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Bactérias, leveduras e algas: biofábricas de proteínas
Prof. Fabricio Rochedo Conceiçã[email protected]
27 de março de 2012
Graduação em BiotecnologiaDisciplina de Biotecnologia Microbiana II
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Por que produzir e purificar proteínas recombinantes?
Estudos bioquímicos
Determinação da estrutura 3D
Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico...
Alternativa para as seguintes limitações:
Quantidade
Dificuldade de purificação a partir do tecido original
Contaminação (príons, vírus, oncogenes...)
Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas
Processo completamente controlado
Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos
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Mycoplasma hyopneumoniae
Pneumonia Micoplásmica Suína
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Toxina botulínica
Clostridium botulinum C e D
Botulismo
Como prevenir?
Toxóide
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Sistemas de expressão de proteínas heterólogas
***Algas, animais e plantas
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2. Expression vectors
3. Hosts
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Relação volume meio/capacidade do frasco
0,2 (20%)
Inóculo – 5 a 10%
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Bactérias e leveduras
Microalgas
Produção industrial
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Algumas empresas que comercializam insumos para a expressão de proteínas heterólogas
http://www.promega.com
http://www.neb.com
http://www.stratagene.com
http://www.invitrogen.com
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Cultivo:- 28 a 37 C- Aerobiose- pH neutro- Fonte de C e N, microelementos (sais)
Escherichia coli Bacillus subtilis
BACTÉRIASBACTÉRIAS
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APLICAÇÕES- Minimizar a proteólise- Maximizar a expressão- Minimizar “vazamento” de expressão (expressão de proteínas tóxicas)- Facilitar o folding- Solubilidade
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Vantagens Desvantagens
Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais
Enorme variedade de vetores disponíveis
Atividade biológica pode diferir da proteína natural
Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas
Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção
Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão
Expressão heteróloga em E. coli
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*** Alternativas
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Vantagens Desvantagens
Não patogênico (sem LPS); GRAS Proteases extracelulares
Codon usage adequado Plasmídeos instáveis
Possibilidade de secreção da proteína Expressão geralmente menor que E. coli
Biologia Molecular e Fisiologia conhecidas
Alta produção de proteínas heterólogas
Expressão heteróloga em B. subtilis
*** Alternativas
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LEVEDURASLEVEDURAS
Eucariotos unicelulares – “organelas”
Multiplicação rápida
Manipulação simplificada
Altas densidades celulares
Não Patogênicas (GRAS)
Fisiologia e genética bem conhecidas
Realizam modificações pós-traducionais
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PRINCIPAIS ESPÉCIES UTILIZADAS
PRINCIPAIS ESPÉCIES UTILIZADAS
Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Pichia methanolica Hansenula polymorpha (Pichia augusta) Kluyveromyces lactis Schizosaccharomyces pombe Schwanniomyces occidentalis Yarrowia lipolytica
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DESVANTAGENSDESVANTAGENS
Hiperglicosilação – mais de 100 resíduos de manose
Alteração da antigenicidade da proteína
Alteração da estrutura 3D
Produção de etanol – tóxico
Falha na secreção de proteínas
Alternativa: outras espécies de leveduras
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Metilotrófica – metanol como fonte única de carbono
Glicosilação mais estável e semelhante a de mamíferos
Fermentação pobre – não produz etanol e atinge altas densidades
celulares
28 a 30 C, aerobiose, pH 5,0 - 6,0
Fonte de C (glicerol, metanol...)
Fonte de N (sulfato de amônio)
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Desvantagens
Proteólise de proteínas secretadas
Poucos vetores disponíveis (Invitrogen)
Necessita o uso de fermentadores para atingir alta densidade
celular – no entanto não realiza fermentação. Precisa de
oxigênio!
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METABOLISMO DO METANOLMETABOLISMO DO METANOL
Álcool Oxidase
Dois genes: AOX1 e AOX2
AOX1 é mais expresso e altamente induzido na presença de
metanol
Enzima tem baixa afinidade por metanol, formando
formaldeído. Compensa produzindo grande quantidade de AOX
(~30% do total de prot)
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FENÓTIPOSFENÓTIPOS
Mut = Metanol Utilization
Mut+ - crescimento rápido em metanol
MutS – crescimento lento em metanol
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CEPASCEPAS
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CLONAGEM - INTEGRAÇÃOCLONAGEM - INTEGRAÇÃO
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PROTEÍNAS EXPRESSAS EM PICHIA
PROTEÍNAS EXPRESSAS EM PICHIA
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MICROALGAS
MICROALGAS
Eucariotos unicelulares que realizam fotossíntese
Elaboração de alimentos e obtenção de compostos naturais de valor agregado
“Best of both worlds”
Microrganismos: rápido crescimento e facilidade de cultivo
Plantas: capacidade de realizar modificações pós-transcripcionais/traducionais
Rápida produção e scale up
Meio de cultivo muito barato: sais, CO2 e luz solar
Não Patogênicas (GRAS)
Baixo custo de produção de algumas proteínas recombinantes
Chlamydomonas, Chlorella, Volvox, Haematococcus e Dunaliella
Baixa expressão de proteínas heterólogas
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Chlamydomonas reinhardtii
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Cultivo:
- No geral 18 a 22 C- Agitação- Luz natural ou fluorescente- pH 8,2 – 8,7- Microelementos (P, Zn, B...)- Salinidade 20 a 24 g.L-1
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