bakterİyel salginlarin araŞtirilmasi; pfge yönteminin ... · − toplam elektroforez süresi...
TRANSCRIPT
![Page 1: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/1.jpg)
KURS 01-05SALGINLARIN İZLENMESİ VE MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİ
BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI;
PFGE yönteminin uygulamaları, problemleri ve sonuçların analizi
Barış Otluİnönü Üniversitesi Tıp FakültesiTıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Malatya.
![Page 2: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/2.jpg)
Modern epidemiyolojinin başlangıcı-John Snow
Dr.John Snow
![Page 3: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/3.jpg)
Modern epidemiyolojinin başlangıcı-John Snow
![Page 4: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/4.jpg)
Moleküler epidemiyoloji için yöntemler
PFGE
AP-PCR
RFLPAFLP
RAPD
MLST
RAPD
Dizi analizi
![Page 5: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/5.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
• Bir çok mikroorganizma için halen «altın standart» genotiplendirme yöntemidir.
Infect Genet Evol. 2010 Oct;10(7):866-75. Epub 2010 Aug 6.
![Page 6: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/6.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
• Kromozomal DNA polimorfizmine dayalı, tüm genomu hedef alan genotiplendirme
yöntemidir.
• Bu yöntemlerle izolatlar arasındaki ilişkilerin belirlenmesinde;
− bant paternlerinin benzerlik yüzdesine ya da
− bant sayısı ve büyüklüğündeki farklılıklara göre değerlendirme yapılır.
![Page 7: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/7.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
• PFGE kullanım alanları;
− hastane enfeksiyonlarının araştırılması ve bulaş kaynağının belirlenmesinde,
− özellikle gıda ile oluşan toplum kaynaklı salgınların incelenmesinde,
− laboratuvar kontaminasyonlarının doğrulanmasında
− hastaların izlenmesi
rölaps – yeniden infeksiyon ayrımı
İnfeksiyonun kalıcılığının gösterilmesi
kontaminasyon – infeksiyon ayrımının yapılması
• PFGE kullanım alanları;
− hastane enfeksiyonlarının araştırılması ve bulaş kaynağının belirlenmesinde,
− özellikle gıda ile oluşan toplum kaynaklı salgınların incelenmesinde,
− laboratuvar kontaminasyonlarının doğrulanmasında
− hastaların izlenmesi
rölaps – yeniden infeksiyon ayrımı
İnfeksiyonun kalıcılığının gösterilmesi
kontaminasyon – infeksiyon ayrımının yapılması
![Page 8: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/8.jpg)
Geleneksel Jel Elektroforez
![Page 9: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/9.jpg)
• DNA fragmentinin jel üzerindeki göçüne etki eden faktörler;
- büyüklüğü
- elektiriksel yükü ve üç boyutlu yapısı.
• Bunun yanında agaroz jelin konsantrasyonu ve por çapı DNA’nın göçünü etkiler.
Geleneksel Jel Elektroforez
University of Rochester
![Page 10: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/10.jpg)
- - - - -
• Geleneksel elektroforezde 20 kb’dan büyük DNA parçaları, jel üzerinde hemen
hemen aynı hızda göç edeceklerinden birbirlerinden ayrıştırılamazlar.
Geleneksel Jel Elektroforez
+ + + + +
![Page 11: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/11.jpg)
• Büyük DNA fragmentleri jel üzerinde nasıl ayrıştırılabilir ?
Pulsed Field Gel Electrophoresis
![Page 12: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/12.jpg)
• DNA’nın elektroforetik alandaki haraketi
Pulsed Field Gel Electrophoresis
-
---
--
-- -
-- -
+-
akım yok akım yok
![Page 13: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/13.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• 1984’de Schwartz and Cantor büyük DNA moleküllerinin daha iyi ayrışması için
elektriksel alanın periyodik olarak değiştirildiği bir elektroforez yöntemi geliştirdiler.
![Page 14: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/14.jpg)
• Field inversion gel electrophoresis (FIGE)− Tek yönlü ve sabit akımlı en basit sistemdir.
− Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni
önerilir. Özellikle 50-600 kb aralıkta iyi ayırım gücüne sahiptir.
-/+ -/+ -/+ -/+
PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması
-/+ -/+ -/+ -/+
![Page 15: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/15.jpg)
B- A-
• Orthogonal field alternation gel electrophoresis (OFAGE)− Elektriksel alan jel boyunca homojen olarak dağılmaz.
− DNA fragmnetleri, jelin farklı bölgelerinde farklı hızda göçer.
− Tekrarlanabilirliliği düşüktür.
− Laboratuvarlar ve cihazlar arası standardizasyon güçtür.
PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması
B+
B-
A+
A-
Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Apr 28;95(9):5150-5.
![Page 16: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/16.jpg)
B- A-
• Transverse alternating field electrophoresis (TAFE)− Jel elektriksel alana vertikal bir şekilde yerleştirilmiştir.
− Basit bir elektrot yapısı vardır ve akım jel boyunca homojen olarak dağılır.
