptomyces halstedii (Abou-zeid et al., 2008).

Penelitian tentang pengaruh molasses sebagai bahan pengganti sumber

karbon dalam media produksi eritromisin sudah pernah dilakukan di Mesir (El

enshasy et al., 2008). Namun, pada penelitian ini, peneliti melakukan uji sampel

yang belum pernah dilakukan pada penelitian sebelumnya antara lain pertumbuhan

sel dengan metode PMV, gula tereduksi dalam sampel menggunakan uji DNS,

kadar gula total menggunakan uji C organik dan uji aktivitas sampel terhadap

Micrococcus luteus ATCC 9431 dengan mengukur diameter hambat pada media

agar pertumbuhan bakteri.

Penelitian ini diharapkan akan berguna dalam ilmu pengetahuan,

terutama untuk mengetahui pengaruh molasses terhadap peningkatan produksi

eritromisin sehingga limbah tersebut dapat didayagunakan dan berguna bagi

industri fermentasi, khususnya industri yang memproduksi obat.

Selain itu, bukti ilmiah yang dapat menunjukkan kemanfaatan limbah

tersebut, dapat dipublikasikan dalam bentuk jurnal ilmiah dan dikembangkan

menjadi komposisi medium dalam produksi eritromisin.

4

B. Tinjauan Pustaka

1. Eritromisin

Eritromisin merupakan antibiotik yang aktif secara oral, yang ditemukan

oleh McGuire pada tahun 1992 dalam produk metabolisme Streptomyces

erythraeus. Spesies mikroba penghasil eritromisin lainnya adalah Streptomyces

griseoplanus dan Arthobacter sp (Omura & Tanaka, 1984). Dari ketiganya yang

merupakan penghasil utama eritromisin adalah Streptomyces erythraeus. Nama dari

mikroba telah mengalami retaksonomi menjadi Saccharopolyspora erythraea.

Seno & Hutchinson (1986) menyatakan bahwa mikroba ini bukan tergolong dalam

genus Streptomyces, karena dinding sel dari genus Streptomyces terdiri dari asam

L-Dimetilamino pimelat (L-DMP), sedangkan pada Saccharopolyspora erythraea

terdapat pula meso-DMP yang umum terdapat pada genus Saccharopolyspora

(Omura & Tanaka, 1984). Sehingga nama baru yang diusulkan adalah

Saccharopolyspora erythraea.

Eritromisin tersebut termasuk dalam golongan makrolid, yang terdiri dari

bagian aglikon berupa cincin lakton dengan anggota 14 atom, yang terikat pada

molekul gula, yakni desosamin dan L-kladinosa / L-mikarosa (Omura & Tanaka,

1984) seperti pada struktur berikut :

5

Gambar 1. Struktur Eritromisin

Keterangan:

Antibiotika R1 R2 R3 R4 Gula Netral

Eritromisin A OH CH3 CH3 H Kladinosa

Eritromisin B H CH3 CH3 H Kladinosa

Eritromisin C OH H CH3 H Mikarosa

Eritromisin D H H CH3 H Mikarosa

Eritromisin E OH CH3 CH2 O Kladinosa

Eritromisin F OH CH3 CH2OH H Kladinosa

Eritromisin A merupakan produk akhir dalam biosintesis eritromisin oleh

mikroba penghasil, sedangkan pada eritromisin B dan C merupakan bentuk

intermediet dalam biosintesis eritromisin. Biosintesis dari eritromisin melalui dua

jalur, yaitu jalur pertama merupakan terjadinya cincin 6-deoksieritronolid B dan

jalur kedua menuju kepada glikosilasi 6-deoksieritronolid B. Sedangkan jalur

biosintesis 6-deoksieritronolid B dari propionil KoA dan 2-metilmalonil KoA

6

berjalan melalui tujuh langkah, seperti tertera pada gambar berikut (Sudibyo, 1998)

:

Gambar 2. Biosintesis 6-deoksieritronolid B

Asam propionat dapat digunakan untuk biosintesis eritromisin yang berasal

dari metabolisme oksidatif piruvat melalui suksinat, dari pemecahan asam lemak

dengan jumlah atom karbon gasal, dari asam-asam amino rantai cabang (valin dan

isoleusin) atau dari asam amino seperti treonin dan metionin.

