BACILLUS -BAKTEERIEN TUOTTAMAT LIPOPEPTIDIT

JAPANILAISESSA SOIJAPOHJAISESSA ELINTARVIKKEESSA

(NATTO)

Mari Juola

Pro gradu -tutkielma

Biotieteiden koulutusohjelma

Biotieteiden pääaine

Itä-Suomen Yliopiston

luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta

Helmikuu 2015

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta

Biotiede

Ravitsemus- ja elintarvikebiotekniikka

JUOLA MARI K.: Bacillus -bakteerien tuottamat lipopeptidit japanilaisessa soijapohjaisessa

elintarvikkeessa (natto)

Pro gradu -tutkielma, 82 sivua, liitteet 4 kpl, 3 sivua

Tutkielman ohjaajat: Prof. Atte von Wright ja prof. Sirpa Kärenlampi

Helmikuu 2015

Avainsanat: Bacillus subtilis, natto, sykliset lipopeptidit, surfaktiinit, sytotoksisuus

Tämän tutkielman tavoitteena oli tuottaa tietoa japanilaisen soijapavuista valmistetun,

fermentoidun elintarvikkeen nimeltä natto elintarviketurvallisuudesta. Tutkimuksessa

selvitettiin fermentoinnin heräteviljelminä käytettyjen Bacillus subtilis var. natto -bakteeri-

kantojen syklisten lipopeptidien tuottokyky ja pitoisuus nattoateriassa yhteistyössä Chr. Hansen

A/G:n kanssa sekä arvioitiin tuotettujen lipopeptidien sytotoksisuutta. Tulosten pohjalta

suoritettiin toksikologinen arvio turvallisesta kerta-annoksesta nattoa.

Bacillus subtilis on hyvin yleinen, harvoin infektioita aiheuttava ympäristöbakteeri, jota

hyödynnetään elintarviketeollisuudessa usein eri tavoin. Toisinaan B. subtilis -löydöksiä

tehdään myös ruokamyrkytyksen aiheuttaneista elintarvikkeista. Lisäksi joidenkin B. subtilis -

bakteerikantojen on havaittu kykenevän tuottamaan aineenvaihduntatuotteenaan syklisiä

lipopeptidejä kuten surfaktiineja, fengysiinejä, plipastatiineja ja mykosubtiliinia.

Lipopeptidien, erityisesti surfaktiinien on todettu olevan hemolyyttisiä ja sytotoksisia, ja

bakteerikantojen käyttöturvallisuus elintarvikeketjussa on kyseenalaistettu. Euroopan

elintarviketurvallisuusvirasto EFSA edellyttääkin B. subtilis -bakteerikantoja sisältävien

elintarvikkeiden toksikologista arviointia ja seurantaa sekä heräteviljelminä käytettyjen

bakteerikantojen identifiointia.

Tutkimuksen kokeellisessa osiossa identifioitiin kolmessa nattoateriassa heräteviljelminä

toimineet mikrobikannat 16S rDNA -sekvenoinnin avulla ja analysoitiin niiden lipopeptidien

synteesi PCR- ja UHPLC-qTOF -tekniikoiden avulla. Lisäksi uutettiin bakteerien tuottamat

mahdolliset lipopeptidit sekä nattoaterioista että isolaateista ja määritettiin niiden

hemolyyttisyys naudan verisolujen ja sytotoksisuus karjun siittiöiden liikkuvuuden estotestin

avulla.

Tutkimustulokset osoittivat, että nattoaterioista eristetyt B. subtilis -bakteerikannoiksi

osoittautuneet heräteviljelmät tuottivat merkittäviä pitoisuuksia surfaktiineja. Isolaatit

osoittautuivat sekä β-hemolyyttisiksi että toksisiksi karjun siittiöille.

Tulosten perusteella arvioitiin ilman akuutteja terveyshaittoja aiheuttavaksi kerralla

nautittavaksi annokseksi nattoa 50 grammaa, mikä on yleinen Japanissa myytävä

annospakkaus. Akuutti toksisuus arvioitiin hyvin lieväksi.

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Natural and Forest Sciences

Biosciences

Nutrition and Food Biotechnology

JUOLA MARI K.: The production of lipopeptides by Bacillus -bacteria in Japanese food

made from soya beans (natto)

Master’s thesis, 82 pages, 4 appendices, 3 pages

Supervisors: Prof. Atte von Wright and prof. Sirpa Kärenlampi

February 2015

Keywords: Bacillus subtilis, natto, cyclic lipopeptides, surfactins, cytotoxicity

The aim of this thesis was to find out the information of the food safety of a Japanese, soya

bean based, fermented food terming natto. The cyclic lipopeptide production potential of

fermentation starter strains Bacillus subtilis var. natto and their concentration in natto meal was

determined in association with Chr. Hansen A/G. Furthermore, the cytotoxicity of the

lipopeptides was tested. On the strength of the results a toxicological assessment of the safe

level of natto without any toxic effects was done.

Bacillus subtilis is very commonly found environmental bacterium, causing infections rarely.

It is widely utilized on the food technology. It has been used on traditional, soya based,

fermented food terming natto as a starter strain for several centuries. Occasionally, the findings

of B. subtilis, are being made on food poisonings. Furthermore, the ability of some B. subtilis

strains to produce cyclic lipopeptides as surfactins, fengycins, plipastatins and mycosubtilin as

metabolism products has documented. Notably the surfactins are hemolytic and cytotoxic, and

the safety for humans has challenged. European Food Safety Authority EFSA requires the

toxicological assessment of safety, follow-up studies and the identification of bacterial strains

in foods including B. subtilis.

In the experimental part, the starter strains from three natto meal samples was identificated by

16S rDNA and the synthesis of lipopeptides was analyzed by PCR and UHPLC-qTOF. The

possible lipopeptides was extracted from isolates and natto samples. The hemolytic activity on

bovine erythrocytes was detected and cytotoxicity assay by boar sperm motility inhibition was

performed.

The results indicated, that the starter strains characterized B. subtilis strains and produced

surfactins significantly. Moreover, all isolates proved to be β-hemolytic and culture extracts

were toxic to boar sperm cells.

On the strength of the results the safe level of natto without any toxic effects is 50 grams, which

is a standard package of natto in Japan. The acute toxicity of natto was assessed very low.

SISÄLTÖ

1. JOHDANTO 7

KIRJALLISUUS 8

2. BACILLUS SUBTILIS 8

2.1. Taksonomia 8

2.2. Ominaisuudet 9

2.3. Esiintyminen ja käyttö 11

2.3.1. Bacillus subtilis -bakteerin probioottikäyttö elintarvikkeissa 11

2.3.2. Bacillus subtilis -bakteerin probioottikäyttö rehuissa 12

2.3.3. Bacillus subtilis -bakteerikantojen käyttö heräteviljelminä 13

2.3.3.1. Natto 14

2.4. Bacillus subtilis var. natto 15

2.4.1. Genomi 16

2.4.2. Ominaisuudet 16

2.4.3. Poly-γ-glutamaattisynteesi 18

2.5. Bacillus subtilis infektioiden aiheuttajana 18

2.5.1. Elintarvikeperäiset infektiot 19

2.5.1.1. Probioottivälitteiset infektiot 19

2.5.2. Ruokamyrkytykset 20

2.5.2.1. B. subtilis -ryhmän bakteerien esiintyvyys elintarvikkeissa 20

2.5.2.2. Ruokamyrkytysten esiintyvyys 22

2.6. Bacillus subtilis -bakteerikantojen tuottamat lipopeptidit 26

2.6.1. Surfaktiinit 28

2.6.1.1. Synteesi 29

2.6.1.2. Ominaisuudet ja käyttö 30

2.6.2. Muut B. subtilis -ryhmän bakteerikantojen tuottamat lipopeptidit 31

2.6.2.1. Fengysiinit ja plipastatiinit 32

2.6.2.2. Mykosubtiliini 33

3. NATON ELINTARVIKETURVALLISUUSARVIOINTI 35

3.1. B. subtilis var. natto -bakteerikantojen käyttöturvallisuus 35

3.1.1. Nattoaterioiden B. subtilis var. natto -kokonaispitoisuus 35

3.1.2. Probioottien käyttöturvallisuus 38

3.2. B. subtilis var. natto -bakteerikantojen tuottamien toksiinien

aiheuttamat terveysriskit 39

3.3. Suolistokolonisaatio 43

3.4. Turvallisuuden arviointimenetelmät 44

3.4.1. Hemolyysi 45

3.4.2. Sytotoksisuus 45

3.4.3. Lipopeptidien tuottokyky 45

KOKEELLINEN OSA 46

4. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET 46

5. AINEISTO JA MENETELMÄT 47

5.1. Bakteerikantojen eristäminen nattoaterioista 47

5.2. Tutkimuksessa käytetyt referenssibakteerikannat 48

5.3. Identifiointi 48

5.4. Lipopeptidien uuttaminen mikrobistosta 49

5.4.1. Uutto MOLP-elatusliemeen 49

5.4.1.1. Uutteen valmistaminen mikrobipesäkkeestä 49

5.4.1.2. Uutteen valmistaminen nattonäytteestä 50

5.4.2. 2-butanoliuutto 50

5.5. Hemolyysin määrittäminen 51

5.6. Sytotoksisuuden määritys karjun siittiöiden liikkuvuuden estotestillä 51

5.7. Lipopeptidien synteesikyky 52

5.7.1. Surfaktiinien synteesiin vaadittavan geenin määrittäminen 52

5.7.2. Fengysiinien, plipastatiinien ja mykosubtiliinin synteesiin

vaadittavien geenien määrittäminen 53

5.8. Mikrobien tuottamien lipopeptidien analysointi 54

6. TULOKSET 55

6.1. Identifiointi 55

6.2. Hemolyysi 55

6.3. Sytotoksisuus 56

6.4. Surfaktiinien synteesiin vaadittavan geenien esiintyminen 57

6.5. Fengysiinien, plipastatiinien ja mykosubtiliinin synteesiin

vaadittavien geenien esiintyminen 57

6.6. Nestekromatografiset tulokset 58

7. POHDINTA 60

8. LÄHTEET 64

9. LIITTEET 80

LYHENTEET

Caco-2 (Colon Carcinoma cells) Ihmisen suolistosyövästä eristetty epiteelisolulinja

EC50 (Effective Concentration 50 %) Pitoisuus, jossa puolella koe-eliöistä ilmenee koeaikana jokin

erikseen määriteltävä myrkkyvaikutus

EFSA (European Food Safety Authorization) Euroopan elintarviketurvallisuusviranomainen

GRAS (Generally Recognized as Safe) Yleisesti turvalliseksi tunnustettu

Hep-2 (Human larynx carcinoma cell line) Ihmisen kurkunpääsyövästä eristetty solulinja

HT29-16E (Human colonic epithelial goblet cell line) Ihmisen suolistosyövästä eristetty

epiteelisolulinja

LD50 (Lethal Dose 50 %) Kerta-annos, joka tappaa puolet koe-eliöistä koeaikana

M-CGH (Microarray-based comparative genomic hybridization) Mikrosirutekniikkaan

perustuva vertaileva genomien hybridisaatioanalyysi

MS (Mass Spectrometry) Massaspektrometri(a)

MS/MS (Tandem Mass Spectrometry) Kaksivaiheinen MS-analyysi

NOAEL (No Observed Adverse Effect Level) Annos, joka ei aiheuta koe-eliössä haitallista

muutosta

QPS (Qualified presumption of safety) Oletettavasti turvallinen

qTOF (Quadrupole-Time-Of-Flight) Kvadrupoli-lentoaika-(massa)analysaattori

TOF (Time-Of-Flight Mass Analysator) Lentoaika-(massa)analysaattori

UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) Äärimmäisen suuren erotuskyvyn

nestekromatografi(a)

7

1. JOHDANTO

Osa Bacillus –suvun bakteerilajeista on todettu ruokamyrkytyksiä aiheuttaviksi patogeeneiksi.

Osaa pidetään terveydelle harmittomina, ja niitä hyödynnetään elintarvike- ja rehutuotannossa.

Eräs käytetyimmistä on Bacillus subtilis. Organismin turvallinen käyttö elintarvikkeissa on

kuitenkin kyseenalaistettu, sillä joissain ruokamyrkytystapauksissa, joiden aiheuttajaksi on

todettu tunnettu toksiineja tuottava patogeeni Bacillus cereus, näytteissä on esiintynyt

samanaikaisesti myös B. subtilis -bakteerikantoja. B. subtilis -ryhmän bakteerien on myös

havaittu itsessään kykenevän aiheuttamaan toisinaan sekä ruokamyrkytyksiä että muita

mahdollisia terveyshaittoja.

Merkittävimmäksi mahdolliseksi terveysriskien aiheuttajaksi on noussut esiin B. subtilis -

bakteerikantojen kyky tuottaa voimakkaita pinta-aktiivisia aineita kuten sytotoksisia,

hemolyyttisiä lipopeptidejä. Useilla bakteerikannoilla on havaittu lipopeptidien synteesiin

vaadittavia geenejä, ja erityisesti syklisen lipopeptidi surfaktiinin tuotto katsotaan terveydelle

mahdollisesti haitalliseksi sen korkean bioaktiivisuuden vuoksi (Mikkola ym. 2000).

Potentiaalinen surfaktiinien tuottaja on esimerkiksi perinteisessä japanilaisessa natto-nimisessä

elintarvikkeessa esiintyvä B. subtilis var. natto.

Natto valmistetaan fermentoimalla soijapapuja B. subtilis var. natto -bakteerikannan avulla, ja

lopullinen tuote sisältää organismin eläviä soluja yli 108 pmy grammassa. Perusteellista näyttöä

B. subtilis -bakteerikantojen elintarviketurvallisuudesta ei ole eikä B. subtilis var. natto

-bakteerikannan nattoateriassa tuottamista lipopeptideistä tiedetä juuri lainkaan.

Useat Bacillus -bakteerit, kuten B. subtilis, sisältyvät Euroopan Elintarviketurvallisuus-

viranomaisen (EFSA) elintarviketurvallisiksi oletettujen mikrobien nk. QPS-listalle (Qualified

presumption of safety). Euroopan ulkopuolella ei edellytetä käytön virallista

turvallisuusarviointia, mutta EFSA on ohjeistanut, että organismien lisääminen

elintarvikeketjuun vaatii toksikologisen arvioinnin ja seurannan (EFSA 2007, 2013). Lisäksi

edellytetään elintarvikkeessa käytetyn bakteerikannan identifiointia.

Tämän pro gradu -tutkielman tavoitteena on tuottaa tietoa siitä, kykenevätkö natto-aterian

valmistuksessa käytetyt bakteerikannat tuottamaan tiettyjä lipopeptidejä ja kuinka paljon sekä

arvioida näin naton elintarviketurvallisuutta.

8

KIRJALLISUUS

2. BACILLUS SUBTILIS

2.1. Taksonomia

Bacillus subtilis on Firmicutes -pääjaksoon ja Bacillus -sukuun kuuluva bakteerilaji. Bacillus

subtilis -laji jaetaan alalajeihin B. subtilis ssp. subtilis, B. subtilis ssp. spizizenii sekä B. subtilis

ssp. inaquosorum (Nakamura ym. 1999, Rooney ym. 2009, Yi ym. 2013). Bacillus subtilis ssp.

subtilis -klusterin muodostavat B. subtilis, B. pumilus ja B. licheniformis (Salkinoja-Salonen

ym. 1999). B. subtilis -ryhmän fylogenetiikka on hyvin haastavaa. Alalajit ovat fenotyypiltään

hyvin samankaltaisia ja niiden geenit ovat niin konservoituneita, että niitä on vaikea erottaa

toisistaan luotettavasti (Yi ym. 2013). Lähitaksonien luokittelu muuttuu hieman käytetyn

analyysimenetelmän mukaan.

Hyvin läheistä sukua B. subtilis -ryhmän alalajeille ovat esimerkiksi B. tequilensis, B.

mojavensis ja B. vallismortis (Roberts ym. 1994, 1996). Sen lisäksi, että B. mojavensis ja B.

vallismortis -lajit on vaikea erottaa alalajeista, myös erottamisen käytännön merkitys on

kiistanalaista. Perinteisin fenotyyppisin testein eroja ei voidakaan havaita (Rooney ym. 2009,

Logan ja de Vos 2009), ja yleisimmin käytetty 16S rRNA -geenin sekvenointi antaa usein

virheellisen tuloksen (Barbosa ym. 2005, Earl ym. 2007, Wang ym. 2007). Tarkin erotuskyky

B. subtilis –ryhmän alalajien kesken saavutetaan mikrosirutekniikkaan perustuvalla DNA-

hybridianalyysillä (M-CGH) tai sekvenoimalla gyrA tai gyrB, joten on suositeltavaa käyttää

niitä 16S rRNA –sekvenoinnin sijasta (Earl ym. 2007, Wang ym. 2007, Yi ym. 2013).

Toisilleen hyvin läheisten B. subtilis -bakteerikantojen vaikea erotettavuus on johtanut siihen,

että teollisuudessa käytetään B. subtilis -bakteerikantana käytännössä myös B. mojavensis- tai

B. vallismortis -bakteerikantoja (Euroopan Komissio 2000). Erityisesti B. vallismortis

-bakteerikannat voidaan erottaa B. subtilis ssp. subtilis -alalajista luotettavimmin sekvenoimalla

gyrA ja gyrB (Wang ym. 2007, EFSA 2013).

9

2.2. Ominaisuudet

Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835, Koch 1872) on Gram-positiivinen, katalaasipositiivinen,

liikkuva 0,7 – 3,0 µm pituinen sauvabakteeri. Pesäkkeet kasvavat yleensä joko yksittäin tai

pareina, harvoin ketjuina. Niiden morfologia vaihtelee jopa saman bakteerikannan sisällä

kiinteistä voimaisiin tai limaisista kalvopintaisiin. Myös reunan muoto vaihtelee säännöllisistä

hyvinkin aaltoileviin ja epäsäännöllisiin. B. subtilis luokitellaan aerobiseksi, mutta se voi

lisääntyä myös anaerobisissa olosuhteissa joko nitraattia pelkistäen tai glukoosia fermentoiden

sitä stimuloivan pyruvaatin läsnä ollessa (Nakano ym. 1997, Nakano ja Zuber 1998, Rooney

ym. 2009).

Bacillus subtilis hydrolysoi kaseiinia, gelatiinia ja tärkkelystä. Fermentaatiossa organismi

tuottaa laktaattia ja asetaattia sekä glukoosin läsnä ollessa myös 2,3-butaanidiolia. Solut

kykenevät myös muodostamaan polysakkaridi- tai polyglutamiinihappokapselin kasvun

stationäärisessä vaiheessa, mutta sillä ei ole yleensä taksonomista merkitystä. B. subtilis var.

natto -bakteerikantojen syntetisoimalla solunulkoisen poly-γ-glutamiinihapon (PGA)

tuotannolla on sitä vastoin merkittävää taloudellista hyötyä. (Logan ja de Vos 2009.)

Optimikasvulämpötila on 28–30 oC vaihteluvälin ollessa yleensä 5–55 oC (Logan ja de Vos

2009). Useat B. subtilis -bakteerikannat voivat kasvaa jopa yli 56 oC:ssa (Rooney ym. 2009).

Kasvualueen pH vaihtelee arvojen 5,5 ja 8,5 välillä. Osa B. subtilis -bakteerikannoista sietää

jopa 10 % natriumkloridipitoisuutta, mutta tavallisesti kasvu heikkenee NaCl-pitoisuuden

kohotessa 6 %:iin (van der Ploeg ym. 2012). B. subtilis käyttää ravinteenaan tyypillisesti

sitraattia ja hiilenlähteinään esimerkiksi L-arabinoosia, D-glukoosia, natriumglukonaattia,

sakkaroosia, tärkkelystä ja D-ksyloosia (Pötter ym. 2001, Logan ja de Vos 2009).

Hyvin tunnusomaista B. subtilis -bakteerille on elinolosuhteiden heikentyessä esiintyvä itiöinti.

Pääosin organismin tiedetään tuottavan endosporeja, mutta myös eksosporeja on havaittu

(Hong ym. 2009). Muoto vaihtelee ellipsoidaalisista sylinterimäisiin (Logan ja de Vos 2009).

Lajintunnistuksessa itiönmuodostus korostuukin solujen ja itiöiden välisessä erottumisessa.

Merkittävä rakenteellinen ominaisuus B. subtilis -lajin itiöillä on niitä ympäröivä

monikerroksinen, vähintään 70 erilaisesta proteiinista muodostunut ulkokuori, joka

mahdollistaa vuosien, jopa vuosisatojen resistenttiyden ympäristön ääriolosuhteita vastaan

(McKenney ym. 2013).

10

Itiöt ovat metabolisesti lepotilassa ja osittain dehydratoituneita, mikä mahdollistaa niiden

säilymisen elinkykyisenä ravinteiden puuttuessa (Nguyen Thi Minh ym. 2011). Resistenttiyden

kestoa ravinteettomuutta, kuumuutta, kuivuutta, hydrostaattista painetta, suolapitoisuutta sekä

muita olosuhteita vastaan on haastavaa luotettavasti arvioida, sillä itiöt kehittyvät ja muuntuvat

olosuhteiden muutosten mukaan. Esimerkiksi B. subtilis -bakteereilla saastuneessa

elintarvikkeessa puolen tunnin ajan 100 oC:ssa kuumentamisen jälkeen 10 % itiöistä on edelleen

elinkelpoisia (Evira 2010). Takaisin vegetatiivisiksi soluiksi ne puolestaan muuntuvat hyvin

nopeasti. Itiöt voidaan tuhota autoklavoiden 20 minuuttia 121 oC lämpötilassa. Itiönmuodostus

on puolet nopeampaa ns. villin tyypin bakteerikannoilla kuin laboratoriokannoilla (Tam ym.

2006). Itiöitymistehokkuutta nostaa myös organismin kyky tuottaa useita kymmeniä eri

lipopeptidejä (Nakano ym. 1991).

Kasvuolosuhteiden heikentyessä ja usein itiönmuodostuksen yhteydessä useat B. subtilis

-bakteerikannat muodostavat myös soluja ympäristön epäedullisilta fysikokemiallisilta

tekijöiltä suojaavaa biofilmiä. Nopea itiönmuodostuskyky korreloi suoraan biofilmin

muodostuksen kanssa (Hong ym. 2009). Biofilmin rakennetta pitää koossa ja vahvistaa

solunulkoinen, pääasiassa eksopolysakkarideista ja amyloidikuidusta koostuva matriisi.

Biofilmin rakenteeseen vaikuttaa merkittävästi solujen kyky syntesoida surfaktiineja.

Surfaktiinit ovat syklisiä lipopeptidejä, jotka laskevat voimakkaasti solun pintajännitystä.

Surfaktiinia tuottavat bakteerikannat muodostavat tyypillisesti paksun, monisyisen ja

suonimaisen biofilmin, kun taas sitä tuottamattomien kantojen muodostama biofilmi on ohut,

hauras ja sileä. Myös pesäkkeiden koko on suurempi kuin surfaktiinia tuottamattomien

kantojen. Jotkut surfaktiinia tuottavat bakteerikannat myös kykenevät elämään pysyvästi

esimerkiksi ihmisen suolistossa persistoituen sinne pidemmäksi ajaksi kuin sitä tuottamattomat

kannat. (Branda ym. 2001, 2006; Barbosa ym. 2005; Tam ym. 2006.)

Suurin osa tunnetuista B. subtilis -bakteerikannoista ei ole patogeeneja, ja useat inhiboivat

patogeenisten bakteerien kasvua (Barbosa ym. 2005, Hong ym. 2008, Larsen ym. 2013).

Organismin ei yleensä ole havaittu tuottavan enterotoksiinia (Beattie ja Williams 1999,

Pedersen ym. 2002, Phelps ja McKillip 2002). Enterotoksiinituotanto on kuitenkin mahdollista

mediumin koostumuksen ollessa maltodekstriini- tai glukoosipitoinen (Rowan ym. 2001). B.

subtilis on usein vahvasti hemolyyttinen (Barbosa ym. 2005).

11

2.3. Esiintyminen ja käyttö

Bacillus subtilis on hyvin yleinen ympäristöbakteeri. Se on eristetty alun perin kuivasta heinästä

(Logan ja de Vos 2009), ja sitä esiintyykin runsaasti maaperässä, kasveissa, vesisedimentissä

sekä ilmassa. B. subtilis -bakteerin laajat kasvuominaisuudet, antimikrobisten yhdisteiden ja

biofilmin muodostamiskyky sekä aerobinen ja anaerobinen itiöinti edistävät organismin

runsasta esiintyvyyttä ympäristössä (Hong ym. 2008, Rooney ym. 2009). B. subtilis on

luonteeltaan alloktoninen, eli esiintyessään ihmisen elimistössä se on kulkeutunut sinne

elimistön ulkopuolelta joko sillä kontaminoituneen tai fermentoidun elintarvikkeen mukana. Se

voi kuitenkin kasvaa ja lisääntyä ihmisen ruoansulatuskanavassa koko elinkaarensa ajan

(Sanders ym. 2003).

B. subtilis -bakteerikantoja ja niiden itiöitä hyödynnetään laajalti elintarvike-, rehu- ja

tekstiiliteollisuudessa. Isolaatteja ja niiden avulla tuotettuja peptidejä käytetään erilaisten

entsyymien, kuten amylaasien ja ekstrasellulaaristen proteaasien tuotannossa, pinta-aktiivisten

lipopeptidien kuten surfaktiinin tuottajina, erilaisina apuaineina sekä pestisideinä. Hong ym.

(2008) havaitsivat B. subtilis var. natto -bakteerikannan tuottavan hyvin biosurfaktantti

surfaktiinia. Organismia hyödynnetään myös lääketeollisuudessa vitamiinien, antibioottien,

nukleotidien ja nukleosidien tuotannossa. B. subtilis -bakteerikantojen fermentaatioprosessissa

tuottamalla D-riboosilla voidaan voimistaa ihmis- ja eläinravinnon aromia lääketeollisuuden

sovellusten lisäksi. Etenkin B. subtilis -bakteerikantojen itiöitä käytetään heräteviljelminä

perinteisissä aasialaisissa ja afrikkalaisissa elintarvikkeissa sekä probiootteina elintarvikkeissa

ja rehuissa. (Schallmey ym. 2004, Hong ym. 2008, EFSA 2013.)

2.3.1. Bacillus subtilis -bakteerin probioottikäyttö elintarvikkeissa

B. subtilis -bakteerikantoja sisältäviä valmisteita käytetään yleisesti ihmisille ja eläimille

probiootteina. Käyttönsä luonteen vuoksi probioottien tulisi olla resistenttejä maha- ja

sappinesteelle sekä kyetä kiinnittymään limakalvolle tai epiteelisoluihin. Niiden tulisi myös

inhiboida potentiaalisten patogeenien kasvua ja kyetä vähentämään patogeenien adheesiota

pinnoille sekä hydratoimaan sappinestettä sekä in vitro että in vivo (FAO/WHO 2002).