− Elektriksel açı, üst bölgeler 115 alt kısımlarda 165 olmak üzere jel boyunca
farklılık gösterir. Bundan dolayı jelin alt kısımlarında DNA’nın göçü yavaşlar ve
bantlarda yığılma görülebilir.
115
PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması
B+
B-
A+
A-
• Transverse alternating field electrophoresis (TAFE)− Jel elektriksel alana vertikal bir şekilde yerleştirilmiştir.
− Basit bir elektrot yapısı vardır ve akım jel boyunca homojen olarak dağılır.
− Elektriksel açı, üst bölgeler 115 alt kısımlarda 165 olmak üzere jel boyunca
farklılık gösterir. Bundan dolayı jelin alt kısımlarında DNA’nın göçü yavaşlar ve
bantlarda yığılma görülebilir.
115
Infect Immun. 1991 Oct;59(10):3596-603.
![Page 17: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/17.jpg)
• Simultaneous tangential/rectangular inversion decussate electrophoresis (ST/RIDE)− TAFE düzeneğine ilave olarak bir çift elektrod daha vardır.
− Elektriksel alan jelin eni boyunca homojendir ve 90 ile 180 arasında
değiştirilebilir.
− Jelin alt kısımda band yığılmalarının oluşması önlendi.
B- B+
A-
PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması
• Simultaneous tangential/rectangular inversion decussate electrophoresis (ST/RIDE)− TAFE düzeneğine ilave olarak bir çift elektrod daha vardır.
− Elektriksel alan jelin eni boyunca homojendir ve 90 ile 180 arasında
değiştirilebilir.
− Jelin alt kısımda band yığılmalarının oluşması önlendi.
C+
B-
C-
B+
A+
Infect Immun. 1991 Oct;59(10):3596-603.
![Page 18: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/18.jpg)
• Rotating gel electrophoresis− Elektriksel alanın yönü yerine, jelin kendisi ya da elektrotlar döndürülür.
− B mekanik düzenek gerektirir.
− Mekanik olarak değişiklik hızı, elektriksel alan değişikliklerine göre daha yavaştır.
− Toplam elektroforez süresi uzundur.
- - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - -
PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması
+ + + + + + + + + + +
Ziegler A, Volz A Rotating Field Gel Electrophoresis (ROFE) In: Methods in Molecular Biology, 1992, Volume 12, Part I, 63-72
![Page 19: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/19.jpg)
• Contour- clamped homogenous electrıc fıeld (CHEF)− Hekzagonal yerleşime sahip toplam 24 (6 x 4) elektrota sahiptir.
− Homojen elektriksel alan sağlar.
− Elektriksel alanın açısı sabit veya değişken olabilir.• DRII sisteminde sabit 120’dir.• DRIII sisteminde 90-120 arasında• CHEF Mapper: sisteminde ise 1-360 arasında değişkendir.
PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması
B-
B+ A+
A-
• Contour- clamped homogenous electrıc fıeld (CHEF)− Hekzagonal yerleşime sahip toplam 24 (6 x 4) elektrota sahiptir.
− Homojen elektriksel alan sağlar.
− Elektriksel alanın açısı sabit veya değişken olabilir.• DRII sisteminde sabit 120’dir.• DRIII sisteminde 90-120 arasında• CHEF Mapper: sisteminde ise 1-360 arasında değişkendir.
120
CHEF DRII
![Page 20: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/20.jpg)
• Contour- clamped homogenous electrıc fıeld (CHEF)
PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması
![Page 21: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/21.jpg)
− Tüm kimyasallar üreticinin önerdiği şekilde depolanmış olmalı.
− Hesaplamalar doğru yapılmalı.
− Tartımlar doğru yapılmalı.
− Tamponlar için ultra saf su kullanılmalı.
− Kullanılacak tüm cam malzemeler temiz olmalı.
− Tüm cihazların doğru çalıştığı kontrol edilmeli.
− Doğru kimyasallar (enzim, deterjan) kullanılmalı.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Başlarken nelere dikkat edilmeli ?− Tüm kimyasallar üreticinin önerdiği şekilde depolanmış olmalı.
− Hesaplamalar doğru yapılmalı.
− Tartımlar doğru yapılmalı.
− Tamponlar için ultra saf su kullanılmalı.
− Kullanılacak tüm cam malzemeler temiz olmalı.
− Tüm cihazların doğru çalıştığı kontrol edilmeli.
− Doğru kimyasallar (enzim, deterjan) kullanılmalı.
![Page 22: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/22.jpg)
• Tüm genom hedef alındığından DNA’nın kırılmamış olarak elde edilmesi gereklidir.
• Aksi taktirde hatalı bant profilleri oluşacaktır.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
![Page 23: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/23.jpg)
Fiziksel Yöntemler– Kaynatma– Dondurma-çözme
Enzimler– Proteinaz K– Lizozim– Lysostaphin
Deterjanlar– SDS– Tween-80
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Standart yöntemlerle bakterinin ekstraksiyonu sırasında DNA’nın tam ve kırılmamış
olarak elde edilmesi mümkün değildir.
