bactérias ii
TRANSCRIPT
11/09/2017
1
MORFOLOGIA E ULTRA-ESTRUTURA DE BACTÉRIAS
Microbiologia FFI 0751
Profa. Dra. Ilana CamargoContinuação (aula 5)
Citoplasma
11/09/2017
2
Citoplasma
Substância da célula dentro da membrana plasmáticaEspesso, aquoso, semitransparente, elástico
80% - àguaProteínas (enzimas)CarboidratosLipídeosÍons inorgânicosCompostos de peso molecular muito baixo
Principais estruturas:DNARibossomosInclusões
Parede✓
Estruturas internas à parede✓
Membrana citoplasmática✓
Citoplasma✓
Inclusões✓
Endósporos✓
Estruturas externas à paredeo
Glicocálice (ou glicocálix) o – Camada limosa e cápsula
Flageloso
Fímbrias e Pilio
Locomoção da célula bacterianao
Flagelaro
Deslizamentoo
Taxias (fototaxia, quimiotaxia)o
MORFOLOGIA E ULTRA-ESTRUTURA DE BACTÉRIAS
11/09/2017
3
GlicocáliceCamada limosa e cápsula
Glicocálice/Glicocalix: Camada de material viscoso que
envolve as células bacterianas.
Produzido na maioria dos casos dentro da célula e
excretado para a superfície celular.
Composto de polímeros (viscoso e gelatinoso) situado
externamente à parede celular.
Cápsula – Se estiver organizado e acoplado firmemente à parede
celular (exclui partículas pequenas como tinta naquim);
Camada limosa – Se estiver desorganizado, sem forma e acoplado
frouxamente à parede celular tende a ser solúvel em água.
Estruturas externas à parede - Glicocálice
11/09/2017
4
Estruturas externas à parede - Glicocálice
Podem ser:
espessas ou delgadas,
rígidas ou flexíveis,
dependendo na sua composição química
e grau de hidratação
Estruturas externas à parede - Glicocálice
Evidenciada pela Tinta Nanquim
11/09/2017
5
Composição:
Único tipo de açúcar –homopolissacarídeos;
Ex.: Streptococcus mutans
Sacarose – glicina = polímero para aderir às
superfícies lisas dos dentes e causa a cárie! Sem
a glicina, a bactéria seria expelida pelo fluxo da
saliva.
Mais de um tipo de açúcar – heteropolissacarídeos;
Ex. Streptococcus pneumoniae
Possui a cápsula tipo VI de Glicose, Galactose e
Ramnose.
Estruturas externas à parede - Glicocálice
A determinação dos constituintes da cápsula é
normalmente um passo importante na identificação de
certas bactérias patogênicas.
Algumas cápsulas são de polipeptídeos.
Ex. Bacillus anthracis (agente do carbúnculo/ antrax)
– Cápsula de ácido glutâmico.
Estruturas externas à parede - Glicocálice
11/09/2017
6
Funções do glicocálice:
-Aderência à superfícies sólidas;
- Proteção contra o dessecamento temporário se ligando a
moléculas de água;
-Reservatório de alimentos;
-Evita a adsorção e lise da célula por bacteriófagos;
Vírus que atacam bactérias.
-Proteção para as bactérias patogênicas contra fagocitose por
células sanguíneas, aumentando a chance de infecção.
Praga na indústria – responsável pelo acúmulo de lodo nos
equipamentos, afetando a qualidade dos produtos.
http://www.nehmi-ip.com.br/imagens_servicos/bio_7_p.gif
Cápsula
Cápsulas bacterianas. (a) Demonstração da presença de cápsulas por coloração negativa com tinta nanquim em Acinetobacter, observada em MO de fase. (b) Micrografia eletrônica de uma seção fina de célula de Rhizobium trifolli, corada com vermelho de rutênio, revelando a cápsula. Madigan et el., 2004.
11/09/2017
7
Estruturas externas à parede - Glicocálice
Glicocálice: cápsulas e camadas limosas– Maior parte de natureza polissacarídica
(exopolissacarídeos = EPS).
– Composição variável nas diferentes espécies.
