41

METODE PENELITIAN

Penelitian ini terdiri atas 2 tahap yaitu penelitian pendahuluan dan

penelitian inti. Penelitian pendahuluan terdiri atas 2 tahap yaitu uji nilai kisaran

(range value test) dan uji toksisitas akut merkuri. Sedangkan penelitian inti yaitu

pemeliharaan ikan bandeng pada media yang tercemar merkuri dengan salinitas

berbeda.

Persiapan Penelitian

Akuarium yang digunakan sebelumnya dicuci bersih dan diberi

desinfektan. Selanjutnya akuarium diisi air sesuai dengan volume pada perlakuan

dan diaerasi selama 1 hari agar jenuh oksigen. Sedangkan untuk membuat larutan

stok merkuri nitrat dilakukan pelarutan merkuri nitrat ke dalam akuades.

Sebelum melakukan penelitian pendahuluan, terlebih dahulu dilakukan

aklimatisasi ikan uji. Aklimatisasi ini dilakukan selama seminggu yang bertujuan

untuk membiasakan ikan agar dapat hidup dalam suasana laboratorium.

Penelitian Pendahuluan

Tahap 1

Penelitian pendahuluan tahap 1 adalah melakukan uji nilai kisaran (range

value test) merkuri yang bertujuan untuk menentukan ambang batas atas (N) dan

ambang batas bawah (n) yang digunakan untuk uji toksisitas akut. Konsentrasi

ambang batas atas adalah konsentrasi terendah dari bahan uji yang dapat

menyebabkan semua ikan uji mati pada periode waktu pemaparan 24 jam.

Sedangkan konsentrasi ambang batas bawah adalah kosentrasi tertinggi dari bahan

uji yang dapat menyebabkan semua hewan uji hidup setelah pemaparan 48 jam.

Waktu dan Tempat

Penelitian pendahuluan tahap 1 ini dilakukan di Laboratorium Lingkungan

Departemen Ilmu Akuakultur Fakultas Perikanan IPB. Uji ini dilakukan selama

48 jam.

42

Alat dan Bahan

Wadah Percobaan

Wadah yang digunakan adalah akuarium dengan ukuran 30 x 30 x 30 cm3

sebanyak 15 unit. Masing-masing akuarium diisi dengan air sebanyak 20 liter.

Media Percobaan

Untuk media percobaan digunakan air tawar. Sebelum digunakan air

tersebut diendapkan dan diaerasi selama 24 jam agar jenuh oksigen.

Bahan Uji

Ikan yang digunakan adalah ikan bandeng dengan ukuran 7-8 cm dan

bobot 3-5 gram sebanyak 150 ekor dengan padat tebar 10 ekor/akuarium.

Sedangkan bahan pencemar yang digunakan adalah Merkuri Nitrat (Hg(NO3)2)

dengan penentuan konsentrasi menggunakan metode logaritmik berbasis 10

(lampiran 1) yaitu A (kontrol), B (0.006), C (0.06), D (0.6), dan E (6) mg Hg/l

dengan 3 ulangan tiap perlakuan. Perhitungan konsentrasi larutan uji mengacu

pada persamaan berikut:

V1 N1 = V2 N2

Keterangan:

N1 : Konsentrasi merkuri dalam larutan stok (mg/l)

V1 : Volume larutan stok yang akan diambil (ml)

N2 : Konsentrasi merkuri yang diinginkan dalam media air (mg/l)

V2 : Volume media air penelitian yang diinginkan (ml)

Parameter Pengamatan

Selama penelitian, setiap unit akuarium diberi aerasi namun tidak

dilakukan pergantian air dan pemberian pakan. Parameter yang diukur adalah

mortalitas ikan yang dihitung pada jam ke- 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22

dan 24. Sedangkan perhitungan berikutnya dilakukan setiap 6 jam sekali sampai

jam ke- 48.

Tahap 2

Penelitian pendahuluan tahap 2 adalah melakukan uji toksisitas akut untuk

mengetahui toksisitas akut merkuri yang dinyatakan dengan LC50. Nilai LC50 yang

dilihat adalah nilai yang dapat mematikan ikan pada jam ke 48 dan jam ke 96.

43

Waktu dan Tempat

Penelitian pendahuluan tahap 2 ini dilakukan di Laboratorium Lingkungan

Departemen Ilmu Akuakultur Fakultas Perikanan IPB. Penelitian ini dilakukan

selama 96 jam (4 hari).

Alat dan Bahan

Wadah Percobaan

Wadah yang digunakan adalah akuarium dengan ukuran 30 x 30 x 30 cm3

sebanyak 15 unit. Masing-masing akuarium diisi dengan air sebanyak 20 liter.