Fiziksel Yöntemler– Kaynatma– Dondurma-çözme
Enzimler– Proteinaz K– Lizozim– Lysostaphin
Deterjanlar– SDS– Tween-80
![Page 24: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/24.jpg)
Bu sebeplerden dolayı PFGE yönteminde DNA eldesi için
farklı bir yol izlenmektedir.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
![Page 25: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/25.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
BakterilerinParçalanması ve diyaliz Elektroforez
• Yöntemin ana basamakları
Bakteri Kalıplarınınhazırlanması
SonuçlarınAnalizRE ile kesim
10 m
m
![Page 26: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/26.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması
İlk olarak bakteri süspansiyonları hazırlanır.
Bunun için tür düzeyinde tanımlaması yapılmış mikroorganizmanın, saf kültürüne
ihtiyaç vardır.
![Page 27: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/27.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.Öncelikle tiplendirilecek bakteri türü dikkate alınarak uygun kültür yöntemi kullanmak
gereklidir. Örneğin; PFGE için C. difficile suşları “Schaedler’s anaerobic broth” da
üretilmelidir.
J Clin Microbiol. 2002 Sep;40(9):3546-7; author reply 3547.
“Schaedler’s anaerobic broth”
![Page 28: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/28.jpg)
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.Önerilen; katı besiyerinde saf olarak üremiş tek bir koloninin alınarak sıvı
besiyerinde üretilmesidir. Ancak, katı besiyerinde saf olarak üretilen bakteri
kolonileri de doğrudan kullanılabilmektedir.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
![Page 29: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/29.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.Bakteriler için kullanılacak tüm kültürler 24 saatlik olmalıdır.
![Page 30: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/30.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.
− Bakteriler hücre süspansiyon tamponu içerinde süpanse edilir.
− Hücre süspansiyon tamponu çoğunlukla Tris-HCl, NaCl ve EDTA içermektedir.
Ancak bazı bakteriler; yüksek EDTA konsantrasyonlarından ve NaCl ile
oluşabilecek ozmotik basınç yüzünden daha kalıp içerisine gömülmeden
parçalanabilir.
− Enterococcus spp. için; 100 mM Tris-HCL, 100 mM EDTA
1M NaCl içeren hücre süspansiyon tamponunda ozmatik dengesizliğe maruz kalırlar.
− S. aures için; 10 mM Tris, 1M NaCL
EDTA konsantrasyonlarına karşı oldukça hassasdır ve eğer mutlaka gerekli ise düşük
miktarlarda kullanılmalıdır.
![Page 31: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/31.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.
− Bakteriler hücre süspansiyon tamponu içerinde süpanse edilirken en önemli
nokta bakteri yoğunluğunun ayarlanmasıdır.
− Spektrofotometre, turbidometre, kolorimetre gibi optik yoğunluk temelli
yöntemler sıklıkla kullanılmaktadır.
![Page 32: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/32.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.
Bakteri yoğunluğunun ayarlanmasında en ideal yöntem “hemocytometer” .
![Page 33: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/33.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.
− Bakteri süspansiyonu hazırlanırken; koloniler pamuklu çubuklarla alınmamalı,
mutlak suretle öze kullanılmalı ve bakteri kolonisi çözücü içerisinde iyice
homojenize edilmelidir.
XX
![Page 34: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/34.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması
−Her bakteri türü kendine özgü yoğunlukta hazırlanmalıdır.
−Örneğin;
560 nm dalga boyunda
Pseudomonas türleri için 1.0
Streptococcus türleri için 1.0
Acinetobacter türleri için 0.7 absorbans yeterli olmaktadır.
• Bakteri kalıplarının hazırlanması
−Her bakteri türü kendine özgü yoğunlukta hazırlanmalıdır.
−Örneğin;
560 nm dalga boyunda
Pseudomonas türleri için 1.0
Streptococcus türleri için 1.0
Acinetobacter türleri için 0.7 absorbans yeterli olmaktadır.
![Page 35: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/35.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.
A. boumannii, bakteri yoğunluğu 590 nm
1.0 absorbans0.7 absorbans
![Page 36: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/36.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.
P. aeruginosaE. coli
McFarland4
McFarland7
McFarland3
McFarland4
McFarland7
![Page 37: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/37.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.
250 l HST+250 l LMP agaroz
250 l HST 250 l LMP agroz
içerisinde uygun yoğunluktabakteri olan hücre süspansiyon tamponu
aynı hücre süspansiyon tamponu içerisindehazırlanan %2’lik low melting agarose
İçerisinde bakteri bulunan%1’lik LPM agaroz
plug molds
Hücre/agaroz karışımının ısısı 50 C’yigeçmemelidir. Aksi taktirde hücrelerkalıp içerisine tam olarak gömülmedenparçalanacaktır.