– Proporcionam aderência entre a bactéria e superfícies, por meio de reações químicas: tecido hospedeiro (células do pulmão, dentes, implantes, tubulações, raízes e vasos condutores de plantas, rochas, etc).
EPS– Dificultam o reconhecimento e destruição pelas células
fagocitárias do sistema imune – relacionado à virulência(Ex. Streptococcus pneumoniae com e sem cápsula).
– Oferecem resistência à dessecação (tem muitas moléculas de água associadas).
– Aplicação industrial: espessantes – goma xantana(Xanthomonas campestris).
Sob determinadas condições, os microrganismos se aderem, interagem
com as superfícies e iniciam crescimento celular.
Essa multiplicação dá origem a colônias e quando a massa celular é
suficiente para agregar nutrientes, resíduos e outros microrganismos
(camada espessa), está formado o que se denomina BIOFILME.
São➢ complexos ecossistemas microbiológicos embebidos em uma matriz
de polímeros orgânicos, aderidos a uma superfície;
➢Forma-se um cultivo puro ou uma associação com outros
microrganismos.
➢Os microrganismos em biofilmes estão mais resistentes à ação de
agentes químicos e físicos.
EPS e Biofilme
11/09/2017
8
http://www.textbookofbacteriology.net/biofilm_formation.gif
http://ehp.niehs.nih.gov/realfiles/docs/1998/106-12/innovations.html
Biofilmes bacterianos
Fixação Crescimento Separação
Células planctônicas
11/09/2017
9
Biofilme
Biofilme
Encontrado onde há água e suporte sólido
Dentes, canos, lentes de contato, sistemas digestivos
11/09/2017
10
✓ Parede
✓ Estruturas internas à parede
✓ Membrana citoplasmática
✓ Inclusões
✓ Endósporos
o Estruturas externas à parede
✓ Glicocálice (ou glicocálix)
o Fímbrias e Pili
o Flagelos
o Locomoção da célula bacteriana
o Flagelar
o Deslizamento
o Taxias (fototaxia, quimiotaxia)
MORFOLOGIA E ULTRA-ESTRUTURA DE BACTÉRIAS
Fímbrias e Pili
Estruturas filamentosas compostas por proteínas que se projetam a partir da superfície de uma célula, podendo
apresentar muitas funções
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/57/caphtm/cap0401.htm http://www.dbi.ufla.br/Ledson/LBMP/Bact24.htm
11/09/2017
11
Estruturas externas à parede – Fímbrias
• Mais curtas e mais numerosas que flagelo.
• Função de adesão.
• Pilina: proteína formadora, distribuídas de modo helicoidal em torno de um eixo.
Fímbrias em célula em divisão de E. coli (Fonte: Tortora et al.,
2005).
• Neisseria gonorrhoeae –agente causador da gonorréia: fímbrias
ajudam a colonização das membranas mucosas.
http://www.nibib.nih.gov/NewsEvents/ResearchHighlights/Archive/2007/06June07
➢ Podem ser vistos somente pelo Microscópio Eletrônico
➢ Penetram na parede celular, mas não possuem ancoragem
complexa como os flagelos
➢ São ocos, mas possuem Pilina, proteínas arranjadas em
forma de espiral em torno de um espaço central para formar a
estrutura.
Estruturas externas à parede – Fímbrias
Em infecção, as fímbrias auxiliam a
bactéria patogênica a aderir às
células superficiais do trato
respiratório, intestinal ou
geniturinário.
http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Fimbriae%2C+Bacterial&lang=1
11/09/2017
12
Pili
Estruturas externas à parede – Pili
• Pili (singular Pilus): mais longos que as fímbrias e há apenas um ou dois por célula.
• Mesma estrutura das fímbrias.• Função sexual: auxilia a aproximação entre duas células
bacterianas para que ocorra transferência de DNA.
Presença de pilus em célula de E. coli, revelada pela adesão de bacteriófagos ao pilus. O contato entre duas bactérias conjugantes
é feito pelo pilus, que as aproxima por retração (despolimerização da pilina). Fonte: Madigan et al., 2004
11/09/2017
13
• Outras funções:
– aderência
– a classe de pili tipo IV realiza uma forma incomum de motilidade: motilidade pulsante!!