12

Organismista valmistettujen probioottivalmisteiden on havaittu inhiboivan useiden

patogeenien, kuten Listeria monocytogenes- ja Clostridium perfringens -bakteerikantojen

kasvua. Patogeenien inhibitio vaihtelee kuitenkin suuresti ollen sekä kanta- että

substraattispesifistä (Barbosa ym. 2005, Cutting ym. 2011, Kaboré ym. 2013).

Itiöitä muodostavilla B. subtilis -bakteerikannoilla on useita merkittäviä etuja verrattuna ei-

itiöiviin mikrobeihin, kuten joihinkin Lactobacillus -bakteerikantoihin. Probioottisia B. subtilis

-bakteerikantoja hyödynnetäänkin useita eri Bacillus -bakteerikantojen itiöitä sisältävinä

itiövalmisteina. Kuivatut itiöt säilyvät erittäin hyvin huoneenlämmössä elinkyvyn

heikkenemättä. Niiden nopea germinoituminen, biofilmin muodostuskyky ja uudelleen

itiöityminen mahdollistavat koko elinkaaren aikaisen säilymisen ruuansulatuskanavan

happamassa ja osittain anaerobisessa ympäristössä. Lisäksi solujen muodostama biofilmi

suojaa niitä mahanesteen happamuudelta ja voimistaa niiden adheesiota suolistolimaan.

(Barbosa ym. 2005, Tam ym. 2006, Hong ym. 2008, 2009.)

Epäsuora käyttösovellus on myös mahdollisuus hyödyntää B. subtilis -bakteerikantojen

tuottamaa polypeptidiä, poly-γ-glutamaattia (PGA) muiden probioottien kryoprotektanttina.

Säilyvyyden parantamiseksi ei-itiöivistä maitohappobakteereista valmistetut probiootit usein

pakastetaan. Pakastaminen kuitenkin itsessään vähentää elinkykyisten mikrobien pitoisuutta

tuotteessa keskimäärin kolme kertaluokkaa. Bhatin ym. (2013) mukaan pakastaminen steriilissä

PGA-matriisissa vahvistaa erityisesti Lactobacillus paracasei -bakteerikannan solujen

elinkykyä. Ei-hemolyyttistä B. subtilis var. natto ATCC 15245 -bakteerikantaa pidetään

turvallisena PGA:n tuottajana, sillä sen genomissa ei ole havaittu esiintyvän tunnettuja entero-

tai enteritoksiineja koodaavia geenejä hblD/A, nheB, bceT ja entFM. Myöskään toksisten

sfingomyelinaasin tai fosfolipaasi A2:n tuotantoon vaadittavia geenejä sph tai piplc ei ole

havaittu. (Bhat ym. 2013.)

2.3.2. Bacillus subtilis -bakteerin probioottikäyttö rehuissa

Organismia käytetään probioottina myös tuotantoeläimille, pääasiassa siipikarjalle ja porsaille

(Euroopan komissio 2002; 2013a, b). B. subtilis ssp. subtilis -bakteerikantojen itiöitä sisältäviä

valmisteita lisätään niiden rehuun kasvun promoottoriksi sekä lisäämään eläinten

vastustuskykyä patogeenejä kohtaan.

13

Probiootin on arvioitu laskevan infektioiden määrää ja siten antibioottien käyttöä

tuotantoeläimillä, minkä seurauksena niistä saatava taloudellinen tuotto paranee. (Hong ym.

2009, Cutting 2011, Larsen ym. 2014.)

Myös uusimmat tutkimustulokset organismin probioottikäytöstä tuotantoeläinten rehussa ovat

taloudellisesti lupaavia. B. subtilis var. natto -solujen tai niiden avulla fermentoidun tuotteen

lisääminen lypsylehmien rehuun on havaittu lisäävän niiden maidontuottoa sekä maidon

sisältämän rasvan määrää (Peng ym. 2012, Sun ym. 2013). Myös pötsin somaattisten solujen

määrän lasku ja proteolyyttisten bakteerien pitoisuuden nousu sekä suoliston

kokonaisbakteerimäärän nousu viittaavat kyseisten bakteerikantojen käytön kannattavuuteen

lypsylehmien rehussa. Vasikoiden ravintoon lisätyt vegetatiiviset B. subtilis var. natto -solut

puolestaan edistävät niiden pötsin kehittymistä nopeuttaen vasikan muuttumista märehtijäksi

vähentäen näin karjanhoitokustannuksia (Sun ym. 2011).

Song ym. (2014) puolestaan havaitsivat, että B. subtilis var. natto -bakteerikantojen itiöitä

sisältävän valmisteen lisäys naudan rehuun laski ulosteen typpipitoisuutta ja vähensi

proteiinineritystä ulosteeseen. Organismi nosti näin naudan ravinnon sisältämän typen

hyödyntämisastetta. Tutkimuksessa havaittiin myös ruoansulatuskanavan mikrobipopulaation

muuttuneen merkitsevästi kahdeksan viikon probioottilisäyksen jälkeen esimerkiksi nostamalla

hyödyllisten bifidobakteerien määrää suolistossa. Lisäksi eläinravinnon lisäaineena voidaan

käyttää B. subtilis -bakteerikantojen tuottamaa PGA:a (Schallmey ym. 2004).

2.3.3. Bacillus subtilis -bakteerikantojen käyttö heräteviljelminä

Tiettyjä B. subtilis -bakteerikantojen itiöitä käytetään runsaasti heräteviljelminä useissa

perinteisissä fermentoiduissa elintarvikkeissa. Käyttökohteita ovat esimerkiksi

kaakkoisaasialaiset perinneruoat ”natto” Japanissa, ”shi” Kiinassa, ”thua-nao” Thaimaassa,

”chunk-kook-jong” Koreassa ja ”tao-si” Filippiineillä (Wei ym. 2001). Fermentoinnin aikana

lisätty organismi saa aikaan raaka-aineiden proteiinien, hiilihydraattien ja lipidien

pilkkoutumisen asetaateiksi, hiilidioksidiksi ja vedyksi. Mikrobien aikaansaamat pH-arvojen

muutokset ja metaboliatuotteiden kuten haihtuvien orgaanisten yhdisteiden muodostuminen

antavat elintarvikkeelle sille ominaisen rakenteen, aromin ja maun. (Beaumont 2002, Shrestra

ym. 2010.)

14

2.3.3.1. Natto

Natto on japanilainen, useita satoja vuosia vanha perinneruoka, joka keksittiin alun perin

vahingossa: soijapapuja pakattiin olkien sisään ja säilytettiin vähähappisissa olosuhteissa maan

alla vähintään viikon ajan. Oljissa luonnollisesti esiintyvät B. subtilis -bakteerikantojen

haihtuvat aldehydit, ketonit ja hapot aiheuttivat papuihin säilytyksenaikaisen fermentoitumisen

aikana voimakkaan, pähkinäisen aromin sekä solujen tuottama PGA papuja yhdistävän runsaan

liman muodostumisen. Teollinen valmistus alkoi vasta 1900-luvun alussa, kun japanilainen

kemisti S. Sawamura eristi ja puhdisti bakteerikantoja nattoaterioista, nimesi ne Bacillus natto

-bakteerikannoiksi, ja organismin itiösuspensiota alettiin lisätä valmistusprosessiin

tarkoituksellisesti. Nykyään teollinen valmistus on tarkoin säädettyä ja valvottua.

Valmistusprosessin yksinkertaisuuden vuoksi nattoa valmistetaan kuitenkin myös

yksityistalouksissa. (Sawamura 1906, Beaumont 2002, Nagai 2012.)

Teollinen valmistusprosessi on monivaiheinen. Pienehköt soijapavut pestään, ja niitä liotetaan

10 oC vedessä 18 tuntia. Pehmenneitä papuja höyrytetään kiertokeittimessä 2 kg paineessa

1–1,5 tunnin ajan, jolloin mikrobit kuolevat ja papujen ravintoarvo paranee proteiinien

denaturoituessa. B. subtilis var. natto -bakteerien itiöitä laimennetaan veteen siten, että

pitoisuus on keskimäärin 108 per 60 kg papuja ja suspensio lisätään höyrytettyihin papuihin.

Inokulaatin mikrobipitoisuus vaihtelee suuresti käytettävän bakteerikannan mukaan (Wei ym.

2001). Toisaalta myös valmistusprosessin olosuhteet vaikuttavat tarvittavan populaation

määrään. Pavut jaetaan polystyreenirasioihin 30–50 g annoksiin ja peitetään muovikalvolla.

Oheen laitetaan maustepakkaukset, yleensä maustekastiketta ja sinappia, ja annoksia

fermentoidaan 40–50 oC lämpötilassa korkeassa kosteuspitoisuudessa 16–18 tunnin ajan,

jolloin proteiinit hydrolysoituvat. Sen jälkeen fermentointia jatketaan alhaisemmassa

kosteuspitoisuudessa 3–10 oC lämpötilassa 8 tuntia. Lopullisen tuotteen B. subtilis -pitoisuus

on 108 – 1010 pmy/g. Valmistusprosessissa mikrobien limantuotto on oleellista. Natolle

ominainen korkeaviskositeettinen lima koostuu pääasiassa levaanimuotoisesta

eksopolysakkaridista fruktaanista sekä PGA:sta (Hara ym. 1981, Wei ym. 2001). Onnistuneena

lopputuotteena pidetään vaalean, silkkisen limakerroksen peitossa olevaa pehmeää ja

karakteristisen aromin omaavaa korkeaviskoosista massaa, joka kyetään hyvin nauttimaan

syömäpuikoilla. Valmiin naton laatu vaihtelee voimakkaasti myös liotus- ja höyrytysajan,

inokulaatin ja sen pitoisuuden sekä fermentaatioajan mukaan (Wei ym. 2001).

15

Korkean viskositeetin aikaansaamiseksi nattoa sekoitetaan sakkaroosin läsnä ollessa. Mitsuin

ym. (2011) mukaan viskositeetti laskee säilytyksen aikana, mutta bakteriofageilla

kontaminoituneen naton viskositeetti laskee jyrkästi jo sekoittamisen aikana. (Wei ym. 2001,

Schallmey ym. 2004, Kim ym. 2012, Nagai 2012.)

Fermentaatiossa tapahtuviin monimutkaisiin biokemiallisiin reaktioihin, niiden asteeseen ja

nopeuteen sekä tuotettuihin yhdisteisiin vaikuttavat voimakkaasti fermentointiprosessin eri

vaiheiden kestot sekä käytetyt bakteerikannat (Wei ym. 2001).

Natto on erittäin proteiinipitoinen elintarvike. Noin 36 % soijapavun kuivapainosta koostuu

proteiinista, ja valmis tuote sisältää noin 55–60 % vettä, 17 % proteiinia ja 10 % rasvaa (Wei

ym. 2001, Fineli 2014, USDA 2014). Nattoa nautitaan Japanissa tyypillisesti aamiaiseksi

kuumentamatta (Wei ym. 2001). Nattoa on kolmenlaista: itohiki-natto, yukiwai-natto ja hama-

natto. Suurimmat määrät tuotetaan Itohiki-nattoa, ja sana ”natto” viittaakin yleensä siihen.

Kyseessä on edullinen ja arkinen elintarvike, jonka säilyvyyttä pidetään hyvänä. Vaikka natto

nautitaan perinteisesti sipulin, merilevän tai mausteiden sekä riisin kera, sitä käytetään

Japanissa myös aromaattisena aineena valmistettaessa liha-, merilevä- tai kasvisruokia taikka

yhtenä kastikkeen ainesosana. (Wei ym. 2001.)

Nattoa pidetään Japanissa yleisesti terveellisenä ja terveysvaikutteisena elintarvikkeena, ja siitä

valmistetaan myös ravintosupplementteja (Chen ym. 2012). Naton ja B. subtilis var. natto

-bakteerikantojen vegetatiivisten solujen tuottaman fibrinolyyttisen entsyymin nattokinaasin

nauttimisen on havaittu stimuloivan immuunijärjestelmää sekä suojaavan sydän- ja

verisuonitaudeilta (Sumi ym. 2004, Cutting 2011). Myös korkeaan kalsium- ja K2-

vitamiinipitoisuuteen perustuvaa osteoporoosilta suojaavaa vaikutusta on raportoitu (Ikeda ym.

2006). Toisaalta natto sisältää terveydelle haitallisen määrän biogeenisia amiineja, erityisesti β-

fenyylietyyliamiinia ja tyramiinia (Kim ym. 2012).

2.4. Bacillus subtilis var. natto

Erityisesti naton tuottamiseen soveltuvat B. subtilis var. natto -bakteerikannat (lyhyesti B.

subtilis natto tai Bacillus natto) ovat läheistä sukua referenssibakteerikannalle B. subtilis

Marburg 168. Naton fermentaatioprosessiin soveltuu useita kymmeniä eri B. subtilis var. natto

-bakteerikantoja (Kubo ym. 2011).

16

Kaupallisessa tuotannossa käytetään kuitenkin pääasiassa kolmea, joista yli 50 vuotta sitten

eristetty B. subtilis natto Mira (kutsutaan myös nimellä Miura) -bakteerikannan markkinaosuus

on 70–80 %. Muut pääosin käytetyt bakteerikannat ovat Naruse ja Takahashi (Nagai 2012).

Fermentointiin käytetty bakteerikanta vaikuttaa naton lopulliseen mikrobipitoisuuteen

(vaihteluväli 2,6 – 5,0 ×109 pmy/g), pH-arvoon (vaihteluväli noin 7…8), viskositeettiin sekä

ammoniakkipitoisuuteen (Wei ym. 2001). B. subtilis var. natto -bakteerikannat eroavat muista

B. subtilis –bakteerikannoista pääosin korkean PGA:n tuottokyvyn, bakteerifaagispesifisyyden

sekä insertiosekvenssien suhteen. Ne ovat myös biotiiniauksotrofisia. (Hara ym. 1982; Nagai

ym. 1997, 2000; Kubo ym. 2011.)

2.4.1. Genomi

B. subtilis var. natto -bakteerikantojen genomille tunnusomaisia ovat karakteristiseen tuoksuun

ja bakteriofagi φNIT1:n herkkyyteen sekä itiön muodostukseen vaikuttavat

sekundäärimetaboliittien metaboliareittejä säätelevät geenit kuten gyrA, rpoB, purH, polC ja

groEL (Kubo ym. 2011). Korkeaviskoosisen liman muodostukseen vaaditaan myös PGA:ta

koodaava geenioperoni pgsBCAywtC (Ashiuchi ym. 2003, Qiu ym. 2004, Kimura ym. 2009).

Genomissa ei esiinny profaagia SPβ eikä skin -elementtiä, kun taas profagi PBSX esiintyy (Qiu

ym. 2004). Myöskään biotiinin synteesiin vaadittavaa bio-geeniä genomissa ei esiinny.

Insertiosekvenssien (IS) IS4Bsu1 ja IS256Bsu1 puuttuminen genomista kuvaa osaltaan myös

organismin kykyä toimia naton heräteviljelmänä. IS4Bsu1 aiheuttaa epästabiiliutta mikrobien

PGA-synteesiin. IS-elementtien esiintyminen genomissa ei sinänsä estä onnistunutta

fermentaatioprosessia, mutta niiden läsnäolo voi heikentää lopputuotteen laatua. (Inagaki. ym.

2003, Kubo ym. 2011.) Enterotoksiineja tuottavia geenejä hbl, nhe, cytK eikä bceT ei ole

havaittu (Hong ym. 2008, Bhat ym. 2013).

2.4.2. Ominaisuudet

B. subtilis var. natto -bakteerikannat tuottavat spesifisellä kasvualustalla proteaasia ja osa niistä

myös amylaasia (Inatsu ym. 2002). Mutantin B. subtilis natto Mira -bakteerikannan avulla

tuotetaan EFSA:n turvalliseksi arvioimaa lasten K2-vitamiiniöljyvalmistetta. (Nishiguchi ym.

2002, EFSA 2008). Lisäksi bakteerikannat ovat tehokkaita pinta-aktiivisten aineiden tuottajia.

Antibioottiresistenttiyttä ei ole havaittu (Hong ym. 2008).

17

Natosta eristetyille bakteerikannoille on ominaista myös runsas fibrinolyyttisen entsyymin,

nattokinaasin tuotto, jonka on havaittu inhiboivan sydän- ja verisuonisairauksia osaltaan

aiheuttavien verihyytymien muodostumista in vivo (Sumi ym. 2004). Nattokinaasin on havaittu

myös estävän valtimoiden sisäkalvon paksuuntumista, joka on seurausta suonten

endoteelisoluvaurioista (Suzuki ym. 2003). Vauriot altistavat verihyytymien muodostumiselle.

Lisäksi on saatu viitteitä organismin tuottaman surfaktiinin antitumoraalisuudesta (Schallmey

ym. 2004, Cao ym. 2009). Altistettuaan ihmisen rintasyöpäsolut surfaktiinipitoisuudelle 40

mg/l Cao ym. (2009) havaitsivat apoptoosinopeuden merkitsevää lisääntymistä ja solusyklin

pysähtymistä G2/M -faasiin.

Hongin ym. (2008) tutkimuksessa havaittiin B. subtilis var. natto -bakteerikantojen säilyttävän

elinkykynsä hyvin ruoansulatuskanavan haastavissa olosuhteissa. Ne itiöivät hyvin

mahanesteessä ja suolilimassa sekä muodostivat selviämistä merkittävästi edesauttavan

hydrofobisen biofilmin. Organismi myös germinoitui nopeasti. Lisäksi se inhiboi merkitsevästi

sekä gram-positiivisten että gram-negatiivisten patogeenien kasvua.

Vaikka B. subtilis var. natto -bakteerikantojen genomien ole havaittu sisältävän

enterotoksiineja koodaavia geenejä, organismilla esiintyy muita virulenssitekijöitä (Hong ym.

2008). Sen on todettu olevan hemolyyttinen ja tuottavan runsaasti lämpöresistenttejä toksiineja:

sytotoksista syklistä lipopeptidiä surfaktiinia sekä nekroottista neurotoksista proteiinia,

fosfolipaasi A2:a (Hong ym. 2008, EFSA 2013). Neurotoksisuuden vuoksi fosfolipaasi A2:n

tuotanto on syytä huomioida toksikologisessa arvioinnissa (Chu 1949, Matarante ym. 2004,

Hong ym. 2008). Hongin ym. (2008) mukaan B. subtilis var. natto –bakteerikanta on myös

sytotoksinen Caco-2-, Hep-2- ja HT29-16E –soluille.

Nattoaterioiden fermentointiin käytettäville bakteerikannoille on tunnusomaista myös herkkyys

spesifisille bakteriofageille. Nagain (2012) mukaan heräteviljelmiä infektoivia bakteriofageja

tunnetaan useita kymmeniä. Ne luokitellaan nykyään infektiivisyyden, lämpöresistenttiyden ja

kasvualustavaatimusten perusteella kahteen ryhmään. Ryhmään 1 sisältyy mm. tunnettu

JNDMP -fagi sekä ryhmään 2 tunnetut P-1 ja ONPA. Ryhmän 2 bakteriofagit ovat

virulentimpia ja lämpöresistentimpiä kuin ryhmään 1 sisältyvät. Ne kykenevät kontaminoimaan

kaikkia kaupallisia nattoon käytettäviä heräteviljelmiä, kun taas ryhmän 1 bakteriofagit eivät

voi kontaminoida Mira -viljelmiä. Jälkimmäiset myös vaativat kasvualustaansa magnesiumia.

18

Bakteriofagien infektoimien solujen tuottaman PGA:n viskositeetti laskee voimakkaasti pian

itiösuspension lisäämisen ja solujen germinoitumisen jälkeen heikentäen näin naton laatua

(Kimura ja Itoh 2003). Fagikontaminaatio pyritään estämään normaalein elintarvikehygienian

keinoin (Nagai 2012).

2.4.3. Poly-γ-glutamaattisynteesi

Hyvin tunnusomaista ja merkityksellistä B. subtilis var. natto -bakteerikannoille on niiden kyky

tuottaa solunulkoista poly-γ-glutamaattia (PGA) L-glutamaatin puuttuessa kasvualustasta

(Inatsu ym. 2002). PGA on glutamiinihapon polymeeri, anioninen polypeptidi, jossa kaksi

karboksyyliryhmää on polymeroitunut hiiliketjun α- ja γ -hiiliin. Naton solunulkoisen liman

sisältämä PGA koostuu 50–80 %:sti D- ja 20–50 %:sti L -muodon glutamaatista (Ashiuchi ym.

2003). Isomeerien keskinäinen suhde määräytyy mediumin mangaanipitoisuuden mukaan: mitä

enemmän siinä on mangaania, sitä suurempi osa glutamaatista on D-muodossa (Leonard ym.

1958, Nagai 2012). PGA absorboi tehokkaasti vettä ja veteen liuenneena suojaa mikrobisoluja

kylmältä sekä muodostaa fysikaalisen esteen ei-toivottujen organismien kuten bakteriofagien

pääsylle soluun (Kimura ja Itoh 2003, Kimura ym. 2009). PGA:n aktiivisuuden väheneminen

säilytyksen aikana voi aiheuttaa viskositeetin stabiloitumisen (Mitsui ym. 2011). Parhaiten

limaa erittävät ja niin ollen tehokkaimpia heräteviljelmiä ovat ne toisilleen hyvin läheiset B.

subtilis -bakteerikannat, jotka sekä tuottavat poly-γ-glutamaattia että ovat biotiinille

auksotrofisia (Kubo ym. 2011).

2.5. Bacillus subtilis infektioiden aiheuttajana

B. subtilis infektoi ihmisiä tiettävästi suhteellisen harvoin. Suurimman terveyshaitan on arvioitu

olevan vakava, paikallinen tai systeeminen infektio (Sanders ym. 2003). Tämänhetkisen tiedon

valossa näyttää siltä, että B. subtilis -bakteerin aiheuttama infektioriski on suurin

vastustuskyvyltään heikoilla henkilöillä kuten imeväisillä, immunosuppressiivisilla tai muuten

immuniteetiltaan heikentyneillä henkilöillä sekä implantin omaavilla potilailla (Logan 2011).

Immunosuppressiiviset syöpäpotilaat tai jonkin muun vaikean sairauden heikentämät henkilöt

voivat herkimmin sairastua organismin aiheuttamaan hengenvaaralliseen bakteremiaan, jolloin

mikrobit lisääntyvät potilaan verenkierrossa. B. subtilis -itiöitä sisältävät probioottivalmisteet

toimivat eräänä reittinä elimistöön.

19

Lisäksi vaikean sairauden hoitoon liittyy usein injektointeja, punkteerauksia, katetrointeja tai

vastaavia toimenpiteitä, jotka mahdollistavat ympäristöstä vaikeasti häädettävän B. subtilis

-bakteerin pääsyn potilaan kudoksiin. Organismi voi saada aikaan paikallisen infektion myös

lapsella esim. ihon lävitse tunkeutuneen tikun kautta. (de Boer ja Diderichsen 1991.)

2.5.1. Elintarvikeperäiset infektiot

Elintarvikeperäisen infektion aiheuttaa joko elintarvikkeessa esiintyvän bakteerin suuri

pitoisuus tai sen tuottama(t) toksiini(t). Elintarvikeperäiset B. subtilis -infektiot jaetaan

aiheuttamismekanismin perusteella elintarvikevälitteisiin infektioihin ja ruokamyrkytyksiin.

Elintarvikevälitteisen infektion aiheuttaa B. subtilis -bakteerikannan riittävän suuri

infektiivinen annos elintarvikkeessa tai siihen verrattavassa tuotteessa kuten probiootissa.

Ruokamyrkytys aiheutuu bakteerin tuottamasta toksiinista elintarvikkeessa ja/tai sitä nauttineen

henkilön elimistössä. (Evira 2010.)

2.5.1.1. Probioottivälitteiset infektiot

B. subtilis -bakteerikantoja sisältäviä itiövalmisteita on käytetty jo vuosia suolistosairauksien

rinnakkaishoitokeinona (Spinosa ym. 2000). Tunnettuudesta huolimatta B. subtilis -bakteerien

käyttäminen probiootteina ei ole riskitöntä. Eräässä eurooppalaisessa sairaalassa oli 1980-

luvulla B. subtilis -bakteerien aiheuttamaan bakteremiaan sairastunut kuuden vuoden aikana

kahdeksan potilasta. Puolet heistä oli kärsinyt ripulista, jota pyrittiin hoitamaan B. subtilis

-itiöprobiootilla. Potilaat olivat letkuruokinnassa ja pääosin syöpäpotilaita. Kukaan potilaista

ei menehtynyt. (Richard ym. 1988.)

Seuraavalla vuosikymmenellä immuunipuolustukseltaan heikentynyt iäkäs potilas menehtyi

bakteremiaan nautittuaan B. subtilis -bakteerin itiöitä sisältävää probioottivalmistetta. Valmiste

sisälsi liian suuren pitoisuuden itiöitä potilaan yleistilaan nähden. Germinoiduttuaan potilaan

elimistössä vegetatiivisten solujen suuri määrä sai aikaan yleistilan heikentymisen ja sitä kautta

kuoleman voimakkaista antibioottihoidosta huolimatta. Nautitut bakteerikannat eivät olleet

resistenttejä käytetyille antibiooteille. (Oggioni ym. 1998.)

20

Hyväkuntoisetkin aikuiset voivat toisinaan sairastua vakavasti B. subtilis -bakteerin

aiheuttamaan infektioon. Suuren ihmisryhmän turvallisena pitämät Herbalife®-

ravintovalmisteet ovat kasviperäisiä luontaistuotteita, jotka eivät sisällä vaikuttavana

ainesosana B. subtilis -itiöitä. Kaksi valmisteita useita vuosia nauttinutta henkilöä sai vakavan

maksavaurion vuonna 2009. Heistä vanhempi kärsi akuutista pahoinvoinnista sekä sai

sapensalpausoireita, hepatiitin ja maksakirroosin nautittuaan nestemäisiä ravintovalmisteita

kolmen vuoden ajan. Keski-ikäinen nainen puolestaan sairastui sappifibroosiin ja -kirroosiin

nautittuaan kiinteitä valmisteita kuten vitamiinitabletteja toista vuotta. Kolmen eri

ravintovalmisteen todettiin kontaminoituneen B. subtilis -bakteereilla. Myös yhdessä

avaamattomassa valmisteessa havaittiin B. subtilis -kontaminaatio. Valmisteista eristetyt

mikrobit identifioitiin 16S rRNA- ja gyrB- sekvenoinnein B. subtilis -bakteerikannoiksi. Yksi

bakteerikanta osoittautui HepG2-solujen avulla suoritetuissa hepatologisissa testeissä

maksatoksiseksi in vitro. Sappifibroosin todettiin aiheutuneen nimenomaan valmisteiden

pitkäaikaiskäytöstä. Mitään raskasmetalleja, pestisidejä tai vastaavia kontaminantteja ei

näytteistä löydetty. (Stickel ym. 2009.)