LMP agaroz mikrodalgada,kaynatılmadan yavaş yavaş eritilmeli
Bakteriler HST içerisinde tamemnçözülmeli ve partikül olmamalıdır.
![Page 38: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/38.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.
− Hücre/agaroz karışımı kalıplara pipetlenirken, kabarcık ve boşluk kalmamasına
özen gösterilmelidir.
![Page 39: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/39.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.
• Agaroz kalıpların hazırlanması için; standart kalıplar kullanılabileceği gibi cam
veya parafilm üzerine damlalar oluşturacak şekilde dökülerek de hazırlanabilir.
![Page 40: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/40.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.
− Kalıplardaki agarozun nihayi yoğunluğu, restriksiyon enzimleri ile kesimden
oluşacak DNA fragmentlerini büyüklükleri göz önüne alınarak seçilmelidir.
− Örneğin;
Enterokoklar için (SmaI ile kesimde) %1’lik,
Streptokoklar için (ApaI ile kesimde) %0,5’lik agaroz kalıpları hazırlanmalıdır.
![Page 41: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/41.jpg)
- Proteinaz K
- Lizozim
- Lyticase veya Zymolase gibi enzimler
- SDS gibi deterjanlar kullanılmaktadır.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bakteri kalıplarının hazırlanması.
• Bazı durumlarda bakteri hücresinin parçalanmasını arttırmak için, kalıp içerisine
enzim ve deterjanlar da eklenebilir.
- Proteinaz K
- Lizozim
- Lyticase veya Zymolase gibi enzimler
- SDS gibi deterjanlar kullanılmaktadır.
![Page 42: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/42.jpg)
• Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA’nın saflaştırılmasıBakteri parçalama tamponu;
Proteinaz K ve lizozim gibi enzimler ve deterjanlar, agaroz içerisine gömülü
bakterilerin hücre duvarını parçalar.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
![Page 43: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/43.jpg)
• Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA’nın saflaştırılmasıBakteri parçalama tamponu;
Kullanılacak enzimin çeşidi ve konsantrasyonu bakteri türüne göre farklılık gösterebilir.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
Örneğin;
- Proteinaz K yaygın olarak kullanılan enzimlerden biridir ve 4 günü aşkın
inkübasyonunda bile DNA’ya zarar vermez.
- S. aureus gibi bazı bakterilerde lizozim yerine lizostafin daha etkilidir.
- Mantarlarda ise; zymolase veya lyticase kullanılmalı.
Örneğin;
- Proteinaz K yaygın olarak kullanılan enzimlerden biridir ve 4 günü aşkın
inkübasyonunda bile DNA’ya zarar vermez.
- S. aureus gibi bazı bakterilerde lizozim yerine lizostafin daha etkilidir.
- Mantarlarda ise; zymolase veya lyticase kullanılmalı.
![Page 44: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/44.jpg)
• Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA’nın saflaştırılmasıBakteri parçalama tamponu;
- Bakteri parçalama tamponu büyük hacimli tüplerin içerisinde olmalıdır.
- İnkübasyonlar sırasında çalkalamalı benmari kullanılmalı ve tüpler yarı yatık olmalıdır.
Örneğin;
5 ml parçalama tamponu 50 ml’lik tüp içerisinde olmalı.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
X
![Page 45: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/45.jpg)
• Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA’nın saflaştırılmasıBakteri parçalama tamponu;
P. aeruginosa, A. baumannii, E. coli ve Klebsiella spp.için ortak parçalama tamponu
Pulsed Field Gel Electrophoresis
Hücre parçalama tamponu-1
50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 50 mM EDTA,
2.5 mg/ml lizozim, 1.5 mg/ml proteinaz K
37°C’de 1 saat
Hücre parçalama tamponu-2
0.5 M EDTA, %1 sarkozil, 400 g/ml proteinaz K
55°C’de 2 saat
Hücre parçalama tamponu-1
50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 50 mM EDTA,
2.5 mg/ml lizozim, 1.5 mg/ml proteinaz K
37°C’de 1 saat
Hücre parçalama tamponu-2
0.5 M EDTA, %1 sarkozil, 400 g/ml proteinaz K
55°C’de 2 saat
. Durmaz R, Otlu B, Koksal F, Hosoglu S, Ozturk R, Ersoy Y, Aktas E, Gursoy NC, Caliskan AJpn J Infect Dis. 2009 Sep;62(5):372-7.
Tubitak Proje No: 106S211 (SBAG-3459)
![Page 46: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/46.jpg)
• Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA’nın saflaştırılmasıHücrelerin parçalanmasından sonra agaroz kalıpların yıkanması ;
agaroz kalıpların içerisindeki hücresel kalıntıların uzaklaştırılması başarılı elektroforez
için oldukça önemlidir.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
diyaliz
Yetersiz diyaliz
![Page 47: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/47.jpg)
• Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA’nın saflaştırılmasıHücrelerin parçalanmasından sonra agaroz kalıpların yıkanması ;
parçalama tamponu döküldükten sonra agaroz kalıplar su ve TE tamponu ile yıkanır.