Por deslizamento: movimento ao longo de uma superfície sólida através da extensão dos pili seguida da sua retração.
Estruturas externas à parede – Pili
Parede✓
Estruturas internas à parede✓
Membrana citoplasmática✓
Inclusões✓
Endósporos✓
Estruturas externas à paredeo
Glicocálice✓ (ou glicocálix)
Fímbrias e ✓ Pili
Flageloso
Locomoção da célula bacterianao
Flagelaro
Deslizamentoo
Taxias (o fototaxia, quimiotaxia)
MORFOLOGIA E ULTRA-ESTRUTURA DE BACTÉRIAS
11/09/2017
14
Flagelos
Os flagelos são muitas vezes mais longos que as células, mas o
diâmetro é muito fino e por isso não podem ser vistos com o
microscópio óptico.
Procedimentos de coloração colocam uma camada de corante
precipitado na superfície dos flagelos fazem com que apareçam mais
espessos e, assim, visíveis ao microscópio óptico.
Os corantes são a base de acetato de pararosanilina e
hidrocloreto de pararosanilina.
Flagelos – corado de vermelho
Não flagelo – corado de azul
Estruturas externas à parede – Flagelos
11/09/2017
15
Estruturas externas à parede – Flagelos
Estruturas externas à parede – Flagelos
• Associado à locomoção da célula (movimento natatório), oferece uma vantagem na exploração dos recursos dos ambientes.
• Apêndices longos e finos (~20 nm de espessura).
• Único ou vários, em diferentes arranjos
Monotríquio: Flagelo único e polar;
Anfitríquio: Um flagelo em cada extremidade;
Lofotríquio: Dois ou mais flagelos em um pólo da célula;
Peritríquio: Flagelos distribuídos por toda a célula.
11/09/2017
16
Estruturas externas à parede – Flagelos
Fonte: Tortora et al., 2005
Estrutura do flagelo procariótico
Fonte: Madigan et al, 2004.
• Semi-rígida helicoidal (não fica reto).
• Formado pelo motor, gancho e filamento.
• Motor: ancorado na Membrana citoplasmática e parede, bastão + anéis, proteínas Mot (rotação) e Fli (reversão do sentido de rotação).
• Gancho: base mais rígida.
• Filamento: formado por subunidades de flagelina. Anel C
11/09/2017
17
Estrutura do flagelo procariótico
2002
Estrutura do flagelo procariótico
Bactéria Gram-negativo Bactéria Gram-positivo
2002
11/09/2017
18
Tipos de movimentação em procariotos com flagelação
Fonte: Madigan et al, 2004.
-Energia para rotação: movimento de prótons na membrana, passando pelo complexo Mot (força próton motiva). Translocação de 1.000 prótons para cada rotação.
-Velocidade até 60 comprimentos celulares/segundo-Capazes de girar até 300 revoluções por segundo!!
Impulsão em meio líquido 0,00017 Km/h60 comprimentos celulares/segundo!!
Velocidade não é constante e pode-se aumentar ou diminuir de acordo com a intensidade da força próton motiva
11/09/2017
19
http://microblog.me.uk/wp-content/uploads/petri.0.jpg
Proteus mirabilis
Crescimento da colônia seguido por “ondas”.
Células normais com 2 m e de 6-10 flagelos
Células de expansão com 40 m e de milhares de flagelos movem-se para a extremidade do ágar, perdem a diferenciação e voltam ao normal e novas células de expansão se formam...
Momento I
“Aprendendo Microbiologia com Poema e Poesia”
By Ilana Camargo
http://www.icej.org.br/?p=372
11/09/2017
20
Oh Meu Deus! Isso deve ser Proteus! ( por Ilana Camargo)
Ninguém, por mais que fosse desatento,deixaria de notar tal véu no crescimento.Um bacilo Gram negativo com tal mobilidade,migra sobre o meio sólido com grande habilidade.
Com tantos flagelos após grande diferenciação,migra pela superfície do ágar durante a incubação.
A morfologia ao redor de suas colônias... Hm! Com seu colega comente!O entrega até mesmo para o menos experiente:Basta observar o véu no ágar nutriente.