2.5.2. Ruokamyrkytykset

Yleisesti ei-patogeenina pidetyn B. subtilis -bakteerin taudinaiheuttamis- ja toksiinien

tuottokyky ja siten yhteys elintarvikevälitteisiin infektioihin on selkeä. Ruokamyrkytysten

esiintyvyys on kuitenkin matala.

2.5.2.1. B. subtilis -ryhmän bakteerien esiintyvyys elintarvikkeissa

B. subtilis -ryhmän bakteerikantojen itiölöydökset ovat tavallisimpia maitotuotteissa, erityisesti

maitojauheessa, sekä vilja- ja lihatuotteissa. Raaka-aineissa esiintyy B. subtilis -bakteerikantoja

siinä kuin useita muitakin ympäristöbakteereja. Itiöinti mahdollistaa Bacillus -bakteerien

säilymisen elintarvikeprosessien aikana. Lämpöresistentit itiöt muuntuvat vegetatiivisiksi

soluiksi hyvin nopeasti kuumennetun elintarvikkeen jäähdyttämisen, tarjoilun ja nauttimisenkin

aikana. Infektion aiheuttanut elintarvike on tutkimusten mukaan usein valmistettu astiassa,

jossa on tarjoiltu lihaa tai kalaa yhdessä viljapohjaisen komponentin kuten riisin tai jonkin

leivonnaisen kanssa. (Logan 2011.)

21

Meijerituotteet ovat hyvin tavallinen Bacillus -bakteerilähde. Jakauma on kirjavaa. Esimerkiksi

eri meijerituotteissa esiintyneistä Bacillus -lajeista B. subtilis -bakteerikantoja havaittiin

Cosentinon ym. (1997) mukaan olevan 7,4 %, B. licheniformis -bakteerikantoja 11,8 % ja B.

pumilus -bakteerikantoja 6,2 %. B. subtilis -löydöksiä tehtiin pastöroidusta maidosta,

prosessoiduista juustoista ja juustolevitteistä ja muita tarkasteltavia bakteerikantoja myös

iskukuumennetusta maidosta sekä tuorejuustosta. Kuitenkin vaikka B. subtilis -ryhmän

bakteerikantojen esiintyminen maitotuotteissa on hyvin tavallista, mikrobipitoisuuden on

oltava vähintään 107 pmy/ml, jotta merkittäviä määriä toksiinia voi maidossa muodostua

(Griffiths 1990). Cosentinon ym. (1997) suorittamassa tutkimuksessa mikrobipitoisuus oli

hyvin alhainen vaihdellen välillä 101 - 103 pmy/ml. Mataranten ym. (2004) mukaan tulisi silti

huomioida, että Bacillus -bakteeripitoisuus määritetään tavallisesti pastöroinnin jälkeen, joten

lasketaankin vain itiöt ja osa soluista. Sen vuoksi nautittavien solujen kokonaispitoisuus on

tuntematon ja niiden potentiaalinen riski aiheuttaa ruokamyrkytys saatetaan aliarvioida.

Leivässä itiöivien Bacillus -bakteerien esiintyminen on myös hyvin tavallista. Tutkittaessa eri

bakteeripitoisuuksia valkoisessa ja täysjyvävehnäleivässä havaittiin erityisesti B. subtilis

-bakteerikantojen selviävän valmistusprosessista hyvin. Tutkittavat leivät oli valmistettu ilman

säilöntäaineita tai hapattamista. Niitä säilytettiin kahden vuorokauden ajan 25–30 oC:ssa, minkä

jälkeen niistä eristettiin seuraavia bakteerikantoja: B. subtilis (70 %), B. licheniformis (24 %),

B. pumilus (2 %) ja B. cereus (2 %). Mikrobipitoisuudet olivat noin 106 pmy/ml. B. subtilis

-bakteerikannat olivat vallitsevia todennäköisesti korkean lämpöresistenttiyden ansiosta.

Pilaantuneessa leivässä havaittiin ainoastaan B. subtilis -bakteerikantoja. Leipien raaka-

aineissa, kuten hiutaleissa ja leseissä, havaittiin Bacillus -bakteerien itiöitä 0–1×102 pmy/ml.

(Rosenkvist ja Hansen 1995.)

Mataranten ym. (2004) mukaan valmistusprosessi ja sitä kautta mikrobipitoisuus valmiissa

tuotteessa sen nautintahetkellä on merkitsevä tekijä ruokamyrkytysriskiä arvioitaessa.

Tutkittaessa kahdeksan kappaletta sekä käsin että teollisesti valmistettuja eurooppalaisia

kestomakkaroita havaittiin 54 % niistä eristetyistä mikrobeista olevan B. subtilis- ja 38 %

saman ryhmän B. pumilus -bakteerikantoja. Mikrobipitoisuudet olivat kuitenkin niin pieniä,

noin 103 pmy/g, ettei pitoisuuden katsottu aiheuttavan ruokamyrkytyksen vaaraa. Tulosten

perusteella on päätelty, että kestomakkaroiden hyvin pitkä valmistusaika (vähintään 2 kk)

laskee niistä saatavan ruokamyrkytyksen riskiä. Eristetyt B. subtilis -bakteerikannat

osoittautuivat kuitenkin α-hemolyyttisiksi, ja niistä 67 %:lla ilmeni fosfolipaasi A2 -aktiivisuus.

Enterotoksiinien tuottoon vaadittavia geenejä hbl tai nhe ei havaittu.

22

Maitokarjan utaretulehdukset eli mastiitit ovat eräs maitotuotteissa esiintyvien Bacillus

-bakteerien lähde (Nieminen ym. 2007). Meijeriin tulevista utaretulehduksen sairastaneiden,

parantuneiksi todettujen lehmien maitonäytteistä on eristetty B. licheniformis- ja B. pumilus

-organismeja. Mastiittitapauksissa Bacillus -bakteerit luetaan harvinaisiksi taudinaiheuttajiksi

tai kontaminanteiksi eikä antibioottihoitoa kohdisteta niihin (Evira 2001, ETT 2012). Niemisen

ym. (2007) tutkimuksen mukaan kuusi prosenttia kotimaisista maitonäytteistä sisälsi sellaisia

B. licheniformis- ja B. pumilus -bakteerikantoja, jotka kykenivät tuottamaan lämpöresistenttiä

likenysiini A -sytotoksiinia. Koska B. licheniformis -bakteerikantojen itiöt eivät tuhoudu

pastöroitaessa ja mikrobien likenysiini A -tuotanto on mahdollista myös anaerobisesti

suolistossa, maitojauheen käyttämisen ilman huolellista kuumennusta on katsottu olevan

turvallisuusriski erityisesti vastustuskyvyltään heikon henkilön terveydelle (Mikkola ym.

2000).

Tunnetuin B. subtilis -ryhmän mikrobeja sisältävä riskielintarvike lienee kontaminoituneesta

äidinmaidonvastikejauheesta huolimattomasti valmistettu maito. Rowan ym. selvittivät vuonna

2001 julkaistussa tutkimuksessaan, kykenevätkö B. subtilis- ja B. licheniformis -bakteerikannat

tuottamaan B. cereus –bakteerikantojen aiheuttamassa ripulioireisessa ruokamyrkytyksessä

esiintyviä toksiineja hemolysiini-BL (HBL) ja enterotoksiini T:ä (BceT). Yksi B. subtilis- ja

kaksi B. licheniformis -bakteerikantojen genomeista sisälsivät toksiinituotantoon vaadittavia

hbl- ja bce –geenejä. Kyseiset bakteerikannat kykenivät metaboloimaan enterotoksiinia

äidinmaidonvastikkeesta valmistetussa maidossa sen sisältäessä maltodekstriiniä tai glukoosia.

Tutkittujen bakteerikantojen havaittiin olevan myös sytotoksisia Caco-2- ja Hep2 -solulinjoilla.

Toksisuus heikkeni kuumennuksen jälkeen. Tulokset korostavat enterotoksiinituotannon

riippuvuutta mediumin koostumuksesta sekä äidinmaidonvastikkeen huolellisen

kuumennuksen ja pikaisen tarjoilun merkitystä.

2.5.2.2. Ruokamyrkytysten esiintyvyys

Vaikka varmennettuja B. subtilis -bakteerikantojen aiheuttamia ruokamyrkytyksiä raportoidaan

harvoin, täsmällistä ja luotettavaa kokonaismäärää ei tiedetä. Syynä on mahdollisesti se, etteivät

ruokamyrkytyspotilaita hoitavat tahot aina erota infektion aiheuttanutta B. subtilis -ryhmän

bakteerikantaa B. cereus -bakteerikannoista.

23

Sekavuutta löydösten esiintyvyyden tarkastelussa aiheuttaa myös se, että ennen 1970-lukua

mitä tahansa kliinistä Bacillus -isolaattia kutsuttiin usein nimellä B. subtilis. Näin ollen pitkän

aikavälin epidemiologisiin tutkimustuloksiin on suhtauduttava varauksella. Viimeisten 30–40

vuoden aikana infektioiden aiheuttaja on nimetty raporteissa täsmällisemmin. Bakteriologian

kehitys voikin muuttaa raportoitujen tapausten suhteellista lukumäärää pitkällä aikavälillä.

Toisaalta on huomioitava immuniteetiltään heikentyneiden henkilöiden määrän jatkuva kasvu

esimerkiksi syöpäpotilaiden määrän kasvaessa ja eliniän pidentyessä. (de Boer ja Diderichsen

1991, Sanders ym. 2003, Logan 2011.)

Todennetut muiden kuin B. cereus -ryhmään kuuluvien Bacillus -bakteerien aiheuttamat

ruokamyrkytystapaukset ovat lähinnä B. subtilis -ryhmään kuuluvien, hyvin läheistä sukua sille

olevien B. licheniformis- ja B. pumilus -bakteerikantojen aiheuttamia. Elintarvikkeissa

esiintyvän B. subtilis -organismin aiheuttaman infektion edellytyksenä on pidetty Loganin

(2011) mukaan sekä huomattavan suurta mikrobipitoisuutta että bakteerikantojen mahdollista

lipopeptidituotantoa, joskin jälkimmäisen yhteys infektioihin on vielä osittain epäselvä. Riskin

muodostavat paikalliset ja yleisinfektiot immuunivasteeltaan heikkojen henkilöiden kohdalla,

kun taas organismin toksiinien tuotto on merkitsevää sekä terveillä että sairailla henkilöillä.

Infektiot ovat monimuotoisia. Tyypillistä on lyhyt, jopa 10 minuutin ja keskimäärin 2,5 tunnin

inkubaatioaika sekä rajut vatsaoireet, erityisesti raju oksentaminen ja voimakas vatsakipu.

Myös ripulia ja sappitietulehdusta on raportoitu. B. subtilis kykenee kolonisoimaan suoliston.

Immunosuppressiivisilla henkilöillä on esiintynyt vähäisesti myös bakteremiaa. Nautitun

elintarvikkeen mikrobipitoisuus vaihtelee tyypillisesti 105 ja 109 pmy/ml välillä. (Oggioni ym.

1998, Kramer ja Gilbert 1989, Logan 2011.)

Organismin aiheuttamien ruokamyrkytystapausten esiintyvyydeksi on vv. 1975–1986

raportoitu Yhdistyneissä Kuningaskunnissa 49 tapausta. Diagnosoinnin epätarkkuuden vuoksi

tieto ei ole eksakti, mutta tarkasteltuna jälkimmäisten esiintyvyystietojen kanssa osaltaan

suuntaa-antava. (Kramer & Gilbert 1989.)

Salkinoja-Salosen ym. vuonna 1999 ilmestyneeseen tutkimukseen oli koottu Suomen ja

Yhdistyneiden Kuningaskuntien alueelta yli 10 vuoden ajalta 210 B. licheniformis -bakteeri-

kantojen aiheuttaman ruokamyrkytyksen isolaattia. Niiden alkuperät olivat kirjavia: mastiittia

sairastaneiden lypsylehmien utareet, erilaiset maitotuotteet, riisi, lihapiirakat ja voileivät.

24

Yksi isolaatti oli peräisin ruokamyrkytykseen menehtyneen imeväisen nauttimasta

äidinmaidonvastikkeesta. Yksi puolestaan oli peräisin ruokamyrkytyspotilaan ulosteesta.

Organismien aiheuttama ruokamyrkytys oli ollut akuutti tai jopa puolen vuorokauden kuluttua

ruoan nauttimisesta havaittu. Elintarvikkeista tutkimuksessa eristettyjen bakteerikantojen

pitoisuus vaihteli 3×105 – 1×108 pmy/g välillä, mutta nautitun ravinnon todelliset

mikrobipitoisuudet elimistössä olivat tuntemattomia. Isolaateista valmistettujen solujen

metaboliittia, likenysiiniä sisältävien uutteiden sytotoksisuus arvioitiin solujen hemolyysin,

Corynebacterium renale -solujen kasvun inhibition ja karjun siittiöiden liikkuvuuden estotestin

avulla. Kaikista tutkituista isolaateista noin 7 % osoittautui β-hemolyyttisiksi ja 6,2 %

sytolyyttisiksi. Puolet hemolyyttisistä – eli 4,3 % kaikista – isolaateista inhiboi siittiöiden

liikkeen häiritsemällä solun energiametaboliaa kuluttamalla solujen ATP:n loppuun ja

laajentamalla akrosomit. Vaikutukset korreloivat pitoisuuden kanssa. Mastiittia sairastaneen

naudan raakamaidosta eristetyistä kolmesta isolaatista kaksi osoitti siittiötestissä samanlaisia

toksisia vasteita kuin ruokamyrkytyksen aiheuttaneesta äidinmaidonvastikejauheesta eristetty

bakteerikanta. Äidinmaidonvastikejauhe luokiteltiin imeväisen riskielintarvikkeeksi.

Vuonna 2000 äidinmaidonvastikkeessa esiintyneet B. licheniformis -bakteerikannat aiheuttivat

sitä nauttineen imeväisen kuoleman. Karjun siittiöiden liikkuvuuden estotestissä havaittiin, että

sekä eristetyt isolaatit että niistä uutettu lipopeptidi, likenysiini A olivat erittäin sytotoksisia.

Siittiöiden plasmamembraani- ja akrosomivauriot olivat selkeitä ja niiden liikkuvuus heikkeni

huomattavasti. Solujen NADH ja ATP vähenivät myös selkeästi. Likenysiini A:n toksisuus oli

kymmenkertainen itse isolaattiin nähden. Likenysiini A:n ja vertaillun kaupallisen surfaktiinin

vaikutus oli sama. (Mikkola ym. 2000.)

Vuonna 2005 kaksi pientä lasta, iältään 9 ja 12 kk, olivat nauttineet kaupallista muro-

kuivahedelmä-maitojauhevalmistetta, johon sekoitetaan ennen tarjoilua vettä. Lapset olivat

sairastuneet akuutisti useaksi päiväksi rajuun oksentamiseen ja pahoinvointiin. Myös samasta

pakkauksesta uuden erän tuotetta valmistanut ja nauttinut toisen lapsen äiti sai

pahoinvointioireita. Valmisteen maitojauheessa ja muroissa havaittiin merkitseviä määriä sekä

B. cereus- että B. subtilis -bakteerien itiöitä. B. cereus -bakteerikantojen ei havaittu tuottavan

organismin oksennusmuotoa aiheuttavaa emeettistä toksiinia, kereulidia. Näytteissä havaittiin

enterotoksiineja koodaavia geenejä hbl ja nhe, mutta potilaat eivät kärsineet ripulista. Toisen

eristetyn B. subtilis -bakteerikannan todettiin olevan hemolyyttinen. Lasten ikä, oireet ja

löydökset viittasivat siihen, että ruokamyrkytyksen syynä oli valmisteen sisältämä B. subtilis

-itiöiden korkea pitoisuus yhdessä B. cereus –itiöiden kanssa. (Duc ym. 2005.)

25

Useissa ruokamyrkytyksissä osallisena olleiden B. subtilis- ja B. mojavensis -bakteerikantojen

toksiinintuottokykyä oli tutkittu Fromin ym. tutkimuksessa, joka ilmestyi vuonna 2005.

Bakteerikantoja oli eristetty erilaisista ruokamyrkytystapauksista, joissa niiden oli todettu

olleen ainakin yhtenä osatekijänä. Tutkimukseen sisältyi 333 isolaattia, joista 37 % oli peräisin

erilaisista elintarvikkeista kuten tyhjiökypsennetyistä ruoista, elintarviketeollisuuden raaka-

aineista ja valmispizzoista. Esimerkiksi pakastetusta, marinoidusta kanasta eristetyn B. subtilis

-bakteerikannan oli arvioitu aiheuttaneen usealle sitä nauttineelle henkilölle ruokamyrkytyksen.

Oirekuvaan kuului myös ripuli osoittaen organismin lisääntyneen myös suolistossa. Lähes

viidennes bakteerikannoista oli peräisin mausteista. Kolmannes oli eristetty vesihanasta

otetusta juomavedestä, mistä ne voivat kulkeutua elintarvikkeisiin. Toksiinin tuottokyvyn

tutkimukset Vero-solutestillä osoittivat, että vain alle 2 % organismeista tuotti lämpöresistenttia

sytotoksiinia. Karjun siittiöiden liikkuvuuden estotestin ja nestekromatografi-

massaspektrofotometrin (LC-MS) avulla suoritettujen emeettisen toksiinin analyysitulosten

perusteella pääteltiin, että alle 1 % bakteerikannoista tuotti emeettistä toksiinia. Yhdeksi

emeettisen toksiinin tuottajaorganismiksi osoittautui B. subtilis. Enterotoksiinin tuottokykyä ei

ilmennyt. Ruokamyrkytystapausten matalasta esiintyvyydestä huolimatta terveysriskinä

mainitaan erityisesti hitaasti jäähdytetyt, viljapohjaiset elintarvikkeet. (From ym. 2005.)

Apetroaie-Constantin ym. (2009) tutkivat 26 eri elintarvikkeesta peräisin olevia isolaatteja 94

kpl. Näytteet oli koottu vuosiväliltä 1990–2006. Niistä 76 oli eristetty

ruokamyrkytystapauksista. Osa aterioista oli tarjottu kypsänä ja osa raakana, osa kylminä ja osa

lämpimänä. Kahdesta ruokamyrkytystapauksesta peräisin olevat kuusi isolaattia, 6 % kaikista,

osoittautui lämpöresistentteja lipopeptidejä amylosiinia sekä surfaktiinia sekä aerobisesti että

anaerobisesti tuottaviksi Bacillus -bakteerikannaksi. Viisi niistä luokiteltiin B. subtilis- ja yksi

B. mojavensis -bakteerikannaksi. Yksi amylosiinia tuottanut B. subtilis -bakteerikanta oli

peräisin Yhdistyneiden Kuningaskuntien alueelta valmisbroileriateriasta, ja se oli aiheuttanut

nauttijalleen oksennus- ja ripulioireita. Viisi ruokamyrkytystä oli peräisin Suomessa myydyistä

kurpitsa-curry -aterioista. Näistä neljän aiheutti B. subtilis ja yhden sen lähisukulainen B.

mojavensis. Valmisbroileriateriasta eristetyn B. subtilis -bakteerikannan ja yhdestä kurpitsa-

curry -ateriasta eristetyn B. mojavensis -bakteerikannan todettiin metaboloivan sekä surfaktiinia

että amylosiinia, jonka osuus oli suurempi. Amylosiini todettiin sytotoksiseksi sekä Caco-2

-solulinjan tulosten että siittiöiden liikkuvuuden estotestin perusteella, ja sen havaittiin toimivan

toksiinina hyvin samankaltaisesti kuin ituriiniryhmän lipopeptidit, kuten likenysiini.

26

Myös B. subtilis -ryhmään kuuluva B. pumilus on aiheuttanut ruokamyrkytyksiä. Oirekuva on

samankaltainen kuin B. subtilis -bakteerikantojen aiheuttamissa infektioissa. Tyypillinen

inkubaatioaika on 2–11 tuntia ja oireita ovat raju oksentaminen ja huimaus sekä vatsakivut ja

ripuli (Kramer & Gilbert 1989). Kolmen kiinalaisessa ravintolassa aterioineen asiakkaan on

Fromin ym. (2007 b) mukaan raportoitu saaneen ruokamyrkytyksen B. pumilus -bakteerikannan

tuottamasta lipopeptidi pumilasidiinista. Akuutit oireet ilmaantuivat jo aterian aikana.

Muutamia tunteja myöhemmin potilaat saivat vatsakramppeja ja ripulin, mitkä kestivät useita

viikkoja. Ruokamyrkytyksen lähteeksi jäljitettiin edellisenä päivänä keitetty ja tarjoilupäivänä

uudelleen kuumennettu riisi. Esikypsennetty riisi oli säilytetty yli yön yli +10 oC:ssa ennen

kuumennusta ja tarjoilua. Riisistä eristettiin B. pumilus -soluja noin 105 pmy/ml. Solujen

todettiin tuottaneen sytotoksista pumilasidiini A:ta. Mikrobit tuottivat sitä koko testatulla

lämpötila-alueella, 10–37 oC:ssa. Pitkä säilytysaika +10 oC:ssa mahdollisti itiöiden

germinoitumisen, mikrobien lisääntymisen ja toksiinituotannon. Organismi kasvoi myös

anaerobisesti +37 oC:ssa, mikä on yhdenmukainen havainto pitkäkestoisten suolisto-oireiden

kanssa. Potilaiden oireet korreloivat suoraan nautitun riisimäärän kanssa.

2.6. Bacillus subtilis -bakteerikantojen tuottamat lipopeptidit

Eri Bacillus -alalajit kykenevät tuottamaan yli 30 erilaista amfipaattista lipopeptidiä. Niissä on

hydrofiilinen aminohappopää, jonka aminohapot ovat vaihtelevasti D- ja L -konfiguraatioissa

peptidisidoksin muodostaen syklisen rakenteen. Aminohapporenkaaseen on liittynyt

hydrofobinen rasvahappoketju. Lipopeptidit eroavat toisistaan toisinaan hyvinkin vähän

aminohappotähteiden lukumäärän ja konfiguraatioiden, aminohappoketjun rakenteen,

rasvahappoketjun pituuden sekä sen sisältämien hydroksyyli- ja metyyliryhmien suhteen.

Bacillus -bakteerien tuottamat lipopeptidit voidaan jakaa neljään ryhmään: surfaktiineihin,

fengysiineihin, ituriineihin ja kurstakiineihin (taulukko 1). Lipopeptidien tuottokyky on

toisaalta hyvin kantaspesifistä, toisaalta sama bakteerikanta voi tuottaa useita eri lipopeptidejä,

ja vaikutukset ovat usein synergistisiä. Mikrobin kasvuolosuhteet, kuten esimerkiksi

fermentointiprosessin aikana käytetty typenlähde, mediumin pH ja muut vaikuttavat siihen,

mitä lipopeptidiä / lipopeptidejä kulloinkin tuotetaan. (Ahimou ym. 2000, Volpon ym. 2000,

Wei ym. 2001, Ongena ja Jacques 2008, Jacques 2011.)

27

Taulukko 1. Bacillus -bakteerien tuottamat lipopeptidit (Jacques 2011).

Surfaktiiniryhmä Fengysiiniryhmä Ituriiniryhmä Kurstakiiniryhmä

Surfaktiini Fengysiini A Ituriini A Kurstakiini

Pumilasidiini Fengysiini B Ituriini AL

Likenysiini Plipastatiini A Ituriini C

Esperiini Plipastatiini B Mykosubtiliini

Bamylosiini A Basillomysiini D

Basillomysiini F

Basillomysiini L tai Lc

B. subtilis on hyvin tunnettu syklisten lipopeptidien tuottaja. Lipopeptidit ovat mikrobien

sekundäärimetaboliitteja. Ne syntetoidaan ei-ribosomaalisten peptidisyntetaasien välityksellä

(nonribosomally synthesized peptides, NRPS) tai polyketidisyntetaasien ja ei-ribosomaalisten

peptidisyntetaasien hybridin (PKS/NRPS) avulla. Syntetaasit ovat useista toiminnallisista

yksiköistä, moduuleista, koostuvia megaentsyymejä, jotka katalysoivat erilaisia peptidi- tai

polyketiditransformaatioon johtavia reaktioita. Jokainen moduuli on jaettu useisiin

katalyyttisiin domeeneihin, jotka vastaavat kustakin biokemiallisesta reaktiosta. Tyypillinen

NRPS-moduuli rakentuu tavallisesti noin tuhannesta aminohappotähteestä. Moduulit sisältävät

ne operonit, joilla koodataan kunkin lipopeptidin synteesiä katalysoivat entsyymit. Kukin

moduuli on vastuussa yhden aminohapon synteesistä. NRPS-biosynteesimekanismeihin

vaikuttaa kulloisenkin mediumin koostumus, mikä vaikuttaa tuotetun lipopeptidin lopulliseen

aminohappojärjestykseen. (Ongena ja Jacques 2008.)

Lipopeptidit toimivat useiden patogeenien antagonisteina ihmisillä, eläimillä ja kasveilla

vaikeuttamalla patogeenin pääsyä soluun muuttamalla solukalvon läpäisevyyttä sekä

kolonisoimalla kasvien juurimikrobistoa tai ihmisen suolistoflooraa (Mongkolthanaruk 2012).

Sykliset lipopeptidit ovat erittäin stabiileja ja kestävät hyvin kuumentamista ja pH-muutoksia

aktiivisuuden heikentymättä (Salkinoja-Salonen ym. 1999, Cao ym. 2009).

Tässä tutkielmassa on keskitytty B. subtilis -bakteerikantojen tuottamaan surfaktiiniryhmän

surfaktiineihin, fengysiiniryhmän fengysiineihin ja plipastatiineihin sekä ituriiniryhmän

mykosubtiliiniin.

28

2.6.1. Surfaktiinit

Surfaktiiniryhmään sisältyvästä noin 20 eri lipopeptidistä B. subtilis -bakteerin tuottama

surfaktiinit ovat tutkituimpia (Duitman 2003). Rakenteeltaan surfaktiini on syklinen

heptapeptidi, jonka kiraaliseen LLDLLDL-sekvenssiin on laktonisidoksella liittynyt 13–15 hiilen

pituinen β-hydroksirasvahappoketju (kuva 1). Surfaktiinit ovat rakenteeltaan hyvin

samankaltaisia kuin B. licheniformis -bakteerikantojen tuottama likenysiini A ja tunnetun

patogeenin, B. cereus -bakteerin tuottama kereulidi sekä B. pumilus -bakteerikantojen tuottama

pumilasidiini. (Mikkola ym. 2000.)

Kuva 1. Surfaktiini C15 -molekyylirakenne. Lähde: Liu ym. 2012.