Böylece içinde saflaştırılmış DNA bulunan agaroz, restriksiyon enzimi ile kesime hazır
hale getirilmiş olur.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• İçinde agaroz kalıp bulunan tüpe, steril ultra saf sudan (Reagent
Grade Type 1) 4 ml eklenerek, 50°C çalkalamalı su banyosunda
15 dakika bekletilir. Su tamamen aspire edilir ve bu işlem üç kez
daha tekrarlanır.
• Daha sonra agaroz kalıpları üç defa (her biri 50°C’de 15 dakika
olmak üzere), 4 ml TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.6)
tamponuyla yıkanır
• İçinde agaroz kalıp bulunan tüpe, steril ultra saf sudan (Reagent
Grade Type 1) 4 ml eklenerek, 50°C çalkalamalı su banyosunda
15 dakika bekletilir. Su tamamen aspire edilir ve bu işlem üç kez
daha tekrarlanır.
• Daha sonra agaroz kalıpları üç defa (her biri 50°C’de 15 dakika
olmak üzere), 4 ml TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.6)
tamponuyla yıkanır
. Durmaz R, Otlu B, Koksal F, Hosoglu S, Ozturk R, Ersoy Y, Aktas E, Gursoy NC, Caliskan AJpn J Infect Dis. 2009 Sep;62(5):372-7.
Tubitak Proje No: 106S211 (SBAG-3459)
![Page 48: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/48.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Agaroz kalıpları içindeki DNA’nın RE enzimi ile kesilmesi
− Çift zincirli DNA’yı özgül dizilerden tanıyarak kesen enzimlerdir.
− Bugüne kadar yaklaşık 250 kadar farklı diziyi tanıyabilen 3600 kadar
restriksiyon enzimi saptanmıştır.
![Page 49: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/49.jpg)
EcoR IKesim Noktaları
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Agaroz kalıpları içindeki DNA’nın RE enzimi ile kesilmesi− Uygun enzim seçimi önemlidir.− İyi bir ayrım için bant sayısı en az 10 en fazla 20-30 olmalıdır.
− Kesim noktaları arasında kalan DNA fragmentleri büyüklüklerine
göre elektroforetik alanda, jel içinde göç ederler.
− Klonal olarak ilişkili suşlar, benzer bant profilleri oluşturacaktır.
1000 bp
800 bp
600 bp500 bp
200 bp175 bp
![Page 50: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/50.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Agaroz kalıpları içindeki DNA’nın RE enzimi ile kesilmesi− DNA içeren agaroz kalıbı bir lam üzerine alınarak bir bistürü yardımıyla ¼
oranında kesilir.− Kesilen kalıp, önce restriksiyon enziminin tamponu ile yıkanır. Daha sonra enzim
ile, uygun ısıda benmaride inkübe edilir.
• Her agaroz kalıbı için aşağıdaki karışım hazırlanır.
10x EcoRI tamponu--------10 l ,
EcoRI enzimi (10 U /l)-- -3 l
Steril ultra saf su------------87 l
Toplam hacim-------------- 100 l
• Her agaroz kalıbı için aşağıdaki karışım hazırlanır.
10x EcoRI tamponu--------10 l ,
EcoRI enzimi (10 U /l)-- -3 l
Steril ultra saf su------------87 l
Toplam hacim-------------- 100 l
![Page 51: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/51.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Agaroz kalıpları içindeki DNA’nın RE enzimi ile kesilmesi− Kalıpların içerisindeki genomik DNA’lar restriksiyon enzimi ile kesildikten sonra,
kalıplar elektroforez için hazırdır.
![Page 52: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/52.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Elektroforez− Tercihan PFGE sertifikalı agaroz kullanılarak %1’lik agaroz kalıp hazırlanır.
![Page 53: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/53.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Elektroforez− Agaroz kalıplar iki şekilde jel içerisine yerleştirilebilir.
![Page 54: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/54.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Elektroforez− Agaroz kalıplar iki şekilde jel içerisine yerleştirilebilir.
![Page 55: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/55.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Elektroforez− Elektroforezde kullanılacak 0.5X TBE tamponu titizlikle hazırlanmalıdır.
− Tüm çalışma dizisi sırasında değişmemelidir.
![Page 56: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/56.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Elektroforez
− Restriksiyon enzimi ile kesimden sonra oluşacak DNA fragmentlerinin
büyüklüğüne göre uygun elektroforez koşulları uygulanmalıdır.
Başlangıç zamanı: 1 saniye
Bitiş zamanı: 20 saniye
Toplam süre: 20 saat
Akım : 6 V/cm², 14 C
Vuruş Açısı: 120
Başlangıç zamanı: 1 saniye
Bitiş zamanı: 20 saniye
Toplam süre: 20 saat
Akım : 6 V/cm², 14 C
Vuruş Açısı: 120
![Page 57: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/57.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Görüntüleme− Elektroforezden sonra jel, 5 g/ml etidyum bromür içeren 400 ml ultra saf su içine
alınırak 20 dakika boyanır ve UV ışığa altında görüntülenir.− Fotoğraflar dijital kamerayla ve programların çoğunun kabul ettiği TIFF formatında
çekilmelidir. İyi görüntülenememiş tiplendirme sonucu veri olarak değerkazanmamaktadır.
