TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCMKHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

---------- ----------

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH HOÁ SINH

Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài HươngCN. Bùi Văn Thế Vinh

Tp. Hồ Chí Minh, 04/2009

2

Lời mở đầu

Bài giảng “Thực hành sinh hoá” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Môitrường & Công nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM.

Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thínghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dungchính của học phần lý thuyết sinh hóa cơ sở.

1. Giới thiệu phòng thí nghiệm sinh hóa, cách pha chế các dung dịchchuẩn độ và các dung dịch đệm;2. Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS);3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl;4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford;5. Xác định hoạt tính enzyme amylase.

3

BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH CHUẨN ĐỘVÀ CÁC DUNG DỊCH ĐỆM

1. Yêu cầu đối với sinh viên làm thí nghiệm:- Sinh viên phải có mặt đủ và đúng giờ trong các buổi thí nghiệm. Nếu

nghỉ học có lí do chính đáng thì sinh viên phải xin phép giáo viên sắp xếp cholàm thí nghiệm bù. Thiếu một bài thí nghiệm coi như chưa hoàn tất chương trình.

- Sinh viên phải đọc kỹ, nắm vững nội dung bài thí nghiệm và chuẩn bịsẵn bản báo cáo kết quả trước khi đến phòng thí nghiệm (PTN). Trước buổi thínghiệm giáo viên hướng dẫn sẽ kiểm tra việc chuẩn bị của sinh viên. Đạt yêucầu, sinh viên mới được làm thí nghiệm.

- Trong PTN phải mặc áo blouse, rất thận trọng khi sử dụng dung môi dễcháy nổ và hóa chất độc hại.

- Khi làm thí nghiệm phải trật tự, cẩn thận, giữ sạch nơi làm thí nghiệm,tiết kiệm hoá chất. Làm vỡ hoặc gây hư hỏng dụng cụ, thiết bị thì phải bồithường.

- Sau khi thí nghiệm, sinh viên phải rửa dụng cụ, sắp xếp lại dụng cụ, hóachất đúng chỗ, lau sạch bàn thí nghiệm và bàn giao cho cán bộ phòng thí nghiệm.Mỗi buổi thí nghiệm, lớp cử một tổ trực nhật có nhiệm vụ nhắc nhở các bạn giữvệ sinh chung và làm sạch PTN sau giờ thí nghiệm.

- Cuối mỗi buổi thí nghiệm sinh viên phải nộp bản báo cáo kết quả thínghiệm cho giáo viên hướng dẫn. Viết báo cáo ngắn gọn, viết tay gồm nguyêntắc, phương pháp, phương trình phản ứng, sơ đồ tiến hành thí nghiệm, bảng kếtquả thô, công thức tính và kết quả tính cùng các ý kiến giải thích hay nhận xét.

- Mỗi bài thí nghiệm sẽ có điểm. Điểm môn học sẽ gồm điểm thực hànhthao tác, sự hiểu bài, tuân thủ nội quy và điểm các bài báo cáo.

2. Hướng dẫn sử dụng một số thiết bị trong phòng thí nghiệm1. Cân điện tử2. Máy đo so màu quang phổ3. Bộ chưng cất Kjendahl (hoặc máy cất nitơ tự động)4. Máy khuấy từ5. Máy đo pH7. Máy ly tâm6. Các dụng cụ thủy tinh khác: bình định mức, pipet, micropipet, burette,

bình Kjendahl, ....

4

3. An toàn khi làm việc với axit và kiềm1. An toàn khi làm việc với axit:Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện

phản ứng với các hơi axit tự doKhi pha loãng, luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếpGiữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang, găng

tay và kính bảo vệ mắt. Nếu làm văng lên da, lập tức rửa ngay bằng một lượngnước lớn

Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúngH2SO4: Luôn cho acid vào nước khi pha loãng, sử dụng khẩu trang và

găng tay để tránh phòng khi văng acidCác acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay, kính bảo

hộ.2. An toàn khi làm việc với kiềmKiềm có thể làm cháy da, mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấpMang găng tay cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm

đặcThao tác trong tủ hút, mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi

kiềm.Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da, mang găng tay cao su, khẩu

trang, thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. Hơi amoniac dễ cháy, phản ứng mạnh vớichất oxy hoá, halogen, axit mạnh.

Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da, tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kimloại nặng:Ag, Pb, Zn ... và muối của chúng.

Kim loại Na, K, Li, Ca: phản ứng cực mạnh với nước, ẩm, CO2, halogen,axit mạnh, dẫn xuất clo của hydrocacbon. Tạo hơi ăn mòn khi cháy. Cần mangdụng cụ bảo vệ da mắt. Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate,cho vào từ từ. Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan. Tương tự khi hoà tan vớinước, đồng thời phải làm lạnh nhanh.

Oxit canxi rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước, cần bảo vệ da mắt,đường hô hấp do dễ nhiểm bụi oxit.

Natri và kali hydroxyt: rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước. Các biệnpháp an toàn như trên, cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làmngược lại.

4. Chuẩn bị thí nghiệm1. Hoá chất thí nghiệm:Các hoá chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, ... trong

phòng thí nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm.

5

Hoá chất có thể ở dạng rắn (Na, MgO, NaOH, KCl, (CH3COO)2...; lỏng(H2SO4, aceton, ethanon, chloroform, ...) hoặc khí (Cl2, NH3, N2, C2H2 ...) vàmức độ tinh khiết khác nhau:

- Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90%- Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99%- Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99%Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những

yêu cầu khác nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu2. Nhãn hiệu hoá chất:

Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín cónhãn ghi tên hoá chất, công thức hóa học, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh,khối lượng phân tử, nơi sản xuất, điều kiện bảo quản.

3. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất:Khi làm việc với hóa chất, nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên

cần hết sức cẩn thận, tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọingười. Những điều cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt nhưsau:

- Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ, vôcơ, muối, acid, bazơ, kim loại, ...) hay theo một thứ tự a, b, c để khi cần dễ tìm.

6

- Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chấttrước khi dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu.

- Chai lọ hóa chất phải có nắp. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạchnắp, cổ chai, tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai.

- Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trongchai lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối.

- Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửangay, không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất.

- Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa.Khi cần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi, có mùi,... phải đưa vào tủ hút, chú ýđậy kín nắp sau khi lấy hóa chất xong.

- Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ, không ngửi haynếm thử hóa chất.