Surfaktiinit jaetaan kuuteen muotoon, A-F, asemissa 2, 4 ja 7 esiintyviin alifaattisiin ryhmiin

kuuluvien aminohappotähteiden perusteella (kuva 2). Asemissa esiintyy valiinia, leusiinia,

isoleusiinia tai alaniinia L-konfiguraatiossa. Surfaktiinien molekyylipaino on 1050 ± 100 u.

(Arima ym. 1968, Oka ym. 1993.)

HT─CH─CH2─CO─L-Glu─L-X1─D-Leu─L-X2─L-Asp─D-Leu─L-X3─O

Kuva 2. Surfaktiinimolekyylin peptidisekvenssi. Asemassa X1 ja X3 esiintyy valiinia, leusiinia

tai isoleusiinia. Asemassa X2 puolestaan esiintyy alaniinia, valiinia, leusiinia tai isoleusiinia.

Lähde: Ongena ja Jacques 2008.

29

2.6.1.1. Synteesi

Surfaktiinien synteesiä säätelevät useat tekijät. Syntetaasia koodaa kuvassa 3 esitetty srfA

-operoni, joka koostuu neljästä lineaarisesta osasta. Sen ensimmäiset osat, srfA-A ja srfA-B,

rakentuvat kumpikin kolmesta moduulista, jonka ensimmäisen moduulin geenituotteen

aktivoituun aminohappoon rasvahappoketju lisätään. srfA-C sisältää puolestaan yhden

moduulin. Viimeiseen, srfA-D -geeniin, johon ei kokonaista moduulia sisälly, on koodattu

biosynteesin aloitusta stimuloivan entsyymin synteesi. (Ongena ja Jacques 2008)

C A P

C

P C A

P

C

P C A

P

C

P E

C A

P

C

P C A

P

C

P C A

P

C

P E

C A

P

C

P

T

e

Te/

At

Glu Leu Leu Val Asp Leu Leu

srfA-A srfA-B srfA-C srfA-D

Kuva 3. Surfaktiinioperoni srfA. Kolme surfaktiinin synteesiä koodaavaa moduulia ovat srfA-

A, srfA-B ja srfA-C. Kaksi ensimmäistä moduulia rakentuvat kolmesta osasta, ja niissä A-

domeeni vastaa adenylaatin aktivaatiosta, PCP-domeeni peptidyylin kuljettajaproteiinista ja C

peptidisidoksen muodostumisesta. Kolmas moduuli on yksiosainen, ja siinä esiintyvä Te

koodaa tioesterisidosten ja usein syklisen rakenteen muodostumisesta. Substraatin

epimerisaatiosta vastaa E-kirjaimella kuvattu domeeni. Neljännen osan muodostava srfA-D

-geeni koodaa tioesteraasi/asyylitransferaasia (Te/At) ja biosynteesin aloitusta. Lähde: Ongena

ja Jacques 2008.

Peptidin biosynteesiin osallistuvat myös erilaiset säätelytekijät kuten 4´-

fosfopanteteinyylitransferaasia koodaava sfp -geeni, itiön muodostusta säätelevät proteiinit

SpoOA ja AbrB sekä srfA -operonin transkriptionaalisen aktivaattorin, comA –geenin tuottama

operonin promoottorialueeseen sitoutuva säätelytekijä ComA (Strauch ym. 1990, McLoon ym.

2011). Synteesin alkuvaiheessa merkityksellisiä ovat myös ComP- ja ComQ -proteiinit

(Nakano ym. 1991, Marahiel ym. 1993).

30

2.6.1.2. Ominaisuudet ja käyttö

Surfaktiinia on hyödynnetty teollisuudessa kymmeniä vuosia. Molekyyli karakterisoitiin

osittain jo noin 50 vuotta sitten (Arima ym. 1968). Surfaktiinimolekyylit ilmentävät liuoksessa

tyypillistä hevosen satulan muotoa, mikä saa aikaan niiden laaja-alaisen biologisen

aktiivisuuden ja tekee ne hyvin kiinnostavaksi sekä teollisuuden sovelluksiin että akateemisiin

tutkimuksiin (Peypoux ym. 1999). Peptidin korkeaa bioaktiivisuutta lisää myös

aminohapporenkaan ja rasvahappoketjun yhdistävä laktonisidos (Mikkola ym. 2000).

Surfaktiini on tunnettu erityisesti voimakkaana biosurfaktanttina, joka kykenee vähentämään

veden pintajännitystä jo 20 µM pitoisuudessa 72 mN/m:sta 27 mN/m:iin. Lisäksi sillä on hyvät

emulsifikaatio- ja vaahdottamisominaisuudet. (Peypoux ym. 1999.)

Fermentaation aikana tapahtuvassa B. subtilis -bakteerikantojen surfaktiinituotannossa

tehokkaita hiilenlähteitä ovat glukoosi, sakkaroosi ja fruktoosi. Jatkuvassa viljelmätuotannossa

määrää lisäävät myös rauta ja manganaasi. (Peypoux ym. 1999, Schallmey ym. 2004.)

Elintarviketeollisuudessa mikrobien tuottaman surfaktiinin ominaisuuksia hyödynnetään

probioottituotannossa. Surfaktiini toimii signaalimolekyylinä, joka vahvistaa biofilmin

rakennetta ja lisää näin B. subtilis -bakteerin sietokykyä ruoansulatuskanavan haastavissa

olosuhteissa (Branda ym. 2001). Ahimoun (2000) mukaan surfaktiinin tuotanto parantaa myös

organismin adheesiokykyä, sillä sen molekyylit kykenevät adsorboitumaan pinnoille ja

muokkaamaan niiden hydrofobisuutta. Hydrofobisuus vaihtelee kuitenkin bakteerikannan

mukaan.

Ravinnossa esiintyvän surfaktiinin vaikutukset ihmiselle ovat kaksijakoisia. Yhtäältä

surfaktiini laskee veren LDL-kolesterolipitoisuutta inhiboimalla verihyytymien

muodostumista, tuhoaa suolistopatogeenejä sekä kasvaimia in vitro (Oka ym. 1983, Schallmey

ym. 2004). Sen on myös havaittu tehoavan lukuisia ihmiselle ja eläimille haitallisia tai

kiusallisia sairauksia, kuten eri herpesinfektioita, suu- ja sorkkatautia sekä suolistotulehduksia,

aiheuttavia vaipallisia DNA- ja RNA-viruksia vastaan. Teho perustunee surfaktiinin kykyyn

tuhota virusvaippa muodostamalla solumembraanin lipidikerrokseen kationikanavia ja näin

invasoitua virukseen.

31

Invaasio aiheuttaa kuitenkin ristiriitaa surfaktiinin hyötyä arvioitaessa, sillä havaittu

hemolyyttisyys ja sytotoksisuus heikentää käyttösovellusten tuomia etuja ihmisten kohdalla.

Lisäksi teho on heikko runsaasti proteiinia sisältävissä elintarvikkeissa kuten soijatuotteissa.

(Vollenbroich ym. 1997b, Hong ym. 2008.)

Surfaktiini on vahvasti antiviraalinen ja kohtalaisen antibakteerinen. Sen kykyä erottaa

Mycoplasma -bakteerin solut muista bakteereista on hyödynnetty farmaseuttisten tuotteiden

laadun parantamisessa (Nissen ym. 1997, Vollenbroich ym. 1997a). Sen on havaittu myös

inhiboivan B. subtilis -bakteerikantojen tuottamaa ruoansulatusentsyymiä, virheellisesti

aktivoituessaan haimatulehdusta aiheuttavaa fosfolipaasi A2:a, ja toimivan näin tulehdusta

hillitsevänä tekijänä (Kim ym. 1998). Surfaktiinivalmisteiden potentiaalisiksi funktioiksi on

harkittu myös elinsiirtojen hylkimisreaktioiden estoa ja autoimmuunisairauksien hoitoa, sillä se

heikentää fagosytoosia inhiboimalla makrofaagien toimintaa suoraan ja välillisesti säätelevien

proteiinien toimintaa (Park ja Kim 2009).

Surfaktiinin on havaittu olevan myös tehokas perunan ja useiden vihannesten antifungaalinen

pestisidi. Sen vaikutusmekanismi perustuu usein kasvin juuristossa elävien B. subtilis -baktee-

rien aiheuttamaan systeemisen puolustusjärjestelmän stimuloimiseen (indusoitu systeeminen

resistanssi, ISR). Surfaktiini voi saada aikaan myös erilaisia entsymaattisia muutoksia kasvin

puolustusjärjestelmän metaboliassa. Vaikutus on havaittu sekä käyttämällä suoraan

tuottajabakteerikantoja että niistä uutettua surfaktiinia kohdekasvin mukaan vaihdellen.

(Ongena ja Jacques 2008.)

Surfaktiini uutetaan usein mikrobiviljelmästä yleensä klassisilla metodeilla kuten saostamalla,

uudelleenkristallisoinnilla tai uuttamalla orgaaniseen liuottimeen. Tutkimuskäyttöön peptidiä

on uutettu myös kaksifaasiuuton, ultrasuodatuksen ja kiinteäfaasiuuton avulla. (Peypoux ym.

1999.)

2.6.2. Muut B. subtilis -ryhmän bakteerikantojen tuottamat lipopeptidit

B. subtilis -ryhmän bakteerikannat tuottavat sopivissa olosuhteissa myös muita lipopeptidejä.

Organismi kykenee tuottamaan fengysiinejä, plipastatiineja, ituriineja ja mykosubtiliinia

(Jacques 2011). Lisäksi B. subtilis ja B. amyloliquefaciens kykenevät tuottamaan sekä

basillibaktiinia että basilysiiniä eli antikapsiinia (May ym. 2002, Rajavel ym. 2009).

32

Lineaarista lipopeptidiä amylosiinia kykenee tuottamaan niiden lisäksi B. mojavensis (Mikkola

2006, Apetroiae-Constantin ym. 2009). Syklisiä lipopeptidejä ovat puolestaan likenysiini A,

jota tuottavat B. licheniformis ja B. pumilus, sekä B. pumilus -bakteerikantojen tuottama

pumilasidiini A (Duc ym. 2005).

2.6.2.1. Fengysiinit ja plipastatiinit

Suurimmat B. subtilis -bakteerin tuottamat lipopeptidit ovat dekapeptidejä: fengysiiniryhmään

luokiteltuja fengysiinejä ja hyvin samankaltaisia plipastatiineja (kuva 4a). Fengysiinin

makrolaktonirenkaan kymmenen aminohappotähdettä ovat konfiguraatiossa LDLDLDLLDL, ja

siihen on kiinnittynyt 14–18 hiilen pituinen β-hydroksirasvahappoketju, kun taas plipastatiinin

rasvahappoketju sisältää 11–13 hiiliatomia (Vanittanakom ym. 1986, Duitman 2003).

Fengysiinit ja plipastatiinit eroavat toisistaan myös aminohapporenkaiden asemassa 3

sijaitsevien tyriinitähteiden stereokemian osalta (kuva 4b). Sekä fengysiinejä että plipastatiineja

on kahta muotoa, A ja B, jotka luokitellaan aseman 6 aminohapon perusteella: A-muodossa se

on D-alaniini ja B-muodossa D-valiini. (Vanittanakom ym. 1986, Volpon ym. 2000)

4a

Fengysiini A L-Glu–D-Orn–D-Tyr–D-aThr–L-Glu–D-Ala-L-Pro–L-Gln–L-Tyr–L-Ile

Fengysiini B L-Glu–D-Orn–D-Tyr–D-aThr–L-Glu–D-Val-L-Pro–L-Gln–L-Tyr–L-Ile

Plipastatiini A L-Glu–D-Orn–L-Tyr–D-aThr–L-Glu–D-Ala-L-Pro–L-Gln–L-Tyr–L-Ile

Plipastatiini B L-Glu–D-Orn–L-Tyr–D-aThr–L-Glu–D-Val-L-Pro–L-Gln–L-Tyr–L-Ile

4b

Kuva 4. Fengysiini A -molekyylin rakenne osakuvassa 4a sekä fengysiienien ja plipastatiinien

aminohapposekvenssit osakuvassa 4b. Lähteet: NaPDoS 2011, Ongena ja Jacques 2008.

33

Fengysiini syntetisoidaan fen -operonilla koodattavien NRPS-syntetaasein. Operoni koostuu

viidestä geenistä, fenA-E (Ongena ja Jacques 2008). Plipastatiinin biosynteesiin vaaditaan viisi

avointa lukuraamia sisältävä syntetaasioperoni ppsA-E (kutsuttu myös pli -operoniksi) sekä

geenit degQ ja sfp (Tsuge ym. 1999, Ongena ja Jacques 2008). Plipastatiinia B. subtilis

-bakteerikannat kykenevät syntetoimaan L-glutamaatin ollessa ainoa typenlähde (Volpon ym.

2000).

Sekä fengysiinien että plipastatiinien ominaisuuksista tunnetuimpia ovat antibakteerisuus ja

antifungaalisuus. Useiden entsyymien, kuten immuunipuolustukselle merkityksellisen, mutta

toksisen fosfolipaasi A2:n inhiboiva vaikutus on myös molemmille ominaista. Fengysiinit ja

plipastatiinit vähentävät sitä kautta tulehduksia, akuutteja yliherkkyysreaktioita ja

verisuonitukoksia. (Vanittanakom ym. 1986, Peypoux 1999, Volpon ym. 2000.)

Fengysiinillä on havaittu olevan myös antikarsinogeenisiä vaikutuksia, ja siitä valmistetulle

syöpälääkevalmisteelle onkin jätetty patenttihakemus (Vanittanakom ym. 1986, Yin ym. 2013).

Viljelykasvien taudinkestävyyden parantamiseen fengysiinistä on merkittävää hyötyä. Paras

teho on saavutettu käsittelemällä kasveja fengysiiniuutteella, joka muuttaa kasvin

puolustusjärjestelmään liittyvää metaboliaa (Ongena ja Jacques 2008). Elintarvikkeissa

esiintyvän fengysiinin haittana on kuitenkin sen hemolyyttisyys, joskin heikohko

(Vanittanakom ym. 1986).

2.6.2.2. Mykosubtiliini

Ituriiniryhmään kuuluva mykosubtiliini on kuvassa 5 esitetty syklinen heptapeptidi, jonka

aminohappopään α-aminohapoista on muodostunut pysyvä kiraalinen LDDLLDL-sekvenssi,

johon on liittynyt 14–17 hiilen pituinen alifaattinen β-aminorasvahappoketju (Peypoux ym.

1986, Maget-Dana ja Peypoux 1994).

34

5a

Mykosubtiliini L-Asn–D-Tyr–D-Asn–L-Gln–L-Pro–D-Ser–L-Asn

5b

Kuva 5. Mykosubtiliinin rakenne (5a) ja aminohapposekvenssi (5b). Lähteet: Ongena ja

Jacques 2008, NaPDoS 2011.

Mykosubtiliinisyntetaasin muodostavat proteiinit MycA, MycB ja MycC. Ne syntetoidaan

PKS-NRPS -hybridikompleksin avulla. Syntetaasia koodaava hybridioperoni mycS koostuu

neljästä avoimesta lukuraamista: fenF ja mycA-C. Myc-geenit vastaavat aminohappotähteiden

yhdistämisestä, ja fenF koodaa malonyyli-CoA -transasylaasia. Operonin insertionaalinen

mutageneesi saa aikaan mykosubtiliini-negatiivisen fenotyypin. Sponaanistikin tapahtuva

mahdollinen profagi-insertio voi aiheuttaa mutaatioita ja peittää säätelyelementtien

koodisekvenssejä. Tämä koskee myös mykosubtiliinia hyvin tuottavaa referenssikantaa B.

subtilis ATCC 6633. Fengysiiniä ja mykosubtiliinia syntetoivat operonit kykenevät siirtymään

niitä tuottavien bakteerikantojen välillä. (Duitman 1999, 2003; Ongena ja Jacques 2008.)

Mykosubtiliinin on todettu olevan hemolyyttinen, antibakteerinen ja vahvasti antifungaalinen.

Sen vaikutusta tehostaa kyky lisätä kohdesolun solukalvon huokoisuutta. (Maget-Dana ja

Peypoux 1994, Duitman 2003)

35

3. NATON ELINTARVIKETURVALLISUUSARVIOINTI

Naton fermentoinnissa käytettävät B. subtilis -klusterin bakteerikannat sisältyvät EFSA:n

elintarviketurvallisiksi arvioimien mikrobien nk. QPS-listalle (Qualified presumption of

safety). Aasialaista perinneruokaa nattoa nautitaan myös Euroopassa. Koska Euroopan

elintarviketurvallisuusviranomainen EFSA katsoo niiden lisäämisen elintarvikeketjuun

vaativan toksikologista arviointia ja virulenssitekijöiden esiintyvyyden seurantaa sekä

suosittelee käytetyn B. subtilis -bakteerikannan identifiointia (EFSA 2007, 2013; Wang ym.

2007), myös B. subtilis var. natto -bakteerikantojen käytön toksikologinen seuranta on

perusteltua, vaikkei elintarviketurvallisuusarviointia Euroopan ulkopuolella edellytetäkään.

Arvioinnin perusteena on B. subtilis -bakteerikantojen ominaisuuksien perusteella nautittujen

mikrobien kokonaispitoisuus, niiden tuottamien toksiinien, etenkin surfaktiinin tuottokyky ja

sytotoksisuus sekä suolistokolonisaatio.

3.1. B. subtilis var. natto -bakteerikantojen käyttöturvallisuus

Bacillus -bakteerien muodostaman potentiaalisen infektioriskin muodostaa niiden yleisyys,

nopea itiöityvyys ja siten elinkyvyn säilyminen kuivissa, kuumissa ja ravinneköyhissä

olosuhteissa sekä kyky mahdollisen elintarvikekontaminaation jälkeen lisääntyä kypsennetyssä

ateriassa ja tuottaa sopivissa olosuhteissa toksiineja (de Boer ja Diderichsen 1991, Apetroaie-

Constantin ym. 2009). Lisäksi toksiinit ovat lämpöresistenttejä, joten ne eivät tuhoudu

kuumentamalla elintarviketta jälkeenpäin. Nattoaterioissa esiintyvien B. subtilis var. natto

-bakteerikantojen ei tällä hetkellä tiedetä aiheuttaneen infektioita (von Wright, Itä-Suomen

Yliopisto, suullinen tiedonanto 1.10. 2013).

3.1.1. Nattoaterioiden B. subtilis var. natto -kokonaispitoisuus

Likimäärin 75 % japanilaista syö nattoa vähintään kerran viikossa ja puolet heistä keskimäärin

joka kolmas päivä (Murooka ja Yamshita 2008). Ikedan ym. (2006) mukaan japanilainen nainen

nauttii nattoa tyypillisesti yhdestä kahteen annosta eli 56–80 grammaa viikossa. Lopullisessa

tuotteessa B. subtilis -pitoisuus on korkea, 108 - 1010 pmy/g fermentointiolosuhteista riippuen,

jolloin nautittu mikrobimäärä on noin 6×109 – 8×1011 pmy per annos(Wei ym. 2001).

36

Laskennallisesti kolmen neljänneksen japanilaisen pitkäaikainen B. subtilis natto -saanto on siis

3×109 – 4×1010 pmy vuodessa, ja lähes 40 prosentin 7×109 – 1×1012 pmy vuodessa.

Yksilötasolla saantoa voi nostaa hieman mahdollinen itiöprobioottien nauttiminen sekä naton

käyttäminen aromaattisena ainesosana muissa aterioissa ja kastikkeissa (Wei ym. 2001). Tämä

tuo hieman epätarkkuutta nautittavien mikrobimäärien arviointiin etenkin selvitettäessä saantoa

yksittäisellä kyselyllä.

Infektiivinen B. subtilis -pitoisuus immuniteetiltaan heikentyneille henkilöille on vähintään 105

pmy/ml ja terveille vähintään 107 pmy/ml (Griffiths 1990, Oggioni ym. 1998, Logan 2011).

Näin ollen ateriassa esiintyvä korkean mikrobipitoisuuden voidaan epäillä aiheuttavan

potentiaalisen ruokamyrkytysriskin etenkin immunosuppressiivisille henkilöille, jotka nauttivat

vähintään kohtalaisen kokoisen aterian, mikäli organismin toksiinintuotto on merkittävää.

Japanin kansalaiset pitävät nattoa arkisena, terveellisenä ja turvallisena elintarvikkeena jo

pienille lapsille. Suhtautumista kuvastaa esimerkiksi se, että B. subtilis var. natto -mikrobi-

peräistä, fermentoitua K2-vitamiinivalmistetta annettiin Nishiguchin ym. (2002) tutkimuksessa

jo vastasyntyneille. EFSA on katsonut, että kyseinen K2-vitamiiniöljyvalmisteen nauttiminen

on turvallista myös imeväisille, ja sitä voidaan lisätä elintarvikkeisiin, myös vauvan ruokaan ja

äidinmaidonvastikkeeseen (EFSA 2008). Viitteitä sen toksisuudesta ei ole tullut esiin.

Valmisteen koe-eläimille haitattomaksi NOAEL-arvoksi (No Observed Adverse Effect Level)

on arvioitu 20 mg/kg/vrk (Ikeda ym. 2006).

Ateriakokonaisuudellakin on oma merkityksensä infektioriskin arvioinnissa. Nattoateria

nautitaan useimmin riisin kera. Aasiassa yleinen tapa on esikypsentää suuri määrä riisiä ja

säilyttää se huoneenlämmössä. Tällä pyritään minimoimaan jäähdyttämisen aikana tapahtuvaa

kokkaroitumista. Riisissä luontaisesti esiintyvät Bacillus -bakteerien itiöt voivat säilyä

keittämisen ajan ja germinoitua lämpötilan laskiessa. Vegetatiiviset Bacillus -solut lisääntyvät

hyvin nopeasti juuri hiilihydraattipitoisessa mediumissa ja kykenevät tuottamaan hyvinkin

suuria pitoisuuksia toksisia lipopeptidejä. Myös naton fermentaatioprosessin

jäähdytysvaiheessa toksiinintuotanto on mahdollista. Näin ollen yksilön nauttimien mikrobien

ja tuotettujen toksiinien kokonaismäärä voi olla hyvinkin suuri. Vastustuskyvyltään heikkojen

henkilöiden riski saada ruokamyrkytys nattoateriasta voi näin kohota. (From ym. 2007b, Logan

2011.)

37

Kaneki ym. (2001) vertasivat naton kulutusta Japanin eri hallintoalueiden välillä. Erityisesti Itä-

Japanissa nattoa nautitaan tutkijoiden mukaan runsaasti arvioituna siihen käytettävän

vuosittaisen rahamäärän perusteella, joka on 2,5-kertainen Länsi-Japaniin verrattuna.

Tutkimuksessa mitattiin seerumin K2-vitamiinipitoisuus kahdeksalta vaihdevuosi-iän

ohittaneelta naiselta heidän nautittuaan yksi 80 gramman natto-ateria. B. subtilis var. natto on

tehokas K2-vitamiinin tuottajamikrobi. Nattoa ei syöty kahteen viikkoon ennen ja jälkeen

tutkimuksen, ja verinäytteet otettiin ennen tutkimusta sekä 1, 3, 7 ja 14 vrk aterian nauttimisen

jälkeen. Seuraavana päivänä seerumin K2-vitamiinipitoisuus oli kohonnut lähes 20-kertaiseksi,

kolmantena tutkimuspäivänä se oli vielä 8-kertainen ja 14 vuorokauden kuluttuakin

kaksinkertainen lähtötilanteeseen verrattuna. Tutkimus kuvasi mikrobin tehokasta

lisääntymistä ihmisen elimistössä.

Epidemiologisen kohorttitutkimuksen Japanissa suorittivat Ikeda ym. (2006). Tutkimuksessa

seurattiin ravinnon K2-vitamiinipitoisuuden ja osteoporoosiin sairastumisen välistä yhteyttä.

Sen ohessa saatiin tietoa myös nautituista nattomääristä. Koehenkilöt olivat 20–79 -vuotiaita

naisia (n = 944), jotka jaoteltiin iän mukaan pre- ja postmenopausaalisiin ryhmiin. Seuranta-

aika oli 3 vuotta. Tutkimuksessa määriteltiin japanilaisen aikuisen nauttimaksi kerta-

annokseksi 40 g nattoa, minkä katsottiin edustavan tavanomaista määrää. Nautittava nattomäärä

arvioitiin laskemalla nautittujen 40 gramman nattopakkausten lukumäärä viikossa.

Premenopausaalisista koehenkilöistä 30 % söi 1-2 pakkausta eli 40–80 g viikossa, 22 % yli 2

pakkausta eli yli 80 g viikossa ja lähes puolet, 48 % ei lainkaan. Postmenopausaalisista

koehenkilöistä 36 % söi nattoa 40–80 g viikossa, 15 % yli 80 g viikossa ja 49 % ei lainkaan.

Keskimäärin premenopausaaliset naiset söivät nattoa lähtötilanteessa 1,4±1,8 pakkausta eli

56±72 grammaa viikossa ja seurannan aikana 1,3±1,7 pakkausta eli 52±68 grammaa viikossa.

Postmenopausaaliset söivät sitä aluksi 2,0±2,6 eli 80±104 grammaa ja seurannassa 2,1±2,7

pakkausta eli 84±108 grammaa viikossa. Iäkkäämmät naiset söivät siis nattoa lähtökohtaisesti

enemmän kuin nuoremmat. Tutkimustulokset vahvistivat aiempia tuloksia, joiden mukaan

naton nauttiminen voi suojata osteoporoosilta lisäten luuntiheyttä vaikkakin heikommin kuin

kliininen K2-vitamiinivalmiste, jonka K2-vitamiinipitoisuus on lähes satakertainen nattoon

nähden. Tutkimuksen oleellinen virhelähde on nautittujen ateriamäärien laskennan

epätarkkuus, sillä arvio perustui kyselytutkimuksen tuloksiin, sekä suuri keskihajonta. (Ikeda

ym. 2006)

38

3.1.2. Probioottien käyttöturvallisuus

Elintarvikeketjuun päätyvien probioottien arviointiin on laadittu kansainväliset ohjeet

(FAO/WHO 2002). Ne sisältävät muun muassa käytettävän bakteerikannan identifioinnin,

turvallisuusarvioinnin, toiminnallisten ominaisuuksien selvittämisen ja ohjeita tuotteen

ominaisuuksien informoinnista asiakkaalle.

Probioottien turvallisuutta arvioitaessa on merkityksellistä tuotteessa käytetyn bakteerikannan

huolellinen sekvenointi, sillä valmisteen sisältämä mikrobikoostumus saattaa poiketa

tuoteselosteessa ilmoitetusta ja luoda harhakuvia mikrobikannan toksisuudesta. Esimerkiksi

valmistajan mukaan B. subtilis -bakteerikannan itiöitä sisältävän probioottivalmisteen oli

todettu aiheuttaneen 1990-luvulla suolistotulehduksen 15-vuotiaalle munuaissairaalle lapselle

(Wallet ym. 1996). Spinosan ym. (2000) suorittamat sekvenoinnit sekä probiootti- että

infektioisolaateista osoittivat, ettei valmiste sisältänytkään väitettyä B. subtilis- vaan B. cereus

-bakteerikannalle läheistä sukua olevaa B. thuringiensis -bakteerikantaa. Samoin Greenin ym.

vuonna 1999 julkaistussa tutkimuksessa korostui huolellisen karakterisoinnin merkitys

turvallisuusarvioinnissa. Kahden yleisesti tunnetun probioottivalmisteen väitettiin

todenvastaisesti sisältävän B. subtilis -bakteerikantojen itiöitä, mutta ne olivatkin

todennäköisimmin B. pumilus- ja B. alcalophilus -bakteerikantojen itiöitä.