![Page 58: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/58.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Karşılaşılabilecek sorunlar
− Restriksiyon endonüleaz enzimi kesim yapmamış.
− uygun enzim seçilmemiş olabilir
− uygun ısıda inkübe edilmemiş olabilir
− enzim uygun depolanmamış olabilir
− enzimin çalışmasını engelleyecek inhibitör
bulunabilir
− bakteri tür düzeyinde yanlış tiplendirilmiş
dolayısıyla enzimin kesim bölgesine sahip
olmayabilir
− Restriksiyon endonüleaz enzimi kesim yapmamış.
− uygun enzim seçilmemiş olabilir
− uygun ısıda inkübe edilmemiş olabilir
− enzim uygun depolanmamış olabilir
− enzimin çalışmasını engelleyecek inhibitör
bulunabilir
− bakteri tür düzeyinde yanlış tiplendirilmiş
dolayısıyla enzimin kesim bölgesine sahip
olmayabilir
![Page 59: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/59.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
P. aeruginosa
DNA kesim enzimi: Xba-I
Agaroz jel: %1
Elektroforez koşulları:
Başlangıç zamanı: 5 saniye
Bitiş zamanı: 50 saniye
Toplam süre: 17 saat
Akım : 6 V/cm²165 mA, 14 C
Vuruş Açısı: 120
Cihaz: CHEF DR II (Biorad)
P. aeruginosa
DNA kesim enzimi: Xba-I
Agaroz jel: %1
Elektroforez koşulları:
Başlangıç zamanı: 1 saniye
Bitiş zamanı: 17 saniye
Toplam süre: 24 saat
Akım : 6 V/cm²165 mA, 14 C
Vuruş Açısı: 120
Cihaz: CHEF DR II (Biorad)
• Karşılaşılabilecek sorunlar
P. aeruginosa
DNA kesim enzimi: Xba-I
Agaroz jel: %1
Elektroforez koşulları:
Başlangıç zamanı: 5 saniye
Bitiş zamanı: 50 saniye
Toplam süre: 17 saat
Akım : 6 V/cm²165 mA, 14 C
Vuruş Açısı: 120
Cihaz: CHEF DR II (Biorad)
P. aeruginosa
DNA kesim enzimi: Xba-I
Agaroz jel: %1
Elektroforez koşulları:
Başlangıç zamanı: 1 saniye
Bitiş zamanı: 17 saniye
Toplam süre: 24 saat
Akım : 6 V/cm²165 mA, 14 C
Vuruş Açısı: 120
Cihaz: CHEF DR II (Biorad)
![Page 60: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/60.jpg)
7 11 141 2 3 4 5 6 8 9 10 12 13 15
Pulsed Field Gel Electrophoresis
A. baumannii
7,11,14. örnekler yanlıştanımlanmış.
• Karşılaşılabilecek sorunlar
![Page 61: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/61.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
Bakteri yoğunlukları iyi ayarlanmamış Bakteri yoğunlukları iyi ayarlanmamış vekalıplar hasar görmüş
• Karşılaşılabilecek sorunlar
![Page 62: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/62.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Karşılaşılabilecek sorunlar
![Page 63: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/63.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Karşılaşılabilecek sorunlar
![Page 64: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/64.jpg)
su/elektroforeztamponu problemli
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Elektroforez sırasında kullanılan tampon ve uygulanan akımın şiddetinde problem.
• Karşılaşılabilecek sorunlar
Başlangıç vuruş: 1 snSon vuruş: 30 snElektroforez süresi: 22 saat6V/cm2 150 mA pH= 8
Başlangıç vuruş: 1 snSon vuruş: 30 snElektroforez süresi: 22 saat6V/cm2 135 mA pH= 8
su/elektroforeztamponu problemli
![Page 65: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/65.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması
![Page 66: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/66.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması• İlk defa Tenover ve arkadaşları 1995 yılında PFGE sonuçlarının yorumlanması için
belirli kriterler önermişlerdir.
aynı sayıda ve büyüklükte bant içeren izolatlar “aynı”2-3 bant farkı olanlar “yakın ilişkili”4-6 bant farklı olanlar “muhtemel ilişkili”7 veya daha fazla bant farkı olanlar “ilişkisiz”
![Page 67: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/67.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması
− Bu kriterler özellikle hastane enfeksiyonları için, sınırlı bir sürede (1-3 ay)
gerçekleşen salgınlar için geliştirilmiştir.
− Bir yıl ve daha uzun süreyi içeren, geniş kapsamlı çalışmalar için uygun
değildir.
Durmaz R. Pulsed-field gel electrophoresis. In: Durmaz R, eds. Uygulamalı moleküler mikrobiyolojikitabı, 2. baskı, Ankara: Nobel Kitap Evi, 2001:161-168.