Media Percobaan

Untuk media percobaan digunakan air tawar. Sebelum digunakan air

tersebut diendapkan dan diaerasi selama 24 jam agar jenuh oksigen.

Bahan Uji

Ikan yang digunakan adalah ikan bandeng dengan ukuran 7-8 cm dan

bobot 3-5 gram sebanyak 150 ekor dengan padat tebar 10 ekor/akuarium.

Sedangkan bahan pencemar yang digunakan adalah Merkuri Nitrat (Hg(NO3)2).

Dari uji nilai kisaran didapatkan bahwa nilai ambang batas atas (N) adalah 0.6 mg

Hg/l dan nilai ambang batas bawah adalah 0.06 mg Hg/l. Nilai ambang batas dan

ambang bawah ini dimasukkan kedalam rumus menurut Wardoyo (1977),

sehingga didapatkan konsentrasi yang akan digunakan dalam uji toksisitas ini.

Rumus tersebut adalah sebagai berikut:

Log N/n = k (log a – log n)

a/n = b/a = c/b = d/c = N/d

Keterangan:

N : Konsentrasi ambang atas

n : Konsentrasi ambang bawah

k : Jumlah konsentrasi yang diuji

a,b,c,d : Konsentrasi yang diuji dengan nilai a sebagai konsentrasi terkecil

Rancangan Percobaan

Penelitian pendahuluan tahap 2 ini terdiri atas 4 perlakuan dan 1 kontrol

dengan 3 ulangan dengan konsentrasi sebagai berikut (Lampiran 1):

44

A : Tanpa merkuri

B : 0.110 mg Hg/l

C : 0.195 mg Hg/l

D : 0.347 mg Hg/l

E : 0.618 mg Hg/l

Metode dan Parameter Pengamatan

Selama penelitian tidak dilakukan pergantian air dan setiap perlakuan

diberi aerasi agar kematian ikan tidak disebabkan karena kekurangan oksigen.

Parameter yang diukur adalah mortalitas ikan yang dihitung pada jam ke- 0, 6, 12,

18, 24 dan selanjutnya dilakukan perhitungan setiap 12 jam sekali sampai jam ke-

96. Indikator pengamatan tingkah laku ikan uji yaitu gejala Ram-jet ventilation

(mulut terbuka terus menerus dan tutup insang terabduksi), frekuensi pernafasan

yaitu gerak membuka dan menutup insang/mulut per menit (perhitungan dimulai

dari 30 menit setelah pemberian bahan uji dan selanjutnya dibandingkan dengan

kontrol), pola gerak renang dan refleksi (normal, diam di dasar, ke permukaan,

tidak seimbang, atau kehilangan gerak reflek). Sedangkan pengukuran fisika

kimia air dilakukan setiap hari.

Analisa Data

Untuk dapat menentukan nilai konsentrasi LC50 dilakukan analisa probit

dengan SPSS 17. Analisa probit adalah suatu cara transformasi statistik dari data

presentase kematian ke dalam varian yang disebut probit dan kemudian digunakan

untuk menentukan fungsi regresi probit dengan log konsentrasi agar dapat

mengestimasi LC50.

Penelitian Inti

Pada penelitian ini dilakukan penggabungan dari 2 variabel yaitu toksisitas

merkuri dengan konsentrasi sama dan salinitas yang berbeda. Tujuan dari

penelitian inti ini adalah untuk mengetahui pengaruh salinitas yang berbeda

terhadap toksisitas merkuri dan pengaruhnya terhadap kondisi fisiologis ikan

bandeng.

45

Waktu dan Tempat

Penelitian inti dilakukan di Laboratorium Lingkungan Departemen Ilmu

Akuakultur Fakultas Perikanan IPB. Penelitian inti ini dilakukan selama 30 hari.

Alat dan Bahan

Wadah Percobaan

Wadah yang digunakan adalah akuarium dengan ukuran 60 x 30 x 40 cm3

sebanyak 12 unit. Masing-masing akuarium diisi dengan air sebanyak 40 liter

dengan tanpa resirkulasi (static renewal).

Media Percobaan

Untuk media percobaan digunakan campuran air laut dan air tawar.

Sebelum digunakan campuran air tersebut diendapkan dan diaerasi selama 24 jam

agar jenuh oksigen. Untuk pergantian air setiap harinya dibuat media stok dengan

salinitas 20 ppt, 10 ppt dan air tawar.

Bahan Uji

Ikan yang digunakan adalah ikan bandeng dengan ukuran 7 – 8 cm dan

bobot 3 - 5 gram sebanyak 240 ekor dengan padat tebar 20 ekor/akuarium. Bahan

pencemar digunakan adalah merkuri dengan konsentrasi 10 % dari LC50.