Akuutti- ja kroonisen toksisuustutkimuksen vähäisyyden lisäksi antimikrobisia aineita

tuottavien probioottien lääkkeenomaisen käytön on epäilty olevan riskialtista mahdollisen

antibioottiresistenttiyden leviämisen vuoksi. Erityisesti B. subtilis var. natto -bakteerikantojen

runsaasti tuottaman surfaktiinin aikaansaamaa antibioottiresistenttiyttä on pohdittu Hongin ym.

(2009) suorittaman tutkimuksen tulosten tarkastelussa. Antibioottiresistenttiyttä ei kuitenkaan

ole tutkimuksissa ilmennyt. Probioottien turvallisuuden arvioinnin ongelmana on Hongin ym.

(2009) mukaan myös akuuttitutkimuksen osalta LD50:n määrittämisen epätarkkuus.

Vaikka B. subtilis var. natto -itiövalmisteen käyttö tuotantoeläinten rehulisäaineena on arvioitu

turvalliseksi sekä tuotantoeläimille että niitä nauttiville ihmisille, tieto pitkäaikaisvaikutuksista

ihmisen elimistöön ja terveydelle on suppeaa. Tutkimukset osoittavat organismin muuttavan

eläinten suoliston mikrobikoostumusta, mutta tulosten perusteella on mahdotonta tehdä

päätelmiä käytön pitkäaikaisvaikutuksista. (Sun ym. 2011; Peng ym. 2012; Euroopan komissio

2013 a,b; Song ym. 2014.)

39

3.2. B. subtilis var. natto -bakteerikantojen tuottamien toksiinien aiheuttamat terveysriskit

B. subtilis -bakteerikantojen ei-patogeenisuus on kyseenalaistettu, ja ne voitaneenkin luokitella

opportunistisiksi patogeeneiksi. B. subtilis -bakteerien aiheuttamien ruokamyrkytysten

matalasta esiintyvyydestä huolimatta niitä sisältävien itämaisten fermentoitujen

elintarvikkeiden turvallisuusarviointi on mikrobien toksiinien tuottokyvyn vuoksi tärkeää. On

myös huomioitava, että B. subtilis -bakteerikantojen itiöt ovat lämpöresistentimpiä kuin B.

cereus –bakteerikantojen itiöt. (Apetroaie-Constantin ym. 2009.)

Ei-hemolyyttisen B. subtilis natto ATCC 15245 -bakteerikannan genomissa ei ole havaittu

esiintyvän tunnettuja enterotoksiinien tuotantoon vaadittavia eikä sfingomyelinaasin tai

fosfolipaasi A2:n tuotantoon vaadittavia geenejä (Bhat ym. 2013). Toksisuusarviointien

tulokset viitaavat siihen, että B. subtilis -bakteerikantojen infektiivisyys voisi perustua

nautittujen solujen suuren pitoisuuden lisäksi niiden hemolyyttisyyteen ja

aineenvaihduntatuotteiden, erityisesti surfaktiinin, toksisuuteen (EFSA 2011). Koska B. subtilis

var. natto omaa edellä mainittuja ominaisuuksia, terveysriskien arviointi keskittyy niiden

tarkasteluun.

Sekä kuumentamattomat että kuumennetut B. subtilis -isolaatit ovat Beattien ja Williamsin

vuonna 1999 ilmestyneessä tutkimuksessa osoittautuneet CHO-solulinjalla (Chinese Hamster

Ovarios) sytotoksisiksi. Hongin ym. (2008) suorittamassa tutkimuksessa B. subtilis var. natto

-bakteerikannan tuottama surfaktiini puolestaan osoittautui toksiseksi ihmisten Caco-2-, Hep-

2- ja HT29-16E -soluille. Organismi myös invasoitui hyvin epiteelisoluihin. Invaasio Hep-2-

soluihin oli merkitsevästi voimakkaampaa kuin tunnetusti hyvin invasoituvalla Listeria

monocytogenes -bakteerikannalla, mikä voisi Hongin ym. mukaan selittyä B. subtilis var. natto

-bakteerikannan surfaktiinituotannolla surfaktiinin rikkoessa epiteelisolun

fosfolipidimembraanin. Altistuksessa käytetty mikrobipitoisuus oli 107 – 108 pmy/ml. Marsuilla

ja kaniineilla suoritetut akuuttia ja subkroonista toksisuutta in vivo arvioivat koetulokset olivat

negatiivisia. Akuutin toksisuuden arviointikriteereinä käytettiin ruokahalun, painon ja

infektioherkkyyden muutoksia sekä kudosten patologisia muutoksia. Lisättäessä B. subtilis var.

natto -organismin itiöitä päivittäin 30 vuorokauden ajan kaniinien (n=6) rehuun suspensiona,

jonka itiöpitoisuus oli 109 pmy/ml, muutoksia niiden voinnissa ei havaittu.

40

Subkroonisen toksisuusarvioinnin kesto oli 17 vuorokautta ja arviointikriteereinä käytettiin

yleistä statusta, hematologisia ja kudosmorfologisia muutoksia sekä muutoksia ulosteessa. Koe

suoritettiin annostelemalla marsuille (n=10) oraalisesti ja kertaluonteisesti itiösuspensiota

pitoisuudeltaan 1012 pmy/ml. Seuranta-aika oli jaettu yhden viikon jaksoihin.

Mikkolan ym. (2000) karjun siittiöiden liikkuvuuden estotestin perusteella tekemien

havaintojen mukaan surfaktiini vaurioitti siittiöiden solukalvoa ja aktivoi akrosomireaktiota.

Puolet karjun siittiöistä lamaava surfaktiinipitoisuus (EC50) oli 5–7 µg/ml. Surfaktiinilla

havaitut sytotoksiset vaikutukset todettiin erilaisiksi kuin siittiöiden mitokondrioon

vaikuttavilla kereulidilla tai valinomysiinillä, rakenteellisesti toisilleen läheisillä toksiineilla,

joita tuottavat muut gram-positiiviset bakteerit, kuten B. cereus.

Surfaktiinin käyttöä patogeenisten, vaipallisten virusten torjunnassa tutkivat puolestaan

Vollenbroich ym. (1997b). Tutkimusten ohessa suoritettu nisäkässolujen

sytotoksisuusarvioinnin mukaan toksisuus voi vaikuttaa nisäkässolujen lisääntymiseen riittävän

suurella, yli 40 mM, pitoisuudella, kun altistusaika on vähintään kolme vuorokautta. Virusten

inaktivointi heikkeni mediumin proteiinipitoisuuden kasvaessa. Koska vaipallisten virusten

inaktivointi tapahtuu muutamassa minuutissa, pääteltiin, että surfaktiinia voidaan käyttää

paikallisessa virustentorjunnassa matalan proteiinipitoisuuden omaavissa tuotteissa, kuten

rokotteissa. Aiempien toksisuustutkimusten in vivo (hiirillä) perusteella oli asetettu surfaktiinin

LD50-arvoksi lihakseen annosteltuna 200 mg/kg ja oraalisesti 4000 mg/kg. Surfaktiinin

arvioitiin olevan niin lievästi toksinen, ettei sitä tarvitse täysin poistaa suun kautta nautittavista

tai lihakseen annosteltavista tuotteista. Toisaalta surfaktiini on hemolyyttinen ja inhiboi

fibriiniverihyytymiä, mikä on huomioitava lääketieteellisissä sovelluksissa.

Nishiguchi ym. (2002) tutkivat imettävien äitien nauttiman, B. subtilis natto -bakteerikannoilla

tuotetun K2-vitamiinivalmisteen vaikutusta vastasyntyneiden lasten K-vitamiinistatukseen.

Tutkimuksessa oli mukana 31 lasta, joiden äidit olivat saaneet 15 mg/vrk K2-vitamiinia

tabletteina kaksi viikkoa alkaen 14. päivästä synnytyksestä ja 46 lasta, joiden äidit eivät olleet

nauttineet sitä. Kaikki lapset saivat kaksi kertaa ensimmäisen elinviikkonsa aikana 2 mg K2-

vitamiinia siirappivalmisteena. Tutkimuksessa havaittiin, että K2-vitamiinisupplementtia

saaneiden äitien lasten syntymäpaino sekä äitien itsensä painoindeksi kohosi selvästi verrattuna

verrokkiryhmään. Maksatoksisuutta tai muita merkittäviä haittavaikutuksia ei havaittu, mutta

huomionarvoista on K2-vitamiinin erittyminen äidinmaitoon.

41

Avoimeksi kysymykseksi jää, erittyvätkö siihen myös organismin muut metaboliatuotteet kuten

toksiset lipopeptidit. Kuten aiemmin on mainittu, NOAEL-arvoksi arvioitiin 20 mg/kg/vrk.

Vuonna 2002 Kikuchi ja Hasumi arvioivat surfaktiini C:n LD50 -arvoksi yli 100 mg/paino-kg.

Tutkimus suoritettiin muutamalla 6-viikkoisella uroshiirellä, joille annettiin suonensisäisesti

suurina kerta-annoksina, suurimmillaan 100 mg/kg, surfaktiini C:tä. Altistuksen jälkeen eläimiä

seurattiin neljän viikon ajan. Hiirissä ei havaittu vireystilan, ruokahalun, painon tai

käyttäytymisen muutoksia. Tutkijat arvioivat tulosten ja pitkäaikaiskokemusten perusteella,

että yhdessä 30 g natto-aterian arvioitu noin 10 mg määrä surfaktiinia ei aiheuta ihmiselle

akuutteja terveyshaittoja.

Surfaktiinin C-muodon geno- ja kehitystoksisuustutkimustuloksia puolestaan julkaisivat

Hwang ym. vuonna 2008. Genotoksisuutta tutkittiin sekä in vitro bakteerireversiotestillä (nk.

Amesin testi) että in vivo luuydinmikrotumamenetelmällä. Bakteerireversiotesti suoritettiin

yhden Escherichia coli- ja neljän Salmonella typhimurium -bakteerikannan avulla. Mikrobeja

altistettiin viidellä eri surfaktiinipitoisuudella, tasavälein 312,5–5000 µg/alusta. Mutageenisuus

arvioitiin vähintään yhdellä toistolla käyttäen kolmea alustaa per annos. Tutkimuksessa

huomioitiin mahdollinen maksametabolia. Luuydinmikrotumamenetelmässä kahdeksan viikon

ikäisiä uroshiiriä ruokittiin 2000, 3000 ja 4000 mg/kg surfaktiiniliuoksilla kaksi kertaa yhden

vuorokauden ajan. Kummatkaan tutkimustulokset eivät antaneet viitteitä genotoksisuudesta.

Kehitystoksisuustutkimuksen tutkimusryhmät koostuivat kolmesta 14–15 raskaana olevasta

hiirestä sikiöineen. Testi suoritettiin raskausviikoilla 6–17. Kullekin ryhmälle annettiin

oraalisesti surfaktiini C -liuosta 125, 250 ja 500 mg päivittäin 12 vuorokauden ajan. Surfaktiinin

aiheuttamia emojen kuolemia, keskenmenoja, painoeroja tai kliinisiä oireita ei esiintynyt, kuten

ei sikiöepämuodostumiakaan tai muutoksia niiden ruumiinpainossa. Tutkimuksen perusteella

todettiin, että surfaktiini C:n kehitystoksisuudesta ei ole viitteitä pitoisuuden ollessa

korkeintaan 500 mg painokiloa kohti vuorokaudessa ja altistuksen 12 vuorokautta. (Hwang ym.

2008)

Hwang ym. (2009) tutkivat myös surfaktiini C:n subkroonisia vaikutuksia rottiin. Kuudesta

kahdeksaan viikon ikäiset rotat (n = 90) jaettiin kolmeen yhtä suureen (n = 30) ryhmään, joissa

kussakin oli puolet uroksia ja puolet naaraita. Rotat saivat oraalisesti surfaktiini C:tä 500, 1000

ja 2000 mg painokiloa kohti 28 vuorokauden ajan. Rottien fysiologista tilaa ja käyttäytymistä

tarkkailtiin päivittäin.

42

Kuolemia, myrkytyksiä, hematologisia tai käyttäytymismuutoksia ei havaittu tutkimusaikana

millään altistuspitoisuudella. Sitä vastoin korkein pitoisuus hidasti ruumiinpainon nousua

merkitsevästi molemmilla sukupuolilla. Syynä tähän oli oletettavasti surfaktiinin aiheuttamat

ohutsuolivauriot, mistä seurasi ravintoaineiden imeytymisen heikkeneminen. Myös maksa-

arvot ALP (alkaliinifosfataasi), ALAT (alaniiniaminotransferaasi) ja AST

(aspartaattiaminotransferaasi) kohosivat rotilla, joita altistettiin vähintään 1000 mg / paino-kg

surfaktiinia. ALP kohosi molemmilla pitoisuuksilla vähintään 50 %, jopa kaksinkertaisiksi.

ALAT kohosi noin 50 % ja AST vähintään kolmanneksen. Naarailla muutos oli pienempi kuin

uroksilla. Arvojen nousun aiheuttajaksi epäiltiin maksalaskimoissa esiintynyttä nekroosia.

Maksan massakin oli merkitsevästi suurempi vähintään 1000 mg/paino-kg saaneilla ryhmillä,

neljänneksen uroksilla ja viidenneksen naarailla. Tutkimuksen perusteella tehtiin päätelmä, että

toistuvat yli 1000 mg/paino-kg pitoisuudet surfaktiini C:tä voivat aiheuttaa maksakudokseen

rakenteellisia ja toiminnallisia muutoksia ollen näin maksatoksinen. Tutkimuksen perusteella

arvioitiin surfaktiinin NOAEL-tasoksi alle 500 mg/kg 28 vuorokauden altistusajalla.

Sytotoksisuusarvioinnissa on huomioitava myös Hwangin ym. (2009) mukaan surfaktiinilla

aiemmin havaitut veritulppien muodostumista estävät, fibrinolyyttiset ja antikoagulanttiset,

ominaisuudet in vitro tekevät siitä potentiaalisesti veritoksisen. Kyseiset ominaisuudet

vaikuttavat osaltaan systeemisten ja/tai aivoverenvuotojen syntyyn.

Tarkasteltaessa surfaktiinin sytotoksisuutta maksa- ja munuaissoluille (brl ja HEK-293)

fluoresenssimikroskopian avulla havaittiin sen aikaansaavan morfologisia muutoksia. Soluissa

esiintyi sekä apoptoottisia muutoksia että tuman tiivistymistä. Sitä vastoin MCF-7 -epiteeli-

solulinjalla merkitsevää toksisuutta ei havaittu. Arviointikriteerinä oli surfaktiinialtistuksen

jälkeinen LDH:n (laktaattidehydrogenaasi) vapautuminen. (Cao ym. 2009.)

Okan ym. (1993) mukaan nattoaterian surfaktiinipitoisuus on noin 0,35 mg/g. Keskimääräisessä

30–50 gramman kerta-annoksessa elimistöön päätyy siis 10,5–17,5 mg surfaktiinia. Ikedan ym.

vuonna 2006 julkaiseman tutkimuksen mukaan laskettuna keskimäärin 56–80 grammaa nattoa

viikossa eli 224–320 g kuukaudessa nauttivan japanilaisnaisen nattoaterioista saama

surfaktiinialtistus on 78–112 mg. Kikuchin ja Hasumin (2002) arvioiman akuuttia toksisuutta

ilmaisevan LD50-arvon, yli 100 mg/kg, mukaisesti 60 kg painava aikuinen voi nauttia

surfaktiineja ilman havaittavia haittavaikutuksia 6000 mg eli 6 g kerta-annoksen, ja 10-kiloinen

lapsi yhden gramman verran olettaen, että hänen elimistönsä toimisi kuten aikuisen.

43

Hwang ym. (2009) puolestaan päätyivät suosittelemaan surfaktiinin NOAEL-arvoksi alle 500

mg/kg/kk. Ilman havaittavia surfaktiinin aikaansaamia haittavaikutuksia 60-kiloinen aikuinen

voisi kuukauden ajan nauttia surfaktiinia korkeintaan 30000 mg, minkä hän saa noin 1700:sta

50 gramman annoksesta nattoa. Hyvin suoraviivaisesti arvioiden 10-kiloinen lapsikaan ei

kykene ylittämään NOAEL-suositusta: hänen kestokykynsä olisi näiden laskelmien perusteella

korkeintaan 5000 mg surfaktiinia eli 285 kappaletta 50 gramman ateriapakkausta kuukaudessa.

Mikrobien surfaktiinimetabolian lisäksi toksikologisessa arvioinnissa on syytä huomioida

mahdollinen muiden toksiinien, kuten muiden lipopeptidien ja fosfolipaasi A2:n tuottokyky

(Chu 1949; Matarante ym. 2004; Hong ym. 2008; EFSA 2011, 2013). Fosfolipaasi A2:n tuotto

tosin estyy yli 80-prosenttisesti 30 µM surfaktiinipitoisuudella 20 minuutissa (Kim ym. 1998).

3.3. Suolistokolonisaatio

Suolistokolonisaation merkitys naton fermentointiin käytettävien mikrobien

elintarviketurvallisuusarvioinnissa on vielä epäselvä. Jo useita vuosikymmeniä sitten on

havaittu B. subtilis -bakteerikantojen kykenevän kolonisoimaan suoliston mikrobiflooran

(Kramer ja Gilbert 1989), ja Hongin ym. (2008) mukaan B. subtilis var. natto itiöi hyvin

mahanesteessä ja suolilimassa sekä kykenee muodostamaan suolistossa biofilmin ja

invasoituvan suoliston epiteelisoluihin hyvin.

Hieman viitteitä organismin vaikutuksista suolistoon antaa Samanyan ja Yamauchin suorittama

in vivo -tutkimus (2002). He lisäsivät neljän viikon ajan kuivattuja B. subtilis var. natto -soluja

yhteensä 52 kananpojan rehuun ja tarkkailivat sen vaikutusta kananpoikien suoliston

histologiaan. Mikrobipitoisuudet olivat 108 – 1010 pmy/g eli samaa suuruusluokkaa kuin natto-

ateriassa. Rehut sisälsivät probioottia 0; 0,2; 0,5 ja 1 %. Tulokset osoittivat itiöitä saaneiden

kananpoikien suolen nukkalisäkkeiden painon nousevan sekä solujen pinta-alan ja mitoosin

lisääntyvän verrattuna kontrolliryhmään, joskaan ei merkitsevästi.

44

Song ym. (2014) puolestaan havaitsivat merkitsevän naudan suolistomikrobikoostumuksen

muuttumisen B. subtilis natto -bakteerikantojen nauttimisen tuloksena. Itiöprobiootin, jonka

mikrobipitoisuus oli 8,3×109 pmy/ml, lisäys 36 lypsylehmän rehuun kahdeksaksi päiväksi

muutti merkitsevästi suoliston mikrobipopulaation koostumusta. Huomionarvoista on

patogeenien väheneminen ja bifidobakteerien määrän lisääntyminen, joskin syy on vielä

tuntematon.

Kanekin ym. (2001) tekemien havaintojen mukaan 80 g kertaluonteisen natto-annoksen

syöneiden naisten ulosteen B. subtilis var. natto -mikrobipitoisuus vaihteli suuresti päivittäin,

ja organismi selviytyi suolistossa kohtalaisen hyvin. Vuorokauden päästä nauttimisesta

organismi havaittiin vain kolmasosalla, kahden vuorokauden kuluttua 66 %:lla ja seitsemän

vuorokauden kuluttua 66 %:lla kuudesta koehenkilöstä. Nattoa ei nautittu kahteen viikkoon

ennen ja jälkeen tutkimuksen.

3.4. Turvallisuuden arviointimenetelmät

Perinteiset turvallisuuden arviointimenetelmät, jotka perustuvat toksikologisiin eläinkokeisiin,

eivät sovellu valtaosaan elintarvikkeista eivätkä uusien elintarvikkeiden turvallisuuden

arviointiin ihmisten ja eläinten välisten metaboliaerojen ja niiden aiheuttamien tulosten

rinnastusvaikeuksien sekä eläinkokeiden eettisten ongelmien vuoksi (FAO/WHO 2002). B.

subtilis -ryhmän mikrobeja sisältävien elintarvikkeiden toksisuusarviointiin käytetään niiden

absoluuttisen määrän mittaamista suoraan elintarvikkeista ja niitä nauttineiden henkilöiden

ulosteista. Arviointia täydennetään epäsuorilla menetelmillä kuten hemolyysin tarkastelulla,

mahdollisesti tuotettujen sytotoksiinien esiintymistä mittaavilla menetelmillä

epiteelisolulinjoilla ja karjun siittiöiden liikkuvuuden estotestillä sekä toksiineja koodaavien

geenien sekvenoinnilla (From ym. 2007a). Organismin aineenvaihduntatuotteiden identifiointi

on merkityksellistä paitsi ruokamyrkytystapauksissa, joissa haetaan varmuutta siitä, ovatko

kyseessä B. subtilis -ryhmän metaboloimat lipopeptidit vai mahdolliset B. cereus -bakteerin

tuottamat toksiinit, myös sellaisen elintarvikkeen kohdalla, johon on tarkoituksellisesti lisätty

mikro-organismeja (Salkinoja-Salonen ym. 1999, Sanders ym. 2003).

45

3.4.1. Hemolyysi

B. subtilis hajottaa useiden nisäkkäiden verisoluja (Williams 1957). Elintarvikkeissa esiintyvän

hemolyysin katsotaan aiheutuvan SpoVG -geenin läsnäolosta organismin genomissa sekä

matriksista peräisin olevien solujen normaalimetaboliiteista kuten lipopeptideistä.

Hemolyyttisyys luokitellaan yhdeksi mikrobin virulenssitekijäksi. Vaikka B. subtilis -bakteeri-

kantojen hemolyysiaktiivisuus on vähäisempi kuin patogeeneiksi katsottujen organismien, se

katsotaan niin merkitykselliseksi, että se on määritettävä elintarvikkeiden probiootteina ja

fermentoinnin heräteviljelminä käytettävistä bakteerikannoista. (Matarante ym. 2004, EFSA

2011, Pan ym. 2013.)

3.4.2. Sytotoksisuus

B. subtilis -ryhmän bakteerikantojen tuottamien sytotoksisten lipopeptidien metabolaatio

voidaan havaita kvalitatiivisesti karjun siittiöiden liikkuvuuden estotestillä (Andersson ym.

1998, Beattie ja Williams 1999, Hoornstra ym. 2003). Menetelmää käytetään yleisesti

esimerkiksi Euroopan rekisteröintiasiakirjoissa arvioitaessa Bacillus -mikrobeja sisältävien

elintarvikelisäaineiden turvallisuutta (Apetroaie-Constantin ym. 2009), ja sitä suosittelee myös

Euroopan elintarviketurvallisuusvirasto (EFSA 2013).

3.4.3. Lipopeptidien tuottokyky

Lipopeptidien synteesiin vaadittavien geenien läsnäolon tunnistamiseksi mikrobien genomista

monistetaan kyseinen geenisekvenssi polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla (Tapi ym. 2010).

Erittäin korkean erottelukyvyn omaava nestekromatografia (ultra high performance liquid

chromatography, UHPLC) on nopea ja tarkka yhdisteen sisältämien fragmenttien

erottelumenetelmä. Sen avulla B. subtilis -bakteerikantojen eri metaboliatuotteet voidaan

määrittää luotettavasti samanaikaisesti yhdestä näytteestä (Oka ym. 1993). Laitteistoon voidaan

yhdistää erilaisia detektoreja. Erittäin korkearesoluutioisella, nelinkertaisen nopeuden

omaavalla kvadrupoli-lentoaikamassaspektrometrillä qTOFMS (quadrupole Time Of Flight

Mass Spectrometer) -analysaattorilla on näytteen kvalitatiivisen ja kvantitatiivisen tiedon

tarkka ilmaisukyky (Kildgaard ym. 2014).

46

KOKEELLINEN OSA

4. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET

Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida kolmen perinteisen japanilaisen soijapavuista valmistetun

natto-aterian elintarviketurvallisuutta analysoimalla niiden tuottamisessa käytettyjen Bacillus

subtilis var. natto -bakteerikantojen aineenvaihduntatuotteina syntyneiden syklisten

lipopeptidien läsnäolo ja kvalitatiivinen sytotoksisuus. Koska aterioiden mikrobipitoisuus on

korkea ja niitä nautitaan usein runsaasti ja useiden vuosien ajan, tavoitteena oli lisäksi arvioida

turvallinen ilman haittavaikutuksia nautittava kerta-annos nattoa.

47

5. AINEISTO JA MENETELMÄT

Käytetyt arviointimenetelmät pohjautuvat Euroopan elintarviketurvallisuusviraston EFSA:n

voimassaoleviin ohjeisiin. Työ jakautui viiteen osaan. Natto-annospakkauksista eristettiin

fermentoinnissa heräteviljelminä käytetyt bakteerikannat, ja niiden lajimääritys suoritettiin 16S

rDNA -sekvenoinnin avulla. Hemolyyttisyys määritettiin naudan veriagarilla. Lipopeptidien

synteesiä ilmentävien geenien esiintyminen määritettiin polymeraasiketjureaktion avulla.

Bakteereista valmistettiin myös kaksi erilaista lipopeptidiuutetta, joiden sytotoksisuutta

arvioitiin karjun siittiöiden liikkuvuuden estotestillä. Lipopeptidien kvantitatiivinen analysointi

suoritettiin Tanskan teknillisessä yliopistossa UHPLC-qTOFMS -analysaattorin avulla.

5.1. Bakteerikantojen eristäminen nattoaterioista

Elintarvikenäytteinä oli neljä Japanista toimitettua 50 g annospakkausta nattoa. Kaksi näytettä

oli peräisin samasta erästä, joten niitä käsiteltiin rinnakkaisnäytteinä. Näytteiden mikrobistot

eristettiin ja viljeltiin Itä-Suomen yliopistossa valmistetuille tryptoni-soija- (TSA) ja plate

count- (PC) -yleiselatusalustoille. Laktoosia fermentoivien koliformisten bakteerien

havaitsemiseksi mikrobistot viljeltiin myös violettipuna-sappi-glukoosi- (VRBGA) ja hiivojen

ja homeiden erottamiseksi oksitetrasykliini- (OGYE) -elatusalustoille, jotka myös oli

valmistettu Itä-Suomen yliopistossa.