• Sonuçların analizi ve yorumlanması
− Bu kriterler özellikle hastane enfeksiyonları için, sınırlı bir sürede (1-3 ay)
gerçekleşen salgınlar için geliştirilmiştir.
− Bir yıl ve daha uzun süreyi içeren, geniş kapsamlı çalışmalar için uygun
değildir.
![Page 68: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/68.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Tenover ve arkadaşları PFGE sonuçlarını etkileyecek mutasyonların önemini ve
tiplendirme sonuçlarına etkisini de vurgulamışlardır.
- Tek bir genetik olay----->izolatlar aynı
- İki genetik olay-----> muhtemel ilişkili
- Üç veya daha fazla genetik olay-----> ilişkisiz
- Tek bir genetik olay----->izolatlar aynı
- İki genetik olay-----> muhtemel ilişkili
- Üç veya daha fazla genetik olay-----> ilişkisiz
− İnsersiyonlar
− Delesyonlar
− Yeniden düzenlenmeler ve tek baz değişiklikleri PFGE paternlerini
etkileyebilecek genetik olaylardır.
Goering RV. Pulsed-field gel electrophoresis. In: Persing DH, Tenover FC, Versalovic J, Tang Y-W, Unger ER, Relman DA, White TJ, eds. Molecular
Microbiology: Diagnostic Principles and Practice. Washington, D.C: ASM Pres, 2004; 185-96.
![Page 69: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/69.jpg)
RE
RERE
salgınizolatı
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Nokta mutasyonlar-Yeniden düzenlenmeler.
− Kromozom üzerinde bu şekilde gerçekleşecek minör değişiklikler PFGE profilineyansımayacaktır
RE RE
RE
Bakteri kromozomu
Bir genetik olaybant farkı yok
![Page 70: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/70.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Nokta mutasyonlar-Yeniden düzenlenmeler.
− Bu nedenle, tiplendirilen izolatlar arasında bant farkı olmadığında;“aynı” (identical) değil,“ayırt edilemez” (indistinguishable) olarak adlandırılmalıdır.
![Page 71: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/71.jpg)
salgınizolatı
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Delesyon
Bir genetik olaybir bant farkı
![Page 72: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/72.jpg)
Bir genetik olayİki bant farkı
salgınizolatı
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Insersiyon
![Page 73: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/73.jpg)
Bir genetik olayüç bant farkı
salgınizolatı
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Insersiyon
Bir genetik olayüç bant farkı
![Page 74: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/74.jpg)
Bir genetik olaydört bant farkı
salgınizolatı
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Insersiyon
Bir genetik olaydört bant farkı
![Page 75: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/75.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Bu yaklaşıma göre; gerçekleşecek bir mutasyonel olay kesim bölgelerini etkileyerek
iki izolat arasında 0–4 bant farklılığına yol açabilir.
− Yani buna göre iki mutasyonel olay 2–8 arası bant farkı oluşturabilir.
![Page 76: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/76.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Tenover kriterlerine göre 4 bant farkına sahip izolatlar “olası ilişkili” olarak kabul
edilmektedir.
Oysa oluşan 4 bant farkı 4 genetik olay sonucu gerçekleşmiş olabilir.
− 5-8 bant farklılığı en az 2 genetik olay sonucunda oluşabilir ve bu durumdaki suşların
da alttip olarak ifade edilmeleri gerekir.
Bu durumda 9 veya daha fazla bant farklılığı olan suşlar ise ilişkisiz olarak
tanımlanabilir.
• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Tenover kriterlerine göre 4 bant farkına sahip izolatlar “olası ilişkili” olarak kabul
edilmektedir.
Oysa oluşan 4 bant farkı 4 genetik olay sonucu gerçekleşmiş olabilir.
− 5-8 bant farklılığı en az 2 genetik olay sonucunda oluşabilir ve bu durumdaki suşların
da alttip olarak ifade edilmeleri gerekir.
Bu durumda 9 veya daha fazla bant farklılığı olan suşlar ise ilişkisiz olarak
tanımlanabilir.
![Page 77: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/77.jpg)
Bu nedenle iki izolat arasındaki bant farklılığının üç ile
sınırlandırmanın (üç bant kuralı) en iyi sonucu vereceğini
bildiren yayınlar vardır.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması
Goering RV. Pulsed-field gel electrophoresis. In: Persing DH, Tenover FC, Versalovic J, Tang Y-W, Unger ER, Relman DA, White TJ, eds.Molecular Microbiology: Diagnostic Principles and Practice. Washington, D.C: ASM Pres, 2004; 185-96.
![Page 78: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/78.jpg)
Daha net bir değerlendirme yapabilmek için türlerin
mikro çevresel baskılar altındaki mutasyon oranının
bilinmesi önemlidir.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması
van Belkum A, Tassios PT, Dijkshoorn L, et al. Guidelines for the validation and application of typing methodsfor use in bacterial epidemiology. CMI 2007;13(Suppl. 3):1-46.