Aglikon dari eritromisin adalah lipida dan pembentukan secara biologinya

terlihat menyerupai asam lemak rantai panjang. Mayoritas propionat yang

digunakan dalam pembentukan eritromisin A sepertinya diturunkan dari

pemecahan asam amino rantai cabang (Corcoran, 1981). Di bawah ini adalah skema

pembentukan eritromisin A.

7

Gambar 3. Skema biosintesis eritromisin A (Summers, 1997)

Eritromisin A merupakan senyawa dengan rumus molekul C13H67NO13

dengan BM 733,22. Bentuk senyawa berupa kristal berwarna putih atau agak

kuning, sedikit higroskopis, tidak terlalu berbau dengan jarak lebur 135-140°C.

Antibiotik ini sangat larut dalam alkohol, aseton, kloroform, asetonitril dan etil

asetat. Dalam air kelarutannya 2 mg/mL. Eritromisin bersifat basa dan memiliki

harga pKa 8,8 sehingga bila bereaksi dengan asam akan membentuk garam

(Budavari, 1999).

Antibiotik ini memiliki aktivitas sebagai bakteriostatik maupun bakterisida

tergantung dari jenis mikroba patogen dan konsentrasi obat. Mekanisme aksi

eritromisin adalah dengan cara menghambat sintesis protein bakteri dengan jalan

berikatan secara reversible dengan ribosom subunit 50 S.

1 Propionil Ko A

+

6 Metilmalonil KoA

Eritronolid B 6-Deoksieritronolid B

3-α-mikarosileritronolid B

Eritromisin A

Eritromisin B

Eritromisin C

Eritromisin D

8

Eritromisin memiliki spektrum cukup luas terhadap bakteri gram positif

(Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes dan Streptococcus pneumoniae)

dan gram negatif (Haemophilus influenzae, Pasteurella multocida, Brucella dan

Rickettsia) maupun mikoplasma (Chlamydia) namun tidak memiliki aktivitas

terhadap virus, ragi ataupun jamur. Penggunaan eritromisin terbukti aman dalam

pemakaiannya.

2. Molasses

Molasses merupakan hasil samping dari pabrik gula tebu, berbentuk cairan

berwarna coklat hitam, merupakan sumber karbohidrat murah dan kaya akan gula,

mengandung nitrogen, vitamin, dan elemen lainnya. Pemanfaatan molasses sampai

saat digunakan sebagai bahan baku pembuatan alkohol, penyedap rasa, bahan

tambahan makanan hewan ternak dan pupuk organik.

Penggunaan molasses sebagai sumber karbon dalam fermentasi karena

adanya kandungan gula dan berbagai nutrisi yang diperlukan bagi mikroorgansme

untuk tumbuh dan berkembang biak (Rosen, 1987).

Gambar 4. Molasses

9

Perbedaan kualitas molasses tergantung pada lokasi, kondisi iklim, dan

proses produksi dari masing-masing pabrik. Komposisi molasses dapat dilihat pada

tabel I. di bawah ini .

Tabel I. Komposisi kandungan molasses (Paturau, 1969)

Komposisi Kisaran (%) Rata-rata (%)

Air 17-25 20

Sukrosa 30-40 35

Glukosa 4-9 7

Fruktosa 5-12 9

Pereduksi lain 1-5 3

Karbohidrat lain 2-5 4

Abu 7-15 12

Komponen nitrogen 2-6 4,5

Komponen non nitrogen 2-8 5

Lilin, sterol, fosfolipid 0,1-1 0,4

Selain itu, analisis kualitas molasses dilakukan secara teratur oleh tim analisis

dari Pabrik Gula Madukismo. Analisis dilakukan secara teratur setiap kali setelah

produksi selesai. Berikut ini data kualitas molasses hasil analisis dari Pabrik Gula

Madukismo pada tanggal 21 September 2012:

10

Tabel II. Komposisi molasses berdasarkan hasil analisis dari Pabrik Gula

Madukismo 29 September 2012 (Pabrik Gula Madukismo, 2012)

Komposisi Kisaran Metode

Pengujian

Brix (jumlah padatan terlarut) (%) 88,37 Piknometris

Pol (%) 25,13 Polarimetris

HK (Harga Kemurnian) (%) 28,44 Perhitungan

Sukrosa (%) 28,47 Polaritas Ganda

HK Sukrosa (%) 32,22 Perhitungan

Gula Reduksi (%) 26,88 Lane & Eyton

TSAI (Total Sugar At Invertion)

(%)

56,85 Perhitungan

Bahan Kering (%) 78,67 Oven

Abu Konduktiviti (%) 11,44 Konduktometris

Kemurnian dicapai (%) 35,49 Perhitungan

Kemurnian dihitung (%) 36,55 Perhitungan

Perbedaan Praktis (%) -1,06 Perhitungan

Viskositas pada 50°C (mPa,s) 5040 Viskosimetris

Kadar air 21,33 Perhitungan

3. Metabolisme mikroorganisme

Metabolisme didefinisikan sebagai suatu rangkaian proses transformasi

enzimatis molekul organik dalam sel (Lehninger, 1991). Metabolisme sel ini

11

merupakan aktivitas yang teratur dan melibatkan rangkaian kerja enzim-enzim.

Proses metabolisme dapat dibedakan menjadi dua yaitu :

a. Metabolisme primer

Metabolisme primer merupakan serangkaian proses yang bersifat menyusun

atau menghancurkan makromolekul seperti karbohidrat, protein, lemak dan

asam nukleat untuk mempertahankan kelangsungan hidup dan pertumbuhan

mikroba. Senyawa yang dihasilkan disebut metabolit primer (Manitto,

1981).

Metabolisme primer biasanya terbentuk selama fase eksponensial (Jawetz,

1986). Proses ini hampir semua organisme memiliki kesamaan meskipun

organisme tersebut mempunyai perbedaan genetik (Manitto, 1981).

b. Metabolisme sekunder

Metabolisme sekunder memiliki peranan cukup besar bagi kelangsungan

hidup mikroba terutama dalam menghadapi ancaman dari lingkungan atau

serangan dari mikroba lainnya atau bila mikroba dalam kondisi tertekan.

Produk yang dihasilkan disebut metabolit sekunder, sifatnya spesifik

tergantung jenis spesiesnya dan terbentuk pada fase stasioner pertumbuhan

mikroba (Stanbury et al., 2003).

Manusia memanfaatkan metabolit sekunder untuk berbagai hal antara lain,

anti bakteri, beberapa merupakan inhibitor enzim yang spesifik, pemacu

pertumbuhan dan sebagian lagi memiliki efek farmakologi yang penting

(Stanbury & Whitaker, 1984)

12

Ada enam sifat khas metabolit sekunder yaitu, spesifik untuk satu atau

beberapa spesies, tidak diperlukan untuk pertumbuhan sel, produksinya

sangat dipengaruhi oleh faktor ligkungan, beberapa diproduksi mirip

struktur, biosintesisnya dikendalikan oleh mekanisme yang berbeda dengan

metabolit primer dan metabolit sekunder biasanya dihasilkan secara

ekstraseluler (Crueger & Crueger, 1984).

4. Fermentasi

Fermentasi berasal dari bahasa latin fervere yang berarti mendidih. Istilah ini

digunakan untuk menggambarkan aksi ragi dalam ekstrak buah atau biji-bijian yang

menghasilkan gelembung-gelembung gas CO2 sebagai akibat proses katabolisme

anaerob dari gula yang terdapat dalam ekstrak.

Menurut Kamus Besar Bahasa Indonesia, fermentasi adalah penguraian

metabolik senyawa organik mikroorganisme yang menghasilkan energi yang pada

umumnya berlangsung dengan kondisi anaerobik dan dengan pembebasan gas.