- Khi làm việc với acid hay base mạnh:Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ

nước vào acid hay base);Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như

ống bóp cao su.Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên

vết bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏngbase). Nếu bị bắn vào mắt, dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%.

Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày, nếu là acid phải súc miệngvà uống nước lạnh có MgO, nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh cóCH3COOH 1%.Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm.

5. Dung dịchDung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau

về mặt vật lý và hóa học. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi. Nếuchất hòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan, nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất.

Tùy theo tính chất của dung môi mà phân thành dung dịch nước và dungdịch khan. Phần lớn các dung dịch acid, base, muối trong phòng thí nghiệm làdung dịch nước, dùng dung môi là nước. Một số chất khác tan trong dung môihữu cơ.

Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch. Cónhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau. Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị,phân tích và tính toán khác nhau.

1. Các đơn vị nồng độ dung dịch* Nồng độ phần trăm, (%)

7

- Nồng độ phần trăm khối lượng - khối lượng, % (w/w): là số gam chất tancó trong 100g dung dịch.Ví dụ: dung dịch NH4Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH4Cl

- Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100mldung dịch.Ví dụ: dung dịch CuSO4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO4

- Nồng độ phần trăm thể tích - thể tích, % (v/v): là số ml dung chất cótrong 100ml dung dịch.

Ví dụ: dung dịch gycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10mlglycerin* Nồng độ gam-lit, (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch.* Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol, (Mol/L) hay M: là số phân tử gam(hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch.

Ví dụ: Dung dịch KH2PO4 M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15phân tử gam KH2PO4

* Nồng độ đương lượng gam, (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan cótrong 1 lit dung dịch.

Ví dụ: dung dịch KOH 0,5N là trong 1000ml dung dịch chứa 0,5đlg KOH* Nồng độ dung dịch bảo hòa: là khối lượng tối đa chất hòa tan trong dung dịch.

Ngoài ra trong các phép phân tích vi lượng còn có một số đơn vị nồng độkhác như:

- Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch- Miligam phần trăm, mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch.- Microgam phần trăm, µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch.- Phần nghìn, 0/00: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch.- Phần triệu, ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch.- Phần tỷ, ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch.2. Cách pha dung dịch có nồng độ xác định

* Pha dung dịch có nồng độ phần trăm theo khối lượng, % (w/w)- Chất tan là chất rắn khan:Ví dụ: 1) Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w)

100g dung dịch cần 40g NaOH500g dung dịch cần Xg?Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200gLượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml)Vậy, cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất, hòa tan ta được 500gdung dịch NaOH 40%

- Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4. 12H2O;...)Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn.

8

Ví dụ: 2) Pha 320g dung dịch CuSO4 10% (w/w) từ CuSO4.5H2OM(CuSO4) = 160 và M(CuSO4.5H2O) = 250Lượng CuSO4 khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32gLượng CuSO4.5H2O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50gLượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml)Vậy, cân 50g CuSO4.5H2O, đong 270ml nước cất, hòa tan ta được 320gdung dịch CuSO4 10%.

- Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn:Ví dụ: 3) Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10%

Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25gLượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250gLượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250gVậy, đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%, hòa tan ta được 500gNaOH 5%

- Pha dung dịch bão hoà:Dung dịch bão hòa là dung dịch có lượng chất tan tối đa. Nếu cho thêm

chất tan vào dung dịch bão hòa thì lượng chất tan đó không tan được nữa và sẽlắng xuống.

Muốn pha dung dịch bão hòa cần phải biết độ tan tối đa của chất tan (nồngđộ bão hòa). Ở mỗi nhiệt độ khác nhau, mỗi loại dung môi khác nhau thì nồng độbão hòa của mỗi loại chất tan sẽ khác nhau. Tra cứu những số liệu này trong "Sổtay các hiện tượng hóa lý".- Cách pha nhanh dung dịch bão hòa khi không tra được số liệu từ bảng:

Lấy chất tan cần pha vào becher, thêm một ít nước cất và khuấy cho tan.Nếu sau khi khuấy, chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phíatrên là dung dịch bão hòa. Nếu chất tan tan hết, thêm chất tan và tiếp tục khuấy,cứ như thế cho đến khi chất tan không còn tan được nữa.* Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích- Chất tan là chất rắn khan

Cân lượng chất tan cần thiết, chuyển sang bình định mức, dùng nước cấthòa tan và định mức đến thể tích đúng.Ví dụ: 3) Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v)

Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50gVậy, cân 50g NaCl, hòa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất, tađược 1lít dung dịch NaCl 5%.

- Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4. 12H2O;...)Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh có sẵn giống

như ở phần a.- Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H2SO4 ...

9

Việc cân không thuận lợi, có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thứcV = M/d

V: Thể tích chất lỏng; M: khối lượng chất lỏng cần cân; d: tỷ trọng chấtlòngChú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chấtmà là các dung dịch đậm đặc. Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tíchvà thay đổi tùy theo loại hóa chất. Ví dụ như H2SO4 - 96%; HCl - 37%; H3PO4 -65%; NH4OH - 25%. Do đó khi pha các dung dịch từ các loại hóa chất nàyta phảichú ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc.Ví dụ: 5) Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml)

Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4,4gLượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4,4)/37 = 11,9g

= 11,9/1,19 = 10 mlLượng nước cất thêm vào:440-10 = 430mlVậy, dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl37%, và 430ml nước cất tađược 440 ml HCl 1%Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch

thí nghiệm trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thínghiệm được pha chế theo nồng độ khối lượng - thể tích (w/v).* Pha dung dịch nồng độ phân tử gam

Mol (M) hay phân tử gam (ptg) là khối lượng của các chất tính ra gambằng khối lượng phân tử của nó.

Dung dịch nồng độ 1M là dung dịch chứa 1ptg chất hòa tan trong 1 lít.Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó, ta tính khối lượng

phân tử chất đó ( hoặc tra bảng) theo đơn vị gam. Cân chính xác lượng chất tan,qua phễu cho vào bình định mức có dung tích 1 lít. Cho vào từng lượng nước cấtnhỏ, lắc để hòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức. Chuyển dung dịch sangbình chứa, lắc để trộn đều đồng nhất.

Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có toảnhiệt thì phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêmnước tới vạch định mức.Ví dụ: 6) Pha 1 lít dung dịch KOH 1M

Phân tử lượng của KOH: MKOH = 39 +16 +1 =56Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56gVậy, cân 56g KOH, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 1000.Đây là phản ứng tỏa nhiệt, cần làm nguội dung dịch trước khi định mứcthành 1 lít.Nếu muốn pha dung dịch 2M; 3M hay 0,1M; 0,05M ta cũng tiến hành

tương tự với lượng cân tương ứng.