![Page 79: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/79.jpg)
Aşağıdaki öneriler izlenebilir;
• Bant farkı olmayan suşlar; salgın suşu
• 1-4 arası bant farklılığı; aynı tipin subtipi
• ≥5 bant farkı olan izolatlar; farklı tipler
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması
van Belkum A, Tassios PT, Dijkshoorn L, et al. Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterialepidemiology. CMI 2007;13(Suppl. 3):1-46.
Aşağıdaki öneriler izlenebilir;
• Bant farkı olmayan suşlar; salgın suşu
• 1-4 arası bant farklılığı; aynı tipin subtipi
• ≥5 bant farkı olan izolatlar; farklı tipler
![Page 80: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/80.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması
Moleküler epidemiyolojik çalışmalarda incelenen izolat sayısı
artıkça bant profillerinin değerlendirilmesi için
bilgisayar programlarına ihtiyaç duyulmaktadır.
![Page 81: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/81.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması• Bu amaçla en çok kullanılan bilgisayar programları;
- Gel-Compar (Applied Maths, Kortfijk, Belgium)
- Dendron (Solltech, Oakdale, Iowa)
- Diversity Database Fingerprinting Software (Bio-Rad)
- Gene Profiler (Scanlytics, Fairfaz, Va)
- Phoretix 1-D (Nonlinear USA, Durham, N.C.)
- Quantar Pro (KeyGene Producrts, Wageningen, Netherlands)
- Taxotron (Taxolab, Institut Pasteur, Paris, France)
• Sonuçların analizi ve yorumlanması• Bu amaçla en çok kullanılan bilgisayar programları;
- Gel-Compar (Applied Maths, Kortfijk, Belgium)
- Dendron (Solltech, Oakdale, Iowa)
- Diversity Database Fingerprinting Software (Bio-Rad)
- Gene Profiler (Scanlytics, Fairfaz, Va)
- Phoretix 1-D (Nonlinear USA, Durham, N.C.)
- Quantar Pro (KeyGene Producrts, Wageningen, Netherlands)
- Taxotron (Taxolab, Institut Pasteur, Paris, France)
![Page 82: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/82.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Sonuçların analizi ve yorumlanması
![Page 83: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/83.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları
![Page 84: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/84.jpg)
.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları• Elde edilen fotoğrafların bilgisayar ortamına aktarılması ve işlenmesi analizin ilk
basamağını oluşturur.
.
![Page 85: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/85.jpg)
.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları
.
![Page 86: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/86.jpg)
.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− Normalizasyon; elektroforez ile aynı büyülükte DNA parçalarının, aynı sürede
eşit yol almaları beklenmektedir.
.
![Page 87: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/87.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− Normalizasyon
![Page 88: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/88.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− Bantların işaretlenmesi
![Page 89: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/89.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− Bantların işaretlenmesi
![Page 90: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/90.jpg)
.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− İzolatlar arasındaki ilişkilerin değerlendirilmesi
.
![Page 91: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/91.jpg)
.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− İzolatlar arasındaki ilişkilerin değerlendirilmesi
− Sıklıkla «Dice benzerlik katsayısı» kullanılmaktadır.
.
Benzerlik katsayısı hesaplanırken bant ve
profil toleransı, en fazla %1–1.5 olarak
belirlenmelidir.
![Page 92: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/92.jpg)
.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− İzolatlar arasındaki ilişkilerin değerlendirilmesi
.
![Page 93: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/93.jpg)
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− İzolatlar arasındaki ilişkilerin değerlendirilmesi
• dendogramlarının oluşturulması için;
- UPGMA (unweighted pair group method with arithmeti caveraging)
- neighbor joining gibi analiz alogaritmaları kullanılabilir.
![Page 94: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/94.jpg)
.
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− İzolatlar arasındaki ilişkilerin değerlendirilmesi
.
![Page 95: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/95.jpg)
genotipSuş no
farklıfarklıSISISI
farklı
Pulsed Field Gel Electrophoresis
• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− İzolatlar arasındaki ilişkilerin değerlendirilmesi
benzerlik derecesinin eşik değerine (cut-off similarity level) önceden karar vermek veçalışmanın tamamında aynı eşik değerini kullanmak gereklidir.
farklıSIISIIbSIIISIIIaSIIIb
farklıfarklıSIVSIVbSVSVSVSVSVSVSVa
farklıfarklı
toplam 24 suşun 17 tanesi bir küme içinde yer almakta
kümeleşme oranı %71
![Page 96: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/96.jpg)
• Analiz programlarının
sonuçları her zaman çıplak
gözle konfirme edilmelidir.
• Analiz programlarının
sonuçları her zaman çıplak
gözle konfirme edilmelidir.
![Page 97: BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062914/5e5c0d83f828256e0f4dee85/html5/thumbnails/97.jpg)
Moleküler tiplendirme sonuçları,
epidemiyolojik araştırmaların bir parçasıdır ve
ancak klasik epidemiyolojik veriler varlığında değerlidir.