Näytteeksi otettiin kustakin annoksesta soijapapuja sekä niitä ympäröivää limaa yhteensä 1 g,

mihin lisättiin 4 ml peptoni-suolaliuosta. Näyte homogenoitiin Seward Stomacher® 80 -homo-

genisaattorilla käyttäen normaalia nopeutta 30 sekunnin ajan. Homogenoitua näytettä

pipetoitiin kullekin elatusalustalle 50 µl. VRBGA- ja OGYE-elatusalustoille valmistettiin

laimennossarjat -2…-4 sekä TSA- ja PC-alustoille -2…-8. Maljoja inkuboitiin +30 oC:ssa

vuorokauden ajan, minkä jälkeen TSA- ja PC-alustoilta laskettiin pesäkkeet ja niiden

perusteella mikrobitiheys pmy/g. PC-alustoilla parhaan kasvun omaavat pesäkkeet

(keskimäärin 109 pmy/ml) valittiin tutkimukseen, ja niistä tehtiin puhdasviljelmät toisen

vuorokauden inkuboinnin jälkeen. Mikrobien karkea luokittelu Bacillus -bakteereihin

suoritettiin pesäkkeiden morfologisten ominaisuuksien ja gram-värjäyksen perusteella.

48

5.2. Tutkimuksessa käytetyt referenssibakteerikannat

Tutkimuksessa käytettiin natto-näytteistä eristettyjen kolmen tutkittavan bakteerikannan lisäksi

positiivi- ja negatiivikontrolleina Itä-Suomen yliopistosta peräisin olevia

referenssibakteerikantoja sekä positiivikontrollikantana Chr. Hansen A/G:n toimittamaa

bakteerikantaa B. subtilis CHCC 16388. Kontrollibakteerikannat on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2. Natto-elintarvikkeessa esiintyvien Bacillus -bakteerien tuottamien lipopeptidien

toksisuusarvioinnissa käytetyt positiivi- (+) ja negatiivikontrollibakteerikannat (-). Lyhenne e.t.

merkitsee ei tutkittu.

Bakteerikanta Hemo-

lyysi

Siittiötes-

ti

Surfaktii-

nien

synteesi

Fengysii-

nien

synteesi

Plipastatii-

nien

synteesi

Mykosubtilii-

nien synteesi

B. subtilis

ATCC 6051 + + e.t. e.t. + e.t.

B. subtilis

ATCC 6633 + e.t. e.t. + e.t. +

B. subtilis

ATCC 21332 + + + e.t. e.t. e.t.

B. lichenifor-

mis ATCC

14580

- - e.t. e.t. e.t. e.t.

B. subtilis

CHCC 16388 + + + e.t. e.t. e.t.

Lactobacillus

plantarum E

71084

e.t. e.t. - - - -

5.3. Identifiointi

Natto-näytteistä A, C ja D eristetyt isolaatit identifiointiin aluksi organismien hiilenlähteisiin

perustuvalla GEN III -menetelmällä valmistajan ohjeiden mukaan (GEN III MicroPlate;

Biolog, Hayward, Kanada). Tarkempi lajimääritys suoritettiin sekvenoimalla isolaatit ns.

uuden sukupolven 16S rDNA -menetelmällä DNA eristettiin kitin avulla (NucleoSpin® Extract

II, Macherey-Nagel, Germany) sen ohjeen mukaisesti. Kukin bakteerikanta rikastettiin

inkuboimalla 1 µl bakteerimassaa 10 ml:ssa tryptoni-soija-lientä (TSB) 24 tuntia +37 oC:ssa.

Suspensio sekoitettiin koeputkisekoittajalla ja 1 ml sitä sentrifugoitiin kahden minuutin ajan

11000 rpm nopeudella. Pelletti suspensoitiin 180 µl:aan puskuriliuosta (20 mM Tris-HCl + 2

mM EDTA + 1 % Triton × 100). Suspensioon lisättiin 75 µl lysotsyymiä (50 ng/ml).

49

Näytettä inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 oC:ssa, minkä jälkeen siihen lisättiin 25 µl proteinaasi K:ta

ja inkuboitiin vielä kahden tunnin ajan 56 oC:ssa. Eristetyn DNA:n sekvenssi AGA GTT TGA

TCM TGG CTC AG – TAC GGY TAC CTT GTT ACG AC monistettiin

polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla käyttäen universaalialukkeita 27-f ja 1492-r (Lane ym.

1991). Saatu PCR-tuote puhdistettiin em. kitin protokollan mukaisesti, ja riittävä puhtaus sekä

DNA-saanto varmistettiin Nanodrop-spektrofotometrillä. Puhtaat PCR-tuotteet lähetettiin

sekvenoitavaksi Agovalle Saksaan.

5.4. Lipopeptidien uuttaminen mikrobistosta

Bakteerien metaboloimat lipopeptidit uutettiin kahdella eri menetelmällä, joista ensimmäinen

oli Abdel-Mawgoudin ym. (2008) sekä Ahimoun ym. (2000) käyttämien metodien mukaelma.

Metaboliatuotteet uutettiin sekä koostumukseltaan Ahimoun ym. (2000) mukaiseen MOLP-

elatusliemeen (Medium for optimal lipopeptide production) Abdel-Mawgoudin ym. (2008)

menetelmän mukaisesti että 2-butanoliin Tanskan teknillisen yliopiston professori Kristian Fog

Nielsenin henkilökohtaisen ohjeen mukaan (liite 1). Valmiit uutteet säilytettiin +7 oC:ssa.

5.4.1. Uutto MOLP-elatusliemeen

Aluksi valmistetiin elatusliemeksi MOLP (liite 2). Surfaktiini analysoitiin sekä epäsuoralla

uuttomenetelmällä näytteestä eristetyistä Bacillus -isolaateista että suoralla uutolla natto-

ateriasta Abdel-Mawgoudin ym. (2008) mukaan.

5.4.1.1. Uutteen valmistaminen mikrobipesäkkeestä

Mikrobipesäke siirrostettiin PC-alustalta 25 ml:aan brain-heart-infusion-kasvatuslientä (BHI).

Inokulaattia inkuboitiin 24 tunnin ajan 30 oC lämpötilassa 150 rpm ravistelussa (Orbital Shaker

SO1), minkä jälkeen 600 µl inokuloitiin 30 ml:aan MOLP-mediumia. Suspensiota inkuboitiin

72 tuntia 30 oC:ssa 150 rpm nopeudella ja ultrasentrifugoitiin viiden minuutin ajan 10000 g:n

voimalla 5 oC:ssa (Avanti J-301, roottori JA-30.50; Beckman Coulter, USA). Supernatantista

käytettiin 20 ml. Sen pH laskettiin 6M HCl:lla kahteen.

50

Lipopeptidien annettiin sakkautua 7 oC lämpötilassa vähintään 18 tuntia, minkä jälkeen

supernatanttia sentrifugoitiin 4100 rpm nopeudella 5 oC:ssa 25 minuutin ajan (Jouan BR4i,

Thermo Scientific). Pelletti suspensoitiin 99 % etanoliin, ja etanoli haihdutettiin 70 oC:ssa

typpivirrassa (N-EVAP™, Organomation Associates, USA). Kuivaan näytteeseen lisättiin 5 ml

dikloorimetaania (DCM), ja sitä inkuboitiin huoneenlämmössä 18 tuntia hitaasti ravistellen.

Ekstrakti suodatettiin ja uutettiin uudelleen 5 ml:aan dikloorimetaania kahdesti. DCM

haihdutettiin typpivirrassa 40 oC lämpötilassa. Surfaktiini eluoitiin 1 ml:aan 5 mM Tris-HCl

-puskuriliuosta (pH 8,5) ja säilytettiin 7 oC:ssa.

5.4.1.2. Uutteen valmistaminen nattonäytteestä

Kunkin natto-annospakkauksen soijapavuista sekä niitä yhdistävästä B. subtilis -bakteerien

tuottamasta limasta valmistettiin vertailunäyte. Sytotoksisuustestin negatiivikontrolliksi

valmistettiin uute steriilistä, maustamattomasta säilykesoijapavusta (maahantuoja Inex

Partners). Seward Stomacher®80 -homogenisaattorilla (Seward Laboratory Systems, USA)

homogenoitiin 10 g näytettä ja 25 ml peptoni-suolavettä keskisuurella nopeudella

silmämääräisesti arvioiden homogeeniseksi. Näytettä ultrasentrifugoitiin 5 minuuttia 10000 g:n

voimalla 5 oC:ssa. Ekstraktin valmistus jatkui samoin kuin eristetystä mikrobipesäkkeestä.

5.4.2. 2-butanoliuutto

PC-alustalta siirrostettua mikrobipesäkettä inkuboitiin 25 ml:ssa BHI-lientä 24 tuntia 30 oC

lämpötilassa 150 rpm nopeudella ravistellen, minkä jälkeen 10 ml:aan suspensiota lisättiin 12

ml 2-butanolia (Merck) ja ravistelua jatkettiin 15 minuutin ajan (liite 1). Sentrifugoinnin (4000

rpm, 10 min.) jälkeen 10 ml supernatanttia otettiin talteen. Jäljelle jääneeseen supernatanttiin

(10 ml) lisättiin jälleen 12 ml 2-butanolia, ja ravistelu sekä sentrifugointi toistettiin. Saatu

supernatantti yhdistettiin edelliseen, 2-butanoli haihdutettiin typpivirrassa, ja kuiva pelletti

eluoitiin 1ml:aan 5 mM Tris-HCl -puskuriliuosta (pH 8,5). Uute säilytettiin 7 oC:ssa.

51

5.5. Hemolyysin määrittäminen

Bakteerikantojen fenotyyppistä hemolyyttisyyttä tarkasteltiin naudan erytrosyyttien avulla

Euroopan elintarviketurvallisuusviraston ohjeiden mukaan (EFSA 2011). PC-alustalta

siirrostettiin pesäke naudan verilevylle (bioTRADING, Benelux B.V., Mijdrecht, Alankomaat),

ja sitä inkuboitiin 3 vrk 30 oC:ssa. Verisolujen hajoamista seurattiin vuorokauden välein.

Positiivikontrollikantoina toimivat B. subtilis -bakteerikannat ATCC 6051, ATCC 6633 ja

ATCC 21332 (Hsieh ym. 2004, Dehghan-Noudeh ym. 2005, EFSA 2011). Tutkimukset

toistettiin kahdesti.

5.6. Sytotoksisuuden määritys karjun siittiöiden liikkuvuuden estotestillä

Sytotoksisuustestit suoritettiin sekä suoraan natto-annospakkauksista että niistä eristetyistä

Bacillus-bakteerikannoista valmistetuilla surfaktiiniuutteilla Anderssonin ym. (1998)

kehittämää karjun siittiötestiä mukaillen. Tutkimukseen sisältyi kolme siittiötestiä, joissa

käytettiin vaihtelevia näytekokoonpanoja. Abdel-Mawgoudin ym. (2008) menetelmän mukaan

Bacillus -isolaateista A MOLP-elatusliemeen valmistetut surfaktiiniuutteet rinnakkais-

näytteineen testattiin kahdesti sekä isolaateista C ja D valmistetut uutteet kolmesti, joista

viimeisessä oli mukana rinnakkaisnäytteet. Suoraan natto-aterioista Abdel-Mawgoudin ym.

(2008) menetelmällä MOLP-elatusliemeen uutetut näytteet A, C ja D testattiin kahdesti. Sekä

kaupalliset surfaktiininäytteet (c = 5 µg/ml ja 10 µg/ml) että 2-butanoliin uutetut pesäkenäytteet

A, C ja D rinnakkaisnäytteineen testattiin yhden kerran.

Positiivikontrollikantoina toimivat B. subtilis ATCC 6051, B. subtilis ATCC 21332 ja B.

subtilis CHCC 16388. Lisäksi positiivikontrollinäytteenä käytettiin siittiöiden liikkuvuuden jo

nanomolaarisina pitoisuuksina estävää dimetyylisulfoksidiin (DMSO) liuotettua

valinomysiiniä (Sigma-Aldrich®, Saksa). (Mikkola ym. 2000, Hoornstra ym. 2003.)

Negatiivikontrolleina käytettiin maustamattomasta säilykesoijapavusta valmistettua uutetta

sekä kahdesti suodatettua dikloorimetaania. Positiivisena vertailunäytteenä käytettiin

kaupallista surfaktiinia S3523 (Sigma-Aldrich®, Saksa) liuotettuna 99 % etanoliin

pitoisuudeltaan 10 mg/ml liuokseksi (Mikkola ym. 2000).

52

Karjun siittiöiden liikkuvuuden estotesti suoritettiin altistamalla huoneenlämpöisillä uutteilla

huoneenlämpöistä karjun siemennestettä (Perussiemen 57, Tuomikylän karjuasema, Seinäjoki)

kolmen vuorokauden ajan. Polystyreenilinkoputkessa olevaan kevyesti ravisteltuun

siemennesteeseen (2 ml) lisättiin uutteet 10 µl/ml, 20 µl/ml ja 40 µl/ml pitoisuuksiksi.

Valinomysiinikontrollien altistuspitoisuuksina käytettiin 0,08 ng/ml; 0,2 ng/ml; 0,4 ng/ml ja

0,8 ng/ml. Kevyen ravistelun jälkeen näytteitä säilytettiin polystyreenilaatikossa

huoneenlämmössä. Siittiöiden liikkuvuus tarkistettiin päivittäin mikroskoopilla 20-kertaisella

suurennuksella (Olympus CK40, Japani) +37-asteisena.

5.7. Lipopeptidien synteesikyky

Natto-näytteistä eritettyjen B. subtilis -bakteerikantojen surfaktiinin, fengysiinin,

mykosubtiliinin ja plipastatiinin synteesikyky todennettiin monistamalla niistä synteesiin

tarvittava geenialue polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla Tapin ym. (2010) kehittämän

menetelmän mukaan. Ohjeesta poiketen bakteerien DNA:ta ei laimennettu. Kunkin

bakteerikannan DNA eristettiin käytetyn kitin (Nucleo Spin®Extract II, Macherey-Nagel,

Saksa) menetelmäohjeen mukaan kuten kohdassa 4.2. PCR-ajoa varten valmistetut

reaktioseokset on kuvattu liitteessä 3 ja ajo-ohjelmat liitteessä 4.

5.7.1. Surfaktiinien synteesiin vaadittavan geenin määrittäminen

Surfaktiinien synteesiin vaadittavan geenin sfp tunnistamiseksi eristettiin aluksi DNA näytteistä

A, C ja D sekä positiivikontrolleista B. subtilis ATCC 21332 ja B. subtilis CHCC 16388 sekä

negatiivikontrollista Lb. plantarum E 71084 Tapin ym. (2010) menetelmän mukaan. DNA-

saannot sekä -puhtaudet absorbanssisuhteella 260/280 nm määritettiin Nanodrop ND-1000

-spektrofotometrilla (Nanodrop Technologies, USA), ja tulokset käyvät ilmi taulukosta 3.

53

Taulukko 3. Surfaktiinien synteesiin vaadittavan geenin tunnistamiseksi tutkituista

bakteerikannoista eristettyjen isolaattien DNA-pitoisuudet ja -puhtaudet. Kaikkien isolaattien

DNA-pitoisuus oli riittävä (≥ 10,0 ng/µl) sfp-geenin havaitsemiseksi.

Näyte Pitoisuus ng/µl Puhtaus (A260/280)

A 151,5 1,96

C 64,8 2,11

D 110,0 2,17

B. subtilis ATCC 21332 50,6 1,96

B. subtilis CHCC 16388 55,6 2,18

Lb. plantarum E 71084 95,0 2,06

Näytteistä monistettiin 419–431 emäsparin kokoinen DNA-sekvenssi CGC GGM TAC CGV

ATY GAG-ATB CCT TTB TWD GAA TGT CCG CC alukkeiden As1-F ja Ts2-R avulla.

PCR-tuote analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla 1,2 % agaroosigeelillä ajoparametreilla

80 V/1h/20 min. Monistustuotteen määrittämiseen käytettiin Gene Ruler™ 100 bp DNA Ladder

-molekyylipainomarkkeria (Fermentas).

5.7.2. Fengysiinien, plipastatiinien ja mykosubtiliinin synteesiin vaadittavien geenien

määrittäminen

Eristetyistä DNA-näytteistä määritettiin myös fengysiinin, mykosubtiliinin ja plipastatiinin

synteesiin vaadittavat geenit Tapin ym. (2010) menetelmän mukaan. Fengysiinien tuottamiseen

vaadittavan geenin fen (koko 443–455 ep) tunnistamiseksi monistettiin sekvenssiä GAA TAY

MTC GGM CGT MTK GA - GCT TTW ADK GAA TSB CCG CC alukkeilla Af2-F ja Tf1-R.

Plipastatiineja koodaavan geenin pps (koko 893–929 ep) havaitsemiseksi bakteerin DNA:ssa

puolestaan käytettiin alukkeita Ap1-F ja Tp1-R sekvenssillä AGM CAG CKS GCM ASA TCM

CC - GCK ATW WTG AAR RCC GGC GG. Mykosubtiliinin synteesiin tarvittavan geenin

myc (416–419 ep) läsnäolo analysoitiin monistamalla sekvenssiä CAK CAR GTS AAA ATY

CGM GG - CCD ASA TCA AAR AAD TTA TC alukkeiden Am1-F ja Tm1-R avulla.

54

5.8. Mikrobien tuottamien lipopeptidien analysointi

Uutteista analysoitiin lipopeptidit Tanskan Teknillisen Yliopiston toimesta Poroshell -fenyyli-

heksyylipylvään sisältävän erittäin korkean erottelukyvyn omaavan nestekromatografin (ultra

high performance liquid chromatography, UHPLC) Agilent 1290 -järjestelmän (Agilent

Technologies, Santa Clara, Kanada), ja kaksoissähkösumutuksella varustetun Agilent 6550

kvadrupoli-lentoaikamassaspektrometrin, qTOF-MS:n (quadrupole Time Of Flight Mass

Spectrometer), muodostamalla hybridianalysaattorilla (Juola ym. 2014). Ajoliuoksena toimi

asetonitriili. Kvantifiointi muodostettiin ionikromatogrammeista, jotka saatiin surfaktiinien

[M+H]+-ionien täysskannauksesta. Automaattinen tandem-massaspektrometri (MS/MS) antoi

MS/MS-spektrillä ionit m/z -arvoilla 950–1300.

Kontrollinäytteet valmistettiin 85 % asetonitriililiuokseen 0,5 grammasta soijajauhoa 50 µl:aan

S3523-surfaktiinia (Sigma-Aldrich®, Saksa) 3000; 1500; 750; 375; 188; 93,8; 46,9; 23,4 ja 0

µg/g -pitoisuuksiin. Seoksen sisältämät surfaktiinit uutettiin 2-butanoliin liitteen 1 mukaisesti

yön yli +4 oC:ssa inkuboinnin jälkeen. Kaupallisen surfaktiinin molekyylipaino oli 1036,34 u.

Eri surfaktiinien A1, B, C1 ja D suhteelliset osuudet määritettiin UHPLC-qTOF-MS -

analysaattorin avulla 200 nanometrin signaalilla. Positiivikontrollikantana käytettiin B. subtilis

CHCC 16388 -bakteerikantaa (Chr. Hansen A/S, Hørsholm, Tanska).

55

6. TULOKSET

6.1. Identifiointi

GEN III -identifikaatiotulokset osoittivat isolaattien A ja B olevan B. subtilis -bakteerikantaa ja

isolaatin C sille hyvin läheistä, B. subtilis -ryhmään sisältyvää B. vallismortis -bakteerikantaa.

Sekvenointitulosten perusteella kaikki isolaatit osoittautuivat 99 % todennäköisyydellä Bacillus

subtilis -lajeiksi. Tulokset ovat yhdenmukaisia morfologisten havaintojen kanssa, joissa

mikrobit osoittautuivat voimakkaasti PC-alustalla leviäviksi, endosporeja sisältäviksi gram-

positiivisiksi sauvabakteereiksi. Bakteerit kasvoivat myös TSA-yleisalustalla eivätkä lainkaan

spesifisillä VRBGA- tai OGYE-alustoilla. Fermentointiin katsottiin käytetyn yksittäistä

bakteerikantaa.

6.2. Hemolyysi

Kaikki isolaatit osoittautuivat sekä α- että β-hemolyyttisiksi (kuva 5). Hemin hajoamisesta

seuraava α-hemolyysi ilmenee pesäkkeen vihertymisenä, ja täydellisen hajoamisen eli β-

hemolyysin seurauksena verimalja on täysin kirkastunut pesäkkeen ympäriltä. Hemolyysi

ilmeni selkeästi jo yhden vuorokauden inkuboinnin jälkeen. Kuvasta voidaan havaita myös

bakteerikannalle ominainen pesäkkeiden voimakas leviäminen alustan pinnalla.

Kuva 5. Natto-näytteistä eristetyn Bacillus subtilis –bakteerin aiheuttama hemolyysi naudan

veriagarilla kolmen vuorokauden +30 oC:ssa inkuboinnin jälkeen. α-hemolyysin seurauksena

pesäkkeet ovat vihertyneet. Täydellisen, β-hemolyysin seurauksena kasvualusta on kirkastunut.

56

6.3. Sytotoksisuus

Sytotoksisuuden voimakkuuden kuvaamiseen käytettiin siittiöiden liikkuvuutta asteikolla -

(liikkuvuus 45–50 %) … +++ (liikkuvuus 0-10 %). Tulokset käyvät ilmi taulukosta 4. Puhtaan

siemennesteen siittiöiden liikkuvuus kunkin testin lähtötilanteessa oli 45–50 % merkiten hyvää

liikkuvuutta. Ensimmäisessä testissä käytetty siemenneste oli toimitettaessa viileää kylmän

vuodenajan vuoksi. Puolet karjun siittiöistä lamaannuttavan EC50-pitoisuuden määritykset

perustuvat testin lisäksi Tanskan teknillisen yliopiston natto-isolaateista ja kaupallisesta

surfaktiinista määrittämiin surfaktiinipitoisuuksiin, ja osoittavat, että nattoateriassa esiintyvä

jopa alle 0,2 µg/ml -surfaktiinipitoisuus on toksinen karjun siittiöille.

Taulukko 4. Natto-näytteistä ja niistä eristetyistä isolaateista valmistettujen surfaktiiniuutteiden

aikaansaama karjun siittiöiden liikkuvuuden esto ja sen perusteella määritetyt EC50-arvot.

Inhibitio on merkitty koodein - (liikkuvuus 45–50 %), + (liikkuvuus 30–40 %), ++ (liikkuvuus

15–25 %) ja +++ (liikkuvuus 0-10 %), ja e.t. merkitsee ei tutkittu.

Näyte Liikkuvuuden inhibitio

EC50 (µg/ml) MOLP-

mediumiin uutettu

2-butanoliin

uutettu

Isolaatti A +/++ +++ 0,238

Isolaatti C ++ +++ 0,140

Isolaatti D ++/+++ +++ 0,130

Natto A + e.t. e.t.

Natto C ++/+++ e.t. e.t.

Natto D +/+++ e.t. e.t.

Säilykesoijapapu - e.t. e.t.

B. subtilis ATCC 6633 +/++ e.t. e.t.

B. subtilis ATCC 6051 ++ +++ e.t.

B. subtilis ATCC 21332 ++ +++ e.t.

B. subtilis CHCC 16388 +/++ +++ 0,531

Surfaktiini S3525 5 µl/ml + +++ 0,018

Surfaktiini S3525 10

µl/ml + +++ 0,048

Valinomysiiniliuos ++/+++ ++/+++ 0,0002

DCM-suodos - - e.t.

57

6.4. Surfaktiinien synteesiin vaadittavan geenin esiintyminen

PCR ja agaroosigeelielektroforeesi osoittivat kaikkien tutkittujen isolaattien DNA:n sisältävän

surfaktiinien synteesiin vaadittavan sfp-geenin (kuva 6).

Kuva 6. Kolmesta natto-ateriasta eristettyjen Bacillus -isolaattien surfaktiinia koodaavien

geenien sfp (419-431 ep) esiintyminen bakteerien DNA:ssa. A1 ja A2 kuvaavat isolaatin A

vyöhykkeitä, C kuvaa isolaatin C ja D isolaatin D vyöhykettä. Positiivikontrollina toimineet B.

subtilis ATCC 21332 ja B. subtilis CHCC 16388 sekä negatiivikontrolli Lb. plantarum E 71084

on kuvattu bakteerikantoja vastaavin numerokoodein. Molekyylipainomarkkerina (M)

käytettiin Gene Ruler™ 100 bp DNA Ladder:a (Fermentas).

6.5. Fengysiinien, plipastatiinien ja mykosubtiliinin synteesiin vaadittavien geenien

esiintyminen

Natto-näytteistä eristettyjen B. subtilis -bakteerikantojen genomeissa ei havaittu esiintyvän

fengysiiniä, mykosubtiliinia tai plipastatiinia syntetoivien geenien läsnäoloa PCR-analyysin

perusteella. Yhteistyötahon suorittaman UHPLC-qTOF -analyysin tulokset tukivat PCR-

tutkimustuloksia (tuloksia ei esitetty).

M

A1

A2

C

D

AT

CC

21332

CH

CC

16388

M

0

E 7

10

84

500 ep

58

6.6. Nestekromatografiset tulokset

UHPLC-qTOF -analyysin tulokset osoittivat nattoaterioiden fermentoinnissa käytettyjen

mikrobien tuottaneen ainoana non-ribosomaalisena lipopeptidinä surfaktiinia (kuva 7).

Surfaktiinia esiintyi neljänä pitoisuuksiltaan hyvin vaihtelevina jakeina, A1, B, C1 ja D. Ne

havaittiin [M+H]+- ja [M+Na]+ -ioneina, joiden massa-alueen (m/z-arvo) vaihteluväli oli

1022.6756 ja 1044.6570 toleranssien mukaisesti.

Kuva 7. Natto-isolaatin A UHPLC-qTOF-MS -analysaattorilla havaitut surfaktiinifraktiot

(positiivinen sähkösumuionisointi ESI+ m/z –alueella 950-1500). Osakuvasta A voidaan

havaita surfaktiinijakeet A1, B, C1 ja D. Osakuvasta B ilmenee lipopeptidifraktioiden

havainnointi [M+H]+-ioneina sekä surfaktiini B -jakeen tarkka kromatografinen spektri.

Osakuva C osoittaa standardina käytetyn surfaktiini B -jakeen (Sigma-Aldrich®) aikaansaaman

MS-spektrin molekyylipainoltaan 1022,6756 u, ja osakuva D sille identtisen, isolaatin

tuottaman MS-spektrin. Viitearvo surfaktiinin molekyylipainolle on 1050 ± 100 u ja

standardina käytetyn surfaktiinin ilmoitettiin olevan molekyylipainoltaan 1036,34 u.