10

Ví dụ: 7) Pha 500ml dung dịch KCl 3MPhân tử lượng của KCl: MKCl = 39 +35,5 = 74,5Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74,5 *3*500)/1000 =111,75gVậy, cân 111,75g KCl, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức500, định mức đến vạch.Trường hợp chất rắn có ngậm nước, ptg chất đó phải tính luôn cả khối

lượng các phân tử nước.Nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính toán dựa vào nồng độ dung dịch đó.

Ví dụ: 8) Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37%Phân tử lượng HCl: MHCl = 1+35,5 = 36,5Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = (36,5*100)/37 = 98,65g

Hay 98,65/1,19 = 83mlVậy, đong 83ml HCl 37% cho vào bình định mức 1000 có sẵn 1 ít nước.Định mứ c thành 1 lít. Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất

độc hại.* Nồng độ đương lượng gam (N)

Dung dịch nguyên chuẩn là dung dịch có nồng độ 1NĐương lượng gam(đlg) được định nghĩa theo mỗi trường hợp riêng biệt từ

phương trình phản ứng dùng để định phân.Định phân acid- base:

- Đlg của một axit là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 iongam H+.

- Đlg của một base là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 iongam OH-.Ví dụ: 9) Phản ứng giữa HCl và NaOH

H+Cl- + Na+OH- → Na+Cl- + H2O1ptg HCl cho ra 1 ion gam H+, vậy 1 N (HCl) = 1M (HCl)1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH-, vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH)

Ví dụ: 10) Phản ứng giữa H2SO4 và NaOH2H+SO4

2- + 2 (Na+OH-) → 2 Na+SO42- + 2H2O

1ptg H2SO4 cho ra 2 ion gam H+ vậy 1N (H2SO4) = 2 M (H2SO4)1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH-vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH)Số ion gam tạo ra từ 1 ptg được gọi là hệ số nguyên chuẩn độ (ký hiệu là

n)N= M/n

Phản ứng oxy hoá khử: Tùy theo số điện tích trao đổi ở từng phản ứng màhệ số n khác nhau. Tính N theo công thức trên.Ví dụ: 11) 2 Na2S2O3 + I2 → Na2S4O6 + 2 NaI

11

I2 + 2e → 2I-

2 S2O32- -2e → S4O6

2-

Trong phản ứng này n =1 nên N = M/1 = MViệc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự với cách

pha dung dịch nồng độ phân tử gam (M).3. Hiệu chỉnh nồng độ dung dịchKhi pha hóa chất, có nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch

không chính xác như việc cân đong không chính xác, các hóa chất không tinhkhiết hay bị hút ẩm. Thời gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa, bị oxy hóa,dung môi bay hơi, vì vậy phải kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵndựa vào các dung dịch có nồng độ chính xác được gọi là dung dịch chuẩn(fixanal)

* Dung dịch chuẩnDung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác

và được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. Cácchất dùng trong dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúngkhông thay đổi nhanh chóng theo thời gian.

Pha dung dịch chuẩn, ta phải dùng ống chuẩn. Ong chuẩn là một ốngampun thủy tinh hay nhựa đóng kín. Bên trong chứa một lượng cân chính xácchất tan hoặc dung dịch chất tan. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vàobình định mức và pha thành 1 lít ta được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trênnhãn ngoài ống.* Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn

- Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình địnhmức, dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừathêm nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức.

- Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl,AgNO3, acid oxalic, ... có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chínhxác chất cần pha, pha loãng và định mức tới thể tích đúng.

- Đối với các chất như NaOH, HCl, Na2S2O3, ... không thể pha ngay đượcdung dịch chuẩn, do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thànhphần, vì vậy sau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ.

Ví dụ: 12) NaOH thường nhiễm một lượng Na2CO3 rất dễ chảy nước, HCldễ bay hơi, Na2S2O3 dễ bị mất nước tinh thể khi để ngoài không khí.

* Hiệu chỉnh nồng độ dung dịchĐối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha

dung dịch có nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đóhiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩnthích hợp.

12

Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0,1 N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩnH2SO4 0,1N để chuẩn độ lại. Dung dịch KOH 0,05N tron cồn phải dung dungdịch chuẩn là H2SO4 0,05N

Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sửdụng lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch

Xét một phản ứng trung hòa acid - base, 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1ion gam OH-. Vậy nếu dùng dung dịch acid và dung dịch base có cùng nồng độN, thì phản ứng sẽ đạt điểm cân bằng khi thể tích hai chất bằng nhau

C1V1 = C2V2

Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dungdịch ta có hệ số hiệu chỉnh K:

K= Cp/Ct = Vp/Vt

Ví dụ: 13) Dung dịch chuẩn là H2SO4 0,1N, dung dịch định pha là NaOH0,1NLấy 10ml H2SO4 0,1N cho vào erlen, thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien,dùng burette định phân bằng NaOH được 11 ml NaOHVậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0,1)/11 = 0,091 N

Hệ số điều chỉnh K: K= 0,091/0,1 = 10/11 = 0,916. Dung dịch đệm:Dung dịch đệm là dung dịch tạo môi trường ổn định pH cho dung dịch,

thường gồm một acid yếu và một base yếu với tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pHcủa dung dịch.

Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base cóhằng số phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với sốmol bằng nhau. Thí dụ, để có đệm pH ở giá trị 4.75, chọn cặp acid - baseCH3COOH (0,1M)/CH3COONa (0,1M). Nếu thêm vào dung dịch 0.001 mol HClthì pH của hệ vẫn chỉ ở mức 4.748 gần bằng 4.75. Nghĩa là pH thay đổi rất ít.

Trong cơ thể sống, dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng, ví dụ như ổnđịnh pH của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate.

Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhauthành 1 dung dịch là không có vấn đề gì. Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùythuộc vào ứng dụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tửtrong hệ phản ứng khảo sát theo chiều hướng có hại. Các phản ứng thường thấylà phản ứng tạo kết tủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử.

Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối củanó (Ví dụ: muối natri acetate), dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau:

CH3COOH + H2O -----> CH3COO- + H3O+

13

Có dung dịch khác chẳng hạn, chứa hỗn hợp base yếu (Ví dụ: amoniac)với muối của nó (Ví dụ: muối amoni clorua),trong dung dịch cân bằng có dạngsau:

NH3 + H2O ----------> NH4+ + OH-

Dung dịch đệm có pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base.Khi thêm một lượng acid mạnh (H3O

+), base liên hợp kết hợp với nó cho acidyếu (cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch) pH của dung dịch giảm khôngđáng kể.

Trái lại, khi thêm một lượng base mạnh (OH-), acid điện li cho H3O+ (cân

bằng chuyển dịch theo chiều thuận), ion hidroni H3O+ trung hòa OH- cho base

yếu H2O. Kết quả pH của dung dịch tăng không đáng kể.Khả năng đệm của hỗn hợp đệm phụ thuộc vào hàm lượng acid và base

liên hợp có trong hỗn hợp.

* Dung dịch đệm borat:- Dung dịch acid boric (a): 12,404 g H3BO3 hòa tan và định mức đến 1000

ml.- Dung dịch borat (b): 19,108 g Na2B4O7.10H2O hòa tan và định mức đến

1000 mlDung dịch đệm borat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a)

và dung dịch (b) theo bảng dưới đây:

A b pH a b pH9,80 0,2 6,60 6,50 3,50 8,209,70 0,6 6,77 6,00 4,00 8,319,40 0,6 7,09 5,50 4,50 8,419,00 1,0 7,36 5,00 5,00 8,518,75 1,25 7,50 4,50 5,50 8,608,50 1,50 7,60 4,00 6,00 8,698,00 2,0 7,78 3,00 7,00 8,847,70 2,30 7,88 2,00 8,00 8,987,50 2,50 7,94 1,00 9,00 9,117,00 3,00 8,08 0,00 10,0 9,24

*Dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2)- Dung dịch acid citric 0,1M (a): 21,01 g C6H8O7.H2O hòa tan và định

mức đến 1000 ml.- Dung dịch trinatri citrate 0,1M (b): 29,41 g C6H5O7Na3.2H2O hòa tan và

dẫn nước đến 1000 ml.Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung

dịch (a) và số ml dung dịch (b) theo bảng sau:

A b pH a b pH46,5 3,50 3,0 23,0 27,0 4,8

14

43,8 6,20 3,2 20,5 29,5 5,040,0 10,0 3,4 18,0 32,0 5,237,0 13,0 3,6 16,0 34,0 5,435,0 15,0 3,8 13,7 36,3 5,633,0 17,0 4,0 11,8 38,2 5,831,0 19,0 4,2 9,5 40,5 6,028,0 22,0 4,4 7,2 42,8 6,225,5 24,5 4,6 - - -

*Dung dịch đệm phosphate (pH = 5,7 – 8,0)- Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M (a): 27,8 g NaH2PO4 hòa tan

và định mức đến 1000 ml.- Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M (b): 53,05 g Na2HPO4.7H2O

hoặc 71,7 g Na2HPO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.Dung dịch đệm phosphate có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung

dịch (a) và số ml dung dịch (b) định mức đến 200 ml.

a b pH a b pH93,5 6,50 5,6 45,0 55,0 6,992,0 8,00 5,8 39,0 61,0 7,090,0 10,0 5,9 33,0 67,0 7,187,7 12,3 6,0 28,0 72,0 7,285,0 15,0 6,1 23,0 77,0 7,381,5 18,5 6,2 19,0 81,0 7,477,5 22,5 6,3 16,0 84,0 7,573,5 26,5 6,4 13,0 87,0 7,668,5 31,5 6,5 10,5 89,5 7,762,5 37,5 6,6 8,50 91,5 7,856,5 53,5 6,7 7,00 93,0 7,951,0 49,0 6,8 5,30 94,7 8,0

*Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH = 5,0 – 8,0)- Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15M (a): 23,9 g Na2HPO4.12H2O

hòa tan và định mức đến 1000 ml.- Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15M (b): 9,07 g KH2PO4 hòa tan và

định mức đến 1000 ml.Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số

ml dung dịch (b).

a b pH a b pH10 990 5,0 372 628 6,618 982 5,2 492 508 6,830 970 5,4 612 388 7,049 951 5,6 726 274 7,279 921 5,8 818 182 7,4

15

121 879 6,0 885 115 7,6184 816 6,2 936 64 7,8264 736 6,4 969 31 8,0

*Dung dịch đệm Glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6)- Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hòa tan và định mức đến

1000 ml.- Dung dịch HCl 0,2 M (b): 16,8 ml HCl đặc (37%) pha thành 1000 ml.Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X

ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.

X pH X pH5,0 3,6 16,8 2,86,4 3,4 24,2 2,68,2 3,2 32,4 2,4

11,4 3,0 44,0 2,2

*Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6)- Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hòa tan và định mức đến

1000 ml.- Dung dịch NaOH 0,2 M (b): 8 g NaOH hòa tan và định mức đến 1000

ml.Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X

ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.

X pH X pH4,0 8,6 22,4 9,66,0 8,8 72,2 9,88,8 9,0 32,0 10,0

12,0 9,2 38,6 10,416,8 9,4 45,5 10,6

*Dung dịch đệm acetate (pH = 3,6 – 5,6)- Dung dịch acid acetic 0,2M (a): 11,55 ml CH3COOH đặc và định mức

đến 1000 ml.- Dung dịch natri acetate 0,2M (b): 16,4 g CH3COONa hoặc 27,2 g

CH3COONa.3H2O được hòa tan và định mức đến 1000 ml.Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y

ml dung dịch (b) và định mức đến 100 ml.

a b pH a b pH46,3 3,7 3,6 20,0 30,0 4,844,0 6,0 3,8 14,8 35,2 5,041,0 9,0 4,0 10,5 39,5 5,236,8 13,2 4,2 8,8 41,2 5,4

16

30,5 19,5 4,4 4,8 45,2 5,625,5 24,5 4,6

*Dung dịch đệm vạn năng 0,1M- Dung dịch acid acetic 0,1M (a): 5,7 ml CH3COOH đặc và định mức

bằng nước cất đến 1000 ml.- Dung dịch acid phosphoric 0,1M (b): 6,45 ml H3PO4 đậm đặc và định

mức bằng nước cất đến 1000 ml.- Dung dịch acid ortho-boric 0,1M (c): hòa tan 6,18 g acid ortho-boric

trong nước cất và định mức đến 1000 ml.- Dung dịch natri hydroxide 1N (d): hòa tan 40 g NaOH trong nước cất và

định mức đến 1000 ml.Trộn lẫn các dung dịch (a), (b), (c) với thể tích bằng nhau nhận được dung

dịch đệm 0,1M có pH = 1,8. Điều chỉnh giá trị pH của dung dịch đệm trongkhoảng pH = 1,8 đến pH = 12,0 bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 1N (d). Cácdung dịch đệm vạn năng nồng độ khác được chuẩn bị tương tự.