No ágar MacConkey, no entanto,há colônias em crescimento,mas o grande véu some como por encantoe a inibição eu não entendo!
Como sugestão eu digoe meu colega repete comigo:Oh Meu Deus! Isso deve ser Proteus!
Locomoção e taxia
11/09/2017
21
Locomoção microbiana - deslizamento
Mecanismo proposto para a motilidade por deslizamento em Flavobacterium johnsoniae –
movimentação de proteínas na superfície celular.Madigan et al., 2004.
Movimento mais lento e suave
Requer contato com superfície sólida
Cianobactéria filamentosa Oscillatoria princeps. Os filamentos deslizam por meio da secreção de
um polissacarídeo limoso.Madigan et al., 2004.
11/09/2017
22
• Motilidade pulsante com pili tipo IV
Locomoção microbiana - deslizamento
Respostas comportamentais - Taxias
Movimento de uma bactéria para perto ou longe de um •
estímulo particular.
Melhor conhecido em bactérias que apresentam locomoção •
flagelar.
Quimiotaxia• – resposta a um agente químico.
Fototaxia• – resposta a um estímulo luminoso.
Outras taxias (p.e., aerotaxia).•
11/09/2017
23
Regulação da quimiotaxia
• Proteínas sensoras localizadas na membrana –quimiorreceptores – percebem o gradiente químico einteragem com as proteínas que afetam a direção domotor flagelar.
• Principais agentes quimiotáticos bacterianos:nutrientes excretados por células como algas eprotozoários, ou por organismos macroscópicos mortos.
Quimiotaxia
Ocilação corrida
Gradiente maior do agente atrativo
11/09/2017
24
Fototaxia
Fototaxia positiva de uma colônia inteira da bactéria púrpura Rhodospirillum centenum, por um período de duas horas. No detalhe, MET de célula de R. centenum, com flagelação peritríquia induzida.
Madigan et al., 2004.
Parte II: Colorações
Sobre a aula prática
11/09/2017
25
Colorações
Simples Diferencial
Positiva
Negativa
Separação de gruposColoração de Gram
Coloração de Ziehl-Neelsen
Observar estruturasEsporosCápsulasFlagelo
Um único corantePara constatação de microrganismo
Colorações
Simples
Positiva
Negativa
Um único corantePara constatação de microrganismo
Positiva: baseada na utilização de corantescarregados positivamente que se ligam às cargasnegativas de superfície de células e de materialnucléico
Negativa: baseada na coloração com corantesacídicos que são repelidos pela carga negativa dasuperfície de células. A lâmina de vidro ficará coradaenquanto que o microrganismo aparecerá mais claro
Azul de metileno (1 – 2 minutos)Cristal de violeta (20 – 60 segundos)Carbolfucsina (15 – 30 segundos)
NigrosinaTinta nanquim
11/09/2017
26
Colorações
Diferencial
Separação de gruposColoração de Gram
Coloração de Ziehl-Neelsen
Observar estruturasEsporos (Schaeffer-Fulton)
Cápsulas (Gins)Flagelo (pararosanilina)
Dois corantes contrastantes que gerarão colorações diferentes em grupos
distintos de bactérias
11/09/2017
27
Coloração de células para observação micorscópica.Madigan et al., 2004.
Partindo de cultura líquida
Partindo de cultura sólida
Adicione uma gota de solução fisiológica e em
seguida adicione uma porção de uma colônia
com o auxílio de uma agulha de inoculação,
misture e espalhe sobre a lâmina
11/09/2017
28
Coloração de Gram
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Coloração de Gram
Fixação das bactérias na lâmina
Pelo calor (Fogo)
Cristal Violeta – 1 minuto
Lugol (Iodo) – 1 minuto
Álcool Cetona
Água destilada
Fucsina - 30 segundos
11/09/2017
29
Solução de Iodo (Lugol)Mordente
Substância que fixa o corante na célula!
Forma um complexo com o Cristal Violeta e se fixam
na camada peptideoglicana!! ( força de ligação)
Cristal Violeta
Se infiltra na parede celular e cora as células de roxo!