Secara skematis proses fermentasi dapat dijabarkan sebagai berikut:

13

Gambar 5. Skema proses fermentasi

Dalam biokimia dan mikrobiologi industri fermentasi diartikan sebagai

pembentukan energi melalui senyawa organik, sedangkan aplikasinya dalam

mikrobiologi industri pengertian tersebut menjadi lebih luas, yaitu suatu proses

untuk mengubah bahan dasar menjadi produk oleh massa sel mikroorganisme.

Dalam suatu fermentasi sistem tertutup dengan jumlah nutrien terbatas,

biakan mikroba akan mengalami empat fase pertumbuhan yaitu fase adaptasi, fase

eksponensial/logaritmik, fase pertumbuhan tetap dan fase kematian (Stanbury &

Whitaker, 1984; Crueger & Crueger, 1984). Fase-fase tersebut dapat dilihat dalam

gambar di bawah ini,

14

Gambar 6. Profil pertumbuhan mikroba dalam fermentasi sistem tertutup

Keterangan:

1=fase adaptasi

2=fase logaritmik

3=fase pertumbuhan tetap

4=fase kematian

a. Fase adaptasi

Fase ini terjadi bila mikroba dipindahkan ke dalam media kultur yang

baru. Dalam kondisi ini mikroba menyesuaikan diri dengan lingkungan

barunya dan tidak terjadi penambahan jumlah sel. Lingkungan yang

baru ini dapat berupa susunan medium yang berbeda, perubahan pH,

bertambahnya nutrien, berkurangnya zat penghambat tumbuh dan

faktor lainnya. Panjang pendeknya fase adaptasi tergantung pada

perbedaan kondisi lingkungan mikroba sebelum dipindahkan dengan

lingkungan baru. Semakin sesuai lingkungan untuk pertumbuhan

mikroba serta umur inokulum tidak terlalu tua maka makin pendek fase

adaptasinya (Prescott et al., 1999; Stanbury & Whitaker, 1984).

15

b. Fase logaritmik

Fase logaritmik sel yang sudah beradaptasi dengan lingkungan baru

mulai mengalami pertumbuhan. Fase ini dinamakan fase tropophase

yang berarti fase pertumbuhan. Pada fase tersebut pertumbuhan sel

merupakan pertumbuhan maksimum. Selama fase eksponensial

mikroba menghasilkan produk esensial untuk pertumbuhan sel seperti

asam-asam amino, protein, karbohidrat, lemak dan sebagainya

(Stanbury & Whitaker, 1984)

c. Fase stasioner

Fase stasioner keterbatasan nutrien dan akumulasi produk toksis

menyebabkan pertumbuhan mikroba melambat atau terhenti sama

sekali serta jumlah populasi sel relatif tetap (Morison, 1988) sehingga

terjadi fase stasioner. Dalam fase ini terjadi perubahan sistem

metabolisme dari metabolisme primer ke metabolisme sekunder dan

produk metabolismenya disebut metabolit sekunder yang bersifat

sangat khas dan tidak esensial untuk pertumbuhan serta penting artinya

bagi fermentasi komersial.

d. Fase kematian

Pada fase ini nutrien yang tersedia telah habis dan terjadi peningkatan

produk yang toksik, sehingga sel mengalami lisis total. Kematian mulai

terjadi dan populasi sel menurun dengan laju eksponensial (Crueger &

Crueger, 1984; Stanbury & Whitaker, 1984).

16

Dengan memperhatikan fase pertumbuhan mikroba dalam medium yang

digunakan, kondisi fermentasi dapat dikendalikan untuk meningkatkan produk

yang diinginkan. Produk metabolisme primer dapat ditingkatkan dengan

menggunakan kondisi fementasi yang memperpanjang fase eksponensial. Kondisi

fermentasi yang memperpendek fase eksponensial dan memperpanjang fase

stasioner ataupun mengurangi laju pertumbuhan mikroba dalam fase eksponensial

dapat mempercepat produk metabolisme sekunder (Stanbury & Whitaker, 1984)

5. Saccharopolyspora erythraea

Streptomyces erythraeus merupakan penghasil utama eritromisin. Nama

dari mikroba telah mengalami retaksonomi menjadi Saccharopolyspora erythraea.