17

BÀI 2. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNGPHƯƠNG PHÁP ACID DINITRO-SALICYLIC (DNS)

1. Nguyên tắc:Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với

thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệthuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thịđường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượngđường khử của mẫu nghiên cứu.

Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt, quả,...) mà cách chuẩn bị dung dịchnghiên cứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút, nhưng nguyên tắcchung như sau:- Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin,có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước. Cân và cho vào cối sứ 1 g nguyênliệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô,... đã đượcnghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi). Nếu là nguyên liệu tươi (nhưhoa, quả tươi) thì cân 5 – 10 g. Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và30 ml nước cất nóng 70 – 80oC. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mứcdung tích 1000 ml. Đun cách thủy 70 – 80oC trong 35 – 40 phút, kết tủa proteinvà các tạp chất bằng dung dịch chì acetate [Pb(C2H2O2)2.3H2O] hoặc chì nitrate[Pb(NO3)2] 10%. Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate). Sauđó loại bỏ lượng chì acetate dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa, để yên hỗn hợp10 phút. Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốchay bình khô. Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm.- Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang,sắn, khoai tây,... cần chiết đường bằng rượu 70 – 80oC, đun hỗn hợp cách thủytrong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí. Trong trường hợp nàykhông cần kết tủa protein bằng chì acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịchkhông nhiều.- Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua, dứa, chanh,khế,... cần chú ý là trong quá tình đun khi chiết, đường saccharose có thể bị thủyphân một phần. Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose. Trướckhi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòatới pH 6,4 – 7,0.

2. Dụng cụ - hóa chất:1 Dụng cụ

- Bình định mức 50ml

18

2. Hóa chất - nguyên liệu- Mẫu rau quả chứa đường (rau cải ngọt, dứa)- Thuốc thử DNS- Dung dịch glucose chuẩn3. Tiến hành- Chiết xuất đường trong thực vật

5g rau cải ngọt → nghiền nhỏ → cho vào becher 100ml + 10ml cồn 900

→ đun cách thủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh → để nguội → lọc(chỉ gạn lấy phần trong).

Cho tiếp 10ml cồn 800 vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên nồiđun cách thủy→ Để nguội → lọc (lặp lại 2 lần)

Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (800)Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy đun

nhẹ. Sau khi cho bay hơi rượu, mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm.Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50ml với nước cất. Để lắng cặn

khi đem làm hiện màu. Và tuỳ theo nồng độ đường nhiều hay ít mà pha loãngthêm 5-10 lần.- Dựng đường cong chuẩn và xác định hàm lượng đường

Cho vào 5 ống nghiệm sạch với các chất có thể tích như bảng sauHoá chất Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5Glucose(10 mg/ml)

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Nước cất(ml)

9.8 9.6 9.4 9.2 9.0

Nồng độ 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Từ các ống nghiệm trên lấy 1ml ở mỗi ống vào 5 ống nghiệm khác vàthêm vào mỗi ống 3ml thuốc thử DNS. Đun sôi đúng 5 phút. Làm lạnh đến nhiệtđộ phòng. Pha loãng mẫu nếu cần sao cho mật độ quang nằm trong khoảng 0,2 –0,8. Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với đối chứng là nước. Vẽ đườngchuẩn glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose.Đường thẳng thu được có thể cắt trục hoành ở 0,04 mg glucose do glucose bị oxyhóa.

Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương ứng 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mgglucose. So màu rồi vẽ đồ thị mẫu (vẽ trên máy tính)

Làm tương tự với mẫu dung dịch đường được chuẩn bị ở trên và một mẫuthử không (nước cất)4. Tính kết quả

Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được % lượng đường trongmẫu vật.

19

BÀI 3. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐBẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

1. Nguyên tắcTất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ

tổng số. Nitơ có trong thành phần acid amine của protein là nitơ protein. Nitơkhông có trong thành phần protein như của các muối vô cơ, acid nitric, các acidamin tự do, các peptid, urea và các dẫn xuất của urea, các alkaloid, các basepurine và pyrimidine,... là nitơ phi protein.

Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein- Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có

chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2

- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phântử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủyphân thành acid amine; carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O;còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành(NH4)2SO4 tan trong dung dịch

2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4

Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,... chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO,MgO,...

- Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH(NH4)2SO4 + 2 NaOH = Na2SO4 +H2O + 2NH3↑

- NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng,bình hứng chứa H2SO4 0.1N

2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư- Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.1N

H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2O

2. Dụng cụ - hóa chấta. Dụng cụ+ Bộ chưng cất Kjeldahl định lượng Nitơ gồm:

- Bình Kjeldahl phá mẫu- Bình cất đạm- Ống dẫn khí- Ống sinh hàn- Bình hứng (becher 250ml)- Bi thủy tinh- Bếp đun

20

+ Pipet 20ml; pipet 10ml+ Erlen 250ml+ vaseline

Bộ chưng cất Kjeldahl

b. Hóa chất + nguyên liệu+ Bột đậu nành (0.1g)+ H2SO4 đậm đặc+ NaOH 40%+ H2SO4 0.1N chuẩn+ NaOH 0.1N chuẩn+ Thuốc thử Tasiro+ chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1)

3. Tiến hành- Vô cơ hóa mẫuCân 100mg bột đậu nành đã sấy khô tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl, cho

tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxihóa). Cho thêm vào 200mg chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặtbình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh

Lưu ý giai đoạn này phải thực hiện trong tủ Hotte, đặt bình hơi nghiêngtrên bếp, tránh trường hợp khi sôi mạnh hóa chất bắn ra ngoài, khi đã sôi giữnhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hóa chất trào ra ngoài và không bị bay mấtamoniac.

Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khithấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tửở trên thành bình còn chưa bị oxi hoá vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đếnkhi dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sangbình định mức 100 ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và địnhmức đến vạch.

- Cất đạm

21

Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm cósẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tímhồng. Tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịchchuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bìnhchưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ).

Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.1N và3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao chongập đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm

Sau khi cất đạm 10-12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo rakhông, dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy qùy không đổi sang màuxanh là được. Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa.

- Chuẩn độ:Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất

màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sửdụng.4. Tính kết quả:Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức

N (mg%) = {1,42 * (V1-V2)*100/a}*2V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứngV2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độa số miligam nguyên liệu1,42 hệ số ; cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đươngvới 1,42mg Nitơ

22

BÀI 4. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁPBRADFORD

1. Nguyên tắcPhương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của

thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dungdịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sónghấp thu cực đại 465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đạiở bước sóng 595 nm. Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trựctiếp tới nồng độ protein.

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn vớidung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thườnglà bovine serum albumin. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốcnhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịchbằng máy quang phổ kế ta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng trong mẫu.Thực hiện một đối chứng với nước cất (OD0). Lấy giá trị OD = ODx - OD0.Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách chấm trênđường chuẩn theo OD, lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành. Đó chính là lượngprotein mẫu trong dung dịch đo.

Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250

2. Dụng cụ - hóa chất1. Dụng cụ- Máy đo quang phổ- Ống nghiệm (14)- Pipette 5ml, 1ml (có thể thay bằng pipetteman)- Đồng hồ bấm giây- Giấy thấm- Giá để ống nghiệm- Bình tia đựng cồn

23

2. Hóa chất- Cồn 900

- Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích, phatrong 1 ml nước cất, lắc đều cho tan. Giữ ở -200C. Khi dùng pha loãng ra 100 lần,được dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml.

- Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử có thành phần trong100ml như sau:

Coomassie Brilliant Blue: 0,005gEthanol tuyệt đối: 4,7gPhosphoric acid 85%: 8,5gPhẩm màu Coomasie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong một

chai đựng màu tối có nắp. Bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100ml bằngnước cất. Lắc đều, giữ ở 40C

- Dung dịch cần xác định hàm lượng protein (phòng thí nghiệm cung cấp)3. Tiến hành

- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứamẫu cần phân tích X

- Bổ sung các thành phần như bảng sau, riêng ống nghiệm X cho 1 mlmẫu cần phân tích do phòng thí nghiệm cung cấp (nếu cần sinh viên tự pha loãngmẫu trước khi phân tích)

- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vàoống nghiệm 0, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ốngnghiệm 1, lắc đều để yên,... cứ tiếp tục cho đến hết.

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 X

Nước cất (ml) 1 0.9 0.9 0.7 0.6 0.5 -

Albumin chuẩn (0,1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -

TT Bradford 5 5 5 5 5 5 5

Nồng độ Albumin (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 ?

- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dungdịch ở bước sóng 595 nm. Ta có giá trị OD0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1(OD1),... tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD.4. Tính kết quả:

- Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quangOD595

- Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml)với mật độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein ở trong mẫu phântích

24

BÀI 5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME

1. Nguyên tắc1.1. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệucao. Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định.Hoạt động hay hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyểnhóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy cóthể đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóacơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng.Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau:

- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trongmột thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.

- Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơchất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định.

Để thực hiện được mục đích trên, nhiều phương pháp phân tích khác nhauđược sử dụng: phương pháp đo quang phổ, đo độ phân cực, áp suất, độ nhớt,phương pháp sắc ký và phương pháp hóa học.* Đơn vị hoạt tính enzyme :

Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. Mộtđơn vị họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp.

a) Đơn vị hoạt tính thông dụng nhất là đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắtU) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUBđịnh nghĩa:

Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóađược 1 mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn.

1 U = 1 mol sản phẩm = 1 mol cơ chất (10-6 mol)/phút

b) Năm 1979, Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katallàm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme:

Một Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 giâyở điều kiện tiêu chuẩn.

1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 mol/ phút = 6 x 107 U

1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16,67 nKat (nanokatal)Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI).c) Đơn vị hoạt tính dựa vào sự thay đổi đặc tính hỗn hợp phản ứng, ví dụ sự

thay đổi độ đục, độ nhớt ...trong một đơn vị thời gian. Trường hợp cơ chất và sảnphẩm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt tính này.

N h ư v ậ y , c ó n h iề u đ ơ n v ị h o ạ t tín h e n z y m e . Đ iề u q u a n trọ n g n h ấ t l à c ầ n đ ịn hn g h ĩa r õ rà n g đ ơ n v ị h o ạ t tín h .

25

Hoạt tính riêng (specific activity) của enzymeHoạt tính riêng của một chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh sạch của chế

phẩm enzyme. Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg proteinprotein (U/mg protein) hoặc Kat/kg protein, trong đó hàm lượng protein đượcxác định theo phương pháp Lowry hoặc Bradford).* Điều kiện phản ứng để xác định hoạt tính

K h i tiế n h à n h th ự c n g h iệ m c ầ n trá n h n h ữ n g y ế u tố c ó th ể b iế n tín h p ro te ine n z y m e .

C á c th ô n g s ố n h iệ t đ ộ , p H , n ồ n g đ ộ io n v à th à n h p h ầ n d u n g d ịc h đ ệ m ả n hh ư ở n g lê n h o ạ t tín h e n z y m e . T h ử h o ạ t tín h e n z y m e p h ả i đ ư ợ c tiế n h à n htro n g đ i ề u k iệ n th íc h h ợ p n h ư đ iề u k iệ n s in h lý , đ iề u k iệ n tồ n trữ th ự cp h ẩ m h o ặ c đ iề u k iệ n m à h o ạ t lự c c ó th ể đ ạ t tố i ư u .

V ớ i n h ữ n g e n z y m e c ầ n c ó c h ấ t h o ạ t h ó a h o ặ c c h ấ t ổ n đ ịn h th ì p h ả i c h o c á cc h ấ t n à y v à o e n z y m e trư ớ c k h i c h o c ơ c h ấ t v à o h ỗ n h ợ p p h ả n ứ n g .

N ồ n g đ ộ c ơ c h ấ t tro n g p h ả n ứ n g e n z y m e p h ả i ở tro n g g iớ i h ạ n th íc h h ợ p ,đ ủ th ừ a đ ể b ã o e n z y m e , n h ư n g k h ô n g q u á c a o đ ể k ìm h ã m e n z y m e . S a u k h id ừ n g p h ả n ứ n g l ư ợ n g c ơ c h ấ t đ ư ợ c c h u y ể n h ó a 2 0 -3 0 % .