59

Lipopeptidit uuttuivat Ahimoun ym. (2000) mukaiseen MOLP-elatusliemeen heikosti, mikä

ilmenee taulukosta 5. Sitä vastoin 2-butanoliin uuttuminen oli huomattavasti tehokkaampaa.

Kuitenkin siihenkin uuttui näytteisiin lisätyistä surfaktiineista alle puolet; alkuperäiseltä

pitoisuudeltaan 5 µg/ml olevasta surfaktiinikontrollista uuttui 36 % ja pitoisuudeltaan 10 µg/ml

olevasta 48 %.

Taulukko 5. Natto-isolaattien 2-butanoliin (uute 1) ja MOLP-elatusliemeen (2) uuttuneet

surfaktiinipitoisuudet (µg/ml). B. subtilis CHCC 16388 toimi positiivikontrollikantana.

Standardi merkitsee 10 ml:aan asetonitriiliä liuotettua surfaktiinistandardia (Sigma-Aldrich®).

Näyte Uute 1a

(µg/ml)

Uute 1b

(µg/ml)

Uute 2a

(µg/ml)

Uute 2b

(µg/ml)

Isolaatti A 23,8 38,7 0,1 0,02

Isolaatti C 19,0 14,1 0,1 0,01

Isolaatti D 13,5 35,5 0,05 0,04

B. subtilis CHCC

16388 53,1 e.t. 0,2 0,4

Standardi (5 µg/ml) 1,8 e.t. 0,05 e.t.

Standardi (10µg/ml) 4,8 e.t. 0,02 e.t.

Mikrobien tuottama surfaktiini esiintyi hyvin vaihtelevina osuuksina eri fraktioina, A1-, B-, C1-

ja D-jakeina, kuten taulukosta 6 ilmenee. Keskimäärin jakeiden A1 ja D osuudet

kokonaissurfaktiinista olivat vähäisimmät ja jakeiden C1 ja B suurimmat. Isolaattien tuottama

surfaktiinipitoisuus oli keskimäärin 1997 µg/g.

Taulukko 6. Natto-isolaatista A UHPLC-qTOF-MS -analysaattorilla kolmeen kertaan

määritetyt surfaktiinin A1-, B-, C1- ja D -jakeiden pitoisuudet ja arvojen keskihajonta.

A1 (µg/g) B (µg/g) C1 (µg/g) D (µg/g) Kokonaispitoisuus

(µg/g)

Näyte 1 125 ± 8 611 ± 43 917 ± 38 73 ± 6 1725 ± 94

Näyte 2 147 ± 21 784 ± 55 1043 ± 105 86 ± 8 2060 ± 183

Näyte 3 168 ± 12 848 ± 23 1093 ± 38 97 ± 4 2206 ± 70

Keskimääräinen

osuus 7,4 % 37 % 51 % 4,3 %

60

7. POHDINTA

Tämän pro gradu -tutkielman tarkoitus oli tuottaa tietoa japanilaisen, Bacillus subtilis var. natto

-bakteerikantojen avulla fermentoidun perinteisen elintarvikkeen, naton sisältämien

lipopeptidien, erityisesti surfaktiinien pitoisuuksista ja akuutista sytotoksisuudesta in vitro, ja

arvioida tulosten pohjalta elintarvikkeen turvallisuutta.

Huolimatta nattoaterioiden sisältämistä korkeista mikrobipitoisuuksista ja samanaikaisesta

niiden tuottamiseen soveltuvien bakteerikantojen toksisten lipopeptidien tuottokyvystä

aterioiden ei tämän hetken tutkimustiedon valossa tiedetä aiheuttaneen ruokamyrkytyksiä. Sitä

vastoin niiden tuottamiseen soveltuvien bakteerikantojen lievästä toksisuudesta on hieman

viitteitä. Sen merkitys on kuitenkin vielä epäselvä. Tutkimus on vähäistä ja suppeaa, sillä

organismin aterioissa tuottamien surfaktiinien aiheuttamia haittavaikutuksia ei Japanissa

vaadita seurattavan eivätkä niiden mahdollisesti aiheuttamat infektiot tule välttämättä

tutkijoiden tietoon. Pitkäaikaisvaikutuksista väestötasolla tutkimustietoa ei ole lainkaan.

Avoimena kysymyksenä ovat myös naton nauttimisesta seuraavat mahdolliset sytofiiliset,

kuten hemolyyttiset ja hepatosellulaariset vaikutukset in vivo sekä suolistokolonisaation

merkitys.

Tutkimuksessa analysoitujen kolmen natto-aterian sisältämä B. subtilis var. natto -pitoisuus oli

tavanomaista suuruusluokkaa, 108 – 109 pmy/g. Pesäkkeet olivat yleisalustalla voimakkaasti

leviäviä, gram-positiivisia, itiöiviä sauvabakteereja. Muita organismeja ei viljelmin eikä

mikroskooppisin tarkasteluin havaittu, ja fermentointiin voidaan sekä sillä että sekvenoinnin

perusteella olettaa käytetyn yhtä B. subtilis -bakteerikantaa.

Kaikki isolaatit aiheuttivat täydellisen β-hemolyysin naudan verisoluille. Hemolyysiä

tarkasteltiin EFSA:n ohjeiden (2011) mukaisesti kolme vuorokautta, mutta se oli selkeästi

havaittavissa jo yhden vuorokauden inkuboinnin jälkeen. Vertailu positiivikontrolleihin tuki

tulosten oikeellisuutta.

Eristettyjen isolaattien genomien havaittiin sisältävän surfaktiinien synteesiin vaadittavan sfp-

geenin ja tuottavan ainoana syklisenä lipopeptidinä surfaktiinia tutkimusolosuhteissa.

Fengysiinien, plipastatiinien ja mykosubtiliinin synteesiin vaadittavia geenejä ei havaittu.

61

Tulokset eivät olleet niiltä osin täysin luotettavia, sillä ainoastaan fengysiinien

positiivikontrollibakteerikannan B. subtilis ATCC 6633 geenituotteen saattoi PCR-kuvassa

havaita, mutta sen, kuten näytteidenkin sitoutuminen oli erittäin epäspesifistä PCR-

reaktioseoksen koostumuksesta riippumatta. Plipastatiinien ja mykosubtiliinin

positiivikontrollibakteerikantojen geenituotteita ei havaittu. Tutkimus keskeytettiin tältä osin.

Tulosten perusteella ei voida luotettavasti tietää, esiintyikö tutkittujen organismien genomeissa

muita lipopeptidejä kuin surfaktiineja koodaavia geenejä. Koska mediumin koostumuksen on

havaittu vaikuttavan merkittävästi B. subtilis -bakteerikantojen lipopeptidien tuottokykyyn, se

ettei nestekromatografinen erottelu osoittanut kyseisiä lipopeptidejä tuotetun tutkituissa

aterioissa, ei takaa sitä, etteivätkö mikrobit olisi voineet erilaisessa mediumissa erilaisen

fermentointiprosessin aikana ja jälkeen niitä tuottaa.

Surfaktiinien saanto vaihteli voimakkaasti käytetyn uuttomenetelmän mukaan. Erityisesti

lipopeptidien uuttoon optimaaliseksi kehitettyyn MOLP-elatusliemeen ei surfaktiinia uuttunut

juuri lainkaan. Sitä vastoin 2-butanoliin surfaktiinit uuttuivat tehokkaammin. Saanto oli samaa

suuruusluokkaa, joskin hieman vähäisempi kuin kirjallisuudessa aiemmin esitetty. Näytteisiin

lisätyistä surfaktiineista uuttui alle puolet, 36 % ja 48 %. Kuten kirjallisuudessa on todettu,

nattoaterioissa esiintyvien lipopeptidien lopulliseen pitoisuuteen vaikuttaa voimakkaasti paitsi

fermentointiolosuhteet myös mediumina toimivan soijapapujen ja niitä yhdistävän liman

koostumus. Nattoaterioissa todellisuudessa esiintyvät surfaktiinipitoisuudet ovatkin

mahdollisesti tässä tutkimuksessa havaittua korkeampia. Koska surfaktiinit ovat solujen

aineenvaihduntatuotteita, lopulliseen pitoisuuteen vaikuttaa myös nattoaterian valmistuksen

jälkeinen säilytysaika. Tämän tutkimuksen näytteiden osalta jäi avoimeksi se, vastasiko niiden

säilytysaika lähellekään tavanomaista. Tutkitut näytteet oli hankittu vähittäismyyntiliikkeistä

hyvissä ajoin ennen viimeistä myyntipäivää. Nattoa pidetään hyvin säilyvänä tuotteena, ja sitä

voidaan säilyttää kenties pitkiäkin aikoja ennen nauttimista. On myös mahdollista, että

keskimääräinen säilytysaika on lyhyt, sillä tuotetta myydään Japanissa myös kadunkulmissa ja

nautitaan kenties hyvinkin pian. Surfaktiinipitoisuus olisikin hyvä analysoida sekä

keskimääräisen säilytysajan jälkeen että viimeisenä myyntipäivänä.

Karjun siittiöiden liikkuvuuden estotestin tulosten perusteella surfaktiinit osoittautuivat

sytotoksisiksi, sillä siittiöiden liike inhiboitui 2-butanoliin uutetuilla surfaktiineilla täydellisesti

0,13 – 0,24 µg/ml -surfaktiinipitoisuudella ollen yli 20 kertaluokkaa pienempi kuin

kirjallisuudessa esitetty, kuten Mikkolan ym. tutkimuksen (2000) mukainen.

62

Abdel-Mawgoudin (2008) menetelmän mukaan valmistettujen uutteiden havaittiin olevan

vähemmän siittiötoksisia, mutta pitoisuusmääritystulokset osoittivat surfaktiinia uuttuneen

näytteistä kyseisellä menetelmällä vain 0,2–0,3 % ja positiivikontrollibakteerikannasta B.

subtilis CHCC 16388 0,56 % 2-butanoliuutteisiin verrattuna. Pitoisuudeltaan 5 µg/ml olevasta

surfaktiinistandardista uuttui Abdel-Mawgoudin (2008) menetelmää käyttäen 1 % ja

pitoisuudeltaan 10 µg/ml olevasta 0,2 %. Voidaankin epäillä menetelmän toimivuutta.

Uuttomenetelmät poikkesivat toisistaan selvästi. MOLP haihtui pelletistä nopeasti, 2-butanoli

hyvin hitaasti. On epätodennäköistä, että 2-butanolista olisi jäänyt uutteisiin kuitenkaan jäämiä,

sillä se on haihtuva liuotin ja pellettien jatkokäsittely suoritettiin vasta niiden ollessa selkeästi

kuivia. On kuitenkin mahdollista, että 2-butanolin avulla valmistetuissa uutteissa oli joitain

epäpuhtauksia, sillä uutteita ei suodatettu toisin kuin MOLP-elatusliemeen valmistettuja

uutteita.

Surfaktiinia esiintyi 50 gramman nattoateriassa keskimäärin 100 mg, mikä ei ylitä LD50 -

suositusta ja kuvaa hyvin lievää akuuttia toksisuutta. Aterioiden surfaktiinipitoisuus oli

kirjallisuudessa esitettyä 17,5 mg:aa (Oka ym. 1993) selkeästi suurempi, mutta yhden 50

gramman nattoaterian nauttimisen voidaan tämänhetkisen tiedon valossa katsoa olevan

aikuiselle turvallista. Vaikka pitkäaikaisvaikutuksia ei tutkittu, mainittakoon, että yhdestä

isolaatista analysoitujen surfaktiinijakeiden A1, B, C1 ja D jakauma osoitti, että surfaktiini C:tä

esiintyi natossa eniten, yli puolet kokonaissurfaktiinipitoisuudesta. Juuri kyseisen jakeen

maksatoksisuudesta rotille on viitteitä. Kuitenkaan NOAEL-taso (alle 500 mg/kg) ei ylity, sillä

surfaktiini C:tä esiintyi noin 1 mg/g eli 50 mg per ateria, ja surfaktiinien kokonaispitoisuuskin

oli NOAEL-tasoa selkeästi alhaisempi. NOAEL-tason mukaisesti 60-kiloisen henkilön

oletetaan sietävän noin 3000 mg surfaktiinia kuukaudessa. Nattoa vuosikymmenien ajan

nauttivien henkilöiden osalta jatkuvan surfaktiinialtistuksen merkitys maksalle on kuitenkin

tuntematon. B. subtilis -bakteerikantojen aiheuttamasta maksatoksisuudesta ihmiselle

tunnetaan kaksi esimerkkiä, mikä on huomionarvoinen seikka, muttei riitä lainkaan

johtopäätösten tekoon.

Koska surfaktiinia tuottavat B. subtilis var. natto -bakteerikannat muodostavat tyypillisesti

paksun ja tiukan biofilmin sekä kykenevät persistoitumaan ihmisen suolistoon pidemmäksi

ajaksi kuin sitä tuottamattomat kannat, on tässä tutkielmassa tutkittujen bakteerikantojen

persistoituminen suolistoon mahdollista. Myös B. subtilis var. natto -bakteerikantojen

vaikutuksista eläinten suoliston mikrobiston muutoksiin ja ohutsuolen nukkalisäkkeeseen on

havaintoja.

63

Lisäksi bakteerikantojen aiemmin havaittu kyky invasoitua tehokkaasti suolen epiteelisoluihin

viittaa siihen, että tutkitut bakteerikannat mahdollisesti kykenevät invasoitumaan nattoa

nauttivan henkilön suoliston soluihin. Asian käytännön merkitys on kuitenkin tuntematon.

Tietoa ei ole myöskään niiden suolistossa mahdollisesti tuottamista lipopeptideistä.

Infektioiden matala esiintyvyys viittaa matalaan riskiin, mutta seurannan puuttuminen Aasiassa

voi vääristää mielikuvaa.

Immunosuppressiivisten ja vastustuskyvyltään muuten erityisen heikkojen henkilöiden tulisi

nattoa nauttiessaan huomioida paitsi sen sisältämä korkea mikrobipitoisuus ja pitkä

säilytysaika, myös tuottajaorganismien säilytyksen aikana mahdollisesti syntetisoimat toksiinit

ja aasialaisen perinnetavan mukaan hitaasti jäähdyttäen valmistettu, naton ohessa usein

nautittava riisi, joka saattaa sisältää huomattavia pitoisuuksia toksisia lipopeptidejä kuten

pumilasidiinia. Hyvän terveydentilan omaaville henkilöille riisi ei tuo merkitsevästi kohonnutta

infektioriskiä. Julkaistujen tutkimustulosten vaikutukset naton nauttimisen edullisista

luustovaikutuksista voivat teoriassa nostaa infektioriskiä iäkkäillä, heikkokuntoisilla naisilla,

mikäli nattoprobioottien kulutus nattoaterioiden ohella kasvaa merkittävästi.

Koska naton fermentaatiossa tuotetut yhdisteet ovat lopputulos soijapapuihin inokuloitujen

mikrobien pitoisuudesta, käytetyistä bakteerikannoista ja fermentointiolosuhteista, tämä

tutkielma antaa ainoastaan viitteitä elintarvikkeen toksisuudesta, joka vaikuttaa olevan hyvin

lievä. Tutkimuksen perusteella naton lyhytaikainen elintarvikekäyttö ei ole terveydelle

haitallista, mutta asiaa on seurattava ja lisätutkimukset ovat tarpeen. Toksisuusarvioinnin

pohjana on pääasiassa useita solutason vaikutuksia arvioivia tutkimuksia in vitro sekä koe-

eläinhavaintoja, eikä niitä voi suoraan soveltaa ihmiseen. Tässä tutkielmassa arvioitiin kolmen

näytteen surfaktiinituotantoa ja testit toistettiin kahdesti, joten tulokset antoivat vain viitteitä

lievästä toksisuudesta.

Naton nauttimisen kroonisia vaikutuksia kuvaava epidemiologinen näyttö puuttuu kokonaan.

Jotta saataisiin relevanttia tietoa natto-aterioiden elintarviketurvallisuudesta, olisi suositeltavaa

selvittää naton pitkäaikaisen nauttimisen vaikutukset sekä maksaan että suolistoon. Olisi hyvä

tutkia myös nattoaterioista eristettyjen bakteerikantojen biofilmin muodostuskykyä surfaktiinin

mahdollisten suolistovaikutusten arvioimiseksi. Lisäksi olisi hyvä selvittää nattoa nauttivan

imettävän äidin rintamaitoon mahdollisesti erittyvän surfaktiinin ja muiden syklisten

lipopeptidien keskimääräiset pitoisuudet ja niiden pitkäaikaiset vaikutukset esimerkiksi lapsen

maksaan, mikäli häntä ruokitaan natolla rintaruokinnan jälkeen.

64

8. LÄHTEET

Abdel-Mawgoud AM, Aboulwafa MM, Hassouna NA-H. Characterization of Surfactin

Produced by Bacillus subtilis Isolate BS5. Applied Biochemistry and Biotechnology Journal

2008; 150: 289-303.

Ahimou F, Jacques P, Deleu M. Surfactin and iturin A effects on Bacillus subtilis surface

hydrophobicity. Enzyme and Microbial Technology 2000; 27: 749-754.

Andersson MA, Mikkola R, Helin J, Andersson MC, Salkinoja-Salonen M. A novel sensitive

bioassay for detection of Bacillus cereus emetic toxin and related depsipeptide ionosphores.

Applied and Environmental Microbiology 1998; 64(4): 1338-1343.

Apetroaie-Constantin C, Mikkola R, Andersson MA, Teplova V, Suominen I, Johansson T,

Salkinoja-Salonen M. Bacillus subtilis and B. mojavensis strains connected to food poisoning

produce the heat stable toxin amylosin. Journal of Applied Microbiology 2009; 106: 1976-

1985.

Arima K, Kakinuma A, Tamura G. Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced

by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.

Biochemical And Biophysical Research Communications 1968; 31(3): 488-494.

Ashiuchi M, Kamei T, Misono H. Poly-γ-glutamate synthetase of Bacillus subtilis. Journal of

Molecular Catalysis 2003; 23: 101-106.

Ashiuchi M, Misono H. Biochemistry and molecular genetics of poly-γ-glutamate synthesis.

Mini-Review. Applied microbiology and biotechnology 2002; 59(1): 9–14.

Barbosa TM, Serra CS, La Ragione RM, Woodward MJ, Henriques AO. Screening for Bacillus

Isolates in the Broiler Gastrointestinal Tract. Applied and Environmental Microbiology 2005;

968-978.

Beattie SH, Williams AG. Detection of toxigenic strains of Bacillus cereus and other Bacillus

spp. with an improved cytotoxicity assay. Letters in Applied Microbiology 1999; 28: 221–225.

65

Beaumont M. Flavouring composition prepared by fermentation with Bacillus spp.

International Journal of Food Microbiology 2002; 75(3): 189-196.

Bernheimer AW, Avigad L. Nature and Properties of a Cytolytic Agent Produced be Bacillus

subtilis. Journal of General Microbiology 1970; 61: 361-369.

Bhat AR, Irorere VU, Bartlett T, Hill D, Kedia G, Morris MR, Charalampopoulos D, Radecka

I. Bacillus subtilis natto: a non-toxic source of poly-γ-glutamic acid that could be used as a

cryoprotectant for probiotic bacteria. AMB Express 2013; 3(1): 36.

de Boer AS, Diderichsen B. On the safety of Bacillus subtilis and B. amyloliquefaciens: a

review. Applied Microbiology and Biotechnology 1991; 36(1): 1-4.

Branda SS, Gonzáles-Pastor JE, Ben-Yehuda S, Losick R, Kolter R. Fruiting body formation

by Bacillus subtilis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America 2001; 98(20): 11621-11626.

Branda SS, Chu F, Kearns DB, Losick R, Kolter R. A major protein component of the Bacillus

subtilis biofilm matrix. Molecular Microbiology 2006; 59(4): 1229-1238.

Cao X-H, Liao Z-Y, Wang C-L, Cai P, Yang WY, Lu M-F, Huang G-W. Purification and

antitumour activity of a lipopeptide biosurfactant produced by Bacillus natto TK-I.

Biotechnology an applied biochemistry 2009; 52: 97-106.

Cao X, Wang AH, Jiao RZ, Wang CL, Mao DZ, Yan L, Zeng B. Surfactin Induces Apoptosis

and G2/M Arrest in Human Breast Cancer MCF-7 Cells Through Cell Cycle Factor Regulation.

Cell Biochemistry and Biophysics 2009; 55(3): 163-171.

Chen K-I, Erh M-H, Su N-W, Liu W-H, Chou C-C, Cheng KC. Soyfoods and soybean products:

from traditional use to modern applications. Applied Microbiology and Biotechnology 2012;

96(1): 9-22.

Chu HP. The Lesithinase of Bacillus cereus and its Comparison with Clostridium welchii α-

toxin. Journal of General Microbiology 1949; 3(2): 255-273.

66

Cosentino S, Mulargia AF, Pisano P, Tuveri P, Palmas F. Incidence and biochemical

characteristics of Bacillus flora in Sardinian dairy products. International Journal of Food

Microbiology 1997; 38: 235-238.

Cutting SM. Bacillus probiotics. Review. Food Microbiology 2011; 28: 214-220.

Dehghan-Noudeh G, Housaindokht M, Bazzaz BS. Isolation, characterization, and

investigation of surface and hemolytic activities of a lipopeptide biosurfactant produced by

Bacillus subtilis ATCC 6633. Journal of Microbiology 2005; 43(3): 272-276.

Duc LH, Dong NA, Logan NA, Sutherland AD, Taylor J, Cutting SM. Cases of emesis

associated with bacterial contamination of an infant cereal product. International Journal of

Food Microbiology 2005; 102: 245-251.

Duitman EH, Hamoen LW, Rembold M, Venema G, Seitz H, Saenger W, Bernhard F,

Reinhardt R, Schmidt M, Ullrich C, Stein T, Leenders F, Vater J. The mycosubtilin synthetase

of Bacillus subtilis ATCC6633: a multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an

amino transferase, and a fatty acid synthase. Proceedins of the National Academy of Sciences

of the United States of America 1999; 96(23): 13294-13299.

Duitman, E. Nonribosomal peptide synthesis in Bacillus subtilis. Väitöskirja. Groningenin

yliopisto 2003.

Earl AM, Losick R, Kolter R. Bacillus subtilis Genome Diversity. Journal of Bacteriology

2007; 1163-1170.

EFSA (European Food Safety Authority). Introduction of a Qualified Presumption of Safety

(QPS) approach for assessment of selected microorganisms referred to EFSA. The EFSA

Journal 2007; 587: 1-16.

EFSA (European Food Safety Authority). Scientific Opinion of the Panel on Dietetic Products,

Nutrition and Allergies. Vitamin K2 added for nutritional purposes in foods for particular

nutritional uses, food supplements and foods intended for the general population and Vitamin

K2 as a source of vitamin K added for nutritional purposes to foodstuffs, in the context of

Regulation (EC) No 258/97. The EFSA Journal 2008; 822: 1-31.

67

EFSA (European Food Safety Authority). Scientific Opinion on the maintenance of the list of

QPS biological agents intentionally added to food and feed. EFSA Journal 2013; 11(11): 3449.

EFSA (European Food Safety Authority). Technical Guidance on the assessment of the

toxigenic potential of Bacillus species used in animal nutrition. EFSA Journal 2011; 9(11):

2445.

Euroopan komissio 2013a. Komission täytäntöönpanoasetus (EU) N:o 306/2013. Annettu 2.

päivänä huhtikuuta 2013.

Euroopan komissio 2013b. Komission täytäntöönpanoasetus (EU) N:o 787/2013. Annettu 16.

päivänä elokuuta 2013.

Euroopan komissio. Report of the scientific committee on animal nutrition on the safety of the

enzymatic product Belfeed B1100 MP® for use as feed additive for pigs for fattening. Annettu

18. päivänä huhtikuuta 2002.

Elintarviketurvallisuusvirasto Evira. Utaretulehdusta aiheuttavien mikrobien eristäminen ja

tunnistaminen. Menetelmäohje Evira 2001/3. Viitattu 11.9.2014.

Elintarviketurvallisuusvirasto Evira. Elintarvikkeiden mikrobiologiset vaarat. Eviran julkaisuja

1/2010. Viitattu 9.1.2014.

FAO/WHO. Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. Report of a Joint FAO/WHO

Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food 2002. London,

Ontario, Canada. ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/wgreport2.pdf . Viitattu 19.9.2014.

FDA. Food Additive Status List.

http://www.fda.gov/food/ingredientspackaginglabeling/foodadditivesingredients/ucm091048.

html. Viitattu 30.5.2014.

Fineli ® - elintarvikkeiden koostumustietopankki. Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen

ravitsemusyksikön ylläpitämä elintarvikkeiden koostumustietopankki. Viitattu 1.9.2014.

68

From C, Hormazábal V, Hardy SP, Granum PE. Cytotoxicity in Bacillus mojavensis is

abolished following loss of surfactin synthesis: implications for assessment of toxicity and food

poisoning potential. International Journal of Food Microbiology 2007a; 117(1): 43-49.

From C, Hormazábal V, Granum PE. Food poisoning associated with pumilacidin-producing

Bacillus pumilus in rice. International Journal of Food Microbiology 2007b; 115: 319-324.

From C, Pukall R, Schumann P, Hormazábal V, Granum PE. Toxin-Producing Ability among

Bacillus spp. Outside the Bacillus cereus Group. Applied and Environmental Microbiology

2005; 71(3): 1178-1183.

Green DH, Wakeley PR, Page A, Barnes A, Baccigalupi L, Ricca E, Cutting SM.

Characterization of Two Bacillus Probiotics. Applied and Environmental Microbiology 1999;

4288-4291.

Griffiths MW. Toxin production by psychotropic Bacillus spp. present in milk. Journal of Food

Protection 1990; 53: 790-792.

Hara T, Aumayr A, Fujio Y, Ueda S. Elimination of Plasmid-Linked Polyglutamate Production

by Bacillus subtilis (natto) with Acridine Orange. Applied and Environmental Microbiology.

1982; 44(6): 1456-1458.

Hong HA, Huang J-M, Khaneja R, Hiep LV, Urdaci MC, Cutting SM. The safety of Bacillus

subtilis and Bacillus indicus as food probiotics. Journal of Applied Microbiology 2008; 105:

510-520.

Hong HM, Khaneja R, Tam NMK, Cazzato A, Tan S, Urdaci M, Brisson A, Gasbarrini A,

Barnes I, Cutting SM. Bacillus subtilis isolated from the human gastrointestinal tract. Research

in Microbiology 2009; 160(2): 134–143.

Hoornstra D, Andersson MA, Mikkola R, Salkinoja-Salonen MS. A new method for in vitro

detection of microbially produced mitochondrial toxins. Toxicology in Vitro 2003; 745-751.

69

Hsieh F-C, Li M-C, Lin T-C, Kao S-S. Rapid Detection and Characterization of Surfactin-

Producing Bacillus subtilis and Closely Related Species Based on PCR. Current Microbiology.

2004; 49: 186-191.