Pakan

Pakan yang digunakan adalah pakan komersil berupa pellet yang akan

diberikan dengan frekuensi pemberian pakan 3 kali sehari yaitu pukul 8.00, 12.00

dan 16.00 wib.

Rancangan Percobaan

Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap

(RAL) dengan mengaplikasikan 4 perlakuan dan 3 ulangan. Konsentrasi merkuri

yang digunakan mengacu pada hasil penelitian pendahuluan. Satuan percobaan

yang digunakan adalah sebagai berikut (Lampiran 1):

A : Salinitas 0 ppt tanpa Hg

B : Salinitas 0 ppt + 0.012 mg Hg/l

C : Salinitas 10 ppt + 0.012 mg Hg/l

D : Salinitas 20 ppt + 0.012 mg Hg/l

46

Metode dan Parameter Pengamatan

Ikan yang digunakan untuk penelitian inti sebelumnya diaklimasi pada air

tawar, salinitas 10 ppt dan 20 ppt selama lebih kurang 5 hari. Untuk mendapatkan

media percobaan dengan tingkat salinitas yang sesuai dengan perlakuan yang

diterapkan, maka dilakukan pengenceran air laut dengan air tawar (lampiran 2).

Sedangkan untuk mendapatkan salinitas yang sesuai dengan perlakuan dilakukan

perubahan salinitas secara bertahap dengan perubahan 3 ppt setiap harinya

sehingga ikan dapat bertahan dan menyesuaikan diri dengan salinitas yang baru.

Selama durasi aklimasi ikan, media pada setiap unit perlakuan diberi aerasi dan

filter.

Sebelum ikan dimasukkan ke dalam media penelitian inti, ikan ditimbang

terlebih dahulu sebagai data awal. Selama penelitian inti setiap unit perlakuan

diberi aerasi dan dilakukan penyiponan sisa pakan dan feses yang mengendap di

dasar akuarium. Selanjutnya ditambahkan air dengan konsentrasi yang sama.

Sedangkan parameter yang diukur adalah:

1. Tingkat Kerja Osmotik/ Gradien Osmotik

Tingkat kerja osmotik dihitung berdasarkan formula yang digunakan oleh

Anggoro (1992).

TKO = │Osmolaritas darah benih ikan (mOsm/LH2O) – Osmolaritas media

(mOsm/LH2O)│

Pengukuran tingkat kerja osmotik ikan bandeng dilakukan sebanyak 2 kali

yaitu pada awal dan akhir penelitian (lampiran 3).

2. Tingkat Konsumsi Oksigen (TKO)

Tingkat konsumsi oksigen akan diukur dengan menghitung selisih oksigen

terlarut pada awal dan akhir penelitian per satuan waktu. TKO diukur dengan

menggunakan toples tertutup tidak berwarna volume 3 liter yang diisi air. Air

yang digunakan adalah air yang telah diaerasi selama 1 hari sehingga jenuh

oksigen. Selanjutnya 1 ekor ikan yang sebelumnya telah dipuasakan selama 1 hari

ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam toples dan diukur DO awalnya.

Setelah 1 jam, dihitung lagi DO akhirnya. Maka akan didapatkan tingkat

konsumsi oksigen ikan tersebut dengan menggunakan rumus berikut:

TKO = {(DO awal – DO akhir)/W x t} x V

47

Keterangan:

TKO : Tingkat konsumsi oksigen (mg O2/gr tubuh/jam)

DO awal : Oksigen terlarut pada awal pengamatan (mg/l)

DO akhir : Oksigen terlarut pada akhir pengamatan (mg/l)

W : Berat ikan uji (gr)

T : Periode pengamatan (jam)

V : Volume air dalam respirometer (L)

Pengukuran konsumsi oksigen pada setiap perlakuan dilakukan sebanyak 4 kali

yaitu pada hari ke-0, 10, 20, dan hari ke-30.

3. Kondisi hematologi (Gambaran darah)

Pengamatan dan pengukuran gambaran darah terdiri atas:

a. Haemoglobin: metode yang digunakan metode sahli dengan sahlinometer

(Wedemeyer dan Yasutake 1977).

b. Hematokrit adalah perbandingan antara volume sel darah dengan total

volume darah (Anderson and Siwichki 1993).

c. Jumlah eritrosit

Σ eritrosit = Σ sel terhitung x 104 sel/mm

3 (Blaxhall dan Daisley 1973)

d. Jumlah leukosit

Σ Leukosit = Σ sel terhitung x 50 sel/mm3 (Blaxhall dan Daisley 1973)

Pengukuran gambaran darah ikan dilakukan sebanyak 3 kali yaitu pada

hari ke-0, 15 dan hari ke- 30 (Lampiran 4).