T h ờ i g ia n x á c đ ịn h h o ạ t tín h th ư ờ n g 5 -3 0 p h ú t. T ố t n h ấ t l à x á c đ ịn h tố c đ ộb a n đ ầ u c ủ a p h ả n ứ n g (3 0 -6 0 g iâ y ), v ì g ia i đ o ạ n n à y tố c đ ộ p h ả n ứ n g lớ nn h ấ t, sa u đ ó b ắ t đ ầ u g iả m (H ìn h 1 ) .

K h i x á c đ ịn h h o ạ t tín h p h ả i l à m m ẫ u đ ố i c h ứ n g so n g so n g v ớ i m ẫ u th ín g h iệ m . T ro n g m ẫ u đ ố i c h ứ n g e n z y m e p h ả i b ị b ấ t h o ạ t tr ư ớ c k h i tiế p x ú cv ớ i c ơ c h ấ t.

Hình 1. Động học phản ứng enzymeT ro n g b à i th ự c h à n h n à y , s in h v iê n là m q u e n v ớ i p h ư ơ n g p h á p x á c đ ịn h h o ạ t tín he n z y m e a m y la se

1.2. E n zym e am ylase và ph ư ơn g ph áp xác đ ịnh hoạt tính* K hai quát v ề enzym e am ylaseA m y la se là c á c e n z y m e x ú c tá c c h o c á c p h ả n ứ n g th ủ y p h â n tin h b ộ t, g ly c o g e n , v à

26

c á c p o ly sa c c h a r id e tư ơ n g t ự . A m y la se c h ia l à m 3 lo ạ i c h ín h :-a m y la se (Endo -1,4-glucanase; E C 3 .2 .1 .1 ) c ó tro n g n ư ớ c b ọ t, h ạ t h ò a

th ả o n ả y m ầ m , tụ y tạ n g , n ấ m m ố c , v i k h u ẩ n . E n z y m e n à y p h â n g i ả i liê n k ế t1 ,4 -g ly c o s id e ở g iữ a c h u ỗ i p o ly sa c c h a r id e (h o ạ t tín h e n d o a m y la se ) tạ oth à n h m a lto se , d e x tr in p h â n t ử th ấ p . D ư ớ i tá c d ụ n g c ủ a e n z y m e n à y , d u n gd ịc h tin h b ộ t n h a n h c h ó n g b ị m ấ t k h ả n ă n g tạ o m à u v ớ i d u n g d ịc h io d e v à

b ị g iả m đ ộ n h ớ t. -a m y la se b ề n v ớ i n h iệ t, n h ư n g k é m b ề n v ớ i a c id .-a m y la se (Exo -1,4-glucanase; EC 3.2.1.2) có nhiều ở thực vật (hạt, củ),xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4-glycoside từ đầu không khửtạo thành maltose và dextrin phân tử lớn. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệtđộ trên 70oC, nhưng bền với acid hơn -a m y la se .

Glucoamylase (Exo -1,4-g lu c a n a se ; EC 3.2.1.3) xúc tác cho phản ứngthủy phân liên kết 1,4- và 1,6-glycoside từ đầu không khử của chuỗipolysaccharide. Sản phẩm chủ yếu là glucose và dextrin. Enzyme này mấthoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. Nhiều glucoamylase hoạt động mạnh ở pH3,5-5,5.

* C ác phương pháp đo ho ạt tính enzym e -am ylaseN g u y ê n t ắ c c h u n g d ự a tr ê n c ơ s ở th ủ y p h â n tin h b ộ t b ở i e n z y m e tro n g d u n g

d ịc h e n z y m e n g h i ê n c ứ u th à n h c á c d e x tr in c ó p h â n t ử lư ợ n g k h á c n h a u . Đ o c ư ờ n gđ ộ m à u tạ o th à n h g i ữ a tin h b ộ t v à c ác s ả n p h ẩ m th ủ y p h â n c ủ a n ó v ớ i io d e b ằ n gm á y so m à u s ẽ tín h đ ư ợ c h o ạ t tín h e n z y m e .

Đ ơ n v ị a m y la se l à lư ợ n g e n z y m e c ầ n th iế t đ ể th ủ y p h â n h o à n to à n 1 0 m gtin h b ộ t sa u th ờ i g ia n p h ả n ứ n g 3 0 p h ú t tro n g đ iề u k iệ n th í n g h iệ m .2. H óa ch ất – D ụng cụ:

D u n g d ịc h đ ệ mD u n g d ịc h đ ệ m a c e ta te p H = 4 ,7 (x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e n ấ m m ố c ): trộ n

1 th ể tíc h C H 3C O O H 1 N v ớ i 1 th ể tíc h C H 3 C O O N a 1 N . K i ể m tra p H .D u n g d ịc h đ ệ m p h o sp h a te p H = 4 ,9 (x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e c ủ a m a lt) :

trộ n 1 0 m l d u n g d ịc h N a 2H P O 4 1 /1 5 M v ớ i 9 9 0 m l d u n g d ịc h K H 2P O 4 1 /1 5 Mn h ậ n đ ư ợ c 1 l d u n g d ịc h đ ệ m p h o sp h a te p H = 4 ,9 4 . K iể m tra p H .

D u n g d ịc h đ ệ m g ly c in e – N a O H 0 ,1 M p H = 1 0 (d ù n g đ ể x á c đ ịn h h o ạ t tín h-a m y la se k i ề m .

D u n g d ịc h H C l 0 ,1 N D u n g d ịc h io d : h ò a ta n 3 0 m g K I v à 3 m g I2 v ớ i m ộ t l ư ợ n g n h ỏ n ư ớ c c ấ t.

L ắ c n h ẹ h ỗ n h ợ p đ ể h ò a ta n h o à n to à n , sa u đ ó c h u y ể n d u n g d ịc h sa n g b ìn hđ ịn h m ứ c 1 0 0 0 m l, b ổ su n g n ư ớ c cấ t đ ế n v ạ c h m ứ c . B ả o q u ả n d u n g d ịc htro n g b ìn h m à u n â u đ ể c h ỗ tố i.