Hwang Y-H, Park B-K, Lim J-H, Kim M-S, Song I-B, Park S-C, Yun H-I. Evaluation of

Genetic and Developmental Toxicity of Surfactin C from Bacillus subtilis BC1212. Journal of

Health Science 2008; 54(1): 101-106.

Hwang Y-H, Kim M-S, Song I-B, Park B-K, Lim J-H, Yun H-I. Subacute (28 day) Toxicity of

Surfactin C, a Lipopeptide Produced by Bacillus subtilis, in Rats. Journal of Health Science

2009; 55(3): 351-355.

Ikeda Y, Iki M, Morita A, Kajita E, Kagamimori S, Kagawa Y, Yoneshima H. Intake of

fermented soybeans, natto, is associated with reduced bone loss in postmenopausal women:

Japanese Population-Based Osteoporosis (JPOS) Study. The Journal of Nutrition 2006; 136(5):

1323-1328.

Inagaki S, Domon E, Saito A, Akutagawa H. Discrimination of Bacillus subtilis natto "strain

KA-145" using insertion sequence, IS4Bsu1. Journal of the Japanese Society for Food Science

and Technology. 2003; 50(10): 483-487.

Inatsu Y, Kimura K, Itoh Y. Characterization of Bacillus subtilis Strains Isolated from

Fermented Soybean Foods in Southeast Asia: Comparison with B. subtilis (natto) Starter

Strains. JARQ 2002; 36 (3): 169–175.

Jacques P. Surfactin and Other Lipopeptides from Bacillus spp. Kirjassa: Soberón‐Chávez G,

toim. Biosurfactants, Microbiology Monographs. Berlin Heidelberg: G. Springer-Verlag 2011,

s. 57–84.

Kaboré D, Nielsen DS, Sawadogo-Lingani H, Diawara B, Dicko MH, Jakobsen M, Thorsen L.

Inhibition of Bacillus cereus growth by bacteriocin producing Bacillus subtilis isolated from

fermented baobab seeds (maari) is substrate dependent. International Journal of Food

Microbiology 2013; 162(1): 114-119.

70

Kaneki M, Hodges, SJ, Hosoi T, Fujiwara S, Lyons A, Crean SJ, Ishida N, Nakagawa M,

Takechi M, Sano Y, Mizuno Y, Hoshino S, Miyao M, Inoue S, Horiki K, Shiraki M, Ouchi Y,

Orimo H. Japanese fermented soybean food as the major determinant of the large geographic

difference in circulating levels of vitamin K2: possible implications for hip-fracture risk.

Nutrition 2001; 17(4): 315-321.

Kikuchi T, Hasumi K. Enhancement of plasminogen activation by surfactin C: augmentation

of fibrinolysis in vitro and in vivo. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure

and Molecular Enzymology 2002; 1596(2): 234-245.

Kildgaard S, Mansson M, Dosen I, Klitgaard A, Frisvald JC, Larsen TO, Nielsen KF. Accurate

Dereplication of Bioactive Secondary Metabolites from Marine-Derived Fungi by UHPLC-

DAD-QTOFMS and a MS/HRMS Library. Marine Drugs 2014; 12: 3681-3705.

Kim B, Byun BY, Mah JH. Biogenic amine formation and bacterial contribution in Natto

products. Food Chemistry 2012; 135: 2005-2011.

Kim K, Jung SY, Lee DK, Jung JK, Park JK, Kim DK, Lee CH. Suppression of inflammatory

responses by surfactin, a selective inhibitor of platelet cytosolic phospholipase A2. Biochemical

Pharmacology 1998; 55(7): 975-985.

Kimura K, Itoh Y. Characterization of Poly-γ-Glutamate Hydrolase Encoded by a

Bacteriophage Genome: Possible Role in Phage Infection of Bacillus subtilis Encapsulated with

Poly-γ-Glutamate. Applied and Environmental Microbiology 2003; 69(5): 2491-2497.

Kimura K, Tran L-SP, Do T-H, Itoh Y. Expression of the pgsB Encoding the Poly-gamma-DL-

glutamate Synthetase of Bacillus subtilis (natto). Bioscience, biotechnology and biochemistry

2009; 73(5): 1149-1155.

Kramer JM, Gilbert RJ. Bacillus cereus and other Bacillus species. Kirjassa: Doyle MP, toim.

Foodborne bacterial pathogens. Marcel Dekker Inc. New York. 1989, s. 58-62.

Kubo Y, Rooney AP, Tsukakoshi Y, Nakagawa R, Hasegawa H, Kimura K. Phylogenetic

Analysis of Bacillus subtilis strains Applicable to Natto (Fermented Soybean) Production.

Applied and Environmental Microbiology 2011; 77(18): 6463–6469.

71

Lane DJ. 16S/23S rRNA sequencing. Kirjassa: Stackebrandt, E ja Goodfellow, M, toim.

Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Chichester: Wiley 1991, s. 115-175.

Larsen N, Thorsen L, Kpikpi EN, Stuer-Lauridsen B, Cantor MD, Nielsen B, Brockmann E,

Derkx PMF, Jespersen L. Characterization of Bacillus spp. strains for use as probiotic additives

in pig feed. Applied Microbiology and Biotechnology 2014; 98: 1105–1118.

Leonard CG, Housewright RD, Thorne CB. Effects of some metallic ions on glutamyl

polypeptide synthesis by Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 1958; 76(5): 499-503.

Liu X, Ren B, Gao H, Liu M, Dai H, Song F, Yu Z, Wang S, Hu J, Kokare CR, Zhang L.

Optimization for the Production of Surfactin with a New Synergistic Antifungal Activity. PloS

one 2012; 7(5)

Logan NA. Bacillus and relatives in foodborne illness. Journal of Applied Microbiology 2011;

112: 417-429.

Logan NA, de Vos P. Genus I. Bacillus Cohn 1872, 174AL. Kirjassa: de Vos P, Garrity GM,

Jones D, Krieg NR, Ludwig W, Rainey FA, Schleifer K-H, Whitman WB, toim. Bergey’s

manual of systematic bacteriology, toinen painos, kolmas osa. 2009, s. 21-128. Springer, New

York.

Maget-Dana R, Peypoux F. Iturins, a special class of pore-forming lipopeptides: biological and

physicochemical properties. Toxicology 1994; 87(1-3): 151-174.

Marahiel MA, Nakano MM, Zuber P. Regulation of peptide antibiotic production in Bacillus.

Molecular Microbiology 1993; 7(5): 631-636.

Matarante A, Baruzzi F, Cocconcelli PS, Morea M. Genotyping and Toxigenic Potential of

Bacillus subtilis and Bacillus pumilus Strains Occurring in Industrial and Artisanal Cured

Sausages. Applied and Environmental Microbiology 2004; 5168-5176.

May JJ, Kessler N, Marahiel MA, Stubbs MT. Crystal structure of DhbE, an archetype for aryl

acid activating domains of modular nonribosomal peptide synthetases. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America 2002; 99(19): 12120-12125.

72

McKenney PT, Adams D, Eichenberger P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and

functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology 2013; 11: 33-44.

McLoon AL, Guttenplan SB, Kearns DB, Kolter R, Losick R. Tracing the domestication of a

biofilm-forming bacterium. Journal of Bacteriology 2011; 193(8): 2027–2034.

Mikkola R, Kolari M, Andersson MA, Helin J, Salkinoja-Salonen MS. Toxic lactonic

lipopeptide from food poisoning isolates of Bacillus licheniformis. European Journal of

Biochemistry 2000; 267: 4068-4074.

Mitsui N, Murasawa H, Sekiguchi J. Disruption of the cell wall lytic enzyme CwlO affects the

amount and molecular size of poly-γ-glutamic acid produced by Bacillus subtilis (natto). The

journal of general and applied microbiology 2011; 57(1): 35-43.

Mongkolthanaruk W. Classification of Bacillus beneficial substances related to plants, humans

and animals. Review. Journal of Microbiology and Biotechnology. 2012; 22(12): 1597-1604.

Murooka Y, Yamshita M. Traditional healthful fermented products of Japan. Review. Journal

of Industrial Microbiology & Biotechnology 2008; 35: 791–798.

Nagai T, Tran L-SP, Inatsu Y, Itoh Y. A new IS4 Family Insertion Sequence, IS4Bsu1,

Responsible for Genetic Instability of Poly-γ-Glutamic Acid Production in Bacillus subtilis.

Journal of Bacteriology 2000; 182(9): 2387-2392.

Nagai T. Bacteriophages of Bacillus subtilis (natto) and Their Contamination in Natto

Factories. Kirjassa: Kurtboke I, toim. Bacteriophages. InTech 2012, s. 95-110.

Nagai T, Itoh Y. Characterization of a Generalized Transducing Phage of Poly-(gamma)-

Glutamic Acid-Producing Bacillus subtilis and Its Application for Analysis of Tn917-LTV1

Insertional Mutants Defective in Poly-(gamma)-Glutamic Acid Production. Applied and

environmental microbiology 1997; 63(10): 4087-4089.

73

Nakamura LK, Roberts MS, Cohan FM. Relationship of Bacillus subtilis clades associated with

strains 168 and W23: a proposal for Bacillus subtilis subsp. subtilis subsp. nov, and Bacillus

subtilis subsp. spizizenii subsp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology 1999; 49:

1211-1215.

Nakano MM, Dailly YP, Zuber P, Clark DP. Characterization of Anaerobic Fermentative

Growth of Bacillus subtilis: Identification of Fermentation End Products and Genes Required

for Growth. Journal of Bacteriology 1997; 179(21): 6749.

Nakano MM, Magnuson R, Myers A, Curry J, Grossman AD, Zuber P. srfA Is an Operon

Required for Surfactin Production, Competence Development, and Efficient Sporulation in

Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 1991; 173(5): 1770-1778.

Nakano MM, Zuber P. Anaerobic growth of a "strict aerobe" (Bacillus subtilis). Annual review

of microbiology 1998; 52: 165-190.

Natural Domain Product Seeker NaPDoS. Jensenlab. USA 2011.

http://napdos.ucsd.edu/pathway_templates/fengycin_info.html

Nguyen Thi Minh H, Durand A, Loison P, Perrier-Cornet J-M, Gervais P. Effect of sporulation

on the resistance of Bacillus subtilis spores to heat and high pressure. Applied Microbiology

and Biotechnology 2011; 90: 1409-1417.

Nieminen T, Rintaluoma N, Andersson M, Taimisto A-M, Ali-Vehmas T, Seppälä A, Priha O,

Salkinoja-Salonen M. Toxinogenic Bacillus pumilus and Bacillus licheniformis from mastitic

milk. Veterinary Microbiology 2007; 124: 329-339.

Nishiguchi T, Yamashita M, Maeda M, Matsuyama K, Kanavama N, Terao T. Improvement of

vitamin K status of breastfeeding infants with maternal supplement of vitamin K2 (MK40).

Seminars in Thrombosis and hemostasis 2002; 28(6): 533-538.

Nishito Y, Osana Y, Hachiya T, Popendorf K, Toyoda A, Fujiyama A, Itaya M, Sakakibara Y.

Whole genome assembly of a natto producing strain Bacillus subtilis natto from very short read

data. BMC Genomics 2010; 11: 243.

74

Nissen E, Vater J, Pauli G, Vollenbroich D. Application of surfactin for mycoplasma

inactivation in virus stocks. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 1997; 33: 414-

415.

Oggioni MR, Pozzi G, Valensin PE, Galieni P, Bigazzi C. Recurrent septicemia in an

immunocompromised patient due to probiotic strains of Bacillus subtilis. Journal of Clinical

Microbiology 1998; 36(1): 325-326.

Oka K, Hirano T, Homma M, Ishii H, Murakami K, Mogami S, Motizuki A, Morita H, Takeya

K, Itokawa H. Satisfactory separation and MS-MS spectrometry of six surfactins isolated from

Bacillus subtilis natto. Chemical & pharmaceutical bulletin 1993; 41(5): 1000–1002.

Ongena M, Jacques P. Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol.

Trends of Microbiology 2008; 16: 115-125.

Pan X, Chen X, Su X, Feng Y, Tao Y, Dong Z. Involvement of SpoVG in hemolysis by Bacillus

subtilis. Biochemical and Biophysical Research Communications 2014; 443: 899-904.

Park, SY. & Kim, YH. Surfactin inhibits immunostimulatory function of macrophages through

blocking NK-κB, MAPK and Akt pathway. International Immunopharmacology 2009; 9: 886-

893.

Pedersen PB, Bjørnvad ME, Rasmussen MD, Petersen JN. Cytotoxic potential of industrial

strains of Bacillus sp. Regulatory Toxicology and Pharmacology: RTP. 2002; 36(2):155-161.

Peng H, Wang JQ, Kang HY, Dong SH, Sun P, Bu DP Zhou LY. Effect of feeding Bacillus

subtilis natto fermentation product on milk production and composition, blood metabolites and

rumen fermentation in early lactation dairy cows. Journal of Animal Physiology and Animal

Nutrition 2012; 96(3): 506-512.

Peypoux F, Pommier MT, Marion D, Ptak M, Das BC, Michel G. Revised structure of

mycosubtilin, a peptidolipid antibiotic from Bacillus subtilis. The Journal of antibiotics 1986;

39(5): 636-641.

75

Peypoux F, Bonmatin J-M, Labbe H, Grangemard I, Das BC, Ptak M, Wallach J, Michel G.

[Ala4]Surfactin, a Novel Isoform from Bacillus subtilis Studied by Mass and NMR

Spectroscopies. European Journal of Biochemistry 1994; 224(1): 89-96.

Peypoux F, Bonmatin J-M, Wallach J. Recent trends in the biochemistry of surfactin. Applied

and Environmental Microbiology 1999; 51: 553-563.

Phelps RJ, McKillip JL. Enterotoxin Production in Natural Isolates of Bacillaceae outside the

Bacillus cereus Group. Applied and Environmental Microbiology 2002; 68(6): 3147-3151.

van der Ploeg R, Mäder U, Homuth G, Schaffer M, Denham EL, Monteferrante CG, Miethke

M, Marahiel MA, Harwood CR, Winter T, Hecker M, Antelmann H, van Dijl JM.

Environmental Salinity Determines the Specificity and Need for Tat-Dependent Secretion of

the YwbN Protein in Bacillus subtilis. PLoS one 2011; 6(3): 18140.

Pyörälä S. Harvinaiset utaretulehduksen aiheuttajat. Eläintautien torjuntayhdistys ETT.

Helsingin yliopisto 2012. Viitattu 11.9.2014.

Pötter M, Oppermann-Sanio FB, Steinbüchel A. Cultivation of Bacteria Producing Polyamino

Acids with Liquid Manure as Carbon and Nitrogen Source. Applied and Environmental

Microbiology 2001: 617-622.

Qiu D, Fujita K, Sakuma Y, Tanaka T, Ohashi Y, Ohshima H, Tomita M, Itaya M. Comparative

Analysis of Physical Maps of Four Bacillus subtilis (natto) Genomes. Applied and

Environmental Microbiology 2004; 6247-6256.

Rajavel M, Mitra A, Gopal B. Role of Bacillus subtilis BacB in the synthesis of bacilysin. The

journal of biological chemistry 2009; 284(46): 31882-31892.

Richard V, van der Auwera P, Snoeck R., Daneau D, Meunier, F. Nosocomial bacteremia

caused by Bacillus species. European journal of clinical microbiology & infectious diseases

1988; 7(6): 783-785.

76

Roberts MS, Nakamura LK, Cohan FM. Bacillus mojavensis sp. nov., Distinguishable from

Bacillus subtilis by Sexual Isolation, Divergence in DNA Sequence, and Differences in Fatty

Acid Composition. International Journal of Systematic Bacteriology 1994; 44(2): 256-264.

Roberts MS, Nakamura LK, Cohan FM. Bacillus vallismortis sp. nov., a Close Relative of

Bacillus subtilis, Isolated from Soil in Death Valley, California. International Journal of

Systematic Bacteriology 1996; 46(2): 470-475.

Rooney A, Price N, Ehrherdt C, Swezey JL, Bannan JD. Phylogeny and molecular taxonomy

of the Bacillus subtilis species complex and description of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum

subsp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2009; 59(10):

2429-2436.

Rosenkvist H, Hansen Å. Contamination profiles and characterization of Bacillus species in

wheat bread and raw materials for bread production. International Journal of Food

Microbiology 1995; 26: 353-363.

Rowan NJ, Deans K, Anderson JG, Gemmell CG, Hunter IS, Chaithong T. Putative Virulence

factor Expression by Clinical and Food Isolates of Bacillus spp. after Growth in Reconstituted

Infant Milk Formulae. Applied and Environmental Microbiology 2001; 3873-3881.

Salkinoja-Salonen MS, Vuorio R, Andersson MA, Kämpfer P, Andersson MC, Honkanen-

Buzalski T, Scoging AC. Toxigenic Strains of Bacillus Licheniformis Related to Food

Poisoning. Applied and Environmental Microbiology 1999; 65(10): 4637-4645.

Samanya M, Yamauchi KE. Histological alterations of intestinal villi in chickens fed dried

Bacillus subtilis var. natto. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular &

Integrative Physiology 2002; 133(1): 95-104.

Sanders ME, Morelli L, Tompkins TA. Sporeformers as Human Probiotics: Bacillus,

Sporolactobacillus and Brevibacillus. Comprehensive Reviews in Food Science and Food

Safety 2003; 2: 101-110.

Sawamura S. 1906. On the micro-organisms of natto. Bulletin of the college of agriculture,

Tokyo Imperial University 1906; 7(1): 107-110.

77

Schallmey M, Singh A, Ward OP. Developments in the use of Bacillus species for industrial

production. Canadian journal of microbiology 2004; 50(1): 1-17.

Shrestha AK, Dahal NR, Ndungutse V. Bacillus Fermentation of Soybean: A Review. Journal

of Food Science and Technology 2010; 6: 1-9.

Song DJ, Kang HY, Peng H, Bu DP. Effect of Feeding Bacillus subtilis natto on Hindgut

Fermentation and Microbiota of Holstein Dairy Cows. Asian-Australasian Journal of Animal

Sciences 2014; 27(4): 495-502.

Spinosa MR, Wallet F, Courcol RJ, Oggioni MR. The trouble in tracing opportunistic

pathogens: cholangitis due to Bacillus in a French hospital caused by a strain related to an Italian

probiotic? Microbial Ecology in Health and Disease 2000; 12: 99-101.

Stickel F, Droz S, Patsenker E, Bögli-Stuber K, Aebi B, Leib SL. Severe hepatotoxicity

following ingestion of Herbalife® nutritional supplements contaminated with Bacillus subtilis.

Journal of Hepatology 2009; 50(1): 111-117.

Strauch M, Webb V, Spiegelman G, Hoch JA. The SpoOA protein of Bacillus subtilis is a

repressor of the abrB gene. Genetics 1990; 87: 1801-1805.

Sumi H, Yanagisawa Y, Yatagai C, Saito J. Natto Bacillus as an Oral Fibrinolytic Agent:

Nattokinase Activity and the Ingestion Effect of Bacillus subtilis natto. Food Science and

Technology 2004; 10(1): 17-20.

Sun P, Wang J-Q, Zhang H-T. Effects of supplementation of Bacillus subtilis natto Na and N1

strains on rumen development in dairy calves. Animal Feed Science and Technology 2011; 164

(3-4): 154-160.

Sun P, Wang JQ, Deng LF. Effects of Bacillus subtilis natto on milk production, rumen

fermentation and ruminal microbiome of dairy cows. Cambridge Journals 2013; 7(2): 216-222.

Suzuki Y, Kondo K, Ichise H, Tsukamoto Y, Urano T, Umemura K. Dietary Supplementation

With Fermented Soybeans Suppresses Intimal Thickening. Nutrition 2003; 19: 261-264.

78

Tam NKM, Uyen NQ, Hong HA, Duc LH, Hoa TT, Serra CR, Henriques AO, Cutting SM. The

Intestinal Life Cycle of Bacillus subtilis and Close Relatives. Journal of Bacteriology 2006;

188(7): 2692-2700.

Tapi A, Chollet-Imbert M., Scherens B, Jacques P. New approach for the detection of non-

ribosomal peptide synthetase genes in Bacillus strains by polymerase chain reaction. Applied

Microbiology and Biotechnology Journal 2010; 85: 1521-1531.

Tsuge K, Ano T, Hirai M, Nakamura Y, Shoda M. The Genes degQ, pps, and lpa-8(sfp) Are

Responsible for Conversion of Bacillus subtilis 168 to Plipastatin Production. Antimicrobioal

Agents and Chemotherapy 1999; 43(9): 2183-2192.

USDA National Nutrient Database for Standard Reference Release 26. Statistics Report 16113,

Natto.

http://ndb.nal.usda.gov/ndb/foods/show/4833?format=Stats&reportfmt=pdf&pdfQvs=%7B%

7D. Luettu 30.5.2014.

Vanittanakom N, Loeffler W, Koch U, Jung G. Fengycin - a novel antifungal lipopeptide

antibiotic produced by Bacillus subtilis f-29-3. The Journal of Antibiotics. 1986; 39(7): 888-

901.

Vollenbroich D, Pauli G, Özel M, Vater J. Antimycoplasma Properties and Application in Cell

Culture of Surfactin, a Lipopeptide Antibiotic from Bacillus subtilis. Applied and

Environmental Microbiology 1997a; 63(1): 44-49.

Vollenbroich D, Özel M, Vater J, Kamp RM, Pauli G. Mechanism of Inactivation of Enveloped

Viruses by the Biosurfactant Surfactin from Bacillus subtilis. Biologicals 1997b; 25: 289-297.

Volpon L, Besson F, Lancelin J-M. NMR structure of antibiotics plipastatins A and B from

Bacillus subtilis inhibitors of phospholipase A2. FEBS Letters 2000; 485(1): 76-80.

Wallet F, Crunelle V, Roussel-Delvallez M, Fruchart A, Saunier P, Courcol RJ. Bacillus subtilis

as a cause of cholangitis in polycystic kidney and liver disease. American Journal of

Gastroenterology 1996; 91(7): 1477-1478.

79

Wang LT, Lee FL, Tai CJ, Kasai H. Comparison of gyrB gene sequences, 16S rRNA gene

sequences and DNA-DNA hybridization in the Bacillus subtilis group. International Journal of

Systematic and Evolutionary Microbiology 2007; 57: 1846-1850.

Wei Q, Wolf-Hall C, Chang KC. Natto Characteristics as Affected by Steaming Time, Bacillus

Strain, and Fermentation Time. Journal of Food Science 2001; 66(1): 167-172.

Williams GR. Haemolytic Material from Aerobic Sporing Bacilli. Journal of general

Microbiology 1957; 16: 16-21.

Yi H, Chun J, Cha C-J. Genomic insights into the taxonomic status of the three subspecies of

Bacillus subtilis. Systematic and Applied Microbiology 2013; 13: 160-164.

Yin H, Guo C, Wang Y, Liu D, Lv Y, Lv F, Lu Z. Fengycin inhibits the growth of the human

lung cancer cell line 95D through reactive oxygen species production and mitochondria-

dependent apoptosis. Anti-cancer drugs 2013; 24(6): 587-598.

80

9. LIITTEET

LIITE 1

Liite 1. Lipopeptidien uutto 2-butanoliin.

10 ml

suspensiota

12 ml 2-

butanolia

150 rpm 15 min.

Mikrobipesäkkeen

nestekasvatus 25 ml:ssa BHI-

lientä 24 h 30 oC 150 rpm

Sentrifugointi

4000 rpm 10 min.

10 ml

supernatanttia

12 ml 2-

butanolia

150 rpm 15 min.

Sentrifugointi

4000 rpm 10 min.

10 ml

supernatanttia

10 ml

supernatanttia

Supernatanttien

yhdistäminen

2-butanolin

haihduttami

nen N2-

virrassa

Pelletin

eluointi 1

ml:aan 5

mM Tris-

HCl (pH

8,5)

81

LIITE 2

Liite 2. Medium of optimal lipopeptide production (MOLP) –elatusliemen koostumus Ahimoun

ym. (2000) mukaan. Elatusliemen pH säädettiin 5 M natriumhydroksidilla arvoon 7 ja

autoklavoitiin.

Ainesosa Pitoisuus

Peptoni 30 g/l

Sakkaroosi 20 g/l

Hiivauute 7 g/l

Kaliumdivetyfosfaatti (KH2PO4) 1,9 g/l

Kuparisulfaatti (CuSO4) 0,001 mg/l

Kidevedellinen Ferrikloridi (FeCl3·6H2O) 0,005 mg/l

Natriumolybdaatti (Na2MoO4) 0,0047 mg/l

Kaliumjodidi (KI) 0,002 mg/l

Kidevedellinen magnaanisulfaatti (MnSO4·H2O) 3,6 mg/l

Kidevedellinen magnesiumsulfaatti (MgSO4·7H2O) 0,921 mg/l

Kidevedellinen sinkkisulfaatti (ZnSO4·7H2O) 0,14 mg/l

Vetyboraatti (H3BO3) 0,01 mg/l

Kidevedellinen sitraatti (C6H8O7·H2O) 10,9 mg/l

82

LIITE 3

Liite 3. Lipopeptidien synteesikykyä määrittävien geenien tutkimiseksi valmistettu PCR-

reaktioseos. Kokonaistilavuus 50 µl / näyte.

Ainesosa Pitoisuus (surfaktiinit ja

fengysiinit)

Pitoisuus (plipastatiinit ja

mykosubtiliini)

Nukleaasivapaa vesi

5 × SYBR Green -puskuriliuos 1 × 1 ×

MgCl2+ -ionit 1,5 mM 1,5 mM

Aluke 1 12 ng / µl 12 ng / µl

Aluke 2 12 ng / µl 12 ng / µl

Nukleotidit (dNTP) 0,2 mM 0,4 mM

Go Taq Flexi -polymeraasi 1,25 U 2,5 U

Kopioitava DNA ≥ 10 ng / µl ≥ 10 ng / µl

LIITE 4

Liite 4. Tutkittuja lipopeptidejä koodaavien geenien määrittämisessä käytetyt PCR-ajo-

ohjelmat. Kaikille näytteille käytettiin kolmen minuutin 94 oC alkudenaturaatiota, 30 sykliä, ja

ajot päätettiin 4 oC:een.

Lipopeptidit Denaturaatio Alukkeiden

kiinnittyminen Ekstensio Loppuekstensio

Syklejä

kpl

Surfaktiinit 94 oC / 1 min 43 oC / 30 s 72 oC / 45 s 72 oC / 10 min 30

Fengysiinit 94 oC/ 1 min 45 oC / 30 s 72 oC / 45 s 72 oC / 10 min 25

Mykosubtiliini 94 oC/ 1 min 45 oC / 30 s 72 oC / 45 s 72 oC / 10 min 25

Plipastatiinit 94 oC/ 1 min 58 oC / 30 s 72 oC / 75 s 72 oC / 10 min 30