4. Histokimia

Ikan bandeng yang telah dipaparkan pada penelitian inti dapat

mengakumulasi merkuri dalam jaringan tubuhnya. Oleh karena itu dibuat

histokimia untuk melihat deposit merkuri pada jaringan ikan. Masing-masing

diambil satu ekor per unit penelitian untuk diambil sampel organ dalamnya yaitu

insang dan hati pada akhir penelitian. Uji histokimia ini dilakukan menggunakan

metode Histoteknik dengan penguat (Embedding material) paraffin (Kiernan,

1990) dan menggunakan pewarnaan logam berat (Lampiran 5).

48

5. Kadar glukosa darah

Pemeriksaan kadar glukosa darah ikan dilakukan sebagai indikator stres

sekunder akibat toksisitas Merkuri. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan

sebanyak 3 kali yaitu pada hari ke-0, 15 dan hari ke- 30 (lampiran 6). Rumus yang

digunakan adalah:

[ ]

[ ]

Keterangan:

[ GD ] : Konsentrasi glukosa darah (mg/ml)

AbsSp : Absorbansi sampel

AbsSt : absorbansi standar

[ GSt ] : Konsentrasi glukosa standar (mg/ml)

6. Laju pertumbuhan (GR)

Data laju pertumbuhan ikan uji diperoleh dengan melakukan pengambilan

ikan uji pada awal dan akhir penelitian, kemudian ditimbang beratnya. Laju

pertumbuhan harian ikan dianalisa dengan menggunakan rumus berdasarkan

Effendie (1979):

1t

Wo

Wt x 100

dengan: α = laju pertumbuhan bobot rerata harian (%)

Wt = bobot rata-rata individu pada waktu t (g)

Wo = bobot rata-rata individu pada waktu t0 (g)

t = lama percobaan (hari)

7. Efisiensi pakan

Efisiensi pakan dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:

Keterangan:

EP = Efisiensi pakan (%)

Bt = Biomasa mutlak ikan pada akhir percobaan (g)

Bd = Biomasa mutlak ikan yang mati selama percobaan (g)

B0 = Biomasa mutlak ikan pada awal percobaan (g)

F = Jumlah pakan yang dikonsumsi oleh ikan selama percobaan (g)

8. Kadar merkuri dalam media dan ikan bandeng

Pengukuran kadar merkuri dalam media dan akumulasinya did aging ikan

dilakukan pada awal dan akhir penelitian dengan menggunakan metode AAS.

49

Untuk pengukuran kadar merkuri pada ikan diukur di daging ikan bandeng

(Lampiran 7).

9. Kelangsungan hidup (SR)

Ikan yang dipelihara diamati setiap hari. Apabila terdapat ikan yang mati

segera dikeluarkan dari wadah uji, dicatat dan tidak dilakukan pergantian ikan

yang mati tersebut. Tingkat kelulusan hidup ikan bandeng dihitung dengan rumus

berikut:

Keterangan:

SR : Tingkat kelangsungan hidup (%)

Nt : Jumlah ikan yang hidup pada waktu t

No : Jumlah ikan yang hidup pada awal penelitian

10. Fisika kimia air

Data kualitas air yang diukur adalah salinitas, suhu, DO, pH, alkalinitas,

kesadahan dan TAN. Pengukuran kualitas air dilakukan setiap 7 hari sekali selama

masa penelitian.

Tabel 1. Metode dan alat untuk analisis parameter fisika kimia air

Parameter Satuan Alat

Salinitas

Suhu

DO

pH

Alkalinitas

Kesadahan

TAN

%0 0

C

mg/l

-

mg/l

mg/l

mg/l

Refraktometer

Termometer

pH meter

DO meter

Titrasi

Titrasi

Spektrofotometer

Analisis Data

Data parameter pengamatan pada perlakuan A dan B di uji menggunakan

Uji T. Sedangkan data pengaruh perlakuan salinitas dan toksisitas merkuri

terhadap perubahan gradien osmotik, tingkat konsumsi oksigen, kondisi

hematologi, kadar glukosa darah, laju pertumbuhan, efisiensi pakan dan

kelangsungan hidup ikna bandeng dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA)

menggunakan SPSS 17. Apabila terdapat pengaruh nyata maka dilanjutkan

dengan uji Tukey. Selanjutnya histokimia organ ikan dan data fisika kimia air

akan dianalisa secara deskriptif dengan menggunakan tabel dan gambar.