Seno & Hutchinson (1986) menyatakan bahwa mikroba ini bukan tergolong dalam

genus Streptomyces. Berikut adalah foto secara mikroskopis bakteri Streptomyces

sp.

Gambar 7. Foto mikroskopis bakteri Streptomyces sp.

17

Bakteri ini banyak digunakan dalam industri produksi eritromisin

menggunakan sistem fermentasi tertutup (Martin & Bushell, 1996; Heydarian et al.,

1999) ataupun dengan sistem immobilisasi sel (El enshasy et al., 2008) sehingga

penelitian ini menggunakan Saccharopolyspora erythraea sebagai bakteri utama.

6. Micrococcus luteus ATCC 9341

Micrococcus luteus adalah salah satu bakteri gram positif bersifat obligat

aerob berbentuk spherical. Micrococcus luteus dapat ditemukan di tanah, debu, air,

dan udara. Micrococcus luteus merupakan mikroflora normal pada tumbuhan dan

kulit mamalia. Selain itu, bakteri ini membentuk koloni pada mulut manusia,

mukosa, dan saluran pernafasan bagian atas (www.microbelibrary.org).

Bakteri ini banyak digunakan untuk uji aktivitas senyawa obat. Pada

penelitian ini, Micrococcus luteus ATCC 9341 digunakan sebagai perwakilan dari

bakteri gram positif dalam uji aktivitas sampel terhadap pertumbuhan bakteri.

C. Landasan Teori

Eritromisin dibentuk melalui kombinasi dua lintasan jalur biosintesis.

Lintasan biosintesis pertama mengarah pada pembentukan eritronolid (bagian

aglikon) yang merupakan inti lakton eritromisin dan lintasan kedua yang bekerja

untuk mendukung biosintesis eritromisin menghasilkan gula deoksi (bagian glikon)

pada antibiotik (Corcoran, 1981).

18

Produksi antibiotik secara fermentasi memerlukan media yang mengandung

sumber karbon, nitrogen, vitamin, mineral dan lain sebagainya yang diperlukan

untuk pertumbuhan, energi, pembentukan biomassa dan produk-produk lainnya.

Sumber karbon merupakan sumber energi yang dibutuhkan mikroorganisme

untuk pertumbuhannya. Sumber karbon yang digunakan pada proses fermentasi

dapat menggunakan monosakarida seperti glukosa dan disakarida seperti sukrosa

dan laktosa.

Pada produksi skala industri dicari alternatif menggunakan sumber karbon

yang murah dan mudah didapatkan. Selain itu sumber karbon yang dipilih harus

menghasilkan produk yang berkualitas tinggi. Pemanfaatan limbah sisa produksi

gula tebu seperti molasses merupakan salah satu sumber karbon yang telah banyak

dikembangkan dewasa ini (Kusmiyati, 2011).

Molasses dalam gula tebu mengandung sukrosa 33,4 %, gula invert 21,4%,

bahan organik lain 19,6 % , Nitrogen 0,4-1,5%, trace elemen seperti P2O3, CaO,

MgO, K2O, SiO2, Al2O3 , Fe2O3, vitamin-vitamin yakni, tiamin, riboflavin,

piridoksin, niasinamida, asam pantotenat, asam folat, biotin dan abu ( Fardiaz,

1988). Ketersediaan sumber karbon berbentuk sukrosa dan gula invert pada

molasses dapat menggantikan sumber karbon pada media.

Penggunaan molasses untuk penggantian sumber karbon dapat dilakukan

pada media perkembangbiakan Saccharopolyspora erythraea dalam produksi

eritromisin.

19

D. Hipotesis

Penggantian glukosa dengan molasses dapat mempengaruhi media produksi

eritromisin biakan Saccharopolyspora erythraea BM/1 A13 terhadap pertumbuhan

sel, kadar gula total dalam media, kadar gula reduksi dan aktivitas media terhadap

bakteri Micrococcus luteus ATCC 9431.