O tratamento de álcool (ou álcool cetona) extrai os lipídeos
resultando em uma porosidade ou permeabilidade
aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativo. O
complexo Cristal Violeta – Iodo (CV-I) é retirado com a
lavagem e as bactérias Gram-negativo são descoradas.
As bactérias Gram-positivas têm parede celular de
composição diferente e se desidrata durante o
tratamento com o álcool, diminuindo a porosidade e o
complexo CV-I não pode ser extraído.
11/09/2017
30
G+ - a célula não é afetada, permanecendo violeta
Última etapa: coloração pela Fucsina
G- - a célula adquire o corante, tornando-se vermelha/rosa.
Cocos Gram-positivo Cocos Gram-negativo
FUNÇÃO: Observar as características morfológicas das
bactérias isoladas – Excelente também como exame
direto para avaliar o material clínico (escarro).
Coloração de Gram
Lugol
água
Fucsina
11/09/2017
31
Coloração de Gram
Espiral
Gram-negativo
Cocos
Gram-positivo
Bacilo
Gram-positivo
11/09/2017
32
Gram positivos retém o cristal violeta e as bactérias Gram-negativo não.
No entanto, isto não é um fenômeno absoluto. Muitas vezes, culturas de
bactérias GRAM (+) parecem Gram (-) ou misturadas (+ e -).
Existem algumas razões para isto:
1 – Super descoloração
2 – Fixação pelo calor muito drástica
3 – esfregaço muito espesso
4 – Passos de lavagens impróprios
5 – Cultura muito velha
6 - Cultura misturada ou impura
Como a coloração de Gram depende da estrutura da parede celular, sempreque houver um dano na parede a coloração de Gram poderá variar.
Uma bactéria Gram-positivo poderá aparecer Gram-negativo, porém, uma bactéria Gram-negativo será sempre Gram-negativo.
- Tamanho: Pequeno, médio e grande (de 0,5 a 1,0 m de
diâmetro ou largura);
- Forma: cocos (esféricas), bacilos (cilíndricas) ou
espirilos (espiraladas);
Bactérias pleomórficas mudam de forma a medida que
a cultura envelhece. Por exemplo: Arthrobacter.
- Arranjo: estafilo..., estrepto..., diplo..., tétrade, sarcina,
paliçada.
Podem ser determinadas por microscopia e colorações!
As características morfológicas das bactérias:
11/09/2017
33
Momento II
“Aprendendo Microbiologia com Poema e Poesia”
By Ilana Camargo
http://www.icej.org.br/?p=372
Gram: ser ou não ser, eis a questão (por Ilana Camargo)
Do aconchego dos nossos clones nos levam...Para onde vamos nesta alça quente?
Deslizam-nos em uma gota de salina sobre uma lâmina de vidroO que vão fazer com a gente?
Ficamos à espera,Ficamos aflitos...
A lâmina seca.Ouço dos humanos alguns gritos.
De repente, nos fixam ao calor do fogo Aí que chega a realidade:
É a primeira aula sobre a coloração desse povo!Então vamos mostrar a nossa identidade!!
Será que vão acertar?Enxergamos tudo roxo por um minuto.
é o cristal violeta a nos corar.Depois vem o lugol como um mordenteE por mais um minuto coram a gente.
Hora do banho de cachoeiraÉ uma breve e leve ducha.
Mas que os humanos chamam de torneira.
De repente tudo fica gelado,e um arrepio vem à tona:É a vez do álcool cetona.
Eu e meus irmãos nos descoramos.Lá vem a fucsina rapidamente.
Vão nos reconhecer estes humanos?
Mais uma ducha gostosa,Depois nos deixam secar.
Ficamos todos cor de rosa:Será que vão adivinhar?
Do microscópio veio uma luminosidade:Tem alguém a nos espiar.
Tentam observar a nossa identidade...acho que vão acertar.
“Estas são todas rosa claro!!”O humano tem certeza disso.
“Porém o Gram eu não declaro!!”O medo de errar é coisa de Bixo!
Gram positivo ou Gram negativo?Eis a questão!
Se somos rosa depois da sua proeza,Fala ai seu Bixão:
Somos Gram negativos com certeza!!