D u n g d ịc h tin h b ộ t 1 % : h ò a ta n 1 g tin h b ộ t ( th e o c h ấ t k h ô tu y ệ t đ ố i) v ớ i 5 0

27

m l n ư ớ c c ấ t tro n g b ìn h đ ịn h m ứ c 1 0 0 m l, lắ c đ ề u . Đ ặ t v à o b ế p c á c h th ủ yđ a n g sô i, l ắ c liê n tụ c c h o đ ế n k h i tin h b ộ t ta n h o à n to à n . S a u đ ó là m n g u ộ iv à b ổ su n g 1 0 m l đ ệ m a c e ta te p H = 4 ,7 (h o ặ c 1 0 m l d u n g d ịc h đ ệ mp h o sp h a te p H = 4 ,9 ) b ổ su n g n ư ớ c c ấ t đ ế n v ạ c h m ứ c , lắ c đ ề u . D u n g d ịc hđ ư ợ c c h u ẩ n b ị tro n g n g à y s ử d ụ n g .

D u n g d ịc h e n z y m e g ố c3. T iến hành:

T ríc h ly e n z y m e : e n z y m e đ ư ợ c tr íc h ly từ c h ế p h ẩ m h a y tế b à o , m ô đ ộ n gth ự c v ậ t b ằ n g d u n g d ịc h đ ệ m c ó p H th í c h h ợ p .

T ríc h ly e n z y m e t ừ v i k h u ẩ n : C â n m = 0 ,1 g c h ế p h ẩ m n g h i ê n c ứ u , d ù n gđ ũ a th ủ y tin h c h à c ẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tro n g m ộ t c ố c th ủ y tin h d u n g t íc h 5 0m l v ớ i m ộ t l ư ợ n g n ư ớ c n h ỏ . S a u đ ó c h u y ể n to à n b ộ h ỗ n h ợ p v à o b ìn h đ ịn hm ứ c d u n g tíc h 1 0 0 m l, b ổ su n g n ư ớ c c ấ t tớ i v ạ c h m ứ c . L ọ c v à th u h ồ i d ịc htr íc h ly e n z y m e . B ả o q u ả n d u n g d ịc h e n z y m e g ố c ở 2 – 4 oC tro n g th ờ i g ia n1 n g à y .

T ríc h ly e n z y m e n ấ m m ố c : C â n m = 5 g c h ế p h ẩ m e n z y m e th ô đ ã n g h iề nsơ b ộ , d ù n g đ ũ a th ủ y t in h c h à c ẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tro n g m ộ t c ố c d u n g t íc h5 0 m l. S a u đ ó c h u y ể n to à n b ộ c h ế p h ẩ m v à o b ìn h ta m g iá c d u n g tíc h 2 5 0m l, b ổ su n g 9 0 m l n ư ớ c c ấ t v à d ịc h đ ệ m a c e ta te p H = 4 ,7 . G iữ h ỗ n h ợ p ởn h iệ t đ ộ 3 0 oC tro n g th ờ i g ia n 1 g iờ c ó k h u ấ y đ ả o đ ịn h k ỳ . L ọ c v à th u h ồ id ịc h tr íc h ly e n z y m e . B ả o q u ả n d u n g d ị c h e n z y m e g ố c ở 2 – 4 oC tro n g th ờ ig ia n 1 n g à y .

T ríc h ly e n z y m e t ừ m a lt : C â n m = 5 -1 0 g m a lt đ ã n g h iề n n h ỏ , c h o v à o b ìn hn ó n d u n g tíc h 2 5 0 m l, b ổ su n g 9 0 m l n ư ớ c c ấ t v à 1 0 m l d u n g d ịc h đ ệ mp h o sp h a te p H = 4 ,9 . G i ữ h ỗ n h ợ p ở n h iệ t đ ộ 3 0 oC tro n g th ờ i g ia n 1 g iờ c ók h u ấ y đ ả o đ ịn h k ỳ . L ọ c v à th u h ồ i d ịc h tr íc h ly e n z y m e . B ả o q u ả n d u n gd ịc h e n z y m e g ố c ở 2 – 4 oC tro n g th ờ i g ia n 1 n g à y .

* D u n g d ịc h e n z y m e đ ể p h â n tíc hP h a lo ã n g d u n g d ịc h e n z y m e g ố c (h ệ số p h a lo ã n g n) b ằ n g d u n g d ịc h đ ệ m

sa o c h o tro n g 1 m l d u n g d ịc h e n z y m e p h â n tíc h c ó c h ứ a m ộ t l ư ợ n g e n z y m e đ ủ đ ểth ủ y p h â n 2 0 % - 7 0 % tin h b ộ t tro n g d u n g d ịc h ở đ iề u k iệ n x á c đ ịn h . N h ư v ậ y , đ ộp h a lo ã n g p h ụ th u ộ c v à o h o ạ t tín h c h ế p h ẩ m e n z y m e c ầ n p h â n tíc h .

C h u ẩ n b ị m ẫ u th í n g h iệ m , m ẫ u đ ố i c h ứ n g v à m ẫ u trắ n g

M ẫ u th í n g h iệ m M ẫ u đ ố i c h ứ n g M ẫ u trắ n gD u n g d ịc h tin h b ộ t 1 % 2 m l 2 m l 0

N ư ớ c c ấ t 0 0 2 m l

Đ ệ m 1 m l 1 m l 1 m l

D u n g d ịc h N a C l 3 % 0 ,5 m l 0 ,5 m l 0 ,5 m l

28

Ủ 4 0 oC , 1 0 p h ú t đ ể đ ạ t n h iệ t đ ộD u n g d ịc h e n z y m e 1 m l 0 0

Ủ 4 0 oC , 3 0 p h ú t đ ể x ả y ra p h ả n ứ n gH C l 1 N 1 m l 1 m l 1 m l

E n z y m e 0 1 m l 1 m l

N ư ớ c c ấ t 4 m l 4 m l 4 m l

Io d e 0 ,5 m l 0 ,5 m 1 0 ,5 m 1

D u n g d ịc h đ ố i c h ứ n g c ó m à u x a n hD u n g d ịc h th í n g h iệ m c ó m à u tím v ớ i c ư ờ n g đ ộ k h á c n h a u t ù y v à o lư ợ n g tin h b ộ tc h ư a b ị th ủ y p h â n .Đ o m ậ t đ ộ q u a n g c ủ a c á c d u n g d ịc h ở b ư ớ c só n g = 6 2 0 n m so v ớ i m ẫ u trắ n g .4. T ính k ết quả:D = m ậ t đ ộ q u a n g

S ố m g tin h b ộ t b ị th ủ y p h â n S = ( )20

Do Dx

Do

H o ạ t tín h e n z y m e a m y la se :

Hoạt tính chung =m

nS

10

trong đó:n = hệ số pha loãngm = khối lượng enzyme